Posterpreis Saskia Bermbach

Transport of bacteria and cell-type specific induction
of signaling in the tracheal airway epithelium of mice
Saskia Bermbach1,2, Jan Rupp2,3, Peter König1
1Institut für Anatomie, Universität zu Lübeck, Germany
für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität zu Lübeck, Germany
3Medizinische Klinik III - Pneumologie/Infektiologie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Germany
2Institut
EINLEITUNG
METHODEN
Mit jedem Atemzug ist das
Epithel in der Trachea einer
Vielzahl von Bakterien ausgesetzt. Meist führt dies nicht
zu einer Entzündung. Warum
k
t es aber
b
d h gelel
kommt
doch
gentlich trotz der mukoziliären
Barriere zu einer Infektion?
Um die zellulären und molekularen Interaktionen zwischen Bakterien und Atemwegsepithel besser zu verstehen, wurden
murine Tracheen entnommen und nach Entfernung des Mukus für die Dauer des jeweiligen Versuchs in Zellkultur gehalten.
Mittels Hochgeschwindigkeitsmikroskopie wurde der Transport verschiedener Bakterien und Partikel unterschiedlicher
Größe (4,5 & 0,2 µm) sowie deren Interaktion mit intaktem Atemwegsepithel untersucht. Um die aus dieser Interaktion
resultierenden Folgen in den betroffenen Zellen identifizieren zu können, wurde Atemwegsepithel isoliert und darin die
V ä d
Veränderung
d mRNA-Expressionslevel
der
RNA E
i
l
l proinflammatorischer
i fl
t i h Cytokine
C t ki
mittels
itt l qRT-PCR
RT PCR gemessen. Der
D Einsatz
Ei
t von
Immunhistochemie in Verbindung mit Konfokalmikroskopie erlaubte die Ermittlung der nukleären Translokation des
Transkriptionsfaktors NFκB p65, um zu erkennen, welche Zellen durch den Bakterienkontakt aktiviert wurden.
ERGEBNISSE
Bakterien und Polystyrenpartikel werden auch ohne Mukus transportiert
0s
1s
0,25 s
Transportgeschwindigkeit
[µm/s]
a)
Bakterien und Polystyrenpartikel werden
auch durch eine Strömung transportiert
100
x
x
40 µm
40 µm
40 µm
a) Transport von Escherischia coli ( ) und 4,5 µm-Polystyrenpartikeln ( ) nach Entfernung der
Mukusschicht. Transport durch direkten Kontakt mit den Zilien und durch eine zilienvermittelte
Strömung (siehe c). Bildmittelpunkt (x). Nachweis in n = 5 Tieren
b) Vergleich der Transportgeschwindigkeiten von Bakterien, 4,5 µm- und 0,2 µm-Polystyrenpartikeln. Nachweis in n = 5 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001; o = p > 0,05. Angabe als Mittelwert ± Standardfehler.
c) Transportgeschwindigkeit: direkt ziliär und indirekt durch eine zilienvermittelte Strömung.
o
**
c)
**
80
60
60
40
40
20
20
0
0
**
0
50
100
150
200
250
300
350
400
x
100
b)
80
Abstand zum Epithel [µm]
4,5 µm Polystyrenpartikel
Bakterien
0,2 µm Polystyrenpartikel
4,5 µm Polystyrenpartikel
ohne ATP
mit ATP (100 µM)
Nachweis in n = 5 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001. Angabe als Mittelwert ± Standardfehler.
Haemophilus influenzae
LPS
**
Pam3Cys
**
**
**
*
o **
*
IL6-mRNA
o
**
o
MIP-2-mRNA
**
KC-mRNA
o o
o * o o
o
40
20
Nachweis in n = 6 - 10 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001; * = p < 0,05; o = p > 0,05. Angabe als
Mittelwert ± Standardfehler.
20 µm
AK gegen NFκB p65
Zellkernebene
20 µm
Hoechst-Kernfärbung
Zellkernebene
**
0
80
0 15 30 45 60
** **
**
b)
60
40
20
**
0
0 30 60 90 120
Stimulationsdauer [Minuten]
0 min
60 min
30 min
20 µm
20 µm
20 µm
20 µm
20 µm
20 µm
20 µm
20 µm
20 µm
Stimulation einer ex-vivo Trachea mit LPS für 0 - 60 min (a und c) bzw.
HIB für 0 - 120 min (b). Maximum nach 30 (LPS) bzw. 90 min (HIB).
Zellkerne ohne ( ) bzw. mit ( ) Translokation von NFκB p65.
Nachweis in n = 5 Tieren. Wilcoxon-Test: ** = p < 0,001. Angabe als Mittelwert ± Standardfehler.
Translokation von NFκB p65 in den Zellkern nach Haemophilus influenzae oder
LPS ausschließlich in nicht-zilientragenden
g
Zellen
Zellkernebene
c)
**
60
CXCL5-mRNA MCP-1-mRNA
Expression der mRNA proinflammatorischer Cytokine nach 2,5 h Stimulation mit
Staphylokokkus aureus, Haemophilus influenzae (HIB), LPS bzw. Pam3Cys.
Anschließend Epithelgewinnung, reverse Transkription und qRT-PCR.
** **
a)
Hoechst-Kernfärbun
ng
Staphylokokkus aureus
**
80
Hoechst & AK
Antikörper
κB p65 gegen NFκB p65
gegen NFκ
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
LPS und Haemophilus influenzae induzieren die
Translokation von NFκB p65 in den Zellkern
Kerne mit NFκB p65Translokation/Gesamtkernzahl [%]
[
Steigerung im Vergleich
zur Negativkontrolle [x]
Haemophilus influenzae, LPS und Pam3Cys induzieren die
Produktion proinflammatorischer Cytokin-mRNA im Epithel, nicht
aber Staphylokokkus aureus
MyD88-Inhibitor verhindert diese Translokation von
NFκB p65 nach LPS-Stimulation
20 µm
Hoechst &
AK gegen NFκB p65
20 µm
20 µm
Nachweis in n = 5 Tieren.
ZUSAMMENFASSUNG
● Zilientragende Zellen transportieren Bakterien ( ) und Polystyrenpartikel ( ) ohne Mukus:
Hoechst &
AK gegen NFκB p65
Hoechst
AK gegen NFκB p65
20 µm
Nachweis in n = 5 Tieren.
[µm]
z.B. 100
b)
a)
direkt ziliär (a) bzw. indirekt durch zilienvermittelte Strömung (b).
● Direkter Kontakt mit zilientragenden Zellen führt nicht zu einer Translokation von NFκB.
● Induktion der NFκB-abhängigen Signalkaskade erfolgt nur in nicht-zilientragenden Zellen.
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