Erstellen einer Restriktonskarte des Plasmids pRS306PRC1 E

Erstellen einer Restriktonskarte des Plasmids pRS306PRC1 E. Jarosch, AG Prof. Sommer Intro Die Arbeitsgruppe beschä;igt sich mit der Proteindegrada>on durch Proteasomen in Hefezellen. Wir erlernten Techniken, die grundlegend für die AuFlärung dieser Stoﬀwechselwege sind. Ziel unserer Versuche war die Erstellung einer Restrik>onskarte eines Plasmids aus E.coli. Methoden Plasmidisola>on aus E.coli -‐  Abzentrifugieren der E.coli Zellen -‐ Aufreinigen der DNA durch verschiedene Fällungen Gelelektrophorese zur Kontrolle der Plasmidisola>on Konzentra>onsbes>mmung der Plasmid-‐DNA -‐ λ 260 = DNA Konzentra>on -‐ HindIII -‐ Xhol -‐ BglII -‐ PstI Gelelektrophorese -‐DNA – Fragmente wandern im Vermutete Fragmentlängen : -‐ BglII, HindIII, XhoI = 7100 bp -‐ PstI = 5600 bp, 1500 bp -‐ BglII/HindIII = 6400 bp, 700 bp -‐ BglII/XhoI = 5100 bp, 2000 bp -‐ BglII/PstI = 4900 bp, 1500 bp. 700 bp -‐ HindIII/PstI = 5500 bp, 1500 bp, 100 bp -‐ HindIII/XhoI = 4500 bp, 2600 bp -‐ PstI/XhoI = 2800 bp, 2600 bp, 1700bp Restrik>onskarte : -‐ λ 280 = Protein Konzentra>on -‐ λ 260/280 = Reinheitsgrad Restrik>onsverdau der Plasmid – DNA Verwendete Enzyme : Ergebnisse elektrischen Feld in Abhängigkeit von ihrer Größe unterschiedlich schnell -‐ Kleinere schneller / Größere langsamer Diskussion Die von uns ermidelte Restrik>onskarte s>mmt mit der tatsächlichen überein. Für ein einfacheres Erstellen der Restrik>onskarte sollte die DNA – Konzentra>on in der Gelelektrophorese erhöht werden. Von C. Willems & S. Mann