Charakterisierung von Bakterienpopulationen

Charakterisierung von
Bakterienpopulationen
auf Pflanzenwurzeln mit CLSM-Volumendaten
K. Rodenacker, B. A. Hense, M. Rothballer
IBÖ/ARB
Inhalt
Stichwörter
Material
Methoden
Beobachtungen
Zusammenfassung
© Rodenacker
Stichwörter
•
•
•
•
CLSM-Volumendaten
Pflanzenwurzeln
Bakterienpopulationen
Charakterisierung
© Rodenacker
Stichwörter
• CLSM-Volumendaten
o λ-Stacks
o Automatische Erfassung
Stackfolgen zeitlich/örtlich
o Auflösung
(pixel/voxel size):
x,y:
0,64 μm
z:
1,00 μm
© Rodenacker
Stichwörter
• Pflanzenwurzeln
o Komplexer Aufbau (variabel über
Zeit und Raum)
o Multifunktionelles Organ
o Strukturierte Oberfläche
o Interaktionen mit anderen
Organismen
o Autofluoreszenz
Bild aus: Ehlers/Noll: "Zellbiologie" (Serie Biologie), Westermann, Wien
© Rodenacker
Stichwörter
• Bakterienpopulationen
o pathogene, PGPR
(plant growth promoting)
o Epiphyt/Endophyt
(extra-/intrazellulär)
o Interaktionen:
Nährstoffe, pathogene
Substanzen, Antibiotika u.a.
o Kommunikation
© Rodenacker
10 µm
Stichwörter
• Charakterisierung
o
o
o
o
Größe, Intensität
Anzahl
Lage
Nachbarschaft
räumliche Beziehung
© Rodenacker
Material
•
Bakterium:
Azospirillum brasilense sp7
o
o
Epiphyt
GFP-Markierung
(induziert durch Wurzelexudate)
•
Pflanze: Weizen
o
o
© Rodenacker
Monoxenisch
Nährmedium
Biologische
Fragestellung
Aufklärung der molekularen
Kommunikation und
Interaktion von Bakterien auf
der Wurzel
Material
© Rodenacker
Methoden
• Qualitativ
o Visualisierung
• Quantitativ
o Segmentation
o Interaktion
o Vermessung
© Rodenacker
Methoden
• Qualitativ
o Visualisierung (Anaglyph)
© Rodenacker
Methoden
• Qualitativ
o Visualisierung (orthogonale Schnitte)
Original
© Rodenacker
Bearbeitetes Original
Methoden
• Qualitativ
o Visualisierung
(virtual reality)
Lokalisierung
von Bakterien
© Rodenacker
Methoden
• Quantitativ
o Segmentation
Wurzel
Fermeture
Radius 13*.64µm
Schwelle: 5
-> Wurzelvolumen
© Rodenacker
Methoden
• Quantitativ
o Segmentation
Bakterien in zwei
verschiedenen Kanälen
-> Bakterienvolumen
-> Anzahl Cluster ...
© Rodenacker
Bakterien
Methoden
• Quantitativ
o Vermessung
Bakterien:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Volumen
Projizierte Fläche
Fluoreszenzintensität
Lage
Ausdehnung in x, y und z
o Wurzeln:
ƒ Volumen
ƒ Fluoreszenzintensität
© Rodenacker
Methoden
• Quantitativ (Anzahl Bakterien)
o Bestimmung der maximalen projizierten
Fläche von isolierten Bakterien
o Berechnung des mittleren Volumen
-> Schätzung der Anzahl aus der Volumenverteilung
-> Schätzung der Anzahl von Bakterienclustern
© Rodenacker
Methoden
• Qualitativ
o Visualisierung
(Größen)
interaktive
Auswahl von
Bakterien nach
Größe
© Rodenacker
Methoden
• Bakterien
o Anzahlschätzung
für zusammenhängende
Objekte aus der
Volumenverteilung
Vorgabe mittleres Volumen
Fitfunktion
isoliert
doppelt
3-fach
Residual
© Rodenacker
Beobachtungen
• Wurzel
o Oberfläche
o Volumen
• Bakterien
o
o
o
o
© Rodenacker
Volumen
Projizierte Fläche
Intensität
Anzahl
Beobachtungen
• Wurzel Oberfläche/Volumen
Positionen
Volumen eines Stacks
tot. Volumen
tot. Fläche
Wurzel 1
Wurzel 2
10
10
40x512x512
60x512x512
42,95
64,42
1,07
1,07
geschätztes Wurzelvolumen
Vw
33,10
49,34
geschätzte Wurzeloberfläche
Aw
1,00
1,03
© Rodenacker
pixel
106 µm3
mm2
106 µm3
mm2
Beobachtungen
• Bakterien Volumen/Projizierte Fläche/Anzahlen
tot. Bakterienvolumen
proj. Bakterienfläche
Anzahl zhgd. Bakterien(cluster)
maximale proj. Bakterienfläche
maximale proj. Bakterienfläche
mittleres Bakterienvolumen
geschätzte Bakterienanzahl
aus Histogramm
geschätzte Bakterienanzahl isoliert
geschätzte Bakterienanzahl doppelt
geschätzte Bakterienanzahl 3-fach
geschätzte Bakterienanzahl 4-fach
geschätzte Bakterienanzahl 5-fach
Restvolumen
Restanzahl
© Rodenacker
VtB
nB
VB
VtB/VB
Wurzel 1
21788,26
6959,51
1749
11
4,51
6,14
3546
3598
1021
427
129
82
18
Wurzel 2
33284,92
9933,62
1710
15
6,14
12,70
2621
2555
1290
210
174
0
0
5640,49
918
4734,60
323
µm3
µm2
pixel
µm2
µm3
µm3
Beobachtungen
• Bakterien Intensität/Auftreten
Ausdehnung Z-Richtung (MODE)
Fluoreszenz (MEAN)
Bakterien/Wurzeloberfläche
© Rodenacker
Wurzel 1
Wurzel 2
4
5
µm
42,24
82,41
a.u.
3536,38
2536,19
1/mm2
Zusammenfassung
• Probleme
Durch das Erfassungssystem gegeben
o Schwund der Fluoreszenz
o Verlust durch nicht ideale Transparenz
o Schwer zu standardisierende Einstellbedingungen
Durch das Experiment gegeben
o Reproduzierbarkeit, Wurzelsphäre, Natur
• Stand
o Makrogesteuerte Erfassung von Stack-Folgen
o λ-Stacks für verbesserte Segmentation
© Rodenacker
Zusammenfassung
• Zukunft
o Zunehmende Anzahl von unterschiedlich markierten
Bakterien
• Info
o http://rhizosphere.gsf.de
• Dank an
o David Fanning
o Robert Schäfer
o Konrad Sandau
© Rodenacker