4. Wachstumsbedingungen für strikt anaerobe Bakterien
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Experiment 4 / Student report Laboratory to Biology III “Diversity of Microorganisms” / Wintersemester 2002/03 / page 1 4. Wachstumsbedingungen für strikt anaerobe Bakterien VerfasserInnen: Alexander Nater [email protected] Cornelia Stacher [email protected] Anna Lena Dätwyler [email protected] Betreuerin: Christine Lehmann [email protected] Einleitung In diesem Experiment geht es darum, strikt anaerobe Bakterien in Kultur zu bringen. Diese Bakterien können in Anwesenheit von Sauerstoff nicht überleben. Aus Torf- und Komposterde reicherten wir diese Bakterien über Verdünnungsreihen in „Agarshakes“ unter anaeroben Bedingungen an. Da die Bodensuspension vorgängig pasteurisiert wurde, kultivierten wir speziell sporenbildende Bakterien. Durchführung Das vorbereitete komplexe Nährmedium (Fleischextrakt, Pepton (hydrolisierte Peptide), Hefeextrakt, NaCl) enthielt als Reduktionsmittel Thioglykolat (O2 wird damit reduziert). Resazurin zeigte als Redoxindikator die reduzierenden Bedingungen im Agar an (entfärbt, reduziert = anoxische Verhältnisse, rosa, oxidiert = oxische Verhältnisse). Pasteurisieren der Bodenprobe 1) Zu 2 g Probe (Torf oder Komposterde) 8 ml sterile Kochsalzlösung pipettieren und gut mischen. 2) Probe bei 70°C im Wasserbad 10 Minuten pasteurisieren, danach auf Raumtemperatur abkühlen lassen. 3) Feststoffe absetzen lassen, Ueberstand als Inokulum (Impfgut) für die Verdünnungsreihe verwenden. Herstellen der 10-fachenVerdünnungsreihe(¯ Vereinzelung der Bakterien) 1) Reagenzgläser nummerieren (1-7) 2) In alle Reagenzgläser je 5.4 ml autoklaviertes Nährmedium pipettieren 3) 10 µl Resazurin in jedes Reagenzglas geben. 4) Reagenzglas 1 mit 0.6 ml Inokulum beimpfen und auf dem Vortex gut mischen 5) 0.6 ml aus Reagenzglas 1 in Reagenzglas 2 transferieren. Wieder gut mischen und 0.6 ml aus dem Reagenzglas 2 in Reagenzglas 3 transferieren etc. 6) Reagenzglas 7 dient als Kontrolle und wird nicht beimpft. Ansetzen der „Agarshakes“(Agarschüttelkultur) 1) 3 ml 2.4% Agar (bei 45°C flüssig gehalten) zu jedem Reagenzglas zupipettieren. 2) Auf dem Vortex gut mischen. 3) Reagenzgläser mit O2 undurchlässigen Butylgummistopfen verschliessen und bei Raumtemperatur verfestigen lassen. 4) Reagenzgläser kopfüber bei 30°C im Dunkeln während einer Woche inkubieren. Ergebnisse/Diskussion • In den Anreicherungen aus Torf-und Komposterde sind morphologisch unterschiedliche, weiss pigmentierte Kolonietypen zu unterscheiden, was auf verschiedene Bakterienstämme hindeutet: Das Spektrum reicht von punktförmigen, kaum sichtbaren, bis zu 4 mm grossen Kolonien (Tab.1). • Zu erwarten sind v. a. anaerobe Sporenbildner, d.h. Clostridien. Experiment 4 / Student report • • • • Laboratory to Biology III “Diversity of Microorganisms” / Wintersemester 2002/03 / page 2 Für weitere Untersuchungen könnten die Kolonien mit einer ausgezogenen Pasteurpipette gepickt und unter dem Mikroskop (Gramfärbung, Flagellenfärbung etc.) charakterisiert, sowie auf selektiveren Medien kultiviert werden. Anoxische Bedingungen wurden durch das Reduktionsmittel Thioglykolat und durch die Atmungs-Aktivität aerober Bakterien im Impfgut geschaffen. Der Anteil aerober Bakterien im Torf ist deutlich geringer als in der Komposterde, wo das Resazurin bis zur Verdünnungsstufe 10-4 vollständig entfärbt wurde. Die Kontrolle (Probe ohne Bakterien) wies bei der 'Torfprobe' keine Kolonien auf. Es wurde demnach steril gearbeitet (in Verdünnungsstufe 10-6 waren allerdings auch schon keine Kolonien mehr sichtbar). Die Kontrolle bei der Probe mit Komposterde war dagegen mit einigen Kolonien kontaminiert. Dies liegt vermutlich daran, dass hier zur Beigabe des Agars fälschlicherweise mehrmals dieselbe Pipette benutzt wurde. Die Reagenzgläser mit den Anreicherungen aus Komposterde mit niedriger Verdünnungsstufe wiesen Gasblasen auf. Sehr wahrscheinlich handelt es sich um die Produkte saccharolytischer (v.a. Kohlehydrat abbauender) Clostridien , nämlich um CO2, H2 und flüchtige Fettsäuren. Tab. 1: Mit pasteurisierter Torferde und Komposterde beimpfte Agarshakes a) Torferde Verdünnungsstufe 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000 0 (Kontrolle) Kolonietypen alle kleine (1 mm), mittlere (2 mm), grosse (4 mm) kleine, mittlere, ev Pilze kleine, mittlere, ev. Pilze kleine, mittlere - Gasbildung nein nein Kolonietypen alle grosse (4 mm) grosse kleine (1 mm) kleine kleine kleine Gasbildung ja ja ja ja nein nein nein nein nein nein nein nein Resazurinfärbung farblos zu 3/4 farblos zu 1/4 farblos rosa farblos zu 1/2 farblos (unterer Bereich) hellrosa b) Komposterde Verdünnungsstufe 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000 0 (Kontrolle) Resazurinfärbung farblos farblos farblos farblos nur oberster Bereich rosa nur oberster Bereich rosa entfärbt Bemerkungen Anaerobe Kulturbedingungen wurden durch die folgenden Massnahmen geschaffen: 9 hohe Inokulumdichte (schneller O2-Verbrauch) 9 Verwenden von Agar (O2 diffundiert schlecht nach) 9 kleiner Gasraum über dem Kulturmedium 9 Verschliessen der Reagenzgläser mit O2-undurchlässigen Butylgummistopfen Vermutete Mikroorganismen Zuerst keimen aerobe sporenbildende Bakterien aus (Bacillus sp), später anaerobe sporenbildende Bakterien (Clostridien). Unter den Clostridien gibt es potente Toxinbildner!!! (Arbeitsweise wie mit fakultativ pathogenen Bakterien). Unser Komplexmedium bevorzugt eher proteolytische Clostridien, welche Proteine und Aminosäuren abbauen und CO2 und H2 bilden. Komposterde enthält ev. eher saccharolytische Clostridien. Mit einem Kartoffelaufgussmedium (Stärke!) können auch in der Torfprobe Bakterien angereichert werden, welche Gas produzieren.
