Oberflächen

Primäre Adhäsion von Bakterien auf Kunststoffoberflächen
11. Thementage Grenz- und Oberflächentechnik
Workshop Antimikrobielle Oberflächen
Nathalie Stefani / Prof. Dr. Hans-Achim Reimann
Primäre Adhäsion von Bakterien auf Kunststoffoberflächen
Oberflächen in der Lebensmittelverarbeitung
Primärbesiedlung mit Mikroorganismen
Oberflächenmodifikation mit Plasmatechnik
Messung mikrobieller Adhäsionskraft
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Motivation
ZIM-Projekt zur Entwicklung von Behältern für den Einsatz in der Fleischverarbeitung
mit leicht zu reinigender Oberfläche
EU Verordnungen für Verarbeitung von Lebensmitteln tierischen Ursprungs*
und mikrobiologische Kriterien** und Fleischhygieneverordnung***
z.B.:
Entfernung von Oberflächenverunreinigungen mit Trinkwasser*
Grenzwert z.B. E.coli Fleischzubereitung 5-50 x 10² KBE / g oder cm² **
am Ende des Arbeitstages sorgfältig reinigen…***
 eingeschränkte Nutzung von Desinfektionsmitteln und Flächenbezug
 Reinigung innerhalb von Stunden (primäre Adhäsion von Mikroorganismen)
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Bakterien und Oberflächen
Keimarme Oberflächen durch
abwehren oder abtöten
abtötend
repulsiv, antiadhäsiv
Mechanismen antimikrobiell ausgerüsteter Oberflächen
(nach [1])
Abwehr verhindert Ablagerungen, die als Substrat für spätere Ansiedlung geeignet wäre:
„Reinigung ist besser als Desinfektion“
[1] F. Siedenbiedel and J. C. Tiller (2012) Polymers, vol. 4, no. 1, pp. 46–71
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Adhäsion von Bakterien auf Oberflächen
Bakterienadhäsion
Umgebung
pH-Wert
Temperatur
Ionenstärke
Expositionszeit
Material
OberflächenFunktionalitäten
OberflächenRauhigkeit
OberflächenPolarität
Organismus
ZellwandFunktionalitäten
Quelle: Papukashvilli, N. (2009)
Extrazelluläre
Polysaccharide
ZellKonzentration
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Anhaftung von Bakterien auf Oberflächen
Phasen
Reversible
Adhäsion
Rev. Adh. 10s [1]
Irreversible
Adhäsion
Mikrokolonisierung
Monolayer nach 30min [1]
Initiale Adhäsion 24h [2]
(nach [1])
Biofilmbildung
Bildung neuer
Mikrokolonien
Mikrokolonien nach 3-4h [1]
Mikrokolonien 48h [2]
Biofilm 3d [2]
Primäre Adhäsion
Oberfläche
[1] G. O’Toole, H.B. Kaplan, and R. Kolter (2000) Annu. Rev. Microbiol., Vol. 54, no. 1, 49–79 (Pseudomonas aeruginosa)
[2] C.Lüdecke, K.D.Jandt, D.Siegismund, M.J.Kujau, E.Zang (2014) PLoS ONE 9(1): e84837 (E.coli EC081)
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Primärbesiedlung
Primärbesiedlung ist, wenn ein Mikroorganismus
 initial adhäriert ist,
 noch keinem Biofilm angehört,
 noch als eigenständiges System agiert,
 die repulsive Energiebarriere überwindet,
 noch typische Gene für die planktonische Lebensform exprimiert,
 noch keine für seine EPS typischen Substanzen extrazellulär ausgebildet hat.
Oberflächenkriterien für eine Primärbesiedlung sind
 Gesamtsystem Oberfläche / Schmutz / Trägerphase
 Parameter Topographie, Oberflächenenergie, Oberflächenladungen
[1] Bellmann, Calvimontes, Caspari, Marx, Mauermann; CIT (2012) 1531
[1]
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Oberflächenkriterium Oberflächenenergie
Oberflächenenergie / Trennkraft
 niederenergetische Oberflächen sind leichter reinigbar [1]
 Oberflächenenergie beeinflusst Verkeimung [2]
 Emaille: hohe Oberflächenenergie vs. niedrige Trennkraft [1]
 Baier-Kurve: Minimum bei 23 mN/m zeigt
Resistenz gegenüber Bioadhäsion (nach [3])
surface free energy (mNm-1) [3]
[1] Bobe, Wildbrett; CIT (2006) 1615; [2] Dexter et al.; Appl. Microb.(1975) 298; [3] R.E. Baier; Bull. N.Y. Acad. Med. (1972) 48, 257
[2]
7
Oberflächenkriterium Oberflächenrauheit
Oberflächenrauheit
 DIN 1672-2: Rauheit Ra </= 0,8µm für produktberührende Oberflächen im
Lebensmittelbereich [1]
 Trennkraft von Hefezellen auf glatten Oberflächen (Ra < 0,2µm) größer als auf
Oberflächen mit Ra = 0,2-1,5µm
[2]
Haftverminderung durch mikrorauhe Topographie
 wenige Oberflächenkontakt für
Mikroorganismen (1-2 µm)
 Größenordnung der Oberflächenstrukturen
0,1-1 µm (Rillenbreite)
glatte Oberfläche
rauhe Oberfläche
< 1µm
mikrorauhe Oberfläche
[1] DIN 1672-2; [2] Weigl (2004) Dissertation TU München
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Plasmamodifikation
Plasmaätzen von PMMA
PMMA im HF-Diodensputter (13,56 MHz, Ar, O2, 2 min)
Rillenbreite: ca. 0,15 µm
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Modifizierte Polycarbonatproben
Ultrahydrophobe Polycarbonatproben
80
Dispers
Polar
Plasmamodifikation:
20 min Argon (1000 W)
5 min Octafluorcyclobutan (170 W)
Energie in [mN/m]
70
60
50
1,98
40
30
20
43,30
0,27
10
10,76
0
Kontrolle
Ar+C4F8
Benetzbarkeit mit Wasser
10
Kultivierung für eine Primärbesiedelung
Fermenter für 10 Proben (76x26mm)
 Rührerdrehzahl 45 rpm
 Temperatur 32 C
 Sauerstoffsättigung 100%
 Kein Antischaummittel
E. coli JM 109 in PM-Medium
 Vorkultur:
16 h, 1 x 109 Bakterien/mL
Inoculum: 50 mL in 1500 mL
 Hauptkultur:
6 h, 3 x 108 Bakterien/mL
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Kultivierung für eine Primärbesiedelung
Standardkultivierung E.coli JM 109
100
80
60
40
20
0
0
1
pH
2
Sauerstoffsättigung [%]
3
Zeit [h]
4
Rührerdrehzahl [rpm]
5
6
Temperatur [°C]
stabile und reproduzierbare Kultivierung
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Modifizierte Polycarbonatproben
sterile Probennahme  spülen mit Wasser  digitale Lichtmikroskopie
a
b
E.coli JM109 nach 6 h Kultivierung a: Kontrolle; b: Ar und C4F8
Plasmamodifizierte Probe (b) zeigt geringeren Bewuchs
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Messung der Adhäsionskraft
Prinzip der Kraftmessung (Schubkraft)
Instrument
(Glasspitze,
<100 nm Spitzenradius)
Materialprobe
mit Bakterien
entspricht einer Scherkraftwirkung:
Hooke‘sches Gesetz
Kraftmessung
10 nN – 50 mN
Federkonstante:
12,5 N/m,125 N/m
F [N] = c [N/m] x s [m]
s [m]
F [N]
c [N/m]
Roboter im REM
Positioniergenauigkeit: 0,5 - 5 nm
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Haftkraft mit Mikromanipulator
1. Positionierung
2. Krafteinleitung
3. Ablösung
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Erste Ergebnisse zur Adhäsionskraft von E.coli
a
Probe
b
PC (Kontrolle) (a)
Fmax [µN]
102,32
92,41
94,54
90,23
104,65
108,51
138,87
84,86
77,99
71,63
Mittelwert
96,6 µN +/-17,9 µN
PC (Ar+C4F8) (b)
Fmax [µN]
15,26
12,24
11,07
20,85
22,98
14,00
23,53
22,11
10,59
11,06
16,4 +/-5,1 µN
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Ausblick / Fazit
Oberflächenreinigung mit Entfernung aller Rückstände ist vorteilhaft.
Die Primäre Adhäsion ist vom Mikroorganismus und der Oberfläche abhängig.
Ultrahydrophobe PC-Oberflächen erniedrigen die Adhäsionskraft von E.coli-Bakterien.
Die Messung der mikrobiellen Adhäsionskraft singulärer Mikroorganismen ist geeignet,
die geeignetste Oberfläche im Vergleich vorherzusagen.
Kraftmessprinzip entspricht einer Scherkraftwirkung.
Adhäsionskraft ist ein direkter Parameter.
Einzelfallbetrachtungen vom System Oberfläche / Mikroorganismus / Umgebung.
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Dank
Dipl.-Ing. Kerstin Bogendörfer
Dipl.-Ing.(FH) Philipp Häfner
Nadine Lörler
Simone Marxt
B.Sc. Nathalie Stefani
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