Mikrobiologie von Anaerobschlämmen der Papierindustrie

Behandlung
Gabriele WEINBERGER; Claudia BEIMFOHR
den Reaktoren vorzunehmen. Mit diesen
entwickelten Gensonden wurden weitere
Anaerobreaktoren untersucht, um die Übertragbarkeit der Ergebnisse auch in anderen
Reaktoren zu überprüfen.
Mikrobiologie von
Anaerobschlämmen
der Papierindustrie
Material und Methoden
Pelletauftrieb und -zerfall in Anaerobanlagen
vermeiden: Analyse der Anaerobschlämme
mit Hilfe moderner Gensondentechnik.
Prinzip der VIT-Gensondentechnologie /4, 5/
A
naerobanlagen haben einen festen
Platz in der Wasserreinigung der Papierindustrie. Sie stellen ein attraktives Behandlungsverfahren dar, da nicht nur Betriebskosten anfallen, sondern durch Nutzung des gewonnenen Biogases auch Erträge
möglich sind.
Verfahrenstechnische Probleme in Anaerobreaktoren gehören der Vergangenheit an.
Wie vor einigen Jahren bei der aeroben Abwasserreinigung, häufen sich mittlerweile
jedoch in Anaerobanlagen Phänomene von
Pelletauftrieb, Pelletzerfall und Bildung von
feindispersem Schlamm. Meist ist damit
auch ein Abtrieb der Biomasse aus dem
Reaktor verbunden.
Ob auch bei diesen Problemen in der anaeroben Reinigung die mikrobielle Zusammensetzung Ursache für die Veränderungen in
der Anaerobschlammmorphologie ist, sollten Untersuchungen im Rahmen eines vom
Bundesministerium für Wirtschaft und
wwt-online.de
Bild 1
Technologie über die AiF geförderten Projekt IGF 15772N prüfen /1/.
Neben diesen Untersuchungen wurde komplementär im Rahmen des EU-Forschungsprojektes AquaFit4use (Projektnummer:
211534) ein aufwändiger molekularer Klonbankansatz durchgeführt. Über so genannte
Klonbanken wurde die Gruppe der Chloroflexi-Bakterien in Anaerobschlämmen
zweier IC-Reaktoren mit unterschiedlich
guter Pelletstabilität genauer untersucht.
Auf Basis der erhaltenen Sequenzinformationen wurden spezifische Gensonden entwickelt, um eine Feintypisierung der vorhandenen Chloroflexi-Bakterien in den bei-
Im Rahmen aktueller Betriebsuntersuchungen /2/ wurden insgesamt 14 anaerobe Reaktoren aus Abwasserbehandlungsanlagen
der Papierindustrie untersucht. Die untersuchten Anaerobreaktoren basierten auf
UASB- und EGSB-Reaktortechnologien.
Das Produktionsspektrum dieser Anlagen
beinhaltete dabei überwiegend die Produktion von Verpackungspapieren, aber auch
Wellpappenrohpapiere, Druckpapiere und
holzfreie Papiere.
Für die Charakterisierung der Anaerobschlämme wurden chemisch-physikalische
Messmethoden angewandt und mikroskopische Untersuchungen durchgeführt (Tabelle 1).
Die Analyse der Anaerobschlammpopulationen erfolgte mit Hilfe der vermicon-Gensondentechnik. Die vermicon-Gensondentechnik ermöglicht es Mikroorganismen
ohne vorherige Kultivierung mittels geeigneter Gensonden direkt in der Probe zu
identifizieren und zu quantifizieren. Dafür
werden fluoreszenzmarkierte Gensonden
über Diffusion in die Bakterien eingeschleust.
Diese Gensonden binden innerhalb der Zellen an spezifische Bindungsstellen auf der
ribosomalen RNA. Diese Bindungsstellen
sind einzigartig für einzelne Arten, Gattungen oder Großgruppen der Bakterien. Je
nach Anforderung können die Gensonden
flexibel gewählt werden. Eine Identifizierung und Quantifizierung der Zellen findet
nach Anregung des an die Gensonden gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffes unter dem
Fluoreszenzmikroskop statt. Durch Wahl
eines geeigneten Gensondensatzes lassen
sich umfassende Populationsprofile erstellen und miteinander vergleichen. Die Besonderheit dabei: Es werden nur lebende Bakterien nachgewiesen und das innerhalb der
Originalprobe, d. h. ohne eine Kultivierung
der Bakterien. Damit werden die Ergebnisse
ohne die bekannten Populationsverschiebungen erhalten, die sich sonst durch unterschiedliches Wachstumsverhalten auf künstlichen Nährmedien ergeben. Der direkte
und unverfälschte Einblick auch in komplexe Untersuchungsproben ist somit möglich /3/.
Das Prinzip der VIT-Gensondentechnologie
beschreibt Bild 1.
Chemisch-physikalische Messmethoden der Anaerobschlammuntersuchung
Tab. 1
Parameter
Einheit
Methode
Trockenrückstand (TR) des Schlamms
Glühverlust (GV) der Trockenmasse des Schlamms
Gesamt-Phosphor (Pges) im Schlamm
Kjeldahl-Stickstoff (TKN) im Schlamm
%
%
mg/g TR
mg/g TR
DIN EN 12880
DIN EN 12879
DIN EN ISO 6878
In Anlehnung an DIN EN 25663
SPECIAL KLÄRSCHLAMM
19
SPECIAL KLÄRSCHLAMM
Bild 2
Phylogenetischer
Baum der Mikroorganismen /4, 6/
a)
b)
identische mikroskopische Bilder unter
Floureszenzanregung, 100fache Gesamtvergrößerung
c)
c) spezifischer Nachweis eines wichtigen
filamentösen Bakteriums der Alphaproteobacteria
Beispiel einer typischen Gensondenanalyse eines Pelletschlamms
aus der Papierindustrie /4/
90 bis 95 % aller Bakterien und Archaea
lassen sich 10 Hauptgruppen innerhalb des
Stammbaumes der Mikroorganismen (Bild 2)
zuordnen. Diese 10 Gruppen können bei der
VIT-Gensondentechnologie mit speziellen
Gensonden erfasst und quantifiziert werden.
Die Quantifizierung erfolgt in Bezug auf
die lebende Gesamtflora und wird in Prozentwerten angegeben. Ein Beispiel einer typischen
Gensondenanalyse eines Pelletschlamms aus
der Papierindustrie zeigt Bild 3.
Mikrobiologische Zusammensetzung von Anaerobschlämmen
Die Zusammenfassung der Gensondenergebnisse der untersuchten Anaerobschlämme
aus /1/ zeigt Tabelle 2. Die Ergebnisse sind
20
Bild 3
für UASB- und EGSB-Schlämme getrennt
dargestellt und geben jeweils die Bereiche
an, in denen die einzelnen Mikroorganismenanteile auftreten.
Die einzelnen erfassten mikrobiellen Großgruppen von UASB- und EGSB-SchlämMO-Anteile in %
2003/2004
men unterscheiden sich nicht wesentlich
voneinander. Die unterschiedlichen hydraulischen Bedingungen in UASB- und EGSBReaktoren führen demnach zu keiner Selektion bestimmter Großgruppen. Dagegen veränderten sich im Laufe der letzten fünf
Jahre einzelne Großgruppenanteile innerhalb der Anaerobschlammbiozönosen, wie
in Bild 4 dargestellt ist.
Die methanbildenden Bakterien der Euryarchaeota zeigen Schwankungen in einem
ähnlichen Bereich, mit gestiegenem Mittelwert. Innerhalb der Euryarchaeota dominieren dabei Organismen der Gattung
Methanosaeta. Sie stellen meist mehr als
80 % aller Euryarchaeota dar. Methanosaeta sind acetiklastische Organismen, die
ausschließlich Acetat zu Methan umwandeln.
In der Gruppe der Proteobacteria sind insbesondere die Alphaproteobacteria und die
Deltaproteobacteria von Bedeutung. Letztere stellen durch ihren Anteil Sulfat reduzierender Bakterien in manchen Fällen Konkurrenten zu den methanogenen Organismen dar. Alphaproteobacteria kommen
meist im Bioschlamm aerober Anlagen vor
und waren bislang im Anaerobschlamm unbedeutend. Auffällig ist, dass diese Gruppe
in den Anaerobreaktoren insbesondere von
unbekannten fadenförmig wachsenden Vertretern dominiert wird, die bereits aus aeroben Anlagen mit Schlammflotationsproblemen bekannt sind.
Obwohl insgesamt der prozentuale Anteil an
hydrolysierenden Organismen gestiegen ist,
zeigen sich die bislang bekannten Vertreter,
wie solcher aus dem Cytophaga-Flexibacter
Subphylum, in den aktuellen Schlammproben deutlich reduziert. Da in den aktuellen
Anaerobanlagen in den meisten Fällen eine
Trennung zwischen Hydrolyse/Versäuerung
und Reaktor vorliegt, ist dieser Rückgang
nachvollziehbar. Maßgeblich für die Erhöhung des Anteils hydrolisierender Bakterien
ist die erst vor wenigen Jahren identifizierte
Gruppe der Chloroflexi (ehemals Grüne,
nicht-schwefelhaltige Bakterien). Diese
wurde als wichtige und ambivalente Gruppe
innerhalb der beteiligten Mikroorganismen
der Anaerobreaktoren identifiziert.
Die Gruppe der Chloroflexi-Bakterien
wurde aus den genannten Gründen erst in
den aktuellen Schlammproben untersucht.
MO-Anteile in %
2009/2010
Bereich
MW
Hydrolyse
16…40
26
22
Versäuerung
6…35
15
20…55
32
Methanbildung
25…50
42
lebende
Zellen
80
lebende
Zellen
37
Bereich
MW
7…22
14
1…27
Bild 4
ZUSAMMENSETZUNG
DER ANAEROBSCHLAMMBIOZÖNOSEN:
Vergleich alter und
aktueller Gensondenergebnisse /2, 7/
10/2011
Bereiche der mikrobiellen Zusammensetzung für UASB- und EGSB-Anaerobschlämme
Tab. 2
Anteil an lebenden Zellen
(Bakterien/Archaebakterien) insgesamt
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Deltaproteobacteria
Phylum Chloroflexi
Cytophaga-Flexibacter Subphylum
Planktomyceten
Firmicutes
Clostridia sensu strictu
Actinobacteria
Euryarchaeota
Anteil in %
EGSB
19 Schlämme in %
UASB
7 Schlämme in %
Min
Max
Min
Max
22
57
25
42
1
1
1
4
19
1
1
1
1
1
35
17
3
2
17
40
15
7
8
1
10
50
1
1
1
5
16
4
1
1
1
1
25
10
1
2
13
40
10
10
7
5
7
50
Ihr wird besondere Bedeutung beigemessen.
Sie enthält fadenförmige Bakterien in hoher
Diversität, die mit steigender Tendenz auch
in aeroben Belebungsanlagen mit Schlammentartungsproblemen in Zusammenhang gebracht werden. In wieweit diese Gruppe in
früheren Untersuchungen der Anaerobschlämme schon präsent war, ist unbekannt.
Hierin liegt jedoch ein möglicher Anhaltspunkt für Schlammentartungsphänomene.
Die durchschnittliche Gesamtzellzahl stieg
zum aktuellen Untersuchungszeitraum auf
mehr als das 6-fache, demgegenüber fällt
der Anteil der davon lebenden Zellen auf
durchschnittlich 36 % gegenüber ehemals
80 %. Das bedeutet absolut aber immer noch
eine Steigerung auf fast das 2,5-fache. Möglicherweise steht die durchschnittlich verbesserte CSB-Abbauleistung damit in Zusammenhang.
Zusammensetzung der Anaerobschlamm-Mikrobiologie
Die Biozönose im Anaerobschlamm von Papierfabriken wird im Wesentlichen von den
Organismengruppen dominiert, die zu den
vermuteten anaeroben Abbauschritten gehören (Bild 5). Die in Bild 5 eingezeichneten
Fragezeichen zeigen bislang unbekannte,
z. T. weitere vermutete Abbauwege an.
Insgesamt stellt die Gruppe der Chloroflexi
quantitativ eine bedeutende Gruppe innerhalb der Biozönose von Anaerobreaktoren
dar (siehe Bild 6). Einige Vertreter des Phylums Chloroflexi haben relativ sicher einen
positiven Einfluss auf die Hydrolyse. Mög-
liche negative Aspekte identischer oder vermutlich anderer filamentöser Vertreter dieser Gruppe in Bezug auf Pelletdestabilisierung werden diskutiert /7, 8/.
Es stellte sich heraus, dass obwohl die vorhandenen Chloroflexi-Bakterien morphologisch in den beiden untersuchten IC-Reaktoren mit unterschiedlicher Pelletstabilität
sehr vergleichbar schienen, auf genetischer
Ebene jedoch eine sehr große Diversität innerhalb dieser Gruppe nachgewiesen werden konnte.
Auf Basis der erhaltenen Sequenzinformationen wurden spezifische Gensonden entwickelt und hierüber eine Feintypisierung
der vorhandenen Chloroflexi-Bakterien in
den beiden untersuchten Anlagen vorgenommen. Bestimmte Filamente wurden
verstärkt in Anlagen mit geringer Pelletstabilität nachgewiesen und andere Filamente
waren in größeren Anteilen nur in Anlagen
mit guter Pelletstabilität vorhanden. Zu den
Letzteren gehören die Vertreter, die sich mit
der blau-gefärbten und der weiß-gefärbten
Gensonde nachweisen lassen. Indikatoren
für einen schlechteren Zusammenhalt der
Pellets könnten Vertreter sein, die mit der
grün-gefärbten Gensonde nachweisbar waren. Es konnte zudem gezeigt werden, dass
die Gensondenergebnisse auf andere Anaerobreaktoren übertragbar sind. Erste Einblicke in die Populationsstruktur der interessanten Chloroflexi-Gruppe konnten somit
erhalten werden. Weitere Untersuchungen
werden zeigen, in wie weit die entwickelten
Gensonden ggf. als Frühwarnsystem ein-
Bacteria
Archaea
CF-Subphylum Chloroflexi Actinobacteria/ Deltaproteo- AlphaproteoFirmicutes
bacteria
bacteria
Euryarchaeota
?
Hydrolyse
?
Acetogenese
?
Desulfurikation
Methanogenese
Bedeutende Mikroorganismengruppen im Anaerobschlamm
Bild 5
von Papierfabriken mit vermutetem Zusammenhang zu Abbauschritten
wwt-online.de
SPECIAL KLÄRSCHLAMM
21
SPECIAL KLÄRSCHLAMM
Gemeinschaftsforschung (IGF)“ vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie über die AiF finanziert. Das Forschungsprojekt AquaFit4use (EU-FP7ENV-211534; www.aquafit4use.eu) wird
von der Europäischen Kommission im Rahmen des 7. Rahmenprogramms für Forschung und Technologische Entwicklung finanziert.
Für beide Projekte sei an dieser Stelle herzlich gedankt.
L I T E R AT U R
Vergleich der Populationsanteile in verschiedenen
Anaerobreaktortypen von Papierfabriken
Bild 6
Ergebnisse der Feintypisierung der Chloroflexi-Bakterien
in den Anaerobschlämmen von Papierfabriken aus Bild 6
mit neu entwickelten Gensonden
Bild 7
setzbar sind, um eine Populationsverschiebung mit entsprechenden negativen Folgen
für die Leistungsfähigkeit von Anaerobreaktoren rechtzeitig erkennbar zu machen
(Bild 7).
Pelletdestabilisierungseffekte werden auch
für die filamentösen Alphaproteobacteria
angenommen.
Die Diversität der Organismengroßgruppen
im Anaerobschlamm ist im Allgemeinen
eher gering. Geringe Diversität kann bedeuten, dass die Biozönose auf Schwankungen
und/oder Veränderungen und/oder Stoßbelastungen in der Abwasserzusammensetzung empfindlicher reagiert und der Anlagenbetrieb deshalb anfälliger für Betriebsstörungen ist.
Der Anteil lebender Zellen in den Anaerobschlämmen der aktuellen Untersuchungen
ist relativ gesunken, bei stark gestiegenen
Gesamtzellzahlen. Dies induziert ein schnelleres Biomassewachstum als tote Zellen aus
dem Reaktor entfernt werden können. Dies
legt nahe, dass ein bedeutender Teil der
22
durch die Abbauaktivität erzeugten Energie
zu Biomasse umgesetzt wird und damit zu
Lasten der Biogasausbeute geht.
Fazit
Um eine zufriedenstellende Pelletbildung zu
generieren und die in der Papierindustrie gewohnte Pelletstruktur aufrecht zu erhalten,
müssen verschiedene Bedingungen vorliegen, wie beispielsweise eine ausgewogene
Zusammensetzung von Anaerobschlammpopulationen.
Die aktuellen Gensondenergebnisse zeigen,
dass innerhalb der Pelletpopulationen die
Hydrolyse- und Versäuerungsbakterien
deutlich abgenommen haben.
Das kann als signifikanter Hinweis darauf
gewertet werden, dass Veränderungen der
Pelletstabiltät stattgefunden haben.
Projekt-Förderung
Das Forschungsvorhaben IGF 15772 der
Forschungsvereinigung PTS wurde im Programm zur Förderung der „Industriellen
/1/ Weinberger, G.: Untersuchungen zur Auswirkung
von Additiven auf die Mikrobiologie und zum
Zusammenhang mit Schlammentartungsphänomenen in Anaerobschlämmen der
Papierindustrie. Veröffentlichung zum
PTS-Abschlussbericht PTS-IGF 15772N,
PTS-Homepage www.ptspaper.de, 48 S., 2011
/2/ Amann, R. I.; Ludwig, W.; Schleifer, K.-H.:
Phylogenetic identification and in situ detection
of individual microbial cells without cultivation.
Microbiol. Rev. 59:143-169, 1995
/3/ Unterlagen Fa. vermicon AG
/4/ Weißmann, H.; Beimfohr, C.: Einsparung von
Fällungsmitteln auf einer Großkläranlage anhand
der Überwachung filamentöser Bakterien mit
Gensonden. In: GWF-Wasser/Abwasser. 145 (9),
652-655, 2004
/5/ Wagner, M.; Loy, A.: Bacterial community
composition and function in sewage treatment
systems. Curr Opin Biotechnol.
13(3):218-27, 2002
/6/ Weinberger, G.: Steigerung der Leistungsfähigkeit
und Betriebssicherheit anaerober Reinigungsprozesse in der Papierindustrie durch
Verbesserung der Schlammeigenschaften.
München. Papiertechnische Stiftung (PTS),
PTS-Forschungsbericht PTS-FB 02/04;
85 S., 2004
/7/ Yamada, T.; Sekuguchi, Y.; Imachi, H.; Kamagata,
Y.; Ohashi, A.; Harada, A.: Diversity, localization,
and physiological properties of filamentous
microbes belonging to Chloroflexi subphylum I in
mesophilic and thermophilic methanogenic sludge
granules.
Appl. Env. Microbiol. 71(11): 7493-7503, 2005
K O N TA K T
Dipl.-Ing. Gabriele WEINBERGER
Papiertechnische Stiftung PTS
Papiertechnisches Institut PTI
Heßstraße 134 | 80797 München
Tel.: 089/12146-462
E-Mail: [email protected]
www.ptspaper.de
Dr. Claudia BEIMFOHR
vermicon AG
Emmy-Noether-Straße 2 | 80992 München
Tel.: 089/15882-0
E-Mail: [email protected]
www.vermicon.com
10/2011