28. Newsletter: Ausgabe 02-2016

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Informationen für die Immunhistochemie, in situ-Hybridisierung und Molekularpathologie
newsletter_02_16
Inhalt
AmoyDx® SuperARMS Real-Time PCR Assays – Gesteigerte Sensitivität für den Mutationsnachweis an cfDNA.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Neue CISH-Sonden für die Lymphomdiagnostik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Der Zytomed Systems Lesetipp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Immunhistochemie bei Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
PD-L1 Immunhistochemie........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Termine
7. bis 9. Oktober 2016
Deutsche Pathologie
Tage 2016
Berlin
7. Oktober 2016
Immunhistochemie
an Lebertumoren
Workhop, Berlin
15. Oktober 2016
Grundlagen der Fluoreszenz
in situ-Hybridisierung –
Theorie und Praxis
Workhop, Göttingen
14. bis 17. November 2016
MEDICA
Düsseldorf
19. November 2016
Immunhistochemie
an Lebertumoren
Workhop, Essen
newsletter_02_16
AmoyDx® SuperARMS Real-Time PCR
Assays – Gesteigerte Sensitivität für den
Mutationsnachweis an cfDNA
Die Testung von EGFR Mutationen an cfDNA (cell free
DNA) aus liquid biopsies wird zunehmend in die Diagnostik Einzug finden. Da der Anteil an Tumor-DNA in
diesen Proben im Vergleich zu Proben aus FFPE-Material gering ist, wird eine möglichst hohe Sensitivität des
Mutations-Nachweises angestrebt. Unter diesem Aspekt hat unsere Partnerfirma AmoyDx® verschiedene
Real-Time PCR Assays mit neuer SuperARMS™ Technologie (Super-Amplification Refractory Mutation System)
speziell für cfDNA Proben entwickelt.
Das neue SuperARMS™ EGFR T790M Mutation Detection Kit erreicht im Vergleich zu den bisher auf dem
Markt befindlichen Real-Time PCR Systemen eine erhöhte Sensitivität von bis zu 0,2 % Mutationsanteil in
der wt-DNA beim T790M Nachweis.
Ebenfalls neu ist das SuperARMS™ EGFR Mutation
Detection Kit. Dieses Kit ermöglicht den Nachweis von
41 Mutationen in den Exons 18 bis 21 des EGFR Gens in
cfDNA mit Sensitivitäten von 0,2 – 0,8 % (T790M: 0,2 %).
Dieses Kit ist im pre-loaded Format erhältlich.
Neue CISH-Sonden für die Lymphomdiagnostik
Neben den klassischen Anwendungsgebieten der
chromogenen in situ-Hybridisierung (CISH) bei
Mamma- oder Sarkomdiagnostik kann die CISHDiagnostik dank neuer ZytoDot® 2C Break Apart
Sonden nun auch in der Lymphomdiagnostik eingesetzt werden. Die Detektion der Sonden erfolgt
mit dem ZytoDot® 2C CISH Implementation Kit
Exon 18: G719C, G719A
Exon 19: 29 Deletionen
ZytoDot® 2C CISH Sonden für die Lymphomdiagnostik
Bezeichnung
Markierung
Menge
ZytoDot® 2C SPEC ALK Break Apart Probe
DIG/DNP
100 µl (10 Tests)
C-3055-100
ZytoDot® 2C SPEC ALK Break Apart Probe
DIG/DNP
400 µl (40 Tests)
C-3055-400
ZytoDot® 2C SPEC BCL2 Break Apart Probe
DIG/DNP
100 µl (10 Tests)
C-3073-100
ZytoDot 2C SPEC BCL6 Break Apart Probe
DIG/DNP
100 µl (10 Tests)
C-3074-100
ZytoDot® 2C SPEC CCND1 Break Apart Probe
DIG/DNP
100 µl (10 Tests)
C-3075-100
ZytoDot 2C SPEC IGH Break Apart Probe
DIG/DNP
100 µl (10 Tests)
C-3071-100
ZytoDot® 2C SPEC MALT1 Break Apart Probe
DIG/DNP
100 µl (10 Tests)
C-3072-100
ZytoDot® 2C SPEC MYC Break Apart Probe
DIG/DNP
400 µl (40 Tests)
C-3066-400
®
Exon 20: T790M, S768I, 6 Insertionen
Exon 21: L858R, L861Q
Assay-Design: Vier Reaktionen - Vier Fluoreszenzen
FAM
ROX
Cy5
HEX/VIC
Reaktionsmix 1
19-Del
L858R
IC*
Reaktionsmix 2
T790M
IC*
Literatur
[1] Douillard JY et al. First-line gefitinib
in Caucasian EGFR mutation-positive
NSCLC patients: a phase-IV, open-label,
single-arm study. Br J Cancer 110:5562, 2014
Reaktionsmix 3
G719X
L861Q
S768I
IC*
Reaktionsmix 4
20-Ins
IC*
[2] Zheng D et al. Plasma EGFR T790M
ctDNA status is associated with clinical
outcome in advanced NSCLC patients
with acquired EGFR-TKI resistance. Sci
Rep 6:20913, 2016
[3] http://news.merck.de/N/0/2DC5340
5BDD827A1C1257FFD006F7BC2/$File/
PressRelease-Merck_AmoyDxChinaCollaboration_English280716.pdf
kolorektalen Karzinom evaluiert werden.
Die AmoyDx® SuperARMS Kits sind geeignet für RealTime PCR Geräte mit einem möglichen Reaktionsvolumen von 80 µl. Für die Aufreinigung von cfDNA
aus liquid biopsies stehen ein speziell entwickeltes
AmoyDx® Circulating DNA Kit sowie die Cell-free
DNA Protection Vacuum Tubes zur Verfügung.
Zytomed Systems hat bei dem NordiQC Ringversuch HER-2 FISH, H9, 2016 erfolgreich teilgenommen. In diesem Ringversuch sollten 5 Gewebeschnitte auf ihren HER2 (ERBB2)-Status
untersucht werden. Die Untersuchung wurde
im Zytomed Systems Labor mit der FISH-Sonde
„ZytoLight® SPEC ERBB2/CEN 17 Dual Color Probe“
Nachweis der EGFR T790M Mutation an cfDNA (liquid biopsies)
SuperARMS EGFR Mutation Detection Kit
Nachweis von 41 EGFR Mutationen in den Exons 18–21 an cfDNA (liquid biopsies)
Bezeichnung
Cell-free DNA Protection Vacuum Tube
ZytoDot® 2C SPEC CCND1 Break Apart Probe,
Mantelzell-Lymphom,
1 Fusions- und 1 Split-Signal pro Zellkern
Zytomed Systems Lesetipp : PD-L1 Immunhistochemie als Herausforderung für die Pathologie
Form
Menge
Bestell-Nr.
Bulk
1 Kit (24 Tests)
ADX-EG12-R
pre-loaded
1 Kit (12 Tests)
ADX-EG14-R
Kits für die cfDNA Aufreinigung
Circulating DNA Kit
(Z-2015-200) und dem Vorbehandlungskit „ZytoLight®
FISH Tissue Implementation Kit“ (Z-2028-20) unserer
Partnerfirma ZytoVision durchgeführt.
Das Zytomed Systems Labor nimmt regelmäßig
an nationalen und internationalen Ringversuchen
zur Qualitätssicherung in der Pathologie (u.a. QuIP,
NordiQC, EQA der ESP) teil.
Kerr KM and Nicolson MC. Arch Pathol Lab Med 2016 March; 140:249-254
AmoyDx® SuperARMS™ Kits
SuperARMS EGFR T790M Mutation Detection Kit
ZytoDot® 2C SPEC MYC Break Apart Probe,
Non-Hodgkin Lymphom,
1 Fusions- und 1 Split-Signal pro Zellkern
Ringversuch News
Produktinformation
Bezeichnung
Bestell-Nr.
ZytoLight®, ZytoDot® und ZytoFast® sind eingetragene Marken unserer Partnerfirma ZytoVision GmbH, Bremerhaven.
*IC: interne Kontrolle
Neben der Anwendung des EGFR-Mutationsnachweises beim Lungenkarzinom können zukünftig
auch andere Mutationsnachweise an cfDNA interessant werden. In einer kürzlich gestarteten Kooperation zwischen AmoyDx® und Merck, Darmstadt, soll
die Untersuchung von KRAS-, NRAS und BRAF-Mutationen in klinischen Studien beim metastasierenden
ZytoDot® 2C SPEC BCL2 Break Apart Probe,
Normalgewebe, 2 Fusionssignale pro Zellkern
Produktinformation
®
Nachweisbare Mutationen mit dem SuperARMS™ EGFR Mutation Detection Kit
(C-3044-40) und unserem CISH-Standardprotokoll.
Für neue Gewebetypen sollte bei der Gewebevorbehandlung wie üblich eine Anpassung der PepsinEinwirkzeit durchgeführt werden.
Für die Auswertung von CISH Break Apart Sonden
empfehlen wir die Verwendung eines 100X Objektives (Öl-Immersion) mit hoher Apertur.
Non–Small Cell Lung Cancer, PD-L1, and the Pathologist
Kerr KM and Hirsch FR. Arch Pathol Lab Med 2016 April; 140:325-331
Programmed Death Ligand-1 Immunohistochemistry: Friend or Foe?
Die Autoren diskutieren in diesen beiden Publikationen die aktuelle Situation des PD-L1-Nachweises aus der Sicht des Pathologen und des Onkologen.
Insbesondere der Umstand, dass ein einzelnes Zielmolekül im Rahmen der Companion oder Complementary Diagnostics in Abhängigkeit von der in Frage
kommenden Therapie mit 4 oder mehr verschiedenen Methoden (und möglicherweise auch noch auf verschiedenen Immunfärbeautomaten) detektiert
werden soll, stellt die Pathologie nach Meinung der Autoren vor große, bisher nicht bekannte Herausforderungen.
Menge
Bestell-Nr.
1 Kit (24 Tests)
ADX-BL03-R
Kerr & Nicolson, 2016: “The biology of PD-1/PD-L1 is complex, the clinical data for these drugs show considerable variation, the selection performance of
the PD-L1 biomarker test is not perfect, and the existence of 4 drug/test combinations adds significantly to the problems faced.”
1 Set (10 Röhrchen)
ADX-VT01-R
Beide Publikationen sind auf archivesofpathology.org/toc/arpa/140/3 bzw. archivesofpathology.org/toc/arpa/140/4 frei verfügbar.
newsletter_02_16
Immunhistochemie bei Karzinomen mit
unbekanntem Primärtumor
In einem Übersichtsartikel in der Ausgabe vom Juni 2016
der Archives of Pathology & Laboratory Medicine stellen
Patricia L. Kandalaft und Allen M. Gown etablierte und
neue Antikörper für die Klassifikation von Karzinomen
mit unbekanntem Primärtumor (CUP) vor [1].
Darstellung von Arginase-1
am Leberzellkarzinom
Etwa 4 % aller Krebspatienten werden mit CUPs vorstellig. Die Identifikation des Primärtumors ist wegen unterschiedlicher Prognosen und Behandlungsoptionen, insbesondere vor dem Hintergrund neuer
zielgerichteter Therapien, von höchster klinischer
Relevanz. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener
neuer Genexpressionstests sehen die Autoren die
Immunhistochemie nach wie vor als Goldstandard
für die CUP-Diagnostik an.
Für die Aufarbeitung von CUP sind zwei Klassen von
Antikörpern hilfreich: (A) Antikörper gegen Keratine (Zytokeratine) und (B) Antikörper gegen zelloder organspezifische Marker.
Adenokarzinom der Lunge
GATA3-Nachweis
am Urothelkarzinom
Duktales Mammakarzinom
Serös-papilläres Ovarialkarzinom
Adenokarzinom des Endometriums
Hepatozelluläres Karzinom
Neuroendokrines Karzinom der Lunge
Nierenzellkarzinom
Adenokarzinom der Prostata
Plattenepithelkarzinom der Lunge
Urothelkarzinom
Napsin A-Nachweis
am pulmonalen Adenokarzinom
(Tabelle 2, modifiziert nach Kandalaft und Gown, 2016) [1]
Lokalisation des Signals
Sensitivität
Spezifität
Zusätzliche Reaktivität
Mamma
Östrogenrezeptoren
Nukleus
moderat
moderat
endometrioides Adeno-CA,
seröses Ovarial-CA
Mamma
GCDFP-15
Zytoplasma
niedrig
moderat
Speicheldrüse, Schweißdrüsentumoren
Mamma
Mammaglobin
Zytoplasma
niedrig
moderat
Speicheldrüse, Schweißdrüsentumoren
Mamma
GATA3
Nukleus
hoch
moderat
Speicheldrüse, Urothel-CA,
Adnextumoren der Haut
Kolorektum und GI
Villin
Zytoplasma und
Zytoplasmamembran
(Bürstensaum)
hoch
moderat
einige Lungen-CA, Ovarial- und
Endometrium-CA
Kolorektum
CDX2
Nukleus
hoch
hoch
einige Pankreas-, Magen- und
Ovarial-CA
Hepatozellulär
HepPar1
Zytoplasma
moderat
hoch
hepatoide Adeno-CA
Hepatozellulär
Arginase
Nukleus und Zytoplasma
hoch
hoch
TTF-1
Nukleus
hoch
hoch
neuroendocrine CA anderen Ursprungs
Napsin A
Zytoplasma
hoch
hoch
klarzellige gyn. CA, einige Nierenzellund Schilddrüsen-CA
Gynäkologische CA
PAX8
Nukleus
sehr hoch
moderat
Nierenzell- und Schilddrüsen-CA
Ovar (serös)
WT1
Nukleus
sehr hoch
hoch
Mesotheliom
80 - 100
Prostata
PSA
Zytoplasma
sehr hoch
sehr hoch
71 - 89
Prostata
NKX3.1
Nukleus
sehr hoch
sehr hoch
60 – 80
Nierenzell
PAX8
Nukleus
moderat
moderat
gyn. und Schilddrüsen-CA
Plattenepithel, Urothel
p63
Nukleus
sehr hoch
sehr hoch
Thymome, Speicheldrüsentumoren, einige neuroendokrine CA, trophoblastische
Tumoren, einige pulmonale Adeno-CA
Plattenepithel, Urothel
p40
Nukleus
sehr hoch
sehr hoch
Thymome, Speicheldrüsentumoren,
trophoblastische Tumoren
Schilddrüse
Thyreoglobulin
Zytoplasma
hoch
sehr hoch
Schilddrüse
PAX8
Nukleus
sehr hoch
moderat
Urothel
Uroplakine
Zytoplasmamembran
niedrig
hoch
Urothel
GATA3
Nukleus
hoch
moderat
Die in diesem Zusammenhang wichtigsten Keratine
sind Keratin 7 und Keratin 20, deren Expression in
verschiedenen Karzinomen in Tabelle 1 zusammengefasst ist. Daneben finden Antikörper gegen Keratin 5 (und 14) Verwendung, die dem Nachweis einer
plattenepithelialen, urothelialen, myoepithelialen
und mesothelialen Differenzierung dienen. Schließlich ist zur Unterscheidung von Karzinomen des pankreatobiliären Systems und Magenkarzinomen der
Nachweis von Keratin 17 hilfreich.
Keratin 7
Keratin 20
Häufigkeit dieses
Immunphänotyps [%]
+
+
+
+
+
+
+
75 - 95
Die organ- oder zellspezifischen Marker werden ihrerseits in zwei Gruppen unterteilt: (A) zytoplasmatisch
und/oder membranständig lokalisierte Differenzierungsmarker sowie (B) nukleäre Transkriptionsfaktoren. Die Expression der Differenzierungsmarker und der Anteil der für diese Marker positiven
Tumorzellen sind abhängig vom Differenzierungsgrad
Karzinom- bzw. tumorspezifische Antikörper
Antikörper gegen
(Tabelle 1, modifiziert nach Kandalaft und Gown, 2016) [1]
Kolorektales Adenokarzinom
stattdessen auf einen Übersichtsartikel [2], in dem
die aktuellen Empfehlungen der ISUP (International
Society of Urological Pathology) dargestellt werden.
Karzinomtyp
Verteilung der Keratin 7 und 20 Immunphänotypen in verschiedenen Karzinomen
Karzinomtyp
Tabelle 2 gibt eine Übersicht der wichtigsten organspezifischen Marker. Nicht berücksichtigt sind dabei
Marker für Keimzelltumoren. Die Autoren verweisen
90
80 – 95
> 90
Lunge (Adeno) und Schilddrüse
einschließlich neuroendokrin
Lunge (Adeno)
70 – 90
60 – 100
50 – 90
25 - 90
des Tumors. In stärker entdifferenzierten Tumoren findet man allgemein eine schwächere Expression und
weniger positive Zellen. Im Gegensatz dazu sind nukleäre Transkriptionsfaktoren meist in der gesamten
Tumorzellpopulation nachweisbar und ihre Expression
ist (nach Meinung der Autoren) weitgehend unabhängig vom Differenzierungsgrad.
gyn. und Nierenzell-CA
Mamma- und Speicheldrüsen-CA,
Adnextumoren der Haut
newsletter_02_16
Anmerkungen von P. L. Kandalaft und A. M.Gown zu den in Tabelle 2 genannten Markern [1] :
Die Publikation von Kandalaft
und Gown ist auf
archivesofpathology.org/toc/arpa/140/6
frei verfügbar.
GATA3: Um eine maximale Sensitivität zu erzielen, wird bei Verdacht auf Mammakarzinom der
Nachweis aller drei Mamma-spezifischen Marker, also GATA3, GCDFP-15 und Mammaglobin, empfohlen.
CDX2: Nahezu 100 % aller kolorektalen Karzinome sind CDX2-positiv. Eine Ausnahme stellen kolorektale
Karzinome mit Mikrosatelliten-Instabilität dar, die im Allgemeinen nur eine schwache oder sogar
fehlende CDX2-Expression zeigen [3].
Arginase-1: Während bis vor einigen Jahren α-Fetoprotein als der beste Marker für eine hepatozelluläre
Differenzierung angesehen wurde, stehen inzwischen mit HepPar1, Glypican-3 und Arginase-1 bessere
immunhistochemische Nachweise zur Verfügung. Arginase-1 zeigt dabei die höchste Sensitivität und
Spezifität und ist für die Identifizierung von Leberzellkarzinomen der Marker der Wahl.
PSA und NKX3.1: In einigen Fällen kann der kombinierte Nachweis von PSA und NKX3.1 für den
Nachweis von Adenokarzinomen der Prostata hilfreich sein. Antikörper gegen PSAP (Prostatic Acid
Phosphatase) werden dagegen wegen ihrer geringeren Spezifität nicht empfohlen.
PAX8: Für den Nachweis metastasierender Nierenzellkarzinome ist PAX8 ein sensitiver und robuster
Marker, der PAX2 inzwischen weitgehend ersetzt hat. Bei der Abgrenzung TTF-1 positiver Schilddrüsenkarzinome von TTF-1 positiven pulmonalen Adenokarzinomen hilft die PAX8-Immunhistochemie insofern
als dieses Protein in Adenokarzinomen der Lunge nicht nachweisbar ist.
Zytomed Systems bietet eine Vielzahl paraffingängiger Antikörper gegen organspezifische Marker an.
Die Antikörper sind zum Großteil als CE/IVD klassifi-
ziert und meist sowohl als gebrauchsfertige Lösungen für die Immunhistochemie als auch in konzentrierter Form erhältlich.
Produktinformation: organpezifische Antikörper (Auswahl)
Bezeichnung
Arginase-1
Klon: EP261 I Wirt: Kaninchen
[1] Kandalaft PJ and Gown AW. Practical
Applications in Immunohistochemistry: Carcinomas of Unknown
Primary Site. Arch Pathol Lab Med
140:508-523, 2016
[2] Ulbright TM et al.; Members of the
ISUP Immunohistochemistry in Diagnostic Urologic Pathology Group.
Best practices recommendations in
the application of immunohistochemistry in testicular tumors: report
from the International Society of
Urological Pathology consensus conference. Am J Surg Pathol 38:e50-e59,
2014
[3] Hinoi T et al. Loss of CDX2 expression and microsatellite instability
are prominent features of large cell
minimally differentiated carcinomas
of the colon. Am J Pathol 159:22392248, 2001
Verdünnung
Menge
Bestell-Nr.
-
konzentriert
1:100 – 1:200
6 ml
0,1 ml
0,5 ml
API3058AA
ACI3058A
ACI3058B
gebrauchsfertig
-
6 ml
MSG105
konzentriert
1:100 – 1:200
0,5 ml
MSK105-05
gebrauchsfertig
-
konzentriert
1:50 – 1:100
6 ml
0,5 ml
1 ml
RBG019
RBK019-05
RBK019
GATA3
Klon: L50-823 I Wirt: Maus
gebrauchsfertig
-
6 ml
MSG100
konzentriert
1:100 – 1:200
0,5 ml
MSK100-05
Napsin A
Klon: BC15 I Wirt: Kaninchen
gebrauchsfertig
-
6 ml
RBG059
konzentriert
1:100 – 1:200
0,5 ml
RBK059-05
NKX3.1
Klon: polyklonal I Wirt: Kaninchen
gebrauchsfertig
-
6 ml
RBG062
konzentriert
1:50 – 1:100
0,5 ml
RBK062-05
gebrauchsfertig
-
konzentriert
1:100 – 1:200
6 ml
0,1 ml
0,5 ml
1 ml
API438AA
ACI438A
ACI438B
ACI438C
konzentriert
1:50 – 1:100
0,5 ml
MSK101-05
gebrauchsfertig
-
konzentriert
1:200 – 1:500
gebrauchsfertig
-
konzentriert
1:100 – 1:200
6 ml
0,5 ml
1 ml
6 ml
0,1 ml
1 ml
MSG004
MSK004-05
MSK004
API3126AA
ACI3126A
ACI3126C
gebrauchsfertig
-
6 ml
MSG102
konzentriert
1:50 – 1:100
0,5 ml
MSK102-05
Cadherin 17 (CDH17)
Klon: 1H3 I Wirt: Maus
Literatur
Format
gebrauchsfertig
CDX2
Klon: EPR2764Y I Wirt: Kaninchen
PAX8
Klon: BC12 I Wirt: Maus
SATB2
Klon: SATBA4B10 I Wirt: Maus
TTF-1
Klon: 8G7G3/1 I Wirt: Maus
TTF-1
Klon: SPT24 I Wirt: Maus
Uroplakin II
Klon: BC21 I Wirt: Maus
PD-L1 Immunhistochemie
Von Dr. med. Till Braunschweig, Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Aachen
PD-L1 (Programmed Cell Death Ligand 1)
sowie der abhängige Rezeptor, PD1 (Programmed Cell death 1), wurden 2000 in
Ihrer Funktion und Interaktion beschrieben. PD-1 ist auf den T-Zellen in der Zellmembran lokalisiert. Durch Ligandenbindung wird die T-Zelle deaktiviert. Die
Ligandenbindung von PD-L1 an PD-1 wurde zunächst mit dem Effekt der Inhibition
der T-Zellproliferation und Verringerung der
Zytokinproduktion beschrieben. Eine weitere Funktion der zytotoxischen T-Zellen ist
die gezielte Einleitung der Apoptose von
Tumorzellen nach spezifischer Antigenpräsentation über Antigen-präsentierende
Zellen (APC), z. B. B-Lymphozyten und histiozytäre Zellen. Diese Inaktivierungswege
werden als Checkpoints bezeichnet. Zu
diesen Checkpoint-Rezeptoren zählen neben dem oben erwähnten PD-1 zum Beispiel auch CTLA4, CD28 und einige weitere.
Eine Bindung von Liganden bzw. Aktivierung des Rezeptors führt zu einer Deaktivierung der zytotoxischen T-Lymphozyten.
In physiologischen Situationen verhindern
APC Zellen durch Oberflächenexpression
von PD-L1 eine zytotoxische Reaktion der
interagierenden T-Zellen. Die Deaktivierung
von T-Zellen mittels Bindung von PD-L1 an
PD-1 stellt einen wesentlichen Escape-Mechanismus von Tumorzellen dar [1].
Innerhalb der letzten Jahre wurden einige
Inhibitoren entwickelt, die diese Checkpointmechanismen blockieren können, so
genannte Checkpoint-Inhibitoren. Eine der
ersten Zielstrukturen war CTLA4 [2]. Insbesondere bei Melanomen sehr effektiv, wurde Ipilimumab (Bristol-Myers-Squibb), ein
monoklonaler Antikörper, einer der ersten
von der European Medicines Agency (EMA)
zugelassenen Checkpoint-Inhibitoren. Es
folgten Inhibitoren von PD-1: Nivolumab
(Bristol-Myers-Squibb) und Pembrolizumab (MSD Sharp & Dohme). Der Einsatz
dieser PD-1 Inhibitoren ist, neben einer
Kombinationstherapie von Nivolumab mit
Ipilimumab beim fortgeschrittenen, nicht
mehr operablen malignen Melanom, das
nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC)
und für Nivolumab das Nierenzellkarzinom
(RCC) [3]. Bislang besteht die Zulassung
durch die EMA nur für das vorbehandelte, nicht operable NSCLC (sowohl Plattenepithelkarzinome als auch Adenokarzinome) für die so genannte second line
Therapie. Weitere Therapeutika mit einer
in den nächsten Jahren zu erwartenden
Zulassung für andere Karzinome, z. B. das
Harnblasenkarzinom, sind Atezolizumab
(Roche) und Durvalumab (Astra-Zeneca).
In den verschiedenen Studien wurden unterschiedliche immunhistologische Parameter in Bezug auf das Therapieansprechen
untersucht. Dabei konnte keine Abhängigkeit in Bezug auf die PD-1 Expression der
T-Lymphozyten gefunden werden. Die immunhistologische PD-L1 Expression wurde
als wesentlicher Parameter bei verschiedenen Tumoren beschrieben, wobei neben
der Expression von PD-L1 auf den Tumorzellen auch die PD-L1 Expression auf Antigenpräsentierenden Zellen als signifikant korreliert gefunden werden konnte [4].
In der momentanen Zulassungslage besteht für Nivolumab keine Notwendigkeit,
die Expression von PD-L1 in Tumoren zu
untersuchen. Bei Pembrolizumab ist für
die Anwendung bei NSCLC die PD-L1 Färbung bezüglich der Tumorzellen nötig. Eine
Expression von mindestens 1 % reicht dabei aus, wobei die Intensität der Färbung
und die Ausprägung der membranären
Anfärbung (geschlossen – partiell) keine
Rolle spielen. Der zukünftige Einsatz in der
Erstlinientherapie hat sehr wahrscheinlich höhere Cut-Off Werte. Bei den noch
nicht zugelassenen Therapeutika ist in
den bisherigen Studien insbesondere das
Atezolizumab hervorzuheben, da dort die
so genannten Immunzellen, am ehesten
APC, hinsichtlich ihrer PD-L1 Expression als
Stratifizierungswerkzeug genutzt werden.
Die verschiedenen Therapeutika verwenden dabei in den jeweiligen Studien diverse monoklonale Antikörper für die immunhistochemische Färbung, die in einer
Harmonisierungsstudie verglichen wurden.
Zum Einsatz kommen hier zwei Antikörper
der Firma DAKO, Klone 28-8 und 22C3 sowie
zwei Antikörper der Firma Roche/Spring,
Klone SP142 und SP263. Die Studie konnte
zeigen, dass die Spezifität identisch ist. Die
0
100
200
300 µm
Abbildung 1: Färbung von Plazenta mit anti-PD-L1, CAL10,
200x mit membranärer Färbung des Synzytiotrophoblasten.
0
100
200
300 µm
Abbildung 2: Färbung von Tonsillengewebe mit anti-PD-L1, CAL10,
200x mit membranärer Färbung Antigen-präsentierender Zellen APC).
0
100
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Abbildung 3: Färbung eines NSCLC, Plattenepithelkarzinoms, mit antiPD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung Tumorzellen (ca. 70 %).
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IC
T
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Abbildung 4: Färbung eines Plattenepithelkarzinoms, NSCLC mit
anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung von Tumorzellen
(T) und tumorassoziierten Immunzellen, APC (IC).
G
Intensität zeigte in dieser Studie ähnliche
Ergebnisse bei den zwei DAKO Antikörpern
und dem Roche SP142. Der Roche Antikörper SP263 war als ready-to-use Antikörper
deutlich intensiver [5]. Die Antikörper der
Firma DAKO sind seit kurzem verfügbar,
jedoch kostenintensiv zum Teil als Färbekit zu beziehen. Die Antikörper der Firma
Roche sind noch nicht regulär zu beziehen
und bislang nur als Färbekit und ebenfalls
kostenintensiv erhältlich.
Alternativen bieten weitere Firmen, als
Auswahl: Von der Firma Abcam wird häufig als Konzentrat der anti PD-L1 Antikörper,
Klon 28-8 (identisch mit den DAKO-Klon)
angewandt. Von der Firma Cell Signalling
existieren zwei Antikörper (E1L3N und E1J2J),
wovon der E1L3N häufig verwendet wird.
Auch der monoklonale Antikörper PD-L1
CAL10 (Biocare/Zytomed Systems) zeigt ein
identisches spezifisches Färbeergebnis und
ist dabei kontrastreich und präzise.
Für die Positivkontrolle wird Plazentagewebe eingesetzt, in dem der Synzytio-
trophoblast eine distinkte starke, membranäre Färbung zeigt (Abb. 1). APC in der
Tonsille können auch als Positivkontrolle
dienen, sind jedoch in ihrer Anzahl und
Färbeintensität variabel (Abb. 2). Im Tumorgewebe ist die Expression variabel,
unabhängig von der Auswertung der Tumorzellen oder APC (Abb. 3, Tumorzellen
und Abb. 4, APC bzw. Immunzellen).
Zur Auswertung für das Scoring im Rahmen
der klinischen Anwendung in der Pathologie kommt nur die membranäre Färbung
von PD-L1 zum Tragen. Dabei wird nur die
Anzahl der gefärbten Tumorzellen bzw.
APC in Prozent bestimmt. Die Problematik
der Auswertung ist zum einen die zu wertende Positivität auch sehr zarter membranärer Färbungen (Abb. 5) und die bereits in
der Zulassung von Pembrolizumab für das
NSCLC in der second line Therapie festgelegte Grenze von 1 %. Bei größeren histologischen Präparaten ist ein sehr genaues,
zeitintensives Durchmustern in höherer Vergrößerung notwendig [6].
Literatur
[1] Igney FH, Krammer PH. Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor
counterattack. J Leukoc Biol 71:907-920, 2002
[2] Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.
Nat Rev Cancer 12:252-264, 2012
[3] Ott PA et al. CTLA-4 and PD-1/PD-L1 blockade: new immunotherapeutic modalities
G
with durable clinical benefit in melanoma patients.Clin Cancer Res 19:5300-5309, 2013
[4] Sznol M, Chen L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of
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25
50
100 µm
advanced human cancer. Clin Cancer Res 19:1021-1034, 2013
[5] Scheel AH et al. Predictive PD-L1 immunohistochemistry for non-small cell lung
Abbildung 5: Färbung eines Plattenepithelkarzinoms, NSCLC mit
anti-PD-L1, CAL10, 400x mit membranärer Färbung von Tumorzellen:
die Problematik zeigt sich hier mit fraglich geringer membranärer
Färbung in 80 % oder doch nur prominente Zellgrenzen (z. B. G)?
cancer: Current state of the art and experiences of the first German harmonization
study. Pathologe Aug 10, 2016 [Epub ahead of print]
[6] Kerr KM, Hirsch FR. Programmed Death Ligand-1 Immunohistochemistry:
Friend or Foe? Arch Pathol Lab Med 140:326-331, 2016
Antikörper und Kontrollen für die PD-L1-Immunhistochemie
Bezeichnung
PD-L1 (CD274)
Klon: CAL10 I Wirt: Kaninchen
Format
Verdünnung
Menge
Bestell-Nr.
gebrauchsfertig
konzentriert
1:100 – 1:200
6 ml
0,5 ml
RBG063
RBK063-05
Menge
Bestell-Nr.
1 Packung mit
5 Objektträgern
HD787
Bezeichnung
CD274 (PD-L1) Expression IHC Reference Standard
Paraffinschnitte von Stanzen aus 4 Zellkulturblöcken mit unterschiedlicher PD-L1-Expression (- / + / ++ / +++)
Anhaltinerstraße 16 | 14163 Berlin | Fon +49 30 804 984 990 | Fax +49 30 804 984 999
[email protected] | www.zytomed-systems.de
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