Analyse Metabolischer Netzwerke
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Analyse Metabolischer Netzwerke Hauptseminar: Aktuelle Probleme der Bioinformatik Barbara Hummel LMU München SS2008 1 2 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 3 1. Einleitung 5 2. Analyse metabolischer Netzwerke 7 2.1 Elementary Mode Analyse 7 2.1.1 Analyse 7 2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten 10 2.2 Petri Netze 11 2.2.1 Allgemeines 11 2.2.2 Anaylse von Petri Netzen 12 2.2.3 Weitere Eigenschaften: Siphons und Traps 14 3. Vergleich beider Methoden 15 4. Zusammenfassung 15 5. Literatur 16 3 4 1. Einleitung Der Metabolismus ist zuständig für die Aufnahme, den Transport und die chemische Umwandlung von Stoffen in einem Organismus. Dabei entstehen Stoffwechselprodukte, welche im Organismus weiterverwendet oder auch an die Umgebung abgegeben werden. Dies geschieht durch biochemische Vorgänge, welche durch Enzyme katalysiert werden. Enzyme spielen eine wesentliche Rolle für den Metabolismus. Sie setzen die Aktivierungsenergie der Metaboliten herab und katalysieren somit die Reaktion zwischen diesen, ohne dabei selbst verbraucht zu werden. Man unterteilt den Metabolismus in zwei chemische Transformationstypen: den Katabolismus und den Anabolismus. Diese beiden Typen sind miteinander energetisch gekoppelt. Im Katabolismus erfolgt der Abbau von Stoffwechselprodukten zu einfachen Molekülen. Dies dient der Entgiftung des Organismus, sowie der Energiegewinnung. Die Energie, die hierbei entsteht, wird nun im Anabolismus zum Aufbau körpereigener Substanzen verwendet (zum Beispiel Fettsäuren, Aminosäuren, Nukleinsäuren). [1][2] Alle Reaktionen, die im Metabolismus vorkommen, können zu einem metabolischen Netzwerk zusammengefasst werden. Die Basiselemente eines metabolischen Netzwerkmodels sind die Substanzen mit ihren Konzentrationen und die Reaktionen, die die Konzentration der Metaboliten ändern. Außerdem unterscheidet man zwischen zwei verschiedenen Arten von Prozessen. Zum einen Enzym-katalysierten Reaktionen und zum anderen Transportprozesse, die durch Transportproteine und Poren vollzogen werden. Da metabolische Netzwerke recht komplex und damit auch sehr unübersichtlich sind, unterteilt man sie in funktionale Einheiten (metabolische Pfade). Selbst in einem so einfachen Organsimus wie E.coli laufen mehr als Tausend chemische Reaktionen ab. Als metabolischen Pfad bezeichnet man eine Abfolge von Reaktionen, die zusammen für die Umsetzung eines Stoffes in einen anderen sorgen. Die einzelnen Reaktionen sind dabei im Wesentlichen durch das katalysierende (die Reaktion beschleunigende) Enzym charakterisiert. Wichtige Beispiele für metabolische Pfade sind der Citratzyklus oder die Glykolyse. Bei der Glykolyse wird Glukose in Pyruvat umgewandelt, bei gleichzeitiger Synthese von geringen Mengen an ATP. [3] Eine sich nicht ändernde Eigenschaft von metabolische Netzwerken ist die Stöchiometrie der Reaktionen im Metabolismus, die das molare Verhältnisse von Substrat und Produkt zwischen Anfang und Ende einer Reaktion beschreibt. Sie beschreibt die Architektur oder Topologie dieser Metaboliten. Enzyme gleichen schwankende Substrat-Konzentrationen aus, indem sie ihre Tätigkeit dem Angebot anpassen, um z.B. schädliche Schwankungen des Blutzuckerspiegels ausgleichen, indem z.B. Insulin ausgeschüttet wird. Um Modelle metabolischer Pfade werden künstliche Systemgrenzen gezogen, d.h. das System ist für manche Metaboliten begrenzt, während andere Metaboliten die Systemgrenze passieren dürfen (siehe Abbildung 1). Metabolische Pfade sind charakterisiert durch ihre Flüße. Es wird zwischen extern und internen Flüßen unterschieden. Die internen Flüße sind Reaktionsflüsse innerhalb der Systemgrenzen, während externe Flüße die Systemgrenzen überqueren (Abbildung 1). Ein Fluß definiert eine Kette von Reaktionen, die ein Edukt über mehrere Zwischenschritte in ein bestimmtes Produkt umwandeln. In einer solchen Reaktionskette wird ein Metabolit, das durch ein Enzym umgewandelt wird, durch ein anderes Enzym oder durch andere Transportvorgänge nachgeliefert, so dass die ursprüngliche Konzentration dieses Metaboliten wieder erreicht wird. Daher ändert sich die durchschnittliche Konzentration der einzelnen Metaboliten nicht.[4] Diese Eigenschaft wird Fließgleichgewicht (bzw. steady state) genannt. Der steady state ist der Zustand, indem die Menge an fließenden Metaboliten immer gleich bleibt. Die Metaboliten befinden sich im Fluss, die Konzentration im betrachteten System ändert sich jedoch nicht. Der metabolische Pfad eines betrachteten Sets an Substraten und Produkten ist stoichiometrisch ausgeglichen. Eine Flußverteilung ist eine bestimmte Menge an Reaktionsflüßen innerhalb eines Netzwerks. [4][5] 5 Abb.1: Pfad eines einfachen Reaktionsnetzwerkes mit Cofaktoren und Nebenprodukten, bei dem die externen Flüße mit bi bezeichnet werden, und die internen Flüße mit vj. [4] Aber warum ist man überhaupt daran interessiert, metabolische Pfade zu analysieren? Nachdem man die Funktion einzelner Proteine herausgefunden hat, möchte man das Zusammenspiel dieser Proteine in metabolischen Pfaden untersuchen. Zum einen können Aussagen über die Netzwerktopologie gemacht werden. So kann untersucht werden, wie flexibel und robust ein metabolisches Netzwerk ist. Dazu wird ein bestimmtes Enzym ausgeschalten, so dass es seine Funktion nicht mehr ausführen kann, um dann zu analysieren, wie wichtig dieses Enzym für den Metabolismus ist. Gibt es mehrere alternative Flüße, die von einem Metaboliten zu einem anderen führen und so die ausgeschaltete Reaktion umgehen können, spielt das Enzym keine so wichige Rolle. Andernfalls würde der Metabolismus zusammenbrechen. Dies gibt einen ersten Anhaltspunkt für die Target-Identifizierung und die Entwicklung von Medikamenten.[6] Zum anderen kann die Analyse metabolischer Netzwerke beim Metabolic Engineering hilfreich sein, bei dem Gene im Stoffwechsel von Mikroorganismen gezielt verändert werden, um deren Produktionsleistung zu verbessern. Mikroorganismen werden unter anderem als industrielle Bioreaktoren für die Massenproduktion von Feinchemikalien, Enzymen sowie für die Herstellung von Pharmawirkstoffen, Agrochemikalien und Lebensmitteladditiven eingesetzt. Aufgrund dieser vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten gibt es ein großes ökonomisches Interesse, die Eigenschaften der entsprechenden Produktionsstämme zu verbessern. Mit gentechnischen Methoden versucht man dabei, den mikrobiellen Produktionsstamm durch Eingriffe in den Stoffwechsel gezielt so zu verändern, daß er in der Lage ist, die gewünschten biochemischen Reaktionen mit hoher Effizienz durchzuführen.[7] Außerdem können die metabolischen Pfade eines Organismus, dessen Genom erst neu sequenziert ist bzw. noch keine Information zu dessen Stoffwechsel bekannt sind, mithilfe der Netzwerkanalyse rekonstruiert werden. Dazu verwendet man Referenz-Netzwerke und untersucht, welche Pfade der Organsimus aufgrund seines Genotyps, d.h. aufgrund seiner Enzyme bzw. Proteine, ausbilden kann. 6 2. Analyse metabolischer Netzwerke 2.1 Elementary Mode Analyse Elementary Mode Analyse ist ein mathematischer Ansatz, welcher Methoden der linearen Algebra verwendet. Sie bietet gute Möglichkeiten, funktionelle und strukturelle Eigenschaften in metabolischen Netzwerken zu analysieren. 2.1.1 Analyse Die einzigen Informationen, die bei der Analyse benötigt werden, sind die Angabe, welche Substanzen externen und welche internen sind sowie die einzelnen enzymatischen Reaktionen und deren Richtungen. Der Regulationszustand wird nicht beachtet, ebenso wie kinetische Parameter. Bei der Analyse von metabolischen Netzwerken ist man daran interessiert, zu untersuchen, welche Flüße es in einem Netzwerk gibt. Dazu wird zunächst die Stöchiometrie Matrix dieses Netzwerkes erstellt, die die Einzelflüße bzw. einzelne Reaktionen samt ihrer Richtung enthält. Die Stöchiometriematrix S ist eine m x n Matrix, wobei m der Anzahl an Metaboliten und n der Anzahl an Reaktionen entspricht, die innerhalb des Netzwerks vorkommen. Das Element S ij der Matrix S entspricht dem stochiometrischen Koeffizienten des Reaktanten i in der Reaktion j. V j ist der Fluss durch diese metabolische Reaktion. Die stöchiometrischen Koeffizienten sind ganze Zahlen, welche die Anzahl der Moleküle repräsentieren, die in einer entsprechenden Reaktion umgesetzt werden. Diese Koeffizienten sind Konstanten, das heißt sie sind nicht abhgängig von äusseren Faktoren, wie zum Beispiel der Temperatur, Druck, pH-Wert, etc. Abb.2: Einfaches Beispiel eines Netzwerkes mit dazugehöriger Stöchiometriematrix [5] Aber wie werden nun mithilfe der Stöchiometriematrix die Flüße bestimmt? Dazu muss zunächst betrachtet werden, wie die Konzentrationsänderung der einzelnen Metaboliten durch die Flüße definiert ist. Die Konzentrationsänderung wird durch folgende Gleichung berechnet : dx =S⋅v dt (1) S ist die Stöchiometriematrix und v ist der Vektor mit den Teilflüßen durch den metabolischen Fluß. Da bei der Analyse von metabolischen Netzwerken einen Steady-State angenommen wird, ändert sich die Konzentration der Metaboliten nicht. Daher kann die Gleichung (1) umgewandelt werden in: 7 S∗v=0 (2) Der Vektor v bezeichnet die relative Aktivität jedes Flußes. Nimmt man Beispielsweise das Netzwerk aus Abbildung 1 , welches 9 Einzelreaktionen (6 interne Reaktionen v j und 3 externe bi) enthält. Ein dazugehöriger Vektor v hätte die Dimension 1 x 9, bei dem jeder Eintrag die Häufigkeit jeder Reaktion zusammen mit ihrer Richtung enthält. Alle Vektoren v, die durch Lösen des linearen Gleichungssystems bestimmt werden, bilden einen Vektorraum, der der Nullraum (NulS) von S genannt wird. Dies entspricht allen Flüßen, die durch das Netzwerk fließen können. Jeder Lösungsvektor v stellt einen Elementary Mode dar. Elementary Modes sind definiert als eine minimale Menge von Enzymen, die unter Steady State Bedingungen zusammenarbeiten, um ein Edukt über mehrere Zwischenprodukte in ein Produkt umzuwandeln. Elementary Modes unterliegen folgenden drei Bedingungen [6]: ▪ Die Steady-State Bedingung, d.h. die Menge an fließenden Metaboliten bleibt immer gleich. ▪ Die Bedingung der Durchführbarkeit, d.h. nur thermodynamisch realisierbare Flüße werden betrachtet. ▪ Die Bedingung der Unzerlegbarkeit, d.h. dass die Eelementary Modes nicht weiter aufgeteilt werden können, so dass Untereinheiten entstehen, die als funktionelle Einheit bestehen können Abb.3: Einfaches Beispiel eines Netzwerks mit den Elementary Modes [11] Diese Vektoren des Nullraums sind noch linear abhängig voneinander. Es kann eine Basis dieser Vektoren bestimmt werden, die alle Vektoren enthält, die linear unabhängig voneinander sind und den Nullraum aufspannen. Bei der mathematischen Berechnung der Basis wird nicht darauf geachtet, ob die resultierenden Basisvektoren biochemisch sinnvoll sind. So kann es sein, dass internen Reaktionen ein negatives Vorzeichen erhalten, was aber bedeutet, dass kein durchgehender Fluß möglich ist. Daher müssen die Basen in den meisten Fällen noch transformiert werden. Dabei werden neue Basisvektoren durch lineare Kombination der alten erzeugt, so dass bei den internen Reaktionen keine negative Vorzeichen vorhanden sind. 8 Abb.4: Transformation der Basis [5] Der Unterschied diese Basisvektorendarstellung zur Stöchiometriematrix besteht darin, dass bei der Stöchiometriematrix einzelne Teilflüße bzw. Reaktionen betrachtet werden, während bei den Basisvektoren ganze Flüße betrachtet werden. So stellen die Spalten in Abbildung 4 ganze Flüße da, die Zeilen die einzelnen Reaktionen, während bei der Stöchiometriematrix die Spalten die Reaktionen und die Zeilen die einzelnen Metaboliten repräsentieren. Diese Basisvektoren werden auch Extreme Pathways genannt und spannen die sogenannte Convex Cone in einem mehrdimensionalen Raum auf (Abbildung 5). Die Dimension dieses Raumes wird bestimmt durch die Anzahl der einzelnen Reaktionen. Innerhalb dieser Cone liegen alle Flüße durch das metabolische Netzwerk, die biochemisch gesehen möglich wären. Dies entspricht dem Genotyp. Daher kann jede real existierende Flußverteilung durch Linearkombination dieser Basisvektoren dargestellt werden. Diese Basisvektoren repräsentieren die unterliegenden Pfade, die grundlegend für das entsprechende metabolische Netzwerk sind. Alle Flußverteilungen die durch ein Set von Enzymen durchgeführt werden können, sind also eine Linearkombination dieser Basisvektoren. Fig.5: Convex Cone [4] Im Gegensatz zu den Elementary Modes sind die Extreme Pathways linear unabhängig zueinander. Daher ist die Anzahl der Elementary Modes meist größer als die der Extreme Pathways, da die Elementary Modes als Linearkombination aus den Extreme Pathways dargestellt werden können. [5][8] 9 2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten ▪ Optimale Produktionsleistung: Elementary Modes werden verwendet um alle möglichen Pfade von einem Metaboliten zu einem anderen zu erkennen. In einem Netzwerk gibt es oftmals mehrere Pfade von einem Edukt zu einem gewünschten Produkt. Daher ist es recht interessant den Weg zu ermitteln, der den größten molaren Ertrag, d.h. das größte Verhältnis zwischen Produkt und Edukt, liefert. Meistens unterscheiden sich die Erträge von optimalen und suboptimalen Pfaden nur geringfügig. Daher werden teilweise auch suboptimale Flüße für die Produktion verwendet, wenn diese biochemisch leichter zu realisieren sind oder zusätzlich bestimmte nützliche Nebenprodukte liefern. Nachdem man den optimalen Elementary Mode ausgewählt hat, wird der Umsatzertrag berechnet, indem man die Stöchiometrie der externen Metaboliten ausrechnet. Dazu werden die Werte aus der Stöchiometriematrix und eine bestimmte Anfangskonzentration angenommen. Anschließend wird der Fluß solange durchlaufen, bis die Anfangskonzentration aufgebraucht ist. Daraus kann die Menge des Produkts berechnet werden. Ein Beispiel ist die Tryptophan-Synthese in E.coli. Tryptophan wird aus Glukose und Ammonium hergestellt und ist von großem biotechnologischen Interesse. Die Analyse ergab, dass es zwei Elementary Modes gibt, die den maximalen Ertrag erzielen. Dabei werden 105 mol Tryptophan aus 233 mol Glukose erzeugt, was einer Ertragrate von 0.451 entspricht. Außerdem gibt es weitere 6 Pfade, bei denen nur geringfügig weniger Ertrag erzielt wird.[9] ▪ Effekte von Insertionen und Deletionen von Enzymen Mithilfe der Elementary Modes können metabolische Netzwerke, die sich nur leicht voneinander unterscheiden, verglichen werden. In der Medizin kann dies als Leitfaden für die Entwicklung neuer Medikamente sein. Dazu werden einzelne Enzyme blockiert, um dann zu analysieren, ob bestimmte Produkte immer noch synthetisiert werden können, oder ob sich der Verlust auch auf andere Flüße negativ auswirkt und somit unerwünschte Nebeneffekte auftreten. Für diese Analyse wird die Menge an erlaubten Pfaden eines Wildtyps mit den eines biotechnisch generierte Netzwerks verglichen. Kommt ein Enzym nur in einem oder sehr wenigen Flüßen vor, so hat eine Deletion dieses Enzyms keine oder wenige Nebeneffekte, während der Verlust eines häufig verwendeten Enzyms bewirkt, dass viele Flüße ausfallen. Werden jedoch zusätzliche Enzyme hinzugefügt, erhöht sich normalerweise die Anzahl der Elementary Modes. Das kann zur Synthese neuer Endprodukte führen oder zu einer Erhöhung des Ertrags eines schon zuvor synthetisierten Produkts. Zum Beispiel führt das Einfügen von PyruvatDecarboxylase und Alkohol-Dehydrogenase-II Genen aus Zymomonas mobilis zu einem großen Anstieg des Ethanolertrags aus Zucker in E.coli. [9] ▪ Rekonstruktion von Pfaden Anhand der Elementary Mode Analyse können Pfade von Organsimen rekonstruiert werden, deren Metabolisches Netzwerk noch nicht bekannt ist. Dazu werden die Modes eines verwandten Organsimus als Referenz herangezogen, um dann experimentell zu ermitteln, welche Fähigkeiten der Organsimus hat und welche nicht. Je nachdem werden die Modes weggelassen oder in das Netzwerk integriert. Zum Beispiel lässt man ein Bakterium auf einem Medium wachsen und untersucht welche Substanzen im Medium enthalten sein müssen, damit das Bakterium wachsen kann. Aus einem Referenz-Netzwerk kann bestimmt werden, ob alternative Wege vorhanden sind, damit ein bestimmter Metaboliten synthetisiert werden kann. Gibt es zum Beispiel mehrere alternative Pfade Glukose zu synthetisieren, überprüft man, ob das Bakterium diese alternativen Pfade ebenfalls besitzt, indem man es zum Beispiel auf einem Glukose-freien Medium wachsen lässt. Überlebt der Organismus nicht, kann man daraus schließen, dass diese alternativen Wege in diesem Organsimus nicht vorkommen. 10 2.2 Petri Netze 2.2.1 Allgemeines Petri Netze wurden nach Carl Adam Petri benannt und sind eine graphische und mathematische Methode verwendbar für die Analyse und das Modelieren von dynamischen Systemen. Mit ihren zahlreichen Erweiterungen erlauben PN das Definieren sowohl qualitativer, als auch quantitativer Modelle. Ein Petri Netz ist ein gerichteter bipartiter Graph mit zwei verschiedenen Arten von Knoten. Places (Reaktanten, Produkte und Enzyme) und Transitionen (Reaktionen). Places repräsentieren die Resourcen des Systems, während Transitions den Ereignissen entsprechen, die den Zustand der Resourcen ändern. Gewichtete Kanten verbinden Places mit Transitions und stellen damit die Beziehung zwischen den Resourcen und den Ereignissen anschaulich dar. Kantengewichte entsprechen den stöchiometrischen Koeffizient der Reaktionen. Ein Place ist mit einer Transition verbunden, wenn dieser Place (inputplace) allein oder in Kombination mit anderen Places für die Aktivierung der Transition verantwortlich ist. Dabei wird der Zustand dieses Places geändert. Ein Transition ist mit einem Place (output place) verbunden, wenn die Transition einen Einfluss auf den Zustand des Places hat. Die Tokens in einem Place repräsentieren die Anzahl der Moleküle des entsprechenden Metaboliten, die zu einem bestimmten Zeitpunkt vorhanden sind. Abb.6: Einfaches Beispiel eines Petri Netzes [12] Der Zustand eines Petri Netzes ist festgelegt durch die Verteilung der Tokens in den Places und wird Marking genannt. Das Initial Marking M0 legt fest, wieviele Tokens anfangs zu jedem Place verteilt werden. Die State Equation definiert das Marking (Verteilung der Moleküle) nach einem Feuerungsprozess. M ' =M 0C∗σ (3) Parikh Vektor σ gibt an, wie oft jede Transition feuern muss, damit das Marking M' aus dem Initial Marking M0 erreicht wird. Enthalten alle Inputplaces einer Transition genügend Tokens, wie durch die Gewichtung der Kanten vorgegeben, wird die Transition aktiviert. Dieses Feuern einer ermöglichten Transition verbraucht die Tokens im Inputplace und plaziert die entsprechende Anzahl der Tokens im Outputplace (ebenfalls festgelegt durch die Gewichtung der Kante). Ein Beispiel ist in Abbildung 7 gezeigt. 11 Abb.7: Beispiel eines Feuerungsprozesses [13] Die topologische Struktur eines Petri Netzes wird durch die Inzidenzmatrix C beschrieben. Die Inzidenzmatrix ist eine |P| x |T| Matrix, die für jeden Place die Anzahl der Tokens enthält, die durch eine Transition gebildet oder verbraucht werden. Sie entspricht der Stöchiometriematrix. [13][14] 2.2.2 Analyse von Petri Netzen: Die Eigenschaften von Petri Netzen werden hauptsächlich durch die Analyse ihrer Invarianten untersucht. Es gibt zwei verschiedene Arten von Invarianten: Die T-Invarinate und die P-Invariante. ▪ P-Invarianten: P-Invarinaten sind ein Menge von Places, für die die Summe an Tokens konstant ist, unabhängig davon, welche Transitionen gefeuert haben. P-Invarianten sind definiert durch einen Integervektor Y, der die folgende Gleichung erfüllt: Y ∗C=0. (4) C stellt dabei die Incidencematrix dar. In metabolischen Netzwerken entspricht diese Menge an Places den Konservierungsbedingungen. P-Invarianten haben außerdem die Eigenschaft, dass sie multipliziert mit einem beliebigen Marking M, welches vom Anfangsmarking M0 erreicht werden kann, das gleiche Ergebniss liefern, wie wenn sie mit dem Anfangsmarking M0 multipliziert würde. In einer Gleichung ausgedrückt: Y T ∗M 0=Y T ∗M (5) Eine Charakteristik von biologischen Netzwerken ist die Konservierung bestimmter Molekülgruppen (Moiety). Diese nehmen am Reaktionsmechanismus teil ohne an Konzentration zu verlieren. Diese Beziehungen werden durch P-Invarianten bestimmt. Ein biologisches Beispiel für eine P-Invariante sind die Metaboliten ATP und ADP (siehe Abbildung 8). Die Summe von ADP und ATP sollte in einer Zelle konstant sein, da ATP aus ADP synthetisiert wird und umgekehrt. 12 Abb. 8: Einfaches Beispiel einer Konservierungsbeziehung [14] In Abbildung 8 werden die nicht benannten Places als extern angesehen, die unendlich viele Tokens haben. Transition T1 bzw. T2 wird aktiviert, wenn ATP bzw. ADP ein Token besitzt. Ein Anfangsmarking (c,c,c,c,1,0) aktiviert die Transition T1. Daraus ergibt sich das Marking (c,c,c,c,0,1), die Transition T2 aktiviert. Dadurch wird das Anfangsmarking wiederhergestellt.Diese Konservierungsbeziehung führt zur Begrenzung der Kapazitäten aller internen Places. Diese Begrenzung tritt aber nur in einzelnen Fällen auf, normalerweise sind die Places in biologischen Systemen nicht begrenzt. [13][14] ▪ T-Invarianten: Biochemische Netzerke erreichen oft einen stationären Zustand, d.h. dass sich die Konzentrationen der internen Metaboliten nicht änderen (steady state). Diese Eigenschaft kann durch T-Invarianten untersucht werden. T-Invarianten sind eine Menge an Transitionen, mit der Eigenschaft, dass wenn jede dieser Transitionen feuert, das ursprüngliche Marking wieder erreicht wird. Eine T-Invarianten wird durch einen Integervektor X definiert, der die folgende Gleichung erfüllt: C∗X =0 (6) Die Integerwerte innerhalb dieses Vektors geben an, wie oft die entsprechenden Transitionen feuern müssen, damit das ursprpüngliche Marking wieder erreicht wird. Diese T-Invarianten sind linear abhängig voneinander. Daher kann aus allen Vektoren eine minimale Menge bestimmt werden, aus der alle anderen Lösungen dargestellt werden können. Diese minimale Menge an T-Invarianten entspricht den Elementary Flux Modes. Abb. 9: Einfaches Beispiel eines Petri Netzes [12] 13 Löst man für das einfache Petri Netz aus Abbildung 9 die Gleichung C*X=0, so erhält man viele Lösungen (z.B. (1 0 1), (0 1 1), (1 1 2), (2 1 3), … ). Die Lösung (101) z.B. bedeutet hier, dass Transition 1 und Transition 3 einmal feuern müssen, damit das Marking, wie in Abbildung 9 dargestellt, wieder erreicht wird. Feuert Transition 1 wird ein Token von P1 nach P2 übertragen. Feuert T2 wird dieses Token aus P2 wieder nach P1 zurückübertragen. Die minimalen TInvarianten sind in diesem Fall (101) und (011), da die anderen Lösungen durch Linearkombination aus den ersten beiden dargestellt werden können. [12][14] 2.2.3 Weitere Eigenschaften: Siphons und Traps Ein Siphon ist eine Menge von Places, die sobald sie einmal keine Tokens mehr enthalten, auch keine mehr bekommen und somit keine Transition mehr auslösen können. Ein Trap ist eine Menge an Places, die sobald sie Tokens enthalten, diese nicht mehr aufbrauchen können. Diese Eigenschaften wurden bis jetzt noch nicht in der biochemischen Modelierung betrachtet und sind hilfreich um spezielle Eigenschaften von metabolischen Netzwerken zu charakterisieren. Viele biochemische Netzwerke haben die Funktion in bestimmten Perioden Substanzen zu produzieren, die eingelagert werden, um in anderen Perioden diese zu verbrauchen. Ein Beispiel dafür ist die Kartoffel, die während ihres Wachstums Stärke produziert und diese in der Wurzelknolle speichert. Die Stärke wird dann nach dem Herbst verbraucht. In der Wachstumsphase bilden die Stärke und einige ihrer Vorstufen Traps in den Reaktionsnetzwerks, während nach dem Herbst die Stärke und ihre Zwischenprodukte Siphons bilden. Dies wird in Abbildung 10 veranschaulicht. Abb. 10: Einfaches Beispiel für Siphons und Traps [14] In Abbildung 10 ist ein einfaches Petri Netz dargestellt. S1 stellt Glucose-1-Phosphatdar, S3 symbolisiert die Stärke, S2 bzw. S4 sind die Vorstufen bzw. Zwischenprodukte von Stärke. Je nachdem, in welcher Periode man sich befindet, wird entweder Stärke aufgebaut bzw. abgebaut. Daher sind entweder die Transitionen t3 und t4 aktiv (rot) oder t5 und t6 (blau). Sind nun t3 und t4 aktiv, so wird Stärke produziert und die Tokens häufen sich in S3. Da in diesem Fall keine Transition durch S3 als Inputplace aktiviert werden kann, können die Tokens in S3 nicht verbraucht werden und werden dort angehäuft. S3 stellt somit ein Trap dar. Tritt der andere Fall ein, dass Stärke abgebaut wird, sind t5 und t6 aktiv. Die Tokens in S3 aktivieren t5 und t6 solange, bis keine Tokens mehr in S3 vorhanden sind. Es gibt keine Transition die Tokens nach S3 überträgt. Daher bildet S3 in diesem Fall ein Siphon, dass kein Token mehr bekommt, sobald es einmal leer ist. Abschließend kann man sagen, dass Siphons und Traps vielversprechend in der Analyse von Krankheiten, wie Fettsucht oder Hypercholesterinämie, sind, die mit einer Überanhäufung von bestimmten Substanzen in Verbindung gebracht werden. [14] 14 3. Vergleich beider Methoden Elementary Modes und Petri Netze sind unterschiedliche Ansätze, funktionelle und strukturelle Eigenschaften zu analysieren, die jedoch viele Übereinstimmungen aufweisen. Zum einen entsprechen sich die Stöchiometriematrix und die Inzidenzmatrix. Sie sind in den meisten Fällen nicht exakt identisch, da es verschiedene Methoden gibt, externe Metaboliten in Petri Netzen zu modelieren. Daher kann es z.B. vorkommen, dass der Teil der Stochiometriematrix mit den externen Flüßen in der Incidencematrix komplett fehlt, da in Petri Netzen externe Flüße nicht immer dargestellt werden, sondern z.B. den Anfangsplaces unendlich viele Tokens zur Verfügung gestellt werden. Zum anderen entsprechen sich die Elementary Flux Modes und die minimalen T-Invarianten. Beide repräsentieren Flüße innerhalb des metabolischen Netzwerks von einem Metaboliten zu einem anderen, bei dem die Konzentration der beteiltigten Substrate sich nicht verändert. Außerdem zerlegen beide Methoden die Netzwerke in einfacher Einheiten, die eine zusammenhängende Funktion ausüben und benötigen keine kinetischen Parameter für ihre Anlyse. Petri Netze haben darüber hinaus aber noch eine Reihe weiterer Eigenschaften, wie Siphons und Traps, die weitere Möglichkeiten für die Analyse von metabolischen Netzwerken liefern. Elementary modes Petri Netze Stochiometriematrix Inzidenzmatrix Elementary Modes T-Invariante Tab. 1: Übersicht über die hauptsächlichen Übereinstimmungen zwischen Elementar Modes und Petri Netzen 4.) Zusammenfassung Die Analyse von metabolischen Netzwerken ist zum einen wichtig für die Analyse der Netzwerkstruktur, d.h. herauszufinden wie robust und flexibel ein Netzwerk ist, um daraus mögliche Angriffspunkte, z.B. für Medikamente, zu entwickeln. Zum anderen hat die Analyse eine große Bedeutung im Metabolic Engineering, bei dem metabolische Flüsse in Richtung eines gewünschten Produkts umgeleitet werden bzw. bei dem versucht wird, den maximalen Ertrag eines Produkts aus möglichst wenig Edukt zu erhalten. Sowohl bei den Elementary Modes als auch bei den Petri Netzen werden die metabolischen Netzwerke in Untereinheiten zerlegt, um so bessere Aussagen machen zu können. Man sollte jedoch immer im Hinterkopf behalten, dass diese Untereinheiten idealisierte Situationen darstellen. Obwohl beide Methoden recht unterschiedliche Ansätze verwenden, haben sie viele Übereinstimmungen und liefern auch ähnliche Ergebnisse. 15 5.) Literatur: [1] Jeremy M. Berg, John L. 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