400 Jahre Chemie und Pharmazie in Marburg

Die Geburt zweier Wissenschaften:
400 Jahre Chemie und Pharmazie in Marburg
Neurodegeneration und Neuroprotektion
Arbeitsgruppe Culmsee – Klinische Pharmazie
Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Die Entwicklung neuer Therapiestrategien für neurodegenerative Erkrankungen ist ein Forschungsschwerpunkt der Arbeitsgruppe Klinische Pharmazie. In
Modellsystemen akuter Hirnschädigung (Schlaganfall, Schädel-Hirn-Trauma) und chronisch-neurodegenerativer Erkrankungen (Morbus Alzheimer, Morbus
Parkinson) werden mit Hilfe proteinbiochemischer und molekularbiologischer Methoden neue Interventionspunkte für mögliche neuroprotektive
Therapieansätze ermittelt. Diese Arbeiten umfassen gentherapeutische Strategien (siRNA) und die Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe, die zunächst in
Zelllinien und primären Neuronenkulturen getestet und dann in klinisch relevanten Tiermodellen validiert werden.
A
Kontrolle
PD146176 0.5µM
30
25
20
15
***
10
5
0
1
Kontrolle
PD146176 0.1µM
PD146176 0.5µM
120
Glutamat 17h
Viabilität (% Kontrolle)
% Lipidperoxidation
35
Neuronaler Zelltod
100
***
80
60
Trauma, Ischämie,
Amyloid-beta, Glutamat
***
40
20
0
0mM
Ca2+ Ca2+
5mM
Glutamat
2
Ca2+
B
Lipidperoxidation nach Glutamatschädigung.
Glutamat induziert in neuronalen Zellen die Bildung von
reaktiven
Sauerstoffspezies
(freie
Radikale,
Peroxide).
Inhibitoren der 12/15-Lipoxygenasen verhindern die Bildung der
reaktiven Sauerstoffspezies und schützen die Zellen. A. Die
Lipidperoxidation wird mit Hilfe von Fluorezenzfarbstoffen
gemessen und das Überleben der Zellen über Absorptionsänderungen bestimmt (B., MTT-Assay).
Zellmembran
Lipoxygenasen
Ca2+ Ca
ROS
120
2+
2+
Ca2+ Ca
2+
Ca2+ Ca
Ca2+
Ca2+
Ca2+
1
Fused
Fragmented
C
IonenKanäle
100
80
60
40
2
Glutamat-vermittelter Calcium-Einstrom (Exzitotoxizität).
A. Glutamat führt in primären Neuronen zum Einstrom toxischer Calciummengen.
Der folgende rasche Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration wird durch
einen Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht. NS309, ein Aktivator von
bestimmten Kaliumkanälen, vermindert den Calciumeinstrom deutlich (B) und
schützt die Neurone so gegen die Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität (C).
20
0
Kontrolle
Bid
6
AIF
Cytochrom c
Apoptosom
3
AIF/DAPI
Kontrolle
DAPI
tBid
tBid
Mitochondrien-Fragmentierung.
Mitochondrium
AIF
7
Translokation des proapoptotischen Proteins Bid. Nach
Glutamatschädigung transloziert Bid (rot) aus dem Zytosol zu den Mitochondrien
(grün). Die Translokation von Bid zu den Mitochondrien führt zur Überlagerung
von roter und grüner Fluoreszenz, die gelb dargestellt wird (weiße Pfeile). Der
Zellkern ist mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff blau angefärbt.
Caspasen
8
Glutamat
A
P
P
p53
P
P
AIF
p53
DNA
Schädigung
B
C
mRNA
GAPDH
Bid
Zellkern
Nach Glutamat-Exposition kommt es in geschädigten Neuronen zur
Translokation von AIF (Apoptose induzierender Faktor, grün) aus
den Mitochondrien in den Zellkern (blau). AIF führt im Zellkern zu
DNA-Fragmentierung und somit zum Zelltod. Der Bid Inhibitor BI6c9 unterdrückt die Freisetzung von AIF aus den Mitochondrien, so
dass die Neurone überleben.
α-Tub
Mut-siRNA
Bid-siRNA
100
***
80
60
40
20
0
B
0
15´
3h
6h
***
60
40
20
Control
Glutamate
C
12h 24h
<30
min
p53
p53
Silicon coating
80
0
Glutamate
4mM
Control Glutamate
3mM
Cell viability (% control)
PFT
LF2000
Mut-siRNA
Bid-siRNA
100
der folgenden siRNA-Prozessierung. B. Nachweis der Bid-Expression auf RNAund Proteinebene. C. Messung der Integrität der Mitochondrienmembran durch
einen Fluoreszenzfarbstoff (JC-1) und D. neuroprotektive Wirkung der Bid-siRNA.
A
Vehicle
120
RNA-Interferenz ermöglicht das gezielte Ausschalten der BidExpression. A. Schematischer Überblick der siRNA-Aufnahme in die Zelle und
A. cerebri media
A
***
4
Neuronaler
Zelltod
A
Protein
AIF-Translokation in geschädigten Neuronen.
D
120
Cell viability (%control)
BI-6c9
+ Glutamat
9
Bid
7
Glutamat 9h
Glutamat 6h
5
JC-1 red fluorescence
(% of control)
6
Mitochondrien erscheinen in gesunden Zellen als Netzwerk von
langen, tubulären Organellen. Glutamat induziert die vermehrte
Fragmentierung und Immobilisierung der Mitochondrien. Der
Bid-Inhibitor BI-6c9 verhindert diese Fragmentierung und schützt
so die Neurone vor dem Zelltod.
3
Tubulin
p-tBid
120
100
80
***
60
40
20
0
Nylon thread
- 43%
8
AIF-vermittelte Infarktentwicklung nach zerebraler
Ischämie. In einem Schlaganfallmodell der Maus (A) entwickeln
Harlequin-Mäuse (HQ) einem wesentlich geringeren Infarkt als die
Kontrolltiere (B). AIF ist somit ein vielversprechendes Target für die
Entwicklung neuroprotektiver Wirkstoffe.
p53/NeuN
AIF
80
40
*
*
*
*
20
0
9
B
60
Vehicle
HQ/HQ
Vehicle 15‘‘
1h
6h
3h
PFT application
after trauma
Neuroprotektive Wirkung des p53-Inhibitors Pifithrin (PFT). A, B.
Verstärkte Ansammlung von p53 in Hirngewebe nach Schädel-Hirn-Trauma. Die erhöhte
Ansammlung und Aktivierung von p53 führt in Nervenzellen in der Regel zum Absterben
der Zellen. C. Durch die Gabe des p53 Inhibitors PFT bis 6 h nach Trauma werden
Hirngewebe und -funktion weitgehend bewahrt.
BI - 6C9
+/HQ
Lesion expansion (%)
24h after trauma
+/+
NeuN
B
5
Control
Glutamate
D
Annexin-V binding (x-fold)
C
A. carotis communis
7
Glutamate
6
5
4
3
2
***
1
0
Entwicklung eines niedermolekularen Bid-Inhibitors. A. 3D-Struktur
von Bid mit der Bindungstasche (grün) des Bid-Inhibitors BI-6c9. Die BH-3 Domäne
ist rot dargestellt. B-D. Protektive Effekte von BI-6c9 in einer neuronalen Zelllinie
(immortalisierte hippokampale Neurone der Maus, HT-22) .