DNA Reparatur

DNA Reparatur
Häufige Ursachen von DNA Schäden und ihre
Reparaturmechanismen
Syndrome mit defekter DNA-Reparatur
Karzinogene und ihre Wirkungsweise
Direkte Reparatur I: die meisten Fehler werden bei der
Replikation gemacht – und Mutationen trotzdem verhindert!
Polymerase -Fehlerrate
Korrekturlesen
Fehlpaarungsreparatur
~10(e -5)
~10(e -2)
~10(e -3)
Gesamt
~10(e -10)
UV-Licht kann benachbarte Pyrimidinreste im
gleichen Strang crosslinken
Direkte Reparatur II: Bakterien und Hefen können Pyrimidindimere
photochemisch spalten und zu zwei Monomeren rekonvertieren
Die Photolyase besitzt ein Coenzym (N5, N10-Methenyltetrahydrofolat),
welches ein Photon absorbieren und dadurch angeregt werden kann.
Direkte Reparatur III: die Methylguaninmethyltransferase
kann Methylierung von G (zu 6-O-MeG) rückgängig machen
Wichtiger Mechanismus z.B. während einer Krebstherapie mit alkylierenden Chemotherapeutika; MGMT-Spiegel müssen dazu gesenkt werden (durch 6-O-Benzylguanin).
Desaminierung von C oder 5-Methyl-C ist die häufigste Ursache für
Punktmutationen
Spontan desaminierte Basen werden durch die
Basenexzisionsreparatur repariert
O
NH2
HN
N
O
N
Cytosin (C)
O
O
CH3
HN
N
Uracil (U)
O
N
Thymin (T)
Andere DNA-Glykosylasen sind spezifisch für
andere modifizierte Basen, z.B. 8-Oxy-Guanin. Depurinierung wird durch einen ähnlichen Mechanismus
repariert.
Warum enthält RNA Uracil (bzw. warum enthält DNA Thymin)?
Die Methylierung von Desoxyuridylat
zu Desoxythymidylat ist energetisch aufwendig;
was ist der Grund für diese “Energieverschwendung”?
O
NH2
HN
N
O
N
Cytosin (C)
O
O
CH3
HN
N
Uracil (U)
Cytosin in der DNA desaminiert zu einem messbaren
Prozentsatz spontan zu Uracil. Da Uracil mit Adenin paart,
ist die Desaminierung potenziell mutagen (einer der
Tochterstränge würde ein AU-Basenpaar statt einem
CG Basenpaar enthalten).
O
N
Thymin (T)
In DNA eingebautes Uracil wird
durch ein spezielles Reparaturenzym
entfernt. Die Methylmarkierung
des Thymidins bewirkt, das Thymin von
der Uracil-DNA-Glykosidase nicht erkannt
wird.
Wäre die Methylgruppe nicht vorhanden, könnte korrekt eingebautes Uracil
nicht von durch Desaminierung gebildetem Uracil unterschieden werden.
UV-Licht kann benachbarte Pyrimidinreste im
gleichen Strang crosslinken
Pyrimidindimere können durch die Nukleotidexzisionsreparatur
repariert werden
In E.coli:
Nuklease=UvrABC-Excinuklease
Xeroderma pigmentosum Patienten haben Defekte in der
Nukleotidexzisionsreparatur
• klinisch und genetisch heterogene Erbkrankheit
• Häufigkeit 1:105 - 1:106
Symptome
• Extreme Sensitivität gegenüber
UV Strahlung
• 2000-fach erhöhtes
Hautkrebsrisiko
• Schwere Haut- und
Augenanomalien
• Neurologische Defekte (20% der
Patienten)
• Lebenserwartung um 30 Jahre
verkürzt
Die in XP-Patienten mutierten Gene führten zur Aufklärung der
Wirkungsweise der Nukleotidexzisionsreparatur im Menschen
1. UV-Licht
4. Bildung des Reparaturkomplexes
TFIIH
XPA
XPB
2. Schadenerkennung durch XPC
XPG
XPD
RPA
23B
XPC
5. Excision durch XPF und XPG Endonukleasen
TFIIH
23B
XPC
ERCC1
XPA
XPF
RPA
6. Reparatursynthese (Pol ε)

3. Rekrutierung der Helikasen XPB, XPD

XPG
XPV ist nicht beteiligt an Reparatur;
es ist eine Polymerase, die Pyrimidindimere tolerieren und
übergehen kann (by-pass-Polymerase).
Eukaryonten
DNA-Pol α
Primase, kurze DNA-Fragmente
DNA-Pol β
Reparatur
DNA-Pol γ
Replikation des Mitochondriengenoms (16.6 kbp zirkulär*)
DNA-Pol δ
Replikation Folgestrang
DNA-Pol ε
Replikation Leitstrang
DNA-Pol κ
DNA-Synthese auf beschädigter DNA
DNA-Pol λ
"
DNA-Pol ι
"
DNA-Pol θ
"
DNA-Pol ϕ
"
DNA-Pol η
“
Verschiedene Arten von Mutationen treten bei der Replikation auf
1. Substitution eines Basenpaares durch ein anderes (am häufigsten)
2. Deletion eines oder mehrerer Basenpaare
3. Insertion eines oder mehrerer Basenpaare
Transition: Ersatz eines Purins durch ein
anderes oder eines Pyrimidins durch ein
anderes
Transversion: Ersatz eines Purins durch ein
Pyrimidin oder umgekehrt
Die Fehlpaarungsreparatur erkennt fehlgepaarte Basen
oder kleine Insertionen
In E. coli: MutL rekrutiert die
Endonuklease MutH, die den
nicht-methylierten Strang
(blau) spaltet.
5'
3'
G
T
3'
5'
5'
3'
G
T
hMLH1
hPMS2
Die Fehlpaarungsreparatur erkennt fehlgepaarte Basen
oder kleine Insertionen
Exo1
3'
5'
MutSα, MutLα
Exo1, PCNA
RPA
5'
3'
hMSH6
G
T
hMSH2
3'
5'
5'
3'
3'
5'
DNA polymerase δ / PCNA
DNA ligase
ADP
ATP
5'
5'
3'
hMLH1
hPMS2
3'
hPMS2
3'
hMLH1
5'
5'
ADP
G
T
3'
3'
ATP
5'
G
C
3'
5'
Im Menschen: Der Mismatch-Erkennungskomplex aus
MSH2/6 und MLH1/PMS2 wandert an der DNA entlang,
bis er auf eine Strangdiskontinuität trifft. Dort wird
durch PMS2 ein Einzelstrangbruch eingeführt und
Exo1 rekrutiert, die den Tochterstrang abbaut.
Ionisierende Strahlung (X-, γ−) kann Doppelstrangbrüche hervorrufen
Diese werden durch nicht-homologes „End-joining“ repariert
Doppelstrangbrüche können auch durch homologe
Rekombination repariert werden
Doppelstrangbrüche können auch durch homologe
Rekombination repariert werden
Die Fusion nicht-zusammenpassender Enden
kann zu chromosomalen Translokationen und Krebs führen
Die t(8;14) Translokation beim Burkitt-Lymphom bewirkt
Űberexpression des Myc-Onkoproteins (Transkription von Cyclingenenverstärkte Zellteilung)
IgH und Bcl-2 fusionieren bei Follicularem Lymphom,
was zu Bcl-2 Űberexpression fuehrt
Fehlerhaftes End-joining kann zu chromosomalen Translokationen
und Krebs führen
Bei der t(9;22) Translokation in CMLPatienten fusioniert der BCR- mit dem
Abl- Lokus;
Das Fusionsprodukt hat konstitutive
Tyrosinkinaseaktivität.
Konstitutiv aktives BRC-ABL phosphoryliert zahlreiche neue Substrate
und macht die Zellteilung unabhängig von Wachsumsfaktoren
Imatinib (Gleevec) blockiert spezifisch
BRC-ABL.
Der Nachweis von chromosomalen Translokationen erfolgt über FISH
Die Enden von Chromosomen replizieren mit Hilfe des Enzyms Telomerase
Stammzellen haben lange Telomere und viel Telomerase;
in somatischen Zellen nimmt die Telomerlänge mit zunehmenden Alter
ab und Telomerase fehlt
Der Verlust von Telomeren bewirkt Abbruch-Fusion-Brücken Zyklen
(breakage-fusion-bridge cycles)
Karzinogene sind häufig Mutagene
Epidemiologischer Zusammenhang zwischen Rauchen und Lungenkrebs
Benzo(a)pyren wird von Cytochrom P450 Enzymen aktiviert und
modifiziert Guanin, so dass es mit A statt C paart (G->T Transversion)
Kausaler Zusammenhang zwischen Rauchen und Lungenkrebs
Aflatoxin (ein Schimmelpilzgift) modifiziert nach Aktivierung
ebenfalls G und bewirkt G-> T Transversionen
(seltene Mutationen in p53)
Das Erhitzen von Fleisch bei hohen Temperaturen erzeugt
heterozyklische Amine, die Guaninaddukte bilden und mit Prostatakrebs
in Verbindung stehen (p53 Mutationen)
Erbkrankheiten mit DNA-Reparatur-Defekten
Expression der genetischen InformationRNA-Synthese (Transkription)
Bei der Transkription wird DNA in RNA umgeschrieben (transkribiert)
Einige Konventionen bei der Beschreibung der Transkription
Die Transkription besteht aus 3 Schritten: Initiation,
Elongation und Termination
Űbersicht Transkription
Bakterien besitzen eine einzige RNA-Polymerase,
die aus mehreren Untereinheiten besteht
Untereinheit
!
"
"‘
#70
Gen
Anz.
rpo A
rpo B
rpo C
rpo D
2
1
1
1
Masse
(kd)
37
151
155
70
Funktion
Bindet regulatorische Sequenzen
Bildet Phosphodiesterbindungen
Bindet die DNA-Matrize
Erkennt den Promotor und initiiert die Synthese
Bakt. RNA-Polymerase mit Matrize während der Elongation
Transkriptionsrichtung
Bakterielle und eukaryotische RNA-Polymerasen sind ähnlich aufgebaut
Eukaryoten besitzen mehrere RNA-Polymerasen
mit unterschiedlicher Funktion
Die Zusammensetzung der Untereinheiten ist bei allen RNA-Pol ähnlich
Nur die RNA-Pol II (mRNA Synthese) hat eine C-terminale Domäne,
die während aktiver Transkription phosphoryliert wird
chromosomal „puffs“: Orte aktiver Transkription
grün: nicht-phosphorylierte CTD
rot: phosphorylierte CTD
Genorganisation in Pro- und Eukaryoten
Transkription und Translation sind in Eukaryoten
zeitlich und räumlich getrennt
Regulation der Genexpression-- Prokaryoten
Die Sigma-Untereinheit der bakt. RNA-Pol erkennt
Promotorsequenzen upstream des Transkriptionsstarts
-35 Region
TTGACAT
-10 Region
15-17 bp
TATAAT
E. coli kann die Gene des Laktosemetabolismus in Abhängigkeit
von Substratverfügbarkeit kontrollieren
Die Kontrollregion rund um den
Transkriptionsstart des lacZ-Operons
besteht aus ca. 100bp, die
Repressoren und Aktivatoren binden
RNA-Pol assoziiert mit unterschiedlichen Sigmafaktoren, je nach
Wachstumsphase und Substratverfügbarkeit
housekeeping
heat shock
nitrogen
metabolism
Transkriptionsfaktoren können auch sehr weit entfernt vom
Transkriptionsstart an regulatorische Sequenzen binden- sog. Enhancer
Schleifenbildung
Zwei-Komponentensysteme erlauben es Bakterien, schnell auf
Umwelteinflüsse zu reagieren
Regulation der Genexpression-- Eukaryoten
Eukaryotische RNA-Pol erkennen ebenfalls
Promotorsequenzen upstream des Transkriptionsstarts
Konsensussequenz der TATA-Box
>900 eukaryotische Gene analysiert
Die generellen Transkriptionsfaktoren TFIIA,B, und D
ermöglichen die Initiation der Transkription durch sukzessive Bindung
an die TATA-Box
Alternativ zur TATA-Box können Initiator-Elemente oder CpGInseln als Promotoren (z.B. von housekeeping-Genen) dienen
Initiator
CpG Insel
5‘- Y-Y-A+1-N-T/A-Y-Y-Y -3‘
Typischer Aufbau eines Säuger- bzw. Hefegenlokus-Enhancer können viele kb upstream vom durch sie regulierten Gen liegen
Die Kontrollregion eines Gens kann Bindungsstellen (Enhancerelemente)
für mehrere Transkriptionsfaktoren haben
Enhancer werden von Transkriptionsfaktoren gebunden,
die eine DNA-Bindungs- und eine Aktivierungsdomäne besitzen
Die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors
interagiert mit DNA (grosse Furche) z.B. mittels einer α-Helix
Viele Transkriptionsfaktoren haben Zink-Finger-Domänen, die
ebenfalls eine α-Helix in die grosse Furche inserieren
GL1: C2H2,monomeric
Glucocorticoid-R:
C4,homodimeric;
recognizes inverted
repeats
Andere Transkriptionsfaktoren gehören zur Familie der
Leucine-Zipper- oder Helix-Loop-Helix-Proteine
„Basic Helix loop Helix“
„Leucine Zipper“
Im C-Terminus bewirken
hydrophobe AS die
Dimerisierung
(amphipathische αHelices)
Im N-Terminus
bewirken positiv
geladene (basische) AS
die Bindung an DNA
(Phosphatreste)
Manche Transkriptionsfaktoren brauchen die Hilfe von
Co-Aktivatoren
Der Östrogenrezeptor
gehört zur
TranskriptionsfaktorFamilie der
„nuclear receptors“.
Manche Transkriptionsfaktoren “kooperieren”: nur wenn beide
vorhanden sind, können AP1 und NFAT hochaffin an promotor-proximale
Kontrollelemente binden
IL-2 Genlokus
An Enhancerelementen bilden sich häufig Multiproteinkomplexe
(Enhancesomen), die kooperativ die Genexpression regulieren
β-Interferon Enhancerelement
Wie werden Transkriptionsfaktoren reguliert?
-Entwicklungsspezifische Regulation
-Zelltyp-/Gewebe-/Organspezifische Regulation
-Regulation durch Signale von aussen:
Proteinsignale
Hormonsignale
Steroidhormone wirken, indem sie spezifische
Transkriptionsfaktoren (“nuclear receptors”) aktivieren
Nuclear receptors haben konservierte DNA-Bindungsdomänen und
variable N- und C-Termini
Manche Nuclear receptors binden als Homodimere,
andere als Heterodimere an ihre Kontrollregionen (Response elements)
Der Glukocorticoid- und der
Östrogenrezeptor binden als
Homodimere an inverted repeats.
Die Vitamin D3-, Thyroxin- und
Retinolsäurerezeptoren bilden
Heterodimere mit RXR, und
binden an direkte repeats, die
sich nur in der Anzahl
zwischengeschalteter Nukleotide
unterscheiden (N)3,4,5.
Hormonbindung aktiviert die homodimeren Nuclear receptors, indem sie
ihre Translokation vom Zytoplasma in den Kern induziert
- Hormon
+ Hormon
Wie arbeiten Transkriptionsfaktoren?
-beeinflussen die Dichte des Chromatins
und damit die Zugänglichkeit der DNA für Proteine
-regulieren die Initiation der Transkription, indem sie
die Zusammenlagerung des “Präinitiationskomplexes”
bewirken
Transkriptionsfaktoren wie z.B. die Nuclear Rezeptors wirken,
indem sie die Packung der DNA beeinflussen
Aktiv transkribierte Gene befinden sich in lose gepacktem (Eu)chromatin
Die Kondensation des Chromatins wird durch Acetylierung von Histonen
beeinflusst
Reprimierende bzw. aktivierende
Transkriptionsfaktoren beeinflussen
den Acetylierungsstatus benachbarter Nukleosomen und damit
die Zugänglichkeit der in ihnen
verpackten Promotorsequenzen
Methylcytosin in CG-Dinukleotiden kann ebenfalls durch
Rekrutierung von Histon-Deacetylasen Chromatinkondensation bewirken
5-Methylcytosin
NH2
CH3
N
5’
O
N
3’
T T A A C G A T A C
A A T T G C T A T G
3’
5’
Sukzessive Bindung der generellen Transkriptionsfaktoren
an Promotorelemente initiiert die Transkription
Pol II im Komplex mit DNA und generellen Transkriptionsfaktoren
Der Mediatorkomplex rekrutiert Pol II an Promotoren, indem er
sowohl an Pol II als auch an Aktivierungsdomänen von
Transkriptionsfaktoren bindet
Die Elongation verläuft hochprozessiv mit 50 Nukleotiden/ Sekunde
Die Entwindung der DNA in der
Transkriptionsblase wird von TFIIH
Vorangetrieben.
In Prokaryoten besteht das Terminationssignal aus einer
Haarnadelschleife gefolgt von einer poly-U Sequenz
In Eukaryoten wird das Primärtranskript prozessiert
Übersicht über Primärtranskript-Prozessierung in Eukaryoten
Die Prä-mRNA erhält ko-transkriptionell ein schützendes “Cap”
Das capping Enzym bindet an
die phosphorylierte CTD der
PolII und wird dadurch aktiviert
Die Prä-mRNA erhält post-transkriptionell einen poly(A)-Schwanz
EM-Fotos von mRNA-DNA-Hybriden bewiesen die Existenz von Introns
Übersicht über RNA-Prozessierung inkl. Spleissen
Konsensus-Sequenz der Spleiss-Region
Atomarer Mechanismus des Spleissens
Am Spleissprozess sind ca. 100 Proteine und 5 snRNAs beteiligt
Im ersten Schritt hybridisieren die
U1 und U2 snRNAs mit der 5’ Spleissstelle
und der Sequenz um die Verzweigungsstelle
Das nicht gepaarte A der Verzweigungsstelle zeigt aus dem Hybrid
der U2 snRNA mit der komplementären Sequenz der Prä-mRNA heraus
Durch anschliessende Anlagerung der U4-6 Ribonukleoproteinkomplexe
entsteht das Spleissosom
Die U2 und U6 Ribonukleoproteinkomplexe
bilden das katalytische Zentrum
Bei der ersten Transesterifizierung
bildet sich ein 2’-5’ verknüpftes
Intermediat zwischen dem G am 5’ des
Introns und dem A der Verzweigungsstelle
Die beiden Exons werden bei
der zweiten Transesterifizierung über eine normale
5’-3’ Verknüpfung verbunden
Nach extensiver Umlagerung der
Basenpaarungen zwischen U1,2,4,5
und 6 dissoziieren U1 und U4 ab.
Vorgang des Spleissens
Die snRNAs im Spleissosom leiten sich wahrscheinlich von sich selbst
spleissenden Introns ab
Durch die Assoziation von mRNA-prozessierenden Proteinen mit phosphorylierter CTD von PolII werden Transkription
und Prozessierung gekoppelt
Übersicht Transkription, mRNA-Prozessierung und Translation
Ribosomale RNA (rRNA) wird als eine einzige Prä-rRNA synthetisiert
Pro Transkriptionseinheit werden simultan zahlreiche Prä-rRNAMoleküle von RNA-Pol I synthetisiert
rRNA wird in Nukleoli transkribiert,
und assoziiert sofort mit ribosomalen Proteinen
Ribosomen sind Nukleoprotein-Komplexe und
bestehen zu 60% aus RNA und zu 40% aus Protein
Bei der Reifung der Prä-rRNA im Nukleolus wird das Primärtranskript
exo- und endonukleolytisch gespalten und methyliert
Jede tRNA ist spezifisch für eine Aminosäure,
die am 3’-Ende gebunden wird
tRNAs bestehen aus ca. 75 Nukleotiden,
die teilweise Basenpaarungen eingehen.
Auch tRNAs werden im Kern post-transkriptionell prozessiert
Das 5’ Ende wird exonukleolytisch
durch RNase P gespalten.
Die Uridin-Reste am 3’
Ende werden durch CCA
ersetzt.
Etwa 10% der Nukleotide in tRNAs werden
modifiziert.
Manche tRNAs besitzen Introns, die herausgespleisst werden müssen.
Bei der Modifizierung der Basen entstehen einige seltene Nukleotide
O
N
N
N
NH
N
NH2
Guanin (G)
Guanin
(G)
Adenin (A) (A)
Adenin
O
N
N
Ribose
Inosin (I)
HN
O
N
Cytosin (C)
O
N
HN
O
N
O
HN
N
N
N
O
NH2
NH2
N
O
Uracil (U)
O
OCH3
N
O
Ribose
Pseudouridin (Ψ)
N
Thymin (T)
NH2
NH
CH3
HN
N+
N
N
Ribose
5 Methylcytosin (m5C)
NH2
CH3
N
N
Ribose
7-Methylguanosin (m7G)
Die dreidimensionale Struktur einer tRNA sieht aus wie ein L
Translation/Proteinsynthese
-Der genetische Code
-Initiation, Elongation, Termination
Die drei Arten von RNA arbeiten bei der Proteinsynthese zusammen
Der genetische Code besteht aus 43=64 Codons
Die meisten Aminosäuren werden durch mehr als 1 Codon spezifiziert
Die Abfolge von Codons zwischen einem Start- und einem Stopcodon
heisst Leseraster (reading frame)
Eine mRNA kann für 2, in seltenen Fällen sogar 3
Polypeptide kodieren (Leserasterverschiebung).
Die Übersetzung der Nukleotidsequenz der mRNA in die
Aminosäuresequenz eines Proteins erfolgt in zwei Hauptschritten:
1. Die Aminosäure wird durch ihre spezifische
Aminoacyl-tRNA-Synthetase an die korrespondierenden tRNAs gekoppelt.
Die Übersetzung der Nukleotidsequenz der mRNA in die
Aminosäuresequenz eines Proteins erfolgt in zwei Hauptschritten:
2. Das Anticodon der tRNA paart mit dem Codon
in der mRNA, das für die auf die tRNA geladene
Aminosäure kodiert. Dadurch kann diese ins Protein
eingebaut werden.
Die dritte Position eines Codons kann häufig mit mehr als einer
Base im tRNA Anticodon paaren (“wobble position”)
Beispiel:
4 der 6 für Leucin kodierenden Codons- CUA, CUC, CUU, UUAerkennen die gleiche tRNA (GAI), da das Inosin in der
wobble position mit A, C und U paaren kann und das U in der
Position 1 ein unkonventionelles Basenpaar mit G bilden kann.
Die Proteinsynthese erfolgt an der Schnittstelle zwischen kleiner und
grosser Untereinheit der Ribosomen
Bakterielle (polycistronische) mRNAs kodieren für mehrere Proteine,
eukaryotische (monocistronische) mRNAs nur für ein Protein
Die Proteinsynthese auf eukaryotischen mRNAs beginnt in der Regel
in <100 Nukleotiden Entfernung vom 5’Cap, am ersten AUG
Kozak-Sequenz:
ACCAUGG
Inaktive Ribosomenuntereinheiten sind separiert und an spezifische
Initiationsfaktoren (IF) gebunden
Bei der Translationsinitiation in Eukaryoten muss sich zunächst
ein Prä-Initiationskomplex aus kleiner Ribosomenuntereinheit, IFs
und Methionyl-Initiator-tRNA bilden
Regulation der Proteinsynthese
über Phosphorylierung von eIF2
(GDP-GTP-Austausch)
Der Prä-Initiationskomplex assoziiert dann mit mRNA, an deren Cap
eIF4 gebunden hat, zum Initiationskomplex
Der Initiationskomplex wandert an der mRNA entlang und sucht
das Startkodon (scanning)
Beim Scanning müssen RNA-Sekundärstrukturen durch die eIF4A Helikase
entwunden werden.
Nachdem das Startkodon identifiziert worden und die
tRNA über ihr Anticodon damit fest verbunden ist,
hydrolysiert eIF2-GTP zu GDP und alle IFs dissoziieren ab.
Unter Mithilfe von eIF5 und 6 assoziiert am Startkodon die grosse
Ribosomenuntereinheit mit der kleinen Untereinheit zum 80S Ribosom
Dabei wird die Initiator-tRNA in der
P-Stelle positioniert.
Die Proteinsynthese auf prokaryotischen mRNAs beginnt
an internen Startkodons, denen eine Shine-Dalgarno-Sequenz vorausgeht
Die Shine-Dalgarno-Sequenz (6 bp, purinreich) ist komplementär
zum 3’ Ende der rRNA in der kleinen Ribosomenuntereinheit.
Prokaryotischen mRNAs haben kein Cap; der Initiationskomplex
entsteht am Startkodon/ der Shine-Dalgarno-Sequenz
Die Elongation der Peptidkette wird durch Bindung einer
neuen, komplementaren tRNA in Position A eingeleitet
Die tRNAs sind an den Elongationsfaktor EF1α
gebunden, der sie ans Ribosom transportiert
Die GTPase-Aktivität der Elongationsfaktoren stellt die
Irreversibilität der einzelnen Schritte sicher
Bei korrekter Basenpaarung hydrolysiert EF1α GTP zu GDP, was im Ribosom
zu einer Konformationsänderung, und zu
fester Bindung der tRNA führt
Die 23S rRNA (grosse Ribosomen-UE)
katalysiert die Bildung einer Peptidbindung zwischen den Aminosäuren in
Positionen A und P
Nach erfolgter Peptidbindung treibt die
Hydrolyse von GTP durch EF2 die
Translokation des Ribosoms um ein Codon
in 3’ Richtung an
Elongation der Polypeptidkette-Mechanismus
Wie kann EF1α-GTP regeneriert werden?
Eukaryoten
EF1α
EF1βγ
EF2
Prokaryoten
EF-Tu
EF-T (GDP-GTP exchange factor)
EF-G
Modell basierend auf cryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen
Termination der Proteinsynthese
eRF1 erkennt Stopcodons UAA,
UGA, UAG
(Form von eRF1 ist ähnlich wie tRNA)
Abspaltung der fertigen Polypeptidkette ist gekoppelt an GTP Hydrolyse
an/durch eRF3
Inaktive Ribosomenuntereinheiten werden separiert und
binden wieder an ihre Initiationsfaktoren (IF)
Zahlreiche Ribosomen arbeiten simultan an der gleichen mRNA
(Polysomen)
PABPI vernetzt das 3’Poly-A-Ende der mRNA mit dem 5’Cap, so dass
freiwerdende Ribosomenuntereinheiten sofort wieder starten können
Manche Antibiotika hemmen spezifisch die Proteinsynthese
in Bakterien
Antibiotikum
Wirkung
Streptomycin
und andere Aminoglykoside hemmen die Initiation und verursachen Fehlablesungen der mRNA
(bei Prokaryoten)
Tetracyclin
lagert sich an die 30S-Untereinheit an und hemmt die Bindung der Aminoacyl-tRNAs (bei
Prokaryoten)
Chloramphenicol
hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 50S-Ribosomenuntereinheit (bei Prokaryoten)
Cycloheximid
hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 60S-Ribosomenuntereinheit (bei Eukaryoten)
Erythromycin
lagert sich an die 50S-Untereinheit an und hemmt die Translokation (bei Prokaryoten)
Puromycin
verursacht vorzeitigen Kettenabbruch, weil es als Analogon der Aminoacyl-tRNA wirkt (bei
Prokaryoten und Eukaryoten)
Manche bakteriellen Toxine wirken, in dem sie die Proteinsynthese
im Wirt inhibieren (Diphtherietoxin)
Ein modifizierter Histidinrest in EF2
(Diphthamid) wird von Diphtherietoxin
ADP-ribosyliert
Post-transkriptionale Regulation der Genexpression
-RNA interference/silencing
-RNA editing
-Alternatives Spleissen
microRNAs sind 20-23 Nukleotide lang und verhindern die
Translation ihrer komplementären Ziel-mRNA(s)
miRNAs werden durch Prozessierung von Primärtranskripten gewonnen
Die Bindung von mehreren miRNA/RISC-Komplexen an den 3’UTR
einer mRNA bewirkt Translationsinhibition
1000 menschliche miRNAs regulieren ca. 1/3 aller Gene
Dicer prozessiert neben Prä-miRNAs auch lange, doppelsträngige RNA
(z.B. viralen Ursprungs) zu kurzer, ds RNA
miRNA und siRNA unterscheiden
sich nicht in ihrer Struktur,
wohl aber in ihrer Wirkung.
Der silencing complex (RISC) kann die Genexpression über
zwei unterschiedliche Mechanismen ausschalten
siRNA wird experimentell eingesetzt, um Expression eines Gens
auszuschalten (knock-down)
Lokale bzw. systemische Applikation von
siRNA eröffnet neue therapeutische Anwendungen
P2X3 siRNA (Kationenkanal) bei
neuropathischem Schmerz
VEGF siRNA gegen makulare
Degeneration der Retina
Fas/Caspase 8 siRNA
gegen Hepatitis
HBV siRNA gegen HBVinduzierte Hepatitis
SARS/Influenza siRNA gegen LungenInfektionen mit dsRNA Viren
RNA editing erzeugt zwei unterschiedliche Proteine vom gleichen
Primärtranskript in der Leber und im Darm
Einfache Transkriptionseinheiten (~40%) kodieren
für nur eine Polypeptidkette
Komplexe Transkriptionseinheiten (60%) kodieren für >1 Polypeptid
Alternatives Spleissen ermöglicht die Produktion membranständiger
und löslicher Antikörper vom gleichen Primärtranskript
Alternatives Spleissen ermöglicht die Produktion membranständiger
und löslicher Antikörper vom gleichen Primärtranskript
Alternatives Spleissen ermöglicht die Produktion der
Fibronektin-Isoformen in der extrazellulären Matrix und im Serum
Exone IIIA und B kodieren für
Domänen, die Fibronektin an die
Zelloberfläche binden. Lösliches
Fibronektin ist dagegen an der
Blutgerinnung beteiligt.
Genetische Vielfalt: Genumordnung (Rekombination)
-Homologe Rekombination
-Ortsspezifische Rekombination
-Transposons und Retrotransposons
-Exon shuffling
Ortsspezifische Rekombination: Beispiel Antikörperdiversität
Die Spezifität eines Antikörpers wird durch seine
hypervariable Region bestimmt
Die Antikörpervielfalt wird durch “somatische Rekombination” generiert
im Menschen: 250
15
4
=45000
V-Gensegmente
D-Gensegmente
J-Gensegmente
Kombinationen
Somatische Rekombination erfordert eine Signalsequenz
Kompatible Gensegmente lagern sich über ihre Signalsequenzen zusammen
Die Rag-Rekombinasen stabilisieren den Komplex
12/23-Spacer-Regel: nur Signalsequenzen mit unterschiedlich
langen Spacerregionen können
sich zusammenlagern.
Die Rekombination in B-Zellen erfordert Rag-Proteine und Komponenten
der nicht-homologen Endenverknüpfung
Kompatible Gensegmente
lagern sich über ihre Signalsequenzen zusammen
Rag-Rekombinasen schneiden
je einen Strang.
Die Partnerstränge werden
kovalent verbunden.
Die Haarnadelschleifen gehen
assymetrisch oder symmetrisch auf.
Überhänge werden generiert
und aufgefüllt.
Ligase 4 und XRCC4 ligieren
die beiden Enden.
=> Zusätzliche Diversität entsteht durch Einfüllen von
Nukleotiden, die in der Originalsequenz nicht vorkommen.
Pro B-Zelle wird nur ein Antikörper produziert
1. Beide homologen Chromosomen
rekombinieren zunächst die Dund J-Segmente der schweren Kette.
2. Die V-DJ-Rekombination erfolgt
nur auf einem Chromosom. Die
Nähe von V-Promoter und Enhancer
bewirkt, dass das rekombinierte Gen
abgelesen werden kann. OberflächenExpression der schweren Kette inhibiert
die V-DJ-Rekombination auf dem
anderen Chromosom.
3. Ist die erste V-DJ-Rekombination unproduktiv, rekombiniert das 2. Chromosom (4.).
5. Sind beide Rekombinationen unproduktiv,
stirbt die B-Zelle.
Jede B-Zelle kann Antikörper verschiedener Klassen exprimieren,
die durch die konstante Domäne definiert sind
Keimbahn-DNA
rearrangierte DNA
Aktivierte B-Zellen können die Produktion ihrer schweren Ketten
umschalten (class switch recombination)
Mobile Elemente (Transposons) machen 45% des
menschlichen Genoms aus
45%
Transposons können über DNA- oder RNA-Intermediate
im Genom “springen” (cut-and-paste vs. copy-and-paste-Strategie)
Retrotransposons vermehren sich
bei jedem Transpositionsereignis.
DNA-Transposons vermehren sich nur, wenn sie in der S-Phase des
Zellzyklus von bereits kopierten in nicht-kopierte Regionen springen
Dieser auf den ersten Blick “ineffiziente”
Mechanismus hat zu immerhin schon 300.000
Kopien (3% der DNA) im menschlichen Genom
geführt.
In Bakterien kommen nur DNA-Transposons vor- sie heissen
IS (insertion sequence)-Elemente
Die invertierten Wiederholungen werden
von der Transposase erkannt.
Die direkten Wiederholungen an den
Rändern entstehen beim Integration der
Transposon-DNA in die Zielsequenz.
Die zentrale Region kodiert für das
Enzym Transposase.
Die Transposition von IS-Elementen erfolgt in 3 Schritten
Manche IS-Elemente können Antibiotikaresistenzen transportieren
LTR-Retrotransposons ähneln Retroviren, die ihr Genom ins
Wirtsgenom integriert haben
kodiert für reverse Transkriptase und Integrase
LTR-Retrotransposons besitzen neben den kurzen
zusätzlich lange direkte Wiederholungen, die für
Promotor und Polyadenylierungsstelle kodieren.
LTR-Retrotransposons replizieren vermutlich wie Retroviren unter
Ausnutzung von zellulären Enzymen
Die RT der LTR Retroposons schreibt das RNA-Intermediat in
ds DNA um, die dann von Integrase ins Genom eingebaut werden kann
Lebenszyklus von Retroviren zum Vergleich
Non-LTR-Retrotransposons machen 34% des
menschlichen Genoms aus
Non-LTR-Retrotransposons werden durch RNA-Pol von einem Promotor in der A/T-reichen Region abgelesen und im Cytoplasma translatiert
Orf1 kodiert für ein RNA-bindendes Protein
Orf2 kodiert für Reverse Transkriptase/DNA-Endonuklease
SINEs sind nicht-kodierende “Parasiten” von LINEs.
In den Kern zurücktransportierte LINE RNA wird im Zuge der
reversen Transkription ins Genom integriert
Zelluläre Enzyme bauen das RNA-Intermediat ab und
füllen die Lücken auf
Integration von LINEs in protein-kodierende Sequenzen ist der
Auslöser für einige Krankheiten (0.1-0.2% aller Mutationen)
Faktor IX: Hämophilie B (Bluterkrankheit; 30% der Fälle spontan)
Dystrophin: Duchenne Muskeldystrophie; (30% der Fälle spontan)
Mobile Elemente haben die Evolution eukaryotischer Organismen
massgeblich vorangetrieben:
Bsp. Exonverdoppelungen während der Meiose durch ungleichen Crossover
L1: LINE Familie, die die Fähigkeit zur Transposition beibehalten hat.
Genverdoppelungen ermöglichten die Diversifizierung
der β-Globinfamilie
“Exon shuffling”: Austausch von Exons zwischen verschiedenen Genen
durch homologe Rekombination (Doppel-Crossover)
Alu: häufigster Typ von SINE.
“Exon shuffling”: Insertion eines fremden Exons durch
Transposition benachbarter homologer DNA-Transposons
“Exon shuffling”: Insertion eines fremden Exons
durch Überspringen eines schwachen LINE-Polyadenylierungssignals