Immunzytochemischer Nachweis von Tumorzellen - biomed

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wissenschaft & praxis
Immunzytochemischer
Nachweis von Tumorzellen
Zusammenfassung der Diplomarbeit „Immunzytochemischer Nachweis von Tumorzellen im Knochenmark und
peripheren Blut bei Patientinnen mit Mamma- und Ovarialkarzinomen“ von Severin Schöpf, Diplomierung 2001 an
der MTA-Akademie in Innsbruck.
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Ich hatte bereits bei der MTA-Frühjahrstagung am 16. März 2002 in Innsbruck die Möglichkeit, meine Diplomarbeit zu präsentieren.
wissenschaft
Nachdem einige von uns im Jänner 2002 ge& praxis
beten wurden, passende Diplomarbeiten zum
Thema Histologie/Zytologie einzusenden, wurde unter anderem auch meine Diplomarbeit zur Prämierung und Präsentation ausgewählt. So konnte ich erfreulicherweise meine
Diplomarbeit auch noch im Rahmen der Tagung „Histologie–
Zytologie. 3. Gemeinsame Fortbildungstagung für Ärzte und
MTA“ am 18. April im Adolf-Zettel-Bildungsheim der AK
Wien präsentieren und den Preis entgegennehmen.
Einleitung
Die Inzidenz des Mammakarzinoms und auch des Ovarialkarzinoms steigt in den industrialisierten Ländern ständig weiter an. Trotz der Versuche, dies durch Früherkennungsmaßnahmen zu reduzieren, weisen gerade Patientinnen, die vermeintlich einen lokalisierten Tumor haben, später ein Fernrezidiv auf. Es wäre daher sinnvoll und wünschenswert, diese Metastasierung bereits zum Zeitpunkt der
Primäroperation durch den Nachweis disseminierter Tumorzellen im peripheren Blut und Knochenmark der Patientinnen zu erkennen.
Mammakarzinom
Definition und Inzidenz
In den westlichen Industrienationen ist das Mammakarzinom mit 25 % die häufigste bösartige Tumorerkrankung der
Frau. 75 % aller Erkrankungen werden bei Frauen über dem
50. Lebensjahr diagnostiziert. Nach heutigen Inzidenzzahlen
erkranken ca. 10 % der Frauen am Mammakarzinom. Die Inzidenz ist weltweit steigend. Erfreulicherweise wird diese Zunahme der Inzidenz des Mammakarzinoms in den letzten
Jahren von einem Stillstand bzw. sogar von einem Rückgang
der Mortalität begleitet. Dies ist vor allem auf die konsequent angewandten Früherkennungsprogramme und ständig
optimierten therapeutischen Maßnahmen zurückzuführen.
Ätiologie und Risikofaktoren
Die Ätiologie des Mammakarzinomes ist noch weitgehend unklar. Neben einer genetischen Disposition mit entsprechender familiärer Häufung werden auch chemische und
virale Karzinogene sowie hormonale Faktoren diskutiert.
Neben dem Alter und familiärer Belastung (Mutter oder
Schwester mit bekanntem Mammakarzinom) ist derzeit das
Vorliegen einer Mutation im BRCA-1-Gen mit dem höch-
sten Risiko behaftet – zum Glück weisen weniger als 0,5 % der weiblichen
Bevölkerung diese Mutation auf.
Nach aktueller Datenlage führt eine
orale Kontrazeption (Pille) nicht zu einer Erhöhung des Mammakarzinomrisikos.
Lokalisation und Metastasierung
Das Mammakarzinom entsteht
vorwiegend einseitig unter Bevorzugung der oberen äußeren Quadranten
und metastasiert kanalikulär, lymphogen v. a. in die regionären Lymphknoten und schließlich schicksalsentscheidend hämatogen und hier wiederum vorwiegend ins
Knochensystem.
Prognostische Faktoren
Die Bestimmung von Prognosefaktoren beim Mammakarzinom hat das Ziel, den Krankheitsverlauf für die individuelle Patientin möglichst genau abzuschätzen. Zu unterscheiden ist hierbei einerseits zwischen den gesicherten „klassischen“ Prognosefaktoren wie zum Beispiel dem Ausbreitungsstadium des Tumors (pTNM-Status), dem axillären
Lymphknotenbefall, dem histologischen Typ und dem Steroidhormonrezeptorstatus (Östrogen, Progesteron), welcher einen wichtigen therapierelevanten Faktor für eine mögliche
endokrine Therapie darstellt. Andererseits gibt es auch genügend potentiell neue Prognosefaktoren wie zum Beispiel den
immunzytochemischen Nachweis von disseminierten Tumorzellen, tumorassoziierte Proteolysefaktoren (Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp u-PA), den Nachweis von Ki–
67, usw.
Für die Patientin selbst ist jedoch nur entscheidend, ob diese Faktoren Vorhersagen über das Gesamtüberleben erlauben,
oder ob dadurch weitere Therapieentscheidungen mitbeeinflusst werden können.
Die Anforderungen an einen neuen Prognosefaktor sind
sehr hoch, da die Berücksichtigung nicht relevanter Faktoren
nur zu einer Verunsicherung der betroffenen Patientin und oft
auch ihrer behandelnden Ärzte führt, nicht aber zu einer Verbesserung der Abschätzung der individuellen Prognose.
Ovarialkarzinom
Epidemiologie und Risikofaktoren
Das Ovarialkarzinom ist nach dem Endometrium- und
Zervixkarzinom das dritthäufigste Genitalmalignom der
Frau und in etwa 28 % aller malignen Erkrankungen des
weiblichen Genitalbereichs nachzuweisen. Wie bei vielen
Malignomen steigt auch hier die Inzidenz mit zunehmenden
Alter an. Eine weitere pathogenetische Rolle spielen Umwelt- und Ernährungsfaktoren, Infertilität und die medikamentöse Ovulationsauslösung. So wird zum Beispiel das
Ovarialkarzinomrisiko durch die hormonale Kontrazeption
auf 1/4 reduziert.
Metastasierung und Früherkennung
Die Ausbreitung von Ovarialmalignomen erfolgt in erster
Linie intraabdominell und lymphogen in die regionären
Lymphknoten (Stadium II und III). Fernmetastasen (Stadium
IV) finden sich hauptsächlich in den Lungen und der Leber,
seltener im Knochen und Gehirn.
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Abb. 1: 5- bzw. 10-Jahres-Überlebensraten beim Ovarialkarzinom
Aufgrund des häufig symptomarmen Krankheitsverlaufs in
den Frühstadien erfolgt die Diagnosestellung in 70 % der Fälle erst in den fortgeschrittenen Stadien FIGO III und IV. Hierdurch lässt sich die niedrige Gesamt-Fünf-Jahres-Überlebensrate erklären, die zwischen 20 und 40 % liegt (siehe Abb.1).
Die Prognose der Patientinnen in frühen Tumorstadien ist
demgegenüber bedeutend günstiger, wie man deutlich anhand dieses Diagramms (Abb. 1) erkennen kann. Eine Früherkennung und frühzeitige Therapie könnte somit zu einer erheblichen Verbesserung der Gesamtprognose führen.
Zu den klassischen morphologischen Prognosefaktoren
gehören das pathologische Stadium (Staging), der histologische Typ (Typing) und Differenzierungsgrad (Grading). Weitere neuere prognostische Faktoren sind der DNA-Index
(Ploidiestatus) und die S-Phase-Fraktion, eventuell auch die
Überexpression des Onkogens c-erb B2 und des Tumorsupressorproteins p53.
Immunzytochemie – Allgemein
Prinzip
Immunzytochemische Arbeitstechniken dienen der Lokalisation von Zell- und Gewebekomponenten (= Antigen)
mittels immunologischer Methoden, bei denen es zur Reaktion von Antigenen mit Antikörpern kommt. Diese Immunreaktion (Ag/Ak-Reaktion) kann sichtbar gemacht werden
mittels Fluorochromen, radioaktiven Isotopen oder – wie im
Rahmen meiner Diplomarbeit – durch Enzyme.
In der Immunzytochemie werden vor allem monoklonale Antikörper verwendet, da sie gegenüber ihren polyklonalen Äquivalenten etliche Vorteile aufweisen, wie zum Beispiel ihre weitreichende Homogenität, das Fehlen unspezifischer Antikörper, ihre leichte Charakterisierbarkeit sowie
das Fehlen von chargenabhängigen Qualitätsschwankungen.
Die Fixierung stellt immer einen Kompromiss zwischen
Erhaltung der Antigenität und optimaler Konservierung der
Zellen dar. In der Immunzytochemie stellt bereits das
Lufttrocknen eine Form der Fixierung dar. Weitere Möglichkeiten der Fixierung sind die Formalin-, Aceton-, Methanol- oder Ethanolfixation.
Fragestellung
Der Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut und
im Knochenmark bei Patientinnen mit Mamma- und Ovarialkarzinom könnte bei folgenden klinischen Fragestellungen
relevant sein:
■ Frage nach Mikrometastasen
■ Diagnose von Primärtumoren („Tumorsuche“)
■ Therapie- und Verlaufskontrolle
Die prognostische Bedeutung disseminierter Tumorzellen und eine eventuelle Korrelation mit klinischen Parametern
sollten im Rahmen einer Studie der Universitätsklinik für
Frauenheilkunde in Innsbruck evaluiert werden. Durch neue
und sensitivere Nachweisverfahren für disseminierte Tumorzellen und Aussagemöglichkeiten über deren klinische
Bedeutung besteht vielleicht einmal die Möglichkeit, Patientinnen besser Risikogruppen zuordnen zu können und damit
einer adäquaten Therapie zuzuführen.
Aufgabe meiner Diplomarbeit war es nun, die Häufigkeit, Menge und Charakteristika zirkulierender Tumorzellen
in Blut und Knochenmark bei Patientinnen mit Mammaund Ovarialkarzinom mittels Immunzytochemie nachzuweisen und anschließend diese Methode mit der der immunomagnetischen Beads zu vergleichen. Eine weitere Fragestellung lautete: Besteht eine Korrelation mit dem Lymphknotenstatus beziehungsweise mit dem Tumor-Grading?
Material und Methode
Material
Im Rahmen der Primäroperation von 19 Patientinnen
mit Mamma- oder Ovarialkarzinomen und benignen Veränderungen der Mamma/des Ovars wurde nach Einwilligung der Patientinnen eine Blutentnahme und eine Knochenmarksaspiration durchgeführt.
Bei meiner Diplomarbeit standen mir von diesen 19 Patientinnen jeweils zumeist 6 Objektträger (OT) mit Blut,
Knochenmark vor (KM prä) und Knochenmark nach
Primäroperation (KM post) zur Verfügung.
Nach Austestung der optimalen Fixationsmethode und
der optimalen Verdünnung des verwendeten Primärantikörpers (A45-B/B3) mit Hilfe bekannter Tumorzelllinien wurden
pro Patient zumindest 3 OT mit Blut und je 4 OT mit Knochenmark prä und post immunzytochemisch gefärbt und
anschließend auf das Vorhandensein von möglichen Tumorzellen untersucht.
Vorbehandlung des verwendeten Materials
Die Knochenmarksaspirationen wurden mit Aspirationsnadeln aus dem Beckenkamm unmittelbar vor (KM prä)
und direkt im Anschluss (KM post) an die Primäroperation
durchgeführt. Hierbei wurden jeweils 8-10 ml Markblut in heparinisierte Spritzen aspiriert. Die Bestandteile des Aspirates
wurden anschließend über einen Dichtegradienten differentialzentrifugiert, wodurch man in der Schicht über dem Lymphoprep die mononukleären Zellen erhalten hatte (MNC =
Mono Nuclear Cells).
Diese MNCs wurden vorsichtig abgehoben und in PBS
(Phosphat Buffered Solution) mit 1%igem HSA (Humanem
Serum Albumin) gewaschen, resuspendiert und in Röhrchen
zu je 10 Mio. Zellen pro ml bereitgestellt. Diese MNCs wurden mit 10 µl von einem DNA-bindenden Farbstoff (HoechstStain) 30 min bei 37 ºC im Wärmeschrank inkubiert und
anschließend im Eisbad wieder auf 4 ºC heruntergekühlt.
Gewaschene und mit MOC 31 konjugierte Beads wurden
dann mit MNCs für 30 min bei 4 ºC rotierend inkubiert.
Anschließend wurde die Zellsuspension mit PBS/1 % HSA
verdünnt, in eine Magnethalterung gespannt und dort 2–3
min belassen, damit die an die Beads gebundenen Tumorzellen von den nichtgebundenen Zellen durch Abkippen des
Überstandes getrennt werden konnten. Die noch verbliebenen
Zellen wurden auf einen Objektträger (OT) übertragen, ein
Deckglas daraufgegeben und noch am selben Tag unter dem
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Fluoreszenzmikroskop auf das Vorhandensein von sogenannten Rosetten durchsucht (= Tumorzellen, die von mindestens 5 Beads flankiert sind). Nach erfolgter Auswertung
wurde das Deckglas vorsichtig vom OT genommen, mit der
zellhältigen Seite nach oben auf einen weiteren OT mit Proclear befestigt und nach Lufttrocknung bei 4 °C im Kühlschrank
archiviert.
Kontrollmaterial
Bei allen immunzytochemischen Färbungen wurden eine
Positivkontrolle und 2 Negativkontrollen mitgeführt. Als
Positivkontrollen wurden mir freundlicherweise vom Biochemischen Labor der Univ.-Frauenklinik Innsbruck für das
Mammakarzinom BT-20 und für das Ovarialkarzinom Ovcar 3 als Tumorkontrollzelllinien zur Verfügung gestellt.
Bei jedem Lauf wurden 2 Negativkontrollen mitgeführt.
Bei der 1. Negativkontrolle wurden bekannte Tumorzellen im
Sinne einer Verfahrenskontrolle statt mit Primärantikörper
(A45-B/B3) nur mit RPMI inkubiert, um zu zeigen, dass wirklich nur der Primärantikörper für die spezifische Reaktion verantwortlich ist. Als 2. Negativkontrolle wurden PBMCs eines gesunden Probanden herangezogen, um sicherzustellen,
dass der Primärantikörper keine unspezifischen Reaktionen
mit regulär im Blut vorkommenden PBMCs eingeht.
Die Kontrollen zeigten bei allen durchgeführten immunzytochemischen Färbungen das geforderte Ergebnis.
Verwendeter Primärantikörper
Bei dem verwendeten Primärantikörper A45-B/B3 handelt
es sich um einen gereinigten monoklonalen Panzytokeratinantikörper der Maus, der spezifisch gegen die epithelialen
Zytoskelettkomponenten von CK 8, CK 18 und CK 19 gerichtet ist. Dieser Antikörper wurde mir dankenswerterweise aus einer ordentlichen Dotation des Biochemischen Instituts der Univ.-Frauenklinik Innsbruck zur Verfügung gestellt.
Es ist dies ein monoklonaler Antikörper der Immunglobulinklasse IgG1, der speziell zur Detektion epithelialer Zellen geeignet ist, die normalerweise nicht im Knochenmark und
peripheren Blut vorkommen sollten.
Methoden
Neben der direkten Methode, 2-Schritt- bzw. 3-Schrittindirekten-Methode und Avidin-Biotin-Complex-Methode
(ABC-Methode) gibt es auch noch die von mir angewandte lösliche Enzym-Immunkomplexmethode (APAAP-Methode).
Angewandte Methode – APAAP
Enzym-Anti-Enzymkomplex-Techniken werden nach dem
jeweils verwendeten Enzym-Immunkomplex benannt, zum
Beispiel:
PAP
(Peroxidase-Anti-Peroxidase)
APAAP (Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische
Phosphatase)
Diese Methode nützen die präformierten löslichen Enzym-Anti-Enzym-Immunkomplexe zwischen Antigen (= Enzym) und den dagegen gerichteten Antikörper (siehe Abb. 2).
An das Gewebsantigen lagern sich der Reihe nach an:
1. Unkonjugierter Primärantikörper
2. Unkonjugierter Sekundärantikörper
3. Lösliche Enzym-Anti-Enzymkomplexe
4. Substratlösung
Als Hauptvorteil dieser Methode ist die sehr
hohe Sensitivität zu nennen, wodurch diese Technik zu einer der empfindlichsten der Immunzytochemie zu zählen ist. Angewandt wird sie vor allem zur Bestimmung von
Antigenen in niedrigen
Konzentrationen oder zur
Bestimmung eines Tumorursprungs, um somit
eine genauere Klassifikation möglich zu machen.
Der große Vorteil der
APAAP- gegenüber der
PAP-Methode, die ja
Abb. 2: Lösliche Enzym-Immunauch auf löslichen Imkomplex-Methode
munkomplexen beruht,
besteht darin, dass bei der
APAAP-Methode der störende Effekt der endogenen Peroxidase-Aktivität wegfällt. Daher wird diese vor allem für
Blut- und Knochenmarkausstriche empfohlen. Die endogene
Phosphatase-Aktivität des Knochengewebes, der Leber und
der Niere sowie einiger Leukozyten kann durch den Zusatz
von 0,2–1 mM Levamisol zum Chromogen Fast Red unterdrückt werden. Es werden also keine zusätzlichen Blockierungsschritte benötigt (im Gegensatz zur PAP-Methode).
Ermittlung der optimalen Fixationsmethode
Um die optimale Fixationsmethode der Patientenproben
zu ermitteln, wurde mit Tumorkontrollzellen eine Reihe von
Vorversuchen durchgeführt.
Ethanolfixation für 10 Minuten ergab zwar viele sehr
schön positive (= intensiv rote) Tumorzellen, leider gingen jedoch auch einige Tumorzellen zugrunde.
Als optimale Fixationsmethode hat sich die Methanolfixation für 10 Minuten herausgestellt, da dabei 100 % der
Tumorzellen ein positives (= intensiv rotes) Ergebnis zeigten.
Austestung der optimalen Antikörperkonzentration
Als optimale Verdünnung des Primärantikörpers A 45B/B3 hat sich durch eine Reihe von Vorversuchen (1:10,
1:50, 1:100, 1:200, 1:400) jene von 1:200 herausgestellt.
Mit dieser Verdünnung gelang es am besten, einen positiven
Nachweis der Zytokeratinkomponenten bei allen Tumorzellen durch eine intensiv rote Anfärbung im Zytoplasma der
Zellen zu zeigen. Es war dabei praktisch keine störende Hintergrundfärbung zu erkennen (siehe Abb. 3 zum Vergleich ein
positives Resultat einer immunomagnetischen Methode,
Abb. 4).
Durchführung des immunzytochemischen Nachweises
Als Primärantikörper wurde der monoklonale Antikörper
A45-B/B3 verwendet, da normal im Blut- bzw. Knochenmarkausstrich keine epithelialen Zellen vorkommen sollten.
1. Zunächst wurden die OT in abgedeckten Küvetten mit
Methanol für 10 Minuten lang fixiert, anschließend einzeln herausgenommen und der gewünschte Bereich mittels eines PAP-PEN-Stiftes (= Fettstift) umrandet.
2. Die OT wurden mit dem Primärantikörper, der 1:200
mit RPMI verdünnt worden ist, beschichtet und für 60
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Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ab diesem Zeitpunkt durften die OT nicht mehr austrocknen!
Im nächsten Schritt wurde der Primärantikörper vorsichtig an einem Zellstoff abgeklopft, die OT in Küvetten
mit Tris-Spülpuffer gegeben und durch vorsichtiges
Schwenken zweimal gewaschen.
Nun erfolgte für 30 Minuten bei Raumtemperatur die
Inkubation mit dem Brückenantikörper RAM (= Sekundärantikörper), der zuvor 1:30 mit RPMI und Humanserum (6T + 1T) verdünnt wurde.
Die OT wurden erneut in die Küvetten transferiert und
zweimal vorsichtig mit Tris-Spülpuffer gewaschen.
Der nächste Inkubationsschritt in der feuchten Kammer
dauerte 60 Minuten. Die OT wurden mit dem löslichen
Enzym-Immunkomplex APAAP beschichtet, der zuvor
1:100 mit RPMI verdünnt wurde. In dieser Zeit konnte
nun die Fast-Red-Lösung hergestellt werden.
Nach zweimaligem vorsichtigem Spülen kamen die OT
dann für 30 Minuten in die frisch hergestellte Fast-RedLösung.
Es folgte ein kurzes Spülen der OT mit AD und für 15–20
Sekunden die Kerngegenfärbung mit verdünntem Hämalaun (1:2 mit AD).
Im letzten Schritt wurden die OT noch mit kaltem Leitungswasser gebläut, diese Bläuung mit AD gestoppt
und die OT mit Kaysers Glyceringelatine eingedeckt.
CAVE: Nicht mit Alkohol entwässern, da Fast Red in Al(C
kohol löslich ist!!)
Abb. 3: Positivkontrolle (Immunzytochemie)
Ergebnisse
Im Rahmen meiner Diplomarbeit wurde das periphere
Blut und Knochenmark von 19 Patientinnen mit Mammaund Ovarialtumoren mit der immunzytochemischen APAAPMethode auf das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen untersucht. Die Hauptfragestellung war der direkte
Vergleich mit der immunomagnetischen Methode, die schon
zuvor am selben Material durchgeführt wurde.
Nach Austestung der optimalen Fixationsmethode und
der optimalen Verdünnung des verwendeten Primärantikörpers (A45-B/B3) mit Hilfe bekannter Tumorzelllinien wurden
pro Patient zumindest 3 OT mit Blut und je 4 OT mit Knochenmark prä und post immunzytochemisch gefärbt.
Nach der immunzytochemischen Färbung ging es nun
darum, akribisch alle OT auf das Vorhandensein von etwaigen Tumorzellen unter dem Mikroskop zu durchsuchen. Dies
stellte sich als eine äußerst schwierige und zeitaufwändige
Arbeit heraus, da die Dynabeads der immunomagnetischen
Methode, mit der das Blut/Knochenmark schon zuvor bearbeitet wurde, sich als sehr störend für das Durchscreenen
nach Tumorzellen erwiesen. Es wurden prinzipiell all jene
Proben als positiv bewertet, bei denen mehr als eine Zelle
ein positives Ergebnis (= Tumorzelle) aufwiesen. Eine weitere Bedingung war, dass zumindest eine Tumorzelle im Knochenmark (prä oder post) nachgewiesen werden musste. Alle fraglichen Ergebnisse wurden mit Negativ bewertet.
Korrelation der Ergebnisse – Mamma
Es bestand eine deutliche Korrelation der Ergebnisse der
immunzytochemischen Methode mit jener der immunomagnetischen Beads. Es wurden keine Tumorzellen bei benignen
Veränderungen der Mamma gefunden.
Bei den Karzinomen kam es in 8 von 9 Fällen zu einer
Übereinstimmung beider Methoden. Nur in 1 Fall mit Sta-
Abb. 4: Positivkontrolle (HOECHST-Stain)
dium pT2N0 (Grad III) kam es mittels der immunzytochemischen Methode zu einem positivem Ergebnis, wohingegen mit der immunomagnetischen Methode keine Tumorzellen gefunden werden konnten.
Weiters bestand auch eine deutliche Korrelation der immunzytochemischen Methode mit der Stadieneinteilung und
dem Lymphknotenstatus.
Korrelation der Ergebnisse – Ovar
Bei den Ovarialtumoren hingegen kam es zu einer bedeutend höheren Diskrepanz. Es kam bei drei von vier benignen Veränderungen des Ovars zu einem positiven Ergebnis – beide Methoden zusammengezählt. Diese benignen Veränderungen wurden jedoch eigentlich als vermeintliche „Negativkontrollen“ mitgeführt!
Was die vier Ovarialkarzinome anbelangt, so konnten
mit der immunzytochemischen Methode bei allen Tumorzellen im Knochenmark nachgewiesen werden.
In einem Fall kam es zu einem falsch positivem Ergebnis,
da hierbei nur in einem von sechs OT mit Blut 11 CK-positive Zellen nachgewiesen werden konnten und rein morphologisch eher Epithelien der Haut zuzuordnen waren. Dies
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alles deutete eher auf eine Kontamination im Rahmen der
Vorbehandlung des Materials hin (siehe auch 4.3.).
Mögliche Ursachen für die Diskrepanz
Auch wenn das Ergebnis bei den Patientinnen mit Mammakarzinom recht gut mit der Immunzytochemie korrelierte, gab es vor allem bei den benignen Tumoren des Ovars eine doch deutliche Diskrepanz. Die Ursache dafür ist in den
folgenden Punkten zu suchen:
■ Frage: Prinzipiell wird bei beiden Methoden ein anderes
Antigen in der gesuchten Tumorzelle nachgewiesen, welches nicht zwangsläufig bei jeder Tumorzelle in derselben
Art und Weise sowie Intensität exprimiert werden muss.
Dadurch ist erklärbar, dass nicht in allen Fällen eine Übereinstimmung beider Methoden gegeben ist.
■ Frage: Als größtes Problem stellte sich jedoch die Vorbehandlung der OT mit der immunomagnetischen Methode heraus, da hierbei für die Auswertung des gewonnenen
Materials unter dem Fluoreszenzmikroskop ein Deckglas auf die Zellsuspension gegeben werden musste. Durch
das Herunterlösen des Deckglases nach erfolgter Auswertung wurden die Zellen zum Teil in Mitleidenschaft gezogen. Wenn man bedenkt, dass es bei diesen Untersuchungen darum geht, eine Tumorzelle unter 106 normalen Zellen zu erfassen, kann man dieses Problem nur
schwer tolerieren.
■ Frage: Ebenfalls als sehr störend erwiesen sich die Dynabeads (= magnetische Kügelchen, die mit MOC 31 beladen sind), da sie die Auswertung unter dem Mikroskop
durch Überlagerung mancher Zellen stark erschwerten
und auf diese Weise zu einigen fraglichen Ergebnissen
führten. Zudem zog es die Dynabeads – wahrscheinlich
aufgrund ihrer geringen Größe und eher hohen Dichte –
vermehrt an den Rand in den Bereich der PAP-PEN-Umrandung. Dort sorgten sie wiederum vermehrt für das zuvor erwähnte Phänomen der Überlagerung von Zellen
(siehe Abb. 5).
■ Frage: Aufgrund doch einiger Waschschritte bestand zudem die Gefahr, dass sich Zellen herunterlösen könnten.
Diese Gefahr wurde jedoch durch reichliche Vorversuche zur Bestimmung der optimalen Fixationsmethode auf
ein Minimum reduziert.
In einem Fall kam es bei einem Ovarialkarzinom zum
Nachweis von 11 zytokeratinpositiven Zellen im Blut, wobei
alle 11 nur in einem der 6 durchgescreenten OT gefunden
wurden. Zudem wiesen die detektierten Zellen keine zytologischen Zeichen von maligne transformierten Zellen auf und
waren rein morphologisch eher den Epithelien der Haut zuzuordnen. Diese Punkte sprechen vielmehr für eine Kontamination des OT mit Epithelien der Haut. Diese Fehlerquelle sollte bei zukünftigen Untersuchungen stets in Betracht
gezogen werden.
Zusammenfassung
Das Mammakarzinom zählt zu den häufigsten Tumoren
der Frau (25 %). Das Ovarialkarzinom ist mit ca. 28 % das
dritthäufigste Genitalmalignom der Frau. Die Inzidenz des
Mammakarzinoms steigt in den industrialisierten Ländern
weiter an. Trotz der Versuche, dies durch Früherkennungsmaßnahmen zu reduzieren, weisen oft Patientinnen, die vermeintlich einen lokalisierten Tumor haben, später ein Fern-
Abb. 5: Überlagerung durch Dynabeads
rezidiv auf. Eine hämatogene Metastasierung ist für das weitere Schicksal der Patientinnen meist von größter Bedeutung.
Es wäre daher sinnvoll und wünschenswert, diese Metastasierung bereits zum Zeitpunkt der Operation durch den
Nachweis disseminierter Tumorzellen im peripheren Blut
und Knochenmark der Patientinnen zu erkennen.
Es stellte sich heraus, dass eine deutliche Korrelation zwischen der Immunzytochemie und der Methode der immunomagnetischen Beads nur bei Patientinnen mit Mammakarzinom gegeben war. Bei den Patientinnen mit Ovarialkarzinom bestand eine höhere Diskrepanz. Vor allem kam es bei
den vermeintlichen „Negativkontrollen“ von Patientinnen
mit benignen Veränderungen des Ovars in drei von vier Fällen zu einem positiven Ergebnis. Als störend hat sich für die
Immunzytochemie die Vorbehandlung durch die immunomagnetische Methode herausgestellt. Es wäre daher interessant, bei nachfolgenden Untersuchungen mit unbehandeltem Patientenmaterial nochmals die Immunzytochemie anzuwenden, um anschließend die Ergebnisse vergleichen zu
können.
Und zuletzt noch ein kurzer Blick in die nahe Zukunft:
Durch die Identifikation und Charakterisierung von im
Blut bzw. Knochenmark zirkulierenden Tumorzellen mit metastatischem Potential wäre es in Zukunft denkbar, durch
den Einsatz monoklonaler Antikörper, die gezielt gegen eine
spezifische Antigendeterminante der Tumorzelle gerichtet
sind, diese Tumorzelldissemination bereits im Keim zu unterdrücken. Zudem könnten daraus wichtige Rückschlüsse
und Informationen über den Prozess der Metastasierung gewonnen werden!
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Diplomarbeit, MTA-Akademie Innsbruck (2001), ausgeführt am
Morphologischen Labor der Universitätsklinik für Frauenheilkunde in Innsbruck und hervorragend betreut von A. Univ.-Prof.
Dr. Elisabeth Müller-Holzner.
Herzlich bedanken möchte ich mich auch noch beim gesamten
Team des Morphologischen Labors, vor allem bei den Diplomierten med.-techn. Analytikerinnen Martina und Vera für die Einarbeitung auf dem Gebiet der Immunzytochemie und bei Tommy
für die Recherchierung aller Patientendaten.
Severin Schöpf
[email protected]