Gebrauchsinformation FLUORIMMUN Influenza

Gebrauchsinformation
FLUORIMMUN Influenza
Indirekter Immunfluoreszenztest (IFT) für Influenza A oder B
Best.-Nr.: FI-100, FI-200
Verwendungszweck
Die FLUORIMMUN-Influenza A und B Testpackungen und Einzelreagenzien sind zur Bestimmung der Influenza-Antikörper vorgesehen, um damit den Zustand eines Infektionsschutzes oder einer Frischinfektion mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz unter Verwendung gebrauchsfertiger oder lyophilisierter Reagenzien festzustellen.
Anwendungsbereich
Die FLUORIMMUN-Influenza Testpackung ist ein indirekter Immunfluoreszenz-Test zum
Nachweis von Typ-Immunglobulinklassen-spezifischen Influenzavirus-Antikörpern im Serum.
Die Reagenzien und Objektträger sind auch einzeln zu beziehen. Bei Verwendung von
Einzelreagenzien ist eine Standardisierung im Anwender-Labor erforderlich.
Der Test ist zur Verwendung durch Fachpersonal vorgesehen.
Diagnostische Bedeutung
Ein ”grippaler Infekt” kann durch eine Vielzahl viraler, z. T. auch bakterieller Erreger
hervorgerufen werden. Es treten dabei zumeist Krankheitssymptome der oberen Luftwege
sowie Fieber und Gliederschmerzen auf. Die Zeichen einer echten Grippe dagegen beginnen
überwiegend systemisch, mit plötzlich auftretendem allgemeinen Krankheitsgefühl,
Kopfschmerzen, Myalgien, Schüttelfrost, Husten und hohem Fieber. Dabei können
Pneumonien auftreten, die entweder durch Influenza A- oder Influenza B-Viren oder durch
bakterielle Superinfektionen ausgelöst werden.
Mit diesem Test können frische oder kürzlich zurückliegende Influenza-Infektionen durch
Unterscheidung der Virus-spezifischen Immunglobulinklassen erkannt werden. Dadurch
können auch niedrige KBR-Titer interpretiert werden (1, 3, 4). Störfaktoren wie z. B.
hämolytische Seren, antikomplementäre Serumaktivität oder unspezifische Seruminhibitoren
beeinflussen den Test nicht. Epidemiologisch kann der Nachweis von Influenza A-VirusSubtypen bedeutungsvoll sein (2).
Testprinzip
Grundlage des Tests ist die Bindung Influenzavirus-spezifischer Antikörper an mit Influenzavirus-Antigen beschichtete Hühner-Erythrozyten auf Objektträgern. Der Bindungsnachweis erfolgt durch FITC-markierte anti-human-IgA- bzw. anti-human-IgG-Antikörper. Bei
den Antigenen handelt es sich um die von der WHO für die jeweilige Saison empfohlenen
Influenzavirus-Impfstämme.
FI-100, FI-200 / 2017-01
Labor Dr. Merk & Kollegen GmbH
Beim Braunland 1, 88416 Ochsenhausen
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Fax + 49 7352 / 9119-40
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Sicherheitsmaßnahmen
Gefahrenhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Dieses Produkt ist ein In-vitro-Diagnostikum.
Die FLUORIMMUN-Influenza A und B Testpackungen sowie die Einzelreagenzien sind nur
für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken
einwandfrei beherrscht.
Das Influenza-Antigen zur Beschichtung der Hühner-Erythrozyten wurde chemisch
inaktiviert. Dennoch müssen alle Proben, biologischen Reagenzien und für die
Testdurchführung verwendeten Materialien grundsätzlich als potentiell infektiös angesehen
und entsprechend behandelt und entsorgt werden. Bitte beachten Sie die Laborvorschriften
für die Handhabung von infektiösem Material!
Nicht mit dem Mund pipettieren. In den Bereichen, in denen mit den Testreagenzien und
Patientenproben gearbeitet wird, nicht Rauchen, Essen oder Trinken.
Beim Umgang mit den Testreagenzien und Patientenproben geeignete Schutzkleidung und
Einweghandschuhe tragen.
Entsorgung
Bitte beachten Sie die jeweils geltenden gesetzlichen Vorschriften!
Reagenzien
FLUORIMMUN-Influenza A (H1N1 + H3N2): FI-100
Reagenz
Menge
FLUORIMMUN-Influenza
Influenza A (H1N1 + H3N2)
mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten
und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten
Verhältnis 40 % zu 60 %
Best.-Nr.
6 x Objektträger
à 12 Felder
FI-510
Influenza-Kontrollserum positiv 1:10 vorverdünnt
für FLUORIMMUN-Influenza A + B-Test
Titer siehe beiliegendes Titerblatt
1 x 0,2 ml
FI-004
Influenza-Kontrollserum negativ gebrauchsfertig
für FLUORIMMUN-Influenza A + B-Test
1 x 0,2 ml
FI-006
anti-Human-IgA-Konjugat
FITC markiert, lyophilisiert
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 0,5 ml
FI-001
anti-Human-IgG-Konjugat
FITC markiert, lyophilisiert
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 0,5 ml
FI-002
Phosphat-Puffer 20 x konzentriert
3 x 7,0 ml
P-040
Einbettungsmedium
mit Fluoreszenzverstärker
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 1,5 ml
FI-007
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FLUORIMMUN-Influenza B: FI-200
Reagenz
Menge
FLUORIMMUN-Influenza
Influenza B
mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten
und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten
Verhältnis 20 % zu 80 %
Best.-Nr.
6 x Objektträger
à 12 Felder
FI-520
Influenza-Kontrollserum positiv 1:10 vorverdünnt
für FLUORIMMUN-Influenza A + B-Test
Titer siehe beiliegendes Titerblatt
1 x 0,2 ml
FI-004
Influenza-Kontrollserum negativ gebrauchsfertig
für FLUORIMMUN-Influenza A + B-Test
1 x 0,2 ml
FI-006
anti-Human-IgA-Konjugat
FITC markiert, lyophilisiert
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 0,5 ml
FI-001
anti-Human-IgG-Konjugat
FITC markiert, lyophilisiert
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 0,5 ml
FI-002
Phosphat-Puffer 20 x konzentriert
3 x 7,0 ml
P-040
Einbettungsmedium
mit Fluoreszenzverstärker
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 1,5 ml
FI-007
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FLUORIMMUN-Influenza Einzelreagenzien
Reagenz
Menge
Best.-Nr.
FLUORIMMUN-Influenza
Influenza A (H1N1 + H3N2)
mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten
und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten
Verhältnis 40 % zu 60 %
Objektträger
à 12 Felder
FI-510
FLUORIMMUN-Influenza
Influenza B
mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten
und unbeschichteten Kontroll-Erythrozyten
Verhältnis 20 % zu 80 %
Objektträger
à 12 Felder
FI-520
Influenza-Kontrollserum positiv1:10 vorverdünnt
für FLUORIMMUN-Influenza A + B-Test
Titer siehe beiliegendes Titerblatt
1 x 0,2 ml
FI-004
Influenza-Kontrollserum negativ gebrauchsfertig
für FLUORIMMUN-Influenza A + B-Test
1 x 0,2 ml
FI-006
anti-Human-IgA-Konjugat
FITC markiert, lyophilisiert
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 0,5 ml
FI-001
anti-Human-IgG-Konjugat
FITC markiert, lyophilisiert
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 0,5 ml
FI-002
Phosphat-Puffer 20 x konzentriert
3 x 7,0 ml
P-040
Einbettungsmedium gebrauchsfertig
mit Fluoreszenzverstärker
für FLUORIMMUN-Tests
1 x 1,5 ml
FI-007
Zusätzlich erforderliches Material







Übliche Laborausrüstung
Aqua purificata und steriles Aqua purificata
Magnetrührer
Färbewännchen
Fluoreszenz-Mikroskop (Auflicht, Filterkombination für FITC)
Brutschrank mit 37 °C (± 1 °C)
Pipetten mit Einmalspitzen (100 µl, 1000 µl)
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Lagerung und Haltbarkeit der Reagenzien
Reagenzien bis zur Anwendung bei 2 °C – 8 °C aufbewahren.
Haltbar bis zu dem auf den Etiketten angegebenen Datum.
Reagenzien nach Ablauf der Haltbarkeit nicht mehr verwenden.
Haltbarkeit nach dem Öffnen
Um Kontaminationen zu vermeiden sollten aseptische Techniken zur Entnahme der
Reagenzien angewandt werden.
ID-Nr.
Bezeichnung
Stabilität nach Öffnen
FI-510
FLUORIMMUN-Influenza A Objektträger
bis zu einer Woche haltbar
bei Lagerung 2 °C – 8°C
FI-520
FLUORIMMUN-Influenza B Objektträger
bis zu einer Woche haltbar
bei Lagerung 2 °C – 8°C
FI-001
rekonstituiertes anti-Human-IgA-Konjugat
einen Monat
bei Lagerung 2 °C – 8°C
FI-002
rekonstituiertes anti-Human-IgG-Konjugat
einen Monat
bei Lagerung 2 °C – 8°C
Transportstabilität
Die Transportstabilität der Reagenzien ist für 1 Tag bei 37 °C gegeben.
Probenmaterial
Im FLUORIMMUN-Influenza Test wird Serum untersucht. Kontaminierte Proben oder
Proben, die Partikel enthalten, sind für den Test nicht geeignet.
Die Proben können bei 2 °C – 8 °C bis zu 5 Tagen oder bei – 20 °C für längere Zeit gelagert
werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden.
Vorbereiten der Reagenzien
Vor Testansatz folgende Reagenzien vorbereiten.
ID-Nr.
Bezeichnung
Vorbereitung
FI-001
anti-Human-IgA-Konjugat FITC markiert,
lyophilisiert
Lyophilisat mit 0,5 ml sterilem
Aqua purificata rekonstituieren
FI-002
anti-Human-IgG-Konjugat FITC markiert,
lyophilisiert
Lyophilisat mit 0,5 ml sterilem
Aqua purificata rekonstituieren
Phosphat-Puffer 20 x konzentriert
1 x 7 ml Konzentrat 1:20 mit
Aqua purificata verdünnen
(z. B. 7 ml Pufferkonzentrat + 133 ml
Aqua purificata)
P-040
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Testdurchführung
Für die sachgemäße Anwendung des FLUORIMMUN Influenza Tests sind ausschließlich die
Reagenzien von Labor Dr. Merk & Kollegen zu verwenden. Bei Verwendung von Reagenzien
anderer Hersteller muss die Kombination der Reagenzien vom Anwender neu validiert
werden.
Proben und Reagenzien vor Verwendung sorgfältig schütteln. Beim Öffnen und bei der
Entnahme der Reagenzien mikrobielle Kontamination vermeiden.
Die strikte Einhaltung der Arbeitsvorschrift gewährleistet korrekte Ergebnisse.
Testdurchführung zum Nachweis von IgA-Antikörpern
 Patientenseren 1:150 in PBS verdünnen = Screeningverdünnung (z. B. 5 µl Serumprobe +
745 µl PBS-Puffer).
 Positives Kontrollserum (liegt 1:10 vorverdünnt vor) entsprechend den Angaben auf dem
beiliegenden Datenblatt in PBS verdünnen.
 Negatives Kontrollserum unverdünnt einsetzen.
 10 µl Kontroll- bzw. Patientenserum pro Feld pipettieren. Pro Ansatz je 1 Feld für das
positive und negative Kontrollserum ansetzen.
 90 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
 Waschen der Objektträger: Objektträger gründlich zuerst mit PBS und anschließend mit
Aqua purificata vorsichtig abspülen, wobei ein starker Wasserstrahl vermieden werden
muss. Bei Verwendung einer Spritzflasche nicht direkt auf die beschichteten Felder
spritzen, sondern auf die dazwischen liegenden Stege.
Alternativ kann so verfahren werden: Objektträger kurz 1 x in PBS tauchen, 10 min in
einem Färbewännchen mit Magnetrührer (800 Upm) in PBS inkubieren. Danach in einem
zweiten Färbewännchen mit Aqua purificata 1 min auf Magnetrührer (800 Upm)
inkubieren.
Nach dem Waschen werden die Objektträger luftgetrocknet oder mit dem Fön getrocknet,
dabei den warmen Luftstrom nicht länger auf eine Stelle richten.
 10 µl Anti-human-IgA-Konjugat pro Feld pipettieren.
 60 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
 Waschen und trocknen wie oben beschrieben.
 Einbetten mit Einbettungsmedium, Deckglas auflegen.
Testdurchführung zum Nachweis von IgG-Antikörpern
 Patientenseren in PBS verdünnen = Screeningverdünnungen
1:2500 bei Influenza A (bei Verdacht auf akute Infektion)
1:5000 bei Influenza B (bei Verdacht auf akute Infektion)
 Positives Kontrollserum (liegt 1:10 vorverdünnt vor) entsprechend den Angaben auf dem
beiliegenden Datenblatt in PBS verdünnen.
 Negatives Kontrollserum unverdünnt einsetzen.
 10 µl Kontroll- bzw. Patientenserum pro Feld pipettieren. Pro Ansatz je 1 Feld für das
positive und negative Kontrollserum ansetzen.
 90 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
 Waschen der Objektträger wie oben beschrieben (Nachweis IgA-Antikörper).
 10 µl Anti-human-IgG-Konjugat pro Feld pipettieren.
 60 min bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
 Waschen und trocknen wie oben beschrieben.
 Einbetten mit Einbettungsmedium, Deckglas auflegen.
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Siehe Kurzanweisung Seite 10
Ablesen der Ergebnisse
Objektträger unter dem Fluoreszenz-Mikroskop (Auflicht, Filterkombination für FITC) bei 200bis 400-facher Vergrößerung mikroskopieren. Eine Ablesehilfe mit Fotos ist auf Anfrage
erhältlich. Die Ablesung darf nicht im Randbereich des Objektträgerfeldes erfolgen, da hier
unspezifische Fluoreszenz auftreten kann
Beurteilung der Test-Ergebnisse
Mikroskopisches Bild
Bewertung
Strahlend leuchtende, gelbgrüne Fluoreszenz der mit
Influenzavirus-Antigen-beschichteten Erythrozyten;
negative Kontroll-Erythrozyten sind rot
+++
Leuchtende, gelbgrüne Fluoreszenz der mit InfluenzavirusAntigen-beschichteten Erythrozyten;
negative Kontroll-Erythrozyten sind rot
++
positiv
schwache aber noch deutliche, gelbgrüne Fluoreszenz der
mit Influenzavirus-Antigen beschichteten Erythrozyten;
negative Kontroll-Erythrozyten sind rot
+
Schwach positiv
= Titer
keine Fluoreszenz, alle Erythrozyten erscheinen rot
Ø
negativ
stark positiv
Gültigkeitskriterien
Influenza-Kontrollserum positiv Der im Titerblatt angegebene Endtiter des Kontrollserum
1:10 vorverdünnt
muss erreicht werden
Influenza-Kontrollserum
negativ
Das negative Kontrollserum darf keine Fluoreszenz zeigen.
Interpretation der Ergebnisse
Die Fluoreszenzintensität ist beim IgA-Nachweis meist schwächer als beim IgG-Nachweis.
Der Nachweis von IgA-Antikörpern (Titer 1:150) spricht für eine akute oder kürzlich
zurückliegende Infektion, jedoch können sie nicht bei jeder frischen Infektion bzw. nicht bei
jedem Patienten nachgewiesen werden. Bei einem negativen IgA-Antikörpernachweis kann
auch ein hoher IgG-Antikörpertiter auf eine frische oder kürzlich stattgefundene Infektion
hindeuten: Antikörpertiter, die für eine akute oder kürzliche Infektion sprechen:
IgG Titer
IgA Titer
Influenza A
1: ≥ 2500
≥ 150
Influenza B
1: ≥ 5000
1: ≥ 150
Die angegebenen Titer dienen nur als allgemeine Richtlinie, da sie sich durch die ständig
wechselnden Influenza-Stämme ändern können.
Nach Infektionsbeginn wird das Titermaximum 1 - 2 Wochen nach Infektion erwartet. IgAAntikörper können bis zu 6 Monate nach Infektion mit einem Titer = 1:80 nachgewiesen
werden, während IgG-Titer über einen Zeitraum vom mehr als einem Jahr auf hohem Niveau
persistieren können.
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Fehlerbetrachtung
1.
Grau grünlicher Schleier über das ganze Auftragsfeld - mögliche Ursachen: Waschschritt
nicht ausreichend.
2.
Viele hell fluoreszierende Körnchen zwischen den Erythrozyten - mögliche Ursachen:
Waschschritt nicht ausreichend. Testwiederholung wird empfohlen. Unspezifische
Serumbestandteile wurden nicht abgewaschen.
3.
Positiv Kontrolle erreicht nicht den im Titerblatt angegebenen Endtiter - mögliche
Ursachen: Vorverdünnung des positiven Kontrollserums nicht beachtet.
Sollten im Zusammenhang mit den Reagenzien Qualitätsmängel oder unklare falsch positive
oder falsch negative Ergebnisse auftreten, bitten wir Sie, dies uns zu melden.
Leistungsdaten
Nachweisempfindlichkeit
Die Grenztiter zur Erkennung einer frischen bzw. nur kurze Zeit zurückliegenden Infektion
wurden mit Seren ermittelt, bei denen jeweils eine klinisch gesicherte Infektion vorlag (1).
62 Seren wurden auf IgG- und IgA-Antikörper gegen Influenza A getestet, 60 Seren auf
Antikörper gegen Influenza B.
Influenza A, Antikörper
IgG
IgA
Grenztiter
1:≥ 2500
1:≥ 150
Influenza B, Antikörper
IgG
IgA
Grenztiter
1:≥ 5000
1:≥ 150
Spezifität / Sensitivität
Zur Bestimmung der Sensitivität wurden Patientenseren mit klinisch gesicherter Infektion
verwendet; 62 Seren wurden mit dem FLUORIMMUN Influenza A untersucht, 60 Seren mit
dem FLUORIMMUN B.
Die Spezifitäten des FLUORIMMUN Influenza A und B wurden mit 103 Prä-Epidemieseren
ermittelt.
Influenza A, Antikörper
IgG
IgA
Sensitivität
83,8 %
77,5 %
Spezifität
95,1 %
99,0 %
Influenza B, Antikörper
IgG
IgA
Sensitivität
72,5 %
85,3 %
Spezifität
100 %
100 %
Interferenzen
Störfaktoren wie z. B. hämolytische Seren, antikomplementäre Serumaktivität oder
unspezifische Seruminhibitoren beeinflussen den Test nicht.
Stammspezifität
In einer Versuchsreihe wurden 30 Patientenseren aus einer Influenza A H3N2 – Epidemie mit
dem FLUORIMMUN Influenza A untersucht. Alle Seren zeigten eine bevorzugte
Antikörperantwort für den damals kursierenden Stamm (2).
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Symbole
I
r
L
E
T
M
In vitro Diagnostikum
Bestell-Nummer
Chargen-Nummer
Ungeöffnet verwendbar bis
Lagerung bei x °C bis y °C
Hersteller
Literatur
1)
2)
3)
4)
Döller G., Gerth H-J., (1991) Evaluation of Single Serum Diagnosis after Influenza Infections Lab.
med. 15, 560-562
Döller G., Merk C., Gerth H.-J. (1988) Serologische Influenza-Diagnostik: Ist der
Immunfluoreszenztest
eine
Alternative
zum
Hämagglutionationshemmtest
beim
stammspezifischen Antikörpernachweis? Lab. med. 12, 372-377
Döller G., Döller P. C., Gerth H.-J. (1986) Diagnostic significance of influenza subtype-specific
IgG, IgA and IgM antibodies. J. Biol. Standard. 14, 163-175
Döller P. C., Döller G., Gerth H.-J. (1985) Immunofluorescence test with antigen-loaded
erythrocytes: detection of influenza virus specific IgG, IgA and IgM antibodies. Med. Microbiol.
Immunol. 173, 291-302
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