HPV-PCR im Zeitalter der HPV
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AK ADEMIE für ärztliche Fortbildung AK ADEMIE Benötigte Probenmengen Nichtchlorierte und chlorierte Kohlenwasserstoffe (bei Sammel- oder Einzelanforderung) 2 Stechampullen mit je 2 ml Blut Aromat. Kohlenwasserstoffe (Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylole) (bei Sammel- oder Einzelanforderung) 2 Stechampullen mit je 2 ml Blut Aceton, Methanol im Blut 2 Stechampullen mit je 2 ml Blut Trasylol-EDTA-Blut Spurenelemente Vorgehensweise: Mit der Blutentnahme das vorpräparierte Trasylol-EDTA-Röhrchen vollständig füllen Das Röhrchen mehrmals schwenken und sofort nach der Entnahme zentrifugieren Den Überstand (EDTA-Plasma) in das neutrale Röhrchen überführen und einfrieren. Das Probenmaterial ist so mehrere Tage stabil. Die Gefrierbox muss vor Verwendung für das EDTA-Plasma mindestens 12 Abb. 4: Entnahmeset Stunden eingefroren sein. für Trasylol-EDTA-Blut Spezielle gereinigte Schwermetallanalytikgefäße (spezielle Heparinröhrchen) und -kanülen einsetzen (s. Abb. 3). Wenn das spezielle Entnahmebesteck im Einzelfall nicht verfügbar sein sollte, Nativ- oder Neutral-Röhrchen einsetzen, das heißt Blutentnahmeröhrchen ohne jeglichen Zusatz: weder Antikoagulans, noch Gel, noch Gerinnungs-Aktivator. Abb. 3: Spezialröhrchen für Spurenelement-Analytik Stuhlproben für immunologische Untersuchungen Bohnengroßes Stück (mindestens 1g) für jede immunologische Untersuchungen (z.B. Pankreas-Elastase) Der Stuhl sollte am gleichen Tag ins Labor kommen, da einzelne Analyte (z.B. alpha-1 Antitrypsin, Gliadin-Antikörper) bei längerer Transportdauer abfallen. ■ für ärztliche Fortbildung zur Bestimmung von Glukagon, Parathormon related Protein, VIP Set bestehend aus (Abb. 4): Vorpräpariertes EDTA-Röhrchen, mit Etikett: »enthält Trasylol für VIP-Bestimmung« Neutrales (Original-) EDTA-Röhrchen mit Etikett: »EDTAPlasma gefroren« Gefrierbox für den Transport in Ihr synlab-Labor AKADEMIE-INFO Ausgabe 01/2007 HPV-PCR im Zeitalter der HPV-Impfung Humane Papillomaviren (HPV) gehören zu den am häufigsten sexuell übertragbaren Infektionserregern. Die Erkenntnis, dass eine persistierende HPV-Infektion die essentielle Voraussetzung für die Entstehung nahezu aller hochgradigen zervikalen Präkanzerosen und primären Zervixkarzinome ist, haben wir dem deutschen Virologen HARALD ZUR HAUSEN und seiner Arbeitsgruppe am Deutschen Krebsforschungsinstitut in Heidelberg zu verdanken. Dabei besitzen nur bestimmte Papillomaviren - onkogene oder high-risk (hr)-Typen — die Eigenschaft, nach einer auf mindestens 7-8 Jahre geschätzten Latenzzeit, meist aber erst nach 20 Jahren, ein invasives Karzinom zu induzieren (vgl. Tab. 1). Die durch das Virus induzierte Zelltransformation zum Karzinom stellt in diesem Prozess ein seltenes Ereignis dar, dass nur deshalb als relativ häufig empfunden wird, weil die Durchseuchung der Bevölkerung mit HPV sehr hoch ist. Epidemiologische Daten lassen vermuten, dass im Laufe des Lebens nahezu jeder sexuell aktive Mensch einmal mit genitalen HPV Kontakt hat. Fragen zur Präanalytik beantwortet Ihnen gerne und jederzeit Ihr synlab-Laborteam. Fotos mit freundlicher Genehmigung von Ruth Förster 24.01.2007 Neue Therapien bei Rücken- und 31.01.2007 Gelenkserkrankungen aus der Phytotherapie Welche Diagnostik ist sinnvoll bei klinischem Verdacht auf Immundefekt? Hotel Eden Wolff, München 24.01.2007 Ara Hotel Comfort, Ingolstadt Sputumzytologie MVZ Nürnberg, Veranstaltungsraum Nähere Informationen beim Akademie-Sekretariat unter 09 11/ 97 14 - 435 oder unter www.synlab.de/veranstaltungen. Anmeldung: [email protected] Stand 12/2006 31.01.2007 Präanalytik VI: Handhabung von Spezial-Proben Veranstaltungen der synlab Akademie HPV-Typen 16 und 18 sind onkogen Dr. med. Ute Hasholzner · synlab München Telefon 089/551430 · E-Mail: [email protected] Veranstaltungen der synlab Akademie Grundlagen der Präanalytik HPV-PCR im Zeitalter der HPV-Impfung Kontakt Präanalytik VI: Handhabung von Spezial-Proben Hyatt Hotel, Köln Themen dieser Beilage Nach dem die grundsätzlich onkogene Potenz mancher HPV als gesichert angesehen werden konnte, war es für ZUR HAUSEN nahe liegend, über einen Impfstoff als Präventionsmaßnahme nachzudenken und dessen Entwicklung voranzutreiben. So standen für klinische Studien bereits Ende der 90er Jahre erste Prototyp-Impfstoffe gegen die Haupttypen HPV 16 und 18 zur Verfügung und erbrachten das eindeutige Ergebnis, dass die geimpften Frauen in Doppelblind-Studien eine Antikörperbildung zeigten, die vor einer Infektion mit HPV 16 und 18 schützte. In den Beobachtungszeiten konnte eine signifikante Reduzierung der Infektions- und Persistenzrate bei HPV 16 und 18 nachgewiesen werden, was letztlich nicht nur den Schutz vor einer Infektion mit diesem HPV-Typ, sondern damit auch einen Schutz vor HPV 16/18-assoziierten, zervikalen, epidermalen Neoplasien im Vergleich zur Placebogruppe bedeutete. Einziger Wermutstropfen der ersten Impfstudien: Die Immunantwort der Frauen fiel HPV-Typen-spezifisch aus, sodass zur vollständigen Prävention des Zervixkarzinoms wohl eine Impfung gegen alle onkogenen Typen notwendig sein dürfte. Die Kreuzreaktivität reicht jedenfalls nicht, um gegen Infektionen mit HPVTypen zu schützen, die nicht im Impfstoff enthalten sind. ➤ Noch ist unklar, welche Kassen für welche Frauen die HPV-Impfung zahlen. www.synlab.de akademie_info_0107_v2.indd 1-2 20.12.2006 14:18:28 AK ADEMIE für ärztliche Fortbildung Eine »Impfung gegen Krebs«? Bereits diese drei Überlegungen lassen erkennen, dass auch für die Zukunft auf eine sichere Diagnostik einer HPV-Infektion nebst der Durchführung einer qualifizierten Zytologie nicht verzichtet werden kann. Im Gegenteil, eine differenzierte Labordiagnostik macht die Prävention des Zervixkarzinoms sicherer und zuverlässiger. So könnte es mittels der Impfung und Labordiagnostik endlich gelingen, den Sockel verbliebener Neuerkrankungen an Zervixkarzinomen von ca. 4.000–5.000 per annum weiter entscheidend zu senken. Epidemiologische Überlegungen Seit Beginn 2007 wird jetzt erstmals auch in Deutschland eine zugelassene Vakzine gegen HPV 16 und 18 zur Verfügung stehen, deren Wirksamkeit in großen klinischen Studien - vor allem für die jungen Frauen von 16–23 Jahren - nachgewiesen werden konnte. In Kürze wird noch ein weiterer Impfstoff erhältlich sein. Dieser unzweifelhaft große Erfolg muss jedoch nüchtern betrachtet und eingeordnet werden und bedarf auch in der Zukunft einer kritischen Kontrolle, denn folgende Sachverhalte bleiben von der Einführung des Impfstoffes unberührt: 1. Selbst wenn eine allerdings nur theoretisch vorstellbare 100%ige Durchimpfung aller jungen Frauen erreicht werden könnte, blieben diese Frauen der Infektion mit anderen onkogenen high-risk-Papillomaviren ausgesetzt, da HPV 16 und 18 nur etwa 50–70% der intraepithelialen Neoplasien verursachen - abhängig von regionalen Unterschieden. 2. Die epidemiologischen Auswirkungen einer Massenimpfung auf die zukünftige Populationskinetik der übrigen bisher seltener auftretenden HPV sind nicht absehbar. Es ist zumindest denkbar, dass es zu Verschiebungen in der Häufigkeit des Auftretens verschiedener HPV-Typen kommt, wenn HPV 16 und 18 durch den Impfschutz nicht weiter verbreitet werden. 3. Der Impfschutz hat zurzeit nur präventive, jedoch keine heilende Wirkung. Das heißt, die einmal gesetzte HPV-Infektion mit intraepithelialen Veränderungen ist nicht durch die Impfung rückgängig zu machen. ■ HPV-PCR im Zeitalter der HPV-Impfung akademie_info_0107_v2.indd 3-4 Wir hielten es deshalb für einen fatalen Fehler, die Fortführung dieser Präventionsdiagnostik fallen zu lassen und somit in den gegen HPV 16 und 18 geschützten Frauen den Glauben zu induzieren, sie seien durch die Impfung generell vor einer Infektion mit pathogenen HPV-Typen geschützt. Es ist denkbar, dass diese Frauen eine weitere Prävention dann nicht mehr für notwendig hielten. Diese irrtümliche Ansicht könnte wieder zu einem Anstieg der Inzidenz der Zervixkarzinome führen. Tabelle 1: low-risk (lr)- und high-risk (hr)-HPV-Typen Assoziiert nur mit epithelialen benignen Tumoren (Warzen): lr-Typen: 6, 11, 35, 42, 43, 44, 74 Assoziiert mit vorwiegend intraepithelialen zervikalen Neoplasien: hr-Typen: 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 42, 44, 45, 51, 52, 56, 58, 65 Assoziiert mit Zervix-Karzinom: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 66, 68, 70 Wir sollten die Impfung deshalb ohne Einschränkungen unterstützen, sehr wohl aber unsere Sorgfaltspflicht bei der Überwachung dieser und aller anderen Patientinnen nicht außer Acht lassen. Diese Überwachung lässt sich am besten mit einem molekularbiologischen hochsensitiven HPV-Test durchführen, der mit einer hochwertigen Zytologie kombiniert wird. ■ Kontakt Prof. Dr. med. Holger Blenk · synlab Nürnberg Telefon 0911/9 71 44 35 E-Mail: [email protected] (Literatur beim Verfasser) Präanalytik VI: Handhabung von Spezial-Proben Liquor/Cerebrospinalflüssigkeit Sterile Röhrchen verwenden Punktionsstelle angeben: lumbal, ventrikulär? Trübungen, Blutbeimengungen vermerken Für PCR-Untersuchungen bitte immer gesondertes Röhrchen abnehmen Stets in Notfalltüte versenden Zellzahl/Zelldifferenzierung muss innerhalb 1 Stunde nach Abnahme erfolgen Für das »Reiber«-Schema und alle schrankenabhängigen Berechnungen zeitgleich Serum abnehmen Punktate Cytogenetik/Molekularcytogenetik Steriles Heparinblut (ohne Zentrifugierhilfen), bei entsprechender Fragestellung Fruchtwasser, Chorionzotten, Abortmaterial, Hautbiopsat. Mutterschaftsvorsorge Für Blutgruppen und Antikörpersuchtest: EDTA-Röhrchen Bei positivem Antikörpersuchtest zusätzlich mindestens ein volles 10 ml Serumröhrchen Für weitere Untersuchungen (z.B. HIV, Röteln, TPHA, HbsAg) zusätzlich ein Serum-Röhrchen. Organische Lösungsmittel Idealerweise erfolgt die Abnahme in 3 Portionen: 1. Steriles Röhrchen für bakteriologischen Nachweis und Direktnachweis (z. B. Virus-PCR), evtl. zusätzlich Beimpfen einer Blutkultur 2. EDTA-Röhrchen für die Bestimmung von Zellzahl/Zelldifferenzierung, Kristalle 3. Röhrchen ohne Zusätze für klinisch/chemische und immunologische Untersuchungen Broncheoalveoläre Lavage = BAL Die immunologischen Untersuchungen (z.B. T-Helfer-, TSuppressorzellen) sowie Zellzahl und -differenzierung sind zeitkritisch und müssen direkt nach Gewinnung ins Labor weitergeleitet werden (Notfall-Tüte verwenden) Einsendung der zurückgewonnenen Menge unter Angabe der installierten Menge Bei längerer Transportzeit CPDA-Röhrchen verwenden Steriles zusätzliches Röhrchen für Bakteriologie/PCR-Untersuchungen Benötigte Materialien Graduierte Einmalspritze z.B. 5 ml-Spritze von Braun 20 ml Stechampulle mit teflonbeschichtetem Verschluss und EDTA-Kristallen als Antikoagulans (siehe Abb. 1 und 2) Bitte beachten: Es werden pro Untersuchung zwei Stechampullen benötigt, damit auch Kontrolluntersuchungen möglich sind (s.u. »benötigte Probemengen«). Hautdesinfektion z. B. mit 3%iger Wasserstoffperoxidlösung. Keine üblichen Hautdesinfektionsmittel benutzen. Sie verursachen falsch erhöhte Blutkonzentrationen von Ethanol, Isopropanol und Propanol. 4 ml Venenblut mit graduierter Spritze entnehmen. Deckel der ersten Stechampulle durchstechen. Genau 2 ml Blut mit graduierter Spritze einfüllen (exaktes Volumen sehr wichtig). Die restlichen 2 ml Blut in zweite Stechampulle füllen. Zur besseren Auflösung und Durchmischung des Antikoagulans mehrfach Umschwenken. Molekularbiologische Untersuchungen (Stichwort: PCR , Viruslast) Verwenden Sie bitte separate, nur für diesen Zweck vorbehaltene EDTA-Blutentnahmegefäße (Vermeidung von Verwechslungen / Kontaminationen), alternativ auch separate Vollblutröhrchen (für Hepatitis B/C). Molekulargenetische Untersuchungen Material ist i. d. R. 5–10 ml EDTA-Blut, seltener auch Heparin oder Citratblut, bei entsprechender Fragestellung auch Fruchtwasser, Chorionzotten, Abortmaterial, Hautbiopsat. Abb. 1+2: Headspace-Gefäße und Befüllung Präanalytik VI: Handhabung von Spezial-Proben ■ 20.12.2006 14:19:11
