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M.Sc. Bruns, Svenja – Autophagy regulation by the p38 MAP kinase – Zusammenfassung !
ZUSAMMENFASSUNG Autophagie bezeichnet einen katabolen, intrazellulären Degradations‐
mechanismus, bei dem ein kleiner Teil des Zytoplasmas von einer in situ gebildeten Doppelmembran umschlossen wird. In der daraus entstehenden Vakuole, dem so genannten Autophagosom, werden die eingeschlossenen zytoplasmatischen Komponenten, wie z.B. Proteinaggregate, langlebige Proteine sowie alte, nicht mehr funktionelle Organellen zum Lysosom transportiert. Im Anschluss an die Fusion der beiden Kompartimente wird der Inhalt des Autophagosoms von lysosomalen Enzymen degradiert und die entstehenden Bausteine, wie z.B. Aminosäuren, werden für die Weiterverwertung in das Zytoplasma transportiert. Der Signalweg der Autophagie ist in eukaryotischen Organismen evolutionär konserviert und trägt durch ein kontinuierliches Recycling von Proteinen und Organellen entscheidend zur zellulären Homöostase bei. Eine besondere Bedeutung kommt der Autophagie zu, wenn Zellen sich in Stresssituationen befinden. Beispielsweise wird Autophagie in Folge eines längeren Nährstoffmangels hochreguliert, um für das Überleben der Zelle genügend energetisch nutzbare Bausteine zu generieren. Ein weiteres Beispiel für die Stimulation von Autophagie ist die Invasion eines Pathogens, welches nach dessen Erkennung von einem Autophagosom umschlossen und so der lysosomalen Degradation zugeführt wird. In diesem Fall können die aus der enzymatischen Hydrolyse resultierenden Pathogen‐Peptide zusätzlich für die Beladung von MHC‐
Klasse‐II Molekülen prozessiert werden, sodass durch den Autophagie‐Mechanismus auch die adaptive Immunantwort unterstützt wird. Die große Bedeutung dieses Signalwegs macht eine strenge Kontrolle notwendig. In einer kürzlich veröffentlichen Studie wurde eine neue regulatorische Signalkaskade identifiziert, bei der zunächst der Stress‐Sensor Gadd45β, beispielsweise durch Stimulation der Zelle mit Lipopolysacchariden (LPS), induziert wird. Gadd45β seinerseits initiiert eine Phosphorylierungskaskade, bei der MEKK4 (MAP‐Kinase‐
Kinase‐Kinase 4), MKK3/6 (MAP‐Kinase‐Kinase 3/6) und schließlich die MAP‐Kinase p38 aktiviert werden. Die phosphorylierte MAP‐Kinase p38 transloziert in der Folge zu autophagosomalen Strukturen und interagiert dort mit ATG5, einem zentralen Protein der Autophagie‐Maschinerie. ATG5 ist kovalent an ATG12 konjugiert und bindet zudem an ATG16L1, welches die Assoziation mit der autophagosomalen 1 M.Sc. Bruns, Svenja – Autophagy regulation by the p38 MAP kinase – Zusammenfassung !
Membran reguliert. In Folge der Wechselwirkung zwischen der p38 MAP‐Kinase und ATG5 wird die Anhäufung von Autophagosomen beobachtet, welche aus der Inhibierung der Autophagosom‐Lysosom‐Fusion resultiert. Im Zuge dieser Arbeit wurde die funktionelle Interaktion zwischen der p38 MAP‐
Kinase und ATG5 biochemisch näher untersucht, wobei der Fokus auf der Identifizierung der für MAP‐Kinase‐Substrate typischen docking site von ATG5 lag. Dieses Aminosäure‐Muster an der Substratoberfläche dient der effektiven, spezifischen Anlagerung von Kinasen und ermöglicht so eine gezielte Phosphorylierung des Substrates. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion von p38 und ATG5 in HEK293T Zellen nachgewiesen. Im nächsten Schritt wurden gezielt potentiell am docking beteiligte Aminosäure‐Reste der ATG5‐Sequenz mutiert und die daraus resultierenden Mutanten in Co‐Immunpräzipitationen im Vergleich zu dem WT Protein untersucht. Die Mutationen T75A und L90S resultierten in einer verminderten Bindung von p38 an ATG5. Die Analyse von ATG5‐KO Zellen, die mit den ATG5‐
Mutanten rekonstituiert wurden, zeigte sowohl im Hinblick auf basale und induzierte Autophagie keinen eindeutigen, funktionellen Effekt der reduzierten Interaktion zu p38. Weiterhin wurden in dieser Arbeit in vitro Kinase‐Experimente mit aktiver p38 und entweder „freiem“ ATG5 oder der Autophagie‐aktiven Form, dem ATG12–5‐
Konjugat, durchgeführt. Western Blot‐Analysen wiesen auf eine p38‐vermittelte Phosphorylierung von ATG12, nicht aber von ATG5 hin, sodass ATG5 unter dieser Annahme möglicherweise die Rolle einer Interaktionsplattform zukommt. In einer folgenden massenspektrometrischen Untersuchung des phosphorylierten ATG12–5‐
Komplexes wurde das Peptid 24 bis 49 aus dem flexiblen N‐Terminus von ATG12 näher untersucht. Dieser Teil ist strukturell betrachtet leicht zugänglich und beherbergt drei von insgesamt fünf in der ATG12‐Sequenz befindlichen, potentiellen p38‐Phophorylierungsmotive Serin‐Prolin bzw. Threonin‐Prolin. Vorläufige Daten aus dieser Analyse zeigten im Gegensatz zu den genannten typischen Motiven eine Phosphorylierung an Serin 36 oder Serin 37 von ATG12. Dieses Ergebnis muss in nachfolgenden Experimenten verifiziert werden, um das Interaktionsmodell zwischen p38 und dem ATG12–5‐Konjugat besser zu verstehen. Darüber hinaus ist es notwendig, die Bedeutung der in dieser Arbeit identifizierten, für die Interaktion wichtigen Aminosäuren näher aufzuklären und gegebenenfalls weitere, an der docking site beteiligte, Aminosäuren zu identifizieren. 2 M.Sc. Bruns, Svenja – Autophagy regulation by the p38 MAP kinase – Zusammenfassung !
Zuvor wurde gezeigt, dass der Gadd45β‐induzierte Signalweg einen negativen feedback Regulationsmechanismus darstellen kann, der nach einer starken Autophagie‐Initiation durch LPS bzw. den TLR4 (toll‐like receptor 4) wichtig ist. Für die Identifizierung von weiteren physiologischen Situationen, in denen diese Kaskade aktiviert wird, wurde in dieser Arbeit an der Generierung eines Mausmodells gearbeitet. Die ATG5 Mutanten T75A (verminderte p38‐vermittelte Regulation) und T75E (erhöhte p38‐vermittelte Regulation) sollten dazu im ROSA26 Lokus von Mäusen unter der Kontrolle des EF1α‐Promotors exprimiert werden. Untersuchungen an der F6‐Generation der C57BL/6J‐rückgekreuzten transgenen Tiere machten allerdings deutlich, dass die Expression der ATG5‐Mutanten in Milz‐ und Lebergewebe trotz erfolgreicher Integration der zugehörigen Sequenz nicht verlässlich stattfand. Vermutlich führten spontan auftretende Methylierungen des EF1α‐Promotors zu dessen silencing. Daher konnten die Mäuse nicht, wie zuvor geplant, analysiert werden und das Projekt wurde terminiert. In einem weiteren Projekt innerhalb dieser Arbeit wurde der Effekt einer Staphylococcus aureus (S. aureus)‐Infektion auf die Autophagie‐Maschinerie in Mausfibroblasten untersucht. Studien von anderen Gruppen hatten zuvor gezeigt, dass die Infektion mit S. aureus Autophagie induziert und das Bakterium das Autophagosom möglicherweise als Nische für eine effektive Replikation nutzt. In diesem Zusammenhang weisen die generierten Daten auf eine S. aureus‐abhängige Inhibierung der Autophagosom‐Lysosom‐Fusion hin. Die genauen Wechselwirkungen und involvierten Faktoren waren allerdings nur unvollständig bekannt. Im Zuge dieser Arbeit wurde demonstriert, dass die Invasion von S. aureus die Aktivierung der so genannten selektiven Autophagie in der Wirtszelle auslöst. Dabei wurde die Assoziation von ubiquitinylierten Proteinen an der Oberfläche des Bakteriums und die anschließende Rekrutierung der Autophagie‐Rezeptoren p62 und Optineurin in Immunfluoreszenz‐Experimenten dokumentiert. Neben einer Domäne für die Interaktion mit Ubiquitin, zeichnen sich Autophagie‐Rezeptoren auch durch eine LC3‐
Interaktionsregion aus, über die sie an LC3‐II, ein an der autophagosomalen Membran verankertes Autophagie‐Protein binden. Mittels Fluoreszenz‐Mikroskopie wurde das autophagosomale Umschließen der Bakterien beobachtet. Im Hinblick auf die S. aureus‐abhängig induzierte selektive Autophagie wurden die Daten durch Western Blot‐Analysen bestätigt. Im Einklang mit den Beobachtungen in einer bereits 3 M.Sc. Bruns, Svenja – Autophagy regulation by the p38 MAP kinase – Zusammenfassung !
publizierten Studie wurde gezeigt, dass S. aureus nur zu einem kleinen Teil in sauren Kompartimenten, also den degradierenden Lysosomen endet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass S. aureus in der Lage ist, die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen zu verhindern oder zumindest zu verlangsamen, sodass ein Großteil der Bakterien aus dem Autophagosom ins Zytosol entkommen kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde darüber hinaus erstmals demonstriert, dass die spezifische Aktivierung und Rekrutierung der wirtseigenen MAP‐Kinase p38 eine entscheidende Rolle für den Erfolg dieses bakteriellen Überlebensmechanismus spielt. In p38‐defizienten Fibroblastenzellen co‐lokalisieren deutlich mehr Bakterien mit sauren Kompartimenten, also Lysosomen, als in den korrespondieren WT Zellen. Der Mechanismus, mit dem die Kinase während einer S. aureus‐Infektion phosphoryliert wird und die Faktoren, die an der spezifischen p38‐Translokation beteiligt sind, sind Gegenstand der aktuellen Forschung. Darüber hinaus muss die Frage nach den molekularen Schritten, die für die p38‐abhängige Inhibition der Autophagosom‐
Lysosom‐Fusion verantwortlich sind, adressiert werden. Weiterhin wurde innerhalb dieser Arbeit das Auslösen von Fettleibigkeit durch eine spezielle fettreiche Diät mit männlichen und weiblichen Tieren der Mauslinien Gadd45β‐KOxGFP‐LC3 und GFP‐LC3 untersucht, unter anderem, um die experimentelle Vorgehensweise zukünftig auch für Untersuchungen an anderen Mausmodellen nutzen zu können. In der aktuellen Forschung rückt die regulatorische Rolle von Autophagie bei der Entwicklung von Fettleibigkeit und den damit assoziierten Faktoren wie der Insulin‐Resistenz oder der Zunahme des weißen Fettgewebes immer stärker in den Fokus. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer fettreichen Diät unter anderem durch das Messen der Gewichtsveränderungen, von metabolischen Blutparametern wie Ruhe‐Glukose‐, Triglyzerid‐, Cholesterol‐ und HDL‐Cholesterol‐Konzentration sowie der histologischen Auswertung zentraler metabolischer Gewebe wie Leber und scapularem Fett überprüft. Besonders die männlichen Tiere wiesen dabei die zu erwartenden Veränderungen in Richtung einer sich ausbildenden Fettleibigkeit auf. Auffallend war die im Vergleich zu den WT‐
Weibchen höhere Suszeptibilität der weiblichen Gadd45β‐KO‐Tiere im Hinblick auf die Folgen der fettreichen Diät. Die Zunahme des Gewichts, die Konzentration von Ruhe‐Glukose und Cholesterol und die Pathologie der untersuchten Gewebe waren bei den weiblichen Gadd45β‐KO‐Tieren vergleichbar zu männlichen, fettreich gefütterten 4 M.Sc. Bruns, Svenja – Autophagy regulation by the p38 MAP kinase – Zusammenfassung !
Mäusen beider Genotypen. Dagegen zeigten die WT‐Weibchen nur moderate Diät‐
abhängige Veränderungen in den untersuchten Parametern. Dieser hier dargestellte geschlechtsabhängige Effekt wurde bislang noch nicht beschrieben und stellt eine interessante Basis für weitere, vertiefende Experimente dar, in denen die bereits gesammelten Daten zunächst bestätigt und dann erweitert werden müssen. 5 M.Sc. Bruns, Svenja - Autophagy regulation by the p38 MAP kinase - Summary
SUMMARY
The term autophagy describes the intracellular engulfment of cytoplasmic
contents in autophagosomes and their lysosomal degradation. Autophagy contributes
to basal homeostasis via continuous protein and organelle recycling. It is also
important to sustain amino acid and energy levels upon nutrient withdrawal, as well
as for fighting invading pathogens. Negative regulation by the Gadd45-MEKK4MKK3/6-p38 MAP kinase signaling cascade, which inhibits autophagosome-lysosome
fusion, was shown to depend on the functional interaction of p38 with the key
autophagy protein ATG5.
During this thesis, the interaction was confirmed in vitro and ATG5 mutants were
generated to identify residues crucial for kinase-docking. Co-immunoprecipitation
experiments with ATG5T75A, L90S and L90Q indicated a reduced interaction with p38.
However, a clear functional effect during basal or induced autophagic flux in mutantreconstituted MEF cells was so far not observed. In vitro kinase assays with the
conjugate of ATG12 and ATG5 pointed to a p38-specific phosphorylation of ATG12. A
preliminary mass spectrometry approach suggested Ser36 or Ser37 of ATG12, instead
of one of the canonical S/TP motifs, as target residue for p38-mediated
phosphorylation. The generation of a RMCE-based transgenic mouse model, by which
the physiological role of the Gadd45-induced signaling cascade should be further
elucidated, resulted in a mosaic expression of the transgene and was terminated.
Analysis of the autophagic response in S. aureus-infected fibroblast cells
demonstrated the association of the bacteria with ubiquitinylated proteins, the
recruitment of autophagy receptors such as p62 and OPTN and subsequent
engulfment by LC3-II-positive autophagosomal structures. However, S. aureus was
able to evade these vacuoles prior to lysosomal degradation by a mechanism that
involves activation and recruitment of the host MAP kinase p38.
During the establishment of a high-fat diet induced obesity model with
Gadd45knock out (KO) x GFP-LC3 and GFP-LC3 mice of both genders, in particular
the female Gadd45 KO mice displayed an enhanced susceptibility towards the highfat diet compared to their wild type (WT) counterparts. This observation mainly
included increased weight, plasma levels of resting glucose, total and HDL cholesterol
as well as enhanced pathology of the liver and scapular fat.