Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK)
Werbung
Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Assistierte Reproduktionstechnologien ((ARTs)) in der Maus: Trojanische j Pferde in der Versuchstierhaltung? PD Dr. Esther Mahabir-Brenner (esther.mahabir brenner@uni koeln.de) ([email protected]) Altromin, 3/2012 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Ziel Risikoeinschätzung einer Übertragung von Infektionserregern auf Mä Mäuse mittels itt l assistierten i ti t R Reproduktionstechnologien d kti t h l i (I) Spermien, Embryonen (Embryotransfer/Hygienesanierung) (II) Embryonale Stammzellen (Herstellung genmodifizierter Mäuse) Infektionserreger: Maus Hepatitis Virus (MHV) (MHV), Minute Virus of Mice (MVM) 2 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Schema eines Mausarchivs Wissenschaftler = Depositor D it medizinisch di i i h wertt volle mutante, transgene oder knock out Mauslinien knock-out Archivierung Rederivation Embryofreezing Embryonenarchiv Auftauen in-vitro-Fertilisation E b Embryotransfer t f Hygieneuntersuchung Genotypisierung Expansionszucht Spermfreezing Spermienarchiv wissenschaftliche Gemeinschaft 3 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Gewinnung von in vivo Embryonen und Embryotransfer Schenkel, 1995 1:100 Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. Manipulating the Mouse Embryo. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2003. Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Spermatozoa und Eizellen Blut bei der Vorbereitung der Spermatozoa Sutton et al., 2003, Human Reprod; 35-48 Spermatozoa: dringen in die Eizelle hinein, „sperm tracks“, Mikroporen in der ZP Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) In vitro produzierte Embryonen Fertilisation medium 200µl HTF D1 Culture medium 4x 100µl KSOM D2, D3, D4, D5 1 h nach der Befruchtung : Eizellen mit Kumuluszellen, Spermien 5 h nach der Befruchtung: Eizellen gewaschen Culture medium 100µl KSOM D6 Holding medium 4x 100µl M2 D7, D8, D9, D10 Holding medium 100µl M2 D11 4 h nach der Befruchtung: Eizellen mit abgelösten Kumuluszellen, Spermien 24 h nach der Befruchtung: 2-Zell-Embryonen, 1-Zeller und degenerierte Zellen Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Spermatozoa Agent Size (nm) Site References MCMV 175-200 Testes Dutko and Oldstone, 1979 80-160 Testes and epididymis Scavizzi and Raspa, Raspa 2004, 2006 Sperm Zhang, 2008 (RADIL) Sperm Agca et al, al 2007 Sperm Zhang, 2008 (RADIL) Sperm Besselsen et al., 2008 MHV MPV 20-25 MNV 30 S Sperm Zh Zhang, 2008 (RADIL) TMEV 28-30 Sperm Zhang, 2008 (RADIL) 20 25 20-25 Sperm, testes, epididymidis, idid idi penis, i accesssory glands J Janus ett al. l 2009 300 x 2000-3000 2000 3000 Testes and epididymis Scavizzi and Raspa, 2004 2006 2004, Sperm Zhang, 2008 (RADIL) MMVi Helicobacter typhlonius Helicobacter spp. Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Washing protocol 1) Percoll treatment Not effective for MPV: Agca et al.: 2007 2) Resuspension of spermatozoa in 400 µl NaCl, centrifugation at 500 x g 1, 3, or 5 washing steps: Not effective for MVMi: Janus et al., 2009 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Untersuchungen mit Embryonen • Zona Pelluzida (ZP): gilt als effektive natürliche Barriere für Keime in verschiedenen Spezies und verhindert somit deren Übertragung während des Embryotransfers • Mengovirus (27-28 nm groß) und Coxsackie-B Virus (30 nm groß) überquerten die ZP von murinen Embryonen • Abhängig von der Virusgröße können Mikroporen (140-1000 nm) in der ZP trotz des Waschens Viren beherbergen • Lasermanipulation der ZP und in vitro Befruchtung mit Spermien und Eizellen von infizierten Mäusen (erhöhtes Risiko?) ¾ Übertragung von Infektionserregern auf Mäuse Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Übertragung von MHV-A59 mittels in vitro produzierten Embryonen Fertilisation medium 200µl HTF D1 IVF with MHV-A59, Culture with MHV-A59 Zona-intact oocytes (Group 1) Culture medium 4x 100µl KSOM D2, D3, D4, D5 Holding medium 4x 100µl M2 D7, D8, D9, D10 Culture medium 100µl KSOM D6 Holding medium 100µl M2 D11 + + + + + + + + + + + IVF with MHV-A59, Culture without MHV-A59 Zona-intact oocytes (Group 2) + - - - - - - - - - - IVF with MHV-A59, Culture without MHV-A59 L Laser-manipulated i l t d oocytes t (Group 3) + - - - - - - - - - - + Drops with MHV-A59 - Drops without MHV-A59 D = Drop IVF mit Laser-manipulierten/intakten Eizellen und kryokonservierten Spermatozoen, 108 TCID50/ml MHV-A59, ET Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) K i Üb Keine Übertragung t von MHV MHV-A59 A59 mittels itt l in i vitro it produzierten d i t Embryonen E b Experimentelle Gruppen Serokonversion (Anzahl positiver/Anzahl positiver Rezipienten) Tag 21 Tag 28 Tag 42 Gruppe 1 HTF, KSOM, M2 mit MHV-A59 9/14 10/14 10/14 Gruppe 2 HTF mit MHV-A59 MHV A59 0/12 0/12 0/12 Gruppe 3 HTF mit MHV-A59 + Laser 0/14 0/14 0/14 Kontrolle (Transfer mit M2) 0/8 0/8 0/8 Peters, D., Marschall, S., Mahabir, E. et al., Biol. Reprod., 74:246-52, 2006. Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Übertragung von MVMp mittels in vivo produzierten Embryonen Blastozysten 2-Zeller 16h 1h 16h 1h Ungewaschen/gewaschen Ungewaschen/gewaschen Ungewaschen/gewaschen Ungewaschen/gewaschen 102/104 103/104 103/104 103/104 10 Waschschritte: 10 bis 100-fach Virusreduzierung Serokonversion bis Tag 42 Antikörper in Nachkommen, wenn die Rezipienten bis Tag 21 serokonvertierten, seronegativ bis Tag 133 (112) nach dem ET Minimum Titer an MVM, der zur Serokonversion führte: 102 TCID50/ml Risiko einer MVM-Übertragung während des ETs, wenn der Titer ≥ 104 TCID50/ml Mahabir et al., Biol. Reprod., 76: 189-197, 2007. 12 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Ri ik einer Risiko i Virusübertragung Vi üb t mittels itt l in i vivo i produzierten d i t Embryonen hängt von der Virusgröße ab Embryonen MVM MHV Zunehmende Konzentration 80-160 nm Z Zunehmende h d K Konzentration t ti 20 nm 10 x Waschen Embryotransfer Virusübertragung Nein SPF SPF SPF SPF Nein SPF SPF SPF SPF Mahabir et al. Biol. Reprod., 76: 189-197, 2007. Nein SPF SPF SPF SPF Ja Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Keine Übertragung von MVMp mittels in vitro produzierten Embryonen IVF mit kryokonservierten y Spermatozoen p (C3HeB/FeJ), ( ) 104 TCID50/ml MVMp, p ET IVIA Numb ber of culture dishes s 25 PCR 20 15 10 5 0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Drops (D) of medium Kein infektiöses MVM ab Waschtropfen 6 Kein MVM in den IVF Embryonen Kein MVM in den Rezipienten und Nachkommen (PCR mit mesenterialen Lymphknoten und Dünndarm) Keine Serokonversion der Rezipienten und Nachkommen Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Kumuluszellen verhindern eine Übertragung Ü von MVMp mittels IVF-Embryonen IVF mit Eizellen mit und ohne Kumuluszellen (Hyaluronidase: 300 µg/ml for 2-3 min), 104 TCID50/ml MVMp, ET Group p 1: IVF with MVMp, p Culture without MVMp, p Cumulus-enclosed oocytes y Group 2: IVF with MVMp, Culture without MVMp, Cumulus-free oocytes Group 3: IVF without MVMp, Culture without MVMp, Cumulus-enclosed oocytes Number of culture dishes IVF + MVMp + Kumuluszellen 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 IV IA PCR IVIA 2/11 0/11 Embryonen: 5/11 0/11 PCR D11: D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 Drops (D) of medium IVF + MVMp - Kumuluszellen Number of culture dishes 45 40 IVIA 35 PCR 30 25 D11: PCR IVIA 5/14 1/14 Embryonen: 4/9 20 15 10 5 0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 Drops (D) of medium D8 D9 D10 0/9 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) K Kumuluszellen l ll verhindern hi d eine i Übertragung Üb t von MVMp MVM mittels itt l IVF-Embryonen IVF E b Seropositive Mäuse Tage nach dem ET Experimentelle Gruppe Rezipienten Nachkommen 14 21 28 42 42 63 IVF mit MVMp und mit Kumuluszellen 0/6 0/6 0/6 0/6 0/25 0/14 IVF mit MVMp und ohne Kumuluszellen 0/15 2/15 2/15 2/15 4/28 0/13 IVF ohne MVMp und mit Kumuluszellen 0/6 0/6 0/6 0/6 0/25 0/13 ¾ Seropositive Rezipienten und Nachkommen nach IVF mit Eizellen ohne Kumuluszellen ¾ Alle Rezipienten und Nachkommen waren MVM-negativ mittels PCR Kumuluszellen nehmen MVMp auf (nach Ko-inkubation mit 10 Kumuluszellen Durchschnitt der Wiederholungen (4-5) 4 TCID50/ml MVMp für 5h ) L929 Zellen 105 Zellen Überstand 105 Zellen Überstand 39 103.9 40 104.0 31 103.1 44 104.4 16 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Ovaries, Oocytes, and Embryos Virus Size (nm) Infection of oocytes/ embryos LCMV 110-130 110 130 Oocytes and embryos yes Mims 1966 Mims, trophoderm no Abramzuck et al, 1978 Polyoma Zona Penetration Reference Sendai 100-200 Embryos MCMV 175-200 Microinjected oocytes Tebourbi et al 2002 80-160 Ovary Scavicci and Raspa, 2004 Ovary and oocytes Zhang, 2008 (RADIL) embryos Mahabir et al., 2007 Cumulus cells Mahabir et al., 2009 Ovary, oviduct, uterus, Oocytes Janus et al., 2009 Ovary and oocytes Agca et al., 2007 Oocytes and embryos Zhang, 2008 (RADIL) Oocytes and embryos Zhang, 2008 (RADIL) MHV MMV MPV MNV 20-25 20-25 30 yes Lavilla-Apelo et al, 1991,1992 Tuffrey et al, 1972 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) U t Untersuchungen h mit it embryonalen b l Stammzellen St ll • Intensiver Gebrauch und Austausch von ES-Zellen zwischen Laboratorien • Unbekannter mikrobiologischer Status der ES-Zellen • Mangel an Information über die Effekte von Viren auf ES-Zellen • Risiko einer Ausbreitung von Kontaminationen • Effekte von MHV-A59, MVMp auf ES-Zellen (TBV-2, 129S2/SvPas, GGTC): - Wachstum - Keimbahntransmission Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) ES-Zellen sind restriktive Wirte für MVM, „restrictive virus-cell interaction“ P13, Feeder-frei auf Gelatin (+5), 10-1 TCID50/ES-Zelle, Passage alle 2 Tage, 4-5 Passagen produktive Infektion mit MHV-A59 jedoch nicht mit MVMp Culture 1 P13+5+1 >1010 Culture 2 > 1010 P13+5+2 >1010 108.3 P13+5+3 108.3 P13+5+4 107.8 P13+5+5 n. d. MVMp (TCID50/ml) Culture 1 Culture 2 104.8 103.8 103.8 103 106.8 0 102 107.5 0 101 0 101.3 n. d. Mahabir et al., Transgenic Research, 18: 45-57, 2009. 5500000 5000000 a abc Control MMV ab 4500000 Cell number (mean ± SEM M) Passage MHV-A59 (TCID50/ml) Weniger ES-Zellen mit MHV-A59 ab MHV 4000000 3500000 abc 3000000 2500000 abc abc abc 2000000 1500000 bc bc 1000000 bc 500000 c 0 P13+5+1 P13+5+2 P13+5+3 Pas s age num be r P13+5+4 Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Keine Keimbahntransmission nach Blastozysteninjektion mit MHV–A59- (P13+5+4) und MVMp- (P13+5+5) exponierten ES-Zellen Period of culture and viral dose p per mESC 6h P13+5+4/5 10-1 TCID50 MHV 10-1 TCID50 MVM Control ES Medium 10-1 TCID50 MHV 10-1 TCID50 MVM Control ES Medium Progeny/embryos transferred (%) 34/50 (68)b 30/50 (60)b 16/30 (53)b 16/110 (15)c 22/120 (18)c 19/40 (48)b Seropositive litters (no. mice) 0/5(0)a 0/5(0) 0/3 (0) 5/5 (16)b 0/6 (0) 0/4 (0) Germline chimeras/chimeras 8/17 3/3 3/3 0/0 (0) 0/0 (0) 5/8 7 6.7 6.7 0 0 6.2 Parameter Progeny/germline chimera Mahabir, E., Transgenic Research, 18: 45-57, 2009. Zentrum für Molekulare Medizin Köln (ZMMK) Ri ik i i i Risikominimierung 1) Mäuse • Aktuelle Hygienezeugnisse • Mäuse unter Quarantäne stellen 2) Hygiene • Hygienesanierung, KEINE lebenden Mäuse • 10-fache Waschschritte, 1:100 Verdünnung, in-vivo- oder in-vitro-produzierte Embryonen • Transfer T f von einem i Mindestvolumen Mi d t l an Medium M di zusammen mit it Embryonen E b • Hygieneuntersuchung von jedem Rezipienten nach dem Absetzen (wt-Nachkommen) • Mikrobiologische Untersuchung von biologischen Materialien (ES-Zellen): PCR, MAP-Test 3) Haltung • IVC Haltung 4) Management • Standard Operating Procedures (SOPs) • Umsetzung der Forschungsergebnisse > aktueller Stand ¾Beitrag zum 3R-Konzept: reduction, refinement, replacement
