Kurzfassung des Projektberichtes

Vergleich von Methoden zum mechanischen Zellaufschluss von Pichia pastoris und
Escherichia coli
Projektgruppe: Berthe Kamdem, Paulo Farinha, Marcus Farinha, Daniel Kähler
Kurzfassung des Projektberichts (F.B. Anspach)
Ziele:
Desintegration von Mirkoorganismen durch mechanischen Zellaufschluss mit
• Rührwerkskugelmühle
• Schwingmühle
• Ultraschallhomogenisator
Vergleich der Effektivität des Aufschlusses unter Verwendung von
• Escherichia coli
• Pichia pastoris
Einfluss experimenteller Parameter auf den Aufschluss
• Zellkonzentration
• Eingetragene Energie
Material und Methoden:
Mikroorganismen
Zwei Chargen Zellsuspensionen aus Fermentationsprozessen standen zur Verfügung. Die
Zellen wurden zentrifugiert, der Überstand mit dem Kulturmedium entfernt, mit 20 mM
Phosphatpuffer, pH 7 resuspendiert, gewaschen und 50 ml Zellsuspension in 100 ml
Plastikgefäßen aliquotiert. Die Plastikgefäße wurden danach sofort ohne weitere Maßnahme
bei -18 °C eingefroren (E. coli: 142,8 g BTM L-1, P. pastoris: 133,5 g BTM L-1).
Rührwerkskugelmühle
Typ: Dyno-Mill Multi Lab von WAB (Willi A Bachofen). Die Rührwerkskugelmühle kann
kontinuierlich und im Chargenbetrieb eingesetzt werden. Für den jeweiligen Betrieb stehen
spezielle Mahlkammern und Rührwerke zur Verfügung. In diesem Projekt wurde ausschließlich im Chargenbetrieb aufgeschlossen.
Der Mahlbehälter wurde zu 75% mit Mahlkugeln verschiedenen Durchmessers (0,5 bis 1 mm)
gefüllt. Variiert wurden Mahlkugeldurchmesser, Rührwerksdrehzahl und Mahldauer.
Abbildung 1: Rührwerkskugelmühle mit
Mahlkammer und Kühlmantel
Zellaufschluss
Abbildung 2: Sichtbares Rührwerk mit
Mahlscheiben innerhalb des Mahlbehälters
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Schwingmühle
Mikro-Dissmembrator U von B.
Braun. Die Schwingmühle kann
nur im Chargenbetrieb eingesetzt
werden. Zwei Mahlbehälter
standen zur Verfügung:
• Ein mit drei Einzelkammern ausgestatteter Einsatz für Gefäße mit 1 ml
Inhalt
• Eine größere Kammer für
ein Volumen von ca. 5 ml
Die Mahlbehälter wurden jeweils
zu 70% mit Mahlkugeln gefüllt
und die Zellsuspension bis zum
Gefäßrand aufgefüllt. Variiert
wurde die Schüttelfrequenz. Das
Gerät wies nach einigen Versuchen einen Defekt auf, wodurch
sich die Schüttelfrequenz mit der
Zeit unkontrolliert verringerte.
Abbildung 3: Schwingmühle mit montierter Kammer für 3
Gefäße, vorn Innenaufbau; daneben 5 ml Kammer und
Behälter mit Mahlperlen
Ultraschallhomogenisator
Typ: Labsonic U von B. Braun. Das Gerät
wurde chargenweise unter Verwendung einer
Sonotrode mit 19 mm Durchmesser
eingesetzt. Die Probe wurde in einem mit Eis
gekühlten Rosettentrichter aufgeschlossen.
Die Sonotrode ragt in die Suspension hinein,
die in der Rosette zirkulieren kann. Hierdurch
ist eine relativ gute Kühlung möglich und die
Probe ist ganzheitlich zugänglich.
Der Energieeintrag kann durch stufenweise
Änderung der Schallamplitude (Power) und
durch einen Zyklenbetrieb mit veränderbarer
Beschallungsdauer verändert werden.
Abbildung 4: Ultraschallhomogenisator Labsonic U. Im Bild ist die große Sonotrode montiert, die Mikrosonde steht auf dem Tisch, links
ist das Rosettengefäß zu sehen.
Bestimmung der Proteinkonzentration
Nach der Zentrifugation wurde der Gesamtproteininhalt im Überstand mit einem kommerziellen Proteintest durchgeführt (Proteinassay ESL von Roche). Anmerkung: Dieser Proteintest
wird von Roche nicht mehr vertrieben.
Zellaufschluss
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Bestimmung der Enzymaktivität von Glucose-6-Phosphat-Dehyrogenase (G6-P-DH)
Die Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6-P-DH) wurde nach einer
Vorschrift von Bergmeyer bestimmt. Der Testansatz bestand aus folgenden Reagenzien:
2,50 ml
Triethanolamin-Puffer (0,1 M, pH 7,6)
0,20 ml
MgCl2 (0,1 M)
0,10 ml
Glucose-6-Phosphat, Na-Salz (10 mg ml-1)
0,10 ml
NADP-Na-Salz (10 mg ml-1)
0,02 ml
Probelösung
Die Reagenzien wurden in 3 ml Einmalküvetten pipettiert und die Reaktion durch Zugabe der
Probelösung gestartet. Es wird 2 min gewartet und nachfolgend aus der gemessenen
Extinktionsänderung über einen nachfolgenden Zeitraum von 5 min die Enzymaktivität A in
[µmol ml-1 min-1] berechnet.
A=
VTest ∆E 1
ε d ∆t VProbe
Hierbei ist VTest das Gesamtvolumen [ml], ε der molare Extinktionskoeffizient [mol-1 cm-1], d
die optische Weglänge [cm], ∆E die Extinktionsdifferenz, ∆t die Zeitdifferenz [s] und VProbe
[ml] das Probenvolumen.
Durch Einführung eines Faktors kann die Berechnung vereinfacht werden:
F=
VTest 1
ε d VProbe
A = F ∆E
Nach Bergmeyer wurde für das Enzym G6-P-DH ein Faktor F = 23,175 µmol ml-1 gefunden.
Bestimmung der Biotrockenmasse
1 ml der Zellsuspension wird in einem trockenen und gewogenen Reaktionsgefäß (z.B. von
Eppendorf) in einer Laborzentrifuge bei 13000 min-1 zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das Pellet wird im Trockenschrank bei 60 °C über Nacht getrocknet. Nach dem
Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Reaktionsgefäß inklusive getrockneter Zellmasse
gewogen. Die BTM [mg ml-1] wird aus der Gewichtsdifferenz des Gefäßes berechnet.
BTM =
mvoll − mleer
V
Analyse der Aufschlusskinetik
Der Zellaufschluss wurde indirekt durch Analyse eines freigesetzten löslichen Produktes
verfolgt. Hierbei beschreibt RP den Aufschlussgrad der zerstörten Zellen, c ist die Proteinkonzentration im Überstand und die Indizes 0 und h unterscheiden die Probe vor und nach dem
Aufschluss; cm ist die maximal mögliche Konzentration löslichen Proteins bei vollständigem
Zellaufschluss.
RP =
ch − c 0
cm − c 0
Der mechanische Zellaufschluss kann in erster Näherung als Kinetik erster Ordnung betrachtet werden. Findet keine Produktzerstörung statt, sind diese maximalen Konzentrationen
denen der Zellinhalte gleichzusetzen.
Zellaufschluss
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ln
cm
= k1t
cm − c h
bzw.
c = cm (1− e − k1 t )
Zur Abschätzung der Geschwindigkeitskonstanten k und der maximalen freigesetzten
Produktkonzentration cm wurde ein Iterationsverfahren eingesetzt, das in dem Plot-Programm
ORIGIN implementiert ist. Enzymaktivitäten können entsprechend untersucht werden.
Ergebnisse und Diskussion
Einfluss der Rührwerksdrehzahl der Rührwerkskugelmühle
In Abbildung 5 wird tendenziell der Einfluss der Spitzengeschwindigkeit der Mahlscheiben
auf den Freisetzungsgrad beim Aufschluss von P. pastoris Zellen wiedergegeben. Die unterschiedlichen Spitzengeschwindigkeiten werden durch Umlagern des Riemens am Riemenantrieb eingestellt.
Abbildung 5: Verlauf der Gesamtproteinkonzentration nach der Freisetzung aus P. pastoris bei
verschiedenen Rührwerksdrehzahlen; V = 165 ml Zellsuspension, BTM = 10 g L-1, Glasperlen = 0,75 mm.
Der Anteil der aufgeschlossenen Zellen wächst mit der Aufschlussdauer bei der jeweiligen
Drehzahl, bis der maximale Aufschlussgrad erreicht ist. Diese maximale Proteinkonzentration
verändert sich nachfolgend nicht. Offensichtlich findet keine Veränderung der Proteinkonzentration statt, die durch den Proteintest wiedergegeben würde.
Mit steigender Spitzengeschwindigkeit des Rührwerks erfolgt ein schnellerer Zellaufschluss.
Allerdings sind die Unterschiede nicht so deutlich, wie theoretisch zu erwarten wäre. Gemäß
der Theorie sollte der Energieeintrag mit der dritten Potenz der Umdrehungsgeschwindigkeit
zunehmen. Wahrscheinlich findet bei Hefezellen ein sehr effektiver Aufschluss in der Rührwerkskugelmühle statt, so dass sich Änderungen im betrachteten Bereich nur unwesentlich
auswirken. Bei alleiniger Betrachtung der Proteinfreisetzung in Abbildung 5 ist zu folgern,
dass spätestens nach 5 Minuten (beim geringsten Energieeintrag) alle Zellen aufgeschlossen
sind.
In Abbildung 6 wird tendenziell der Einfluss der Spitzengeschwindigkeit der Mahlscheiben
auf den Freisetzungsgrad beim Aufschluss von E. coli Zellen wiedergegeben. Bei diesem
Versuch wurde nur bei einer Spitzengeschwindigkeit von 10 m s-1 gearbeitet.
Zellaufschluss
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Abbildung 6: Verlauf der Gesamtproteinkonzentration nach der Freisetzung aus E. coli; V = 165 ml
Zellsuspension, BTM = 10 g L-1, Glasperlen = 0,5 mm
Abbildung 7: Verlauf der Enzymaktivität von G6-P-DH nach der Freisetzung aus E. coli; V = 165 ml
Zellsuspension, Glasperlen = 0,5 mm, Rührwerksgeschwindigkeit = 10 m s-1.
Wie im Diagramm zu sehen, ist die Proteinkonzentration zu Beginn deutlich höher als beim
Aufschluss der Hefe (≈ 0,95 mg ml-1). Da die unterschiedlichen Biomassen in gleicher Weise
aufgearbeitet wurden und vor dem Einfrieren vom Medium befreit wurden, muss ein Effekt
Zellaufschluss
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zugrunde liegen, der durch die Bakterien beigetragen wurde. Wahrscheinlich ist die anfänglich hohe Proteinkonzentration darauf zurückzuführen, dass allein durch das Einfrieren der
Zellmasse die Zellwand von E. coli schon teilweise zerstört wurde und dadurch Protein freigesetzt wurde. Hier war außerdem festzustellen, dass ein mehrmaliges Auftauen der Mikroorganismen zu einem noch höheren Anstieg der Proteinkonzentration führte.
Im Vergleich zum Hefeaufschluss ist zu bemerken, dass die verbliebenen intakten Zellen über
einen wesentlich längeren Zeitraum aufgeschlossen werden und im untersuchten Zeitraum
kein ausgeprägtes Plateau erreicht wurde. Betrachtet man die absoluten Messwerte, so ist aus
der Auftragung zu folgern, dass vor dem Aufschluss bereits nahezu 90% der Zellen durch das
Einfrieren zerstört waren. Dies wäre ungewöhnlich viel, da Literaturwerte nur maximal 20%
Aufschluss erwarten lassen. Möglicherweise waren die Zellen schon vor dem Einfrieren im
Bioreaktor teilweise lysiert (Hochzelldichtekultivierung). Um dies abzusichern, hätte die
Proteinkonzentration vor dem Einfrieren gemessen werden müssen. Eine entsprechende Probe
wurde allerdings nicht aufgehoben, so dass diese Vermutung spekulativ ist.
Einfluss der Zellkonzentration
Parallel zu den Proteintests wurden Messungen der Enzymaktivität durchgeführt. Abbildung 7
zeigt den Verlauf der Enzymaktivität bei E. coli bei zwei verschiedenen Zellkonzentrationen.
Die durchgezogenen Linien sind Ergebnisse der Kurvenanpassung des Plotprogramms. Die
Iteration auf der Basis einer Kinetik erster Ordnung ergibt für die beiden Zellkonzentrationen
folgende Schätzwerte (Tabelle 1).
Tabelle 1: Ergebnisse der Kurvenanpassung
BTM [g l-1]
Am [U ml-1]
k [min-1]
10
0,20
0,18
20
0,47
0,15
Dem Diagramm ist zu entnehmen, dass auch die Enzymaktivität zu Beginn nicht Null ist, d.h.
nach dem Auftauen der Zellen sind bereits Zellen zerstört. Beim Vergleich der nachfolgend
freigesetzten Enzymaktivität mit der zu Beginn vorhandenen ist der Zuwachs im Vergleich
zur Gesamtproteinmenge in Abbildung 6 aber viel größer. Es ist zu vermuten, dass dieser
Unterschied auf eine teilweise Deaktivierung der G6-P-DH während der Lagerzeit
zurückzuführen ist, ausgelöst durch proteolytische Aktivität oder Denaturierung.
In diesen Versuchsreihen zeigte sich, dass die E. coli Zellen etwa nach 30 Minuten vollständig aufgeschlossen waren. Weiterhin ist festzuhalten, dass die freigesetzte Enzymaktivität
mit der Zellkonzentration in ungefähr gleichem Maß zunimmt; eine Proportionalität ist zu
erwarten, wenn keine konzentrationsabhängigen Zersetzungsreaktionen stattfinden. Die
Geschwindigkeitskonstanten unterscheiden sich nur geringfügig. Legt man einen ähnlichen
Fehler zugrunde, wie er bei den Maximalkonzentrationen vorliegt, so wäre die Differenz nicht
signifikant. Andernfalls wäre eine geringfügig höhere Geschwindigkeit bei der niedrigeren
Konzentration festzustellen. Das ist mit den folgenden Experimenten zu vergleichen.
Ergebnisse mit dem Ultraschallhomogenisator
Abbildung 8 zeigt den Verlauf der G6-P-DH-Freisetzung von E. coli unter Einsatz des Ultraschallhomogenisators bei drei verschiedenen Zellkonzentrationen. Auf den ersten Blick ist
hier eine eindeutige Proportionalität zu erkennen. Dies wird auch durch den Vergleich der
maximalen Enzymaktivitäten bestätigt (Tabelle 2).
Tabelle 2: Ergebnisse der Kurvenanpassung
BTM [g l-1]
10
20
40
Zellaufschluss
Am [U ml-1]
0,27
0,58
1,35
k [min-1]
1,38
1,07
1,10
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Aus den Geschwindigkeitskonstanten ist auch hier ein Trend festzustellen, dass bei niedrigeren Konzentrationen ein schnellerer Aufschluss stattfindet. Ein regelrechter Einbruch ist
allerdings bis zu einer Zellkonzentration von 40 g l-1 nicht festzustellen.
Abbildung 8: Verlauf der Enzymaktivität von G6-P-DH nach der Freisetzung aus E. coli bei verschiedenen Zellkonzentrationen; V = 100 ml Zellsuspension, Energieeintrag P = 300 Watt.
Der Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten der Freisetzung im Vergleich zur Rührwerkskugelmühle zeigt aber einen deutlich schnelleren Aufschluss mit dem Ultraschallhomogenisator. Diese Methode erlaubt einen mindestens 5-fach schnelleren Aufschluss mit E. coli, so
dass nach bereits 5 Minuten alle Zellen aufgeschlossen sind. Auch zeigt sich, dass eine
durchwegs größere maximale Enzymaktivität gefunden wird. Da keine Verdünnung in der
Rührwerkskugelmühle stattfinden konnte, muss die niedrigere Aktivität entweder auf eine
insgesamt schlechtere Zugänglichkeit der Zellen zurückzuführen sein oder es muss eine Denaturierung zugrunde liegen. Fehler in der Messung der Enzymaktivität können ausgeschlossen
werden.
Inwieweit diese Ergebnisse mit der Hefe P. pastoris nachvollzogen werden konnten, ist in
Abbildung 9 zu sehen. Hier wurde zum Vergleich noch die Schwingmühle herangezogen.
Die Ergebnisse der Schwingmühle weisen auf einen Fehler hin, der auf die nicht reproduzierbar einstellbare Schüttelfrequenz zurückzuführen ist. Auf eine Auswertung durch Iteration der
Ergebnisse wurde daher verzichtet.
Im Gegensatz zu E. coli wird die Hefe P. pastoris durch die Rührwerkskugelmühle wesentlich
schneller aufgeschlossenen, etwa um den Faktor 4 (Tabelle 3). Unterschiede in den maximalen Aktivitäten des freigesetzten Enzyms sind nicht sehr aussagekräftig, da dazu der
Versuch länger hätte andauern müssen.
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Tabelle 3: Ergebnisse der Kurvenanpassung
Gerät
Rührwerkskugelmühle
Ultraschallhomogenisator
Am [U ml-1]
0,47
0,44
k [min-1]
0,17
0,04
Abbildung 9: Verlauf der Freisetzung von G6-P-DH aus P. pastoris unter Einsatz verschiedener
Aufschlussmethoden, BTM = 10 mg ml-1, Rührwerkskugelmühle v = 10 m s-1, Ultraschall P = 300 Watt.
Im Verlauf des Versuchs zeigte sich eine relativ starke Erwärmung der Suspension in der
Rosette, die auch durch die Eiskühlung nur ungenügend unterdrückt werden konnte. Hier
besteht die Gefahr einer Denaturierung des Enzyms.
Obwohl die Ergebnisse der Schwingmühle keinen direkten Vergleich zulassen, so ist im
auswertbaren Bereich ebenfalls eine sehr schnelle Freisetzung zu beobachten. Es scheint also
ein schnellerer Aufschluss der Hefe in Gegenwart von Glasperlen stattzufinden. Die Versuche
mit der Schwingmühle konnten nicht wiederholt werden, da das Gerät zunehmend Schwierigkeiten bei der Einstellung der Schüttelfrequenz bereitete.
Zusammenfassung
• Zellsuspensionen mit dem Bakterium E. coli sind mit dem Ultraschallhomogenisator
wesentlich besser aufzuschließen als mit der Rührwerkskugelmühle.
• Zellsuspensionen mit der Hefe P. pastoris lassen sich besser mit der Rührwerkskugelmühle aufschließen. Wahrscheinlich eignet sich auch die Schwingmühle besser zum
Aufschluss dieser Hefe als das Ultraschallgerät.
• Bei beiden Aufschlussmethoden ist bis zu einer BTM von 40 g l-1 ein geringfügig
schnellerer Aufschluss bei den niedrigeren Zellkonzentrationen festzustellen.
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Beim Ultraschallhomogenisator wird bei längerer Aufschlussdauer eine starke Erwärmung beobachtet.
Der Aufschluss mit dem Ultraschallgerät ist aufgrund des deutlich geringeren
Aufwands in kürzerer Zeit durchführbar. Bei der Rührwerkskugelmühle schließt sich
ein aufwändiger Reinigungsprozess an, da Mahlbehälter, Kugeln, Welle und Mahlscheiben gereinigt und getrocknet werden müssen. Beim Ultraschallgerät ist lediglich
die Rosette und die Sonotrode verschmutzt.
Ein deutlicher Vorteil der Rührwerkskugelmühle ist das größere Aufschlussvolumen
beim kontinuierlichen Betrieb und der kühlbare Mahlbehälter.
Für eine Lagerung bei -18 °C eignen sich die verwendeten E.coli Zellen weniger als
die sehr viel stabileren P. pastoris Zellen.
Literatur
1. U. Fritz (1999) Isolierung und Aufreinigungdes Enzyms Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae mit der Expanded Bed Adsorption,
Diplomarbeit an der HAW, VDI.
2. F. Bunge, Mechanische Zellaufschlussmethoden in Rührwerkskugelmühlen
3. A. E. Smith, K.E. Moxham, A. P. J. Middelberg (2000) Wall material properties of
yeast cells, Part II Analysis, Chem. Eng. Sci. 55, 2043.
4. Michael T. Madigan, John M. Martinkol, Jack Parker, Brock Mikrobiologie,
Spektrum Verlag 2001.
5. F.B. Anspach, Vorlesungsskript Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren, HAW
2003.
6. Bergmeier, Methods of Enzymatic Analysis, Verlag Chemie, Weinheim.
7. Roempp, Chemielexikon, 2000.
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