Interaktion zwischen Metronidazol und parodontopathogenen

Interaktion zwischen Metronidazol
und parodontopathogenen Bakterien
im Zusammenhang mit KB-Zellen
Daniela Stephan
Einleitung
 „Die Parodontitis ist die häufigste chronisch-entzündliche
Erkrankung des Menschen“ (Henderson et al. 2003).
 Actinobacillus actinomycetemcomitans ist der Leitkeim der
aggressiven lokalisierten Parodontitis (Slots und Ting 1999).
 Porphyromonas gingivalis verursacht vor allem schwere Formen
der chronische Parodontitis (Slots und Ting 1999).
Einleitung
CH2CH2OH
Metronidazol
O3N
 Gruppe der Nitroimidazolderivate
N
CH3
N
 Anaerobes Wirkungsspektrum
 Antibakterielle Wirkung in reduzierter Form auf
Nukleinsäuresynthese der Mikroorganismen
 In der Parodontitistherapie: Lokale Applikation als Elyzol-Gel,
Systemische Anwendung oft in Kombination mit Amoxicillin
Einleitung
Zytokine
 Definition: Lösliche, niedrigmolekulare Proteine, die von
verschiedenen Zelltypen des Wirtsorganismus sezerniert werden
und der Regulation von Zellfunktionen dienen
 Einteilung: Interleukine, Chemokine, Interferone,
Wachstumsfaktoren, Tumornekrosefaktoren,
koloniestimulierende Faktoren
 In der Pathogenese der Parodontitis von Bedeutung: IL-1,IL-6,
IL-8, IL-10, TGF-β1, TNF-α
 Zytokine sind sowohl an der Regulation der angeborenen als
auch der erworbenen Immunabwehr beteiligt (Sandros et. al.
2000)
Ziele der Arbeit
 Untersuchung der Wirkung verschiedener
Metronidazolkonzentrationen auf die parodontopathogenen
Bakterien Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 und
Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4 im Zusammenhang
mit KB-Zellen
 Bestimmung von Wirkungsunterschieden des Metronidazols
auf freie, adhärente und invasive Bakterien
 Ermittlung des Einflusses von parodontopathogenen Bakterien
sowie von Metronidazol auf die Freisetzung von Zytokinen aus
KB-Zellen
Material und Methoden
 Ermittlung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
von Metronidazols gegenüber den Bakterienstämmen
A. actinomycetemcomitans Y4: > 256 µg/ml
P. gingivalis ATCC 33277:
0,125 µg/ml
Material und Methoden
 In-vitro-Studie an KB-Zellen, einer permanenten
Epithelzellreihe
 Durchführung von drei Versuchsreihen:
• Vorinkubation der Zellen mit Metronidazol
• Vorinkubation der Bakterien mit Metronidazol
• Zugabe des Metronidazols zum Zeitpunkt der
Infektion der Zellen
Verwendung folgender
Metronidazolkonzentrationen:
ohne
Infektion mit
Bakterien Bakterienstamm
ohne Metronidazol (Kontrolle)
1/4 MHK
10 µg/ml Metronidazol
100 µg/ml Metronidazol
24-Well-Platte
Material und Methoden
P. gingivalis ATCC 33277 bzw.
A. actinomycetemcomitans Y4
Metronidazol
Monolayer von KB-Zellen
Inkubation 1, 6 und 18 h
Zelllyse
Gewinnen der Überstände
Zahl adhärenter
Bakterien (KBE)
Zahl frei vorkommender
Bakterien (KBE)
Zugabe von Antibiotikum
zum Abtöten adhärenter Bakterien
Zelllyse
Zahl intrazellulärer Bakterien (KBE)
Freigesetzte Zytokine
IL-1β, IL-6, IL- 8,
TNFα und TGF- β1
Ergebnisse – Antibakterielle Effekte
A. actinomycetemcomitans Y4
Anzahl der Bakterien (KBE/Well)
Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen
10.000.000
1.000.000
100.000
10.000
1.000
100
10
1
1h
6h
Adhärenz
18 h
1h
6h
Invasion
ohne Metronidazol (Kontrolle)
10 µg/ml Metronidazol
18 h
6h
18 h
freie Bakterien
2,5 µg/ml Metronidazol
100 µg/mlMetronidazol
Bei allen Versuchen mit A. actinomycetemcomitans Y4
konnte keine Reduktion der Kolonie bildenden Einheiten
detektiert werden.
Ergebnisse – Antibakterielle Effekte
P. gingivalis ATCC 33277
Anzahl der Bakterien (KBE/Well)
Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen
10.000.000
1.000.000
100.000
10.000
1.000
100
10
1
1h
6h
Adhärenz
18 h
1h
6h
Invasion
ohne Metronidazol (Kontrolle)
10 µg/ml Metronidazol
18 h
6h
18 h
freie Bakterien
2,5 µg/ml Metronidazol
100 µg/mlMetronidazol
Bei den Versuchen mit P. gingivalis ATCC 33277 konnte nur eine
geringe Verminderung der Bakterienzahlen ermittelt werden.
Ergebnisse - Zytokinfreisetzung
Freisetzung von TGF-β1 aus KB-Zellen
Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen
Konzentration (pg/ml)
100
90
1h
80
6h
18 h
70
60
50
40
30
20
10
0
M
Aa
Pg
M
Aa
Pg
M
Aa
Pg
ohne Metronidazol
1/4 MHK
10 µg/ml Metronidazol
100 µg/ml Metronidazol
Die Konzentrationen von TGF-β1 waren kurzzeitig nach Zugabe
des Metronidazols leicht erhöht.
Ein eindeutiges Ergebnis konnte nicht erzielt werden.
Ergebnisse - Zytokinfreisetzung
Freisetzung von IL-8 aus KB-Zellen
Konzentration (pg/ml)
Zugabe des Metronidazols bei Infektion der Zellen
450
400
1h
350
6h
18 h
300
250
200
150
100
50
0
M
Aa
Pg
M
Aa
Pg
M
Aa
Pg
ohne Metronidazol
1/4 MHK
10 µg/ml Metronidazol
100 µg/ml Metronidazol
Metronidazol induziert die Freisetzung von IL-8 aus KB-Zellen.
Bei Infektion der Zellen mit A. actinomycetemcomitans konnten
ebenfalls erhöhte Konzentrationen von IL-8 nachgewiesen
werden.
Diskussion - Antibakterielle Effekte
Ursachen der Ineffektivität von
Metronidazol gegenüber
A. actinomycetemcomitans Y4
 Mikroaerophiles Bakterium – Ergebnisse in guter
Übereinstimmung mit dem festgestellten anaeroben
Wirkungsspektrum von Metronidazol (Chow et al. 1977)
 In vielen In-vitro-Studien Resistenz von
A. actinomycetemcomitans gegenüber Metronidazol
festgestellt (Eick et al. 2004, Müller et al. 2002)
Diskussion - Antibakterielle Effekte
Mögliche Ursachen der
Ineffektivität von Metronidazol gegenüber
P. gingivalis ATCC 33277
 Biofilmbildung der adhärenten Bakterien an den KB-Zellen mit
nachfolgender schlechteren Wirksamkeit des Metronidazols
(Eick et al. 2004)?
 Veränderung des Phänotyps von invasiven Bakterien (Eick und
Pfister 2004)?
 Interaktion zwischen Zellen und Bakterien oder zwischen den
Zellen und dem Metronidazol führt zu Hemmung oder
Inaktivierung der Nitroreduktasen der Bakterien und somit
entsteht keine antibakteriell wirksame Form des Metronidazols?
Diskussion - Zytokinfreisetzung
Einfluss von Metronidazol und den
Bakterien auf die Freisetzung von TGF-β1
aus KB-Zellen
 TGF-β1 hemmt die Produktion von Matrix-Metalloproteinasen,
die zum Abbau der interzellulären Matrix führen. Die
Erhöhung der TGF-β1-Konzentration im parodontalen
Gewebe könnte die Regeneration des entzündeten Gewebes
unterstützen (Chang et al. 2002)
 Die kurzfristige Induktion der TGF-β1-Bildung durch
Metronidazol könnte einen positiven Einfluss auf den
Entzündungsprozess haben.
Diskussion - Zytokinfreisetzung
Einfluss von Metronidazol und den
Bakterien auf die Freisetzung von
Interleukin-8 aus KB-Zellen
 P. gingivalis induziert in KB-Zellen die Produktion von IL-8, seine
Proteasen bauen IL-8 ab (Zhang et al. 1999)
 Metronidazol hat keinen Einfluss auf den Abbau von IL-8 durch
Proteasen von P. gingivalis
 Metronidazol und P. gingivalis – doppelte Induzierung der IL-8Freisetzung aus KB-Zellen?
 IL-8 beeinflusst im Rahmen der angeborenen Immunantwort die
Anlockung von polymorphkernigen Granulozyten.
Schlussfolgerungen
 Die antibakterielle Wirkung des Metronidazols auf
Actinobacillus actinomycetemcomitans und Porphyromonas
gingivalis im Kontakt zu KB-Zellen ist gering. Metronidazol
kann in der Therapie parodontaler Erkrankungen nur adjunktiv
angewendet werden.
 Metronidazol hat immunmodulatorische Eigenschaften. Im
Zusammenhang mit Deep Scaling und Root planing könnte
dies positiv zu bewerten sein, da es die initiale Immunantwort
stimuliert.