SE Polysaccharides [CHE

LEIMGRUBER Simon
SE Polysaccharides
SE Polysaccharides [CHE.555]
Xanthan
Inhaltsverzeichnis
1. Herkunft
2. Chemische Struktur
3. Supramolekulare Struktur
4. Anwendung
5. Biosynthese
6. Industrielle Herstellung
7. Analyse & Charakterisierung
8. Datenblatt
9. Literatur
1. Herkunft
Xanthan wird von gram-negativen, aeroben Bakterien der Gattung Xanthomonas,
Ordnung Xanthomonadales innerhalb der taxonomischen Klasse der GrammaProteobakterien hergestellt. Es wurde in den 1950er Jahren entdeckt und bereits
1960 industriell produziert.
Bakterien der Gattung Xanthomonas sind pflanzenpathogen und führen weltweit zu
hohen Ernteverluste. Sie befallen über 400 Pflanzenarten, wobei innerhalb der
einzelnen Bakterienspezies Pathovare eine hohe Wirtsspezifität besitzen.
Xanthomonas sind gerade stäbchenförmige Einzeller, wobei die Größe selbst
innerhalb einer Spezies stark variiert. Sie bewegen sich über polare Begeißelung fort.
Abbildung 1: Stäbchenförmige Einzeller (links), von Xanthomonas befallene Blätter (rechts).
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2. Chemische Struktur
Xanthan ist ein extracelluläres, lineares Polymer dessen Hauptstrang aus 1-4
verknüpften
β-D-Glucoseeinheiten
besteht
und
somit
identisch
mit
einem
Cellulosemolekül ist. Im Gegensatz zu diesem unverzweigten Polymer hängt beim
Xanthan am C3 jeder zweiten Glucoseeinheit ein Trisaccharid aus β-D-Mannose 1-4
verknüpft mit β-D-Glucuronsäure 1-2 verknüpft mit α-D-Mannose. Die beiden
Mannoseeinheiten sind dabei häufig derivatisiert: die α-D-Mannose kann an C6
acetyliert sein, die β-D-Mannose kann an C4- und C6-Stellung mit Pyruvat oder nur
an C6 mit Acetat verbunden sein. Der Anteil an Acetat und Pyruvat schwankt
allerdings. Typischer Weise hat Xanthan einen Besetzungsgrad von ca. 80-90% mit
Acetat und ca. 40% mit Pyruvat.
Abbildung 2: Chemische Struktur von Xanthan.
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3. Supramolekulare Struktur
In Lösung bilden zwei Xanthan-Moleküle eine Doppelhelix aus, wodurch durch ein
zunächst flexibles Polymer ein steifes Stäbchen wird. Diese Konformation bedingt die
Viskoelastischen Eigenschaften von Xanthanlösungen: In Ruhe ist eine solche
Lösung sehr viskos und verfügt über eine hohe Suspendierkraft, da die
Polymerstäbchen sich gegenseitig in ihrer Beweglichkeit behindern. Wenn
Bewegungsenergie bzw. Scherkraft in die Lösung eingebracht wird, so richten sich
die Stäbchen parallel zueinander aus und die Lösung wird frei fließend und verliert
ihre Suspensionskraft. Man bezeichnet diese Eigenschaft als scherverdünnend oder
thixotrop. Mit der Rückkehr in den Ruhenden Zustand kehrt auch schlagartig die
hohe Viskosität zurück. Die Höhe der Viskosität von Xanthanlösungen ist erheblich
vom Grad der Derivatisierung mit Acylresten und von der Anwesenheit verschiedener
Metallsalze abhängig. Ein erhöhter Anteil an Pyruvat führt z.B. in Anwesenheit von
Kaliumionen zu einer erhöhten Viskosität.
Abbildung 3: Scherverdünnung von Xanthanlösungen.
Neben dem thixotropen Effekt kann bei Xanthan der sogenannte Ketchup Effekt
auftreten, welche eigentlich das Selbe bewirken. Die Seitenketten des Xanthans
können als „Haare“ angesehen werden. Wenn diese ineinandergreifen, steigt die
Viskosität der Lösung. Wenn die Lösung wiederum Scherkräften ausgesetzt ist, sinkt
die Viskosität.
Abbildung 4: Ketchup Effekt.
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Die
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Zusammenlagerung
der
Xanthanmoleküle
ist
reversibel.
Bei
hohen
Temperaturen können die Helices aufgeschmolzen werden. Die Schmelztemperatur
hängt zu einem großen Teil von der Ionenstärke der Lösung, aber auch von der
Konzentration des Xanthans ab. Kühlt die Xanthanlösung wieder ab, lagern sich die
Moleküle wieder zusammen. Dabei können im Gegensatz zum nativen, von den
Bakterien produzierten Xanthan auch intramolekulare Haarnadel-Helices und
supramolekulare Strukturen gebildet werden. Die Folge ist, dass das denaturierte
Xanthan eine deutlich höhere Viskosität besitzt als das native Xanthan. Durch den
nach der mikrobiellen Fermentation typischerweise erfolgenden Sterilisationsschritt,
z.B. ein Erhitzen auf 130°C bis 140°C für einige Minuten, ist ein kommerziell
erhältliches Xanthan dementsprechend nicht in der nativen sondern in der
rückgefalteten Konformation.
Abbildung 5: Supramolekulares Verhalten von Xanthan.
4. Anwendung
Dank seiner ausgezeichneten pseudoplastischen Eigenschaften findet Xanthan weite
Anwendung als Verdickungsmittel, Emulgator und Stabilisator. Der größte Teil des
Xanthans (ca. 70%) geht dabei in die Lebensmittelindustrie. Die Zulassung dafür
wurde schon in den 1980er Jahren erzielt. In Europa wird Xanthan als
Lebensmittelzusatzstoff E415 geführt. Einsatz findet es als Verdicker in Soucen und
Dressings,
Emulsionsstabilisator
in
Milchprodukten,
Texturierungsmittel
für
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Tiefkühlprodukte oder Schaumstabilisator in Bier. Dabei wird es sowohl allein als
auch in Blends mit anderen Polysacchariden verwendet.
Im technischen Bereich findet Xanthan vor allem als Flutungsmittel in der
Erdölindustrie, Suspensionsmittel in Pharmazeutika oder Emulgator in Kosmetika
Einsatz.
Abbildung 6: Emulsion ohne und mit Xanthan.
5. Biosynthese
Dank der großen industriellen Bedeutung von Xanthan wurde schon früh der
Biosyntheseweg des Xanthanmoleküls im Xanthomonas campestris untersucht.
Die Synthese folgt dabei einem universellen Prinzip der Natur für die Synthese von
Oligo-
und
Polysacchariden:
Die
Hexosemoleküle
werden,
aktiviert
als
Zuckernukleotide, nacheinander auf einen in der Cytoplasmamembran verankerten
Isoprenoid-Lipidträger (Polyisophenolphosphat) übertragen. Jeder einzelne Schritt
erfordert dabei ein eigenes Enzym. Zusätzlich werden ein oder zwei Acetylreste von
Acetyl-CoA (AcCoA) und ein Pyruvatrest von Phosphoenolpyruvat (PEP) an den
beiden Mannoseresten gebunden.
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Abbildung 7: Biosynthese von Xanthan. Ac (Acetyl), Glc (Glucose), Man (Mannose), P (Phosphat),
PEP (Phosphoenolpyruvat), Pyr (Pyruvat).
Der letzte Schritt der Biosynthese ist der Export des fertigen Xanthans. Dabei muss
es zuerst von der Cytoplasmamembran abgespalten werden, durch das Periplasma
und die äußere Membran transportiert werden und zuletzt wird es in die äußere
Umwelt abgegeben. Der genaue Ablauf dieses Prozesses sowie deren Energiequelle
ist noch nicht vollständig verstanden.
Für die Xanthansynthese sind 12 Gene verantwortlich. Diese sind in einem 14kB
langen Operon, dem Gum-Operon organisiert. Wird es in ein anderes Bakterium
eingebracht, so reicht das aus, damit dieses Xanthan produziert. Mit der Identifikation
des Gum-Operons wurde die Möglichkeit eröffnet, durch gezielte genetische
Veränderungen neue Varianten von Xanthan zu erzeugen.
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6. Industrielle Herstellung
Die industrielle Herstellung von Xanthan erfolgt durch aerobe Fermentation von
Xanthomonas campestris. Die Produktion ist schubweise oder kontinuierlich möglich,
wobei indudtriell erstere bevorzugt wird. Sie findet hauptsächlich während der
exponentiellen Wachstumsphase statt. Die Ausbeute und Eigenschaften des
gewonnenen Xanthan sind abhängig vom zur Produktion verwendeten Stamm und
den Produktionsbedingungen.
Abbildung 8: Produktionsablauf der Xanthanherstellung.
Die Bakterien werden gewöhnlich als Glycerinstocks bei -80°C aufbewahrt. Um eine
geeignete Menge an Inoculum zu erreichen, erfolgt die Kultur über mehrere Stufen in
Schüttelkolben und Fermentern mit steigenden Volumina. Die Anzahl der Schritte bis
zum Produktionsfermenter hängt von dessen Größe ab.
Zur Herstellung von Xanthan ist ein geeignetes Medium notwendig. Die am
häufigsten verwendete Kohlenstoffquelle sind Glucose und Saccharose im
europäischen und amerikanischen Raum und Stärke im asiatischen Raum. Lactose
wird von X. campestris nur ungenügend verstoffwechselt. Es wurden aber Varianten
isoliert, die aus Lactose wachsen und Xanthan produzieren können, was für die
Verwendung von Abfällen aus der Milchproduktion interessant ist.
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Die Stickstoffquelle kann bevorzugt aus einem organischen Komplex stammen, aber
auch anorganische Quellen können gut verwendet werden. Xanthomonas kann gut
auf rein synthetischem Medium wachsen und Xanthan produzieren, alle notwendigen
Aminosäuren und Vitamine werden selbst produziert. Am besten dafür geeignet sind
Ammoniumsalze. Nitrate dagegen sind nicht geeignet, da Xanthomonas keine
Nitratreduktase besitzen.
Wird mindestens ein Nährstoff limitiert, wird die Produktion von Xanthan begünstigt.
Besonders geeignet dafür ist die Limitierung von Stickstoff, Phosphat, Magnesium
oder Stärke. Die Qualität des produzierten Xanthans unterscheidet sich jedoch
abhängig davon, welches Element limitiert wird. Durch genaues Einstellen des
C/N/P/S/Mg-Verhältnisses kann die Xanthanproduktion so für bestimmte Qualitäten
optimiert werden.
Eine Temperatur von 28-30°C gilt als optimal für die Produktion. Höhere
Temperaturen bringen zwar eine bessere Xanthanausbeute, die für die Qualität des
des Xanthans wichtige Pyruvatgehalt nimmt aber dabei ab. Der pH-Wert für das
optimale Wachstum der Bakterien liegt bei 7. Da während der Fermentation von X.
campestris große Mengen an Essigsäure gebildet werden, muss der pH-Wert durch
Zugabe von NaOH oder KOH konstant gehalten werden.
Einer
der
wichtigsten
Aspekte
bei
der Produktion
von
Xanthan
ist
der
Sauerstoffeintrag. Die extrem hohe Viskosität, bedingt durch die hohe Konzentration
an Xanthan, erschwert eine gleichmäßige Durchmischung im Produktionsfermenter:
Massentransfer und damit auch Sauerstoggtransfer sind gehemmt. Diesem Problem
kann mit einer sehr hohen Begasungsrate und sehr starkem Energieeintrag
zumindest teilweise begegnet werden.
Die Fermentation wird beendet, wenn die gesamte C-Quelle verstoffwechselt ist. Die
Fermentationsbrühe wird zur Abtötung der Bakterien sterilisiert. Dabei wird auch eine
Konformationsänderung des Xanthan bewirkt, die eine Erhöhung der Viskosität zur
Folge hat.
Um eine vollständige Fällung des Xanthans in Alkohol (Ethanol oder Isopropanol) zu
gewährleisten, werden der Brühe ca. 3% NaCl zugefügt.
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Das Präzipitat wird anschließend abgetrennt, gewaschen, getrocknet und vermahlen.
Das so erhaltene Pulver ist gräulich bis weiß. Es enthält neben dem Xanthan auch
die gesamte Bakterienmasse sowie Proteinreste des Mediums. Für spezielle
Anwendungen kann es nötig sein, die Bakterien abzutrennen. Das erfolgt entweder
durch Filtration, Zentrifugation oder enzymatischen Abbau. Der Alkohol wird durch
Destillation regeneriert.
7. Analyse & Charakterisierung
Bei der Charakterisierung von Xanthan müssen mehrere Parameter berücksichtigt
werden. Dazu gehören die Chemische Struktur, der Acetat und Pyruvat Anteil, das
Molekulargewicht, die Sekundären Strukturen sowie das rheologische Verhalten.
Chemische Charakterisierung
1. Zuckerzusammensetzung
Die Zuckerzusammensetzung von Xanthan ist schwer zu bestimmen da die Cellulose
Hauptgruppe schwer zu hydrolysieren ist. Des Weiteren verhindert die Anwesenheit
von Uronsäure in den Seitenketten die totale hydrolyse von von β-D-GlcA-(1,2)-α-DMan ohne die Glucuronsäure abzubauen. Deshalb müssen mehrere Arten der
Hydrolyse eingesetzt werden, um alle Komponenten des Xanthans quantifizieren zu
können. Aufgrund dieser Probleme bei der Analyse wird bei der offiziellen
Beschreibungen von Xanthan, z.B. von der JECFA (Joint Expert Committee for Food
Additives),
nicht
die
Zusammensetzung
angegeben,
sondern
das
Gelierungsvermögen mit Locust Bean Gum.
2. Pyruvat Bestimmung
Nach der Hydrolyse kann der Pyruvatgehalt von Xanthan auf verschiedene Weise
bestimmt werden. Die älteste Methode ist dabei eine kolorimetrische Prozedur mit
2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH).
Des Weiteren kann der Pyruvatgehalt enzymatisch mit Lactatdehydrogenase (LDH)
bestimmt werden:
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Die Menge an freigesetztem NAD+ wird anschließend bei 340 nm bestimmt.
Neben diesen Methoden ist auch eine simultane Detektion mit HPLC und NMR
möglich.
3. Acetat Bestimmung
Hierfür gibt es eine Methode welche Hydroxamsäure zur Bestimmung verwendet,
heute wird jedoch hauptsächlich HPLC und NMR verwendet.
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Physikalische Charakterisierung
1. Molekulargewicht
In der Literatur variieren die Werte für das mittlere Molekulargewicht Mw von Xanthan
zwischen 4 und 16*106 g/mol bei einer Polydispersität Mw/Mn von 2,8. Die
Bestimmung
des
Molekulargewichtes
erweist
sich
aufgrund
des
hohen
Molekulargewichtes, der Steifheit der Moleküle sowie der Anwesenheit von
Aggregaten als schwierig.
Grundsätzlich gibt es mehrere Analysetechniken, wobei die Wichtigsten GPC-MALLS
(gelpermeation chromatography mit multi-angle laser light scattering), AFFF-MALLS
(assymetrical flow field fractionation in Kombination mit multi-angle laser light
scattering) sowie Elektronenmikroskopie sind.
Abbildung 9: Ablauf der Molekulargewichtsbestimmung mittels GCR-MALLS und AFFF-MALLS.
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GPC-MALLS
Bei der GPC findet die Seperation als Funktion der Molekülgröße statt. MALLS als
Detektor liefert dabei Informationen über das Molekulargewicht. Der Vorteil dieser
Technik ist, dass das absolute Molekulargewicht und der Gyrationsradius ohne
Säulenkalibration oder Standards bestimmt werden können. Die Nachteile bei der
Analyse von Xanthan sind dabei vielfältig. Ein Problem stellt das große
hydrodynamische Volumen dar, da es hierfür keine geeigneten Säulen mehr gibt.
Beim Säulen sind die Makromoleküle starken Scherkräften ausgesetzt, wodurch es
zu Molekülzersetzungen kommen kann. Des Weiteren ist es schwierig bei der
Auswertung der von MALLS generierten Werte auf den Nullwinkel zu extrapolieren.
AFFF-MALLS
AFFF trennt die Moleküle nach ihrem Diffusionskoeffizienten, dadurch können
Makromoleküle mit einem hydrodynamischen Radius von bis zu mehreren µm
getrennt werden. Der Vorteil gegenüber GPC ist dabei, dass kein Packungsmaterial
benötigt wird und somit keine Scherkräfte auf die Moleküle einwirken. Der Nachtei ist,
dass die Fließgeschwindigkeit, das Injektionsvolumen und das Lösungsmittel genau
aufeinander abgestimmt werden müssen.
Elektronenmikroskopie
Diese Technik ermöglicht die direkte Messung der Xanthanmoleküle. Vorher müssen
die Proben allerdings Vakuum getrocknet und mit einem Platin-Film beschichtet
werden.
Die
Konturlänge
der
einzelnen
Xanthanketten
können
mit
dem
Elektronenmikroskop visualisiert und anschließend daraus das Molekulargewicht
berechnet werden. Zusätzlich kann mit dieser Methode die Struktur von Mikrogelen
detektiert werden.
2. Sekundärstruktur
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Xanthan in wässriger Lösung
können
mit
verschiedenen
Lichtstreumethoden,
Techniken
hydrodynamische
studiert
werden.
Methoden,
die
Dazu
gehören
Bestimmung
thermodynamischer Eigenschaften und kalorimetrische Methoden.
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Eine relativ neue Technik zur Bestimmung der Sekundärstruktur von Xanthan ist die
Atomkraft Mikroskopie AFM. Sie erlaubt die Visualisierung von Probeoberflächen,
mit einer Auflösung auf atomarer Ebene. Somit können sowohl Bilder von
Xanthanmolekülen sowie deren Aggregate aufgenommen werden. Zusätzlich besteht
die Möglichkeit, Molekulare Wechselwirkungen zu bestimmen.
3. Rheologie
Abhängig
von
den
Bedingungen
in
Lösung
wie
Polymerkonzentration,
Salzkonzentration oder Beigabe weiterer Hydrokolloide können Xanthan Systeme
Newton’sche Lösungen, Pseudoplastische Lösungen oder Gele bilden.
Bei der Bestimmung von rheologischen Eigenschaften wird grundsätzlich eine
Scherkraft angelegt und die daraus resultierende Scherspannung gemessen.
Häufig bestimmte Parameter sind dabei die intrinsische Viskosität η und die
viskoelastischen Eigenschaften. Bei letzteren wird der elastische Anteil durch das
Speichermodul G` und der viskose Anteil durch das Verlustmodul G`` angegeben.
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8. Datenblatt
Molekulargewicht: 16*106 g/mol
Zuckerverhältnis: D-Glucose : D-Mannose : D-Glucuronsäure = 2 : 2 : 1
Acetatgehalt: 5%
Pyruvatgehalt: 3%
Anwendung in Lebensmitteln:
Sensorische Bewertung:
Aussehen
weiß - cremefarben
Geruch
arteigen, einwandfrei
Geschmack
arteigen, einwandfrei
Konsistenz
einwandfrei
Chemische / Physikalische Daten:
pH - Wert
6,0 - 8,0
Asche %
max. 16
Pyruvat %
min. 1,5
Isopropanol mg/kg
max. 500
Viskosität cps (1%)BF,LVT,sp.3, 60rpm, 25°C 1.400 - 1.600
Korngröße
durch 25 mesh (0,7 mm)
100 %
durch 45 mesh (0,36 mm)
nicht mehr als 95 %
Schwermetalle ppm
max. 20
Blei ppm
max. 2
Arsen ppm
max. 3
Mikrobiologische Daten:
Gesamtkeimzahl p/g
max. 2.000
Hefen p/g
max. 100
Schimmelpilze p/g
max. 100
E. coli / 5 g
negativ
Salmonellen / 25 g
negativ
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Technische Anwendung:
Aussehen
weiß - cremefarben
Korngröße
40-80 mesh
Viskosität 1% Lösung in 1% KCL
1300 – 1600 cps
V1/V2
1.02 – 1.45
pH von 1% Lösung in Wasser
6.0 – 8.0
Feuchtigkeit
13% max
Asche
13% max
9. Literatur
K. Born, V. Langendorff, P. Boulenguer, Xanthan. Biopolymers Online. Wiley-VCH
Verlag, 2005.
G. Antranikian. Angewandte Mikrobiologie. Springer-Verlag, Heidelberg, 2006.
H.-D. Beltz, W. Grosch, P. Schieberie. Food Chemistry, 3rd Edition, Springer, 2004.
G. Holzwarth. Moleculat weight of xanthan polysaccharide. Carbohydrate Research.
66:173-186, 1978.
Internet: http://www.hansacoll.de/page2/page15/page16/page16.html
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