Veränderte Enzymaktivitäten bei Mg

gewinnen sie ihre Fähigkeit, K zu transportieren,
zurück (Abbn. 3 a, b ) . Wachstum (und Proteinsynthese) ist h i e r f ü r notwendig. Inkubiert m a n Mg-arm
gewachsene Zellen in einem Mg-reichen M e d i u m
ohne Stickstoffquelle, so daß kein Zellwachstum eintritt, wobei aber der verminderte intrazelluläre MgGehalt ebenfalls normalisiert wird 1 , d a n n wird der
gehemmte K - T r a n s p o r t nicht wieder hergestellt.
Mit der N o r m a l i s i e r u n g des K-Transportes während des Zellwachstums erfolgt in der gleichen Zeitabhängigkeit die N o r m a l i s i e r u n g der durch den MgMangel veränderten Stoffwechselleistungen. Abb. 3
zeigt a u ß e r d e m , wie schnell die H e m m u n g des K-
T r a n s p o r t e s b e i m Wachsen in einem Mg-freien Med i u m auftritt. Die Ä n d e r u n g e n des Stoffwechsels
entwickeln sich parallel mit der gleichen Geschwindigkeit 1 .
Auch diese Ergebnisse sprechen d a f ü r , daß die
H e m m u n g des K-Transportes durch die bei Mg-Mangel a u f t r e t e n d e partielle E n t k o p p l u n g verursacht
wird. Wahrscheinlich wird bei Mg-verarmten Zellen
ein K o p p l u n g s f a k t o r der oxydativen Phosphorylier u n g nicht m e h r in ausreichender Menge gebildet.
Seine Synthese erfolgt offenbar erst wieder, wenn
M g - a r m gewachsene Zellen in einem Mg-haltigen
M e d i u m wachsen.
Veränderte Enzymaktivitäten bei Mg-arm gewachsenen Zellen von E. coli
T H . GÜNTHER
und
P.
MARISZ
Physiologisch-Chemisches Institut der Freien Universität Berlin
(Z. Naturforsch. 23 b, 338—341 [1968]; eingegangen am 24. J u l i 1967)
Bei Mg-arm gewachsenen E. coli haben zahlreiche Enzyme andere spezifische Aktivitäten als bei
Mg-reich gewachsenen Zellen. Diese Veränderungen waren bei den Enzymen des E m b d e n M e y e r h o f - Weges sowie bei der G-6-P-Dehydrogenase und ICDH gering. Mg-arm gewachsene
Zellen bilden nur noch wenig GDH. Bei nachfolgendem Wachstum in Mg-reichem Medium bleibt
die GDH-Aktivität niedrig.
Verminderte GDH-Aktivitäten werden auch nach Wachsen unter K-, NH 4 -, S0 4 - und P0 4 -Mangelbedingungen gefunden. Die Ursachen werden diskutiert.
Bei Mg-arm gewachsenen Zellen von E. coli sind
— neben einer partiellen Entkopplung der oxydativen P h o s p h o r y l i e r u n g u n d einer H e m m u n g des KT r a n s p o r t e s 1 — die Glykolyse und A t m u n g verm i n d e r t 2 . Z u r Charakterisierung dieser Stoffwechseländerungen untersuchten wir die Aktivitäten
verschiedener Enzyme.
Die Züchtung und Gewinnung der Zellen erfolgte
wie früher beschrieben
Zur Bestimmung der Enzymaktivitäten wurden die Zellen zweimal mit bidest. Wasser gewaschen, in 12 ml 25 mmol Trispuffer pH 7,2 suspendiert und unter Kühlung in einer Eis-Kochsalzmischung mit Ultraschall aufgeschlossen. Die Zellhomogenate wurden 35 Min. bei 0 °C und 120 000 g zentrifugiert. Verschiedene Mengen des Überstandes (0,5
bis 1,0 mg Protein/2 ml Ansatz) wurden zur Bestimmung der Enzymaktivitäten verwendet.
Die Testansätze enthielten in 2 ml:
T H . GÜNTHER
[1968].
U.
P . MARISZ,
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase [/tMol] : 200 Tris
(pH 7,4), 14 Glucose-6-phosphat, 0,25 T P N - N a H 2 , 9,6 M g C l 2 , Enzymüberstand, Start im Glucose-6-phosphat.
Laktatdehydrogenase [//Mol] : 200 Tris (pH 7,4), 20
KCN, 0,20 D P N H - N a 2 , 8,5 Na-Pyruvat, Enzymüberstand, Start mit Pyruvat.
Methode
1
Hexokinase [//Mol] : 120 Tris (pH 7,4), 4 Glucose,
1,6 M g C l 2 , 1 T P N - N a - H 2 , 1 A T P - N a 2 - H 2 ,
50 /ug Glucose-6-P-Dehydrogenase, Enzymüberstand, Start mit ATP.
Z. N a t u r f o r s c h g . 2 3 b,
334
Isozitratdehydrogenase [//Mol]: 200 Tris (pH 7,4),
1,6 M g C l 2 , 0,2 T P N - N a - H 2 , 3,0 D-L-IsozitratNa 3 , Enzymüberstand, Start mit Isocitrat.
Alkoholdehydrogenase [//Mol] : 120 Pyrophosphat (pH
8,7), 120 Semicarbacid, 1,3 mMol Äthanol, 2,4
DPN, 20 KCN, Enzymüberstand, Start mit Äthanol.
DPN-abhängigeGlycerophosphatdehydrogenase[/tMol]:
200 Tris (pH 7,4), 0,26 D P N H - N a 2 , 3,6 Triosephosphatester
(mit NaHCO s neutralisiert),
Enzymüberstand, Start mit Triosephosphat.
2
T H . GÜNTHER U. P . MARISZ, i n V o r b e r e i t u n g .
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Phosphofructokinase: Der Inkubationsansatz enthielt
in 1,3 ml [//Mol] : 78 Tris (pH 8,0), 2,0 MgCl 2 ,
2,0 ATP, 10 Fructose-6-phosphat, Enzymüberstand (ca. 100//g Protein), Start mit Fructose-6phosphat. Nach 15 Min. Inkubation bei 25 °C
wird der Ansatz mit 0,2 ml 30-proz. HC10 4 enteiweißt. Nach Zentrifugation wird der Überstand
mit festem KHC0 3 neutralisiert und in den folgenden optischen Test eingesetzt: 200 //Mol Tris
(pH 7,4), 0,26 //Mol D P N H - N a 2 , 20 /ug Aldolase, Start mit Glycerophosphatdehydrogenase, Volumen 2 ml.
Aldolase: Der Inkubationsansatz enthielt in 1,3 ml
[//Mol] : 130 Tris (pH 7,4), 9,1 Fructosediphosphat und Enzymüberstand (ca. 100 /ug Protein).
Dieser Ansatz wird 15 Min. bei 25 °C inkubiert,
mit 0,2 ml 30-proz. HC10 4 enteiweißt und mit
festem K H C 0 3 neutralisiert. Der neutralisierte
Überstand wird mit 200//Mol Tris (pH 7,4), 0,26
//Mol DPNH-Na 2 und 20 /ug Glycerophosphatdehydrogenase (GDH) in einem Volumen von
2 ml getestet. Start mit GDH.
Enolase: Der Inkubationsansatz enthielt in 1,3 ml
[//Mol]: 130 Tris (pH 7,4), 1,95 MgCl 2 , 9,9
2-Phosphoglycerat und Enzymüberstand. 15 Min.
Inkubation bei 25 °C. Der mit HC10 4 enteiweißte
und mit KHC0 3 neutralisierte Überstand wird getestet mit: 200//Mol Tris (pH 7,4), 2//Mol ADP,
2//Mol MgCl 2 , 20 /ug LDH (Boehringer), 2 0 / / g
Pyruvatkinase (Boehringer). Start mit Pyruvatkinase, Volumen 2 ml.
HK
PFK
ALD
ENOL
PK
LDH
ADH
G-6P-DH
ICDH
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Mg-r
Mg-a
Pyruvatkinase: Der Inkubationsansatz enthielt in 1,3 ml
[//Mol]: 78 Tris (pH 7,4), 1,95 MgCl 2 , 1,95
ADP—Na3, 4,7 Phosphoenolpyruvat, Enzymüberstand. 15 Min. Inkubation bei 25 °C. Der enteiweißte und neutralisierte Überstand wird in 2 ml
mit 200 //Mol Tris (pH 7,4), 2,6//Mol DPNH —
Na 2 und 20 /ug LDH (Boehringer) getestet.
Protein wurde nach LOWRY et al. 3 bestimmt.
Ergebnisse und Diskussion
Bakterien, die über Nacht in einem Mg-armen
Medium gewachsen sind, weisen von Enzym zu
Enzym verschieden, entweder höhere, niedrigere
oder gleiche Enzymaktivitäten im Vergleich mit Mgreich gewachsenen Kontrollzellen auf (Tab. 1 ) . Die
Änderung der Enzymaktivitäten hängt außerdem
noch vom Substrat und den Züchtungsbedingungen
(aerob bzw. anaerob) ab. Die aufgetretenen Unterschiede waren bei den getesteten glykolytischen
Enzymen gering und betrugen das 2 — 3-fache.
Im Gegensatz zu den geringfügigen Aktivitätsänderungen der Glykolyseenzyme fanden wir bei der
DPN-abhängigen
Glycerophosphatdehydrogenase
(GDH) eine fast vollständige Hemmung der Enzymsynthese. Mg-reich gewachsene E. coli haben eine
Glucose aerob
Glucose anaerob
42,1
96,4
433
736
288
271
225
627
37,7
59,6
76,4
90,9
9,9
20,7
187
150
443
191
20,5 ±
71,9 ±
675 ±
593 ±
497 ±
351 ±
1679 ±
846 ±
97,9 ±
66,0 ±
402 ±
235 ±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
3,1
13,3
52
59
26
27
25
66
5,3
12,9
0,6
13,5
2,4
3,7
44
6
47
21
101
175
14,2
35,9
Glycerin aerob
4,2
10,5
136
93
33
21
86
27
22,9
14,6
18
38
34,5 ± 6,8
18,5 ± 3,8
263 ± 27
231 ± 25
233 ± 25
162 ± 9
429 dt 36
689 ± 91
36,6 ± 3,4
40,0 ± 9,9
244 ± 43
234 ± 19
± 13,3
± 12
± 5,4
± 9,8
134
134
343
186
±
±
±
±
15
24
37
32
Tab. 1. Enzymaktivitäten [m/z Mol/mg Prot. • Min.] in E. coli B 163 nach Züchtung in Mg-reichem (Mg-r, 10~ 2 -m. Mg) und
Mg-armem (Mg-a, 3 - 1 0 - 7 - m . Mg) Medium mit 0,5% Glucose unter aeroben (95.% 0 2 —5% C0 2 ) und anaeroben (95% N2—5%
C0 2 ) Bedingungen sowie 0,5% Glycerin unter aeroben Bedingungen. Die Enzymaktivitäten wurden im 120 000 g Überstand
nach Aufschließen der Zellen mit Ultraschall bestimmt. (Einzelheiten s. Methode). Mittelwerte (z) aus 5 — 6 Versuchen (n),
( / = ± 1 / — ^ — X l } . ) , x{ = Einzelwerte, HK = Hexokinase, P F K = Phosphofructo\
X n- (n — 1) )
kinase, ALD = Aldolase, ENOL = Enolase, P K = Pyruvatkinase, LDH = Lactatdehydrogenase, ADH = Alkoholdehydrogenase, ICDH = TPN-abhängige Isocitratdehydrogenase.
± mittlerer Fehler der Mittelwerte
3
O . H . LOWRY, N . J . ROSEBROUGH, A . L . FARR U. R . J . RANDALL, J . b i o l . C h e m i s t r y 1 9 3 , 2 6 5
[1951].
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GDH-Aktivität von ca. 120 m ^ M o l / m g Prot. Min.,
Mg-arm gewachsene n u r von ca. 5 m/zMol/mg Prot.
Min. (Tab. 2 ) .
Mg-r
Mg-a
K-a
P04-a
S04-a
NH4-a
120
6,5
19
17
22
11
Tab. 2. Aktivität der Glycerophosphatdehydrogenase (GDH)
(in m/t Mol/mg P r o t . - M i n . ) . Die Zellen waren über Nacht in
Mg-reichem (Mg-r), Mg-armem (Mg-a), K-armem (K-a), P 0 4 armem (P0 4 -a) und NH 4 -armem (NH 4 -a) Medium gewachsen.
(Zusammensetzung der Medien s. 1. c. 1 .) Die GDH-Aktivität
wurde im 120 000 g Überstand nach Aufschließen der Zellen
mit Ultraschall im optischen Test mit Triosephosphat und
D P N H bestimmt.
Die Bestimmung der kinetischen Konstanten der
GDH ergab f ü r Mg-arm und Mg-reich gewachsene
Zellen gleiche Werte. Mischt man die Überstände von
Mg-reich und Mg-arm gewachsenen Zellen, dann erhält m a n eine Aktivität, die dem arithmetischen Mittel entspricht. Damit läßt sich die Anwesenheit eines
Inhibitors ausschließen. Die Abnahme der GDH-Aktivität its also auf eine Abnahme der Enzymmenge
zurückzuführen.
Eine Gesetzmäßigkeit, w a r u m die Aktivität einiger Enzyme bei Mg-arm gewachsenen Zellen erhöht
und anderer erniedrigt ist, läßt sich nicht erkennen.
Es ist möglich, daß die Zunahme der spezifischen
Aktivität einiger Enzyme bei den Mg-arm gewachsenen Zellen n u r vorgetäuscht wird, weil die Synthese
anderer Enzyme noch stärker gehemmt wird. Auf
jeden Fall ergibt sich, daß bei Mg-Mangel die
Enzymsynthese unterschiedlich beeinflußt wird, bzw.
daß die Synthese einiger Enzyme früher, wenn die
intrazelluläre Mg-Ionenkonzentration noch höher ist,
zum Stillstand kommt. Eine Aktivitätsänderung der
an der Protein- und Nucleinsäurebildung beteiligten
Mg-abhängigen Enzyme infolge einer Abnahme der
intrazellulären Mg-Ionenkonzentration ist unwahrscheinlich, weil hierdurch die Synthese aller Enzyme
wahrscheinlich im gleichen Maße betroffen sein
müßte.
Am Zustandekommen dieser unterschiedlichen
Enzymsynthese könnte die Katabolit-Repression 4
beteiligt sein, denn bei Mg-arm gewachsenen Zellen
4
5
6
B. MAGASANIK, Cold Spring Harbor Sympos. quantitat.
Biol. 2 6 , 2 4 9 [1961].
W. SZER u. S. OCHOA, J. molecular Biol. 8, 823 [1964].
M . GRÜNBERG-MANAGO U. J . DONDON, Biochem.
biophysic.
Res. Commun. 18, 517 [1965].
7
sind vor allem die Zwischenstoff-Konzentrationen
von Glucose-6-Phosphat erniedrigt und die von Fructosediphosphat und Pyruvat e r h ö h t 2 . Eine andere
Möglichkeit ist die Änderung der Codierung bei Mga r m gewachsenen Zellen. Bei Versuchen am isolierlierten Proteinbiosynthese-System wurden bei einer
Änderung der Mg-Konzentration im Ansatz vom
gleichen messenger einige Aminosäuren in höherer
anderer in niedrigerer Rate in Protein eingebaut 5 ~ 7 .
Läßt man Mg-arm gewachsene E. coli in einem
Mg-reichen Medium weiterwachsen, dann erfolgt
während der ersten Stunden kein Anstieg der
spezifischen Aktivität der GDH, obwohl die Bakterien innerhalb weniger Minuten ihren normal
hohen Mg-Gehalt zurückgewinnen, anfangen zu
wachsen und sich in der logarithmischen Phase mit
ihrer typischen Generationszeit vermehren (Abb. 1 ) .
Es wird also noch GDH gebildet, aber der GDHGehalt der Zelle bleibt auf einem niedrigeren Niveau
fixiert. Eine E r k l ä r u n g h i e r f ü r bieten die Befunde
von S U Z U K I et al. 8 und N A K A D A et al. 9 , wonach bei
der Erholung Mg-verarmter E. coli zunächst anomale Ribosomen gebildet werden. Diese ungewöhnlichen Partikel existieren noch in der logarithmischen Wachstumsphase. Man k a n n daraus schließen,
daß diese Partikel nicht in der Lage sind, alle
Enzyme in n o r m a l e r Menge zu bilden.
Die V e r m i n d e r u n g der GDH scheint, wie das
logarithmische Wachstum der Bakterien zeigt, f ü r
die Zelle unwesentlich zu sein. Wahrscheinlich reicht
die vorhandene Aktivität noch f ü r das exponentielle
Wachstum in einem Salz-Glucose-Medium aus.
In Abb. 1 sieht man auch die Abnahme der GDH,
wenn Mg-reich gewachsene Bakterien in Mg-freiem
Medium gezüchtet werden. Dabei kommt es, wie
auch K E N N E L L et a l . 1 0 an A. aerogenes gefunden
haben, noch zu einer Vervierfachung der Zellzahl,
bis das Wachstum aufhört. Gleichzeitig sinkt die
GDH-Aktivität auf den Wert Mg-arm gewachsener
Zellen ab.
Die A b n a h m e der GDH-Aktivität erfolgt nicht n u r
unter Mg-Mangelbedingungen. Auch bei Bakterien,
die über Nacht in K-, P 0 4 - , S 0 4 - und NH 4 -armen
Medien gewachsen sind, nimmt die GDH-Aktivität
8
H. SUZUKI U. Y. HAYASHI, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 8 7 , 6 1 0 [1964].
9
D . NAKADA U. M . J . MARQUISEE, J . m o l e c u l a r Biol. 1 3 , 3 5 1
[1965].
10
D . KENNELL U. A . KOTOULAS, J . B a c t e r i o l . 9 3 , 3 3 4 [ 1 9 6 7 ] .
B . FRIEDMAN U. I. B. WEINSTEIN, P r o c . n a t . A c a d . Sei. U S A
5 2 , 9 8 8 [1964],
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Abb. 1 a.
Glycerophosphatdehydrogenase (GDH)-Aktivität
Mg-reich gewachsener Zellen während der Inkubation in
einem Mg-freien Medium (Kurve 1) und GDH-Aktivität Mgarm gewachsener Zellen während des Wachstums in einem
Mg-reichen Medium (Kurve 2 ) .
— wenn audi in etwas geringerem Maße — ab
(Tab. 2 ) . Dieser Effekt läßt sich ebenfalls auf Katabolit-Repression zurückführen 4 . D a r ü b e r h i n a u s kann
man die Abnahme der GDH bei K- u n d NH 4 -Mangel
noch damit erklären, daß bei erniedrigter K- bzw.
NH 4 -Konzentration
die Proteinbiosynthese
zum
Stillstand k o m m t 1 1 , weil K® und NH 4 ® f ü r die Bindung der Amino-acyl-s-RNS an die Ribosomen nötig
s i n d 1 2 ' 1 3 . Auch hierbei sind verschiedene Enzyme
wiederum verschieden stark betroffen, denn die Aktivitäten der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase und
Glutamat-Pyruvat-Transaminase z. B. waren unverändert.
11
12
13
M. LUBIN U. H. L. ENNIS, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 80, 614 [1964].
T. W. CONWAY, Proc. nat. Acad. Sei. USA 51, 1216 [1964].
G. J. SPYRIDES, Proc. nat. Acad. Sei. USA 51, 1220 [1964].
0
1
2
3
4
5
t [Stdn]
6
7
Abb. 1 b. Wachstumsgeschwindigkeit Mg-reich gewachsener
Zellen in einem Mg-freien Medium (Kurve I) und Wachstumsgeschwindigkeit Mg-arm gewachsener Zellen in einem
Mg-reichen Medium (Kurve I I ) . Die Wachstumsgeschwindigkeit wurde durch Extinktionsmessung bei 405 nm gemessen.
Bringt man K- und NH 4 -arm gewachsene Zellen
in ein K- und NH 4 -reiches Wachstumsmedium, dann
nimmt die GDH-Aktivität ähnlich wie bei Mg-Mangel
anfangs nicht zu, obgleich die Zellen wachsen. Möglicherweise werden auch hier wie bei der Erholung
nach Mg-Mangel zunächst veränderte Ribosomen gebildet, die nicht alle Enzyme ausreichend synthetisieren können.
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