PromotionFriederikeEvaMayer

Der Einfluss natürlicher Killerzellen auf die
Tumorimmunität in einem Doxorubicin-abhängigen
murinen Vakzinierungsmodell
Der Abteilung für Hämatologie und internistische Onkologie
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Friederike Eva Mayer
aus Ulm
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 13.Oktober 2014
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. E. Ullrich
Prof. Dr. A. Mackensen
Meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
Seite
1.
Zusammenfassung……………………………………………… ……………………….1
2.
Abstract…………………………………………………………………………………….2
3.
Einleitung…………………………………………………………………………………..3
4.
5.
6.
7.
3.1.
Das Immunsystem ........................................................................................ 4
3.2.
Natürliche Killerzellen ...................................................................................8
3.3.
Mechanismen der Tumorimmunität ............................................................ 10
3.4.
Vakzinierung durch immunogene, sterbende Tumorzellen ....................... 11
3.5.
Ziele dieser Doktorarbeit ............................................................................14
Material…………………………………………………………………………………...15
4.1.
Ausgangslösungen/ -substanzen ............................................................... 15
4.2.
Hergestellte Medien/ Lösungen..................................................................15
4.3.
Antikörper/ ELISA/ BCA-Assay ..................................................................16
4.4.
Zelllinien ......................................................................................................17
4.5.
Versuchstiere .............................................................................................. 17
4.6.
Verbrauchsmaterialien................................................................................18
4.7.
Geräte .........................................................................................................18
4.8.
Programme .................................................................................................18
Methoden…………………………………………………………………………………19
5.1.
Basismethoden ........................................................................................... 19
5.2.
Überblick über alle Versuche .....................................................................22
5.3.
In-vitro Versuche......................................................................................... 23
5.4.
In-vivo Versuche ......................................................................................... 26
5.5.
Ex-vivo Versuche ........................................................................................ 27
Ergebnisse……………………………………………………………………………….31
6.1.
In-vitro Analyse der Effekte von Doxorubicin auf B16OVA-Zellen .............31
6.2.
In-vivo Vakzinierungsmodell .......................................................................35
6.3.
Überprüfung der NK-Zell-Depletion nach Antikörperinjektion ....................36
6.4.
In-vivo Messung der Tumorprogression.....................................................37
6.5.
Ex-vivo Beurteilung der systemischen Immunreaktion .............................. 39
6.6.
Histologische Beurteilung der CD3+ Infiltration im Tumor .......................... 44
Diskussion………………………………………………………………………………..46
7.1.
Eigenschaften der Vakzinzellen .................................................................46
7.2.
Rolle der NK-Zellen bei der Immunisierung ...............................................48
7.3.
Einfluss der NK-Zell-Depletion auf das Tumorwachstum .......................... 50
7.4.
Infiltrierende T-Zellen in Tumorläsionen.....................................................52
7.6.
Zusammenfassung, klinische Implikation und Ausblick ............................. 53
Literaturverzeichnis…………………………………………………………………………...54
Abkürzungen…………………………………………………………………………………..62
Danksagung…………………………………………………………………………………...64
ZUSAMMENFASSUNG
1.
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: Unter Behandlung mit Chemotherapeutika können
Tumorzellen einen immunogenen Zelltod sterben und damit eine anti-tumorale
Immunität fördern, die additiv zur zytotoxischen Therapie wirkt und optimalerweise
sogar vor Rezidiven schützt. In diesem Zusammenhang soll der Einfluss natürlicher
Killerzellen (NK-Zellen) auf die Tumorimmunität in einem Doxorubicin-abhängigen
murinen Vakzinierungsmodell untersucht werden.
Methoden: Ovalbumin exprimierende B16-Melanomzellen (B16OVA) wurden nach
der in-vitro Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin bezüglich ihrer
Viabilität sowie der Expression von potentiell immunogenen Proteinen analysiert. Ein
in-vivo Modell in C57/Bl6 Mäusen wurde mit Doxorubicin-behandelten B16OVA-Zellen
(DoxoB16) als subkutanes Vakzin etabliert. Sieben Tage nach der Immunisierung
wurden vitale B16OVA-Zellen subkutan an dem kontralateralen Bein appliziert. Das
Tumorwachstum wurde im Versuchsverlauf gemessen. Die Depletion der NK-Zellen
lag entweder über den ganzen Zeitraum des Experiments oder erst nach Vakzinierung
vor. Zu Versuchsende erfolgten durchflusszytometrische Analysen, um die Reaktion
der NK-Zellen, T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen und CD11c+-Zellen zu evaluieren.
Ergebnisse: In-vitro Versuche zeigten, dass die Behandlung mit Doxorubicin in
B16OVA-Zellen Apoptose und Nekrose induzierte und die intrazellulären Expression
von Gefahrensignalen veränderte. In-vivo Versuche wiesen darauf hin, dass die
Vakzinierung mit DoxoB16-Zellen die Mäuse effektiv vor dem Auswachsen später
applizierter vitaler B16OVA-Zellen schützte. Nach Vakzinierung lagen mehr reife,
migratorische und aktivierte NK-Zellen in der Milz vor. Die NK-Zell-Depletion während
des kompletten Versuchszeitraums führte tendenziell zu einer besseren Tumorkontrolle, wogegen die NK-Zell-Depletion erst nach der Vakzinierung zu signifikant
stärkerem Auswachsen der Tumoren führte.
Schlussfolgerung: Unsere in-vivo Ergebnisse deuten auf einen differenzierten
Einfluss der NK-Zellen auf die anti-tumorale Immunität in Abhängigkeit des
Tumorstatus und der Therapie hin. NK-Zellen vermitteln in unserem Modell während
der antitumoralen Vakzinierungsperiode einen negativen Einfluss auf die Generierung
der gewünschten Immunität, weil sie vermutlich das Niveau der tumorspezifischen TZellen vermindern. Im Gegensatz hierzu bestätigen unsere Daten zudem, dass NKZellen zur direkten Lyse auswachsender und bereits solider Tumoren notwendig sind.
1
ABSTRACT
2.
Abstract
Background and Objectives: Treatment with chemotherapeutics can induce
immunogenic cell death of tumor cells and can thus trigger anti-tumor immunity that
affects the cytotoxic treatment in an additional manner und ideally prevents relapse.
This project aims to analyze the impact of natural killer cells (NK cells) on anti-tumor
immunity in a Doxorubicin-dependent murine vaccination model.
Methods: Ovalbumin expressing B16-melanoma cells (B16OVA), which were treated
in-vitro with the chemotherapeutic drug Doxorubicin, were analyzed with respect to
their viability and their expression of potential immunogenic proteins. An in-vivo model
in C57/Bl6 mice with Doxorubicin-treated B16OVA-cells (DoxoB16) as subcutaneously
applied vaccine was established. Seven days after the immunization vital B16OVA
tumor cells were injected subcutaneously on the contralateral thigh. The tumor growth
was measured in the course of the experiment. The NK-cell depletion was either
present during the whole experiment or only later than the vaccination. Once the
experiment was terminated analyses of splenocytes to evaluate the reaction of NKcells, T-cells, memory T-cells and CD11c+-cells were performed.
Results: In-vitro experiments showed that treatment with Doxorubicin induced
apoptosis and necrosis in B16OVA cells and modified their intracellular expression of
danger signals. In-vivo experiments pointed out that the vaccination with DoxoB16-cells
effectively protected mice from the outgrowth of subsequently applied vital B16OVA
cells. Upon vaccination, more mature, migratory and activated NK cells were present in
the spleen. The NK cell depletion during the whole experimental period trended
towards a better tumor control, whereas the NK-cell depletion only later than the
vaccination led to a significant stronger tumor outgrowth.
Conclusions: Our in-vivo results suggest different impact of NK cells on anti-tumor
immunity, dependent on the phase of tumor progress and treatment. During the antitumor vaccination period, NK cells mediate a negative influence on the generation of
the favored anti-tumor immunity in our model. This might be explained by a NK cellinduced reduction of the level of tumor specific T cells. On the other side, our data
confirms that NK cells are crucial to directly lyse tumor cells and efficiently prevent
tumor outgrowth.
2
EINLEITUNG
3.
Einleitung
Maligne Erkrankungen bleiben trotz intensiver experimenteller und klinischer
Krebsforschung, erheblichem Wissenszugewinn und der Entwicklung vieler neuer
Medikamente in den letzten Jahrzehnten eine der häufigsten Todesursachen der
einkommensstarken Länder (World Health Organisation 2008, „Cause-specific
mortality and morbidity: Age-standardized mortality rate by cause“).
Viele klassische Behandlungsregime beinhalten eine operative Entfernung des
Tumors, oft kombiniert mit lokaler Bestrahlung und systemischer Chemotherapie.
Zunehmend rücken daneben additive, synergistisch wirksame Behandlungsmethoden,
die am Immunsystem angreifen in den Fokus. Ein Ziel der Krebsforschung ist es,
Therapien zu etablieren und klinisch nutzbar zu machen, die das körpereigene
Abwehrsystem modulieren, stärken und gezielt im Kampf gegen den Tumor
unterstützen.
Genaue
Kenntnisse
über
die
beteiligten
Komponenten
des
Immunsystems sind obligat, um dabei einen maximalen antitumoralen Effekt zu
erzielen.
Unter Behandlung mit Chemotherapeutika können Tumorzellen auf verschiedene Arten
sterben. Apoptose, Nekrose, Autophagie oder mitotische Katastrophe können induziert
werden, woraufhin es zur Freisetzung
von Tumorantigenen wie auch von
Gefahrensignalen (DAMPs, damage associated molecluar patterns) kommen kann [20,
76]. Diese freigesetzten Stoffe sollen optimalerweise Phagozyten wie die dendritischen
Zellen (DC, dendritic cell) anziehen, welche die Tumorantigene dem adaptiven Teil des
Immunsystem präsentieren und somit eine spezifische Immunantwort gegen die
Tumorzellen auslösen können [52] - ein Mechanismus, der als immunogener Zelltod
(immunogenic cell death) bezeichnet wird [105].
Systemische Chemotherapie gilt an sich als immunsuppressiv und induziert häufig
einen nicht immunogenen Zelltod. Jedoch konnten Casares et al. zeigen, dass
Tumorzellen, die nach Behandlung mit Anthracyclinen, wie z.B. Doxorubicin, zu
Grunde gehen, eine effektive antitumorale Immunantwort hervorrufen, die zu einer
Regression von etablierten Neoplasien sowie auch zur Wachstumsunterdrückung
eines nachfolgend induzierten Tumors führt [11]. In Abwesenheit von DCs oder
CD8+ T-Zellen (CTLs, cytotoxic T lymphocytes) konnte dieser Effekt nicht mehr
nachgewiesen werden [11]. Dies deutet auf eine wichtige Rolle dieser beiden
Zellpopulationen hin, doch welche genaue Bedeutung natürliche Killerzellen (NK-
3
EINLEITUNG
Zellen) in der Tumorimmunität bei Behandlung mit Chemotherapeutika spielen, ist noch
nicht geklärt.
NK-Zellen sind eine Subpopulation der Lymphozyten. Sie zeichnen sich durch die
Fähigkeit
aus,
virusbefallene
oder
entartete
Zellen
gezielt,
jedoch
ohne
vorangegangene Sensibilisierung, zu erkennen und lysieren [98].
Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss der NK-Zellen auf die Tumorimmunität in einem
Doxorubicin-abhängigen murinen Vakzinierungsmodell zu untersuchen.
Im Folgenden soll zunächst ein Überblick über allgemeine Strukturelemente und
Funktionsweisen des Immunsystems mit speziellem Fokus auf NK-Zellen gegeben
werden, bevor dann weiterführend auf Aspekte der Tumorimmunität und -vakzinierung
eingegangen wird.
3.1.
Das Immunsystem
Der menschliche Körper wird täglich mit Krankheitserregern, in Form von Bakterien,
Viren, Pilzen oder Parasiten, konfrontiert. Dem Immunsystem ist es zu verdanken,
dass nicht jeder Kontakt mit diesen Pathogenen zu klinisch manifesten Symptomen
führt.
Alle Zellen des Immunsystems stammen von einer gemeinsamen, im Knochenmark
vorkommenden
Vorläuferzelle
ab,
der
sog.
pluripotenten,
hämatopoetischen
Stammzelle. Von ihr ausgehend etablieren sich die lymphoide und die myeloische
Zelllinie. Aus erster entwickeln sich im Thymus T-Lymphozyten und im Knochenmark
B-Lymphozyten. Auch NK-Zellen werden den Lymphozyten zugeordnet. Aus der
myeloischen Zelllinie gehen über weitere Vorläuferzellen Thrombozyten, Erythrozyten,
Makrophagen/ Monozyten, Granulozyten, Mastzellen und DCs hervor. Ein kleiner Teil
der DCs entwickelt sich zudem aus lymphoiden Vorläuferzellen [62].
Das Immunsystem wird klassischerweise in die angeborene und erworbene Immunität
unterteilt [30, 62].
Die angeborene Immunität ist charakterisiert durch eine Vielzahl myeloischer Zellen
und NK-Zellen, die über eine nur limitierte Zahl spezifischer Rezeptoren verfügen,
damit aber allgemein vorkommende Merkmale von Krankheitserregern erkennen und
als Folge einer Aktivierung schnell ihre Effektorfunktion erlangen [100].
Die Erkennung dieser allgemein vorkommenden Merkmale von Pathogenen, den sog.
4
EINLEITUNG
Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMP, pathogen associated molecular
pattern), ist über Toll-artige Rezeptoren (TLR, toll-like receptor) möglich. Kommt es zu
einer Interaktion zwischen PAMP und TLR werden Signalkaskaden initiiert, die eine
Immunreaktion
fördern
[57].
TLRs
können
anhand
ihrer
Trägerzelle
und
Ligandenspezifität unterteilt werden: Der TLR9 auf B-Zellen oder NK-Zellen wird zum
Beispiel durch bakterielle CpG (Cytidin-phosphatidyl-Guanosin) -DNA-Sequenzen
stimuliert, der TLR4 auf Makrophagen, DCs oder Endothelzellen beispielsweise durch
Lipopolysaccharid (LPS) der Bakterienoberflächen [30, 62].
Ausschlaggebend für die zelluläre Abwehrreaktion des angeborenen Immunsystems
sind Makrophagen, die gemeinsam mit B-Lymphozyten, Monozyten und DCs aufgrund
ihrer Fähigkeit Antigene zu präsentieren als Antigen-präsentierende Zellen (APCs)
zusammengefasst werden [62]. Über verschiedene Rezeptoren auf ihrer Oberfläche
erkennen sie Erreger, phagozytieren diese und schütten immunmodulatorische,
proinflammatorische Stoffe, sog. Zytokine, wie beispielsweise IL-1β, IL-6, TNF-α,
CXC8 und IL-12, aus. Über IL-1β, IL-6 und TNF-α wird eine lokale und systemische
Entzündungsreaktion gefördert. CXC8 wirkt nur lokal inflammatorisch und lockt
Leukozyten, v.a. neutrophile Granulozyten [62] und NK-Zellen [60] in das entzündete
Gewebe. IL-12 aktiviert NK-Zellen [28, 30, 98].
Im Rahmen der angeborenen Immunreaktion, v.a. bei viralen Infektionen, spielen auch
Interferone (IFN) eine Rolle, die in IFN-α, -β, -γ unterteilt werden. IFN-α und –β werden
von virusinfizierten Wirtszellen produziert und wirken ausgesprochen virostatisch.
IFN-γ ist dagegen ein wesentlicher Mediator unspezifischer und spezifischer
Immunreaktionen [30]. Es wird in frühen Phasen einer Infektion v.a. von NK-Zellen, in
späteren Phasen auch von aktivierten CTLs gebildet [62]. Makrophagen steigern nach
IFN-γ Exposition ihre Aktivität [30, 62].
Neben Makrophagen beteiligen sich auch DCs an der Antigenpräsentation. TNF-α
stimuliert ihre Reifung und Abwanderung in regionale Lymphknoten, wo sie den Zellen
des erworbenen Immunsystems antigene Strukturen präsentieren [30, 62]. Die
Antigen-spezifische Aktivierung und darauf folgende Proliferation einer T-Zelle wird als
Priming bezeichnet [3, 62]. Damit findet sich hier die Schnittstelle zur adaptiven
Immunität.
Im Gegensatz zum angeborenen Teil des Immunsystems besteht der erworbene
grundlegend aus nur zwei Zelltypen, den T- und B-Zellen. Diese weisen ein großes
Repertoire klonal exprimierter, durch somatische Rekombination entstandener
Antigenrezeptoren auf, die sog. T- und B-Zellrezeptoren (TCR/ BCR) [30].
5
EINLEITUNG
T-Zellen können über die membranständige Expression von CD4 und CD8
unterschieden werden. Diese Rezeptoren stabilisieren die Verbindung zwischen TCR
und den Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC, major histocompatibility complex)
der APCs. Die CD4+ T-Zelle hat vor allem regulatorische Aufgaben, wogegen die CD8+
T-Zelle in der Lage ist viral und maligne veränderte körpereigene Zellen zu zerstören
und daher auch zytotoxische T-Zelle genannt wird [30].
Bevor T- und B-Zellen ihre komplexen Effektor- und Regulatorfunktionen aufweisen,
müssen sie einen Prozess der Zellteilung und Reifung durchlaufen [100]. Diese
Induktionsphase dauert einige Tage.
In spezialisierten lymphoiden Organen, wie den Lymphknoten, werden naive T- und BZellen Antigenen ausgesetzt und bei spezifisch passendem Antigenkontakt aktiviert.
Die Präsentation von Erregerfragmenten erfolgt mit Hilfe von MHC-Komplexen. MHCMoleküle werden in zwei Klassen unterteilt. Über MHC Klasse-I Moleküle, die sich auf
allen kernhaltigen Zellen befinden, werden v.a. zelleigene intrazelluläre Proteine, aber
auch Proteine intrazellulärer Erreger, präsentiert. CD8+ T-Zellen sind in der Lage
Antigene, die über MHC-I Moleküle dargeboten werden, zu erkennen und in der
präsentierenden Zelle den programmierten Zelltod einzuleiten, falls TCR und das
Antigen zusammenpassen [62]. Über MHC Klasse-II Moleküle werden im Gegensatz
Fremdsubstanzen präsentiert, die zuvor von extrazellulär in die Zelle aufgenommen
und dort prozessiert wurden [62]. Zusätzlich können extrazelluläre Antigene sterbender
Zellen sowie Tumorantigene von DCs aufgenommen, prozessiert und über MHC-I
Moleküle naiven CD8+ T-Zellen angeboten werden, welche auf diese Weise aktiviert
werden [62]. Dieser Mechanismus wird als Kreuzpräsentation (cross presentation)
bezeichnet [62]. Entscheidend sind dabei Retrotranslokationsmechanismen, über die
im Zytosol vorliegende exogene Peptide zurück in das endoplasmatische Retikulum
transportiert und auf MHC-I Moleküle geladen werden [62].
Makrophagen und DCs verfügen über Klasse-II Präsentationsmöglichkeiten und
aktivieren über diesen Weg CD4+ T-Zellen. Aktivierte T-Helferzellen (TH-Zelle) treten in
eine Phase intensiver Zellteilung ein. Zudem wird die Produktion von IL-12 induziert,
die wiederrum die Differenzierung der CD4+ T-Zellen in Richtung TH1-Zellen
vorantreiben. TH1-Zellen sind eine Subpopulation der T-Helferzellen, die über IFN-γ
und weitere Zytokine die Entzündungsreaktion regulieren. TH2-Zellen stellen dagegen
eine Differenzierungshilfe für B-Zellen dar [30, 62].
Naive B-Zellen wandern vom Blut aus in spezielle Bereiche der Lymphknoten, in die
6
EINLEITUNG
sog. B-Zell-Zone, wo sie über ihren BCR extrazelluläre antigene Strukturen direkt
erkennen, binden, internalisieren und prozessieren können. Daraufhin präsentiert die
B-Zelle das Antigen über MHC Klasse-II Moleküle an CD4+ T-Zellen. Passen B-Zelle
und T-Zelle spezifisch zusammen, kommt es über ein CD40-abhängiges zweites
Signal zur B-Zell-Aktivierung. Die B-Zelle kann einerseits zu einer Plasmazelle
differenzieren, die für einige Tage das Immunglobulin IgM produziert, bevor sie sich
über einen programmierten Suizid selbst beseitigt. Anderseits kann es im Keimzentrum
der Lymphknoten zu einer massiven B-Zell-Vermehrung kommen. Nachfolgend wird
die Qualität der BCR über einen zweifachen, erst negativen dann positiven,
Selektionsprozess gewährleistet. Unter Zytokineinfluss kommt es schließlich zum
Isotypenswitch, d.h. der konstante Teil der schweren Kette der Antikörper wird
ausgetauscht. IgA, IgG und IgE stehen jetzt zur Neutralisation der zirkulierenden
Erreger zur Verfügung. Dabei bestimmt das Muster des freigesetzten Zytokine der TH2Zellen die Antikörper-Bildung [30]. Immunglobuline binden an die Oberfläche des
Erregers und machen diesen dadurch unschädlich. Zudem ist nun eine erleichterte
Phagozytose möglich [62].
Ist die Infektion erfolgreich eingedämmt, werden die aktivierten Lymphozyten zum
größten Teil durch Apoptose und Phagozytose eliminiert. Einige wenige bleiben jedoch
lebenslang erhalten [66]. Das immunologische Gedächtnis wird von Gedächtnis-BZellen, Gedächtnis-T-Zellen [30] sowie NK-Gedächtniszellen [90] gebildet. Kommt der
Körper noch einmal in Kontakt mit dem gleichen Erreger, kann die spezifische
Immunantwort schneller und effektiver erfolgen.
CD8+ Gedächtnis-T-Zellen entwickeln sich von naiven CD8+ T-Zellen ausgehend, über
Zentrale Gedächtnis- (TCM, central memory T-cell), zu Effektor Gedächtnis- (TEM,
effector memory T-cell) weiter zu Effektor (TEFF, effector T-cell) T- Zellen, welche sich
schließlich erschöpfen [74]. Im Verlauf dieser Entwicklung verlieren die Zellen ihr
Potential zu proliferieren und IL-2 zu produzieren, gewinnen jedoch an Zytotoxizität
[43]. TCM-Zellen zeigen im Vergleich zu TEM-Zellen bessere Mediatorqualitäten beim
Schutz gegen Bakterien und Viren. Klebanoff et. al publizierte zudem, dass adoptiv
transfundierte tumorreaktive TCM-Zellen in der therapeutischen antitumoralen Immunität
gegen
etablierte
Tumoren
in
einem
Modell
mit
systemisch
applizierter
tumorspezifischen Vakzinierung den TEM-Zellen überlegen sind [42]. Als mögliche
Erklärung
des
besseren
Wirtschutzes
durch
TCM-Zellen
wird
ihre
höhere
Proliferationskapazität nach Antigen-Zweitkontakt gesehen [43]. Dieses Wissen
veranlasste uns dazu, in unserem Vakzinierungsmodell durchflusszytometisch diese
Gedächtniszellen zu analysieren.
7
EINLEITUNG
3.2.
Natürliche Killerzellen
1975 entdeckten Kiessling et al. granuläre Zellen, welche eine schnelle zytotoxische
Reaktion ohne vorherige antigenspezifische Sensibilisierung gegen „MoloneyLeukämiezellen“ aufwiesen. Er nannte sie Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) [40]. Ihre
Fähigkeit Tumorzellen und Metastasen, denen es an MHC-I Molekülen mangelt, in-vivo
zu eliminieren [83], machte NK-Zellen zu einem vielversprechenden Gegenstand der
Krebsforschung [93].
NK-Zellen wurden ursprünglich der angeborenen Immunität zugeordnet. In der
aktuellen Literatur wird NK-Zellen jedoch immer häufiger eine Sonderstellung zwischen
angeborener und erworbener Immunität zugesprochen, weil sie neben ihrer
zytolytischen Fähigkeiten weitere immunregulatorische sowie Eigenschaften der
spezifischen Immunität aufweisen [100].
NK-Zellen werden vom Knochenmark produziert und stammen von der lymphoiden
Stammzelllinie ab. NK-Vorläufer Zellen sind durch die Expression von CD122
charakterisiert [71]. Sie verteilen sich nach Verlassen des Knochenmarks in lymphoide
sowie nicht lymphoide Organe [100]. Während ihrer Reifung werden abwechselnd
verschiedenste Rezeptoren auf murinen NK-Zellen hoch- und herunterreguliert, bis
schließlich eine hohe Expression von CD11b (Mac-1) und CD43 besteht [41].
CD11b+/high Zellen werden als reif (mature) bezeichnet. Sie können über CD27, einen
Oberflächenmarker, der der Tumornekrosefaktor-Rezeptor Superfamilie (TNFRSF,
tumor necrosis factor receptor superfamily) zugehörig ist, weiter unterteilt werden [28].
CD11bhighCD27high reifen unter Einfluss von Milz-Monozyten zu terminal differenzierten
CD11bhighCD27low NK-Zellen heran [84]. Letztgenannte können IFN-γ bei einer
Stimulation durch IL-12 und IL-18 produzieren, wogegen CD11bhighCD27high NK-Zellen
auch bei alleinigem Stimulus durch IL-12 oder IL-18 große Mengen Zytokine freisetzen
können
[29].
Zudem
weisen
CD11bhighCD27high
NK-Zellen
ein
höheres
Proliferationspotential auf [29]. Diese Unterschiede werden durch unterschiedlich
ausgeprägte Empfindlichkeiten gegenüber Zytokinen begründet. IL-15, das z.B. von
DCs produziert wird, ist ein essentieller Faktor der NK-Zell Entwicklung [13, 38], ihres
Überlebens in der Peripherie [10, 67] und ihrer Ausstattung mit lytischen Kapazitäten
[50]. Die Entwicklung zu terminal differenzierten NK-Zellen unterliegt der Regulation
durch verschiedene Transkriptionsfaktoren, z.B. IL-15Rα, Txb21 [84], T-bet [95] und
IFN-regulatorischem Faktor 2 [92]. Liegen an dieser Stelle Veränderungen der
Transkriptionsfunktion vor, endet die NK-Zell-Differenzierung auf früherer Stufe [15,
104].
8
EINLEITUNG
Reife NK-Zellen besitzen die Fähigkeit abhängig von Zytokingradienten, in infizierte,
entzündete Gewebegebiete [53, 70] und Tumorregionen [79] einzuwandern und MHC
Klasse-I negative Tumore anzugreifen [84]. Unter diesen Aspekten werden in unseren
Versuchen die Differenzierungsstadien der NK-Zellen in der Milz analysiert.
NK-Zellen sind in der Lage zwischen kranken Zellen, z.B. durch virale Infektion oder
maligne Transformation, und gesunden Zellen zu unterscheiden. Als wichtiger
Mechanismus dieser Differenzierung wird die verminderte Dichte der MHC-Klasse-I
Expression auf veränderten Zellen diskutiert, sog. „missing self“-Theorie [8, 21, 49].
NK-Zellen werden aktiv durch Rezeptoren, die MHC Klasse-I Moleküle erkennen,
inhibiert [49]. Inhibitorische murine Rezeptoren sind Lektin-ähnliche Ly49-Moleküle und
CD94/NKG2A Heterodimere [100]. Des Weiteren verfügen NK-Zellen über aktivierende
Rezeptoren, die ihre zytotoxische Aktivität kontrollieren. NKp46 als wichtiger
aktivierender NK-Zell-Rezeptor, der in der Maus sowie im Menschen vorkommt, gehört
zu der Familie der natürlichen Zytotoxizität-Rezeptoren (NCR, natural cytotoxicity
receptor) [100]. Beim Mensch können diese Rezeptoren aufgrund ihrer Struktur in zwei
Klassen eingeteilt werden. Erstens den Killerzellen-Lektin-ähnlichen Rezeptoren (KLR,
killer cell lectin-like receptor), zweitens den Killerzellen-Immunglobulin-ähnlichen
Rezeptoren (KIR, killer cell immunglobulin-like receptor). Ein wichtiger, aktivierender
Vertreter der KLRs ist NKG2D, der auf der Oberfläche aller humanen NK-Zellen
exprimiert ist und MHC Klasse-I Moleküle bindet [99, 100]. Die Bindung zwischen
NKG2D-Rezeptor und seinem Liganden (NKG2DL) führt zu einem Signal, welches
zytotoxische Aktivität und die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen zur Folge
hat [68]. Die Erkennung über NKG2D wirkt somit als allgemeines Alarmsignal auf das
Immunsystem [22].
Das Gleichgewicht aus inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren stellt die
Selbsttoleranz der NK-Zellen sicher und erlaubt dennoch eine effiziente Immunreaktion
bei viraler Infektion und Tumorwachstum [100]. Als Folge der Stimulation aktivierender
Rezeptoren oder fehlender Stimulation der inhibierenden Rezeptoren schüttet die NKZelle IFN-γ aus und tötet die Zelle, von der der Stimulus kam, gezielt durch die
Freisetzung von Granzymen und Perforin. Kontakt mit diesen Stoffen leitet in der
Zielzelle den programmierten Zelltod, die Apoptose, ein. Benachbarte gesunde Zellen
bleiben davon verschont [9, 96]. Dieser Effektormechanismus entspricht dem der
zytotoxischen CD8+ T-Zellen [30]. Im Rahmen der Tumorabwehr ist bekannt, dass NKZellen, die zuvor durch DCs aktiviert wurden, Tumorzellen über Perforin töten können,
wodurch die Tumorantigenfreisetzung beschleunigt wird [32].
9
EINLEITUNG
Zusätzlich können NK-Zellen eine Vielzahl von Zytokinen produzieren: IFN-γ, TNF-α,
Lymphotoxin, IL-13, IL-10 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendenFaktor (GM-CSF). Diese Stoffe unterstützen die TH1-vermittelte Immunität in sekundär
lymphatischen Organen [54]. Das deutet drauf hin, dass NK-Zellen eine direkte
Verbindung zwischen angeborener und erworbener Immunität während des sog.
T-Zell-Primings herstellen. Gleichzeitig fördert IFN-γ und TNF-α aus aktivierten NKZellen und ihre direkten zellulären Kontakte die Reifung der DCs [32]. Jedoch ist auch
beschrieben, dass NK-Zellen die Aktivität der DCs limitieren können, indem sie unreife
DCs über TRAIL-vermittelte Mechanismen eliminieren. NK-Zellen werden damit unter
anderem regulatorische Aufgaben zugesprochen [32].
3.3.
Mechanismen der Tumorimmunität
Bereits 2000 beschrieben Hanahan und Weinberg sechs verschieden Merkmale, durch
die sich Tumorzellen von gesunden Zellen unterscheiden [24]. Spezifische Merkmale
tumorbefallener Zellen sind das Vorhandensein anhaltender Proliferationssignale und
unlimitierten Replikationspotenzials, das Umgehen der Wachstumshemmung und des
Zelltodes, die Induktion der Angiogenese und die Fähigkeit zur Invasion und
Metastasierung [24]. 2011 konnten diese Merkmale um die genomische Instabilität,
Mutationen,
Unterdrücken
von
Immunreaktionen
und
die
tumoral-vermittelte
Entzündungsreaktion erweitert werden [25].
Während der Entstehung von Tumoren interagieren maligne Zelle und infiltrierende
Immunzellen ständig miteinander und formen dadurch die Tumorimmunität und das
Tumormilieu. Das Zusammenspiel von Tumorentstehung und Immunzellen ist unter
dem Begriff des Immun-Editings (immune editing) zusammengefasst [17, 18].
Invasives Wachstum von Tumorzellen führt lokal im Gewebe zu der Freisetzung
inflammatorischer Signale, die Zellen des angeborenen Immunsystems, wie NK-Zellen,
DCs und Makrophagen, anlocken [82]. Wichtig sind Gefahrensignale, wie das HighMobility-Group-Protein B1 (HMGB1) aus sterbenden Tumoren, und Interferone, die
über DCs eine anti-tumorale Immunität fördern [77]. Strukturen der transformierten
Zellen werden von infiltrierenden Lymphozyten, vor allem von T-, NK- und NKT- Zellen
erkannt, die daraufhin IFN-γ freisetzen [17]. Als Konsequenz der IFN-γ Freisetzung
kommt es zu Tumorzell-Debris, die von lokalen DCs prozessiert wird [17]. In den
drainierenden
Lymphknoten
induzieren
diese
Antigen-präsentierenden
Zellen
tumorspezifische CD4+ T-Helferzellen, deren IFN-γ Expression wiederum die
Entwicklung tumorspezifische CD8+ T-Zellen unterstützt [17].
10
EINLEITUNG
Tumorspezifische T-Zellen wandern in das Tumorgebiet ein, wo die zytotoxischen
CD8+ T-Zellen die noch vorhandenen Antigen-tragenden Tumorzellen zerstören [17].
Zu diesem Zeitpunkt ist das Immunsystem noch in der Lage das Tumorwachstum zu
verhindern. Vor allem die Interaktion (crosstalk) zwischen DCs und NK-Zellen ist hier
entscheidend [33], die über Chemo- und Zytokine sowie direkten Zell-Zell Kontakt
stattfinden kann [97]. Wie wichtig das Zusammenspiel von DCs und NK-Zellen für die
Induktion einer Tumorimmunität ist, verdeutlichten Versuche von Karimi et al., die eine
Immunisierung mit Hilfe von DCs mit einer Immunisierung über Adenoviren verglichen
[35]. Neben der Rekrutierung von CTLs konnten nur über die DC-abhängige
Vakzinierung IFN-γ-produzierende NK-Zellen induziert werden [35].
Welche Rolle NK-Zellen genau in dieser Phase der Tumorabwehr und damit der antitumoralen Immunität spielen soll in dieser Doktorarbeit unter anderem mit Hilfe einer
NK-Zell-Depletion geklärt werden.
Dieser frühen Phase, auch Immunüberwachung (immune surveillance oder elimination)
genannt, schließt sich die Phase des Gleichgewichts (equilibrium) an, in der sich die
Tumorzellen weiter verändern, um zu überleben. Schließlich haben die Tumorzellen
sich durch Mutationen ein Milieu geschaffen, in welchem sie dem Immunsystem
komplett entgehen und ungehindert proliferieren können. Hier greift der Begriff des
„Immunescapes“ [18].
3.4.
Vakzinierung durch immunogene, sterbende Tumorzellen
Das Ziel einer Vakzinierung ist es, ein langanhaltendes immunologisches Gedächtnis,
welches v.a. aus B- und T-Zellen gebildet wird, zu induzieren. Seit vielen Jahren wird
erfolgreich gegen verschiedenste Infektionskrankheiten, wie z.B. Masern, Tetanus oder
Diphterie, geimpft. Seit 1980 gelten Pocken als ausgerottet (World Health Organisation
2010, „Countries celebrate 30th Anniversary of Smallpox Eradication, Vaccine
Revolving Fund, and look ahead to new challenges”). Dies ist Verdienst weltweiter
Impfkampanien. Das Korrelat in der Krebstherapie, die sog. Tumorvakzinierung, hat
erst in den letzten Jahren Erfolge gezeigt.
Die Entdeckung von Tumor-assoziierten Antigenen (TAA, tumor associated antigen)
hat die Entwicklung der Tumorvakzinierung vorangetrieben. Eine Vielzahl von
Methoden wird präklinisch und klinisch oft in Kombination mit immunstimulierenden
Adjuvanzien erprobt: lösliche Proteine und Peptide, rekombinante Viren und Bakterien
als TAA Vektoren, DNA-Injektionen oder mit TAAs beladene DCs [7]. Darüber hinaus
scheint der Einsatz apoptotischer und nekrotischer Tumorzellen als Vakzine
11
EINLEITUNG
vielversprechend, da sie eine gute Quelle für TAAs darstellen und CTLs und CD4+ THelferzellen gleichzeitig aktivieren könnten [12].
Schon 1996 beschrieb Jaffee et al. die Tumorabstoßungs-Antigene (TRA, tumor
rejection antigen). Ihre Entdeckung zeigte, dass Mäuse durch die Injektion bestrahlter
Tumorzellen gegen später applizierte lebende Zellen genau dieser Zelllinie geschützt
waren. Diese induzierte spezifische Immunität beweist, dass Tumore in der Lage sind
Peptide zu exprimieren, die als Antigene wirken und eine tumorspezifische
Immunantwort der T-Zellen auslösen [34]. Die Methode der Immunisierung in dieser
Doktorarbeit ähnelt genannter, nur werden in-vitro mit Doxorubicin vorbehandelte
B16OVA-Zellen anstatt bestrahlter Zellen eingesetzt.
Die murine Melanomzelllinie B16OVA weist ein hohes Proliferationspotential in-vitro
und aggressives Wachstum in-vivo auf. Obwohl die Tumorzellen MHC-different sind,
werden sie von immunkompetenten C57Bl6 Mäusen nicht abgestoßen, weil dafür der
antigene Reiz nicht ausreichend ist.
Das in dieser Arbeit verwendete Chemotherapeutikum Doxorubicin gehört der Klasse
der Anthrazykline an, die dadurch charakterisiert sind, dass sie mit DNA interkalieren
und die Topoisomerase II hemmen [36]. Topoisomerasen sind eine Enzymklasse, die
die Anzahl und Topologie der Superspiralisierungen (supercoils) der DNA und damit
die DNA-Replikation kontrollieren. Sie werden klinisch bei Karzinomen verschiedenster
Entitäten sowie Leukämien eingesetzt. Neben den klassischen Nebenwirkungen von
Zytostatika, wie z.B. Blutbildveränderungen, Mukositis, Übelkeit und Erbrechen, weist
Doxorubicin eine hohe Kardiotoxizität auf [36].
Tumorzellen, die mit Chemotherapeutika behandelt werden, sterben hauptsächlich
durch Apoptose [31]. Diese Art von Zelltod gilt als immunologisch neutral, da
apoptotisches Material rasch von Phagozyten internalisiert und beseitigt wird [19].
Neuere Arbeiten wie die von Albert et al. zeigen allerdings, dass auch apoptotische
Zellen immunaktivierend wirken können. So präsentieren humane DCs über MHC
Klasse-I Moleküle bevorzugt Antigene apoptotischer, jedoch nicht nekrotischer Zellen,
und stimulieren darüber zytotoxische T-Zellen [1]. Das Wissen über die immunogene
Wirkung apoptotischer Zellen veranlasst uns die Zelltodesformen Doxorubicinbehandelter Zellen zu überprüfen und diese Zellen als Vakzin in Betracht zu ziehen.
Apoptose, im Unterschied zur Nekrose, ist definiert als eine Art des Zelltodes, bei der
die Zellmembran intakt bleibt. Dabei kommt es zu Chromatinkondensation (Pyknosis)
und Kernfragmentierung (Karyohexis) [39].
12
EINLEITUNG
Initiiert werden kann die Apoptose über zwei Wege: Erstens über Todesrezeptoren auf
der Zelloberfläche, sog. extrinsischer Weg (extrinsic pathway), oder zweitens über
Mitochondrien, sog. intrinsischer Weg (intrinsic pathway) [31]. Unabhängig vom
Initiationsstimulus ist die Aktivierung von Cystein-Aspartyl-spezifischen Proteasen, den
sog. Caspasen, häufig eine Begleiterscheinung der Apoptose [45]. Casares et al.
propagierte, dass die Immunogenität des Doxorubicin-induzierten Zelltodes von der
Aktivierung von Caspasen abhängig ist [11]. Prinzipiell werden der Apoptose jedoch
eher nicht-inflammatorische bis hin zu anti-inflammatorischen Effekte zugesprochen
[88, 101].
Die Regulation des programmierten Zelltodes unterliegt einer Vielzahl von Proteinen,
Signalketten und Genen. Teil dieser komplexen Regulationsmechanismen sind
beispielsweise Survivin und p53. Survivin (BIRC5) ist ein Apoptose hemmendes
Protein (IAP, inhibitor of apoptosis protein), das von Tumorzellen vermehrt produziert
wird und klinisch mit einem schlechteren Ergebnis assoziiert ist [37]. Dieses
Überlebensprotein spielt eine ausschlaggebende Rolle in der Determination des
Zellüberlebens [2, 48]. Survivin ist in der Lage Caspasen zu inhibieren und damit den
Zelltod zu blockieren [37]. Es schützt die Zellen vor dem Absterben durch
Chemotherapeutika und Bestrahlung und fördert damit Behandlungsresistenzen [37].
Der Transkriptionsfaktor p53, der in vielen entarteten Zellen in erhöhter Menge
messbar ist, reguliert bei DNA-Schädigung die Expression von Genen, die den
Zellzyklus kontrollieren, den programmierten Zelltod einleiten und für eine DNAReparatur sorgen. Aufgrund dieser Eigenschaften wird p53 in der Literatur als
„Wächter des Genoms“ bezeichnet [46]. p53 stellt ein wichtiges Element bei der
Stress-induzierten Apoptose dar [59, 73]. Es ist gezeigt, dass durch Stress-bedingte
post-translationale Modifikationen die Transkriptionsaktivität von p53, die Apoptosefördernd ist, erhöht werden kann [31] und es damit zu einer vermehrten NKG2Dvermittelten Lyse durch NK-Zellen kommt [94]. Die intrazelluläre Expression von
Survivin und p53 wird im Rahmen der Charakterisierung unseres Vakzins untersucht.
Nekrose, im Unterschied zu Apoptose, ist definiert durch den Verlust der
Membranintegrität, was Entzündungsreaktionen zur Folge hat: Austretende zelluläre
Bestandteile fungieren als Gefahrensignale [6]. Sie fördern die Reifung und Migration
von DCs und führen zu einer T-Zell-Aktivierung [16, 58]. In diesem Zusammenhang
wird in unseren Versuchen des Weiteren HMGB1 (high mobility group protein B1), ein
DNA bindendes Protein, analysiert. Dieses ist konstitutiv in allen Zellen exprimiert, wird
bei Nekrose extrazellulär freigesetzt und dient als allgemeiner Alarmstoff. HMGB1 kann
über TLR4 auf DCs die Antigenpräsentation dieser aktivieren [58].
13
EINLEITUNG
Nekrotische Zellen, denen es an HMGB1 mangelt, zeigen eine reduzierte Fähigkeit
APCs zu aktivieren [72]. Schildkopf et al. beobachteten, dass HMGB1 vermehrt nach
Kombination von Bestrahlung mit zusätzlicher Stimulation wie Hyperthermie von
Tumorzelllinien freigesetzt wird [75].
Immer häufiger wird zudem über die Erhöhung der Immunogenität von Tumorzellen
durch Hitze-Schock Proteine (HSP) diskutiert [76, 91], was uns in dieser Doktorarbeit
dazu veranlasst, die Expression von HSP70 intra- und extrazellulär zu analysieren.
HSP70 stellt eine wichtige Komponente des Chaperonsystems dar, das ubiquitär in
eukaryonten Zellen vorkommt. Chaperone helfen neu synthetisierten Proteinen sich
korrekt zu falten und damit ihre spezifische Konformation zu erlangen [26]. HSP70 liegt
in zwei Isoformen vor. Neben der konstitutiv exprimierten, existiert eine induzierbare
Form, die der Zelle Schutz bietet vor Schäden, die zum Beispiel durch Hitze, Hypoxie,
oxidativer Stress, zytotoxische Substanzen oder Bestrahlung entstehen [86].
3.5.
Ziele dieser Doktorarbeit
In der Ausweitung von Krebstherapieregimen stellt die Tumorvakzinierung eine
möglicherweise zukunftsweisende Strategie dar. Es gilt die Effektivität dieser
auszuweiten, beispielsweise indem durch die Induktion von immunogenem Zelltod
Tumorzellen des Patienten so verändert werden, dass sie als therapeutisches Vakzin
dienen können [55].
Der Ansatz, der in der vorliegenden Arbeit betrachtet wird, ist die Nutzung Doxorubicinvorbehandelter, sterbender B16OVA-Tumorzellen, die nicht mehr in der Lage sind,
in-vivo zu proliferieren,
jedoch eine tumorspezifische Immunisierung
in der
immunkompetenten Maus herbeiführen.
Es ist bis dato nicht abschließend geklärt, wie weit NK-Zellen Einfluss auf die
Tumorimmunität haben. Publizierte Daten zeigen einerseits, dass die Aktivierung von
NK-Zellen durch ihre spezifische Interaktion mit DCs und dem adaptiven Teil des
Immunsystem einen positiven Effekt in der Generierung von Immunogenität besitzen
[44]. Andererseits wird ihnen die Fähigkeit zugesprochen, tumorspezifische CD8+ TZellen zu lysieren und damit negativ auf die Tumorimmunität zu wirken [85].
Ziel dieser Promotionsarbeit ist es, die Rolle von NK-Zellen im Rahmen eines
Doxorubicin-abhängigen murinen Vakzinierungsmodells genauer zu charakterisieren
und dadurch eine Aussage treffen zu können, ob NK-Zellen einen positiven, negativen
oder keinen Einfluss auf die Tumorimmunität im Rahmen der Tumorvakzinierung
haben.
14
MATERIAL
4.
Material
4.1.
Ausgangslösungen/ -substanzen
PBS
FCS
RPMI 1640
Trypan Blue Stain 0,4%
L-Glutamin
Mercaptoethanol
Pen Strep
Trypsin
Vitamine
MEM NEAA
Sodium Pyruvat (100mM)
Fixation/Permealization Lösung
70%, 80%, 96%, 100% Isopropanol
Tetrachlorethylen
Paraffin
Doxorubicin
4.2.
GIBCO, Darmstadt, Dtl.
PAN Biotech, Aidenbach, Dtl.
BD, Franklin Lakes, USA
SAV Liquid Production, Flintsbach am Inn,
Dtl.
VWR, Radnor, USA
Engelbrecht Labor- u. Medizintechnik,
Edermünde, Dtl.
Cell Pharm, Bad Vilbel, Dtl.
Hergestellte Medien/ Lösungen (Verwendungszweck)
R10 (Zellkultur)
ACK-Puffer (FACS-Analyse)
Blocking Puffer (FACS-Analyse)
RIPA-Lysepuffer (Western Blot)
Milch (Western Blot)
Blocking Buffer (Western Blot)
500ml PBS
+ 50ml FCS
+ 5ml MEMNEAA
+ 5ml Pen/Strep
+ 5ml L-Glutamin
+ 5ml Sodium Pyruvat
1000ml H2O
+ NH4CL 8,29g
+ EDTA 0,037g
+ KHCO3 1g
500ml PBS
+ 10% FCS
+ 2% Mausserum
RIPA-Puffer
+ HALT
1:100
+ PMSF
1:100
+ NaF
1:1000
+ Ortho-Vanadat
1:1000
+ β-Glycerol
1:1000
PBS
+ 5% Milchpulver
1000ml H2O
+ 14,4g Glycin
+ 3,025g TRIS (MW 121)
+ 10% Methanol
15
MATERIAL
Running Buffer 10x (Western Blot)
Trenngel 12% (Western Blot)
Sammelgel (Western Blot)
ECL (Western Blot)
T-BST (Western Blot)
4.3.
500ml H2O
+ 72g Glycin
+ 15,1g TRIS (MW 121)
+ 5g SDS
2,7ml Aqua dest.
+ 2,7ml 40% Acrylamid
+ 1,8ml 1,88M Tris (ph 8,8)
+ 1,8ml 0,5% SDS
+ 45µl 10% Ammoniumpersulfat
+ 7,5µl TEMED
1,87ml Aqua dest.
+ 0,53ml 40% Acrylamid
+ 0,8ml 0,625M Tris
+ 0,8ml 0,5% SDS
+ 20µl 10% Ammoniumpersulfat
+ 4µl TEMED
2ml 1M TRIS
+ 200µl Luminol
+ 89µl p-Cumarsäure
+ 17,7ml H2O bidest.
+ 6µl H2O2 35%
1000ml PBS
+ 0,5ml Tween
Antikörper/ ELISA/ BCA-Assay
4.3.1. Antikörper für durchflusszytometrische Analysen
Antikörper
CD27
CD27
Fluorochrom
PE
FITC
Klon
LG.3A10
LG.3A10
CD4
FITC
YTS 191.1.2
CD11b
FITC
M1/70.15.11.5
CD11b
CD11b
NKp46
Horizon
APC
FITC
M1/70
M1/70
29A1.4
NKp46
NKp46
CD3
CD3
NK1.1
CD8
CD8
CD8
CD11c
DX5
CD44
CCR7
CD62L
Horizon
PE
FITC
PerCP
PE/Cy7
APC
APC H7
PeCy7
PE
APC
FITC
PE
APC
29A1.4
29A1.4
17A2
145-2C11
PK136
53-6.7
53-6.7
53-6.7
N418
DX5
IM7
4B12
MEL-14
Firma
BD
Biolegend,
San Diego, USA
Immunotools,
Friesoythe, Dtl.
Miltenyi,
Bergisch
Gladbach, Dtl.
BD
BD
eBioscience,
San Diego, USA
BD
Biolegend
BD
BD
BD
eBioscience
BD
eBioscience
eBioscience
Miltenyi
Biolegend
Biolegend
Biolegend
Verdünnung
1:300
1:300
1:300
1:200
1:300
1:200
1:300
1:300
1:100
1:300
1:100
1:300
1:300
1:50
1:300
1:300
1:20
1:300
1:300
1:300
16
MATERIAL
Antikörper
AnnexinV
DAPI
Fluorochrom
FITC
-
Klon
-
Firma
Verdünnung
Immunotools
1:30
Applichem, St. Louis, 1:1000
USA
4.3.2. Western Blot Antikörper
AK primär
HSP70
p53
Größe
72 kDa
55 kDa
Spezifität
mouse
rabbit
Actin
43 kDa
rabbit
HMGB-1
26 kDa
mouse
Survivin
17 kDa
rabbit
AK sekundär
anti-rabbit
anti-mouse
Detektion
HRP
HRP
Firma
BD
Cell Signaling,
Danvers, USA
Sigma-Aldrich,
St. Louis, USA
Millipore,
Billerica, USA
Abcam,
Cambridge, UK
Firma
Millipore
Millipore
Verdünnung
1:300
1:1000
Belichtung
60 sec
30 sec
1:2000
60 sec
1:1000
60 sec
1:1000
60 sec
Verdünnung
1:40000
1:10000
Inkubation
60 min
60 min
4.3.3. Histologie Antikörper
Antikörper
CD3
Spezifität
rabbit
Firma
Neomarkers,
Fremont, USA
Verdünnung
1:100
4.3.4. ELISA
HSP70
R&D, Minneapolis, USA
4.3.5. BCA-Assay
Pierce® Protein Assay Kit
4.4.
Thermo Scientific, Waltham, USA
Zelllinien
B16OVA-Tumorzellen
4.5.
ATCC, Wesel, Dtl.
Versuchstiere
C57Bl/6 Mäuse (♀, Alter: 6 – 10 Wochen)
Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Frankreich
Weibliche Wildtyp C57Bl/6 Mäuse wurden von der Firma Janvier erworben und unter
pathogenfreien Bedingungen in den Räumlichkeiten des Franz-Penzoldt-Zentrums,
Palmsanlage 5, der Universität Erlangen gehalten. Die Euthanasie der zuvor
narkotisierten
Mäuse
erfolgte
durch
Genickbruch.
Alle
Experimente
wurden
entsprechend des Tierschutzgesetzes durchgeführt.
17
MATERIAL
4.6.
Verbrauchsmaterialien
Kulturflaschen
FACS-Tubes
96-Well-Platten
Antikörper-Säule Protein G HiTrap 1ml
Einmalzählkammer Kova Glasstic Slide 10
Dialysefilter
Einbettkassetten Tissue Tek
Einmalsieb CellStrainer
4.7.
Geräte
Durchflusszytometer (FACS Canto)
Rotations Mikrotome (Modell RM 2145)
Gewebeneinbettautomat (Modell 2050)
Entwässerungsautomat (L2ProcessorMKII)
Ausgießstation Tissue Tek
Brutschrank
4.8.
Greiner, Frickenhausen, Dtl.
BD
Omnilab Falcon, Bremen, Dtl.
GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK
Hycor, Indianapolis, USA
Thermo Scientific
Vogel, Gießen, Dtl.
BD
BD
Leica Micorsystems, Wetzlar, Dtl.
Bavimed Laborgeräte, Birkenau, Dtl.
Shandon, Frankfurt am Main, Dtl.
Sakura, Alphen aan den Rijn, NL
Thermo Scientific
Programme
FlowJo, Version 5
Prism, Version 5.0
ImageJ, Version 1.44, 2011
EndNote, Version X5, 2011
Tresstar Inc., Ashland, USA
Graph Pad Software, La Jolla, USA
National Institutes of Health, USA
Thomson Reuter, New York, USA
18
METHODEN
5.
Methoden
5.1.
Basismethoden
5.1.1. Durchflusszytometrie
Die durchflusszytometrische Messung, häufig auch als FACS (fluorescence-activatedcell-sorter)- Analyse bezeichnet, ermöglicht es, einzelne Zellen durch einen Laserstrahl
anzuregen und so deren Autofluoreszenz sowie deren Streulicht aufzuzeichnen. Das
Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC) ist ein Maß für die Größe einer Zelle, das
Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC) hingegen für die Granularität der Zelle. Die
Zellen können mit mehreren Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern markiert werden,
die sich gegen bestimmte Oberflächenstrukturen oder auch intrazelluläre Stoffe, wie
beispielsweise IFN-γ, richten.
5.1.2. Aufreinigung des inhibierenden anti-NK1.1-Antikörpers
In einer Reihe von in-vivo Versuchen wurden die NK-Zellen einer Versuchsgruppe
durch einen inhibierenden Antikörper gegen NK1.1 depletiert. Der Antikörper wurde
aus Aszites von nu/nu- Mäusen, die mit der Hybridom-Zelllinie PK136 injiziert waren,
aufgereinigt. Das hier verwendete Ausgangsmaterial wurde von der Arbeitsgruppe um
Prof. Dr. L. Zitvogel (Institut Gustave Roussy, Villejuif, Frankreich) zur Verfügung
gestellt. Um Verunreinigungen und Proteinaggregate zu entfernen, wurde der Aszites
zentrifugiert (10min, 500G, 4°C) und anschließend nur der Überstand weiterverwendet.
Dieser wurde zuerst steril filtriert und dann über eine spezielle Bead-beladene Säule
gepumpt, an welcher der anti-NK1.1-AK gebunden wurde. Die Elution des gebundenen
Antikörpers erfolgte mittels Glycin. Dabei wurden Fraktionen von 0,5ml in
Reaktionsgefäßen aufgefangen und unmittelbar mit 3M TRIS (pH9) gepuffert. Der
Proteingehalt der so gewonnenen Proben wurde photometrisch bestimmt. Die Proben
mit den höchsten Konzentrationen wurden anschließend gepoolt. Je 1µl dieser Probe
wurde unverdünnt und zehnfach verdünnt auf ein 12%iges Acrylamidgel aufgebracht.
Nach der elektrischen Auftrennung wurden die Banden direkt auf dem Gel mittels
Coomassiblau sichtbar gemacht, siehe Abbildung 1, und eine Abschätzung der
Proteinmenge konnte vorgenommen werden. Dabei wurde die Bande des neu
hergestellten Antikörpers mit Banden eines bekannten IgG-Antikörpers verglichen.
19
METHODEN
Abb.1: Scan des Acrylamidgels. Links auf dem Gel ist der Größenstandard (GS) sichtbar,
mittig sie Banden eines bekannten IgG-Antikörpers. Die Proben, die untersucht werden sollten,
wurden rechts aufgetragen. Dabei entspricht die breitere Bande der unverdünnten (uv), die
schmälere Bande der zehnfach verdünnten (1:10) Probe.
Die AK-Lösung wurde über Nacht mit Hilfe eines Filters gegen PBS dialysiert und
danach steril filtriert. Die Aufbewahrung des Antikörpers erfolgte bis zu dessen Einsatz
in Aliquots bei -80°Celsius.
5.1.3. In-vivo Austestung des hergestellten anti-NK1.1-Antikörpers
Um sicherzustellen, dass der hergestellte Antikörper auch wie gewünscht die NKZellen bindet und diese daraufhin absterben, wurde Mäusen 200µg Antikörper i.p.
injiziert. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet und ihre Milzen entnommen. Die
Splenozyten wurden zu einer Einzelzell-Suspension verarbeitet, siehe 5.5.2., mit
Antikörpern gefärbt und anschließend mittels Durchflusszytometer analysiert.
Färbung „Depletion“
Antigen
CD3
NK1.1
NKp46
DX5
Fluoflrochrom
FITC
PeCy7
PE
APC
Tab.1: Übersicht über die Antikörper zur Austestung des Anti-NK1.1-Antikörpers.
Murine NK-Zellen exprimieren verschiedene Oberflächenmarker, über die sie
klassifiziert werden können. Mit NK1.1, Nkp46 und DX5, siehe Tabelle 1, werden drei
wichtige murine NK-Zell-Marker abgedeckt. Mit vorliegender Färbung konnte
sichergestellt werden, dass die NK-Zellen auch tatsächlich eliminiert waren und sie
nicht nur maskiert wurden, was prinzipiell bei einer reinen CD3/ NK1.1- Färbung
möglich wäre, da Eliminations- und Analyseantikörper vom gleichen Klon (PK136)
abstammten. In weiteren Versuchen wurden vorwiegend Antikörper gegen NK1.1 und
NKp46 verwendet. NKp46 ist als spezifischer NK-Zell Marker in Mensch und Maus zu
finden [98].
20
METHODEN
5.1.4. Auszählen von Zellen
Die Zellen wurden mit Hilfe einer Einmalzählkammer gezählt. Dafür wurden die Zellen
in eine definierte, an die Größe des Zellpellets angepasste, Menge R10 (Xµl)
aufgenommen. 10µl wurden abgenommen und in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte
pipettiert, die zuvor mit 90 µl Färbelösung gefüllt wurde. B16OVA-Tumorzellen wurden
mit 0,1% Trypanblau, Splenozyten mit Hayemblau gefärbt. Aus diesen 100µl wurden
10µl abpipettiert und auf die Zählkammer gegeben. Unter der 10x Vergrößerung eines
Lichtmikroskops wurden beliebige drei der neun größeren Kästchen der Zählplatte, die
wiederum jeweils in 9 kleinere Kästchen unterteilt sind, ausgezählt, siehe z.B. graue
Bereiche in Abbildung 2. Zellen, die auf dem Rand lagen, wurden von der Zählung
ausgeschlossen. Aus den Ergebnissen der ausgezählten Kästchen wurde der
Mittelwert gebildet und die Zellkonzentration über die folgende Gleichung berechnet:
Mittelwert * 9 (Kammerfaktor) *10 (Verdünnungsfaktor) * Xµl = Zellen/ Xµl.
Abb.2: Zellverteilung auf der Zählkammer. Die Punkte entsprechen beispielhaft Zellen.
5.1.5. Statistische Auswertungen
Die Daten wurden mit dem Statistikprogramm Prism5 ausgewertet und graphisch
dargestellt. Abhängig vom Versuchsaufbau und der Zusammensetzung der Gruppen
wurde zwischen „2way ANOVA Analyse mit Bonferroni Posttests“ und „t-Test mit
Mann-Whitney Test, two-tailed“ gewählt. Die jeweils verwendete Analyse ist im
Ergebnisteil unter den Abbildungen nochmal benannt. Die graphische Darstellung
erfolgte
bei
der
Analyse
der
Immunantwort
nach
Vakzinierung
mittels
Säulendiagrammen und bei der Tumorimmunität in-vivo mittels Verlaufskurven der
Tumorgrößen.
Das
Signifikanzniveau
wurde
über
den
p-Wert
festgelegt.
Zusammenhänge sind wie folgt bezeichnet: p < .05 *, p < .01 **, p < .001 ***.
Alle bestehenden Signifikanzen sind in den Abbildungen angegeben. Analysen mit
p ≥ .05 gelten als nicht signifikant (ns) und sind in den Abbildungen teilweise nicht
explizit markiert.
21
METHODEN
5.2.
Überblick über alle Versuche
Alle beschriebenen in-vitro, in-vivo und ex-vivo Versuche sind als Überblick in
Abbildung 3 dargestellt.
Kernstück dieser Arbeit war das in-vivo Vakzinierungsmodell in C57Bl/6 Mäusen.
Doxorubicin-behandelte Ovalbumin exprimierende B16 (B16OVA) Melanom Tumorzellen dienten als Vakzin. Diese Tumorzellen bzw. ihr Zellkulturüberstand wurden
vorab
in-vitro
mittels
Durchflusszytometrie, Western
Blot
und
HSP70-ELISA
charakterisiert, siehe Abbildung 3 oberer Bereich. Der Vakzinierungstag wurde als d-7
definiert. Bei einem Experiment wurde 48h nach Vakzinierung in den inguinalen
Lymphknoten getestet, ob zu diesem Zeitpunkt eine suffiziente NK-Zell-Depletion
vorlag. Die Tumorinjektion (tumor challenge) erfolgte an Tag d0. Im weiteren
Versuchsverlauf wurde die Tumorgröße in-vivo zweimal wöchentlich bis zu
Versuchsende um Tag d+18 gemessen, siehe unterer Bereich der Abbildung 3. Nach
Euthanasie
der
Mäuse
und
Organentnahme
schlossen
sich
mehrere
durchflusszytometrische Analysen der Splenozyten an, unter anderem eine nochmalige
Überprüfung der NK-Zell-Depletion. Des Weiteren wurden entnommene Tumore
histologisch ausgewertet.
Abb.3: Überblick über alle durchgeführten Analysen im Rahmen des murinen
Vakzinierungsmodells. Im oberen Bereich der Abbildung sind die in-vitro Analysen, die an
Doxorubicin-behandelten B16OVA-Melanomzellen und ihrem Kulturüberstand durchgeführt
wurden, dargestellt. Der untere Bereich illustriert den Ablauf der in-vivo/ ex-vivo Messungen.
Verdeutlicht ist hier zudem, dass die NK-Zell-Depletion ab zwei verschiedenen Zeitpunkten aber
immer bis zu Versuchsende vorlag.
22
METHODEN
5.3.
In-vitro Versuche
5.3.1. Kultivierung der B16OVA-Zellen und Behandlung mit Doxorubicin
Murine B16OVA-Zellen wurden in Zellkultur bei 37°C/5%CO2 kultiviert. Die Behandlung mit 1µM Doxorubicin für 24h erfolgte in der Kulturflasche an den adhärenten
Zellen. Nach der Inkubationszeit wurde der Überstand abgenommen und bei -80°C bis
zur Verwendung im HSP70-ELISA konserviert. Die zurückgebliebenen adhärenten
Zellen wurden mit PBS gespült, mit Hilfe von Trypsin geerntet, abzentrifugiert, in RPMI
mit Hilfe einer Zählkammer ausgezählt (siehe 5.1.4.) und schließlich entweder zur
Analyse ihrer Viabilität am Durchflusszytometer vermessen, zu Western-Blot-Lysaten
verarbeitet oder im Rahmen des in-vivo Vakzinierungsmodells in die Maus injiziert.
Dieser Zeitpunkt wurde in den folgenden in-vitro Versuchen als „0h nach Behandlung“
und in in-vivo Experimenten als „d-7“ definiert. In einigen in-vitro Versuchen war es das
Ziel, Zellen und ihren Überstand bis 96h nach chemotherapeutischer Behandlung zu
analysieren. Dafür wurde unmittelbar nach der 24stündigen Inkubation in Doxorubicin,
also
zum
Zeitpunkt
„0h
nach
Behandlung“,
ein
einmaliger
Mediumwechsel
durchgeführt. 24h, 48h und 96h später wurde der Überstand einer Kulturflasche zur
Verwendung im HSP70-ELISA abgenommen und die Zellen selber wurden im Hinblick
auf ihren apoptotischen und nekrotischen Anteil durchflusszytometrisch gemessen. Der
obere Teil von Abbildung 3 verdeutlicht dieses Vorgehen. Parallel dazu wurden
unbehandelte B16OVA-Zellen als Kontrolle in Kultur gehalten.
5.3.2. AnnexinV/ DAPI-Färbung zur Analyse der Viabilität
Um eine Aussage über den Zustand der Tumorzellen nach Behandlung mit
Doxorubicin treffen zu können, wurde ihre Viabilität über die Antikörper AnnexinV und
DAPI, siehe auch Tabelle 2, beurteilt. Das mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Protein
AnnexinV bindet in Anwesenheit von Calcium spezifisch an das Phospholipid
Phosphatidylserin. In viablen Zellen ist Phosphatidylserin an der cytoplasmatischen
Seite der Zellmembran lokalisiert und kann so nicht von AnnexinV gebunden werden.
Während der Apoptose kommt es zu einer Translokation des Phosphatidylserins von
der Innenseite auf die Außenseite der Zellmembran und wird damit über AnnexinV
detektierbar. AnnexinV bindet auch Phosphatidylserin spätapoptotischer/ nekrotischer
Zellen, da ihre Zellmembranen durchlässig werden. Im Verlauf des nekrotischen
Zelluntergangs kommt es zum Verlust der Membranintegrität der Zelle und der DNAInterkalator DAPI dringt ein und kann detektiert werden [51]. So gelingt mit diesen
beiden Färbungen (AnnexinV-FITC und DAPI) die Unterscheidung zwischen viablen,
frühapoptotischen und spätapoptotischen/ nekrotischen Zellen. Viable Zellen sind
23
METHODEN
AnnexinV-/ DAPI-, frühapoptotische Zellen AnnexinV+/ DAPI- und spätapoptotische/
nekrotische Zellen AnnexinV+/ DAPI+.
Diese Färbung erfolgte in calciumhaltiger Ringer-Lösung und wurde 15min lang bei
Raumtemperatur im Dunklen durchgeführt. Danach mussten die Zellen direkt, ohne
Waschschritt, analysiert werden.
Färbung „Viabilität“
Antigen
AnnexinV
DAPI
Fluorochrom
FITC
-
Tab.2: Übersicht über die Antikörper der Viabilitäts-Färbung der B16OVA-Zellen.
5.3.3. Western-Blot zur Analyse intrazellulärer Proteinexpression
Ein Western Blot ermöglichte die Analyse der intrazellulären Proteinexpression von
B16OVA-Zellen nach Behandlung mit Doxorubicin.
Lysatherstellung
Die B16OVA-Melanomzellen wurden nach der Auszählung zentrifugiert und der
Überstand wurde dekantiert. Das Zellpellet wurde in 1ml PBS resuspendiert und in ein
1,5ml Reaktions-Gefäß überführt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurde
der Überstand vorsichtig abgenommen und verworfen. Die zurückbleibenden Zellen
wurden nun mittels RIPA-Lysepuffer 25min auf Eis lysiert. Die Menge des Lysepuffers
orientierte sich dabei an der Zellzahl. Nach der Inkubationszeit wurde bei maximaler
Geschwindigkeit (10000G, 4°C) für 10min zentrifugiert. Im Überstand waren nun
Proteine gelöst, die später im Western Blot detektiert werden sollten. Die
Proteinkonzentration wurde im BCA-Assay, der laut Herstellerangaben durchgeführt
wurde, gemessen. Um die Proteine haltbar zu machen, wurden sie 1:1 in den
Ladepuffer Lämmli aufgenommen, 5min bei 95°C denaturiert und bei -20°C bis zu ihrer
weiteren Verwendung eingefroren.
Elektrische Auftrennung
Für den Western Blot wurde ein 12%ige Acrylamidgel gegossen, das sich in Sammelund Trenngel unterteilte. Die sog. Taschen, in die das Protein geladen wurde, lagen im
Sammelgel. Die Proben wurden aufgetaut und 20µg Protein wurden jeweils in eine
Tasche pipettiert. Zusätzlich wurden 5µl des Größenstandards separat aufgetragen.
Die elektrische Auftrennung erfolgte bei 130V für 60-90min.
Blotting
Es schloss sich die Übertragung, das sog. „Blotten“, der Proteine auf eine ImmobilionP-Membran an. Die Wet-Blot-Methode wurde bei 130mA über 90min durchgeführt.
Dabei war zu beachten, dass Kammer und Umgebung mit Eis gekühlt wurden, da
durch den Stromfluss Hitze entstand.
24
METHODEN
Blocken und primärer Antikörper
Um unspezifische Proteinbindungen auszuschließen, wurde die Membran in Milch für
30min auf dem Schwenktisch bei Zimmertemperatur geblockt. Die Membran wurde 3x
für 10min mit TBS-T gewaschen, dann wurde 12h mit primärem Antikörper inkubiert, 3x
mit TBS-T gewaschen und schließlich wurde die Membran mit dem sekundären
Antikörper inkubiert.
Sekundärer Antiköper und Proteindetektion
Der sekundäre Antikörper, anti-mouse oder anti-rabbit je nach Eigenschaft des
primären Antikörpers, wurde in Milch verdünnt. Die Membran wurde darin 60min
inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten konnte die Visualisierung erfolgen. Hierfür
wurde das Enzym Meerrettichperoxidase (HRP, horseradish peroxidase) verwendet,
welches an den sekundären Antiköper gekoppelt war. Die Membran wurde für 45sec in
die Entwicklerlösung ECL getaucht und in einer Fotokassette platziert. In einem
dunklen Fotolabor wurde Fotopapier in der Kassette auf der Membran platziert und 3060sec belichtet. Die Entwicklungsmaschine AGFA der Strahlenklinik, Uniklinik
Erlangen, machte die Proteinbanden sichtbar.
Sollte ein weiteres Protein detektiert werden, wurde die Membran 3x gewaschen und
der nächste primäre Antikörper über Nacht inkubiert. Alle weiteren Schritte
wiederholten sich wie oben beschrieben.
Gelquantifizierung
Die Gelquantifizierung bei ungleichmäßiger Ladekontrolle wurde mit dem Programm
ImageJ durchgeführt.
5.3.4. HSP70-ELISA aus Zellkulturüberstand
Um die Frage zu klären, wie viel HSP70 Doxorubicin-behandelte Tumorzellen
freisetzen, wurde ein HSP70-ELISA aus Zellkulturüberstand durchgeführt. Der
Überstand wurde, wie unter Abschnitt 5.3.1. beschrieben, zu verschiedenen
Zeitpunkten nach Behandlung mit Doxorubicin entnommen und bis zur Verwendung im
ELISA bei -80°C aufbewahrt.
ELISA steht für „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ und zählt zu den quantitativen
Immunoassays. Wie in Abbildung 4 schematisch dargestellt wurde der ELISA nach
Herstellerangaben durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf die Zellzahl der jeweiligen
Kulturflasche, aus der der Überstand stammte, umgerechnet.
25
METHODEN
Abb.4: Schematisch Darstellung des HSP70-ELISAs.
5.4.
In-vivo Versuche
5.4.1. In-vivo Vakzinierungsmodell mit NK-Zell-Depletion
B16OVA-Zellen wurden, wie in Abbildung 3 dargestellt, mit Doxorubicin behandelt. Je
1x106 Zellen wurden in 100µl PBS aufgenommen und subkutan in den Oberschenkel
der Maus injiziert. Diese Injektion an Tag d-7 stellte die Tumorvakzinierung dar. Eine
Woche später, d0, wurden der Maus 0,2x106 unbehandelte, vitale B16OVAMelanomzellen in den kontralateralen Oberschenkel, auch subkutan, injiziert.
Im weiteren Verlauf wurde zweimal wöchentlich das Tumorwachstum zweidimensional
über den horizontalen und vertikalen Durchmesser mit einem Kalimeter in mm
gemessen.
Zusätzlich wurden der Hälfte der vakzinierten Mäuse die NK-Zellen durch einen
inhibierenden Antikörpers gegen NK1.1, einer Oberflächenstruktur muriner NK-Zellen,
depletiert. Initial wurden einmalig 200µg des Antikörpers, 2-4 Tage später 100µg und
im weiteren Verlauf alle 7 Tage 100µg intraperitoneal gespritzt.
Zwei Typen von NK-Zell-Depletionen im Hinblick auf den depletierten Zeitraum wurden
unterschieden. Bei „DoxoB16+NK-Depl. kompletter ZR“ wurde mit der Depletion vier
Tage vor der Vakzinierung (d-11) begonnen, bei „DoxoB16+NK-Depl. später ZP“ erst
zwei Tage vor der Tumorinjektion (d-2). Beides Mal wurde die Depletion bis zu dem
Versuchsende aufrechterhalten.
Neben den vakzinierten Mäusen wurde eine Kontrollgruppe mitgeführt, die am Tag d-7
100µl PBS anstatt Doxorubicin-behandelter B16OVA-Tumorzellen injiziert bekam. Der
restliche Versuchsablauf war identisch.
26
METHODEN
Der Versuch wurde 18 Tage nach der Tumorinjektion, d+18, beendet. Nach Euthanasie
der Mäuse wurden ihre Milzen entnommen und die Tumoren freipräpariert.
5.5.
Ex-vivo Versuche
5.5.1. Ex-vivo Zellaufbereitung und Färbung der Lymphknotenzellen
Isolation der Lymphknotenzellen
Ein drainierender inguinaler Lymphknoten (LK) der Vakzinierungsstelle wurde
entnommen und gekühlt bis zur weiteren Untersuchung gelagert. Der Lymphknoten
wurde in eine leere Petrischale transferiert, von dort in eine weiterer mit RPMI gefüllte
überführt, in welcher er von dem Fettkörper und Haaren befreit wurde. In einer neuen
Schale wurde die Oberfläche des Lymphknotens mit einem Skalpell eingeritzt und in
einer letzten Schale wurde er durch ein Zellsieb mit einer Maschenweite von 100µm
gedrückt, wodurch die einzelnen Lymphknotenzellen freigesetzt wurden. Die Zellen
wurden für jeden Lymphknoten einzeln in einem 50ml Falcon aufgefangen. Pro
Lymphknoten wurden neue Petrischalen und ein neues Sieb verwendet. Das Falcon
wurde zentrifugiert und in einer definierten Menge R10 resuspendiert und gezählt.
Zellvorbereitung und Oberflächenfärbung mit T- und NK-Zell-Markern
Die Lymphknotenzellen wurden auf FACS-Tubes, verteilt, dabei wurden pro ProbenTube 5x106 Zellen eingesetzt. Es wurde eine Oberflächenfärbung mit T-Zell/ NK-ZellMarkern durchgeführt. Diese erfolgte direkt in den FACS-Tubes.
Die in R10 gelagerten Zellen wurden zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und
das Zellpellet in 50µl Blocking Buffer plus 0,5µl Fc-Block für 30min bei 4°Celsius
inkubiert. Dieser Schritt war notwendig, um unspezifische Antikörperbindungen
auszuschließen. Gefärbt wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Antikörper in weiteren
50µl Blocking Buffer.
Färbung
„T- / NK-Zellen LK“
Antigen
CD11c
CD3
CD4
CD8
NK1.1
Fluorochrom
PE
PerCP
FITC
APC
PE/Cy7
Tab.3: Übersicht über die Antikörper der Oberflächenfärbung der Lymphknotenzellen.
Die Zellen wurden zusammen mit der Färbelösung für 20min bei 4°C und Dunkelheit
inkubiert. Um überschüssigen, nicht an Zelloberflächen gebundenen Antikörper zu
entfernen, wurde die Zellsuspension einmal mit PBS gewaschen. Nun schloss sich die
durchflusszytometrische Messung an.
27
METHODEN
5.5.2. Ex-vivo Zellaufbereitung und FACS-Färbung der Splenozyten
Zellisolation und Färbung der Splenozyten
Die aus in-vivo Versuchen gewonnenen Milzen wurden unmittelbar nach der Entnahme
aus der Maus in RPMI gekühlt in das Labor gebracht. Die Zellisolation aus den Milzen
erfolgte identisch zu der aus den Lymphknoten (siehe 5.5.1.) mit einem Unterschied:
Da der Anteil der Erythrozyten in der Milz deutlich höher als im Lymphknoten ist,
musste hier zusätzlich eine Erythrozyten-Lyse mit ACK-Puffer durchgeführt werden.
Dazu wurden die Splenozyten direkt nach Freisetzung aus der Milz und einmaligem
Zentrifugationsschritt in 2ml PBS und 2ml ACK-Puffer aufgenommen. Nach
10minütiger Inkubationszeit bei 4°C wurde die Lyse durch die Zugabe von 10ml PBS
gestoppt. Die Zellsuspension wurde erneut gefiltert, um weitere Verunreinigungen und
Zellaggregate zu beseitigen. Weiteres Vorgehen ist in Abschnitt 5.5.1. „Isolation der
Lymphknotenzellen“ und „Zellvorbereitung und Oberflächenfärbung mit T- und NK-ZellMarkern“ beschrieben.
Die Splenozyten wurden wie in Tabelle 4 aufgeführt gefärbt und nach einem
Waschschritt mit PBS durchflusszytometrisch analysiert. Zu beachten ist, dass
Färbung 2, als reine NK-Zell-Färbung, nur mit Splenozyten von Tieren durchgeführt
wurde, die nicht NK-Zell depletiert waren.
Antigen
CD11c
CD3
CD4
CD8
NK1.1
Fluorochrom
PE
PerCP
FITC
APC
PE/Cy7
Färbung 2
„NK-Zellen Milz“
CD27
CD3
NKp46
CD11b
NK1.1
PE
PerCP
FITC
APC
PE/Cy7
Färbung 3
„Gedächtnis-T-Zellen Milz“
CCR7
CD3
CD44
CD62L
CD8
NKp46
PE
PerCP
FITC
APC
APC H7
Horizon
Färbung 1
„T-Zellen Milz“
Tab.4: Übersicht über die Antikörper-Färbungen der Splenozyten. Färbung 2 wird nur mit
Splenozyten von Tieren durchgeführt, die nicht NK-Zell depletiert sind.
Es ist wichtig, die Zellen vor und während der durchflusszytometrischen Messung
dunkel und bei 4°C aufzubewahren, damit eine Erschöpfung der Fluorochrome und die
Bildung von Zellaggregaten möglichst vermieden werden.
28
METHODEN
5.5.3. Histologische Auswertung der CD3-Infiltration im Tumor
Präparation des Tumorgewebes und histologische Gewebeaufarbeitung
Die zu Versuchsende gewonnenen Tumoren wurden in 4%igen Formalin fixiert, 24h
darin aufbewahrt, in NaCl umgelagert und schließlich zur Herstellung von
histologischen Schnitten der Nephropathologie der Uniklinik Erlangen übergeben.
Dort wurden die Biopsate mit einer Klinge der Länge nach halbiert und in
Einbettkassetten einem Entwässerungsautomaten zugeführt, der das Gewebe in einer
aufsteigenden Isopropanolreihe und dem Intermedium Tetrachlorethylen über einen
Zeitraum von acht Stunden stufenweise dehydrierte. Danach wurden die Proben für
zwei Stunden in flüssiges Paraffin eingelegt und anschließend an einer Ausgießstation
in Paraffin eingebettet.
Mit Hilfe eines Rotationsmikrotoms wurden pro Tumor mehrere 1μm dicke Schnitte
hergestellt und in einem Wasserbad auf z.T. silanisierte Objektträger aufgezogen. Die
Schnitte wurden zum einen für die morphologische Untersuchung mit Hämatoxylin und
Eosin (HE), zum anderen für die immunhistochemische Auswertung mit einem Marker
für CD3 gefärbt.
Histologische Auswertung über einen Score
Die histologische Auswertung erfolgt am Lichtmikroskop mit Gitter. Es wurde die
10fache Vergrößerung gewählt. Per Auge wurde das Präparat durchgemustert und
dabei wurden CD3+ Zellen, die rot imponierten, gezählt. Über die Zellzahl pro Gitter
wurde ein Score, siehe Tabelle 5, erhoben.
CD3+ Zellen pro Gitter
keine
<10
10-20
>20
Score
0
1
2
3
Tab.5: Angewendeter Score der histologischen Auswertung.
Es wurden pro Präparat vier Regionen, wie in Abbildung 5 aufgezeigt, betrachtet. Das
waren erstens Muskelgewebe, zweitens das Stroma, drittens der Tumorrand und
viertens das Tumorzentrum.
29
METHODEN
Abb.5: Histologisches Bild eines B16OVA-Melanomtumors nach Entnahme aus der Maus
bei Versuchsende. Gekennzeichnet sind die 4 Regionen in denen der Score erhoben wurde
+
und CD3 Zellen, die rot gefärbt sind.
30
ERGEBNISSE
6.
Ergebnisse
6.1.
In-vitro Analyse der Effekte von Doxorubicin auf B16OVA
B16OVA-Zellen, die mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin behandelt wurden,
dienten in-vivo als Vakzin. Zur Charakterisierung des Vakzins wurden mehrere in-vitro
Analysen durchgeführt. Abbildung 6 verdeutlicht schematisch den Versuchsablauf.
t=0/ 24/ 48/ 96h entspricht den Analysezeitpunkten.
Abb.6: Schematische Darstellung des Ablaufs der in-vitro Versuche.
6.1.1. Überprüfung der Induktion von Apoptose und Nekrose
B16OVA-Zellen wurden bis 96h nach Beendigung der Doxorubicin-Behandlung in
Kultur gehalten und während dieser Zeit mehrfach im Hinblick auf ihre Viabilität
untersucht.
Abbildung 7 zeigt repräsentativ Dot-Plots unbehandelter Tumorzellen zum Zeitpunkt
t=0h (=Kontrolle) und Doxorubicin-behandelter Tumorzellen (=DoxoB16) zu den
Zeitpunkten t=24h, t=48h und t=96h. Bei der Auswertung der DurchflusszytometerRohdaten wurde zuerst die Morphe eingegrenzt (linke Reihe), dann wurden
Einzelzellen (Singulets) bestimmt (mittlere Reihe) und im dritten Schritt wurde ein Gate
gesetzt, welches apoptotische Zellen über AnnexinV+/DAPI- und nekrotische Zellen
über AnnexinV+/DAPI+ festlegte (rechte Reihe). „Viable Zellen“, wie sie in folgenden
Abbildungen z.T. als Achsenbeschriftung vorhanden sind, entsprechen dem Singulet
sowie Annexin- und DAPI-negativen Zellen.
Bei Betrachtung der absoluten Zellzahlen (Daten nicht gezeigt) fiel auf, dass ein Teil
der behandelten Tumorzellen bereits während der 24stündigen Inkubation in
Doxorubicin
starben.
Da
tote
Zellen
ihre
Adhäsionsfähigkeit
an
der
Kulturflaschenoberfläche verlieren, wurden hier bewusst nur adhärente Zellen
gemessen. Diese Zellen hatten durch das Doxorubicin zwar einen Stressstimulus
erhalten, waren jedoch nicht durch den unmittelbaren zytotoxischen Effekt des
Chemotherapeutikums gestorben.
31
ERGEBNISSE
Abb.7: Repräsentative durchflusszytometrische Messungen unbehandelter (=Kontrolle)
und Doxorubicin-behandelter (DoxoB16) Tumorzellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach
Behandlung. t=0h entspricht dem Zeitpunkt unmittelbar nach 24stündiger Inkubation in 1µM
+
Doxorubicin. Apoptotische Zellen sind als Annexin /DAPI , nekrotische Zellen als
+
+
AnnexinV /DAPI definiert.
Die Zellen, die mit Doxorubicin behandelt wurden, zeigten im FSC-SSC Dot-Plot
zunehmend eine Verschiebung nach rechts oben. Sie waren somit größer und wiesen
eine höhere Granularität auf. 24h nach Behandlung bildete sich bereits eine kleine
Population rein apoptotischer Zellen heraus, die im weiteren Zeitverlauf deutlich an
Größe gewann und zum Zeitpunkt t=96h einen circa vierfach so großen Anteil im
Vergleich zu unbehandelten Zellen ausmachte (Abbildung 7 rechte Reihe).
32
ERGEBNISSE
Abb.8: Apoptose und Nekrose adhärenter B16OVA-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Behandlung mit 1µM Doxorubicin im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Der
statistische Wert des Zeitpunkts t=0h wurde aus sechs vergleichbaren, unabhängigen
Experimenten gemittelt, die weiteren Zeitpunkte stellen jeweils das Ergebnis eines Versuch dar.
(t=0h: n=6, t-Test mit Mann-Whitney Test, two-tailed, Analysen nicht signifikant; t=24/48/96h:
n=1, keine statistische Analyse durchgeführt)
Der Anteil apoptotischer Zellen war in der unbehandelten Kontrolle zu allen
gemessenen Zeitpunkten ungefähr gleich hoch. Im Gegensatz dazu nahmen die
apoptotischen Zellen der Doxorubicin-behandelten Gruppe kontinuierlich von ca. 4%
zum Zeitpunkt t=0h bis auf 17% zum Zeitpunkt 96h zu (Abbildung 8A). Bei Betrachtung
der nekrotischen Zellen zeigte sich ein ähnlicher Verlauf. Ab 48h nach Behandlung
stieg der Anteil nekrotischer Zellen in der Doxorubicin-behandelten Gruppe deutlich an,
illustriert in Abbildung 8B.
Es konnte eine Induktion von Apoptose und Nekrose in B16OVA-Zellen durch das
Chemotherapeutikum Doxorubicin gezeigt werden.
6.1.2. Charakterisierung der intrazellulären Proteinexpression
Unmittelbar nach 24stündiger Inkubation in Doxorubicin wurden Lysate der
Tumorzellen hergestellt, um die intrazelluläre Proteinexpression von Survivin, p53,
HSP70 und HMGB1 zu beurteilen. Als Ladekontrolle diente Aktin.
Es zeigte sich eine erhöhte Expression von Survivin in Doxorubicin-behandelten
Zellen. Gleichläufig stieg p53 deutlich an. Die Bande des HMGB1, das als Alarmstoff
bei Nekrose freigesetzt wird, war nach Doxorubicin-Behandlung schwächer als die der
Kontrolle. Es fiel weiterhin eine Abnahme des Gefahrensignals HSP70 auf.
33
ERGEBNISSE
Abb.9: Western Blot Banden der Proteine Survivin, p53, HSP70, HMGB1 und der
Ladekontrolle Aktin. Die Lysate stammten von unbehandelten Kontroll (K)- und Doxorubicinbehandelten (D)- B16OVA-Zellen zu dem Zeitpunkt t=0h. Repräsentativ dargestellt sind die
Banden eines von zwei unabhängigen Versuchen.
Die Behandlung von Doxorubicin führte somit in den Tumorzellen zu intrazellulären
Veränderungen bestimmter Gefahren- und Todessignale.
6.1.3 Messung der HSP70-Freisetzung
Ein HSP70-ELISA wurde aus Zellkulturüberstand, der zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Inkubation in Doxorubicin entnommen wurde, durchgeführt. Die Rohdaten wurden
auf die Zellzahl der jeweiligen Kulturflasche, aus der der Überstand stammte,
umgerechnet. Es stellte sich ein deutlicher Unterschied zwischen Kontrolle und
DoxoB16 zu allen gemessenen Zeitpunkten heraus. Die HSP70-Konzentration der
Doxorubicin-behandelten
Zellen
war
um
ein
Vielfaches
höher
als
die
der
unbehandelten Kontrollzellen.
6
Abb.10: Extrazelluläre HSP70-Konzentration in pg/1x10 Zellen. Die Proben wurden aus
Zellkultur-Überstand zu verschiedenen Zeitpunkten nach Doxorubicin-Behandlung gewonnen.
(t=0h/24h: n=1-2, keine statistische Analyse durchgeführt; t=48h/96h: n=2, 2way ANOVA
Analyse mit Bonferroni Posttests, ** p < .01)
34
ERGEBNISSE
Der Anstieg des im ELISAs nachgewiesenem extrazellulären HSP70, Abbildung 10,
und der im Western Blot sichtbare Abfall der intrazellulären HSP70 Konzentration,
Abbildung 9, deuteten auf eine Induktion der HSP70 Freisetzung durch die Behandlung
mit Doxorubicin hin.
6.2.
In-vivo Vakzinierungsmodell
In-vitro Vorarbeiten, wie in Abschnitt 6.1. beschrieben, waren die Grundlage für die
Etablierung eines in-vivo Vakzinierungsmodels in immunkompetenten C57Bl/6
Mäusen.
Wie in Abbildung 11 schematisch dargestellt und im Methodenteil, siehe 5.4.1., genau
beschrieben, wurden in-vitro mit Doxorubicin vorbehandelte B16OVA-Zellen als in-vivo
Vakzin verwendet. Die subkutane Injektion dieser apoptotischen Zellen erfolgte am Tag
d-7. Eine Woche später wurde den Mäusen unbehandelter, vitaler B16OVA-Tumor
subkutan injiziert. Dieser Zeitpunkt wurde als d0 definiert. Die Effektivität der
Vakzinierung wurde im weiteren Verlauf anhand des Tumorprogress an der
Tumorinjektionsstelle gemessen.
Abb.11: Schematische Darstellung des in-vivo Vakzinierungsmodells. Am Tag d-7 wurden
die Mäuse subkutan (s.c.) in der Flanke mit Doxorubicin-behandelten B16OVA-Zellen vakziniert.
Eine Woche später wurden ihnen vitale, unbehandelte B16OVA-Zellen am kontralateralen Bein
injiziert (Tumorinjektion). Die Tumorgröße wurde auf der Seite der Tumorinjektion bis zu
Versuchsende gemessen. Zusätzlich wurden die NK-Zellen über zwei verschiedene Zeiträume
mittels eines intraperitoneal (i.p.) applizierten AK depletiert.
35
ERGEBNISSE
Des Weiteren wurden die vakzinierten Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt: eine mit und
eine ohne NK-Zell-Depletion. Die antikörpervermittelte Depletion wurde je nach
Versuch entweder schon vor der Vakzinierung an Tag d-11 („DoxoB16 + NK-Depl.
kompletter ZR“) oder erst kurz vor der Tumorinjektion an Tag d-2 („DoxoB16 + NKDepl. später ZP“) begonnen. In welchem Zeitraum die NK-Zellen in den
unterschiedlichen
Experimenten
depletiert
waren,
kann
den
jeweiligen
Abbildungslegenden entnommen werden. Neben den vakzinierten Mäusen wurden
weitere Mäuse gehalten, die eine PBS-Injektion anstelle der Vakzinierung erhalten
hatten. Der restliche Versuchsablauf war bei ihnen identisch zu allen anderen
Gruppen. Mäuse bzw. Material von Mäusen, die keine B16OVA-spezifische
Vakzinierung erhalten hatten, wurden in Abbildungen und Text als „Kontrolle“ betitelt.
6.3.
Überprüfung der NK-Zell-Depletion nach Antikörperinjektion
Um sicherzustellen, dass eine adäquate NK-Zell-Depletion nach repetitiver anti-NK1.1Antikörpergabe bestand, wurden NK-Zellen gefärbt und durchflusszytometrisch
gemessen. Das typische Bild solch einer Analyse zeigt Abbildung 12. Sowohl die NKZellen im Lymphknoten 48h nach der Vakzinierung (Abbildung 12A), wie auch in der
Milz zu Versuchsende am Tag d+18 (Abbildung 12B) waren signifikant (p < .01)
erniedrigt. Im Lymphknoten konnte der Anteil der NK-Zellen von circa 1% in den beiden
nicht depletierten Gruppen auf 0,3%, in der Milz sogar von ungefähr 3,5% auf 0,4%
reduziert werden.
Abb.12: NK-Zell-Depletion in Lymphknoten und Milz. Abbildung A zeigt NK-Zellen des
drainierenden Lymphknotens 48h nach Vakzinierung, Abbildung B NK-Zellen der Milz bei
+
Versuchsende (d+18). NK-Zellen waren definiert als CD3 NK1.1 . (n=5-6, t-Test mit MannWhitney Test, two-tailed, ns p ≥ .05, ** p < .01)
36
ERGEBNISSE
6.4.
In-vivo Messung der Tumorprogression
Abbildung 13.1 zeigt gepoolte Daten aus vier gleichartigen, unabhängigen Versuchen.
In allen diesen Experimenten waren in einer Versuchsgruppe die NK-Zellen schon
mehrere Tage vor der Vakzinierung depletiert.
Es zeigte sich ein hochsignifikanter (p < .001) Unterschied zwischen der nicht
vakzinierten Kontrollgruppe („Kontrolle“) und beiden vakzinierten Gruppen („DoxoB16“/
„DoxoB16 + NK-Depl. kompletter ZR“). Die Mäuse der Kontrolle waren aufgrund
fehlender Vakzinierung nicht gegen die B16OVA Melanomzellen geschützt und
entwickelten sehr schnell Tumore, die ab Tag d+13 signifikant größer waren als die der
vakzinierten Vergleichsgruppen.
Wurden
die
zwei
DoxoB16-vakzinierten
Gruppen
untereinander
verglichen,
manifestierte sich erst ab Tag d+17 ein Unterschied. Die NK-Zell-depletierte Gruppe
zeigte tendenziell kleinere Tumoren. Zum Zeitpunkt d+17 war diese Differenz jedoch
noch nicht signifikant. In einem, in Abbildung 13.2 separat abgebildeten, Versuch
konnte diese Tendenz ab Tag d+22 als signifikant (p < .01) bestätigt werden.
Abb.13.1: Tumorprogress bei Vakzinierung und NK-Zell-Depletion über den kompletten
Zeitraum. Gepoolte Daten der Tumorgröße im Zeitverlauf ab dem Tag der Tumorinjektion aus
vier unabhängigen Versuchen mit NK-Zell-Depletion über den kompletten Versuchszeitraum
(ZR). Ab d+13 wurden die Unterschiede zwischen der Kontrolle und den DoxoB16-vakzinierten
Gruppen signifikant (** p < .01). Die Signifikanzen sind aus Gründen der Übersichtlichkeit in der
Abbildung nur für Tag d+17 dargestellt. (n=21-24, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni
Posttests, *** p < .001)
37
ERGEBNISSE
Abb.13.2: Tumorprogress bei Vakzinierung und NK-Zell-Depletion über den kompletten
Zeitraum. Repräsentative Daten der Tumorgröße eines Versuchs im Zeitverlauf ab dem Tag
der Tumorinjektion mit NK-Zell-Depletion über den kompletten Versuchszeitraum. Die
Signifikanzen sind aus Gründen der Übersichtlichkeit nur für Tag d+22 dargestellt. (n=7-8, 2way
ANOVA Analyse mit Bonferroni Posttests, ** p < .01)
Gepoolte Daten aus zwei gleichartigen, unabhängigen Versuchen zeigt Abbildung 14.
In beiden Experimenten waren in einer Versuchsgruppe die NK-Zellen erst ab einem
späten Zeitpunkt nach Vakzinierung, jedoch vor Tumorinjektion, depletiert.
Es zeigte sich auch hier ein hochsignifikanter Unterschied (p < .001) zwischen der
nicht vakzinierten Kontrollgruppe und beiden vakzinierten DoxoB16-Gruppen. Bei
Mäusen der Kontrollgruppe wuchs sehr schnell ein Tumor, der ab Tag d+12 im
Vergleich zu den vakzinierten Gruppen hochsignifikant größer war.
Bei Vergleich der zwei Doxorubicin-vakzinierten Gruppen untereinander, lies sich erst
ab Tag d+18 ein deutlicher Unterschied (p < .01) ausmachen. Die NK-Zell-depletierten
Mäuse fielen durch signifikant größere Tumore im Vergleich zu den NK-Zellsuffizienten, vakzinierten Mäusen auf.
38
ERGEBNISSE
Abb.14: Tumorprogression bei Vakzinierung und NK-Zell-Depletion ab spätem Zeitpunkt.
Gepoolte Daten der Tumorgröße im Zeitverlauf ab dem Tag der Tumorinjektion aus zwei
unabhängigen Versuchen mit NK-Depletion ab dem späten Zeitpunkt (ZP). Ab d+12 wurden die
Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den DoxoB16-vakzinierten Gruppen signifikant
(*** p < .001). Signifikanzen sind aus Gründen der Übersichtlichkeit in der Abbildung nur für Tag
d+18 dargestellt. (n=16-20, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni Posttests, ** p < .01,
*** p < .001)
Bei Vergleich der Ergebnisse der in Abbildungen 13 und 14 dargestellten
Vakzinierungsexperimente
zeigte
sich
in
beiden
Versuchen
eine
bessere
Tumorkontrolle nach Vakzinierung mit Doxorubicin-behandelten B16OVA-Zellen im
Vergleich zu der nicht vakzinierten Kontrollgruppe. Zudem konnte beobachtet werden,
dass bei NK-Zell-Depletion über den kompletten Versuchszeitraum tendenziell eine
langsamere Tumorprogression bestand. Im klaren Gegensatz dazu zeigte sich eine
schnellere Tumorentwicklung bei Mäusen, die erst nach der Vakzinierung NK- Zell
depletiert wurden.
6.5.
Ex-vivo Beurteilung der systemischen Immunreaktion
6.5.1. Analyse der NK-Zellen und ihrer Differenzierungsstadien
Über Antikörper gegen die Oberflächenmarker NK1.1 und NKp46 wurden die murinen
NK-Zellen in der Milz genauer untersucht. Unabhängig von den verwendeten
Makierungsantikörpern wiesen vakzinierte Mäuse tendenziell etwas mehr NK-Zellen
auf, siehe Abbildung 15.
39
ERGEBNISSE
Abb.15: NK-Zellen in Splenozyten. Nach Ausschluss von T-Zellen über CD3 wurde mittels
NK-Zell spezifischen Antikörpern gefärbt. Verglichen wurden Splenozyten nicht vakzinierter und
+
+
vakzinierter Mäuse. DP stellen doppeltpositive NK-Zellen dar, d.h. NK1.1 NKp46 CD3 . (n=4,
2way ANOVA Analyse mit Bonferroni Posttests, ns p ≥ .05)
Im nächsten Schritt wurden NK-Zellen der Milz auf ihre Differenzierungszustände hin
untersucht. Es ist bekannt, dass sich NK-Zellen von CD27+CD11b- ausgehend, über
CD27+CD11b+, zu den terminal differenzierten CD27-CD11b+ Effektor NK-Zellen
weiterentwickeln können [84].
Nach Vakzinierung („DoxoB16“) kam es zu einem hochsignifikanten Anstieg der
CD27--, CD11b+-Zellen und zu einem signifikanten bzw. tendenziellen Abfall der
CD27+CD11b+ (DP, doppeltpositiv) Zellen unabhängig davon, über welchen NK-ZellMarker die Zellen gefärbt und analysiert wurden (Abbildung 16).
Abb.16: Differenzierungsstadien muriner NK-Zell-Subpopulationen. Verglichen wurden
Splenozyten nicht vakzinierter und vakzinierter Mäuse. (n=4, 2way ANOVA Analyse mit
Bonferroni Posttests, ns p ≥ .05, * p < .05, *** p < .001)
Ähnlich den reifen CD11b+-Killer-NK-Zellen, siehe Abbildung 16, ließ sich auch bei
aktivierten und migratorischen NK-Zellen ein Anstieg nach Vakzinierung mit
Doxorubicin
feststellen.
Die
aktivierten
NK-Zellen
nahmen
tendenziell,
die
migratorischen signifikant (p < .05) zu (Abbildung 17). Aktivierte NK-Zellen wurden über
die Expression von NK1.1 und CD11c, migratorische über die Expression von NKp46+
und CD62L durchflusszytometrisch definiert.
40
ERGEBNISSE
Abb.17: Aktivierte und migratorische NK-Zellen. Verglichen wurden Splenozyten nicht
+
+
vakzinierter und vakzinierter Mäuse. Aktivierte NK-Zellen waren definiert als NK1.1 CD11c ,
+
+
migratorische NK-Zellen als NKp46 CD62L . (n=8-10, t-Test mit Mann-Whitney Test, two-tailed,
ns p ≥ .05, * p < .05)
6.5.2. Charakterisierung der T-Zellen und ihrer Subpopulationen
Die zelluläre Immunantwort wurde bei Versuchsende mittels Durchflusszytometrie
analysiert. T-Zellen wurden als CD3+NK1.1- definiert. Von T-Zellen ausgehend wurde
des Weiteren auf die Subpopulationen der T-Helferzellen (CD8-CD4+), zytotoxische TZellen (CD8+CD4-), und doppeltpositive Vorläufer T-Zellen gegated.
Abb.18: T-Zellen und ihre Subsets in der Milz. Abbildung A zeigt Daten eines Experiments,
bei dem die NK-Zell-Depletion über den kompletten Versuchszeitraum erfolgte (n=4-5, 2way
ANOVA Analyse mit Bonferroni Posttests, ns p ≥ .05, * p < .05, ** p < .01, *** p < .001). Bei in
Abbildung B dargestellten Daten lag die NK-Zell-Depletion erst nach der Vakzinierung (ab
spätem Zeitpunkt) vor (n=5-6, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni Posttests, ns p ≥ .05,
** p < .01, *** p < .001).
41
ERGEBNISSE
Im Vergleich zwischen Kontrolle und Doxorubicin ließ sich ein signifikanter Anstieg der
T-Zellen nach Vakzinierung feststellen. Dieser konnte noch weiter gesteigert werden,
wenn die NK-Zellen während der Vakzinierung depletiert waren, dargestellt in
Abbildung 18A. Die Zunahme war auch innerhalb der T-Zell-Subsets, CD8+ und CD4+,
erkennbar, allerdings nur zwischen „Kontrolle“ und „DoxoB16+NK-Depl.kompletter ZR“,
signifikant. Bei den doppeltpositiven Zellen zeigte sich ebenfalls ein Zuwachs, der
jedoch nicht signifikant war.
T-Zellen und ihre Subpopulationen eines Experiments mit NK-Zell-Depletion ab spätem
Zeitpunkt sind in Abbildung 18B dargestellt. Übereinstimmend mit den Daten, die in
Abbildung 18A gezeigt sind, nahmen die CD3+-Zellen nach Vakzinierung hoch
signifikant zu, siehe Abbildung 18B. Auch innerhalb der T-Zell Subpopulationen
zeichnete sich ein Zuwachs nach Vakzinierung ab, der, mit Ausnahme der
doppeltpositiven Zellen, signifikant war. Kein weiterer Anstieg der T-Zellen konnte
hingegen zwischen der DoxoB16 Gruppe ohne und mit NK-Zell-Depletion beobachtet
werden. Dieses Ergebnis bei NK-Depletion ab spätem Zeitpunkt steht im Gegensatz zu
den Beobachtungen bei NK-Depletion über den kompletten Versuchszeitraum, siehe
Abbildung 18A.
Wurden die Effekte der NK-Zell-Depletion zu verschiedenen Zeitpunkten verglichen,
fiel auf, dass innerhalb der Doxorubicin-vakzinierten Gruppen nur die Gruppe mit NKDepletion über den kompletten Zeitraum einen weiteren Anstieg der T-Zellen
verzeichnen konnte. Im Gegensatz dazu fielen die T-Zellen bei Depletion ab spätem
Zeitpunkt leicht ab.
Zusätzlich wurde der Anteil der Central Memory (TCM) und Effector Memory T-Zellen
(TEM) in der Milz zu Versuchsende bestimmt. Abbildung 19.1 illustriert die GatingStrategie: Lymphozyten wurden über ein Fenster auf CD3+CD8+-Zellen eingegrenzt
und des Weiteren als CCR7high festgelegt. In dieser Population wurden auf TCM als
CD44+CD62L+ und TEM als CD44+CD62L- definiert.
Abb. 19.1: Gating-Strategie der Gedächtnis- T-Zellen. Lymphozyten werden zunächst als
+
+
high
CD3 CD8 , dann als CCR7
eingegrenzt. Schließlich werden Central Memory (T CM) als
+
+
+
CD44 CD62L und Effector Memory T-Zellen (TEM) als CD44 CD62L definiert.
42
ERGEBNISSE
Abb.19.2: Prozentuale Anteile der Central Memory und Effector Memory T-Zellen von den
high
CCR7 -Zellen in der Milz. Linke Abbildung (A) zeigt Daten mit NK-Zell-Depletion über den
kompletten Versuchszeitraum. (n=7-8, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni Posttests, ns p ≥
.05), rechte Abbildung (B) mit NK-Zell-Depletion ab spätem Zeitpunkt (n=8-10, 2way ANOVA
high
Analyse mit Bonferroni Posttests, ns p ≥ .05). Die %-Angaben beziehen sich auf die CCR7
-Zellen. Die genaue Gating-Strategie ist in Abb. 19.1 dargestellt.
Abbildung 19.2A zeigt repräsentativ die Anteile der Central Memory und Effector
Memory T-Zellen eines Versuchs, bei dem die NK-Zellen in einer Gruppe über den
kompletten Versuchszeitraum depletiert waren. Eine leichte Zunahme der TCM-Zellen
nach Vakzinierung, die unabhängig von den NK-Zellen war, deutete sich an. Dieser
Anstieg war jedoch nicht signifikant und in Abbildung 19.2B, in welcher Kontrolle- und
Doxorubicin-Gruppe vom Versuchs-Setting denen in Abbildung 19.2A entsprechen,
nicht vorhanden. Auch unter den TEM-Zellen ließen sich keine signifikanten
Veränderungen zeigen. Abbildung 19.2B zeigt repräsentativ die Anteile der TCM- und
TEM-Zellen eines Versuchs, bei dem die NK-Zellen in einer Gruppe ab spätem
Zeitpunkt depletiert waren. Die Anteile der analysierten Zellen unterschieden sich kaum
in den drei Versuchsgruppen.
Zusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass unabhängig von der
Vakzinierung und von den Depletionszeiträumen keine signifikanten Zu- oder
Abnahmen der TCM- und TEM-Zellen zu den gewählten Analysezeitpunkten zu
beobachten waren.
43
ERGEBNISSE
6.5.3. Analyse der CD11c+ Zellen
Die Splenozyten wurden bei Versuchsende auch im Hinblick auf den Anteil aller
CD11c+-Zellen untersucht. Dafür wurden CD3+ und NK1.1+-Zellen ausgeschlossen, um
dann die Zahl der CD11c+-Zellen zu bestimmen.
+
Abb.20: Prozentualer Anteil der CD11c -Zellen. Die NK-Zell-Depletion lag in linker Abbildung
(A) über den kompletten Versuchszeitraum (n=7-8, 2way ANOVA Analyse mit Bonferroni
Posttests, ns p ≥ .05), in rechter Abbildung (B) ab spätem Zeitpunkt vor (n=8-10 2way ANOVA
Analyse mit Bonferroni Posttests, ns p ≥ .05, ** p < .01). Es wurden nach CD3- und NK1.1+
Ausschluss der Anteil der CD11c -Zellen bestimmt.
Wie in Abbildung 20A und B erkennbar, lagen nach Vakzinierung unabhängig von der
NK-Zell-Depletion tendenziell weniger CD11c+-Zellen vor.
6.6.
Histologische Beurteilung der CD3+Infiltration im Tumor
Bei Versuchsende wurden histologische Schnitte mit CD3-Färbung der exstirpierten
Melanomtumoren angefertigt. CD3+-Zellen wurden über einen AK rot gefärbt. Die
Analyse erfolgte mittels eines von 0-3 reichenden Scores. Je höher der Score, desto
stärker die T-Zell Infiltration. Die Analyse erfolgte jeweils in vier definierten Regionen:
Muskel, Stroma, Tumorrand und Tumorzentrum.
Ein Ausschnitt eines histologischen Präparats ist in Abbildung 21 gezeigt. Der
Lymphknoten, der physiologisch eine hohe T-Zell Dichte aufweist „imponiert“ stark rot.
Es wurde deutlich, dass die CD3-Infiltrate im Tumor im Vergleich zum Lymphknoten
eher spärlich waren. Im Muskel ließen sich bei keinem Präparat Infiltrate finden.
44
ERGEBNISSE
Abb.21: Ausschnitt eines histologischen Bildes des Melanoms in einem
Oberschenkelpräparats nach Entnahme bei Versuchsende. Links im Bild ist der Melanomtumor
zu sehen. Dieser ist von stromalem Gewebe umnetzt. Stark rot eingefärbt ist ein Lymphknoten,
der in einem Bett aus Fettzellen liegt. Des Weiteren ist Muskelgewebe gekennzeichnet.
In der statistischen Auswertung, siehe Abbildung 22, zeigte die unvakzinierte Kontrolle
den höchsten Score in Stroma und am Tumorrand. Im Zentrum des Tumors waren die
meisten T-Zell Infiltrate zu finden, wenn die NK-Zellen während der ganzen
Versuchsdauer depletiert waren. Im Gegensatz dazu stellten sich zentral im Tumor bei
NK-Zell-Depletion ab spätem Zeitpunkt die wenigsten Infiltrate dar. Aufgrund der hohen
Varianzen zwischen den einzelnen Tumoren waren die Unterschiede in der T-ZellInfiltration nicht signifikant.
Abb.22: CD3-Zell Infiltration im Tumorgebiet und direkter Umgebung. NK-Zellen waren den
kompletten Zeitraum über oder ab spätem Zeitpunkt depletiert. Die Analyse erfolge mit Hilfe
eines Scores. Je größer der Score, desto stärker die T-Zell Infiltration. (n=19-36, 2way ANOVA
Analyse mit Bonferroni Posttests, ns p ≥ .05)
45
DISKUSSION
7.
Diskussion
Ziel dieser Doktorarbeit war es zu überprüfen, ob natürliche Killerzellen Einfluss auf die
Tumorimmunität nach Vakzinierung mit in-vitro mit Doxorubicin behandelten B16OVAZellen haben.
Im ersten Teil der Arbeit wurden in-vitro Versuche durchgeführt, um die Tumorzellen,
die später in-vivo als Vakzin verwendet werden sollten, im Hinblick auf ihre Viabilität
und Expression von Gefahren- und Todessignalen zu charakterisieren. In-vivo und
ex-vivo Experimente in einem murinen Vakzinierungsmodell schlossen sich an. Dabei
wurde die Tumorprogression gemessen und verschiedene immunologische Parameter
in drainierenden Lymphknoten, der Milz und dem Tumor abgefragt. In mehreren
Experimenten wurden sowohl der Effekt einer Vakzinierung, wie auch der einer NKZell-Depletion zu verschiedenen Zeitpunkten getestet.
Im Rahmen dieser Arbeit und von Vorarbeiten konnte ein murines Vakzinierungsmodell
etabliert werden. Murine Vakzinierungsmodelle, die unserem Modell ähneln, sind in der
Literatur beschrieben [11, 76, 85]. Nach Stand der Literatur wurde bislang allerdings
nicht die Tumorimmunität in Abhängigkeit des Zeitraums der NK-Zell-Depletion
untersucht.
7.1.
Eigenschaften der Vakzinzellen
Als wichtiges Ergebnis dieser Arbeit konnte ein murines Vakzinierungsmodell mit
Doxorubicin-behandelten
B16OVA-Melanomzellen
etabliert
werden.
Diese
Tumorzellvakzine induzierte eine spezifische antitumorale Immunität, die sehr gut
(p < .001) vor dem raschen Progress später injizierten vitalen B16OVA-Tumorzellen
schützte.
Mit dem Hintergrund, dass apoptotische und nekrotische Zellen immunogen wirken
können [1], wurden B16OVA-Zellen im Hinblick auf ihre Viabilität analysiert.
Interessanterweise zeigten die Tumorzellen unmittelbar nach 24stündiger Inkubation in
1µM Doxorubicin noch keine verstärkte Apoptoserate, wenn diese mittels AnnexinVFITC- und DAPI- Doppelfärbung im FACS ermittelt wurde (Abbildung 8, t=0h).
Dennoch erwiesen sich genau diese Zellen in Vorversuchen als hocheffektives Vakzin.
Um diesem unerwarteten Ergebnis weiter auf den Grund zu gehen, testeten wir die
intrazelluläre Expression von p53 und Survivin. Diese zwei Proteine sind im Rahmen
der Apoptoseinduktion und -inhibition beschrieben [37, 73].
46
DISKUSSION
Zellulärer Stress, z.B. durch Chemotherapeutika oder Bestrahlung, erhöht die Aktivität
von p53 und wirkt damit Apoptose-förderlich [31]. Stimmig zu diesem Wissen war p53
nach Behandlung mit Doxorubicin hochreguliert (Abbildung 9). Zudem konnte eine
erhöhte intrazelluläre Survivin-Expression nachgewiesen werden (Abbildung 9), was
daraufhin deutet, dass die Zellen versuchten einer bevorstehenden, eventuell durch
p53 vorangetriebenen Apoptose entgegenzusteuern. Hier könnte Survivin als
Gegenpol zu p53 betrachtet werden.
Wie oben bereits erwähnt, waren zu einem sehr frühen Zeitpunkt nach Behandlung mit
Doxorubicin die Tumorzellen noch nicht apoptotisch oder nekrotisch, zeigten jedoch bei
Betrachtung des Gefahrensignals Survivin und des Todessignals p53 Veränderungen,
die mit einer Apoptoseinduktion zu vereinbaren sind. Diese Ergebnisse legten die
Vermutung nahe, dass die Tumorzellen nach in-vivo Injektion weiter starben und
darum als effektives Vakzin fungieren konnten. Diese Vermutung konnte durch FACSAnalysen der B16OVA-Zellen zu späteren Zeitpunkten nach Behandlung, in denen sich
in-vitro eine deutlich gesteigert Apoptose- und Nekroserate zeigte, gefestigt werden
(Abbildung 8, t=24/48/96h).
Die immunstimulierende Eigenschaft von Chemotherapeutika ist mit der verstärkten
Expression sog. „stress-like“ Moleküle beschädigter oder sterbender Tumorzellen
assoziiert. Das Vorhandensein von Hitze-Schock Proteinen, Liganden der KillerzellLektin-artigen Rezeptoren Subfamilie K und TRAIL-Todes-Rezeptoren machen
Tumorzellen anfällig für einen Angriff durch Zellen des angeborenen Immunsystems,
beispielsweise durch NK-Zellen [56].
Unseren Daten zeigten eine erniedrigte intrazelluläre und eine erhöhte extrazelluläre
HSP70 Konzentration in Lysaten und Kulturüberständen der behandelten Zellen
(Abbildung 9/ 10). Diese Konstellation legte eine Freisetzung von HSP70 aus B16OVAMelanomzellen nach Behandlung mit Doxorubicin nahe. Schildkopf et al. beschrieben
eine verstärkte Freisetzung von HSP70 aus Kolon-Karzinomzellen nach Bestrahlung
und/ oder Hyperthermie [76]. Extrazelluläres HSP70 vermag die Phagozytose von
Tumorzellen durch Makrophagen und DCs zu steigern und diese Zellen des
angeborenen Immunsystems zu aktivieren [76]. Zu gleicher Schlussfolgerung
gelangten 2002 Srivastava et al., der extrazelluläres HSP70 als Gefahrensignal und
damit als Immunstimulanz beschrieb [87]. Dieses kann an Rezeptoren Antigenpräsentierender
Zellen
binden
und
dort
über
die
Freisetzung
von
pro-
inflammatorischen Zytokinen den Reifungsprozess dieser Zellen initiieren [103]. Des
Weiteren werden Tumor assoziierte Antigene von HSP70 begleitet (chaperoned),
47
DISKUSSION
dadurch leichter von DCs aufgenommen und über MHC Klasse-I Moleküle
kreuzpräsentiert [103].
Ob das freigesetzte HSP70 in unserem Modell für die erfolgreiche Antigenpräsentation
ausschlaggebend war, konnte nicht abschließend geklärt werden. Sicher jedoch ist,
dass freigesetzte Gefahrensignale notwendige ko-stimulatorische Aufgaben haben
[61].
Auch die Freisetzung von HMGB1 aus Tumorzellen nach Behandlung mit
Anthracyclinen, wie beispielsweise Doxorubicin, ist beschrieben [5]. Die intrazelluläre
Messung von HMGB1 zeigte, analog zu HSP70, eine erniedrigte Expression nach
Behandlung der Zellen mit Doxorubicin (Abbildung 9). In Kombination mit der
durchflusszytometrisch gemessenen gesteigerten Nekroserate nach DoxorubicinApplikation,
unterstützen
unsere
Daten
somit
die
Ansicht
[75],
dass
der
immunstimulierende Effekt sterbender Tumorzellen unter anderem auf der Freisetzung
von HMGB1 beruhte. Freigesetzes HMGB1 ist bekannt für seine stimulierende Wirkung
auf DCs über TLR4 [4] und seine unterstützende Wirkung auf die tumorspezifische
Immunantwort [56].
Im Einklang mit der Literatur kann zusammenfassend festgehalten werden, dass
Doxorubicin-behandelte B16OVA Zellen sich als immunogen erwiesen, weil sie
apoptotisch und nekrotisch waren und zusätzlich nachweislich HSP70 und vermutlich
auch HMGB1 freisetzten. Mit diesen Zellen als Vakzin wurde unser in-vivo
Vakzinierungs-Mausmodell etabliert.
7.2.
Rolle der NK-Zellen bei der Immunisierung
Die Tumorprogression ließ sich durch eine Vakzinierung mit immunogenen
Tumorzellen verlangsamen (Abbildung 13/ 14).
Murine Modelle, die bestrahlte [76] oder Chemotherapeutika-behandelte [4] Zellen als
Vakzin oder OVA/CpG als Vakzin plus Immunstimulanz verwendeten [44, 85], sind
vorbeschrieben.
Apetoh
et
al.
arbeitete
unter
anderem
Vakzinierungsmodell,
um
die Rolle des TLR4 im
Antitumorimmunität
zu
charakterisieren.
Mit
in
einem
murinen
Zusammenhang mit
Doxorubicin
der
vorbehandelte
Kolonkarzinomzellen (CT26) wurden dabei über die Fußsohle (footpad) injiziert.
Zeitnah wurde die Fähigkeit drainierender Lymphknotenzellen IFN-γ zu produzieren
analysiert [4]. Unserem Modell noch ähnlicher beschrieb Casares et al. ein
Vakzinierungsmodell, welches Anthrazyklin-behandelte CT26-Zellen als subkutanes
48
DISKUSSION
Vakzin verwendete. Eine effektive antitumorale Immunantwort war gewährleistet und
führte
zu
einer
Regression
von
etablierten
Neoplasien
sowie
zur
Wachstumsunterdrückung eines nachfolgend induzierten Tumors [11]. Gleiche
Wirkung konnte in unseren Versuchen bei Immunisierung mit Doxorubicin-behandelten
B16OVA-Melanomzellen beobachtet werden. Wie in Abbildung 13/14 dargestellt,
zeigten vakzinierte Mäuse („DoxoB16“) ein deutlich reduziertes Tumorwachstum im
Vergleich zu nicht immunisierten Kontrollmäusen („Kontrolle“).
Welche Rolle NK-Zellen in diesem Zusammenhang spielen, ist kontrovers diskutiert. In
seinem CpG/OVA-abhängigen Mausmodell zeigte Krebs et al. 2009, dass NK-Zellen,
die apoptotische Zellen töten, essentiell waren, um eine CD4+ T-Zell Antwort zu
induzieren [44]. Dadurch wurde die Expansion und Effektorfunktion der Agspezifischen
CTLs
initiiert
und
die
humorale
Immunantwort
gefördert
[44].
Entsprechend wiesen Arbeiten von Pham et al. auf eine Verbesserung des
antitumoralen Effekts durch NK-Zellen hin, hier vermittelt über die NK-Zell-abhängige
Reifung und Aktivierung von DCs in Anwesenheit des TLR-Agonisten Lipopolysaccarid
[64]. Stimmig dazu konnten wir zeigen, dass nach der Vakzinierung, die in allen
unseren Versuchen mit signifikant verringertem Tumorwachstum (p < .001) einherging,
die Anzahl der CD11b+CD27- NK-Zellen, die migratorischen und aktivierten NK-Zellen
systemisch im Vergleich zur nicht vakzinierten Kontrolle anstieg (Abbildung 15-17).
Dies deutet auf eine gesteigerte Proliferation und Reifung der NK-Zellen durch die
Immunisierung hin und würde zunächst eine immunisierungsfördernde Aufgabe der
NK-Zellen vermuten lassen. Auch Seki et al. sprach den NK-Zellen eine wichtige Rolle
in der Induktion der antitumoralen Immunität zu, da ihr IFN-γ in der Leber die
Phagozytoseaktivität und Zytokinproduktion der hepatischen Makrophagen, sog.
Kupffer-Zellen, stimulierte [78].
Konträr dazu publizierten Soderquest et al. Daten die NK-Zellen regulatorische, eher
hinderliche Effekte auf die antigenspezifische Tumorkontrolle zusprachen [85].
Hayakawa et al. zeigte bereits 2004, dass unreife DCs von NK-Zellen über einen TNFverwandten Apoptose Liganden (TRAIL) in-vivo eliminiert werden können [27]. Eine
NK-Zell-Depletion, die wie in unseren Versuchen durch anti-NK1.1-Antikörper
durchgeführt wurde sowie eine Antikörper-vermittelte Ausschaltung des TRAILSignalwegs während der Immunisierung durch mit Tumorantigen beladene DCs führte
zu verstärkten spezifischen T-Zell Antworten und zu einer besseren antitumoralen
Immunität [27]. Bekannt ist zudem, dass die Interaktion zwischen DCs und NK-Zellen
neben ihrer gegenseitigen Aktivierung, Proliferations- und Reifungsförderung auch die
Folge haben kann, dass unreife DCs von NK-Zellen getötet werden [65].
49
DISKUSSION
7.3.
Einfluss der NK-Zell-Depletion auf das Tumorwachstum
Um die Rolle der NK-Zellen im Doxorubicin-abhängigen Vakzinierungsmodell genauer
zu untersuchen, wurde nach einer Möglichkeit gesucht, NK-Zellen spezifisch in-vivo
eliminieren zu können.
Knockout Mäuse, denen es nur an NK-Zellen mangelt, gibt es bisher nicht.
Rag2-/- x Fc gamma-/- Mäuse sind verfügbar, allerdings fehlt es ihnen nicht nur an NKZellen, sondern auch an T- und B- Zellen. 2006 publizierten Walzer et al. die
Entwicklung
einer
transgenen
Maus,
der
sog.
NKDTR/EGFP-Maus.
Mittels
Diphterietoxin kann in diesen Tieren der NKp46-Promotor ausgeschaltet werden, was
zu einer NK-Zell Ablation führt [102]. Dieses Modell stellt mit NKp46 als Speziesübergreifenden NK-Zell-Marker einen vielversprechenden Ansatz dar, wurde jedoch
von
uns
nicht
gewählt.
Grund
dafür
war,
dass
die
Mäuse
in
unserem
Vakzinierungsmodell neben der Belastung durch schnellproliferierende Melanome nicht
noch zusätzlich den durchaus nebenwirkungs-behafteten Effekten des Diphterietoxins
ausgesetzt werden sollten.
Zwei inhibierende Antikörper gegen NK-Zellen, die intraperitoneal appliziert werden,
standen des Weiteren zur Auswahl: anti-NK1.1- und anti-asialo-GM1-Antikörper. Krebs
et al. beschrieb 2009 die Abnahme der NK-Zellen unter anti-asialo-GM1-AK zwar als
effektiver als unter anti-NK1.1.-AK [44], jedoch ist anti-asialo-GM1-AK nicht NK-Zellspezifisch, weil er auch an Granulozyten und Monozyten bindet [99]. Darum wurde in
dieser Arbeit bewusst anti-NK-1.1-AK verwendet und damit, wie in Abbildung 12
gezeigt, eine sehr gute, wenn auch nicht absolute, NK-Zell Reduktion erreicht.
Zwei verschiedene Zeiträume der NK-Zell-Depletion wurden eingeführt, illustriert in
Abbildung 11. Zum einen waren vakzinierte Mäuse während der kompletten
Versuchsdauer NK-Zell-depletiert („DoxoB16 + NK-Depl. kompletter ZR“), zum anderen
erst ab dem Tumorinjektionszeitpunkt („DoxoB16 + NK-Depl. später ZP“). Letzteres
heißt konkret, dass während der Vakzinierungsphase noch NK-Zellen vorhanden
waren. Als Ausdruck der Effektivität der Vakzinierung und damit der antitumoralen
Immunität wurde in unserem Modell die Tumorgröße untersucht. Wie zuvor erwähnt,
führte die Immunisierung durch Doxorubicin-behandelte Melanomzellen bei der immunkompetenten Maus zu einer effektiven antitumoralen Immunität, die die Maus bei
nachfolgender Applikation von vitalem Tumor derselben Zelllinie erfolgreich schützte.
Eine NK-Zell-Depletion zum Zeitpunkt der Immunisierung verbesserte diesen Effekt
weiter. Diese Tiere wiesen das geringste Tumorwachstum aller Versuchsgruppen auf.
50
DISKUSSION
Letztgenannte Ergebnisse stehen im Einklang mit Daten des kürzlich von Soderquest
et al. publizierten Papers, in welchem aufgezeigt wurde, dass die Abwesenheit von NKZellen
in
einem
OVA/CpG-abhängigen
Mausmodell
zu
einer
besseren
antigenspezifischen Tumorkontrolle führte. Mit OVA/CpG immunisierte Mäuse erhielten
subkutan OVA-exprimierende, vitale Tumorzellen (B16OVA) [85]. Im weiteren Verlauf
wurde das Tumorwachstum gemessen [85]. Stimmig zu unseren Daten zeigten Mäuse,
die in Abwesenheit von NK-Zellen vakziniert wurden im Vergleich zu vakzinierten
Mäusen mit NK-Zellen ein langsameres Tumorwachstum und ein verlängertes
Überleben [85].
Eine
erhöhte
Zahl
antigenspezifischer
CD8+ T-Zellen
in
den
drainierenden
Lymphknoten des Vakzinierungsgebiets zu einem frühen Zeitpunkt nach Vakzinierung
ist beschreiben. Dieser Effekt wurde dadurch begründen, dass NK-Zellen CD8+ TZellen über eine NKG2D- und Perforin-abhängige Reaktion töteten [85]. Fehlende NKZellen erhöhten des Weiteren insgesamt die Anzahl der antigenspezifischen CD8+
Gedächtnis-T-Zellen und verschoben ihre Differenzierung in Richtung des „Central
Memory“- Phänotyps, der im Rahmen der antitumoralen Immunität dem „Effector
Memory“- Phänotyp überlegen schien [85]. Auch in unseren Versuchen wurden CD8+
Gedächtnis-T-Zellen untersucht (Abbildung 19). Vorliegende Daten von Soderquest et
al. konnten hier allerdings nicht bestätigt werden. Es ließ sich kein prinzipieller Anstieg
der CTLs und auch nicht der TCM-Zellen zeigen. Eine mögliche Erklärung ist, dass
unsere Analysen zu Versuchsende durchgeführt wurden und sich auf die Milz bezogen,
wohingegen Soderquest et al. Lymphozyten der drainierenden Lymphknoten früh nach
der Immunisierung untersuchte [85].
Deutlich wurde jedoch, dass die Gesamtheit der T-Zellen tendenziell bei Vakzinierung
zunahm (Abbildung 18). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der langsameren
Tumorprogression dieser Mäuse, wenn angenommen wird, dass T-Zellen die
antitumorale Immunität fördern. Das T-Zell-Niveau war weiter erhöht in Mäusen, die
bereits während der Immunisierung NK-Zell depletiert waren. Konform dazu zeigte sich
eine verringerte Tumorentwicklung in diesen Tieren. Eine mögliche Erklärung für diese
Beobachtung ist, dass antigenspezifische T-Zellen während der Vakzinierungsphase
von NK-Zellen getötet werden. Somit kann den NK-Zellen ein eher hemmender Effekt
während der frühen Phase der Immunisierung, dem sog. T-Zell Priming, zugesprochen
werden. Die vorübergehende Depletion der NK-Zellen zum Zeitpunkt des T-Zell
Primings resultierte in mehr Gedächtniszellen und führte zu einer effizienteren „Recall“Antwort im Vergleich zu Kontrolltieren mit vorhandenen NK-Zellen [85].
51
DISKUSSION
Lag die NK-Zell-Depletion erst ab Tumorinjektion, und nicht schon während der
Vakzinierung vor, war dieser Effekt, bezogen sowohl auf T-Zell Anstieg sowie auf
Tumorprogression, aufgehoben und sogar in die gegenteilige Richtung verschoben.
Mäuse, die erst ab dem Zeitpunkt der Tumorinjektion NK-Zell depletiert waren,
demonstrierten eine schlechtere Tumorkontrolle als NK-Zell kompetente, immunisierte
Tiere. Hier bestätigen unsere Ergebnisse, dass NK-Zellen nach Tumorinjektion bei
vorliegender Vakzinierung nötig waren, um eine direkte Lyse auswachsender oder
bereits solider Tumoren zu erzwingen [47, 69]. Schon seit 1980 ist bekannt, dass NKZellen in-vivo in der Maus Tumorzellen eliminieren können [69]. Smyth et al.
beleuchtete in einem Methylcholanthrene- induzierten murinen Fibrosarkom-Modell die
Verminderung der Sarkomwachstumsrate durch eine IL-12-Therapie [81]; diese
Beobachtung war NK-Zell abhängig und T-Zell unabhängig. Des Weiteren zeigten
murine NK-Zellen in-vivo die Fähigkeit Metastasenwachstum TRAIL-vermittelt
vorzubeugen [80].
Somit konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das Ausmaß der
Tumorprogression nach Vakzinierung unter anderem von NK-Zellen abhängig war.
7.4.
Infiltrierende T-Zellen in Tumorläsionen
Um eine Aussage über die lokale Situation der Immunzellen machen zu können,
wurden unsere histologischen Tumorpräparate in Hinblick auf T-Zell-Infiltrate
analysiert. In der Mehrzahl von Studien korreliert eine hohe Zahl infiltrierender Zellen,
wie NK-Zellen oder CD8+ T-Zellen, mit einer besseren Prognose für den
Krebspatienten [14]. In Guo et al. Versuchen wurden Mäuse, die Tumoren der
Sarkomzelllinie S180 trugen, mit einer Kombination aus Hitze-Schock Proteinen und
Peptiden, die unter anderem HSP70 enthielt, vakziniert [23]. Zusätzlich wurden das
Chemotherapeutikum Cyclophosphamid und IL-12 appliziert. Vakzinierte Mäuse
zeigten eine Tumorregression, ein besseres Langzeitüberleben und eine Verminderung
des Tumorwachstums [23]. Lymphozyten und Leukozyten infiltrierten den Tumor der
immunisierten Mäuse, wogegen keine Leukozyten in den Tumoren der Kontrolltiere zu
finden waren [23]. Der Anteil der NK-Zellen Zellen war in der vakzinierten Gruppe
erhöht, genauso wie die Aktivität tumorspezifischer CTLs [23].
In unseren untersuchten histologischen Präparaten konnten keine T-Zellen in dem
Muskelgewebe gefunden werden. Die Untersuchung des tumorumgebenden Stromas,
des Tumorrandes und des Tumorzentrums war nicht eindeutig. Tendenziell zeigte sich,
dass in den Tumoren der nicht vakzinierten Kontrollmäuse vermehrt CD3 Infiltrate vor
allem im umgebenden Stroma und im Randgebiet des Tumors vorlagen.
52
DISKUSSION
Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass die Tumoren der Kontrollmäuse
deutlich größer als die der immunisierten Vergleichsgruppen waren und damit dort
aufgrund der verstärkten lokalen Gewebeschädigung ein höherer Infiltrationsreiz
bestand. Nakasone et al. beschrieb die Infiltration von Leukozyten in Läsionen
maligner Melanome als streng durch Chemokine reguliert [63]. Inflammatorische
Zytokine, die von Tumorzellen selbst sowie von infiltrierenden Immunzellen produziert
wurden, waren in der Lage die Tumorprogression zu beeinflussen [63]. Ein verringerter
Prozentsatz infiltrierender CD4+, CD8+ T-Zellen und NK-Zellen war mit verstärktem
Auswachsen einen subkutanen B16F10-Melanoms assoziiert [63]. In unseren
Versuchen konnte keine Abhängigkeit der T-Zell Infiltration von der NK-Zell-Depletion
gezeigt werden (siehe Abbildung 22).
7.6.
Zusammenfassung, klinische Implikation und Ausblick
Durch unsere Ergebnisse können wir das Wissen um die Rolle der NK-Zellen im
Rahmen der Tumorvakzinierung festigen und sogar erweitern.
Immunkompetente Mäuse zeigten nach Vakzinierung eine deutlich langsamere
Tumorprogression als nicht immmunisierte Kontrolltiere. Dieser Vakzinierungseffekt
konnte in Mäusen, die in der Abwesenheit von NK-Zellen immunisiert wurden, weiter
verbessert werden. Unsere Daten deuten auf eine immunsuppressive, eher hinderliche
Rolle der NK-Zellen während der Vakzinierungsphase hin, möglicherweise bedingt
durch eine NK-vermittelte Lyse Tumorantigen-spezifischer T-Zellen.
Dagegen war der Tumorprogress deutlich beschleunigt, wenn die NK-Zellen erst nach
der Vakzinierung aber kurz vor der Tumorinjektion depletiert wurden. Unsere Daten
bestätigen damit, dass NK-Zellen zur Kontrolle auswachsender und solider Tumoren
notwendig sind [89, 99].
Zusätzliche Versuche in vorliegendem Modell, z.B. mit einer NK-Zell-Depletion
während der Vakzinierung und anschließendem Adoptivtransfer aufgereinigter NKZellen, sind notwendig, um weiterführende Aussagen treffen zu können und den Weg
neuer und erfolgreicher Vakzinierungsstrategien zu ebnen.
Des
Weiteren
stellt
der
Effekt
der
inflammatorischen
Apoptose
einen
vielversprechenden Ansatz dar, um die antitumorale Immunität zu fördern [33].
Präklinisch erfolgreiche Strategien und Ansätze müssen weiterentwickelt und erprobt
werden, um Krebspatienten in Zukunft additiv zur chirurgischen Tumorentfernung, der
Chemotherapie und Bestrahlung weitere Therapieoptionen im Rahmen multimodaler
Therapiekonzepte anbieten zu können.
53
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61
ABKÜRZUNGEN
Abkürzungen
ACK-Puffer
Ammoniumchlorid-Kaliumhydrogencarbonat + EDTA
AK
Antikörper
APC
antigenpräsentierende Zellen
B16OVA
OVA-exprimierender B16 Melanomtumor
BCR
B-Zell Rezeptor
CD
cluster of differentiation
CD62L
CD62 Ligand auf Leukozyten
d
day/ Tag
DAMP
damage associated molecular pattern/ Schaden assoziierte
molekulare Strukturen
DC
Dendritische Zellen
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DoxoB16
in-vitro mit Doxorubicin behandelte B16OVA-Zellen
FACS
fluorescence activated cell sorting/ Durchflusszytometrie
FSC
forwardscatter / Vorwärtslichtstrahl
GM-CSF
granulocyte macrophage colony stimulating factor/ Granulozyten
Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
h
hours/ Stunden
HMGB1
high mobility group protein B1
HSP
heat shock protein/ Hitze Schock Protein
IAP
inhibitor of apoptosis protein/ Apoptose hemmendes Protein
i.p.
intraperitonal
IFN
Interferon
Ig
Immunglobuline
IL
Interleukin
KIR
killer cell immunoglobulin-like receptor
KLR
killer cell lectin-like receptor
LK
Lymphknoten
LPS
Lipopolysaccharid
62
ABKÜRZUNGEN
MHC
major histocompatibility
komplex
complex/
Haupthistokompatibilitäts-
NCR
natural cytotoxicity receptor/ natürlicher Zytotoxizitätsrezeptor
NK-Depl.
NK-Zell-Depletion
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
NKG2D
Natural-killer group 2D
NKG2DL
NKG2D Ligand
ns
nicht signifikant
PAMP
pathogen associated molecular pattern/ Pathogen assoziierte
molekulare Strukturen
PBS
phosphatgepufferte Salzlösung
RAG2-Mäuse
Mäuse ohne NK-Zellen, T- und B-Lymphozyten
s.c.
subkutan
sog.
sogenannt
SSC
sidescatter / Seitwärtslichtstrahl
TAA
Tumor-assoziiertes Antigen
TCR
T-Zell-Rezeptor
TCM
central memory CD8+ T-cell/ Zentrale CD8+ Gedächtnis T-Zelle
TEM
effector memory CD8+ T-cell/ Effektor CD8+ Gedächtnis T-Zelle
TEFF
effector T-cell/ Effektor T-Zelle
TH-Zellen
T-Helferzellen
TLR
Toll-like-receptor/ Toll-artiger Rezeptor
TNF
Tumornekrosefaktor
TNFRSF
tumor necrosis factor receptor superfamily/ TumornekrosefaktorRezeptor-Superfamilie
TRA
tumor rejection antigen/ Tumorabstoßungs-Antigene
TRAIL
TNF-related apoptosis inducing ligand
v.a.
vor allem
vs
versus
ZD
Zeitdauer
ZP
Zeitpunkt
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LEBENSLAUF
Danksagung
Ich möchte mich herzlich bei meiner Doktormutter Prof. Dr. Evelyn Ullrich für die
hervorragende Betreuung meiner Promotion bedanken. Sie ermöglichte mir nicht nur
die Anfertigung der vorliegenden Arbeit, sondern begeisterte mich für die Forschung.
Prof. Dr. Andreas Mackensen danke ich für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit an
seiner Klinik durchführen zu können.
Mein besonderer Dank gilt Julia Schneider, Alexandra Abendroth, Dr. Irena Kröger, Dr.
Kathrin Meinhardt und Stefanie Krieg, die mir bei der Durchführung meiner Versuche
eine sehr große Hilfe waren. Des Weiteren möchte ich Franziska Ganß, Johanna
Rothamer, Dr. Ruth Bauer, Anna Reischer und Jennifer Möckl als weitere Mitglieder
der Arbeitsgruppe Ullrich für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre im Labor und ihre
Hilfsbereitschaft danken. Ein großes Dankeschön für das Einlernen in Methoden geht
an Karina Bösl und Max Bittrich. Vielen Dank auch Patrick Finkel, der mir eine große
Unterstützung bei meinen Versuchen war.
Das Interdisziplinäre Zentrum für klinische Forschung (IZKF) ermöglichte mir durch
finanzielle Unterstützung ein Freisemester für meine Doktorarbeit zu nehmen. Zudem
geht mein Dank an Dr. Ulrike Schleicher und PD Dr. Udo Gaipl, die meine Mentoren im
Rahmen dieses Stipendiums waren.
Ein großer Dank gilt der Arbeitsgruppe Gaipl, Strahlenimmunbiologie, für die
Möglichkeit Western Blots in ihren Laboren durchführen zu können. Insbesondere
möchte ich hierbei Renate Sieber danken.
Außerdem möchte ich der Nephropathologie des Universitätsklinikums Erlangen,
insbesondere PD Dr. med. Maike Büttner-Herold und Katrin Schmitt, für ihre Hilfe bei
den Tumorhistologien danken.
Meiner Familie gilt ein ganz besonderer Dank für ihre Ermutigung und Unterstützung
während meines gesamten Studiums. Meinem Onkel Prof. Dr. Klaus Matzel danke ich
besonders für die kulinarischen Bereicherungen nach so manchem langen Labortag
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