Friedrich Loeffler Institut für Medizinische Mikrobiologie

Friedrich Loeffler Institut für Medizinische Mikrobiologie
Universitätsmedizin Greifswald KdöR
Leitfaden zum Praktikum
Pharmazeutische Biologie/Mikrobiologie
Wintersemester 2013/14
Über die durchgeführten Analysen ist im Praktikumsheft ein Kurzprotokoll (ggf. inkl.
Zeichnungen) anzufertigen.
Die Unterlagen sind an jedem Praktikumstag mitzubringen. Experimente gehen z. T. über mehrere
Praktikumskomplexe.
Praktikumsordnung
Das Praktikum besteht aus seminaristischer Einführung in die vorgegebenen Themen und zugehörigen
praktischen Übungen. Dazu wird eine Anwesenheitskontrolle durchgeführt.
Regeln für den Ablauf des Praktikums:
1. Während des Praktikums ist das Tragen von weißen Schutzkitteln Pflicht. Diese werden dem
Kursteilnehmer vom Institut zur Verfügung gestellt. Nach Beendigung jeder Übung werden sie am
zugewiesenen Ort aufbewahrt. Nach Abschluss des gesamten Kurses werden die Kittel gewaschen.
2. Rauchen, Essen und Trinken sind im Praktikumsraum streng untersagt. Infektionsgefahr!
3. Entstandene Kontaminationen von Personen (Mund, Gesicht, Augen oder Hände) bzw.
Kontaminationen von Sachen (Kleidung oder Arbeitsplatz) nicht verheimlichen, sondern sofort
melden, damit geeignete Maßnahmen (Desinfektion und „Erste Hilfe“) ergriffen werden können.
4. Nach Beendigung der Arbeiten sind die Arbeitsplätze aufgeräumt zu verlassen. Die zur Verfügung
gestellten Geräte, insbesondere die Mikroskope, und die Materialien sind pfleglich zu behandeln. Für
fahrlässige Beschädigungen hat der Verursacher finanziell aufzukommen.
5. Bei Bedarf, aber immer vor Verlassen des Praktikumsraumes sind die Hände gründlich zu
desinfizieren. Dazu lässt man etwa 3 ml Desinfektionsmittel aus den Spendern neben der
Wascheinheit im Kurssaal in die Handfläche laufen. Anschließend erfolgt eine Einwirkzeit über 30
Sekunden. Während dieser Zeit werden im Wechsel Handfläche und Handrücken der beiden Hände,
Finger und Fingerkuppen mit dem Desinfektionsmittel eingerieben.
Grundausrüstung auf den Arbeitsplätzen:
-
-
Mikroskop mit 3 Objektiven. Objektiv „Achromat 100/1,25 Oil“ darf nur mit Immersionsöl
benutzt werden. Nach Gebrauch Objektive mit weichem Lappen reinigen! Achten Sie bitte darauf,
dass die übrigen Objektive nicht mit Immersionsöl verschmutzt werden.
Immersionsöl
Objektträger und Deckgläschen
physiologische NaCl-Lösung (0,9%) in Ampullen
Impfösen (für Einmalgebrauch: zur Entsorgung sofort nach Gebrauch in die gelben Abfallbehälter
geben)
Pinzette
Filterpapier zum Trocknen der Präparate
Bleistift
Glasschreiber
Gefäße zum Entsorgen infizierter Materialien einschließlich gebrauchter Präparate.
Die Färbebank mit den benötigten Utensilien befindet sich über einer Abflusswanne. Bitte nur an den
bezeichneten Plätzen Färbungen ausführen!
Der Institutsdirektor
Greifswald, Mai 2013
2
Mikroskopischer und kultureller Nachweis von Bakterien
Kurs 1
1.)
Mikro-Morphologie von Bakterien (Darstellung mit Methylenblaufärbung)
Fixierte Fertigpräparate werden mit Methylenblau nach Loeffler gefärbt (ab Punkt 6).
Nach der Färbung einen Tropfen Immersionsöl auf den Objektträger geben (auf die getrockneten
Präparate)
Mikroskopieren mit dem Objektiv 100x (mit schwarzem Ring) speziell für Ölimmersion
 Bakterien u. a. Zellen blau
Morphologie (Skizze, Beschreibung)
Präparat 1
Präparat 2
Präparat 3
Präparat 4
2.)
Mikro- und Makro-Morphologie von Bakterien
2.1
Analyse eines Rachenabstriches
2.1.1
Anlegen einer Kultur
Entnehmen Sie sich gegenseitig mit Abstrichtupfern Material aus dem Rachen des
Praktikumpartners und streichen dieses auf Blutplatten fraktioniert aus: mit dem Abstrichtupfer über die
Blutplatte streichen (1), mit einer Impföse parallele Impfstriche in 1. Hälfte der Blutplatte ausstreichen (2),
dann Platte um 90° drehen und die 2. Hälfte beimpfen (3). Jeweils neue Impföse verwenden (siehe
Skizze). Inkubation: 24 h 36°C, dann werden die Platten bis zum nächsten Praktikum kühl aufbewahrt.
Auswertung im Praktikum Teil II.
1. Tupfer auf Blutplatte
ausstreichen
2. mit Impföse das ausgestrichene Material
„ausdünnen“
3. mit neuer Impföse Material weiter
„ausdünnen“  Ziel: Einzelkolonien
3
2.1.2
Darstellung mittels Differentialfärbung nach Gram
Entnehmen Sie mit einem 2. Tupfer erneut Material (mehrmals abstreichen!!), bringen dieses Material
auf einen Objektträger aus und färben das getrocknete und hitzefixierte Präparat nach Gram.
Mikroskopieren und zeichnen Sie (+ kurze Beschreibung).
2.2 Subkultivierung und Differenzierung von Bakterien
2.2.1
Anlegen einer Subkultur
Entnehmen Sie etwas Material von den Schrägagar-Kulturen (K1, K2, K3, K9) und streichen es auf einer
Blutplatte fraktioniert aus (s. 2.1.1). Pro Keim wird eine halbe Blutplatte beimpft.
Inkubation für 24 h bei 36°C
2.2.2
Differenzierung mittels Gramfärbung
Fertigen Sie Präparate von den Bakterienkulturen K1, K2, K3 und K9 und färben diese nach Gram
- Objektträger beschriften
- sehr kleinen Tropfen physiologische NaCl auf Objektträger geben
- sehr kleine Menge einer Kolonie von Schrägagar mit sterilem Spatel entnehmen
- vorsichtiges Verrühren in der NaCl-Lösung
- Lufttrocknen
- Fixierung des Objektträgers: mit Pinzette festhalten und 3x sehr kurz durch die Flamme ziehen
- Durchführung der Gramfärbung nach Vorschrift
Mikroskopieren Sie Ihre Präparate. Beachten Sie das Gramverhalten (grampositiv, gramnegativ) sowie die
Morphologie der Bakterien.
Nr
Gramverhalten / Morphologie
Nr
K1:
K3:
K2:
K9:
Gramverhalten / Morphologie
Zeichnen Sie nach dem mikroskopischen Bild (Tab. S. 16 + 17)
Welche Aussagen ergeben sich aus dieser Zuordnung bezüglich des Zellaufbaus der Bakterien?
3.) Differenzierung von verschiedenen Keimgruppen
Differenzieren Sie die vorgegebenen Keime mittels Gramfärbung, Katalase-Test und Hämolyseverhalten
3.1
Mikroskopieren Sie die vorgegebenen Fertigpräparate (Zeichnung und kurze
Beschreibung im Protokoll, Tab. S. 16 + 17)
4
Kurs 2
5.
Desinfektion
Zur Keimreduktion werden abhängig vom Material unterschiedliche
Desinfektionsmethoden angewendet:
Physikalische Verfahren (trockene und feuchte Hitze)
Chemische Verfahren
UV-Strahlen
Ionisierende Strahlen
Sterilisations-
und
Vergleichen Sie verschiedene Möglichkeiten zur Keimreduktion (waschen mit Wasser, desinfizieren mit
alkoholhaltiger Lösung). Legen Sie die Fingerkuppen der rechten Hand nach folgendem Schema auf eine
Petrischale mit Blut-Agar:
a) Auflegen der Tageshand
*vor,
*nach dem Reinigen / Desinfizieren.
b) Kontamination der Fingerkuppen mit einer Bakterienkultur
Auflegen der Fingerkuppe auf den Nährboden
*vor, *nach dem Reinigen / Desinfizieren
Die Auswertung erfolgt in Kurs 3 (siehe Schema S. 18)
Fortsetzung: Differenzierung von Bakterien
3.2
Werten Sie die Kulturen K4, K5, K6 und K7 aus, beziehen Sie dabei die Merkmale:
Koloniegröße, Hämolyseverhalten, Verhalten im Katalase-Test u.a (s.unten) mit ein
Hämolyse
Die Zerstörung der Erythrozyten der Blutplatten und die Zersetzung des Hämoglobins führen zu
Veränderungen, die als Hämolyse bezeichnet werden.
Hämolyse ist ein wichtiges diagnostisches Merkmal, vor allem für Streptokokken und für
Staphylococcus aureus.
-Hämolyse
ß-Hämolyse
(-Hämolyse)
nur partielle Hämolyse, Grünfärbung durch
Met- und Sulfhämoglobin
klarer, durchsichtiger Hof um die Kolonien
Ursache: Reduktion des
Hämoglobins
Ursache: Zerstörung der
Erythrozyten (Hämolysine)
anhämolytische Keime -> keine Veränderung
des Hofes um die Kolonien
Katalasetest
Das eisenporphyrinhaltige Enzym Katalase wird von vielen Spezies gebildet, Anaerobier und
Mikroaerophile (Streptococcus, Lactobacillus) bilden es nicht.
Katalase wandelt im Energiestoffwechsel gebildetes Wasserstoffperoxid (bei Akkumulation toxisch) in
Wasser und molekularen Sauerstoff um.
Plasmakoagulasereaktion
a) Freie Koagulase (extrazelluläres Enzym) bindet an Prothrombin und aktiviert die Entstehung von
Fibrin aus Fibrinogen
 Nachweis im Röhrchen-Agglutinations-Test:
- in NaCl aufgeschwemmte Staphylokokken werden in EDTA-Plasma vom Kaninchen eingebracht
- ist freie Koagulase vorhanden, agglutiniert das Kaninchenplasma innerhalb von 4 h
5
b) Clumping Faktor (zellwandgebundenes Protein) = Fibrinogenrezeptor
 Nachweis mittels Latex-Agglutinationstest
- Latexpartikel sind mit Fibrinogen, IgG und spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen
Kapselpolysaccharide von Staph. aureus sensibilisiert
- Stämme mit starken Polysaccharid-Kapseln werden von den monoklonalen antiPolysaccharidantikörpern agglutiniert
- schwach bekapselte Stämme und Stämme, die ihre Kapsel verloren haben, werden durch das
Fibrinogen und IgG agglutiniert
- Material von einer Staphylokokken-Kolonie wird in das Latexreagenz eingerieben,
Staph. aureus-Stämme (Clumping-Faktor positiv) agglutinieren (verklumpen)
3.3
Ordnen Sie die Stämme K2, K3, K4 und K7 entsprechend den oben beschriebenen
Merkmalen zu (Strepto- oder Staphylococcus) (Tabelle S. 16)
Nutzen Sie auch die Ergebnisse der mikroskopischen Analyse (2.2 / 3.2)
Differenzierung: Micrococcaceae (Staphylococcus, Stomatococcus mucilaginosus) vs Streptococcus
Gramverhalten
grampositiv
grampositiv
Katalase
positiv
negativ
Differenzierung: Staphylococcus
Katalase
Koagulase
Positiv
positiv
Positiv
negativ
 Staphylococcus
 Streptococcus
 Staphylococcus aureus [sowohl invasive (z.B.
Abszeß) als auch toxinbedingte (z.B. Enteritis)
Erkrankungen]
 "Koagulasenegative Staphylokokken"
[z.B. S. epidermidis (nosokomiale Infektionen,
„Plastikinfektionen“) ,
S. saprophyticus (Harnwegsinfektionen)]
Differenzierung: Streptococcaceae (Streptococcus, Enterococcus)
Beispiele:
Mikroskop. Bild
Hämolyse
Ketten
ß-Typ
 S. pyogenes (Scharlach, Pharyngitis, eitererregende
Streptokokken, Lancefield-Serogruppe A)
Diplokokken / Ketten -Typ
 „vergrünende Streptokokken“
S. pneumoniae (Pneumonie, Meningitis)
S. sanguis (auch anhämolytisch) (Karies)
Ketten
 S. salivarius
meist -Typ
 (z.T.anhämolytisch)  orale Streptokokken, z.B. S. mutans
(Plaque, Karies)

S.
milleri (Endokarditis)
/ ß/ anhämolytisch
Diplokokken
 Enterokokken, z.B. Enterococcus faecalis,
/ anhämolytisch
E.faecium
(Lokalinfektionen, Harnwegsinfektionen)
3.4
Differenzierung enteropathogener gramnegativer Stäbchen
Durch Nutzung der angebotenen Substrate (Kohlenstoff-, Stickstoffquelle) kann sich der pH-Wert des
Mediums ändern. Über den Zusatz von Indikatoren zu den einzelnen Nährmedien ist diese Änderung als
Farbumschlag erkennbar
6
3.4.1 Differenzierung mittels MacConkey II-Agar
Mit ausgewählten Medien können Bakterien anhand bestimmter Eigenschaften selektiert werden.
Selektivmedium: Wachstum von Mikroorganismen, die besondere Eigenschaften aufweisen
Bsp.: Medien, die mit Antibiotika angereichert sind  es wachsen nur die Mikroorganismen, die gegen
das verwendete Antibiotikum resistent sind
Differentialmedium: Wachstum von verschiedenen Mikroorganismen mit unterschiedlicher
Koloniemorphologie erlaubt eine Differenzierung
MacConkey-Agar:
- enthält Gallensalze und Kristallviolett (Selektivmedium)
 Wachstum von gram-positiven Bakterien wird weitgehend verhindert
 Wachstum verschiedener gramnegative Darmbakterien wird gefördert
- enthält Laktose als C-Quelle und Neutralrot als pH-Indikator (Differentialmedium)
 Laktose fermentierende (vergärende) Bakterien werden über den Farbumschlag von
Neutralrot identifiziert (Kolonien laktosepositiver Bakterien färben sich rot;
Kolonien laktosenegativer Organismen bleiben farblos).
Überprüfen Sie das Wachstum Ihres zu identifizierenden Stammes auf MacConkey Agar
(Reinheitskontrolle zur biochemischem Differenzierung).
Handelt es sich um einen laktose-positiven oder –negativen Stamm? Stimmt diese Reaktion mit der
Reaktion in der „Bunten Reihe“ überein (Tab. S. 17)?
3.4.2 Analyse des biochemischen Profils von Bakterien-Stämmen
Werten Sie die im Mikrostrip befindlichen Reaktionen (Inkubation 24 h, 36°C) mit Hilfe der Tabellen aus
und identifizieren Sie die Ihnen vorgegebenen Keime.
Enterobakterien: biochemische Leistungsprüfung (klassisches Identifizierungverfahren)
Substrat
Glukose u.a. Zucker
Ammoniumzitrat
Reaktion
Säurebildung, Gasbildung
Alkalisierung durch Verwertung von
A.-Zitrat als einzige Stickstoffquelle
S-haltige Aminosäuren H2S-Bildung
Harnstoff
Tryptophan
NH3-Freisetzung
Indolspaltung
Nachweis über Indikation
Bromthymolblau, grün  gelb
Bromthymolblau, grün  blau
Zugabe von Fe3+Sulfid-Bildung:
Schwarzfärbung
Phenolrot gelb  rot
Zugabe von Dimethylaminobenzaldehyd Rotfärbung
Biochemische Reaktionen
Nachweis von …
Enzymen der Atmungskette
Verwertung von Kohlenhydraten
(Assimilation und Fermentation)
Abbau von organische Säuren
Enzymen des Proteinstoffwechsels
Desaminasen und Decarboxylasen
weiteren Enzymen
(Pathogenitätsfaktoren)
Beispiele
Cytochromoxidase, Katalase, Nitratreduktase
Zucker,.Zuckeralkohol-,Glykosid-Verstoffwechslung
(Säurebildung) unter aeroben und anaeroben Bedingungen
Citratverwertung
Bildung von Schwefelwasserstoff
Abbau von Tryptophan (Indolbildung)
Spaltung von Aminosäuren ( Ornithin, Lysin)
Ureasebildung
Plasmakoagulase
Hämolysine
7
Auswertung 2.1.1
Rachenabstrich
Werten Sie Ihre Blutagarplatte aus  ist eine Reinkultur gelungen (sind unterschiedliche
Einzelkolonien erkennbar? Wie sehen die Kolonien aus? Welche Keimgruppen erwarten Sie im
Rachenraum? Welche dieser Keimgruppen können Sie bei optimalen Bedingungen auf Ihrer
Agarplatte erwarten, welche nicht?
4.
Prüfung der Resistenz von Bakterien
zur vollständigen Diagnostik gehört neben der Identifizierung der Mikroorganismen auch
die Empfindlichkeitsprüfung der Keime gegen verschiedene Antibiotika
(erfolgt im Kurs bei Frau Dr. Wurster)
Kurs 3
Auswertung 5
Desinfektionsversuch (s. Tabelle S18)
Welche Aussagen lassen sich aus den Ergebnissen ableiten?
6.
Differenzierung von sporenbildenden Bakterien
- mikroskopieren Sie die Fertigpräparate P4, P5, P6, P7
- Identifizieren Sie die Bakterien nach Lokalisation der Spore
- beziehen Sie den Sauerstoffbedarf (aerobes/anaerobes Wachstum) mit ein
- Protokollieren Sie die jeweils assoziierten Krankheitsbilder
Nr
Sporenform und –lokalisation (Zeichnung), O2Bedarf
Keim-Name
assoz. Erkrankung
P4
P5
P6
P7
8
7.
Differenzierung weiterer Erreger über Kultur und Präparat
Mikroskopieren Sie die Fertigpräparate P16 und P17, die von den Kulturen K16 und K17 angefertigt
vorliegen (Methylenblaufärbung).
Beurteilen Sie die Koloniemorphologie. Vergleichen Sie makroskopisches und mikroskopisches Ergebnis.
Ziehen Sie Ihre bereits vorhandenen Protokolle von identifizierten Erregern hinzu
Nr
Präparat (Zeichnung)
Koloniemorphologie
Keim
16
17
8.
Demonstration von Pilzkulturen
Mikroskopieren und zeichnen Sie die vorgegebenen Pilzpräparate, arbeiten Sie die Unterschiede zwischen
den Gattungen heraus.
P8
Name:
Merkmale:
Bedeutung:
P9
Name:
Merkmale:
Bedeutung:
P10
Name:
Merkmale:
Bedeutung:
P11
Name:
Merkmale:
Bedeutung:
9
Kurs 4
Virologie
10.
Quantitative Virusbestimmung mit dem Hämagglutinationstest (HA)
Prinzip des Testes:
EinigeViren (Influenza, Röteln, Adeno) besitzen Antigene mit hämagglutinierenden Eigenschaften.
Erythrozyten werden durch das Hämagglutinin zu einem Netz verknüpft.
Material auf den Arbeitsplätzen
PBS: isotone phosphatgepufferte Kochsalzlösung
AG: Virusantigen wird einzeln ausgeteilt
ER: Erythrozyten
Durchführung:
Teil 1: Virusverdünnungsreihe auf der log Basis 2 erstellen.
- 50 µl PBS pro well in eine Querreihe (insgesamt 12 wells) der Mikrotiterplatte pipettieren
(jeder Student setzt eine Reihe an!).
- 50 µl Virusantigen AG in well 1 geben, mischen
- 50 µl aus well 1 in die zweite Vertiefung geben, überpipettieren u.s.w bis well 12
- 50 µl Erythrozytensuspension (ER) in jede der 12 Vertiefungen
- mischen durch leichtes Klopfen an die Platte
- Inkubation ca 1 Std. bei Raumtemperatur
Teil 2: Auswertung
Die höchste Virusverdünnung, bei der eine Hämagglutination erkennbar ist, ist als
eine hämagglutinierende Einheit festgelegt.(1HE)
Welche Verdünnung der Virussuspension entspricht in der Analyse einer hämagglutinierenden Einheit?
______________________
Welche Verdünnung muss eingesetzt werden um 4 hämagglutinierende Einheiten zu haben? ____
4 HE werden bei der Durchführung des Hämagglutinations-Hemmtestes eingesetzt zur quantitativen
Bestimmung von Antikörpern
Prinzip
Serumverdünnungsreihe
4 HE ( quantifizierte Virussuspension)
Erythozyten
Hemmung der Hämagglutination wenn Antikörper vorhanden sind.
10
11.
Nachweis viraler Nukleinsäuren mit Hilfe der Polymerasenkettenreaktion
11.1
Qualitativer Nachweis von Virusnukleinsäure
Prinzip der Methode :
Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnittes von Viren (bei RNA-Viren ist vorherige
Umschreibung in cDNA erforderlich).
Durchführung:
Die nachfolgenden Arbeitsschritte 1. bis 3. wurden bereits im Labor durchgeführt
1.
Reaktionsansatz (z.B.):
Mastermix [Aqua dest + dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) + 10x Taq-Reaktionspuffer (Tris-HCL, MgCl2,
KCl) + Primer 1 + Primer 2 + Taq-DNA-Polymerase (= 1 Einheit)
49µl
DNA
1µl
2. Amplifikationsschritte im Thermocycler:
Enzymaktivierung (95°C, 5 min)
30 Zyklen [Denaturierung (
95°C, 45 sec), Annaeling (55°C, 90 sec), DNA-Synthese (72°C;
90 sec)]
3. Nachweis der Amplifikate
3µl Probenpuffer vorlegen
5µl Amplifikat (nach 30 Zyklen) zugeben
 auftragen auf 3%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid (10µg/ml)
Elektrophorese 30 min 120V, Auswerten unter UV-Licht.
Die Beurteilung der Reaktion erfolgt anhand der Banden-Laufweite
Werten Sie die vorgegebenen Gel-Bilder aus.
Ordnen Sie den einzelnen Lauf-Spuren den jeweiligen Erreger zu.
Erwartete Amplifikatlänge:
Hepatitis B – Virus
Adenovirus
Herpes simplex – Virus
Enterovirus
11.2
400 bp
198 bp
150 bp
119 bp
DNA-Längenstandard
Quantitativer Nachweis von Virusnukleinsäure
In der real-time PCR kommen zusätzlich zum klassischen Reaktionsansatz Detektionssysteme (hier
fluorogene Sonden) bereits während der PCR zum Einsatz. Diese Kombination im one-tube Verfahren
ermöglicht die simultane Amplifikation und Detektion. Über Kontroll-Material mit definierter Kopienzahl
ist neben der Detektion auch eine Quantifizierung positiv gemessener Proben möglich.
Werten Sie die vorgegebenen Real-time PCR Protokolle aus.
Die Kontrollen sind auf ~1000 Kopien/ml eingestellt. Wie hoch ist die viral load der positiv gemessenen
Proben (die Differenz von 4 Ct-Werten entspricht etwa dem Faktor 10).
11
12.
Virusanzucht in der Zellkultur,
Nachweis und Quantifizierung über zytopathischen Effekt (CPE)
Prinzip der Methode
Viren als obligate Zellparasiten verändern die Zellen in ihrer Morphologie, z.T. virusspezifisch
Material auf den Arbeitsplätzen: Objektträger mit zwei verschiedenen Zellarten nach Virusinfektion
und nichtinfizierten Zellen als Kontrolle
Durchführung
Im Labor wurde eine Virus-Verdünnungsreihe von 10-1 bis 10-7 hergestellt, aus der die verschiedenen
Zellkulturen (obere und untere Reihe) mit der jeweiligen Virusverdünnung infiziert und bei 37°C für 4
Tage inkubiert wurden
Well
1 bis 7: Zellen mit Virus infiziert
Well
8:
Zellen nicht infiziert
Mediumzusammensetzung:
Anorganische Salze
Ca, K, Mg, Na
BME-Eagle
Aminosäuren
12 verschiedene
Vitamine
9 verschiedene
Andere Komponenten
Glukose, Phenolrot
Auswertung
Für die Auswertung im Praktikum wurde der Objektträger mit Azeton fixiert Mikroskopieren mit kleiner
Vergrößerung (kein Öl verwenden)
Welcher Zelltyp liegt in der oberen bzw unteren Verdünnungsreihe vor
a) epitheloid
oder b) fibroblastoid
- Mikroskopieren Sie die Ihnen bereitgestellte virusinfizierte Zellkultur
- bestimmen Sie den Virustiter über den zytopathischen Effekt (virusbedingte Zellveränderung)
(Der Endpunkt ist definiert durch das Zellkulturareal, in dem noch ein zytopathischer Effekt im Vergleich
zur Kontrolle zu beobachten ist).
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
Zellkontrolle
Zelltyp
13.
Nachweis von Antikörpern im Serum mit verschiedenen Methoden
13.1
ELISA
Testprinzip:
Der im Humanserum vorhandene Antikörper bildet mit dem auf der Mikrotiterplatte fixierten ErregerAntigen einen Immunkomplex. Mit diesem Komplex verbindet sich ein enzymmarkierter sekundärer
Antikörper = [(anti-human) Ziege-Meerrettich Peroxidase Konjugat].
Nach Zugabe von Substratlösung TMB (farblos) wird durch die Enzymaktivität (Peroxidase) ein blauer
Farbstoff entwickelt, der durch Zugabe der Stopplösung (stark sauer) in gelb umschlägt.
12
Benötigte Materialien:
PBS (Probenverdünnungsmittel), Kontrollen (negativ, schwach positiv = cut-off, positiv), Konjugat [(antihuman) Ziege-Meerrettich-Peroxidase Konjugat], Substratlösung, Stopplösung
Patientenserum
Durchführung:
Kontrollen und Patientenseren 1 : 100 in PBS verdünnen und nach folgendem Schema 100 µl in den
Mikrotiterstreifen pipettieren.
1
2
3
4-8
-
Negativ-Kontrolle (nK)
cut off (schwach positiv) (co)
Positiv-Kontrolle (pK)
Pat. 1 bis Pat . 5
1 h Inkubation 37°C
Waschprozeß
50 µl Konjugat
bis hier vom Labor vorbereitet
100 µl Substratlösung B (TMB=Tetramethylbenzidin-Substratlösung)
5 min Reaktionszeit
100 µl Stopplösung (Stop = Citratlösung)
Umwandlung von blau nach gelb  Visuelle Auswertung
Werten Sie den ELISA-Test für HCV aus.
Bei welchen Proben muss ein Bestätigungstest in Form eines Immunoblots (IBL) durchgeführt werden?
nK
co
pK
Pat.1
Pat. 2
Pat. 3
Pat. 4
Pat. 5
Ergebnis
IBL (j/n)
13.2
Immunoblot (IBL): Nachweis von Antikörpern spezifisch gegen einzelne Proteine
Testprinzip:
Im humanen Serum vorhandene erregerspezifische Antikörper binden an membran-gebundene ErregerAntigene und bilden Immunkomplexe. Daran bindet ein sekundäres enzymmarkiertes Anti-HumanImmunglobulin (Anti-IgG, Anti-IgM, Anti-IgA), durch Substratumsatz (s. ELISA) werden die Reaktionen
sichtbar und so die entsprechenden Antikörpersubgruppen nachgewiesen.
– die Besonderheit jedes IBL liegt in der Art und Menge der an die Membran gebundenen Antigene
– Erregerproteine werden nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend auf NitrocelluloseMembran übertragen (Erregerlysat vs. rekombinant gewonnene Antigene)
Immunoblots werden meist als Bestätigungs-Tests vorhergehender Suchtests (ELISA) eingesetzt.
Werten Sie das Bandenmuster der Immunoblots für die Seren aus, die im Versuch 13.1 im HCV-ELISA
reaktiv waren (s. Abb. S. 18). Welche Aussagen können Sie für die einzelnen Patienten treffen?
Nr.
Strept.
C1
C2
E2
NS3
NS4
NS5
Interpretation
01
15
9
17
04
13
Färbeverfahren für Bakterien
Übersichtsfärbung (Methylenblau) nach Loeffler:
1. Objektträger putzen.
2. 1 Tropfen Kochsalz-Lösung aufbringen.
3. Bakterienhaltiges Material im Tropfen verreiben
(Vorsicht! Nicht zu viel Material einsetzen)
4. Lufttrocknen (Die Präparate müssen völlig trocken sein).
5. Fixieren: 5mal durch die Gasflamme ziehen (bakterienhaltige Fläche nach oben).
6. Loeffler`s Methylenblaulösung, 2 Min. (Objektträger vollständig bedecken).
7. Mit Wasser spülen.
8. Zwischen Fließpapier trocknen.
 Bakterien u.a. Zellen blau
Differentialfärbung nach Gram = Gramfärbung:
1.-5. wie Übersichtsfärbung.
6. Gentianaviolett-Phenol-Lösung, 1 Min.
7. Mit Wasser spülen.
8. Lugol`sche Lösung (Jod-Kaliumjodid), 1 Min.
9. Mit Wasser spülen.
10. 96% Ethanol (Küvette): schwenken, bis keine Farbwolken mehr herausgelöst werden.
11. Fuchsin-Phenol-Lösung, 1 Min.
12. Wie Übersichtsfärbung 7.-8.  grampositive Bakterien blauviolett, gramnegative Bakterien rot
Färbung zur Darstellung metachromatischer Granula nach Neisser:
1.-5. Wie Übersichtsfärbung
6. Neisser I, 25 Sek.
7. Farbstoff abgießen und Objektträger zwischen Fließpapier trocknen.
8. Neisser II, 15 Sek.
9. Wie 7. (nicht spülen!)
 gelbbraune Bakterien, Polkörperchen fast schwarz
Färbung zur Darstellung säurefester Stäbchen nach Ziehl-Neelsen:
1.-5. Wie Übersichtsfärbung.
6. Karbol-Fuchsin-Lösung: Objektträger vollständig bedecken, 3mal bis zur
Dampfbildung erhitzen.
7. Mit Wasser abspülen.
8. Salzsäure-Alkohol: bis keine Farbwolken mehr herausgelöst werden.
9. Mit Wasser spülen.
10. Loeffler`s Methylenblau-Lösung, 1 Min.
11. Mit Wasser spülen.
12. Zwischen Fließpapier trocknen.
 säurefeste Stäbchen rot, übrige Bakterien u.a. Zellen blau
Tusche-Färbung zur Kapseldarstellung nach Burri:
1. 1 Öse Tusche (evt. 1:2 verdünnt mit A.dest) auf gründlich gereinigten Objektträger aufbringen
2. sehr kleine Menge einer jungen Bakterienkultur einbringen
3. bakterienhaltigen Farbstoff mit einem Objektträger wie beim Blutausstrich verteilen
4. nach Trocknen mikroskopieren
 Bakterien = helle Aussparungen auf dunklem Grund
Sporenfärbung:
1.-5. Wie Übersichtsfärbung
6. mit Malachitgrünlösung Objektträger vollständig bedecken, ca. 1 Min. bis zur Blasenbildung erhitzen
7. 10 Sekunden wässern.
8. 15 Sek. gegenfärben mit Safraninlösung oder Fuchsinlösung
9. Wie Übersichtsfärbung 7.-8.
 grüne Sporen in bräunlich / rötlichem Sporangium
14
Differenzierung von Bakterien Teil 1
Keim
Kolonie
morphologie
(Größe, Randbeschaffenheit,
Schleimbildung)
mikroskopisches
Bild
(Zeichnung)
Gram-Verhalten
Katalase-Test
Clumpingfaktor
Hämolyse-Typ
Identifizierung
K2
K3
K4
K5
K6
K7
Differenzierung von Bakterien Teil 2
Keim
Koloniemorphologie (Größe, Randbeschaffenheit,
Farbe, Schleimbildung)
mikroskopisches GramBild
Verhalten
(Zeichnung)
Wachstum auf „Bunte Reihe“
MacConkeyLactoseAgar (+Lactose- fermentation
fermentation)
Identifizierung
K8
K9
K10
K11
K12
K13
K14
K15
16
Zu Aufgabe 3.4.2: Identifizierung von gramnegativen fakultativ anaeroben Stäbchen
(Enterobacteriaceae) mit Hilfe von biochemischen Reaktionsprofilen („Bunte Reihe“)
Glukose
Laktose
AmmoniumZitrat
H2S
Urease /
Indol
Ornithin
Rhamnose
negativ
grün
grün
grün
hell
hell
grün
positiv
orange
orange
blau
schwarz
hell
Urease:
pink
Indol:
roter Ring
Urease /
Indol
violett
orange
E. coli
+
+
-
-
- / +
d
d
Enterobacter cloacae
+
d
+
-
- / -
+
+
Klebsiella
pneumoniae
+
+
+
-
(+) / -
-
+
Klebsiella oxytoca
+
+
+
-
(+) / +
-
+
Citrobacter spp.
+
(+)
+
+
- / -
d
+
Proteus mirabilis
+
-
d
+
+ / -
+
-
Proteus vulgaris
+
-
d
+
+ / +
-
-
Morganella morganii
+
-
-
-
+ / +
+
-
Providencia rettgeri
+
-
+
-
+ / +
-
d
Serratia marcescens
+
-
+
-
- / -
+
-
Salmonella spp.
+
-
+
+
- / -
(+)
+
Pseudomonas
aeruginosa
-
-
+
-
-/-
-
-
Spezies:
Eigenes Isolat
+
(+)
d
=
=
=
=
negativ
positiv
positiv, langsame Spaltung
kann sowohl + als auch – sein, verschiedene biochemische Typen
zu Aufgabe 5
Ablaufschema: Desinfektionsversuch
Test 1
Test 2
Tageshand
Tageshand
mit E. coli
nach Desinfektion
nach dem Waschen mit
Wasser
kurzes Auflegen der
Fingerkuppe auf den
Nährboden
kurzes Auflegen der
Fingerkuppe auf die
vorgegebene
Bakterienkultur, dann
auf den Nährboden
Hände desinfizieren mit
„STERILLIUM“, dann
kurzes Auflegen der
Fingerkuppe auf den
Nährboden
normales Händewaschen nur
mit Wasser, dann kurzes
Auflegen der Fingerkuppe
auf den Nährboden
1. Gruppe
X
2. Gruppe
X
X
X
3. Gruppe
X
4. Gruppe
X
X
X 1)
1)
danach Hände desinfizieren mit „Sterillium Virugard“
Auswertung:
1. Gruppe
2. Gruppe
3. Gruppe
4. Gruppe
zu Aufgabe 13.2: Nachweis und Differenzierung von Antikörpern (Bsp. HCV)
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