Mikroskop

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Titelheadlines sollten nicht zu lang sein,
auf keinen Fall länger als diese zwei Zeilen
Das Auflösungsvermögen optischer
Mikroskope - wo liegt die Grenze?
Stephan Winnerl
Abteilung Halbleiterspektroskopie
Institut für Ionenstrahlphysik und
Materialforschung
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01/2007
Gliederung
• Einführung in die optische Mikroskopie
• Abbe´sches Prinzip und Rayleigh Kriterium
• Spezielle Mikroskoptypen
- Konfokalmikroskop
- Fluoreszenzmikroskop
- STED-Mikroskop (Stimulated Emission Depletion)
• Nahfeldmikroskopie
- Prinzip, Bauformen
- Kombination IR-Nahfeldmikroskop und FreieElektronen-Laser
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01/2007
Einführung
Bahnbrechnde Entdeckungen mit Hilfe opt. Mikroskope:
z.B. Entdeckung der Zellen
Robert Hooke, Micrographia, 1665
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01/2007
Einführung
Brown´sche Bewegung: 1827 von Robert Brown wiederentdeckt;
Thermisch getriebene Eigenbewegung von Teilchen.
(Bereits 1785 entdeckte Jan Ingenhousz die Bewegung von Holzkohlestaub auf
Alkohol.)
Grafik: Thomas Steiner
Einstein 1905: Erklärung der Brown´schen Bewegung mittels stistischer
Mechanik. Molekularer Aufbau der Materie gezeigt.
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01/2007
Grundaufbau eines optischen Mikroskops
Objekt
Okular
Objektiv
f1: Objektivbrennweite
f2: Okularbrennweite
t: Tubuslänge
s0 = 250 mm
f1
f1
t
Vergrößerung:
t·s0
ΓM =
f1·f2
f2
Was bestimmt die Auflösung?
Wo liegt die Grenze?
Wellennatur des Lichts
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01/2007
Abbe´sche Theorie
Objekt
Okular
Objektiv
f1
f1
t
f2
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01/2007
Abbe´sche Theorie (Jena, 1873)
Beugungsbild
Objekt
f1
f1
Reales Zwischenbild
t
Wir betrachten das Objekt als Beugungsgitter, das mit
parallelem Licht bestrahlt wird.
Um das Bild rekostruieren zu können, muss neben der
nullten mindestens die erste Beugungsordnung
übertragen werden.
Ernst Abbe
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01/2007
Beugung an kleiner Offnung mit Durchmesser d
Medium mit Brechungsindex n
α
d
∆l
1. Beugungsminimum:
destruktive Interferenz von Zentrahlstrahl
und Randstrahl, d.h.
n·∆l = λ/2
λ
n·d/2·sinα = λ/2
d=
n sinα
n sinα: numerische Apertur
(Wert z.B. 0.95 für gute Objektive, damit d ≈ 0.5 µm)
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01/2007
Beugung genauer
Berechnung der Intensitätsverteilung
I (wikllk. Einh.)
0.3
0.2
0.1
0.0
-2
⎛ J1( r ) ⎞
I( r ) = ⎜
⎟
⎝ r ⎠
2
-1
0
r/2π
1
2
J1: Besselfunktion 1. Ord.
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01/2007
Rayleigh Kriterium für die Auflösung
0.61 λ
d0 =
n sinα
Hohes Auflösung:
-λ
- n Immersionsobjektiv
I (willk. Einheiten)
Zwei Punkte mit Abstand d werden getrennt, wenn das Maximum des einen
in das erste Minimum des anderen fällt: d = d0
d = 0.8 d0
d = 1.0 d0
d = 1.2 d0
1.0
0.5
0.0
-1
0
r/2π
1
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01/2007
Variation der Wellenlänge
Gitter unterschiedlicher Linienstärke (in µm)
unter rotem und blauem Licht
Bilder: Oliver Kurmis, Uni Jena
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01/2007
Immersionsmikroskopie
Eine numerische Apertur größer 1 ist mit Hilfe von
Immersionsöl (n ≈ 1.5) möglich:
Objektivlinse
Immersionsöl
Deckglas
Objektträger
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01/2007
Konfokalmikroskop
Ziel: Bild nur aus Fokusebene
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01/2007
Fluoreszenzmikroskop
Energieschema Fluoreszenz
Anregung
z.B. UV
Emission
z.B. VIS
Endothelzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Die Mikrotubuli sind grün, Aktinfilamente rot und
die DNA blau markiert.
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01/2007
Fluoreszenzmikroskop
Fluoreszenz mit
Zwei-Photon-Anregung
Anregung
Emission
z.B. VIS
Lichtquelle: FemtosekundenLaser
Endothelzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Die Mikrotubuli sind grün, Aktinfilamente rot und
die DNA blau markiert.
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01/2007
STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskop
STED-Mikroskop: ein hochauflösendes Fluoreszenzmikroskop
Anregung
(Beuegungsbegrenzter Fleck)
Emission
z.B. VIS
Abregung
(Doughnut-Mode)
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01/2007
STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskop
STED-Mikroskop: ein hochauflösendes Fluoreszenzmikroskop
Emission
z.B. VIS
Abregung
(Doughnut-Mode)
Fluoreszenz
Auflösung: 20 nm demonstriert, 10 mal kleiner als Abbe-Limit
Aufnahmen von Molekülen möglich
Zukunftspreis 2006 für Prof. Dr. Stefan W. Hell vom MPI für Biophysikalische Chemie, Göttingen
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Optische Nahfeldmikroskopie
SNOM: scanning near field optical microscope
Typisch: eine metallbeschichtete Faser mit kleiner Öffnung
rastert die Probe ab.
Prinzip: Evaneszente Welle dringt durch kleine Öffnung
Analogie: Tunneleffekt
Typische Größen: Abstand Spitze-Probe ~ 10 nm
Aperturdurchmesser ~ 100 nm, Transmission ~ 0,001
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01/2007
Besispiel: Aperture-SNOM,
λ = 1064 nm, Probe: 20 nm Au auf Si
Bilder: Dr. Hans U. Danzebrink, PTB Braunschweig
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01/2007
Es geht auch ohne Apertur: s-SNOM (scattering SNOM)
Cantilever
La
s
er
r
Detekto
φ = 3 ... 100 nm
Probe
Prinzip:
Die in der Rasterkraftmikroskop-Spitze induzierte
Schwingung polarisiert die Probe;
Intensität des rückgestreuten Lichts hängt von
optischen Konstanten der Probe ab
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01/2007
s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD
FELBE = FEL @ ELBE (Freie-Elektronen-Laser am FZD)
Wellenlängenbereich: 4 – 150 µm; Leistung: einige W
E
A,Ω
Det.
70°
h
k
BaTiO3 Probe (ε^s)
Strahlteiler
FEL
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01/2007
s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD
c
a
BaTiO3
λ ≈ 16.5 µm
Nahe der
Resonanz der
Gitterschwingung
15.9µm
Scan range: (7µm)2
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01/2007
s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD
c
a
BaTiO3
16.6µm
15.9µm
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01/2007
s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD
c
a
BaTiO3
16.8µm
15.9µm
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01/2007
s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD
c
a
BaTiO3
17.4µm
15.9µm
Auflösung: ~250 nm < 0.015 λ
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01/2007
Zusammenfassung
• Verständnis für Rolle der Beugung für
Auflösungsvermögen (Abbe´sches Prinzip und
Rayleigh Kriterium); Wert ca. 200 nm
• Abbildungen jenseits dieser Grenze mit Hilfe
eines speziellen Flureszenzmikroskops:
STED-Mikroskop
• Nahfeldmikroskopie kann Strukturen deutlich
kleiner als die Wellenlänge auflösen
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01/2007
Danksagung
D. Stehr, A. Dreyhaupt, U. Lucchesi, H. Schneider, M. Helm,
P. Michel und ELBE-Team
FZD
S. Schneider, M. Cebula, J. Renger, J. Seidel, S. Grafström, L.M. Eng
TU-Dresden, www.iapp.de
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01/2007
Anhang Versuchsvorschlag: ein Blick auf eine CD
Betrachten Sie eine CD und DVD
mit einem guten Mikroskop.
Beleuchten Sie beide mit einem
Laser und beobachten Sie die
Interferenzfigur in Reflexion,
bestimmen Sie daraus den
Spurabstand!
(1,6 µm für CD, 0,74 µm für DVD)
Bild: Uta Lucchesi, Stephan Winnerl, FZD
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01/2007
Anhang: Blick in ein Achromat-Objektiv
Bilder: Gert Wrigge & Ilja Gerhardt
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01/2007
Anhang: Beispiel für ein kommerzielles ApertureSNOM
Kooperation von JPK Instruments AG, Berlin und
Fraunhofer Gesellschaft e.V.
Institut für Physikalische Messtechnik (IPM),
Freiburg
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