Handouts W. Berger 09.03.2010

er
er
g
.B
W
k,
eti
en
Kl
as
sis
ch
eG
Zystische Fibrose (Mukoviszidose)
Ratjen & Döring (2003), Lancet, 361:681-689
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er
en
eti
k,
W
.B
er
g
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)
eG
Zystische Fibrose (Mukoviszidose)
Gentest:
ch
Screening auf die 36 häufigsten Mutationen
(PCR & Hybridisierung)
sis
ca. 90-95% der Mutationen sind damit nachweisbar
(starke Schwankungen in verschiedenen
Populationen)
Kl
as
wenn negativ:
direkte Sequenzierung des
gesamten Gens (bis zu 3´000,CHF)
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er
er
g
Zyklus 4
DNA
zu amplifizieren
Schema der PCR
Zyklus 3
usw.
Zyklus 1
23 =
8 Kopien 16 Kopien 32 Kopien
236 =
68 Milliarden Kopien
en
eti
k,
22 =
4 Kopien
Zyklus 35
W
DNA
.B
Zyklus 2
eG
Muskeldystrophie Typ Duchenne
Häufigkeit:
1:3000 bis 1:6000
ch
Genetik:
- X-chromosomal rezessiv
sis
- Dystrophin-Gen: 2400 kb, 85 Exons, 3685
Aminosäuren
- Deletionen bei 2/3 der Betroffenen
Kl
as
- In-Frame Mutationen: Muskeldystrophie Typ
Becker
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er
er
g
Hämophilie A (Faktor VIII-Defizienz)
Häufigkeit:
.B
1 : 10 000
Klinik:
W
- Blutungen der Schleimhäute und innere Blutungen
en
eti
k,
- in 25% der Fälle mildere klinische Formen (bis zu
20% Faktor VIII Aktivität)
eG
Hämophilie A (Faktor VIII-Defizienz)
Kl
as
sis
ch
Inversion of exons 1-22 of the factor VIII gene
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g
.B
W
k,
eti
en
eG
Fragiles X Syndrom
Häufigkeit:
1 : 4000 (Männer) – 1 : 6000 (Frauen)
ch
Klinik:
sis
- Entwicklungsverzögerungen (Lernschwierigkeiten
bis hin zur schweren geistigen Behinderung)
- Krampfanfälle bei etwa 25% der betroffenen
Kl
as
- Makroorchidie, auffallendes Gesicht
- Verhaltensauffälligkeiten (autistoides Verhalten,
ADHS: Aufmerksamkeitsdefizit/Hyperaktivitätssyndrom)
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er
W
.B
er
g
CGG expansion in FMR1
n = 6-52
premutation:
n = 48-200
full mutation:
n = 200 bis >1000
k,
normal allele:
Kl
as
sis
ch
eG
en
eti
test: PCR, Southern-Blot
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er
er
g
Myotone Dystrophie (Curschmann-Steinert)
Häufigkeit:
.B
1 : 10´000
Klinik:
W
- häufigste autosomal-dominante neuromuskuläre
Erkrankung
- progredienter Verlauf
k,
- erste Symptome im jungen Erwachsenenalter, aber
auch kongenitale Formen
en
eti
- Begleitsymptome: Katarakt, geistige Behinderung
eG
Myotone Dystrophie (Curschmann-Steinert)
Genetik:
- autosomal dominanter Vererbungsmodus
ch
- DMPK-Gen, Chromosom 19q13.3
Kl
as
sis
- Triplett-Expansion im 3´-UTR des DMPK-Gens
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en
eti
k,
W
.B
er
g
Stammbaum einer Familie mit
myotoner Dystrophie (Curschmann/Steinert)
eG
Chorea Huntington (Veitstanz)
Häufigkeit:
~ 1 : 30´000
ch
Klinik:
- Erkrankungsmanifestation im 35.-45. Lebensjahr
sis
- Bewegungsstörungen
- Wesensänderung (psychiatrische Auffälligkeiten)
Kl
as
- kognitive Leistungseinbussen
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Genetik:
er
.B
- autosomal dominanter Vererbungsmodus
er
g
Chorea Huntington (Veitstanz)
- IT15-Gen (Huntingtin), Chromosom 4p16.3
- Triplett-Expansion (CAG) im translatierten Bereich
W
-> Polyglutaminerkrankung
en
eti
k,
- Antizipation (früheres Erkrankungsalter und
Zunahme des Schweregrades in nachfolgenden
Generationen)
eG
Chorea Huntington (Veitstanz)
Gentest:
- genetisches Beratungsgespräch
ch
- Problematik der präsymptomatischen/pränatalen
molekulargenetischen Testung
Kl
as
sis
- Richtlinien zur Durchführung einer
molekulargenetischen Diagnostik
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er
en
eti
k,
W
.B
er
g
Chorea Huntington (Veitstanz)
eG
Genetische Ursachen der Retinopathia pigmentosa
~ 40 Gene identifiziert
• Phototransduktion
ch
Rhodopsin
AD
Phosphodiesterase, AR
 und -UE
AR
CNCG1 & 2
3q21-24
5q31.2
4p16.3
4p12-cen
6q13-21
sis
• Photorezeptor-Strukturproteine
Peripherin
AD
6p21.1
Kl
as
AR
AR
AR
CRX
NRL
AD
AD
19q13.3
14q11.1-12.1
• Spleißfaktoren
PRPC8
PRP31
HPRP3
AD
AD
AD
17p13.3
19q13.4
1q21.1
• Unbekannte Funktion
• Retinol-Metabolismus
ABCR
RLBP1
RPE65
• Transkriptionsfaktoren
1p21-13
15q26
1p31
CRB1
RP2
RPGR
AR
X
X
1q31-32.1
Xp11.4-11.23
Xp21.1
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er
er
g
Relevanz für die Diagnostik:
W
.B
Heterogenität erschwert die molekulare
Diagnostik
(Nachweis von mehreren Hundert DNAVarianten in zahlreichen Genen)
en
eti
k,
-> erfordert neue, hocheffiziente Technologien
Kl
as
sis
ch
eG
Mutationserkennung mittels DNA-Sequenzierung:
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.B
er
g
Gendiagnostik bei einem Patienten mit
Netzhautablösung
CTG CGG CTG CGA TGC TCA GGG
Protein: LEU ARG LEU ARG CYS SER GLY
Patienten-DNA
CTG CGG CTG CGA AGC TCA GGG
Protein: LEU ARG LEU ARG SER SER GLY
en
eti
k,
W
Kontroll-DNA
eG
Mutationsanalyse mit Gen-Chips
DNA Mikroraster (Genchip)
Kl
as
sis
ch
enthält > 1000 Genvarianten in Form
von kurzen, synthetischen Genabschnitten
Kontrolle
Patient
CTG CGG CTG CGA TGC TCA GGG
CTG CGG CTG CGA AGC TCA GGG
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k,
W
.B
er
g
Digenic retinitis pigmentosa (RP)
en
eti
ROM1: rod outer membrane protein 1
RDS:
retinal degeneration slow / peripherin
eG
Triallelic inheritance in Bardet-Biedl syndrome (BBS)
Kl
as
sis
ch
obesity, retinopathy, polydactyly, renal malformations, mental retardation, hypogenitalism
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er
er
g
.B
W
k,
eti
en
eG
1. Entwicklung neuer Hochdurchsatzverfahren
in der Gendiagnostik
2. Zunahme der Diagnostik bei Prädispositionen
sis
ch
3. Aufklärung der Ursachen multifaktorieller
Erkrankungen (Herz-Kreislauf, Allergien,
Diabetes, Asthma, Krebs, altersbedingte
Erkrankungen)
Kl
as
4. Verstärkte funktionelle Analyse von Genen
und Genvarianten
5. Aufklärung von Krankheitsmechanismen als
Grundlage für die Therapie
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er
(biochemischer Defekt unbekannt!!!)
.B
1. Kartierung im Genom
er
g
Identifizierung krankheitsassoziierter Mutationen
W
- grosse Familienstammbäume
- umfangreiche Patientenkollektive
- strukturelle Chromosomenveränderungen
2. Identifizierung der Mutation(en)
en
eti
k,
- Auswahl von Kandidatengenen
- Suche nach Mutationen
- Untersuchung der Genfunktion
(Biochemie, Zellbiologie, Tiermodelle)
ch
> 2000 kbp
control
Genetic Map
Mutation-Analysis
control
Xp
eG
Identification of disease-causing mutations
patients
patients
1 2 3 4 5 6
sis
cen
Southern-Blot-Analysis
Deletions
Xq
Kl
as
SSCP
Gene Map
Physical Map
Human X chromosome
(160 Mbp, 2000-3000 genes)
50-500 kbp
1-200 kbp
DNA-Sequencing
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er
er
g
Retrieval of gene information from databases
eti
k,
W
.B
search term: rhodopsin
en
http://genome.ucsc.edu/
eG
Cytogenetic Diseases
Duplications / Deletions (dup/del)
Threshold cycle (CT)
Allele 1 Allele 2
Chromosome 17p11.2-12
Normalized fluorescence
ch
Normalized fluorescence
Kl
as
sis
22 22
Duplication of PMP22 Gene
Normalized fluorescence
Deletion of PMP22 Gene
Normal Genome
22 23
Threshold cycle (CT)
Allele 1 Allele 2
Chromosome 17p11.2-12
HNPP
21.5 22
Threshold cycle (CT)
Allele 1 Allele 2
Chromosome 17p11.2-12
CMT
PMP22
Reference Gene
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