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Inhalte unseres Vortrages
Vorstellung der beiden paper:
Germ – line transmission of a disrupted ß2 – mirkroglobulin
gene produced by homologous recombination in embryonic
stem cells
ß2 – Mikroglobulin deficient mice lack CD4- 8+ cytolytic T
cells
Theoretischer Hintergrund zum
besseren Verständnis der beiden
Paper
Gliederung:
1. Was ist eine Knockout – Maus ?
2. Herstellung einer Knockout – Maus
3. T – Zell - Rezeptor
9. MHC Klasse I Komplex und ß2 - Mikroglobulin
5. MHC Klasse II Komplex
1. Was ist eine Knockout – Maus ?
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Tiere bei denen ein ganz bestimmtes Gen
gezielt ausgeschaltet wurde
benötigt Tiere, die den gleichen genetischen
Hintergrund haben → Verwendung von
Inzuchttieren
Vergleich über Auswirkungen des
Genverlustes
Herstellung von Krankheitsmodellen für
bestimmte Krankheiten
Modellsystem Maus:
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kurze Generationszeit (10 Wochen)
Hohe Nachkommenzahl (5 – 10 Neugeborende /
Wurf)
geringe Lebenserwartung
90 % der Gene von Mensch und Maus haben ähnliche
Strukturen und Funktionen
2. Herstellung einer Knockout Maus
Gezieltes Ausschalten von Genen und
Untersuchung der Auswirkungen
 Methode ist sehr langwierig und aufwendig
(dauert mehrere Monate)
 Grundlage ist homologe Rekombination
→ Verknüpfung von DNA Segmenten mit
ähnlichen Nukleotidsequenzen
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Gen liegt in klonierter Form vor
Gen wird verändert durch Einbau
eines Neomycin Resistenzgen
(Neo+) und HSV – tk Gen
(Thymidinkinase – Gen aus
Herpes – simplex – Virus)
Selektionsmarker → Kontrolle
des Rekombinationsprozesses
Targeting Vektor wird kloniert
und über Elektroporation in ES –
Zellen eingebracht
Nur ein Teil des Transgens wird
aufgenommen
. Wie funktioniert ein Replacement
Vektor
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enthält Neomycin Resistenzgen
und HSV – tk Gen →
Selektionsmarker
endogenes Gen wird durch
homologe Rekombination
inaktiviert
2 Crossover – Ereignissen f´ühren
zu Verlust des HSV – tk Gens
(Negativselektion) und
Integration des Neomycin
Resistenzgen (positive Selektion)
Geninaktivierung und Expression
des Neo+
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nur ein Teil des Transgens
wird aufgenommen durch
homologe Rekombination
(keine Insertion des HSV –
tk Gens!!)
andere Möglichkeiten sind
random Insertion ( Insertion
des HSV – tk Gens!!!!)
keine Insertion ( besitzen
kein Neomycin
Resistenzgen)
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Zugabe von Neomycin Antibiotika
G418 und Ganciclovir (Basenanalog)
Bei homologen Einbau des Transgens
sollte HSV – tk Gen
verlorengegangen sein
Zellen mit HSV – tk Gen (random
Insertion) überführen Basenanalog in
Nucleotide → Hemmung der DNA
Replikation → Zelltod
Zellen mit keiner Insertion des
Transgens können kein Neomycin
Resistengen exprimieren → Zelltod
Zellen mit target insertion überleben
Überprüfung der Ergebnisse durch
PCR und Southern Plot
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Zellen sind heterozygot in Bezug
auf das Transgen
Übertragung der transgenen ES
Zellen (einer Maus mit brauner
Fellfarbe) im Blastocyste einer
Maus mit schwarzer Fellfarbe
Übertragung der Blastocyste in
surrogate Maus → Entstehung
einer chimären Maus (Gewebe
besteht aus 2 Zelltypen
unterschiedlicher Herkunft)
Chimäre besitzen fleckig –
schwarze Fellfarbe
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Kreuzung einer Chimären Maus
mit Maus schwarzer Fellfarbe
Phänotyp nicht erkennbar, da das
unveränderte allele Gen Wiltyp –
Gen Produkte produziert
Kreuzung heterozygoter Mäuse
→ man erhält homozygote Mäuse
→ Ergebnis im Phänotyp:
gerollter Schwanz
Vorteil dieser Methode
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Durchführung und Überprüfung genetischer
Veränderung zuerst in Zellkultur und erst
danach Herstellung von genetisch veränderten
Mäusen
3. T - Zell Rezeptor (TCR)
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sind mit B – Zell Rezeptoren
verwandt
2 bekannte TCR Formen:
a.) Heterodimer aus einer α- und
einer β – Kette (α β TCR)
b.) Heterodimer aus einer γ - und
einer δ Kette (γ δ TCR)
Bestehen aus variablen (grau) und
konstanten Domäne (blau)
TCR erkennen intrazelluläre
Antigene (Viren, intrazell.
Bakterien)
Oberflächenkontakt zwischen einer CD4+ T – Zelle
und antigenpräsentierenden Zelle
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TCR Komplex besteht aus spezif.
α β TCR und assoziierten
Molekülen
CD3 Proteine dienen der
Expression des TCR an
Zelloberfläche u. Signaltransfer
von TCR ins Zellinnere →
Aktivierung der T – Zelle
CD4 bzw. CD8 binden als
Corezeptor an MHC Klasse I od.
II (APC) → präsentiert ein
Peptid ;Antigen → vom α β TCR
spezif. erkannt → löst
Immunantwort aus
Einteilung nach Funktion
Zytotoxische T – Zellen (CTL):
- Oberflächenmarker: CD8
- Töten infizierte Zellen unseres Körpers und Tumorzellen
- Erkennen Peptide auf MHC Klasse I
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T – Helferzellen:
Oberflächenmarker: CD4
Aktivieren CTL und Makrophagen und fördern B – Zell Differenzierung
- Erkennen Peptide auf MHC Klasse II
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4. MHC Klasse I Komplex und ß2 Mikroglobulin
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Besitzen eine schwere α – Kette und
eine leichte β – Kette
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Außerhalb des MHC codiert ß2
Mikroglubin (ß2m)
ß2m ist hochkonserviert
α – Kette ist hoch polymorph
MHC I Komplex ist Trimer aus
schwerer Kette, ß2 Mikroglubin und
dem Peptid
TCR von CTL und CD8 binden
MHC I
TCR bindet Peptid und Oberfläche
von MHC I
CD8 bindet α – Domäne von MHC I
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5. MHC Klasse II Komplex
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nur auf B – Zell, Makrophagen
und dentritischen Zellen
hat α – Kette und β – Kette, beide
transmembrane Glykoproteine mit
je zwei lg- ähnlichen Funktionen
MHC II präsentiert für Antigene ,
die durch endozytose
aufgenommen werden
TCR von T – Helferzelle und
CD4 binden MHC II
CD4 bindet an ß2 Domäne von
MHC II
Prozessieren von Antigenen durch
MHC Molekülen
Aufnahme eines exogenen
Antigen → wird prozessiert
- Peptid wird auf der Zelloberfläche
MHC Kl. II Molekülen präsentiert
 Aufnahme einer endogenen
viralen DNA → codiert Virus
Antigen →
wird prozessiert → werden MHC
Kl. I Molekülen präsentiert
Peptidfragmente entstehen in
verschiedenen Kompartimenten
der Zelle
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Funktion von MHC Molekülen ist
die Antigenpräsentation
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Zytotoxische T – Zellen erkennen ein
fremdes Antigen (z.B. Virus) und
tötet Zielzelle
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Helfer T – Zellen erkennen fremdes
Antigen in Verbindung mit
Genprodukten auf
antigenpräsentierenden Zellen (APC)
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Helfer T – Zellen können mit B –
Zellen bei der Induktion von
Antikörper zusammenarbeiten u.
Lymphokine freisetzen, welche
Makrophagen beim Abtöten
intrazellulärer Mikroorganismen
unterstützen.
Quellennachweis
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Kurzes Lehrbuch der Immunologie; 2.
neubearbeitete Auflage von Ihor Harabacz
Molekulare Genetik von Rolf Knippers; 8.
Auflage
Lehrbuch der Genetik von Seyffert; 2. Auflage
An introduction to Genetic Analysis von
Griffiths; 7. Auflage