B. fragilis
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Infektionen des Bauchraumes Leitkeimgruppen: Bacteroides Dr.med. Lutz T. Zabel Institut für Laboratoriumsmedizin Klinik am Eichert 73035 Göppingen Dr. L. Zabel 1 Kasuistik rezidivierendes Rectum-Carzinom ED 10/2004 11/04 Rectum-Resektion 9/05 Rektum-Ca-Rezidiv jetzt Radiatio Dr. L. Zabel 2 Kasuistik Wundabstrich Analwunde keine Angaben zur Klinik anaerob Wachstum auf KV und Schädler Dr. L. Zabel 3 Kasuistik Wundabstrich Analwunde keine Angaben zur Klinik anaerob Wachstum auf KV und Schädler Subkultur: Galle resistent, Indol negativ, Katalase negativ, Eskulin negativ Dr. L. Zabel 4 Kasuistik Wundabstrich Analwunde keine Angaben zur Klinik anaerob Wachstum auf KV und Schädler Subkultur: Galle resistent, Indol negativ, Eskulin negativ, Katalase negativ Identifizierung: B. vulgatus Dr. L. Zabel 5 Kasuistik Wundabstrich Analwunde keine Angaben zur Klinik anaerob Wachstum auf KV und Schädler Subkultur: Galle resistent, Indol negativ, Eskulin negativ, Katalase negativ Identifizierung: B. vulgatus Signifikanz des Befundes? Dr. L. Zabel 6 Kasuistik Ist B. vulgatus in der Analwunde ein Infektionserreger? ja, immer nein, ein Kontaminant weiß nicht Dr. L. Zabel 7 Infektionen des Bauchraumes Appendizitis Peritonitis Bacteroides fragilis Bilophila wadsworthia Bacteroides thetaiotaomicron Peptostreptococcus anaerobius Cholezystitis/Cholangitis Bacteroides fragilis Bilophila wadsworthia Bacteroides thetaiotaomicron Anaerobe grampositive Kokken Leberabszeß Clostridium perfringens Bacteroides fragilis Sepsis Bacteroides fragilis Dr. L. Zabel Peptostreptococcus micros Fusobacterium necrophorum Fusobacterium nucleatum Bacteroides fragilis Bilophila wadsworthia 8 Zusammensetzung der Darmflora Spezies (Prozentualer Anteil an züchtbarer Flora) Bacteroides vulgatus (12%) Eubacterium aerofaciens (10%) Bacteroides thetaiotaomicron (9%) Peptostreptococcus productus II (7%) Bacteroides distasonis (6%) Fusobacterium (Faecalibacterium) prausnitzii (4%) unter 1% Bacteroides fragilis Bilophila wadsworthia Clostridium perfringens Escherichia coli und andere Aerobier Aus Werner, Heizmann und Döller: Medizinische Mikrobiologie, UTB-Schattauer (1991) Dr. L. Zabel 9 Pathogenese von Anaerobierinfektionen t [Tage, Wochen] Endogene Anaerobier Endogene Aerobier Eliminierte,(avirulente) Spezies Vermehrungsfähige (virulente) Spezies Dr. L. Zabel 10 Anaerobierinfektionen Praedisposition Mischinfektionen Chronische Infektionen Warum sind einige Anaerobier krankheitsrelevanter als andere? Dr. L. Zabel 11 Expression Normal intestinal flora Inflammation *3 Inflammation *3 Il 1ß (HBD2) [1] TLR-2 and TLR-6 (HBD2) [6] NF-kB-Activation (HBD2) [7] IFN-y (HBD3) [8] [12] [2, 4]*2 Colon Terminal iIeum HBD-1, constitutive [1,2,3]*1 HBD-2, inducible by infection [2,4 ]*2 HBD-3, inducible by infection [12] HD-5 Paneth cell Dr. L. Zabel Lysozyme, phopholipase A2, α1-antitrypsin E. coli Bacteroides vulgatus Bacteroides fragilis other Bacteroides spp. 12 Unterschiedliches Verhalten gegenüber Defensinen Dr. L. Zabel 13 Unterschiedliches Verhalten gegenüber Defensinen Bacteroides-Arten sind resistent gegenüber gebildeten Defensinen HD5 100 Depolarisierte Bakterien (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 HD-5 (µg/m l) E. coli S. aureus P. vulgaris B. vulgatus 484 B. fragilis G B. fragilis 402238 Dr. L. Zabel B. vulgatus ATCC 14 Unterschiedliches Verhalten gegenüber Defensinen Bacteroides-Arten sind relativ sensibel gegenüber Defensinen, die bei Entzündungen hoch reguliert werden 100 Depolarisierte Bakterien [%] 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2.5 B. vulgatus ATCC 5 7.5 10 HBD-3 [µg/ml] B. fragilis 158 Dr. L. Zabel 12.5 15 B. tjo 412217.4 15 Unterschiedliches Verhalten gegenüber Defensinen Blutkulturisolate sind resistenter als Isolate aus Flora 100 Depolarized bacteria [%] 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 HBD-3 [µg/ml] B. fragilis CIP105891 B. fragilis 968 B. fragilis 158 B. fragilis 480121 B. fragilis 430265 B. fragilis 484143G B. fragilis 484076 B. fragilis 15 B. fragilis Ha4 HBD-3 susceptibility of B. fragilis isolates. Depolarized bateria of clinical B. fragilis isolates from feces and an amputation stump (Open symbols) and isolates from blood culture, liver abscess (968) and the enterotoxinogenic strain B. fragilis CIP 105891 (Filled symbols). Dr. L. Zabel 16 Genus Bacteroides HN Shah and MD Collins: Int J Syst Bact 1989 Gramnegative, obligat anaerobe Stäbchen saccharolytisch, schwach proteolytisch Wachstum in 20% Galle Bildung von Essig-, Propion-, iso-Butter-, iso-Valerian- und Bernsteinsäure GC-Gehalt 39-52% Zellwand enthält Sphingolipide, KDO- und Heptosefreies LPS Menachinone mit 9-13 Isopreneinheiten KDO: 2-Keto-3-desoxy-octonat Dr. L. Zabel 17 Bacteroides species (1998) B. fragilis (Typspezies) B. caccae B. distasonis B. eggerthii B. merdae Dr. L. Zabel B. ovatus B. stercoris B. thetaiotaomicron B. uniformis B. vulgatus 18 Bacteroides Parabacteroides Heute mind. 24 humane Spezies Neue Gattung Parabacteroides Die wenigsten in IDSystemen Dr. L. Zabel 19 Bacteroides-Arten in Datenbanken von IDSystemen (Auszug) ID 32 A API 20 A Vitek ANC Cryst AN Rapid ANA II Biotyper B. cellulosilyticus Saramis Vitek MS + B. clarus B. eggerthii + + + + + + B. intestinalis + + B. nordii + + + + + + + B. faecis B. fluxus B. oleiciplenus B. ovatus + + + + + B.salyersae + B. stercoris + + + + + + + + B. thetaiotaomicron + + + + + + + + B. uniformis + + + + + + + + B. xylanisolvens + Dr. L. Zabel 20 Andere Bacteroides-Arten früher heute B. putredinis Alistipes putredinis B. ureolyticus Campylobacter ureolyticus B. gracilis Campylobacter gracilis B. splanchnicus Odoribacter splanchnicus B. capillosus Pseudoflavonifractor capillosus Dr. L. Zabel 21 Hinweise auf „neue“ Bacteroides Arten Number of stool samples from which a given Bacteroidales species was identified on the two highest-dilution plates from a total of 59 stool samples. Zitomersky N L et al. Infect. Immun. 2011;79:2012-2020 Dr. L. Zabel 22 Bacteroides-Arten bei dicken und schlanken Kindern In der Mikrobiota dicker Kinder B. vulgatus in Relation zu anderen Spezies weniger häufig nachgewiesen Bevoets et al.2013. Differences in gut microbiota composition between obese and lean children: a cross-sectional study. Gut Pathog. 5; 10. Dr. L. Zabel 23 Bacteroides-Arten in Blutkulturen Häufigkeit und korrekte ID Anaerobe Bakterien (N=123) aus positiven Blutkulturen von einem Jahr N Isolate Konv. ID spezies Konv. ID Genus Deskriptiv Missidentifiziert B. dorei 7 0 0 0 7 B. fragilis 26 26 0 0 0 B. nordii 1 0 1 0 0 B. ovatus 2 0 2 0 0 B. thetaiotaomicron 6 5 1 0 0 B. vulgatus 4 4 0 0 0 B. xylanisolvens 1 0 0 0 1 B. species 1 0 1 0 0 U. S. Justesen,* M. N. Skov, E. Knudsen, H. M. Holt, P. Søgaard, and T. Justesen. 16S rRNA Gene Sequencing in Routine Identification of Anaerobic Bacteria Isolated from Blood Cultures. J. Clin. Microbiol. 2010, 48(3):946. Dr. L. Zabel 24 Identifizierung zur Gattung durch Testplättchen Galle Kanamycin 1000µg Vancomycin 5µg Colistin 10µg Bacteroides-fragilisGruppe R R R R B. ureolyticus V S R S Fusobacterium V S S RS R SR S R S V R V V R S S V R R SR S R S Gattung Porphyromonas Prevotella Clostridien Grampositive Kokken Gramnegative Kokken Dr. L. Zabel 25 Bacteroides: Gattungsdiagnose Galle Kanamycin Aeskulin Colistin KNO3 Bacteroides R R Positiv* R Negativ Bilophila R S Negativ S Positiv * Außer B. vulgatus Dr. L. Zabel 26 Bacteroides: Leitkeime Aeskulin Indol Leitkeim B. fragilis Positiv Negativ Infektion B.thetaiotaomicron Positiv Positiv Infektion B.vulgatus Negativ Negativ Darmflora Dr. L. Zabel 27 Abgrenzung der Gattung Parabacteroides von Bacteroides Was A-Fuc positiv ist, kann kein Parabacteroides spp. sein – Der Umkehrschluss gilt aber nicht! ESC A-FUC B-GLUC BGLUC URO GlyA B. finegoldii + - + - - P. merdae + - - + + P. distasonis + - + - + P. goldsteinii + - + + + P. johnsonii + - - + + P. gordonii - - - - - Dr. L. Zabel 28 MALDI-TOF Viele Studien schon durchgeführt Es ist wichtig, mit welchem Gerät, mit welcher Datenbank die Studie durchgeführt wurde ... und ob die Datenbank ergänzt wurde.. ... und welches die Referenzmethode für die Identifizierung war ... und welche Stämme für die Untersuchung ausgewählt wurden Die Identifizierung zur Spezies gelang bei 70,8% der Isolate (Schmitt et al. 2012 vergleich 16S rRNA-Sequenzierung bis 100% (Jamal et al. 2013) Vergleich mit API 20 AN und 16S rRNASequenzierung De facto müssen die Datenbasen ergänzt werden und es gibt noch taxonomische Schwierigkeiten Schmitt et al., 2012. Identification of anaerobic bacteria by bruker biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry with onplate formic acid preparation. J. Clin. Microbiol. 51; 782-786. Jamal et al., 2013. Comparison of two matrix-assisted laser desorption/ionization-time Dr. L. Zabel of flight (MALDI-TOF) mas spectrometry methods and API 20AN for 29 identification of clinically relevant anaerobic bateria. J. Med. Microbiol. 62; 540-544. Differentialdiagnose neuer Bacteroides spezies Marschal M, Autenrieth IB, Schumacher UK (2011). Improvement of Identification of Anaerobes by MALDI-TOF-MS Analysis. ESCMID 2011: P 1830. Dr. L. Zabel 30 Differentialdiagnose B. dorei – B. vulgatus Dr. L. Zabel 31 Identifizierung bis zur Spezies I Indol negativ Dr. L. Zabel 32 Differentialdiagnose neuer Bacteroides spezies Marschal M, Autenrieth IB, Schumacher UK (2011). Improvement of Identification of Anaerobes by MALDI-TOF-MS Analysis. ESCMID 2011: P 1830. Dr. L. Zabel 33 Identifizierung bis zur Spezies II Indol positiv Dr. L. Zabel 34 Enterotoxin bildende B.fragilis Enteritiserreger bei Nutztieren Enteritiserreger bei Menschen Inzidenz zwischen 9% und 25% Metalloprotease Blutkultur-Isolate zeigen häufig Toxinproduktion Dr. L. Zabel 35 B. fragilis enterotoxin • • • • • • • Drei Allele btf1-3 präproprotein Holotoxin Signalpeptid zur Translokalisation durch Bacteroides-Membran Proprotein für Proteinfaltung und Sekretion BFT-1 und BFT-2 sind Trypsin resistent über einen großen pH Bereich stabil (pHs 5 -10), damit ergibt sich keine Degradation im Darm Dr. L. Zabel Sears CL. Enterotoxigenic Bacteroides fragilis: a Rogue among Symbiotes. CMR 2009; 22:349-369 36 Colitis-Pathogenese bei ETBF ein Modell Kolonisierung und Adhärenz BFT-Bildung CEC-Signaltransduktion Spaltung von E-Cadherin Aufhebung der Barrierefunktion Exposition gegenüber mukosalem Immunsystem Entzündungsreaktion Dr. L. Zabel Sears CL. Enterotoxigenic Bacteroides fragilis: a Rogue among Symbiotes. CMR 2009; 22:349-369 37 Enterotoxin bildende B.fragilis Enteritiserreger bei Nutztieren Enteritiserreger bei Menschen Inzidenz zwischen 9% und 25% Metalloprotease Blutkultur-Isolate zeigen häufig Toxinproduktion Nachweis über Zellkultur-Assays (HT29) Nachweis über PCR Dr. L. Zabel 38
