Charakterisierung von Bakterien

Bakterien als Proteinfabrik
Seit es Stanley Cohen und Herbert Boyer in ihrem historischen Experiment gelang, fremde DNA auf einem
Plasmid in ein E. coli Bakterium einzuschleusen, werden diese kleinen ringförmigen DNA-Moleküle als
Transportmittel (Vektoren) für Fremd-DNA genutzt. Durch rekombinante Plasmide können Bakterien in zelluläre
Fabriken für Fremdproteine umgewandelt werden. So werden beispielsweise bestimmte Enzyme und Hormone
in großer Menge produziert. Dadurch sind weitere Untersuchungen möglich: wie zum Beispiel die
Strukturaufklärung des vom Bakterium produzierten Proteins. Daraus können wiederum Erkenntnisse über
dessen Funktionsweise im Organismus gewonnen werden.
In unserem Experiment können die wesentlichen methodischen Schritte, die von der DNA bis zum aktiven
Protein führen - auf mehrere Module verteilt - nachvollzogen werden.
Zeitbedarf: 1-3 Tage je nach Anzahl der Module
Modul 1
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1. Isolierung der Plasmid-DNA
mit Hilfe von Silika-Technologie
und Zentrifugation
Es werden Bakterienzellen aus ÜbernachtKulturen von Escherichia coli verwendet,
deren Plasmide ein so genanntes a-Peptid
zur Komplementierung des b-Galaktosidase-Gens
tragen.
Mit Hilfe eines speziellen Verfahrens wird die DNA
an einer Silika-Membran (Pfeil) in einem Reaktionsgefäß gebunden.
DNA
2. Transformation
3. Ausplattieren der Bakterien
nach der Transformation
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Schließlich wird die hoch gereinigte Plasmid-DNA
– in einem Puffer gelöst – in einem Reaktionsgefäß
aufgefangen.
Die Plasmide werden durch Hitze- und Kälte-Schock
oder Elektroporation in kompetente Bakterienzellen
eingeschleust.
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Unter einer Clean Bench werden die Bakterien durch
Schwenken auf einem Nährboden , der x-Gal enthält, verteilt.
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4. Kultivierung der Bakterien
Zeitbedarf für dieses Modul mit Auswertung ca. 7 - 8h
Auswertung an einem der Tage darauf ca. 1,5 h
In einem Brutschrank werden die Bakterien über
Nacht kultiviert.
Bakterien als Proteinfabrik
Modul 2
1
1. Ansetzen der Vorkultur
ÜN-Kultur
Vorkultur
Es werden Bakterien verwendet, die neben
speziellen Regulationsgenen auch ein Gen für
b-Galatosidase auf einem so genannten Expressionsplasmid tragen.
Mit einer Suspension aus einer Über-Nacht-Kultur
(ÜN-Kultur) dieser Bakterien wird eine Vorkultur
angeimpft.
In bestimmten Zeitabständen wird die Kultur
unterbrochen. Es werden Proben aus der Vorkultur
entnommen und die Optische Dichte (OD) der
Bakteriensuspension fotometrisch ermittelt.
2. Induktion der Genexpression
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Nach Erreichen eines geeigneten OD-Wertes wird
die Expression des b-Galactosidase-Gens mit IPDG
Induziert.
Induktionskultur
Danach werden die induzierten Bakterien weiter
kultiviert.
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3. Probenentnahme
In bestimmten Abständen werden Proben aus der
Induktionskultur genommen.
Nach Zentrifugation werden die Bakterien-Pellets im
Kühlschrank aufbewahrt.
Induktionskultur
4. SDS-PolyacrylamidElektrophorese
5. Aktivitätstest
4
5
Zur Überprüfung des Expressionsergebnisses
Werden die entnommenen Proben nach Aufschluss
der Bakterien auf ein Gel aufgetragen.
Zur Überprüfung der Enzymaktivität der
b-Galactosidase wird das Substrat-Analogon
o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG)
zugegeben und die Aktivität des Enzyms über
die Farbreaktion des ONPG fotometrisch gemessen.
Zeitbedarf für dieses Modul mit Auswertung ca. 8h
Für einen reibungslosen Ablauf bedarf es einer diszipliniert arbeitenden Schülergruppe
Bakterien als Proteinfabrik
Modul 3
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1. Zellaufschluss
Für dieses Modul können Bakterien-Pellets aus
Modul 2 oder zur Verfügung gestellte BakterienPellets verwendet werden.
Für Modul 3 können Bakterien verwendet werden,
die entweder ein Gen für b-Galactosidase oder für
mCherry auf ihrem Plasmid tragen. In beiden Fällen ist
das Gen mit sechs His-Resten gekoppelt.
Die Bakterien in den Pellets werden zunächst aufgeschlossen.
2. Binden der Proteine
an die Säule
(Affinitätschromatographie)
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Das Bakterienlysat wird dann auf eine Säule gegeben,
die mit HisBeats gefüllt ist. Die Genprodukte binden
Über die His-Teste an den HisBeats . Im Falle der
Bindung von mCherry ist die Bindung durch eine
Verfärbung der HisBeats zu beobachten.
.
3. Waschen und Eluieren
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Das Lysat sowie alle Flüssigkeiten aus den Binde-,
Wasch- und Eluierungsschritten werden aufgefangen.
4. SDS-PolyacrylamidElektrophorese
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In einem SDS-Polyacrylamid-Gel werden die Proteine , die sich in den Flüssigkeiten befinden, s
ichtbar gemacht.
5. Aktivitätstest
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Unterschiede in der Enzymaktivität der b-Galactosidase in den Flüssigkeiten wird mit dem SubstratAnalogon ONPG über eine Farbreaktion fotometrisch nachgewiesen.
Zeitbedarf für dieses Modul mit Auswertung ca. 8h