Mikroskop
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Titelheadlines sollten nicht zu lang sein, auf keinen Fall länger als diese zwei Zeilen Das Auflösungsvermögen optischer Mikroskope - wo liegt die Grenze? Stephan Winnerl Abteilung Halbleiterspektroskopie Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 1 01/2007 Gliederung • Einführung in die optische Mikroskopie • Abbe´sches Prinzip und Rayleigh Kriterium • Spezielle Mikroskoptypen - Konfokalmikroskop - Fluoreszenzmikroskop - STED-Mikroskop (Stimulated Emission Depletion) • Nahfeldmikroskopie - Prinzip, Bauformen - Kombination IR-Nahfeldmikroskop und FreieElektronen-Laser Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 2 01/2007 Einführung Bahnbrechnde Entdeckungen mit Hilfe opt. Mikroskope: z.B. Entdeckung der Zellen Robert Hooke, Micrographia, 1665 Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 3 01/2007 Einführung Brown´sche Bewegung: 1827 von Robert Brown wiederentdeckt; Thermisch getriebene Eigenbewegung von Teilchen. (Bereits 1785 entdeckte Jan Ingenhousz die Bewegung von Holzkohlestaub auf Alkohol.) Grafik: Thomas Steiner Einstein 1905: Erklärung der Brown´schen Bewegung mittels stistischer Mechanik. Molekularer Aufbau der Materie gezeigt. Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 4 01/2007 Grundaufbau eines optischen Mikroskops Objekt Okular Objektiv f1: Objektivbrennweite f2: Okularbrennweite t: Tubuslänge s0 = 250 mm f1 f1 t Vergrößerung: t·s0 ΓM = f1·f2 f2 Was bestimmt die Auflösung? Wo liegt die Grenze? Wellennatur des Lichts Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 5 01/2007 Abbe´sche Theorie Objekt Okular Objektiv f1 f1 t f2 Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 6 01/2007 Abbe´sche Theorie (Jena, 1873) Beugungsbild Objekt f1 f1 Reales Zwischenbild t Wir betrachten das Objekt als Beugungsgitter, das mit parallelem Licht bestrahlt wird. Um das Bild rekostruieren zu können, muss neben der nullten mindestens die erste Beugungsordnung übertragen werden. Ernst Abbe Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 7 01/2007 Beugung an kleiner Offnung mit Durchmesser d Medium mit Brechungsindex n α d ∆l 1. Beugungsminimum: destruktive Interferenz von Zentrahlstrahl und Randstrahl, d.h. n·∆l = λ/2 λ n·d/2·sinα = λ/2 d= n sinα n sinα: numerische Apertur (Wert z.B. 0.95 für gute Objektive, damit d ≈ 0.5 µm) Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 8 01/2007 Beugung genauer Berechnung der Intensitätsverteilung I (wikllk. Einh.) 0.3 0.2 0.1 0.0 -2 ⎛ J1( r ) ⎞ I( r ) = ⎜ ⎟ ⎝ r ⎠ 2 -1 0 r/2π 1 2 J1: Besselfunktion 1. Ord. Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 9 01/2007 Rayleigh Kriterium für die Auflösung 0.61 λ d0 = n sinα Hohes Auflösung: -λ - n Immersionsobjektiv I (willk. Einheiten) Zwei Punkte mit Abstand d werden getrennt, wenn das Maximum des einen in das erste Minimum des anderen fällt: d = d0 d = 0.8 d0 d = 1.0 d0 d = 1.2 d0 1.0 0.5 0.0 -1 0 r/2π 1 Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 10 01/2007 Variation der Wellenlänge Gitter unterschiedlicher Linienstärke (in µm) unter rotem und blauem Licht Bilder: Oliver Kurmis, Uni Jena Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 11 01/2007 Immersionsmikroskopie Eine numerische Apertur größer 1 ist mit Hilfe von Immersionsöl (n ≈ 1.5) möglich: Objektivlinse Immersionsöl Deckglas Objektträger Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 12 01/2007 Konfokalmikroskop Ziel: Bild nur aus Fokusebene Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 13 01/2007 Fluoreszenzmikroskop Energieschema Fluoreszenz Anregung z.B. UV Emission z.B. VIS Endothelzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Die Mikrotubuli sind grün, Aktinfilamente rot und die DNA blau markiert. Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 14 01/2007 Fluoreszenzmikroskop Fluoreszenz mit Zwei-Photon-Anregung Anregung Emission z.B. VIS Lichtquelle: FemtosekundenLaser Endothelzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Die Mikrotubuli sind grün, Aktinfilamente rot und die DNA blau markiert. Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 15 01/2007 STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskop STED-Mikroskop: ein hochauflösendes Fluoreszenzmikroskop Anregung (Beuegungsbegrenzter Fleck) Emission z.B. VIS Abregung (Doughnut-Mode) Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 16 01/2007 STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskop STED-Mikroskop: ein hochauflösendes Fluoreszenzmikroskop Emission z.B. VIS Abregung (Doughnut-Mode) Fluoreszenz Auflösung: 20 nm demonstriert, 10 mal kleiner als Abbe-Limit Aufnahmen von Molekülen möglich Zukunftspreis 2006 für Prof. Dr. Stefan W. Hell vom MPI für Biophysikalische Chemie, Göttingen Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 17 01/2007 Optische Nahfeldmikroskopie SNOM: scanning near field optical microscope Typisch: eine metallbeschichtete Faser mit kleiner Öffnung rastert die Probe ab. Prinzip: Evaneszente Welle dringt durch kleine Öffnung Analogie: Tunneleffekt Typische Größen: Abstand Spitze-Probe ~ 10 nm Aperturdurchmesser ~ 100 nm, Transmission ~ 0,001 Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 18 01/2007 Besispiel: Aperture-SNOM, λ = 1064 nm, Probe: 20 nm Au auf Si Bilder: Dr. Hans U. Danzebrink, PTB Braunschweig Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 19 01/2007 Es geht auch ohne Apertur: s-SNOM (scattering SNOM) Cantilever La s er r Detekto φ = 3 ... 100 nm Probe Prinzip: Die in der Rasterkraftmikroskop-Spitze induzierte Schwingung polarisiert die Probe; Intensität des rückgestreuten Lichts hängt von optischen Konstanten der Probe ab Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 20 01/2007 s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD FELBE = FEL @ ELBE (Freie-Elektronen-Laser am FZD) Wellenlängenbereich: 4 – 150 µm; Leistung: einige W E A,Ω Det. 70° h k BaTiO3 Probe (ε^s) Strahlteiler FEL Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 21 01/2007 s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD c a BaTiO3 λ ≈ 16.5 µm Nahe der Resonanz der Gitterschwingung 15.9µm Scan range: (7µm)2 Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 22 01/2007 s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD c a BaTiO3 16.6µm 15.9µm Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 23 01/2007 s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD c a BaTiO3 16.8µm 15.9µm Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 24 01/2007 s-SNOM am Freie-Elektronen-Laser des FZD c a BaTiO3 17.4µm 15.9µm Auflösung: ~250 nm < 0.015 λ Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 25 01/2007 Zusammenfassung • Verständnis für Rolle der Beugung für Auflösungsvermögen (Abbe´sches Prinzip und Rayleigh Kriterium); Wert ca. 200 nm • Abbildungen jenseits dieser Grenze mit Hilfe eines speziellen Flureszenzmikroskops: STED-Mikroskop • Nahfeldmikroskopie kann Strukturen deutlich kleiner als die Wellenlänge auflösen Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 26 01/2007 Danksagung D. Stehr, A. Dreyhaupt, U. Lucchesi, H. Schneider, M. Helm, P. Michel und ELBE-Team FZD S. Schneider, M. Cebula, J. Renger, J. Seidel, S. Grafström, L.M. Eng TU-Dresden, www.iapp.de Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 27 01/2007 Anhang Versuchsvorschlag: ein Blick auf eine CD Betrachten Sie eine CD und DVD mit einem guten Mikroskop. Beleuchten Sie beide mit einem Laser und beobachten Sie die Interferenzfigur in Reflexion, bestimmen Sie daraus den Spurabstand! (1,6 µm für CD, 0,74 µm für DVD) Bild: Uta Lucchesi, Stephan Winnerl, FZD Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 28 01/2007 Anhang: Blick in ein Achromat-Objektiv Bilder: Gert Wrigge & Ilja Gerhardt Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 29 01/2007 Anhang: Beispiel für ein kommerzielles ApertureSNOM Kooperation von JPK Instruments AG, Berlin und Fraunhofer Gesellschaft e.V. Institut für Physikalische Messtechnik (IPM), Freiburg Institut für Ionenstrahlphysik und Materialforschung Stephan Winnerl Mitglied der Leibniz-Gemeinschaft 30 01/2007
