Konzept zur integrierten Bekämpfung der pektinolytischen Bakterien
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Konzept zur integrierten Bekämpfung der pektinolytischen Bakterien in der Schweizerischen Kartoffelproduktion Konzept zur integrierten Bekämpfung der pektinolytischen Bakterien in der schweizerischen Kartoffelproduktion Patrice de Werra, Brice Dupuis, Santiago Schaerer, Andreas Keiser t Projektziele • Nachweis und Bedeutung des Pflanzgutbefalls für die Krankheitsentwicklung (HAFL, INRA, BIOREBA AG) Zuverlässigkeit und Praktikabilität einer Pflanzgutanalyse Bedeutung des Pflanzgutbefalls und der Standortfaktoren für die Krankheitsentwicklung • Monitoring der auftretenden Bakterien (Agroscope, HAFL) Analyse von Pflanzenproben (Stängel und Knollen) in der Schweiz zur Bestimmung der Bakterienart • Identifizierung und Quantifizierung der wichtigsten Risikofaktoren für die Kontamination von Kartoffelposten (Agroscope) Sortenanfälligkeit, Aggressivität der Bakterienstämme, etc. Risikoverminderung durch eine direkt Bekämpfung (neu im Projekt) • Entwicklung des Konzepts zur integrierten Bekämpfung (HAFL, Agroscope und Kartoffelbranche) Zuverlässigkeit und Praktikabilität einer Pflanzgutanalyse Monitoring von Import und Vermehrungsposten (Praxistest für die Pflanzgutanalyse) 2013 25 Importposten (Frankreich, Deutschland, Holland) 28 Vermehrungsposten (Schweiz) 2014 22 Importposten (Frankreich, Deutschland, Holland, Oesterreich) 14 Vermehrungsposten (Schweiz) + 44 Frühkartoffeln Posten(zertifiziert) in Deutschland Methoden Pflanzgutanalyse • Analyse von 6 Teilproben von 50 Knollen (300 Knollen pro Posten) • PCR et Q-PCR mit Enrichment (DPEM) • Amplifizierung mit spezifischen Primern Q-PCR PCR Dsp Patr Pwas Pcbr Dickeya sp. Pectobacterium atrosepticum Pectobacterium wasabiae P. c. subsp. brasiliense ADE1 / ADE2 (Nassar et al., 1996) Y45 / Y46 (Frechon et al., 1998) PhF/PhR (De Boer et al., 2012) BR1f/L1r (Duarte et al., 2004) (Pcc P. c. subsp. carotovorum EXPCCF/EXPCCR (Kang et al., 2003)) Material und Methoden phosphate buffer, overnight à 100 rpm, 4 °C … Seed lot A: 1 300 tubers 2 3 … 6 6 x 50 tubers DNA extraction gel PCR or Q-PCR Enrichment DPEM (2 days at 26°C) 6 tubes (1 to 6) multiplication Dsp ≅ 0.4 % Pcbr ≅ 1.4 % Abschätzung der latenten Infektion 2014 2014 Dsp Patr Pwas Pcbr Herkunft Probe Q-PCR Q-PCR PCR PCR Östereich 1 0% 0% 0% 2.2% Östereich 2 0% 0% 0% 0-0.4% Deutschland 3 0% 0% 2.2% 3.5% Deutschland 4 0% 0% 0% 0.8% Deutschland 5 0% 0% 0.4% 0-0.8% Deutschland 6 0% 0% 0-0.8% >3.5% Deutschland 7 0% 0% 0% 0% Deutschland 8 0% 0.8% 0-0.8% 0-0.4% Niederland 9 0% 0% 0% 0.4% Niederland 10 0% 0% 0.4% 0.4-0.8% Niederland 11 0% 0% 0% 0% Niederland 12 0% 0% 0% 0% Niederland 13 0% 0% 0% 0% Niederland 14 0% 0% 0% 0% Niederland 15 0% 0% 0% 0% Niederland 16 0% 0% 0% 0% Niederland 17 0% 0% 0% 0% Frankreich 18 0% 0% 0% 0% Frankreich 19 0% 0% 0% 0% Frankreich 20 0% 0% 0% 0% Frankreich 21 0% 0% 0% 0% Frankreich 22 0% 0% 0% 0% Importposten Entscheid Pcbr Pcbr Pcbr Patr Latente Infektion 2014 (test binaire) Importposten Latente Infektion von 399 Importposten, Analyse von 1 x 200 Knollen in Changins (Agroscope) Dsp 2 Patr 1 Pcc oder Pwas 49 Pcbr 26 Östereich Deutschland Niederland Frankreich 5 10 5 6 Abschätzung der latenten Infektion 2014 CH Vermehrungsposten, geliefert durch die VO’s, Posten mit Verdacht 2014 Dsp Patr Pwas Pcbr Herkunft Probe Q-PCR Q-PCR PCR PCR Suisse Suisse Suisse 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 1.4% Pcbr Suisse M1 M2 M3 M4 0% 0% 0% >3.5% Pcbr Suisse M5 0% 0% 0.4% 0.4% Suisse M6 0% 0% 1.4% 0% Suisse M7 0% 0% 0% 2.2% Suisse M8 0% 0% 0% 0.8% Suisse M9 0%-0.8% 0% 0% 0.8% Suisse M10 0% 0% 0% 3.5% Pcbr Suisse M11 0% 0% 0% >3.5% Pcbr Suisse M12 0.4% 0% 0% 0.8% Dsp Suisse M13 0% 0% 0.8% >3.5% Pcbr Suisse M14 0% 0% 0% 0% Entscheid Pcbr Abschätzung der latenten Infektion Was muss beachtet werden? Abschätzung der latenten Infektion 2014 22 Importposten 14 Vermehrungsposten 44 Posten Z-Saatgut (Vorderpfalz Deutschland) 80 Posten (Import, CH, D) Abschätzung der latenten Infektion 2014 22 Importposten 14 Vermehrungsposten 44 Posten Z-Saatgut (Vorderpfalz Deutschland) 80 Posten (Import, CH, D) Abschätzung der latenten Infektion 2014 2014 Dsp Patr Pwas Pcbr Herkunft Probe Q-PCR Q-PCR PCR PCR Östereich 1 0% 0% 0% 2.2% Östereich 2 0% 0% 0% 0-0.4% Deutschland 3 0% 0% 2.2% 3.5% Deutschland 4 0% 0% 0% Deutschland 5 0% 0% Deutschland 6 0% Deutschland Deutschland 7 8 Niederland Importposten Entscheid Feld Befall Pcbr faule Stängel od. Knolle < 0.1% kein Schwarbeinigkeit < 0.1% - >0.1% Pcbr (4/5) und Pwas (1/5) 0.8% >0.1% Pcbr (2 Feld) 0.4% 0-0.8% < 0.1% - 0% 0-0.8% >3.5% >0.1% Pcbr (2 Feld) und Pwas in 1 Feld (2/7) 0% 0% 0% 0% < 0.1% - 0% 0.8% 0-0.8% 0-0.4% < 0.1% - 9 0% 0% 0% 0.4% < 0.1% - Niederland 10 0% 0% 0.4% 0.4-0.8% < 0.1% - Niederland 11 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Niederland 12 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Niederland 13 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Niederland 14 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Niederland 15 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Niederland 16 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Niederland 17 0% 0% 0% 0% < 0.1% Frankreich 18 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Frankreich 19 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Frankreich 20 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Frankreich 21 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Frankreich 22 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Pcbr Pcbr Patr Abschätzung der latenten Infektion 2014 Vermehrungsposten CH 2014 Dsp Patr Pwas Pcbr Q-PCR Q-PCR PCR PCR 0% 0% 0% 0% < 0.1% 0% 0% 0% 0% < 0.1% 0% 0% 0% 1.4% Pcbr < 0.1% - Suisse Probe M1 M2 M3 M4 0% 0% 0% >3.5% Pcbr 0.6% Pcbr (4/4) Suisse M5 0% 0% 0.4% 0.4% < 0.1% - Suisse M6 0% 0% 1.4% 0% < 0.1% Suisse M7 0% 0% 0% 2.2% Pcbr Suisse M8 0% 0% 0% 0.8% < 0.1% - Suisse M9 0%-0.8% 0% 0% 0.8% < 0.1% - Suisse M10 0% 0% 0% 3.5% Pcbr >0.2% Pcbr Suisse M11 0% 0% 0% >3.5% Pcbr >0.2% Pcbr Suisse M12 0.4% 0% 0% 0.8% Dsp >0.2% Feld 1: Pcbr (4/5) und Pwas (1/5) Feld 2: Pcbr Suisse M13 0% 0% 0.8% >3.5% Pcbr 5.0% Pcbr Suisse M14 0% 0% 0% 0% < 0.1% - Herkunft Suisse Suisse Suisse Entscheid Feld Befall Pcbr >0.1% faule Stängel od. Knolle Zuverlässigkeit des Tests Monitoring 2013-2014 (89 Schweizer Poste) Lab - / Feld Lab + / Feld + Lab + / Feld Lab -/ Feld + test OK test OK falsch positive falsch negative Zuverlässigkeit des Tests Monitoring 2013-2014 (89 Schweizer Posten) streng Welche Toleranz muss man bei der Interpretation anwenden? Lab - / Feld Lab + / Feld + Lab + / Feld Lab -/ Feld + test OK test OK falsch positive falsch negative tolerant Zuverlässigkeit des Tests Monitoring 2013-2014 (89 Schweizer Posten) Lab - / Feld Lab + / Feld + Lab + / Feld Lab -/ Feld + test OK test OK falsch positive falsch negative Stängelproben 2014 Stängel mit Schwarzbeinigkeit: HAFL Agroscope 265 Proben (Agroscope und HAFL) -87 (kein pektinolytischen Bakterien) =178 Bakterien-Isolate Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense Offizielle Situation2013 Isolate « publiziert »: - Deutschland, Syrien Isolate nicht publiziert: - Belgien Isolate « nur » in Gewässern: - Holland ? ? Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense Offizielle Situation 2014 Anerkanntes Vorkommen: Schweiz, Holland, Frankreich, Deutschland, Belgien Verdacht: Oesterreich ? ? Indentifizierung im Gang: Schweden, Polen, Finland. Auftreten der verschiedenen Bakterien 1999 ? Pcbr schon vor 2013 in der CH? ? 2017 2018 2016 ???? 2015 1988 Phylogenetisches Baum des Pectobacterium Arten Erstellt mit die Neighbor-Joining Methode mit DNA Sequenzen aus 7 konstitutiven Genen: acnA, gapA, icdA, mdh, mtlD, pgi und proA. P. c. subsp. brasiliense HAFL07 (CH) P. c. subsp. brasiliense HAFL08 (CH) 100 P. c. subsp. brasiliense HAFL06 (CH) P. c. subsp. brasiliense HAFL05 (CH) P. c. subsp. brasiliense IPO-3650 (NL) 72 96 Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense P. c. subsp. brasiliense IPO-3665 (NL) P. c. subsp. brasiliense IPO-3671 (NL) 100 P. c. subsp. brasiliense 1009 (CA) P. c. subsp. brasiliense ACW88/157-2 (CH) 100 99 P. c. subsp. brasiliense ACW99/39-31-1 (CH) P. c. subsp. brasiliense Ecbr1695 (BR) 100 100 45 P. c. subsp. brasiliense Ecbr1692 (BR) P. c. subsp. brasiliense NZEC1 (NZ) P. c. subsp. odoriferum CFBP1878 (F) 100 P. c. subsp. carotovorum CFBP2046 (DK) 99 95 P. c. subsp. carotovorum HAFL11 (CH) P. betavasculorum NB2122 (CA) 100 22 P. atrosepticum CFBP 1526 (UK) P. atrosepticum HAFL09 (CH) P. wasabiae CFBP 3304 (JP) 36 P. wasabiae HAFL01 (CH) 100 100 P. wasabiae HAFL02 (CH) D. dadantii Ech703 (US) Dickeya sp. HAFL10 (CH) 0.02 Pectobacterium wasabiae • Monitoring 2014 Symptome im Feld Gesund • Monitoring 2014 Symptome im Feld Welke • Monitoring 2014 Symptome im Feld Schwarzbeinigkeit • Monitoring 2014 Symptome im Feld Gesund • Monitoring 2014 Symptome im Feld Atypische Symptome Verwechslung mit Rhizoctonia Sortenanfälligkeit Sortenanfälligkeit ▶ Keine der Hauptsorten in der Schweiz ist resistent gegenüber der Schwarzbeinigkeit. ▶ Es gibt nur geringe Unterschiede in der Anfälligkeit der in den Versuchen getesteten Sorten. ▶ Agria (3 Jahre im Feld getestet) scheint besonders anfällig gegenüber Schwarzbeinigkeit zu sein. ▶ Versuche 2013: 42% Schwarzbeinigkeit ▶ Versuche 2014: 45% Schwarzbeinigkeit ▶ Markies (2 Jahre im Feld getestet) scheint wenig anfällig gegenüber Schwarzbeinigkeit zu sein. ▶ Versuche 2013: 4% Schwarzbeinigkeit ▶ Versuche 2014: 1% Schwarzbeinigkeit Perte de poids (g) Aggressivität der Bakterienstämme Essai 1 Essai 2 Essai 3 Aggressivität der Bakterienstämme Aggressivität der Bakterienstämme ▶ Die getesteten Stämme von Dickeya solani entwickeln mehr Symptome von Nassfäule als die Stämme von Dickeya dianthicola. ▶ Die Virulenz der Stämme von Dickeya ist nicht abhängig von der Bakterienart. Einflussfaktoren auf die Entwicklung von Schwarzbeinigkeit im Feld Niederschläge (Adams et Stevenson, 1990; Fiers et al., 2012) Temperatur Blattfeuchtigkeit (Czajkowski et al., 2010 et 2013) (Adams et Stevenson, 1990) Anfälligkeit der Sorte (Prokkola, 1994; Hélias et al., 2000; Rouffiange et al., 2013) Luftfeuchtigkeit (Prokkola, 1994; Fiers et al., 2012) Evapotranspiration (Czajkowski et al., 2010) Agressivität des Bakterienisolats (Czajkowski et al., 2013; Rouffiange et al., 2013) Infektionniveau (Bain et Pérombelon, 1990; Czajkowski et al., 2011) Bodeneigenschaften Bodentemperatur (Aleck et Harrison, 1978; Czajkowski, 2013)) Bodenfeuchtigkeit (Aleck et Harrison, 1978; Pérombelon et al., 1989; Adams et Stevenson, 1990; Czajkowski et al., 2010) (Aleck et Harrison, 1978; Lambert et al., 2005; Fiers et al., 2012) Düngung (Graham et Harper, 1966; McGuire et Kelman, 1984; Prokkola, 1994; Bains et al., 1996; Lambert et al., 2005) Einflussfaktoren auf die Entwicklung von Schwarzbeinigkeit im Feld ▶ Das erste Auftreten des ersten Befalls im Feld wird hauptsächlich beeinflusst durch: ▶ ▶ Die Bodenfeuchtigkeit und die Evapotranspiration (42%) Die Entwicklung des Befalls über die gesamte Vegetation wird beeinflusst durch: ▶ ▶ Die Sortenanfälligkeit und die Aggressivität de Bakterienisolate (73%) Die Bodeneigenschaften (%Humus) und die Düngung (N-Gaben) (10%) Verminderung des Risikos durch direkte Bekämpfung Category Disinfectants Number of Name of product or candidates organism 2 Active subtsance Mode of action Reference Benzoic acid Cellular damage due to the dissociation of functional groups Czajkowski et al, 2013 Sodium hypochlorite NaClO Oxydation and denaturation of proteins Mills et al, 2006 Czajkowski et al, 2013 Menno Florades® Essential oil 1 Talenton® D-Carvone (SCarvone) Disruption of Krebs et al, 1999 membraneous exchanges Lo Cantore et al, 2009 and cell energetic levels Plant extracts 15 / Unknown Unknown Elicitors 4 Bion® Acibenzolar-S-methyl Chitosan Phosfik® Salicylic acid Vineyard protection, Agroscope Induction of plant defense Oostendorp et al, 2001 mechanisms (production Rabea et al, 2003 Chitosan of phytoalexins, Phosphite Olivieri et al, 2011 callose,etc.) 2-hydroxybenzoic acid J. van der Wolf, Wageningen UR Lopez et al, 2001 Antagonistic bacteria 9 Pseudomonas spp. / Competition, antibiosis, elicitation, parasitism Fertilizer 1 Granumag® Magnesium Strengthening of the plant Dubois et al, 2014 Czajkowski et al, 2011 Krzyzanowska et al, 2012 Hunziker et al, 2014 Verminderung des Risikos durch direkte Bekämpfung (Gewächshaus) Rotten stems plant-1 (a) Rotten stems plant-1 (d) Sodium hypochlorite Menno Florades® Control (b) (c) 1.6 1.6 1.2 1.2 1.2 0.8 0.8 0.8 1.6 0.4 0.4 0.0 0 0 13 16 20 23 31 34 38 42 13 16 20 23 31 34 38 42 (e) 1.6 0.4 Talenton® Control (f) 1.6 1.6 1.2 1.2 1.2 0.8 0.8 0.8 0.4 F1 F3 Control 0 0.4 Proradix® R47 S49 Control 0.0 0 13 16 20 23 31 34 38 42 Days after emergence 0.4 13 16 20 23 31 34 38 42 Days after emergence Salicylic acid Bion® Chitosan Phosfik® Control 13 16 20 23 31 34 38 42 Granumag® Control 13 16 20 23 31 34 38 42 Days after emergence NaClO reduziert die Symptome um 67 % (NS) Bion® et chitosan reduziert die Symptome um 20 % and 15 % (NS) Das Pflanzenextrakt F1 reduziert die Symptome um 15 % (NS) Verminderung des Risikos durch direkte Bekämpfung (Feldversuche) 30 Bion® F3 Menno Florades® Phosfik® Proradix® R47 S49 Talenton® Dickeya Control % de jambes noires Blackleg incidence (%) 25 20 15 10 5 0 38 46 52 59 66 73 Days afterplantation planting Jours après 80 87 94 Kein Verfahren hat eine signifikantge Wirkung auf die Entwicklung der Schwarzbeinigkeit. Die mit P. DSMZ 13134 (Proradix®) behandelten Verfahren scheinen weniger Symptome zu zeigen (40 % weniger). Folgerungen aus dem Projekt 2nd Euphresco II Dickeya & Pectobacterium meeting 24 and 25 November 2014 Bern (GurtenPark), Switzerland Die pektinolytischen Bakterien ▶ 5 verschiedene Bakterien können Schwarzbeinigkeit und Nassfäule verursachen. ▶ Bis 2012 war Dickeya in der Schweiz dominierend, danach hat sich Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense stark ausgebreitet. 2014 war dieses Bakterium in der Schweiz dominierend. Weitere Entwicklung? ▶ Die gleiche Entwicklung wurde auch in anderen Ländern Europas (Holland, Schweden) beobachtet. ▶ Ein kontinuierliches Monitoring zur Beobachtung der Entwicklung der Bakterien ist ein wichtiger Teil der Bekämpfung der Schwarzbeinigkeit. Nachweis und Bedeutung des Pflanzgutbefalls ▶ Der latente Pflanzgutbefall ist der wichtigste Faktor in der Bekämpfung. ▶ Die Pflanzgutanalyse mittels PCR eignet sich für den routinemässigen Einsatz in der Pflanzgutproduktion als Ergänzung zur visuellen Feldkontrolle. ▶ Die Züchtungsfirmen in Europa nutzen die Pflanzgutanalyse zunehmend in der Pflanzgutproduktion. ▶ 2015 und 2016 wird die HAFL im Auftrag der Swisssem ausgewählte Import- und Vermehrungsposten untersuchen. Bis 2017 soll eine definitive Lösung im Rahmen der Zertifizierung gefunden werden. Die Übertragung der Bakterien ▶ Die Übertragung der Bakterien über die Stolonen auf die Tochter-knollen ist möglich, ist aber nicht der wichtigste Übertragungspfad. ▶ Wichtiger ist die Übertragung mit dem Bodenwasser. Die Bakterien können über die Wurzeln infizieren oder über Lentizellen oder Verletzungen in die Knollen eindringen. ▶ Vorbeugende Massnahmen im Feld und am Lager müssen darauf abzielen, die Bedingungen für die Bakterien ungünstig zu halten: Parzellenwahl, schonende Bodenbearbeitung und Ernte, schonende Manipulation, Belüften und Hygiene am Lager. = gesund = Welke = Schwarzbeinigkeit Bedingungen für die Bakterien Ernte t Bösingen 2010 Kritische Periode für die Entwicklung der Schwarzbeinigkeit Kritische Periode für die Knollenkontamination durch den Boden günstig Schwarzbeinigkeit ungünstig Knolleninfektion 2011 ungünstig Schwarzbeinigkeit ungünstig Knolleninfektion 2012 günstig Schwarzbeinigkeit günstig Workshop Pflanzkartoffeln, HAFL, 07.12.2012 Knolleninfektion Sortenanfälligkeit / Aggressivität der Bakterienstämme ▶ Die Aggressivität der verschiedenen Bakterienstämme von Dickeya ist sehr unterschiedlich. ▶ Diese Unterschiede haben einen bedeutenderen Einfluss auf die Krankheitsentwicklung als die unterschiedliche Anfälligkeit der Kartoffelsorten. ▶ Mittelfristig stellt die Sortenwahl keine wirksame Massnahme gegen die Schwarzbeinigkeit dar! Direkte Bekämpfung ▶ 4 Produkte reduzierten die Symptome von Schwarzbeinigkeit im Gewäschshaus. Diese werden unter den gleichen Bedingungen weiter getestet. ▶ NaClO ist im Gewächshaus das wirksamste Produkt, es wird 2015 im Feld getestet. ▶ Die Ergebnisse sind erst provisorisch. Daraus können keine Behandlungsempfehlungen abgeleitet werden. Verdankungen ▶ Agroscope ▶ Gaétan Riot ▶ Maud Tallant ▶ Isabelle Kellenberger ▶ Elena Dubois Gill ▶ Mout De Vrieze ▶ Jérémie Rouffiange ▶ David Gérardin ▶ Jean-Marie Torche ▶ Ruedi Schwaerzel ▶ HAFL ▶ Floriane Bussereau ▶ Martin Häberli ▶ Claudia Degen ▶ Jürg Moser ▶ Stefan Mellema ▶ BIOREBA AG ▶ Denise Altenbach ▶ Christophe Debonneville ▶ INRA Rennes Fragen? Danke für die gute Zusammenarbeit! Fragen? t
