13.11.2014
Vermehrung oder Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien in Biogasanlagen?
Prof. Dr. Dr.-Ing. Peter Kämpfer
Institut für Angewandte Mikrobiologie
Justus-Liebig-Universität Gießen
Potentieller Transfer antibiotikaresistenter Bakterien
aus der Landwirtschaft
Eingangsproben:
Gülle und Festmist aus
intensiver Tierhaltung
Pharmazeutika (Antibiotika)
Futtermittelrückstände (Cu, Zn)
Pathogene Bakterien
Bakterielle Sporen
Antibiotiaresistente Bakterien
Resistenzgene
Viren
Biogasanlagen als
technologische Barriere für
pathogene und antibiotikaresistente Bakterien ??
Ausgangsproben:
Fermentierter Rückstand
aus Biogasanlagen
Pharmazeutika (Antibiotika)
Futtermittelrückstände (Cu, Zn)
Pathogene Bakterien
Bakterielle Sporen
Antibiotiaresistente Bakterien
Resistenzgene
Viren
1
13.11.2014
Dargestellte Ergebnisse aus Untersuchungen von:
15 Biogasanlagen 2012-2014 (BGA001-BGA015)
Untersuchungen im Rahmen des BMBF Projektes
RiskWa
11 Biogasanlagen 2013 (BG1-BG11)
Untersuchung in Kooperation mit Prof. Breves,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Eingangsproben/Gärsubstrat (nur Gülle/Festmistanteil)
Ausgangsproben/Gärrest
Vorkommen potentiell humanpathogener
antibiotikaresistenter Bakterien in der Großtierhaltung
Extended-Spectrum- Beta- Lactamase (ESBL)-tragende Enterobacteriaceae
> Gram-negative Gammaproteobacteria
> Klinisch relevant: Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli
Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)
> Gram-positive Firmicutes
> Klinisch relevant: Staphylococcus aureus
saureus.mlst.net
Vancomycin-resistente Enterococcus (VRE)
> Gram-positive Firmicutes
> Klinisch relevant: Enterocccus faecalis, Enterococcus faecium
efaecalis.mlst.net
2
13.11.2014
ESBL tragende Enterobacteriaceae
CHROMagar ESBL (www.mast-diagnostica.com)
Genomische
DNA
Plasmid mit
ESBL Gen
Multiplex-PCR
(Parallele Detektion verschiedener Gene)
blaSHV (747 bp)
blaCTX-M (593 bp)
blaTEM (445 bp)
Monstein et al. (2007) APMIS 115, 1400-1408
ESBL – Extended-Spectrum-Beta-Lactamasen
Beta-Laktamasen: bakterielle Enzyme, hydrolysieren Laktam-Ringstrukturen der Antibiotika
Punktmutationen in den enzymcodierenden Genen können „Effektivität der Enzyme” erhöhen
(=Extended-Spectrum Beta-Laktamasen; ESBL)
-> Hydrolysieren Cephalosporine (1. – 4. Generation)
Erstes ESBL Auftreten:
SHV-2 in 1983 Klebsiella ozeanae
Bisher 9 Familien an Beta-Laktamasen bekannt:
TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB,
GES, TLA, BES, OXA
SHV-2
CTX-M
Paterson and Bonomo (2005) Clin. Microbiol. Rev. 218(4): 657-686
CTX-M
Dominierend nach TEM und SHV
Zum ersten Mal beschrieben in 1992
Erfolgreiche/schnelle Verbreitung ->110 CTX-M Typen sind bekannt
3
13.11.2014
ESBL E. coli Populationen bei Mensch, domestizierten
Tieren und Wildtieren
ESBL tragende E. coli gleicher Sequenztypen
wurden bei Menschen, Wildtieren und domestizierten
Tieren detektiert
Möglicher Transmission:
Großtierhaltung
Genomische
DNA
Mensch
Plasmid mit
ESBL Gen
1.
E. coli Stamm 1
E. coli Stamm 1
E. coli Stamm 1
E. coli Stamm 2
2.
Gunther et al. (2011) Frontiers in Microbiology 2(246): 1-13
Detektionprinzip - ESBL, MRSA, VRE Detektion
Direktplattierung vs. spezifischer Voranreicherung
10 g
1x
Eingangs/Ausgangsproben
10 g
10 g
1g
0.1 g
1x
2x
3x
Serielle
Verdünnung in
0.9% NaCl
1. Selektive Voranreicherung
(Selektivmedium mit Antibiotika)
24 Stunden, 37°C
Plattierung auf
CHROMAgarTM
ESBL, VRE, MRSA
24 Stunden, 37°C
2. Vereinzelungsausstrich
CHROMAgarTM ESBL, VRE, MRSA
24 Stunden, 37°C
3. Screening einzelner Kolonien
Nachweis von Resistenzgenen (Multiplex-PCRs)
“Phylogenetische” Identifizierung: 16S rRNA Gen
4
13.11.2014
Ergebnisse der Direktplattierung auf
CHROMAgar E. coli
E. coli
Direktplattierung
auf CHROMAgar ESBL
Erfassung koloniebildender Einheiten (KBE)
Ergebnisse von 5 BGAs
Beprobt 2012
Konzentration auf CHROMAgar ESBL kultivierbare Bakterien waren in
Eingangsproben deutlich höher als im Gärrest.
ESBL-E. coli (pink-gefärbte Kolonien) wurden nur in Eingangsproben detektiert.
Phylogenetische Identifizierung:
Pink gefärbte Kolonien: Spezifisch ESBL-E. coli
Blaue Kolonien: Citrobacter, Enterobacter, aber auch Aeromonas (unspezifisch)
Braun/Beige Kolonien: Größtenteils Pseudomonaden, Acinetobacter
FAZIT: Spezifischer Nachweis, aber geringe Detektionseffizienz bei
der Direktplattierung
Vergleich Direktplattierung – Voranreicherung zur
Detektion von ESBL E. coli auf CHROMAgar ESBL
Pinke Kolonien repräsentieren ESBL-E. coli
-> Obwohl der Nachweis bei der Direktplattierung nicht möglich war waren fast alle
Proben nach Voranreicherung positiv.
5
13.11.2014
ESBL E. coli Nachweis Vergleich der
Direktplattierung und nach Voranreicherung
February
2013/2014
April
July/
August
October
DP
10 g
1g
0.1 g
DP
10 g
1g
0.1 g
DP
10 g
1g
0.1 g
DP
10 g
1g
0.1 g
Untersuchung von zwei BGAs
(BGA001 und 015)
zwischen Februar 2013 und Februar 2014
(4 Probenahmen)
DP: Direktplatterung (aus 10 g)
10 g, 1g , 0.1 g = Mengen an
Ausgangsmaterial das in den die
Voranreicherung eingesetzt wurde
1
11
5
SHV+TEM
SHV
TEM
CTX-M
CTX-M+TEM
SHV+TEM
Output
SHV
TEM
CTX-M
BGA 001
CTX-M+TEM
Input
4 7
2 2
4
3
6 1
7 1
6
3
5
3
1 2
3
1 4 2
2
4
6 5
1 8
Nummern in den Kästchen repräsentieren
die Anzahlen von E. coli Kolonien die die
oben genannten ESBL Gene trugen.
1
Den Hauptanteil machten CTX-M Gene
aus, zusätzlich detektierten TEM Gene sind
vermutlich keine ESBL sondern
chromosomal codierte TEM-1 Gene
(vereinzelt bestätigt mit Sequenzdaten)
Abundanz verschiedener ESBL Gentypen bei
E. coli Isolaten (BGA001 und BGA015)
n=72
Fraction of E. coli with respective ESBL genes (%)
100%
n=40
2
n=8
3
SHV+TEM
4
90%
80%
n=57
SHV
TEM
25
CTX-M
70%
27
60%
7
41
50%
40%
30%
44
20%
13
10%
9
1
Input
BGA015
Output
BGA015
0%
Input
BGA001
Output
BGA001
Zusammenfassung aller
isolierten und gescreenten
E. coli Isolate aus BGA001
und BGA015 der
Untersuchungen zwischen
Februar 2013 und Februar
2014
Total: 176 Isolate
6
13.11.2014
Auftreten verschiedener CTX-M Gruppen
Zusammenfassung der Daten von BGA001 und BGA015
Analyse basiert auf 66 sequenzierten CTX-M Genen
Input
Output
CTX-M-9
6%
CTX-M-2
2%
CTX-M-2
5%
CTX-M-9
15%
CTX-M-1
83%
n = 48 CTX‐M Gene Total
CTX-M-9
12%
CTX-M-2
3%
CTX-M-1
85%
CTX-M-1
89%
n = 18 CTX‐M Gene n = 66 CTX‐M Gene CTX-M Gene der isolierten E. coli wurden waren aus der CTX-M-1 Gruppe
(>80%), CTX-M-9 und 2 wurden mit geringer Abundanz nachgewiesen.
Nachweis Methicillin resistenter Staphylococcus aureus (MRSA)
CHROMagar MRSA
(www.mast-diagnostica.com)
Multiplex-PCR
Poulsen et al. (2003)
7
13.11.2014
MRSA Nachweis (BG 1 – 10)
10 g
MRSA
1E
1A
2E
2A
3E
3A
4E
4A
5E
5A
6E
6A
7E
7A
8E
8A
9E
9A
10E
10A
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1
+
+
+
1g
a
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
+
+
+
b
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2(3)
+
+
+
+
+
a
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
+
+
+
0,1 g
b
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
c
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Resistenzgen
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
mecA
n.d.
mecA
n.d.
n.d.
n.d.
Kein Wachstum
Wachtsum
Resistenzgennachweis: Anzahl positive Kolonien nach
Vorscreening (Isolate mit Resistenzgenen nach Vereinzelung)
Kein MRSA detektiert,
In 2 Eingangsproben
mecA tragende andere
Staphylococcus spp.
E: Eingangsprobe/ Gärsubstrat
A: Ausgangsprobe/ Gärrest
Phylogenetische Identifizierung
Staphylococcus cohnii
Staphylococcus hominis
Staphylococcus lentus
8
13.11.2014
Nachweis Vancomycin resistenter Enterokokken (VRE)
CHROMagar VRE (www.mast-diagnostica.com)
Multiplex-PCR
Kariyama et al. (2008)
1: E. faecalis mit vanA
4: E. faecium mit vanB
VRE Detektion (BG 1 bis 10)
10 g
VRE
1E
1A
2E
2A
3E
3A
4E
4A
5E
5A
6E
6A
7E
7A
8E
8A
9E
9A
10E
10A
+
+
+
+
+
+
+
1
+
+
+
+
+
+
+
+
1(0)
+
1g
a
+
+
+
+
+
+
+
1
+
+
+
+
+
+
+
1
+
0,1 g
Resistenzgen
b
a
b
c
+
+
+
+ n.d.
- n.d.
+
+
+
+ n.d.
+
+
2
+ vanA
+
+
+
+ n.d.
+
+
+
+ n.d.
+
+
+
+ n.d.
+
1 vanA+vanC1
+ 1(0) +
+ vanA
+
1
+
1 vanC1
+
+ 1(2) vanC1
1(0) + 1(0) + vanC1
+
+
+
+ n.d.
+
+
+
+ n.d.
+
+ 1(0) + vanC1
+
+
+
+ n.d.
+
+
+
+ n.d.
+
+
- vanC1
- n.d.
+
+
+
+ n.d.
Kein Wachstum
Wachtsum
Resistenzgennachweis: Anzahl positive Kolonien nach
Vorscreening (Isolate mit Resistenzgenen nach Vereinzelung)
VRE Nachweis in
3 Eingangs- und
5 Ausgangsproben
E: Eingangsprobe/ Gärsubstrat
A: Ausgangsprobe/ Gärrest
9
13.11.2014
Phylogenetische Identifizierung der VRE Isolate
Enterococcus faecium
Enterococcus mundtii
Enterococcus pseudoavium/
Enterococcus viikkiensis
Enterococcus cassilifalvus
Direkter kultivierungsunabhängiger Resistenzgennachweis
ESBL Gene der CTX-M Gruppe
Mit ESBL E. coli „gespikte“ Proben
(Spiking vor der DNA Extraktion)
Nicht „gespikt“
Mix
Output
107 cells
Marker
Input
107 cells
E. Coli SHV
Output
105 cells
Output mix
Input
105 cells
Input mix
Output
103 cells
Input NaCl
Input
103 cells
Output NaCl
Marker
Test der Nachweiseffizienz für ESBL Gene mittels
„spiking“-Experiment
E. coli CTX-M
ResistenzgenNachweis über PCR
1, Multiplex-PCR
(CTX-M, TEM, SHV)
2, QPCR
(CTX-M-1 Gruppe)
E. coli TEM
Direkte
DNA Extraktion
aus der Umweltprobe
Reinkulturen
(Positivkontrolle)
DNA Extraktion aus 250 mg Probe
103 ESBL E. coli Zellen → Schwaches Signal
105 ESBL E. coli Zellen → Starkes Signal
10
13.11.2014
ESBL MRSA
Standard
B1E
B1A
B2E
B2A
B3E
B3A
B4E
B4A
B5E
B5A
B6E
B6A
B7E
B7A
B8E
B8A
B9E
B9A
B10E
B10A
Referenz
NTC
Standard
Direktnachweis von Resistenzgenen aus Eingangs/Ausgangsproben (Kultivierungsunabhängig)
für ESBL und MRSA und VRE Gene
B: Biogasanlage 1-10
E: Eingang
A: Ausgang
Referenz: Positivekontrolle
NTC: No-Template Kontrolle
mecA
+ +
+ +
+ +
+ +
+
+ + + +
+ + +
+ + + +
nuc
SHV
CTX-M
TEM
16S rRNA Gen
(Amplifiktionskontrolle)
-> ESBL Gene waren in Eingangs- und Ausgangsproben detektierbar
(in 2 von 10 Eingängen waren CTX-M Gene detektierbar, nicht in Gärresten)
-> mecA Gene wurden in 4 von 10 Eingangs- und Ausgangsproben detektiert
-> VRE: vanA, vanB, vanC1 konnten nicht detektiert werden
Ergebniszusammenfassung
•
Biogasanlagen eliminieren ESBL und VRE nicht vollständig
•
Probenabhängig wurden ESBL-tragende E. coli und VRE in Eingangs- und
Ausgangsproben von Biogasanlagen detektiert
•
ESBL Gene wurden in Eingangs- und Ausgangsproben auch
Kultivierungsunabhängig detektiert.
•
VRE: klinisch relevante Enterococcus faecalis wurden nachgewiesen
•
MRSA konnten nicht nachgewiesen werden:
mecA tragende Staphylokokken wurden kultivierungsabhängig nur in zwei
Eingangsproben nachgewiesen;
kultivierungsunabhängig wurden mecA Gene in Eingangs- und
Ausgangsproben detektiert
Input
sample
Output
sample
11
13.11.2014
Projektpartner
IAM
IHU
Institut für Hygiene und Umweltmedizin
Institut für Angewandte Mikrobiologie
Prof. Dr. Peter Kämpfer
Stefanie Glaeser
Thorsten Schauss
Steffen Wohlgemuth
Olivia Sovinsky
Jana S. Brunner
Alexandra Gütschow
Prof. Dr. Wolfgang Dott
Tina Wings
ILL
Institut für Lebensmittelchemie und ‐biotechnologie
Prof. Dr. Gerd Hamscher
Astrid Spielmeyer
12
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Vermehrung oder Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien in