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Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel
Moleküle aufgrund ihrer Ladung und ihrer Grösse aufgetrennt werden. Während auf Agarose die
Serumproteine nur in die grösseren Gruppen Albumin, α1- und α2-, β1- und β2-, und γ-Globuline
aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Dutzende verschiedener Serumproteine zu unterscheiden. Ausschliesslich nach der Grösse aufgetrennt werden Proteine in der SDSGelelektrophorese (vgl. S. 14).
Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit qeladener Teilchen
im elektrischen Feld. Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die
Kraft Q@E, so dass die Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q@E/f (1) beträgt. Für den Idealfall einer Kugel ist der Reibungskoeffizient f = 6 πηr (r = Stokes'scher Radius, η = Viskosität des
Mediums). Gleichung (1) zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeit proportional zum
Spannungsabfall (= Feldstärke = Spannung pro Längeneinheit des Elektrophoresestreifens, Volt/cm)
und proportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei Aminosäuren und
Proteinen vom pH-Wert abhängig. Der Reibungskoeffizient f ist abhängig von Form und Grösse der
Teilchen und von der Viskosität des Mediums.
Bei der Elektrophorese entsteht Wärme. Die pro Zeiteinheit gebildete Wärme H beträgt R@I2 (R =
elektrischer Widerstand, I = Stromstärke). Bei der Hochspannungselektrophorese (Feldstärken bis
einige 100 V/cm und Stromstärken von gegen 1 Ampère) wird die entstehende Wärme mit einem
Kühlsystem abgeführt.
CHROMATOGRAPHIE
Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden
Substanzen je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationären und einer
mobilen Phase ungleich verteilen. Die verschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden
in Verteilungschromatographie (Papier-, Dünnschicht-, Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, Affinitätschromatographie) und Gelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zu trennenden
Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nichtkovalente Bindungskräfte zwischen den zu trennenden Substanzen und den Molekülen der einzelnen
Phasen. In der Gelchromatographie beruht die Trennung auf der räumlich begrenzten Zugänglichkeit
der verschiedenen Phasen für unterschiedlich grosse Moleküle. Während der chromatographischen
Trennung werden die stationäre und die mobile Phase gegeneinander verschoben. Verschiedene
Kombinationen von festen, flüssigen und gasförmigen Phasen sind je nach Chromatographietyp möglich. Eine Übersicht gibt die folgende Tabelle.
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Name
Phase 1
(stationär)
Phase 2
(mobil)
Papierchromatographie
H2O in Cellulosematrix des Papiers
organisches
Lösungsmittel
Gaschromatographie
Silikone auf
inertem Träger
inertes Gas
Dünnschichtchromatographie
Aluminiumoxid,
Kieselgel etc.
organisches
Lösungsmittel
Ionenaustauscherchromatographie
Ladungen auf
inertem Träger
Elektrolyt
(Puffer)
Affinitätschromatographie
spezifischer Ligand
auf inertem Träger
Puffer,
Lösungsmittel
Gelchromatographie
Puffer im Raum
innerhalb der
Gelpartikel
Puffer ausserhalb
der Gelpartikel
Die einzelnen Chromatographietypen können nicht immer eindeutig der Verteilungs-, Adsorptionsoder Gelchromatographie zugeordnet werden. Beispielsweise beobachtet man bei der Papierchromatographie gelegentlich auch Adsorption an das Papier. Oder im Falle der Gelchromatographie
werden aromatische Verbindungen wegen Adsorption an die Gelpartikel besonders langsam aus den
Gelpartikeln eluiert (Elutionsverhältnisse bei der Gelfiltration in Exp. 10.1).
Der Rf-Wert ist ein Mass für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier- und
Dünnschichtchromatographie. Der Rf-Wert ist der Quotient aus der Wanderungsdistanz der Substanz und der Lösungsmittelfront.
Rf =
Startpunkt bis Fleckenmitte
Startpunkt bis Lösungsmittelfront
Der Rf-Wert ist für eine Substanz in einem bestimmten Lösungsmittelsystem und bei konstanter Temperatur charakteristisch. Zur Identifikation ist aber der direkte Vergleich von unbekannter Substanz
und Referenzsubstanz im gleichen Chromatogramm zuverlässiger. In der Gelchromatographie ist
der Verteilungskoeffizient Kd eine dem Rf-Wert entsprechende Grösse (S. 30.
Ionenaustauscher-Chromatographie
Bei dieser Art von Chromatographie werden gelöste Ionen gegen Ionen gleichen Vorzeichens, die
an ein unlösliches Gegenion auf einem festen Träger gebunden sind, ausgetauscht. Auf diesem Prinzip
beruht die Enthärtung von Wasser, bei der Ca2+ des "harten" Wassers gegen Na+ von unlöslichem
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Zeolith (= Natrium-Aluminiumsilikat) ausgetauscht wird. Der entstehende Ca-Zeolit kann durch
Waschen mit einer konzentrierten NaCl-Lösung wieder zum Na-Zeolith regeneriert werden.
Die meisten Ionenaustauscher sind synthetische Polymere (Kunstharze), welche saure oder basische
Gruppen enthalten. Austauscher-Harze kann man nach dem pK-Wert ihrer ionischen Gruppen
einteilen. Ein stark saurer Kationenaustauscher kann z.B. -S03 - Gruppen enthalten, ein schwach saurer z.B. -COO- Gruppen. Den Austausch kann man sich folgendermassen vorstellen:
+
R-NH3+
º
Harz-SO3- +H3N-R + Na+
Harz-NH3+Cl- +
R-COO-
º
Harz-NH3+ -OOC-R + Cl-
Harz-S03-Na+
Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz
Bei pH 1 liegen A1 und A2 als Kationen vor. Beide werden am Kationenaustauscher adsorbiert und
wandern nur sehr langsam. Bei pH 6 liegt A1 als Kation vor. A2 wird als ungeladenes Zwitterion nicht
adsorbiert und wandert deshalb schneller als A1.
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Statt einen Puffer konstanter Zusammensetzung zur Elution zu verwenden, können z.B. bei einem
Kationenaustauscher der pH-Wert oder die Ionenstärke oder beide schrittweise (schrittweise Elution)
oder kontinuierlich (Gradienten-Elution) erhöht werden. Dadurch kann die Elution der aufgetrennten
Komponenten beschleunigt werden. Die Aminosäuren eines Proteinhydrolysats werden im automatischen Aminosäuren-Analysator durch Ionenaustauschchromatographie quantitativ aufgetrennt
(Fig. 6).
Fig. 6 Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
(HPLC) an einem Kationenaustauscher-Harz. Die
Fläche unter jedem Signal des Chromatogramms
ist der Menge jeder in der Mischung vorhandenen
Aminosäure proportional.
Gelchromatographie
Vernetztes Dextran ("Sephadex") bildet in gequollenem Zustand ein poröses Gel. Das Flüssigkeitsvolumen innerhalb der Gelpartikel ist bei einem gegebenen Grad der Vernetzung nur für gelöste
Moleküle unterhalb einer bestimmten Grösse zugänglich. Die Verteilung von gelösten Molekülen
innerhalb und ausserhalb der Gelpartikel ist somit abhängig vom zugänglichen Volumen innerhalb
der Gelpartikel. Das Totalvolumen (Vt) einer Sephadex-Säule ist die Summe des Volumens ausserhalb
der Gelpartikel (Vo), des Volumens innerhalb der Gelpartikel (Vi) und des Volumens der Gelsubstanz
selbst (Vg):
Vt = Vo + Vi + Vg
Das Elutionsvolumen (Ve) einer Substanz ist abhängig von Vo und vom "Verteilungskoeffizienten"
Kd, der den Bruchteil des Vi angibt, der für die Substanz zugänglich ist.
Ve = Vo + Kd @ Vi
Für grosse Moleküle, die nicht in das Gel eindringen können, ist Kd = 0, somit Ve = Vo. Für kleine
Moleküle, die vollständig in das Gel eindringen können, ist Kd = 1, somit Ve = Vo + Vi. Für Moleküle
mit einem Kd zwischen O und 1 gilt:
Vo < Ve < (Vo + Vi)
Je nach der Grösse der Moleküle, die voneinander getrennt werden sollen, wird verschieden stark
vernetztes Sephadex verwendet. Die gebräuchlichsten Typen sind:
Sephadex
G-25
G-50
G-75
G-200
Ausschluss-Molekularmasse
> 5'000
> 25'000
> 50'000
> 200'000
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Sephadex G-25 eignet sich wie die Dialyse besonders zur Entsalzung von Makromolekülen (Exp.
5.2, 5.4). Sephadex G-50, G-75 und G-200 werden zur Trennung verschieden grosser Proteine verwendet. Sie dienen auch zur Schätzung der molekularen Grösse und damit der Molekülmasse eines
Proteins. Als Referenzen braucht man die Elutionsvolumina von Proteinen mit bekannter Molekularmasse. Für globuläre Proteine ist das Verhältnis Ve/Vo über einen weiten Bereich umgekehrt
proportional zum Logarithmus der Molekularmasse.
Die nachstehende Figur zeigt solche Kurven für Sephadex G-50 und G-200. Die gesuchte
Molekülmasse eines Proteins erhält man anhand der Kurven aus dem gemessenen Elutionsvolumen.
Affinitätschromatographie (siehe Exp. 5.5, Naturwissenschafter)
PHOTOMETRIE
Gesetz von Beer-Lambert:
Wird Licht durch eine Farbstofflösung gestrahlt und dabei absorbiert, so ist die Intensität des austretenden Lichts (I) kleiner als diejenige des eintretenden Lichts (Io). Der Quotient I/Io wird als Durchlässigkeit D oder Transmittance T bezeichnet und ist abhängig von der Konzentration c des Farb-stoffs
und der Schichtdicke d: D = I/Io = lO-k@c@d. D wird oft in % angegeben. %D = 100 I/Io.
Ein für photometrische Messungen gebräuchlicheres Mass ist die Extinktion E oder optische Dichte