Untersuchungen zur Analytik und diagnostischen Aussagekraft des

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Analytik und diagnostischen Aussagekraft
des Wachstumsfaktors Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF) bei Hunden mit tumorösen Erkrankungen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Meike Frenz
Flensburg
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup,
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen
Prof. Dr. S. Neumann,
Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes der
Georg-August-Universität, Göttingen
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. F.-J. Kaup
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2014
Meiner Familie gewidmet
Teile dieser Arbeit sind bei folgender Zeitschrift eingereicht:
FRENZ, M., F.-J. KAUP, S. NEUMANN (2014):
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with haemaniosarcoma and
haematoma.
Research in Veterinary Science
Ergebnisse dieser Dissertation wurden als Vortrag auf folgender
Fachtagung präsentiert:
FRENZ, M. (2013):
Möglichkeiten der Differenzierung von Milzläsionen bei Hunden mittels Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF).
Vortrag auf der 21. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische
Labordiagnostik“ der DVG.
München: 01.-02.02.2013
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG ................................................................................................................11
2
LITERATURÜBERSICHT.............................................................................................13
2.1
Der „Vascular Endothelial Growth Factor“ VEGF ................................................................... 13
2.2
Regulation der VEGF-Gen Expression ..................................................................................... 14
2.3
VEGF-Rezeptoren ....................................................................................................................... 15
2.4
Rolle von VEGF bei der physiologischen Angiogenese/Vaskulogenese ............................. 16
2.5
Rolle von VEGF bei der pathologischen Angiogenese .......................................................... 17
2.6
VEGF bei Neoplasien des Hundes ............................................................................................ 19
3
MATERIAL UND METHODEN .....................................................................................23
3.1
Patienten – gesunde Kontrollgruppe ........................................................................................ 23
3.2
Geräte und Verbrauchsmaterialien ........................................................................................... 25
3.2.1
Geräte .................................................................................................................................. 25
3.2.2
Verbrauchsartikel ................................................................................................................. 25
3.2.3
Reagenzien und Lösungen .................................................................................................. 26
3.3
Gewinnung und Verarbeitung der Proben ............................................................................... 26
3.3.1
Blutgewinnung ...................................................................................................................... 26
3.3.2
Aufbereitung der Proben ...................................................................................................... 27
3.3.3
Prinzip des ELISA zur Bestimmung von VEGF ................................................................... 27
3.4
Durchführung des ELISA ........................................................................................................... 28
3.4.1
3.5
Testdurchführung „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ ............................................. 28
Auswertung ................................................................................................................................. 29
3.5.1
Auswertung des ELISA ........................................................................................................ 29
3.6
Histopathologie ........................................................................................................................... 29
3.7
Statistik ........................................................................................................................................ 29
Inhaltsverzeichnis
4
ERGEBNISSE ..............................................................................................................30
4.1
MANUSKRIPT I ............................................................................................................................ 30
4.1.1
Abstract ............................................................................................................................... 31
4.1.2
Introduction ........................................................................................................................ 31
4.1.3
Materials and methods ...................................................................................................... 33
4.1.4
Results ................................................................................................................................ 35
4.1.5
Discussion .......................................................................................................................... 36
4.1.6
References .......................................................................................................................... 40
4.2
Manuskript II ................................................................................................................................ 47
4.2.1
Abstract ............................................................................................................................... 47
4.2.2
Introduction ........................................................................................................................ 48
4.2.3
Material and methods ........................................................................................................ 49
4.2.4
Results ................................................................................................................................ 51
4.2.5
Discussion .......................................................................................................................... 53
4.2.6
References .......................................................................................................................... 56
5
ÜBERGREIFENDE DISKUSSION................................................................................64
6
ZUSAMMENFASSUNG ...............................................................................................70
7
SUMMARY ...................................................................................................................72
8
LITERATURVERZEICHNIS .........................................................................................74
9
DANKSAGUNG ...........................................................................................................96
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
In dieser Arbeit wurden folgende Kurzformen verwendet:
bFGF
Basic Fibroblast Growth Factor
ca.
Circa
CBC
Complete Blood Count
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
et al.
Et alii
Fig.
Figure
HIF
Hypoxia-Inducible Factor
HRE
Hypoxie Responsive Element
IL
Interleukin
MDD
Minimum Detectable Dosis
mm
Millimeter
OD
optische Dichte
pg/ml
Pikogramm pro Milliliter
Tab.
Tabelle bzw. table
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
VPF
Vascular Permeability Factor
WBC
White Blood Cells
z. B.
Zum Beispiel
Einleitung
1
Einleitung
Das Zytokin Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ist ein bedeutender vaskulärer
Wachstumsfaktor und spielt daher eine Schlüsselrolle bei der physiologischen und
pathologischen Angiogenese (FERRARA 1999a). Dies gilt besonders im Zusammenhang mit
Tumorwachstum
und
–metastasierung,
da
VEGF
ein
wichtiger
Regulator
der
Tumorangiogenese ist (Folkmann, 1975).
Der Wachstumsfaktor VEGF wird nachweislich von Tumorzellen und den Stromazellen des
Tumors sezerniert (Fukumura et al., 1998) und wurde bisher in zahlreichen Studien bei
Mensch und Hund quantitativ mittels ELISA in Blutproben bestimmt. Viele human- und
tiermedizinischen Studien kamen zu dem Ergebnis ansteigender Serum- und/oder PlasmaVEGF Level in Tumorpatienten im Vergleich zu gesunden Probanden (GEORGE et al. 2000;
SHIMADA et al. 2001; KARAYIANNAKIS et al. 2002a; CLIFFORD et al. 2001; GENTILINI et
al. 2005; KATO et al. 2007; TAYLOR et al. 2007; SOBCZYNSKA-RAK 2009). In einer
Vielzahl caniner Tumoren konnte außerdem eine VEGF-Expression nachgewiesen werden,
so dass von einem bedeutenden Einfluss des angiogenen Wachstumsfaktors VEGF auf die
Tumorgenese auch bei Hunden ausgegangen wird (MAIOLINO et al. 2000; YONEMARU et
al. 2006; REBUZZI et al. 2007; TAYLOR et al. 2007; WOLFESBERGER et al. 2007; ALDISSI et al. 2009; MATIASEK et al. 2009; SHIOMITSU et al. 2009; AMORIM et al. 2010;
MILLANTA et al. 2010).
Bei den bisherigen Studien, die sich mit der Messung der VEGF Konzentration in Serum
und/oder Plasma von Hunden mit tumorösen Erkrankungen beschäftigt haben, wurde
überwiegend ein Human-ELISA eingesetzt (CLIFFORD et al. 2001; GENTILINI et al. 2005;
KATO et al. 2007; TAYLOR et al. 2007), während der erst kürzlich kommerziell verfügbare
canine VEGF-ELISA nur auf sehr wenige Studien beschränkt ist (ABRAMS et al. 2011;
ARESU et al. 2012; MAIOLINI et al. 2013).
11
Einleitung
Ziel der vorliegenden Dissertation war daher die Untersuchung der Serum-VEGF
Konzentration bei Hunden mit unterschiedlichen Neoplasien unter Verwendung des neuen
für Hunde entwickelten ELISA. Für die Validierung wurden beispielhaft Gesäugetumore und
Hämangiosarkome gewählt, da diese Tumorentitäten von intensiven Prozessen der
Angiogenese begleitet werden. In diesem Zusammenhang wurde auch die
Möglichkeit
untersucht, ob sich bei der Milz neoplastische Läsionen von nicht-malignen Veränderungen
am Beispiel von Hämatomen anhand der VEGF-Serumkonzentration differenzieren lassen.
Die Ergebnisse der Untersuchung wurden in zwei Manuskripten zur Publikation
dokumentiert.
12
Literaturübersicht
2
Literaturübersicht
Bereits im Jahre 1983 gelangen SENGER et al. die Isolation eines Proteins, das die
Gefäßpermeabilität erhöht und das daher den Namen Vascular Permeability Factor (VPF)
erhielt (SENGER et al. 1983). Unabhängig davon wurde 1989 durch FERRARA und
HENZEL ein endothelzellspezifisches Mitogen identifiziert, der Vascular Endothelial Growth
Factor (VEGF) (FERRARA u. HENZEL 1989). Weitere Untersuchungen ergaben, dass es
sich bei diesen beiden Faktoren um dasselbe Protein handelte (LEUNG et al. 1989).
2.1
Der „Vascular Endothelial Growth Factor“ VEGF
VEGF (auch als VEGF-A bezeichnet) ist ein Polypeptid aus der VEGF-Familie, zu der neben
VEGF-B (OLOFSSON et al. 1996), VEGF-C (JOUKOV et al. 1996), VEGF-D (ACHEN et al.
1998) und PIGF (Placenta Growth Factor) (MAGLIONE et al. 1991) auch noch die
verwandten viralen Homologen VEGF-E (Orf-virus VEGF) (LYTTLE et al. 1994) und die im
Schlangengift vorhandenen VEGF-F gehören (YAMAZAKI et al. 2009).
Das zuerst entdeckte Mitglied VEGF (VEGF-A), ein Heparin-bindendes Glykoprotein, ist ein
über eine Disulfidbrücke verbundenes Homodimer mit einem Molekulargewicht von etwa 45
kDa (FERRARA u. HENZEL 1989).
VEGF gilt innerhalb der VEGF-Familie als Hauptregulator der Vaskulogenese, Angiogenese
und Gefäßpermeabilität. Bereits die gezielte Ausschaltung von einem VEGF-A Allel führt in
Knockout Mäusen zur embryonalen Letalität aufgrund umfassender Blutgefäßmissbildungen
(FERRARA et al. 1996; YLA-HERTTUALA et al. 2007). Es wirkt als Mitogen auf
Endothelzellen von Arterien, Venen und Lymphgefäßen und fungiert als „Survival Factor“
(Überlebensfaktor) für Endothelzellen (GERBER et al. 1998a; GERBER et al. 1998b;
FERRARA 1999a). Zusätzlich erhöht VEGF durch morphologische Veränderungen des
Endothelzellverbandes die Gefäßpermeabilität und spielt damit eine wichtige Rolle bei
entzündlichen Prozessen (SENGER et al. 1983; DVORAK et al. 1995). VEGF hat aber nicht
ausschließlich Effekte auf Endothelzellen, sondern stimuliert z. B. auch die Chemotaxis von
Monozyten (CLAUSS et al. 1990).
13
Literaturübersicht
VEGF wird dabei von einer Vielzahl an unterschiedlichen Zellarten (u. a. Thrombozyten,
Lymphozyten, neutrophilen Granulozyten, Makrophagen, glatten Muskelzellen) sezerniert, zu
denen auch Tumorzellen und Tumor-assoziierte Stromazellen gehören (FERRARA et al.
1991; BERSE et al. 1992; FUKUMURA et al. 1998).
Das humane VEGF Gen besteht aus acht Exons, die durch sieben Introns gegeneinander
abgegrenzt sind, und ist auf Chromosom 6p21.3 lokalisiert (VINCENTI et al. 1996). Durch
alternatives Splicing der mRNA aus demselben Gen werden verschiedene Varianten
(Isoformen) des Proteins VEGF von unterschiedlicher Länge hervorgebracht. So wurden im
Menschen bisher 9 Isoformen (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 148, VEGF 162, VEGF 165,
VEGF 165b, VEGF 183, VEGF 189 und VEGF 206) identifiziert, während im Hund 5
Isoformen (VEGF 120, VEGF 144, VEGF 164, VEGF 188 und VEGF 205) bekannt sind
(SCHEIDEGGER et al. 1999; ROBINSON u. STRINGER 2001; DICKINSON et al. 2008).
Die Isoformen unterscheiden sich durch ihre Größe (die Nummern entsprechen der Anzahl
Aminosäuren im jeweiligen Protein) und biologische Eigenschaften. Die im humanen
Organismus vorherrschende Form ist VEGF 165, während im Hund die Isoform VEGF 164
überwiegt. Dabei ist die Aminosäure-Sequenz zwischen Mensch und Hund nahezu identisch
(FERRARA 1999a; SCHEIDEGGER et al. 1999).
2.2
Regulation der VEGF-Gen Expression
Die VEGF-Genexpression wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst. Als wichtigster
Regulationsfaktor hat sich jedoch der Sauerstoffpartialdruck (pO2) erwiesen. Die VEGF
mRNA Expression wird bei sinkendem Sauerstoffpartialdruck gesteigert, das heißt, die
Expression von VEGF wird durch Hypoxie induziert (MINCHENKO et al. 1994).
Die Hypoxie-induzierte Transkription der VEGF mRNA ist dabei abhängig von dem „hypoxiainducible factor 1 (HIF-1). HIF-1 ist ein basisches, heterodimeres Doppelhelix-Protein, das
aus zwei Untereinheiten (HIF-1α und HIF-1β) besteht (WANG u. SEMENZA 1995). Unter
hypoxischen Bedingungen bindet HIF-1 an das Hypoxie-responsive Element (HRE) am
VEGF-Promoter mit nachfolgender Synthese von VEGF. Neben der Hypoxie können weitere
Stimuli, wie verschiedene Wachstumsfaktoren, Zytokine, Hormone oder onkogene
Mutationen die VEGF-Expression induzieren (FERRARA 2004).
Zu den Wachstumsfaktoren, die zur VEGF-Produktion führen, gehören z. B. Transforming
Growth Factor (TGF-β), Epidermal Growth Factor (EGF), Keratinocyte Growth Factor (KGF),
Insulin-like Growth Factor (IGF-1), Tumor Necrosis Factor (TNF-α), Fibroblast Growth Factor
14
Literaturübersicht
(FGF) und Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) (PERTOVAARA et al. 1994; FRANK et al.
1995; WARREN et al. 1996). Auch proinflammatorische Zytokine, wie z. B. IL-6, bewirken die
Induktion der VEGF-Expression (COHEN et al. 1996).
2.3
VEGF-Rezeptoren
Die Interaktion des VEGF mit vaskulären Endothelzellen verläuft über die hochaffinen
Rezeptortyrosinkinasen VEGFR-1 (auch Flt-1/fms-like tyrosine kinase genannt) und VEGFR2 (auch KDR/kinase-insert-domain-containing receptor genannt), die an die Zellmembran
gebunden sind (SHIBUYA et al. 1990; TERMAN et al. 1991). Die Mitglieder der VEGFFamilie binden mit unterschiedlichen Affinitäten an die Rezeptortyrosinkinasen.
VEGFR-3 (Flt-4/fms like tyrosine kinase) ist kein Rezeptor für VEGF, sondern wird nur durch
VEGF-C und VEGF-D aktiviert. Seine Expression ist im adulten Organismus weitgehend auf
lymphatische Endothelzellen beschränkt (KOWANETZ u. FERRARA 2006).
VEGF (VEGF-A) bindet an die beiden VEGF-Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2, die aus
sieben extrazellulären Immunglobulindomänen sowie einer Transmembranregion und einer
intrazellulären Tyrosinkinase-Sequenz bestehen (SHIBUYA et al. 1990; TERMAN et al.
1991). Eine durch alternatives Splicing entstehende lösliche Form von VEGFR-1 (sFlt-1)
besitzt nur 6 extrazelluläre Immunglobulindomänen und fungiert als Inhibitor der mitogenen
VEGF-Aktivität (KENDALL u. THOMAS 1993).
Die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren führt zunächst zur Dimerisierung zweier
Rezeptoren und anschließender Autophosphorylierung, wodurch letztlich die Tyrosinkinase
aktiviert
wird.
Dadurch
werden
eine
Reihe
weiterer
intrazellulärer
Tyrosinreste
phosphoryliert. An die phosphorylierten Tyrosinreste können nun Adaptermoleküle binden
und so eine intrazelluläre Signalkaskade in Gang setzen (OLSSON et al. 2006).
VEGFR-1 hat eine deutlich höhere Affinität zu VEGF im Vergleich zu VEGFR-2, zeigt aber
nur eine schwache Tyrosin-Autophosphorylierung als Antwort auf die VEGF-Bindung (DE
VRIES et al. 1992). Daher scheint VEGFR-1 nicht primär für die Übermittlung von mitogenen
Signalen verantwortlich zu sein. Stattdessen stimuliert er vor allem die Monozytenmigration
und kann, als sogenannter „decoy“ Rezeptor, inhibitorisch auf die VEGFR-2 vermittelte proangiogene Signaltransduktion wirken (PARK et al. 1994; BARLEON et al. 1996; RAHIMI et
al. 2000). VEGFR-1 spielt aber eine essentielle Rolle bei der embryonalen Vaskulogenese.
Untersuchungen an Knockout-Mäusen ergaben, dass VEGR-1 defiziente Embryos bereits
am Tag 8,5 infolge von Gefäßmissbildungen starben. So kommt es zwar zur Entwicklung von
15
Literaturübersicht
Endothelzellen, diese sind aber nicht imstande geeignete Blutgefäßstrukturen auszubilden
(FONG et al. 1995; FONG et al. 1999).
Obwohl VEGFR-2 VEGF mit geringerer Affinität bindet als VEGFR-1, gilt er als
Hauptvermittler der mitogenen, angiogenen und permeabilitätssteigernden Wirkung von
VEGF (FERRARA 2004). Außerdem kommt ihm eine Schlüsselrolle bei der Hämatopoese
zu. In VEGFR-2 defizienten Mäuseembryos entwickeln sich keine Endothelzellen oder
hämatopoetischen Zellen und die Bildung von organisierten Blutgefäßen bleibt aus. Die
Embryonen versterben daher zwischen Tag 8,5 und 9,5 der Embryonalentwicklung
(SHALABY et al. 1995).
Die Expression der VEGF-Rezeptoren wird ebenfalls durch Hypoxie sowie durch das Protein
VEGF selbst induziert (TUDER et al. 1995; SHEN et al. 1998).
2.4
Rolle von VEGF bei der physiologischen Angiogenese/Vaskulogenese
VEGF spielt nicht nur eine zentrale Rolle bei der Angiogenese im adulten Organismus,
sondern ist auch essentiell für die embryonale Vaskulogenese und Angiogenese
(CARMELIET et al. 1996; FERRARA et al. 1996).
Unter dem Begriff Angiogenese versteht man das Wachstum neuer Kapillaren aus bereits
bestehenden Gefäßen durch Sprossungs- und Spaltungsvorgänge. Diese ist primär für die
Entstehung von Blutgefäßen während der späten Embryogenese und im Erwachsenenalter
verantwortlich und dient der zellulären Versorgung von Geweben mit Sauerstoff und
Nährstoffen (RISAU u. FLAMME 1995).
Die Angiogenese ist ein komplexer Prozess und wird von einer Reihe pro- und
antiangiogener Faktoren reguliert. Einer der wichtigsten pro-angiogenen Faktoren, der an der
Gefäßneubildung beteiligt ist, ist VEGF. Er führt zu einer Induktion der Gefäß-Neubildung,
der Endothelzell-Proliferation und Migration und zu einer Inhibition der Apoptose von
Endothelzellen (ALON et al. 1995; ROSEN 2002).
VEGF ist im Rahmen der physiologischen Angiogenese, die im adulten Organismus nur
selten stattfindet, erforderlich bei der zyklischen Blutgefäßproliferation im weiblichen
Reproduktionstrakt sowie bei der Wundheilung. Darüber hinaus spielt er eine wichtige Rolle
beim
Längenwachstum
von
Knochen
durch
Beteiligung
Knochenbildung (FERRARA 1999a; GERBER et al. 1999).
16
an
der
enchondralen
Literaturübersicht
2.5
Rolle von VEGF bei der pathologischen Angiogenese
Die Angiogenese ist auch an pathologischen Vorgängen beteiligt. Allerdings muss hier
zwischen überschießender bzw. fehlregulierter und fehlender Angiogenese unterschieden
werden.
Zu einer pathologisch gesteigerten Gefäßneubildung kommt es im Rahmen der
Tumorangiogenese,
diabetischer
Retinopathie,
altersbedingter
Makuladegeneration,
rheumatoider Arthritis und Psoriasis (FERRARA 2004).
Tumorangiogenese
Die Angiogenese ist essentiell für das Wachstum von Tumoren sowie für deren hämatogene
Metastasierung (Folkman, 1985, 1995).
Um eine ausreichende Sauerstoff- und Nährstoffversorgung sowie einen Abtransport von
Stoffwechselabfallprodukten der Tumorzellen zu gewährleisten, ist die Neubildung von
Blutgefäßen notwendig. Ohne den Anschluss an das Blutgefäßsystem ist Tumorwachstum
nur bis zu einer Größe von 1-2 mm3 möglich, bei der eine Versorgung über Diffusion
stattfindet und der Tumor in einem „avaskulären“ Zustand verbleibt (FOLKMAN 1985, 1990;
BERGERS u. BENJAMIN 2003). Beim Übergang in den vaskulären Zustand verschiebt sich
das Gleichgewicht zwischen Stimulatoren und Inhibitoren der Angiogenese in Richtung der
Stimulatoren und es kommt zum sogenannten „angiogenic switch“ (HANAHAN u. FOLKMAN
1996). Tumorzellen und auch Tumor-assoziierte Stromazellen sind in der Lage die Bildung
von Blutgefäßen über die Produktion und Freisetzung von pro-angiogenen Faktoren wie
VEGF zu induzieren (FERRARA u. DAVIS-SMYTH 1997; FUKUMURA et al. 1998).
Der „angiogenic switch“ kann durch Hypoxie, genetische Veränderungen in den Tumorzellen
sowie über die Aktivierung von Onkogenen
Tumorsuppressorgenen
ausgelöst
werden
beziehungsweise die Inaktivierung von
(HANAHAN
u.
FOLKMAN
1996).
In
Glioblastomen wurde z. B. die höchste VEGF-Expression in hypoxischen Tumorzellen um
fokale Nekrosen nachgewiesen (PLATE et al. 1992). Auch laut SHWEIKI et al. (1992) wird
die VEGF-Expression in angrenzenden Regionen zu hypoxisch nekrotischen Arealen
hochreguliert.
Therapeutische Ansätze/Antiangiogenese:
Die Erkenntnis, dass Tumorwachstum Angiogenese-abhängig ist, macht die Hemmung der
Angiogenese zu einem therapeutisch interessanten Ziel.
17
Literaturübersicht
Das Konzept der Antiangiogenese bzw. Angiogenese-Hemmung wurde erstmals 1971
formuliert und geht auf FOLKMAN zurück, der die These eines limitierten Tumorwachstums
in Abwesenheit von Angiogenese aufstellte (FOLKMAN 1971; FOLKMAN et al. 1971). Es
gibt verschiedene Strategien der Angiogenese-Inhibition, um die Neubildung von Gefäßen
und damit die Durchblutung des Tumors zu reduzieren.
Als Inhibitoren von VEGF werden monoklonale Antikörper (Anti-VEGF Antikörper)
eingesetzt, die spezifisch an VEGF binden und damit das Andocken an den Rezeptor und
die anschließende Stimulation der Angiogenese verhindern. KIM et al. zeigten 1993, dass
diese Antikörper einen deutlich inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum haben.
Zu den erfolgreichsten Substanzen in der reinen Angiogenese-Hemmung gehört heute in der
Humanmedizin der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin®). Dieser wurde 2005 zur
Behandlung von Patienten mit metastasiertem Kolon- oder Rektumkarzinom zugelassen und
wird mittlerweile auch zur Behandlung von fortgeschrittenem oder metastasiertem
Mammakarzinom,
nicht-kleinzelligem
Bronchialkarzinom,
Nierenzellkarzinom
und
Ovarialkarzinom eingesetzt. Bevacizumab wird in Kombination mit einer Chemotherapie
angewendet und führt zu einer
statistisch signifikant verlängerten progressionsfreien
Überlebenszeit (HURWITZ et al. 2004; SANDLER et al. 2006; ESCUDIER et al. 2007; GRAY
et al. 2009; BURGER et al. 2011).
Der Wirkungsmechanismus von Bevacizumab beruht zum einen auf der Hemmung der
Gefäßneubildung, zum anderen bilden sich noch VEGF-abhängige unreife Blutgefäße
zurück. Zusätzlich wird die in Tumorgefäßen zum Teil herabgesetzte Gefäßpermeabilität
normalisiert und die unterversorgten Bereiche damit empfänglicher für die in Kombination
eingesetzten Chemotherapeutika (WILLETT et al. 2004; JAIN 2005).
Weitere Angiogenese-Hemmer sind Tyrosinkinaseinhibitoren, deren Angriffsorte die VEGFRezeptoren sind. Hier bleibt die intrazelluläre Phosphorylierung und damit auch die
Signalkaskade aus. Bekannte VEGFR-Tyrosinkinaseinhibitoren sind z. B. Sorafenib
(Nexavar) und Sunitinib (Sutent), die beide zur Behandlung von fortgeschrittenem
Nierenzellkarzinom eingesetzt werden (KOWANETZ u. FERRARA 2006).
Der potentiell klinische Nutzen der VEGF-Inhibition ist aber nicht nur auf Tumorwachstum
beschränkt. Auch in der Augenheilkunde werden beispielsweise derzeit 2 VEGF-Inhibitoren
zur Therapie der feuchten altersbedingten Makuladegeneration genutzt. 2004 wurde der
Wirkstoff Pegabtanib (Macugen) zugelassen, ein künstlich hergestelltes RNA-Aptamer
18
Literaturübersicht
(Oligionukleotid), das hochspezifisch und mit hoher Affinität an VEGF bindet und damit
ebenfalls dessen Wechselwirkung mit dem Rezeptor verhindert (NG et al. 2006). 2007 folgte
die
Zulassung
des
humanisierten
monoklonalen
Antikörperfragments
Ranibizumab
(Lucentis) gegen VEGF, das, wie Pegabtanib, intravitreal injiziert wird (ROSENFELD et al.
2006).
Im Gegensatz zur Humanmedizin, in der VEGF eine zunehmende Verbreitung in Diagnose
und Therapie besitzt, ist die Erkenntnislage beim Hund noch gering.
2.6
VEGF bei Neoplasien des Hundes
Bereits im Jahr 1983 isolierten SENGER et al. VPF/VEGF aus den Kulturmedien
verschiedener
Tumorzelllinien
und
aus
der
tumorbedingten
Ascitesflüssigkeit
der
Hepatokarzinom-Zelllinie 10 beim Meerschweinchen (SENGER et al. 1983). Später zeigten
in-situ-Hybridisierungsversuche,
dass
VEGF
mRNA
in
vielen
humanen
Tumoren
hochreguliert wird (FERRARA u. DAVIS-SMYTH 1997). Heute gilt VEGF als bedeutender
Regulator der Tumorangiogenese und ist damit essentiell für Tumorwachstum und dessen
Metastasierung.
In einer Vielzahl humanmedizinischer Studien konnten bei Krebspatienten deutlich erhöhte
Serum-VEGF
Konzentrationen
nachgewiesen
werden,
die
häufig
mit
einer
Tumorprogression, dem Auftreten von Metastasen, einer schlechten Prognose oder
verkürzten Überlebenszeit einhergingen (YAMAMOTO et al. 1996; SALVEN et al. 1997;
SALVEN et al. 1998; GEORGE et al. 2000; SHIMADA et al. 2001; KARAYIANNAKIS et al.
2002a; KARAYIANNAKIS et al. 2002b).
Verschiedene Studien bei Hunden mit unterschiedlichen tumorösen Erkrankungen,
einschließlich Hämangiosarkomen (CLIFFORD et al. 2001), Gesäugetumoren (KATO et al.
2007), Lymphomen (GENTILINI et al. 2005), malignen Melanomen (TAYLOR et al. 2007)
und Hauttumoren (SOBCZYNSKA-RAK 2009) belegen ebenfalls ansteigende Serumund/oder Plasma-VEGF Level im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren.
In der veterinärmedizinischen Onkologie wurde auch die prognostische Bedeutung von
VEGF untersucht.
So zeigten z. B. Hunde mit oralen malignen Melanomen signifikant höhere Plasma- und
Serum-VEGF Konzentrationen mit fortgeschrittenem Erkrankungsstadium (TAYLOR et al.
2007). Bei Hunden mit Lymphom konnten GENTILINI et al. (2005) dies ebenfalls bestätigen.
19
Literaturübersicht
Außerdem wurde hier eine negative Korrelation zwischen hoher VEGF-Konzentration und
krankheitsfreiem Intervall beobachtet (GENTILINI et al. 2005).
Zu prognostisch bedeutsamen Ergebnissen kamen auch WERGIN u. KASER-HOTZ (2004).
Sie untersuchten Plasma-VEGF Konzentrationen von Hunden mit unterschiedlichen
Tumoren und stellten höchste Plasma-VEGF Level bei Patienten mit besonders aggressiven
Tumoren wie oralen Melanomen und Sarkomen fest. Schlussfolgernd hingen Plasma-VEGF
Level hier von der Tumorhistologie ab. Eine Korrelation zwischen Plasma-VEGF
Konzentration
und
Erkrankungsstadium
oder
Tumorvolumen
konnte
aber
nicht
nachgewiesen werden (WERGIN u. KASER-HOTZ 2004). KATO et al. (2007) berichtete
nicht nur von signifikant erhöhten Plasma- und Serum-VEGF Werten in Hunden mit malignen
Gesäugetumoren im Vergleich zu denen mit benignen Gesäugetumoren, sondern stellte
auch einen signifikanten Unterschied der Plasma- und Serum-VEGF Konzentrationen
zwischen Hunden mit postoperativen Lungenmetastasen und denjenigen ohne Metastasen
fest. Die Untersuchungen von TROY et al. (2006) beschäftigten sich mit Plasma-VEGF
Konzentrationen
in
gesunden
Hunden
sowie
Hunden
mit
Tumoren
oder
nicht-
neoplastischen Erkrankungen. Damit gehört diese Studie zu den ersten, die überhaupt einen
Vergleich der VEGF-Konzentrationen zwischen tumortragenden Hunden und Hunden mit
nicht-neoplastischer
Erkrankung
vornimmt.
Hier
zeigen
sich
signifikant
häufiger
nachweisbare Plasma-VEGF Konzentrationen in Tumorpatienten im Vergleich zu den beiden
oben genannten Gruppen (TROY et al. 2006).
Weitere Studien beschäftigten sich mit der Untersuchung der VEGF-Expression im
Tumorgewebe beim Hund. Die VEGF-Expression wurde bereits in einer Vielzahl caniner
Tumoren
nachgewiesen,
u.a.
in
Mammakarzinomen
(MILLANTA
et
al.
2010),
Hämangiosarkomen, Hämangiomen (YONEMARU et al. 2006), oralen malignen Melanomen
(TAYLOR et al. 2007), malignen epithelialen Nasentumoren (SHIOMITSU et al. 2009),
Lymphomen (WOLFESBERGER et al. 2007), kutanen Fibrosarkomen (AL-DISSI et al.
2009), kutanen Mastzelltumoren (REBUZZI et al. 2007; AMORIM et al. 2010), intrakraniellen
Meningiomen (MATIASEK et al. 2009) und kutanen Plattenepithelkarzinomen (MAIOLINO et
al. 2000).
Darüber hinaus lieferten auch hier einige Studien erste Hinweise darauf, dass die VEGFExpression auch als prognostischer Marker genutzt werden könnte. So stellten QIU et al.
(2008b) eine signifikant höhere VEGF-Expression in caninen malignen Gesäugetumoren als
in normalem Mammagewebe oder benignen Gesäugetumoren fest. PLATT et al. (2006)
20
Literaturübersicht
berichteten von einer VEGF-Expression in allen untersuchten intrakraniellen Meningiomen
und zeigten einen Zusammenhang zwischen erhöhten VEGF-Konzentrationen und kürzerer
Überlebenszeit nach chirurgischer Resektion und Bestrahlung.
ROSSMEISL et al. (2007), die sich ebenfalls mit der VEGF-Expression in caninen
intrakraniellen Tumorproben beschäftigten, konnten im Hirngewebe gesunder Kontrolltiere
kein VEGF-Nachweis erbringen.
Untersuchungen an caninen vaskulären Tumoren zeigten, dass die neoplastischen Zellen in
Hämangiomen im Gegensatz zu denen in Hämangiosarkomen nur schwach ausgeprägte
oder gar keine VEGF-Expression aufwiesen (YONEMARU et al. 2006). Vermutet wird hier
ein
Zusammenhang
zwischen
VEGF-Expression
und
maligner
Proliferation
von
Hämangiosarkomen.
Die bisher veröffentlichten Untersuchungsergebnisse zur VEGF-Konzentration im Blut bzw.
VEGF-Expression bei caninen Tumorpatienten weisen auf einen bedeutenden Einfluss des
angiogenen Wachstumsfaktors VEGF auf die Tumorgenese und Metastasierung hin. Die
Höhe der VEGF-Konzentration und/oder VEGF-Expression kann zukünftig eventuell als
diagnostischer und/oder prognostischer Marker dienen.
Viele Studien haben sich bereits mit der Messung der Serum- und/oder Plasma-VEGF
Konzentration bei Hunden mit tumoröser Erkrankung beschäftigt. Aufgrund der erst kürzlich
kommerziellen Verfügbarkeit eines caninen VEGF-ELISA von R&D Systems wurde in den
hier beschriebenen älteren Studien aber vorrangig ein Human-ELISA (Quantikine, R&D
Systems, Minneapolis, MN, USA) eingesetzt. Lediglich die Studie von SOBCZYNSKA-RAK
(2009) wurde mithilfe eines Maus-ELISA (Quantikine, R&D Systems) durchgeführt.
Aktuell sind nach vorliegendem Kenntnisstand bisher nur drei tiermedizinische Studien
bekannt, die Serum und/oder Plasma-VEGF Level in Hunden mit Lymphom (ARESU et al.
2012), Diabetes mellitus (ABRAMS et al. 2011) und Steroid Responsive Meningitis-Arteriitis
(MAIOLINI et al. 2013) mittels caninem ELISA untersucht haben.
ARESU et al. (2012) konnten hier statistisch signifikant erhöhte Plasma-VEGF Level bei
Hunden mit Lymphom im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe nachweisen. Diese
Ergebnisse decken sich mit denen aus der Studie von GENTILINI et al. (2005), der mithilfe
des humanem ELISA bei an Lymphom erkrankten Hunden deutlich höhere Serum-VEGF
Level als in gesunden Hunden aufzeigte.
21
Literaturübersicht
Ziel der vorliegenden Dissertation war daher die Untersuchung der Serum-VEGF
Konzentration bei Hunden mit Hämangiosarkom oder Gesäugetumor unter Verwendung des
caninen ELISA sowie die Überprüfung einer möglichen Differenzierung zwischen malignen
und nicht-malignen Milzläsionen anhand der Serum-VEGF Level.
22
Material und Methoden
3
Material und Methoden
Zur Klärung der Frage, ob Serum oder Plasma VEGF besser zur Analyse geeignet ist,
wurde vor Studienbeginn von zehn klinisch gesunden Hunden und 38 Hunden mit
unterschiedlichen Erkrankungen neben Serum auch Blut für die Plasmabestimmung von
VEGF entnommen.
3.1
Patienten – gesunde Kontrollgruppe
Im Rahmen der zwei vorliegenden Studien wurden bei insgesamt 15
Hunden mit
Milzläsionen und 32 Hunden mit Gesäugetumoren aus der Klientel der Kleintierklinik des
Tierärztlichen
Instituts
der
Georg-August-Universität
Göttingen
die
VEGF
Serumkonzentration bestimmt.
In der Gruppe der Hunde mit Milzläsionen (n=15) stellten Mischlinge (n=5) die größte Gruppe
dar. Die übrigen 10 Hunde setzten sich aus unterschiedlichen Rassen zusammen: Golden
Retriever (n=2), Deutscher Schäferhund (n=1), Australian Sheperd (n=1), Hovawart (n=1),
Border Collie (n=1), Langhaar Teckel (n=1), Riesenschnauzer (n=1), Kromfohrländer (n=1)
und Jack Russell Terrier (n=1). 10 der 15 Hunde waren männlich. Davon waren 7 Rüden
männlich-intakt und 3 Rüden männlich-kastriert. 5 Hunde waren weiblich. Davon waren 3
Tiere weiblich-intakt und 2 Tiere weiblich-kastriert. Die Hunde mit Milzläsionen waren
zwischen 5 und 14 Jahren alt, das mittlere Alter betrug 12 Jahre. 12 der 15 Hunde waren
über 9 Jahre alt.
Bei den Hunden mit Gesäugetumoren (n=32) stellten Mischlinge (n=13) ebenfalls die größte
Gruppe dar. Des Weiteren waren unterschiedlichste Rassen beteiligt: Golden Retriever
(n=4), Deutscher Schäferhund (n=2), Bayerischer Gebirgsschweißhund (n=2), Altdeutscher
Hütehund (n=2), Labrador Retriever (n=1), Boxer (n=1), Border Collie (n=1), Beagle (n=1),
Pudel (n=1), Deutsche Wachtel (n=1), Katalanischer Schäferhund (n=1), Deutsch Kurzhaar
(n=1) und Schapendoes (n=1). 5 der 32 Hündinnen waren weiblich-kastriert und 27 Hunde
weiblich-intakt. Die Hunde mit Gesäugetumoren waren zwischen 3 und 16 Jahren alt und
das mittlere Alter betrug 10 Jahre.
Zusätzlich zur Messung der VEGF Serumkonzentration wurde bei den erkrankten Hunden
eine hämatologische und klinisch-chemische Blutuntersuchung durchgeführt. Hunde mit
Milzläsionen wurden nur in die Studie aufgenommen, wenn histopathologisch ein
23
Material und Methoden
Hämangiosarkom oder Hämatom vorlag. Die Blutprobenentnahmen erfolgten stets vor dem
chirurgischen Eingriff (Splenektomie bzw. Mastektomie) aus der V. cephalica antebrachii.
Als
gesunde
Kontrollgruppe
dienten
23
Hunde
unterschiedlicher
Rasse
und
unterschiedlichen Alters: Mischlinge (n=9), Deutscher Schäferhund (n=3), Jack Russell
Terrier
(n=2),
Rhodesian
Ridgeback
(n=1),
Weimaraner
(n=1),
Bayerischer
Gebirgsschweißhund (n=1), Australian Shepherd (n=1), Bearded Collie (n=1), Briard (n=1),
Dalmatiner (n=1), Hovawart (n=1) und Entlebucher Sennenhund (n=1). 12 der 23 Hunde
waren weiblich. Davon waren 7 Tiere weiblich-intakt und 5 Tiere weiblich-kastriert. Die
übrigen 11 Hunde waren Rüden. 8 Tiere waren männlich-intakt und 3 Tiere männlichkastriert. Die gesunden Hunde waren zwischen 7 Monaten und 13 Jahren alt, das mittlere
Alter entsprach 5 Jahren. Diese wurden einer klinischen Allgemeinuntersuchung sowie einer
abdominalen Ultraschalluntersuchung unterzogen. Labordiagnostisch wurden zusätzlich eine
hämatologische Untersuchung (Leukozytenzahl, Zahl der neutrophilen Granulozyten, der
Lymphozyten, der Monozyten, der eosinophilen Granulozyten, der basophilen Granulozyten
und der Erythrozyten, Hämoglobin, Hämatokrit, mean corpuscular volume (MCV), mean
corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC),
Thrombozyten)
und
eine
Glutamatdehydrogenase,
klinische
Chemie
(Glucose,
Alaninaminotransferase,
Fructosamin,
Gallensäuren,
Aspartataminotransferase,
Gesamt-
bilirubin, alkalische Phosphatase, Gesamteiweiß, Albumin, Kreatinin, Harnstoff, Calcium,
Phosphor, alpha-Amylase, Cholesterin, Lipase, Kreatinkinase, Kalium, Natrium, C-reaktives
Protein, Globuline) angefertigt. In die Kontrollgruppe sind nur klinisch gesunde Hunde
aufgenommen worden.
24
Material und Methoden
3.2
Geräte und Verbrauchsmaterialien
3.2.1
Geräte

Zentrifuge: Eppendorf Centrifuge 5424 (Fa. Eppendorf AG, Hamburg)

Zentrifuge: Hettich EBA 20 (Fa. Hettich, Bäch, Schweiz)

Analyseautomat klinische Chemie: Konelab 20i (Fa. Thermo Fischer Scientific Inc.,
Dreieich)

Analyseautomat Hämatologie: Abbott Cell-Dyn®3700 (Fa. Abbott GmbH & Co KG,
Wiesbaden)

Vortexer: Vortex-Genie 2 (Fa. Scientific Industries, New York)

Waschvorrichtung für Mikrotiterplatten: Nunc-Immuno ™wash 8 (Fa. NUNC,
Wiesbaden)

Multifunktionslesegerät: TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig,
Österreich)

Pipettierhilfe: pipetus®-akku (Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt)

Pipetten: Pipetman P100/P200/P1000 (Fa. Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)

Mehrkanalpipette: Pipetman Ultra Multichannel (20-300µl, Fa. Gilson, Villers Le
Bel/Frankreich)

Multipipette:
Eppendorf
Multipipette®
plus
mit
Combitips®
plus
in
den
Volumengroßen 2,5 und 5ml (Fa. Eppendorf AG, Hamburg)
3.2.2

Verbrauchsartikel
Serumröhrchen: Microtube 1,3 ml mit Serum-Gerinnungsaktivator (Fa. Sarstedt AG &
Co, Nümbrecht) zur Blutabnahme für die klinische Chemie sowie für die Bestimmung
von VEGF aus Serum

EDTA K-Röhrchen: mit 1,6 mg EDTA/ml Blut angereicherte 2 ml Polypropylenröhrchen
(Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) zur Blutabnahme für die Hämatologie sowie für die
Bestimmung von VEGF aus Plasma

Reagiergefäße: Sarstedt-Reagiergefäß 1,5 ml (Fa. Sarstedt AG & Co, Nümbrecht)
25
Material und Methoden
3.2.3

Reagenzien und Lösungen
Reagenzien und Lösungen des „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ CAVE00
(Fa. R & D Systems, Minneapolis, USA):

Mikrotiterplatte, beschichtet mit einem monoklonalen Antikörper gegen VEGF

VEGF-Konjugat:
o

VEGF-Standard:
o

Polyklonaler Antikörper gegen VEGF, an Meerrettichperoxidase konjugiert
Rekombinantes VEGF in einer gepufferten Proteinbasis
Assay Diluent RD1W: Gepufferte Proteinlösung zur Blockierung unspezifischer
Bindungen und zur Herstellung eines äquimolaren Milieus

Calibrator Diluent RD6U:
o
Mit Konservierungsmitteln versehenes Tierserum zum Auflösen des VEGF
Standard, zur Herstellung der Verdünnungsreihe und als Negativkontrolle

Waschpufferkonzentrat

Farbreagenz A
o

Farbreagenz B
o

Stabilisiertes Wasserstoffperoxid
Stabilisiertes Chromogen (Tetramethylbenzidin)
Stopplösung
o
2 N Schwefelsäure
3.3
Gewinnung und Verarbeitung der Proben
3.3.1
Blutgewinnung
Die Blutabnahme erfolgte bei allen erkrankten Hunden im Rahmen der präoperativen
Vorbereitung am unsedierten Tier. Nach dem Scheren und Desinfizieren der entsprechenden
Hautstelle wurde den Hunden aus der V. cephalica antebrachii mittels Punktion mit einer
sterilen Einmalkanüle 20G 0,9 x 40 mm (Fa. Terumo, Leuven, Belgien) Blut entnommen.
Zur Anfertigung der hämatologischen Untersuchung wurde Blut in ein mit 1,6 mg EDTA/ml
Blut angereichertem Polypropylenröhrchen aufgefangen und mittels eines automatischen
Auszählverfahrens ausgewertet (Abbott Cell-Dyn 3700). Das für die klinische Chemie
benötigte Blut wurde in Serumröhrchen aufgefangen und im Anschluss in einer Eppendorf
Centrifuge 5424
bei 3000 Umdrehungen/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde mit einem Pipetman P1000 abpipettiert und im Konelab 20i photometrisch bestimmt.
26
Material und Methoden
Die Blutproben für die Bestimmung von VEGF aus Serum wurden jeweils in Serumröhrchen
aufgefangen. Für die Bestimmung von VEGF aus Plasma wurden mit 1,6 mg EDTA/ml Blut
angereichertem Polypropylenröhrchen genutzt. Alle Blutproben wurden im Anschluss weiter
bearbeitet.
3.3.2
Aufbereitung der Proben
VEGF wird sowohl aus Serum als auch teilweise aus Plasma bestimmt. Für die Messung aus
Serum müssen die Blutproben zunächst 2 Stunden bei Raumtemperatur gerinnen. Im
Anschluss wird das Blut mit der Eppendorf Centrifuge 5424 für 30 Minuten bei 1000 x g
zentrifugiert. Das Serum wird daraufhin mit einem Pipetman P200 abpipettiert. Das Serum
wird aliquotiert und bei ≤ -20°C eingefroren.
Für die Gewinnung von Plasma wurde EDTA-Blut herangezogen. Dieses wird innerhalb von
30 Minuten nach Gewinnung für 30 Minuten bei 1000 x g in der Zentrifuge Hettich EBA 20
zentrifugiert. Danach wird der Überstand abpipettiert, aliquotiert und bei ≤ -20°C eingefroren.
3.3.3
Prinzip des ELISA zur Bestimmung von VEGF
Bei dem Testsystem „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ (Fa. R & D Systems,
Minneapolis, MN, USA) handelt es sich um einen Sandwich-ELISA, der die quantitative
Bestimmung von VEGF ermöglicht. Die Mikrotiterplatte ist mit Antikörpern beschichtet. Im
Falle des „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“ handelt es sich um einen monoklonalen
Antikörper,
der
spezifisch
für
VEGF
ist.
In
einem
ersten
Schritt
wird
ein
Probenverdünnungsmittel (Assay Diluent) in jedes Well pipettiert. Im Anschluss folgen dann
Standards und Proben. Vorhandenes VEGF wird nun an die immobilisierten Antikörper
gebunden. Es schließt sich ein Waschvorgang an, bei dem alle ungebundenen Substanzen
entfernt werden. In der Folge wird ein enzymgekoppelter polyklonaler Antikörper, der
spezifisch für das bereits im ersten Schritt immobilisierte VEGF ist, hinzugegeben. Dieser
bindet
an
die
bestehenden
VEGF-Antikörper-Komplexe.
Nach
einem
weiteren
Waschvorgang, bei dem nicht gebundene enzymgekoppelte Antiköper entfernt werden, wird
eine Substrat-Lösung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Die an den
polyklonalen Antikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase reagiert mit dem Substrat. Die
enzymatische Reaktion führt zu einem Farbumschlag. Es entsteht der blaue Farbstoff
Tetramethylbenzidin. Die Intensität der daraus resultierenden Färbung ist proportional zur
Menge des im ersten Schritt gebundenen Analyten. Die Farbreaktion wird durch Zugabe
einer Stopplösung gestoppt. Die blaue Farbe schlägt dabei nach Gelb um. Anschließend
wird die optische Dichte eines jeden Wells mit einem Photometer gemessen.
27
Material und Methoden
3.4
Durchführung des ELISA
3.4.1
Testdurchführung „Quantikine Canine VEGF Immunoassay“
Vor der Durchführung des ELISA werden alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht.
Daraufhin
werden
die
Waschlösung
sowie
der
Standard
vorbereitet.
Für
die
Waschpufferlösung werden 20 ml des Waschpufferkonzentrates mit 480 ml deionisiertem
Wasser vermischt. Der lyophilisierte VEGF-Standard wird in 1 ml Calibrator Diluent RD6U
gelöst und für mindestens 15 Minuten stehen gelassen. Es entsteht eine Stammlösung mit
einer Konzentration von 2500 mg/ml. Aus dieser Stammlösung wird anschließend eine 2fache Verdünnungsreihe hergestellt. Dazu werden in 6 Reagiergefäße jeweils 500 µl
Calibrator Diluent RD6U vorgelegt. In das erste Reagiergefäß werden außerdem 500 µl der
Stammlösung gegeben und gründlich vermischt. Aus diesem Gemisch werden wiederum
500 µl Lösung in das nächste Gefäß übertragen. Diese Prozedur wird mehrfach wiederholt
und so entsteht eine Verdünnungsreihe mit den Konzentrationen 1250 pg/ml, 625 pg/ml, 313
pg/ml, 156 pg/ml, 78,1 pg/ml und 39,1 pg/ml. Der unverdünnte VEGF-Standard dient als
höchster Standard mit 2500 pg/ml, der Calibrator Diluent RD6U dient als Negativkontrolle mit
einer Konzentration von 0 pg/ml.
Danach wird mit der eigentlichen Testdurchführung begonnen. In jedes Well der
Mikrotiterplatte werden 100 µl eines Probenverdünnungsmittels (Assay Diluent RD1W)
gegeben. Im Folgenden werden jeweils 100 µl Standard oder Proben in die Wells pipettiert
und die Platte mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt. Es folgt eine zweistündige
Inkubationsphase bei Raumtemperatur. Anschließend folgt ein dreimaliger Waschvorgang.
Dafür wird der Inhalt der Wells zunächst ausgeschüttet und die Wells mit je 400 µl
Waschlösung befüllt. Die Befüllung erfolgt mittels des Nunc-Immuno ™wash 8 (Fa. NUNC,
Wiesbaden). Zur vollständigen Entfernung der Waschlösung nach dem Ausschütten, wird die
Mikrotiterplatte auf ein sauberes Papiertuch geklopft. Im Anschluss werden in jedes Well 200
µl VEGF-Konjugat pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird mit einer neuen selbstklebenden Folie
abgedeckt und erneut für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgt wieder ein
dreimaliger Waschvorgang mit Waschpufferlösung. Dann werden 200 µl Substratlösung in
jedes
Well
gegeben.
Die
Substratlösung
wird
zuvor
aus
zwei
gleichvolumigen
Farbreagenzien (Farbreagenz A und B) hergestellt. Die Substratlösung muss innerhalb von
15 Minuten nach deren Ansatz verwendet werden. Die Mikrotiterplatte wird erneut mit einer
frischen selbstklebenden Folie versehen. Es folgt eine 25-minütige Inkubationszeit, die vor
Licht geschützt stattfinden muss. Nach Ablauf der 25 Minuten wird die Farbreaktion durch die
28
Material und Methoden
Zugabe von 50 µl Stopplösung je Well unterbrochen. Die Messung der optischen Dichte soll
innerhalb von 30 Minuten nach Abstoppen der Farbreaktion erfolgen. Die Messung erfolgte
mithilfe des TECAN GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer
Wellenlänge von 450 nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm.
3.5
Auswertung
3.5.1
Auswertung des ELISA
Die Auswertung der detektierbaren Farbreaktion erfolgte photometrisch mit Hilfe des TECAN
GENios Pro (Fa. TECAN Austria GmbH, Grödig, Österreich) bei einer Wellenlänge von 450
nm und einer Korrekturwellenlänge von 570 nm. Aus der sich hier ergebenden optischen
Dichte wurde die Konzentration von VEGF rechnerisch ermittelt.
3.6
Histopathologie
Von den Patienten wurde im Rahmen der Studie Operationsmaterial zur histologischen
Diagnostik
gewonnen
und
an
die
Abteilung
Infektionspathologie
des
Deutschen
Primatenzentrums Göttingen (Leiter: Prof. Dr. F.-J. Kaup) zur weiteren Bearbeitung
verschickt.
Das in 4 % Formalin fixierte Gewebemateriall wurde routinemäßig in Paraffin im Automaten
Shandon Excelsior ES (Fa. Thermo Scientfic, Dreieich) eingebettet, nach laborüblichen
Protokoll geschnitten und mit Haematoxylin-Eosin ebenfalls im Automaten (Varistain Gemini,
Fa. Thermo Scientfic, Dreieich) gefärbt. Nach Eindecken der Glasobjekträger mit Eukitt
wurden die Proben von Fachtierärzten für Pathologie befundet.
3.7
Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Programme SAS-Sytem (Version 9.3, SAS
Institute, Cary, NC, USA) und Statistika (Version 10.0; StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).
Unterschiede zwischen den Gruppen „Hunde mit Milzläsionen/Hunde mit Gesäugetumoren“
bzw. „gesund“ wurden mit dem Fisher´s Exact Test untersucht.
Für den Vergleich der VEGF Konzentrationen zwischen Hunden
mit Milzläsionen und
gesunder Kontrollgruppe sowie zwischen Hämangiosarkom- und Hämatompatienten wurde
der Mann-Whitney-U-Test verwendet.
Zur Beurteilung von Korrelationen wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman
angewendet.
Die statistische Signifikanz wurde bei p-Werten < 0,05 angenommen.
29
MANUSKRIPT I
4
Ergebnisse
Die vorliegenden Ergebnisse wurden in zwei Manuskripten dokumentiert. Das erste
Manuskript beschreibt die Messungen zu VEGF im Zusammenhang mit dem Auftreten von
Milzveränderungen und vergleicht die Werte von Hämaniosarkomen und Hämatomen. Das
zweite Manuskript geht auf den Zusammenhang zwischen VEGF und Mammatumoren ein.
4.1
MANUSKRIPT I
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with haemangiosarcoma and
haematoma
Meike Frenz1, Franz-Josef Kaup2, Stephan Neumann1
1
Tierärztliches Institut, Universität Göttingen,
Burckhardtweg 2,
37077 Göttingen, Germany
Tel.: 0551-3933387; Fax : 0551-3913919;
Email: [email protected]
2
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen,
Kellnerweg 4,
37077 Göttingen, Germany
30
MANUSKRIPT I
4.1.1
Abstract
Splenic haemangiosarcoma are frequently seen in dogs. Because of their bad prognosis
differentiation from other benign splenic lesions are of prognostic importance.
However, because haemangiosarcoma is a tumour of the vascular system, we hypothesized
that vascular endothelial growth factor (VEGF) may play a major role in tumour growth and
might thus be increased in the blood of affected dogs.
The aim of this study was to investigate the clinical relevance of differences in serum VEGF
concentrations between dogs with splenic haemangiosarcomas and those with nonmalignant splenic lesions (haematomas) and healthy subjects using a canine ELISA.
Serum VEGF levels were significantly higher in dogs with splenic masses compared with
healthy dogs, but did not differ significantly between dogs with haemangiosarcomas and
haematomas.
VEGF has a potential clinical utility as a diagnostic marker for dogs with splenic lesions but
may not be useful to differentiate among the various splenic lesions.
Keywords: Vascular endothelial growth factor, Dog, Haemangiosarcoma, Angiogenesis,
Spleen, Canine ELISA
4.1.2
Introduction
Angiogenesis is controlled by a multitude of pro- and anti-angiogenic factors. It is essential
for tumour growth, especially in tumours greater than 2-3 mm in diameter, in which growth
depends on adequate supplies of oxygen and nutrients (Folkman, 1985). Angiogenesis also
plays a role in metastasis by providing routes for the dissemination of tumour cells (Folkman,
1975, 1995).
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a dimeric heparin-binding glycoprotein and is
one of the most potent angiogenic growth factors. It is an endothelial-cell-specific mitogen
that increases vascular permeability, and is also a survival factor for endothelial cells
(Ferrara, 2004). Ferrara (1999) reported that VEGF is a fundamental regulator of normal and
abnormal angiogenesis. It is produced and secreted by several cell types including platelets,
31
MANUSKRIPT I
lymphocytes, neutrophils, macrophages, smooth muscle cells and fibroblasts (Ferrara et al.,
1991; Berse et al., 1992). Cellular VEGF expression is stimulated by a variety of factors
including hypoxia, inflammatory cytokines, growth factors, hormones and oncogenic
mutations, though oxygen tension appears to play a key role in VEGF up-regulation (Ferrara,
2004). VEGF is expressed by a variety of tumors in humans, and high serum levels are often
associated with tumor progression, the presence of metastasis, poor prognosis and poor
treatment response (Salven et al., 1997; 1998; George et al., 2000; Shimada et al., 2001;
Cooper et al., 2002; Karayiannakis et al., 2002). In addition to tumour cells, tumourassociated stromal cells also secrete VEGF (Fukumura et al., 1998).
Increased serum and/or plasma VEGF concentrations have been found in dogs with
haemangiosarcoma, mammary gland tumours, osteosarcoma, lymphoma and other tumour
types, suggesting that it may play a role in canine tumour growth and metastasis (Clifford et
al., 2001; Gentilini et al., 2005; Kato et al., 2007; Taylor et al., 2007; Thamm et al., 2008;
Sobczynska-Rak, 2009).
VEGF may therefore represent a potential diagnostic marker of malignancy and may have
particular relevance in haemangiosarcomas, which are highly malignant and highly
vascularised tumours arising from the vascular endothelium. Furthermore, the presence of
systemic metastases and local infiltration occur early in the disease, with the lung and liver
being the most frequently affected organs (Brown et al., 1985; Hosgood, 1991).
Haemangiosarcomas are the most frequent malignant splenic neoplasms in dogs, and
represent about 50% of all splenic neoplasms. However, non-neoplastic or benign lesions
occur in over 50% of cases. Non-neoplastic lesions are primarily haematomas or
hyperplastic nodules, which are often associated (Prymak et al., 1988; Spangler and
Culbertson, 1992; Spangler and Kass, 1997).
The better prognosis of non-neoplastic lesions means that it is clinically relevant to
distinguish between malignant and non-malignant splenic masses. There is currently no
established method for differentiating between haemangiosarcoma and other splenic lesions,
prior to histopathological analysis.
Abdominal radiography and ultrasonography are useful methods for identifying lesions in the
spleen when they reach a certain size, but non-malignant splenic lesions such as
haematomas,
hyperplastic
nodules
or
haemangiomas
often
appear
identical
to
haemangiosarcomas. In addition, non-invasive fine-needle aspiration of splenic masses is
difficult and has a poor sensitivity (Ballegeer et al., 2007).
32
MANUSKRIPT I
Now, Campos et al. (2012) reported significantly higher VEGF expression in splenic
haemangiosarcomas than splenic haemangiomas.
This study therefore investigated the ability of serum VEGF levels to differentiate between
splenic haemangiosarcomas and other non-malignant splenic masses in dogs using a canine
commercial enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
4.1.3
Materials and methods
4.1.3.1 Animals and samples
Fifteen dogs with splenic masses treated in the Small Animal Clinic of the University of
Göttingen were investigated in this prospective study. All dogs underwent splenic surgery
with resection of the organ. Dogs with a histological diagnosis of haemangiosarcoma or
haematoma were included in the study. Serum samples for measurement of VEGF levels
were collected from the cephalic vein prior to surgery.
The dogs with splenic masses were of several different breeds: mixed breed (=5), Golden
Retriever (=2), German Shepherd (=1), Australian Shepherd (=1), Hovawart (=1), Border
Collie (=1), Dachshund (=1), Giant Schnauzer (=1), Krom (dog) (=1), Jack Russell (=1). The
median age of the dogs was 12 years (range, 5-14 years), and 12 of 15 dogs were older than
9 years. Ten male (seven intact and three neutered) and five female (three intact and two
neutered) dogs were investigated.
Eight dogs had haematomas and seven had haemangiosarcomas in the spleen. One dog
with a haematoma showed simultaneous hyperplastic nodules in the spleen, and three dogs
with haemangiosarcomas showed metastases in the liver.
The control group consisted of blood samples from 23 dogs confirmed as healthy based on a
physical examination, clinical pathology (complete blood count (CBC), serum chemistry) and
abdominal ultrasonography. The control group consisted of 12 female (seven intact and five
neutered) and 11 male (eight intact and three neutered) dogs with a median age of 5 years
(range, 7 month-13 years). The breeds were: mixed breed (=9), German Shepherd (=3),
Jack Russell (=2), Rhodesian Ridgeback (=1), Weimaraner (=1), Bavarian Mountain
Scenthound (=1), Australian Shepherd (=1), Bearded Collie (=1), Briard (=1), Dalmatian (=1),
Hovawart (=1), and Entlebuch Mountain Dog (=1).
33
MANUSKRIPT I
All serum samples were kept at room temperature for 2 hours to allow them to clot before
centrifugation (30 min, 1000 g), then stored at -20°C until required for analysis. Salven et al.
(1997) reported that serum VEGF concentrations were unaffected by a freeze-thaw cycle.
Biochemical parameters were analyzed according to standardized procedures using an
analyser (Konelab 20i; Fa. Thermo Fischer Scientific Inc., Dreieich, Germany) and
commercial kits. Haematology parameters were measured using a CellDyn 3500 Analyzer
(Fa. Abbott GmbH & Co KG, Wiesbaden, Germany).
Histopathological examinations were performed by a board-certified pathologist (European
College of Veterinary Pathologists) using surgical biopsies fixed in 10% buffered formalin,
and routinely embedded in paraffin and stained with hematoxylin and eosin.
The best source for measuring VEGF was determined by preliminary analysis of serum and
plasma from 10 healthy dogs and 38 dogs with different diseases. VEGF was not detectable
in the serum or plasma of healthy dogs. VEGF was detected in the serum of 17 dogs with
different diseases, but only in 2 plasma samples. Serum samples were therefore used in the
current study.
4.1.3.2 VEGF assay
Serum VEGF levels were measured using a commercially available canine VEGF
quantitative ELISA kit (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) following the
manufacturer’s instructions.
In brief, 100 μl of assay diluent was added to each well of a microtitre plate, which had been
coated with VEGF-specific monoclonal antibody, followed by the addition of 100 μl of
standard or serum sample into each well. The microtitre plates were incubated for 2 hours at
room temperature, followed by washing to remove unbound substances. Two hundred
microliters of an enzyme-linked polyclonal antibody specific for VEGF were then added to the
wells, followed by incubation for 2 hours at room temperature to bind to the immobilized
VEGF.
The plates were washed a further three times. Two hundred microliters of substrate solution
were then added to the wells and the colour developed in proportion to the amount of VEGF
bound in the initial step. The preparation was incubated for 25 minutes at room temperature
and was protected from light. Finally, 50 μl of a stop solution was added and the intensity of
the colour was measured.
34
MANUSKRIPT I
Samples were analyzed using a TECAN microplate reader (Fa. TECAN Austria GmbH,
Grödig, Austria) at an optical density of 450 nm and a wavelength correction of 570 nm.
Calibration was performed using a standard series of dilutions of recombinant canine VEGF.
Each standard and sample was conducted in triplicate and the mean values were calculated.
The average optical density value of the zero standard was then subtracted and the optical
density of the standard solutions was plotted against their corresponding concentrations to
generate a standard curve for the determination of VEGF concentrations for all samples.
According to the manufacturer’s instructions, the assay measures the predominant isoform
VEGF164, and the minimum detectable dose of VEGF was defined as typically less than
19.5 pg/ml. The assay shows no cross-reactivity with a series of cytokines and growth factors
(R&D Systems). The manufacturer reported mean intra- and inter-assay coefficients of
variation were 5.4 and 7.3%, respectively.
Values read as ≤ 0 pg/ml were all considered negative for circulating VEGF.
4.1.3.3 Statistical analysis
Statistical analysis was performed using the program SAS-system (version 9.3, SAS
Institute, Cary, NC, USA) and Statistica (version 10.0; StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). For the
purposes of analysis, dogs with VEGF values ≤ 0 pg/ml were set at 0 pg/ml.
VEGF results of dogs with splenic masses and healthy dogs were compared using Fisher’s
exact test. VEGF concentrations of dogs with splenic masses and healthy dogs were
compared using the Mann-Whitney U test. To compare VEGF level between dogs with
haemangiosarcoma and haematomas the Mann-Whitney U test was used, too.
The relationships between white blood cell (WBC) count (reference range, 6-12x103/μl),
hematocrit (reference range, 44-52%) and platelet count (reference range, 200-400x10 3/μl)
and VEGF concentrations in dogs with splenic masses, were analyzed using Spearman’s
rank correlation coefficient.
A P value < 0.05 was considered statistically significant.
4.1.4
Results
Data were inspected for normality and found to be non-normally distributed because of the
presence of outliers. Measureable concentrations of VEGF were found in only 2 of 23 serum
35
MANUSKRIPT I
samples from the healthy dogs included in the study (3 and 17 pg/ml, respectively). In
contrast, 10 of 15 dogs with splenic masses had detectable concentrations (4.83 ‒ 183.5
pg/ml), with a mean value of 35 pg/ml.
Dogs with splenic masses showed significantly (P < 0.001) higher levels compared with
healthy dogs (Fig. 1).
Based on histopathological examinations, dogs were classified as having either
haemangiosarcoma or haematoma. VEGF concentrations in dogs with haemangiosarcoma
ranged between 24.8 ‒ 146.3 pg/ml (median 24.8 pg/ml), while concentrations in dogs with
haematomas ranged between 4.8 ‒ 183.5 pg/ml (median 12.9 pg/ml) (Fig. 2). These values
were not significantly different, suggesting that haemangiosarcomas and haematomas in
dogs could not be distinguished on the basis of serum VEGF.
Three dogs with haemangiosarcomas had liver metastases, and these dogs had detectable
VEGF concentrations. VEGF detection may therefore be associated with an increased,
though not statistically significant risk of advanced stage of disease.
No statistical relationships were identified between serum VEGF levels in dogs with splenic
masses and platelet count or hematocrit. However, dogs with splenic masses showed an
almost significant positive correlation between WBC count and serum VEGF concentration
(P = 0.06).
Only two of the healthy dogs had detectable VEGF concentrations, and the relationships
between VEGF concentration and WBC count, hematocrit and platelet count were not tested.
4.1.5
Discussion
In the present study, we evaluated serum VEGF levels in dogs with splenic masses and in
healthy controls using a canine ELISA kit, which mainly detects the most abundant VEGF
164 isoform of canine VEGF. This kit has only recently become commercially available, and
to our knowledge, there is only 1 study available in veterinary oncology using the same
canine ELISA kit (ARESU et al., 2012).
However, several studies have demonstrated increased serum VEGF levels in dogs with
different tumor types using a human VEGF ELISA (Gentilini et al., 2005; Kato et al., 2007;
Thamm et al., 2008). This ELISA is designed to measure VEGF 165 levels and its reliability
in dogs has already been reported (Troy et al., 2006). Clifford et al. (2001) showed increased
plasma VEGF levels in dogs with haemangiosarcomas compared with healthy dogs, but no
36
MANUSKRIPT I
studies have compared serum VEGF concentrations in dogs with malignant and nonmalignant splenic masses.
In this study, serum VEGF concentrations were significantly higher in dogs with splenic
masses compared with healthy dogs, which is consistent with the results of other studies in
tumour-bearing dogs (Clifford et al., 2001; Kato et al., 2007). Dogs with splenic masses have
a higher probability to have detectable serum VEGF concentrations (10/15). In our opinion
this could be a consequence of tissue release from the splenic lesions. However, VEGF was
detectable in six of eight dogs with haematomas and in four of seven dogs with
haemangiosarcomas, suggesting that serum VEGF levels may be not useful for
differentiating between haemangiosarcomas and haematomas.
VEGF, as a promoter of tumor angiogenesis, may be especially increased in
haemangiosarcoma patients, because of the vascular-endothelial origin of the tumour.
Splenic haemangiosarcomas are often accompanied by a cavernous structure, whereas
haematomas are more organized and associated with clotted blood (Spangler and
Culbertson, 1992). VEGF may be involved in the pathophysiology and/or the reorganization
of an existing haematoma. In a study of chronic subdural haematomas, Nanko et al. (2009)
suggested that VEGF was an important element for haematoma development because of its
ability to induce angiogenesis and increase vascular permeability. In this case, VEGF was
detectable in both haematoma fluid and serum.
In the current study, only two young dogs in the control group (2/23) had detectable
concentrations of VEGF. Both (one female mixed breed and one male Bavarian Mountain
Scenthound) were intact, under 1 year old, and showed low-grade leukocytosis. Some
studies identified a relationship between VEGF concentrations and certain hematologic
variables in dogs. Troy et al. (2006) recently demonstrated that increased plasma VEGF was
associated with increased WBC and platelet counts in dogs with neoplasia. Clifford et al.
(2001) reported no associations between hematocrit, WBC and platelet counts and increased
plasma VEGF concentrations in dogs with haemangiosarcoma.
Serum VEGF concentrations did not correlate with platelet count or hematocrit in the present
study, though we did detect a positive correlation between VEGF concentration and WBC
counts in dogs with splenic masses (P = 0.06). This observation may account for the
detectable VEGF concentrations in the two healthy dogs.
37
MANUSKRIPT I
There has been considerable debate regarding the use of serum or plasma VEGF levels for
analysis, because of the release of VEGF by platelets and leukocytes during blood clotting,
which may affect circulating serum VEGF concentrations (Banks et al., 1998; Jelkmann,
2001).
Several investigators have suggested that platelets are the main source of VEGF in the
serum, and that serum VEGF levels are higher than plasma VEGF levels in individual cancer
patients and/or healthy subject (Verheul et al., 1997; Banks et al., 1998; Salven et al., 1999;
Gunsilius et al., 2000). Previous studies have therefore proposed that plasma or whole-blood
should be used for the measurement of VEGF (Banks et al., 1998; Webb et al., 1998;
Jelkmann, 2001).
Some authors, however, have used serum VEGF for the measurement of circulating VEGF
in cancer patients. Although serum VEGF concentration may be affected by the platelet
count, this platelet-derived VEGF also reflects the biology of the tumour cells (Lee et al.,
2000).
Platelets may store circulating VEGF secreted by the tumor. This theory is based on the
finding that platelets from cancer patients contained more VEGF than those from healthy
controls (Salven et al., 1999; Salgado et al., 2001). A study by George et al. (2000)
supported the hypothesis that platelets store circulating tumour-derived VEGF, because
VEGF concentration per platelet increased with advancing stage in colorectal cancer
patients, and the median platelet VEGF load was higher in cancer patients than in patients
with benign disease.
Another study showed that the platelet load of VEGF correlated with tumour VEGF
expression, and therefore supported the use of serum VEGF, instead of plasma VEGF, for
evaluating circulating VEGF, because of its greater biological significance (Poon et al.,
2003).
Taylor et al. (2007) showed that serum and plasma concentrations of VEGF were
significantly correlated in dogs with oral malignant melanoma, suggesting that serum or
plasma could be used with similar results.
It is important to recognize that measured serum concentrations of VEGF include both freely
circulating VEGF and VEGF stored in platelets or leukocytes, which is released during the
clotting process.
38
MANUSKRIPT I
The highest serum VEGF value measured in the dogs with splenic masses was 183.5 pg/ml.
This dog, which had a splenic haematoma, also had a pancreatitis. VEGF up-regulation has
been implicated in various inflammatory diseases, and recent studies demonstrated
significantly elevated serum VEGF levels in patients with acute and chronic pancreatitis
compared to a healthy control group (Ueda et al., 2006; Talar-Wojnarowska et al., 2010).
It is therefore not clear which disease was responsible for the high serum VEGF
concentration in this dog.
The undetectable serum VEGF concentrations in some dogs with splenic masses (5/15) may
have been a consequence of measuring the VEGF 164 isoform, which may not be the
dominant angiogenic factor in haemangiosarcomas and haematomas. Five isoforms of
VEGF are generated in dogs by alternative splicing (VEGF 120, VEGF 144, VEGF 164 and
VEGF 188, VEGF 205), of which VEGF 164 is the predominant isoform (Scheidegger et al.,
1999).
The manufacturer reported that the ELISA kit measured VEGF 164 because this was the
dominant isoform in dogs. Other isoforms may have been present, but these were not tested
for.
Further studies should investigate the possible roles of other pro-angiogenic factors, such as
basic fibroblast growth factor, in tumour angiogenesis.
In conclusion, we measured serum VEGF concentrations in healthy dogs and dogs with
splenic masses, using a commercial canine ELISA kit. Serum VEGF concentrations were
significantly increased in dogs with splenic masses, but it was not possible to differentiate
between dogs with haemangiosarcomas and haematomas on the basis of VEGF levels.
This study was limited by the low number of investigated dogs and the lack of the analysis of
tissue VEGF expression to complement the serum VEGF levels within individual dogs.
Further evaluation of VEGF concentrations in a larger population of dogs with non-malignant
and malignant splenic masses, and in dogs with haemangiosarcomas in different stages of
the disease may help to detect the diagnostic and prognostic values of VEGF.
39
MANUSKRIPT I
4.1.6
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44
MANUSKRIPT I
200
Median
25%-75%
Non-Outlier Range
Outliers
Extremes
180
160
Serum VEGF (pg/ml)
140
120
100
80
60
40
20
0
-20
1
2
Fig. 1 Box plot of serum VEGF concentrations in dogs with splenic masses (n=15; group 1)
and healthy dogs (n=23; group 2); (P < 0.001)
45
MANUSKRIPT I
Fig. 2 Box plot of positive serum VEGF concentrations in dogs with haematoma (n=8;
group 0) and haemangiosarcoma (n=7; group 1)
46
Manuskript II
4.2
Manuskript II
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with mammary gland tumours
Meike Frenz1, Franz-Josef Kaup2, Stephan Neumann1
1
Tierärztliches Institut, Universität Göttingen,
Burckhardtweg 2,
37077 Göttingen, Germany
Tel.: 0551-3933387; Fax : 0551-3913919;
Email: [email protected]
2
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen,
Kellnerweg 4,
37077 Göttingen, Germany
4.2.1
Abstract
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent inducer of angiogenesis and seems to
play a major role in tumour growth.
Elevated serum VEGF concentrations have been found in human patients with breast cancer
and dogs with mammary gland tumours using a human VEGF enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA).
The aim of this study was to investigate the levels of serum VEGF in dogs with mammary
gland tumours compared to healthy dogs using a canine ELISA.
VEGF was below detectable limits in 30 of 32 serum samples from dogs with mammary
gland tumours and in 21 of 23 serum samples from healthy dogs. There was no significant
47
Manuskript II
difference between dogs with mammary gland tumours and healthy dogs related to VEGF
detection.
The results of this study do not support the application of the canine ELISA for the detection
of serum VEGF in dogs with mammary gland tumours.
Keywords: Vascular endothelial growth factor, Dog, Mammary gland tumour, Angiogenesis,
Canine ELISA
4.2.2
Introduction
Mammary gland tumours are the most common tumours in female dogs. The majority of
mammary gland tumours have an epithelial origin (carcinoma or adenoma) and
approximately 50% of all tumours are malignant (BRODEY et al. 1983). Malignant mammary
gland tumours often metastasize to distant organs such as lymph node, lung, liver and rarely
bone (OWEN 1979).
Angiogenesis is essential for tumour growth and metastasis, because beyond the size of 2-3
mm a tumour cannot expand without neovascularization (FOLKMAN 1990). Therefore
studies about detection of angiogenesis and its progression could be of clinical relevance,
because of its value for tumour staging and prognosis.
Angiogenesis is a complex process induced by angiogenic peptides like the vascular
endothelial growth factor (VEGF) that leads to the formation of new blood vessels from
existing microvessels. VEGF, a dimeric heparin-binding glycoprotein, is one of the most
potent angiogenic growth factors and a vascular endothelial-cell-specific mitogen. It is a
regulator of physiological and pathological angiogenesis and is produced and secreted by
several cell types including tumour cells and tumour-associated stromal cells (FUKUMURA
et al. 1998). VEGF production and release is stimulated by hypoxia, inflammatory cytokines,
growth
factors,
hormones
or
oncogenic
mutations
(FERRARA
2004).
VEGF
is
overexpressed by different tumours and several human studies demonstrated that serum
and/or plasma VEGF levels of breast cancer patients were significantly elevated compared
with healthy female controls (ADAMS et al. 2000; HEER et al. 2001).
48
Manuskript II
KATO et al. (2007) reported that dogs with mammary gland tumours also have significant
higher serum and plasma VEGF concentrations than healthy dogs and found a significant
difference of serum VEGF levels between malignant and benign tumours.
Multiple isoforms of VEGF are generated by alternative splicing, but VEGF 164 seems to be
the predominant isoform in dogs (SCHEIDEGGER et al. 1999). To detect VEGF
concentrations in dogs with mammary gland tumours KATO et al. (2007) used a solid-phase
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN,
USA) prepared against human VEGF. This ELISA is designed to measure the prominent and
potent human isoform VEGF 165, but its reliability in dogs has already been reported
(SCHEIDEGGER et al. 1999; TROY et al. 2006). The amino acid sequences are nearly
identical between humans and dogs. Canine VEGF 164 is 95% homologous with human
ortholog and the molecular biological function is similar to that of human VEGF
(SCHEIDEGGER et al. 1999).
The purpose of our study was to measure serum VEGF in dogs with mammary gland
tumours and healthy dogs using a commercially available canine VEGF kit obtained from
R&D Systems in order to determine whether VEGF concentration had any prognostic value
in canine mammary tumours.
4.2.3
Material and methods
4.2.3.1 Study Population and Sample Preparation
Prior to the analysis of VEGF in dogs with mammary gland tumours, serum and plasma
concentrations of 10 healthy and 38 dogs with different diseases were compared in order to
establish the best source for measuring VEGF. VEGF was not detectable in serum and
plasma of the healthy group, whereas 17 dogs with different diseases showed positive serum
VEGF concentrations. Only 2 of them had detectable plasma VEGF level, therefore serum
samples were used in our study.
Currently there are no available studies comparing the human and canine ELISA in dogs.
Therefore we measured serum VEGF in 18 dogs with different diseases using both kits, to
test if there is a difference in the detection and concentration of VEGF.
Thirty-two dogs with mammary gland tumours presented for surgery at the Small Animal
Clinic of the University of Göttingen were included in this prospective study. Preoperative
serum VEGF concentrations were measured from blood samples collected from the cephalic
49
Manuskript II
vein. Before surgical intervention thoracic radiographs including right and left lateral views
were performed to evaluate potential metastasis. Serum samples were also collected from
23 healthy dogs as a control group. The dogs were confirmed to be healthy on the basis of a
physical examination, clinical pathology (complete blood count (CBC), serum chemistry) and
abdominal ultrasonography. Serum samples were processed following the R&D Systems
protocol. All samples were kept at room temperature for 2 hours to allow them to clot and
were then centrifuged (30 min, 1000 g). Samples were stored at -20°C until required for
analysis. SALVEN et al. (1997) reported that serum VEGF concentrations were unaffected
by a freeze-thaw cycle.
Histopathology from mammary gland tumours was performed on surgical biopsies that were
fixed in 10% buffered formalin and routinely embedded in paraffin. Sections were stained
with haematoxylin and eosin (H.& E.). The tumours were classified by a board-certified
pathologist (European College of Veterinary Pathologists, ECVP) according to the World
Health Organization (WHO) histological classification.
4.2.3.2 VEGF assay
The Serum VEGF levels were measured using a commercially available canine VEGF
quantitative
enzyme-linked
immunosorbent
assay
kit
(Quantikine,
R&D
Systems,
Minneapolis, MN, USA) following the manufacturer’s instructions.
To determine the serum concentration of VEGF 100 μl of assay diluent (RD1W) was added
to each well of a microtitre plate, which had been coated with monoclonal antibody specific
for VEGF. Then 100 μl of VEGF standard or serum sample were pipetted into each well and
incubated for 2 hours at room temperature so that any VEGF present in the sample was
bound by the immobilized antibody. The plate was washed three times with wash buffer
solution to remove unbound substances. Two hundred microliters of an enzyme-linked
polyclonal antibody specific for VEGF (VEGF conjugate) were then added to the wells and
incubated for 2 hours at room temperature to bind to the immobilized VEGF.
The plate was washed three times again, and then 200 μl of a substrate solution (Colour
Reagent A and Colour Reagent B) were added to the wells and colour developed in
proportion to the amount of VEGF bound in the initial step. The preparation was incubated
for 25 minutes at room temperature and was protected from light. Finally, 50 μl of a stop
solution was added and the intensity of the colour was measured.
50
Manuskript II
Samples were analyzed with the use of a TECAN microplate reader (Fa. TECAN Austria
GmbH, Grödig, Österreich) at an optical density of 450 nm and a wavelength correction of
570 nm.
Calibration on the microtitre plate included standard series dilutions of recombinant canine
VEGF. All assays were conducted in triplicate and the mean values were calculated. The
average zero standard optical density was subtracted. The optical density of the standard
solutions was plotted against their corresponding concentrations to generate a standard
curve and allow the determination of VEGF concentrations from all samples. Concentrations
are reported as pg/ml.
According to the manufacturer’s instructions, the assay measures the predominant isoform
VEGF 164, and the minimum detectable dose (MDD) of VEGF was defined as typically less
than 19.5 pg/ml. The assay shows no cross-reactivity with a series of cytokines and growth
factors. The manufacturer reported mean intra- and inter-assay coefficients of variation of 5.4
and 7.3%, respectively, for this kit.
Values read as ≤ 0 pg/ml were all considered negative for circulating VEGF.
4.2.3.3 Statistical analysis
Statistical calculations were performed using a commercial software package (SAS-system,
version 9.3, Cary, NC, USA.). For the purposes of analysis, dogs with VEGF values ≤ 0
pg/ml were set at 0 pg/ml. VEGF concentrations were not normally distributed.
VEGF results of dogs with mammary gland tumours and healthy dogs were compared using
Fisher’s exact test.
The statistical significance was defined as P <0.05.
4.2.4
Results
4.2.4.1 Dogs with mammary gland tumours
Thirty-two sera obtained from dogs with mammary gland tumours were assayed for VEGF
concentrations. The median age of the dogs with mammary gland tumours was 10 years
(range, 3-16 years).The dogs sampled belonged to a variety of breeds, including mixedbreed (=13), Golden Retriever (=4), German Shepherd (=2), Bavarian Mountain Scenthound
(=2), Old German Cattledog (=2), Labrador Retriever (=1), Boxer (=1), Border Collie (=1),
Beagle (=1), Poodle (=1), German Spaniel Dog (=1), Catalan Shepherd Dog (=1),German
51
Manuskript II
Shorthaired Pointer (=1) and Shapendoes (=1). Five dogs of the 32 female dogs with
mammary gland tumours in our study were neutered and twenty-seven dogs were intact.
In 27 of the studied dogs (n=32), the mammary gland tumours were malignant, while only 5
benign tumours were observed.
The malignant mammary gland tumours included the following histopathologies: complex
carcinoma (=12), simple carcinoma (=8), spindle cell carcinoma (=3), carcinosarcoma (=2)
and adenocarcinoma (=2).
The benign mammary gland tumours included the following histopathologies: complex
adenoma (=2), fibroadenoma (=2) and fibroma (=1).
In addition 4 dogs had mammary mixed tumours.
Only one case had a lymph node metastasis among the 27 malignant mammary tumours
and thoracic radiographs showed no evidence of lung metastasis.
4.2.4.2 Healthy control group
Twenty-three serum samples of healthy dogs were assayed for VEGF concentrations. The
control group (n=23) consisted of 12 female (5 neutered females, 7 intact females) and 11
male (3 neutered males, 8 intact males) dogs with a median age of 5 years (range, 7 month13 years). The breeds included mixed breed (=9), German Shepherd (=3), Jack Russell (=2),
Rhodesian Ridgeback (=1), Weimaraner (=1), Bavarian Mountain Scenthound (=1),
Australian Shepherd (=1), Bearded Collie (=1), Briard (=1), Dalmatian (=1), Hovawart (=1)
and Entlebuch Mountain Dog (=1).
4.2.4.3 VEGF results
Measureable concentrations of VEGF were found in 2 of 32 serum samples from dogs with
mammary gland tumours in the study (6.9 and 10.3 pg/ml). In the control group, only 2 of 23
healthy dogs had detectable concentrations (3 and 17 pg/ml). There was no significant
difference between dogs with mammary gland tumours and healthy dogs related to VEGF
detection (Fig. 1).
To compare the sensitivity between the human and canine ELISA kit from R&D Systems, we
measured serum VEGF in 18 dogs with different diseases (Table 1). With the use of the
human ELISA 6 dogs had detectable VEGF concentrations (range, 4.9 ‒ 92.2 pg/ml), while
only one of these dogs were positive for VEGF (71 pg/ml), when using the canine ELISA.
52
Manuskript II
4.2.5
Discussion
In the present study, we measured serum VEGF levels in dogs with mammary gland tumours
and healthy control subjects using a canine ELISA kit, which mainly detects the predominant
canine isoform VEGF 164. The aim of the study was to find out if this ELISA is useable for
dogs with mammary gland tumours.
To our knowledge, there is only 1 study available in veterinary oncology using the same
canine ELISA kit. The reason herefore is its recent commercial availability. ARESU et al.
(2012) showed that plasma VEGF concentrations were significant higher in lymphomaaffected dogs than in controls.
To detect VEGF-levels in serum and/or plasma from dogs most studies used a commercial
ELISA test kit for human VEGF (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)
(CLIFFORD et al. 2001; WERGIN u. KASER-HOTZ 2004; GENTILINI et al. 2005; KATO et
al. 2007; ROSSMEISL et al. 2007; THAMM et al. 2008; SILVERSTEIN et al. 2009). This
human VEGF commercial kit is designed to measure VEGF 165 levels and has been already
validated for use in the dog (SCHEIDEGGER et al. 1999; TROY et al. 2006).
KATO et al. (2007) reported that serum VEGF where significantly higher in dogs with
mammary gland tumours compared to a healthy control group with the use of the described
human ELISA kit. Furthermore, SOBCZYNSKA-RAK (2009) detected plasma VEGF in dogs
suffering from skin and subcutaneous tissue tumours with the use of a mouse VEGF ELISA
kit (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). This can be explained because the
predominant canine isoform VEGF 164 shares, according to the manufacturer, 95% and 90%
amino acid sequence identity with human VEGF and mouse VEGF, respectively
(SCHEIDEGGER et al. 1999).
Nevertheless, these three commercial kits from R&D Systems differ in their sensitivity. The
limit of detection in the mouse ELISA was defined as 3 pg/ml, whereas the minimum
detectable dose (MDD) of VEGF in the human and canine ELISA was defined as typically
less than 9.0 pg/ml and 19.5 pg/ml, respectively. In comparison with the human and mouse
ELISA, the canine ELISA showed a worse sensitivity and this may be one reason why we
couldn’t confirm the observations of KATO et al. (2007). In his study serum VEGF
concentrations in dogs with mammary gland tumours ranged from ND-992.9 pg/ml with a
median of 14.85 pg/ml.
53
Manuskript II
Our results when comparing VEGF concentrations from 18 dogs with different diseases
measured with a human and canine ELISA from R&D Systems demonstrated a better
sensitivity of the human ELISA related to VEGF detection (Table 1). This examination
supports our hypothesis of an inadequate sensitivity of the canine ELISA for mammary gland
tumours and may explain why serum VEGF was undetectable in 30 of 32 dogs with
mammary gland tumours, contrary to our expectations.
Nonetheless, because of the small sample size and the inhomogeneity of the group further
investigations are required.
A technique fault in the implementation of the canine ELISA, that could explain why the 30
tumour-bearing dogs have no detectable VEGF concentrations, is excluded, since a total of
175 dogs with various internal diseases were analyzed for their individual VEGF
concentration. Thus, serum samples from dogs with mammary gland tumours were
distributed on several assays and significant increased VEGF-levels were found for several
other diseases in comparison to healthy controls (unpublished data).
Alternatively to a deficient sensitivity, it is possible that VEGF 164 may not be the primary
angiogenic isoform involved in mammary gland tumour growth or that other pro-angiogenic
factors have a predominant role in angiogenesis.
Altogether, 5 isoforms of VEGF have been isolated in dogs. The canine splice variants
include VEGF 120, VEGF 144, VEGF 164, VEGF 188 and VEGF 205, while human VEGF
consist of nine isoforms (121, 145, 148, 162, 165, 165b, 183, 189 and 206). VEGF 164 and
VEGF 120 are soluble proteins, while VEGF 144 and VEGF 188 are associated with the
extracellular matrix or bound to the cell surface by heparan sulphate. Therefore VEGF 144
and VEGF 188 do not exist in a soluble form (SCHEIDEGGER et al. 1999; ROBINSON u.
STRINGER 2001).
The manufacturer reported that VEGF 164 is measured by the canine ELISA as it is the
dominant isoform in dogs. Other isoforms are potentially also detected but this was not
tested.
In our study serum VEGF was detectable in 2 of the 32 dogs with mammary gland tumors
and the detectable concentrations were 6.9 and 10.3 pg/ml, which is below the MDD of 19.5
pg/ml.
54
Manuskript II
Both dogs had malignant mammary gland tumours and one of them also had a chronic fistula
at the neck, diagnosed histopathologically as a chronic inflammation.
VEGF is known also as VPF (Vascular Permeability Factor), based on its ability to increase
vascular permeability (SENGER et al. 1983). Therefore VEGF expression is also upregulated in inflammatory disorders and this may be a cause for the detectable VEGF
concentration in the dog with an inflammatory process (BENAV et al. 1995).
It is not known why the second dog with mammary gland tumour had a measureable VEGF
concentration. Another plausible hypothesis for the two positive values is that the isoform
VEGF 164 may have been the primary angiogenic factor for tumour growth in these two
dogs.
Two healthy dogs (n=23) also showed a positive VEGF concentration of 3 and 17 pg/ml.
Both (one female mixed breed and one male Bavarian Mountain Scenthound) were intact,
under 1 year old, and had a low-grade leukocytosis. The serum sample of the female dog
with a VEGF level of 17 pg/ml was collected after a longer period of heat because of ovarian
cysts. VEGF as an inducer of angiogenesis is involved in a variety of physiological
processes, like wound healing and also the female reproductive cycle. This is a plausible
explanation for this relative high value in our study (FERRARA 1999).
In addition VEGF is stored in platelets and leukocytes and is released during blood clotting
and it has been considerable debate if serum VEGF or plasma VEGF should be used for
analysis (SALVEN et al. 1999; JELKMANN 2001). Therefore an increase in serum VEGF
could perhaps be explained by the presence of leukocytosis or thrombocytosis. Nevertheless
six tumor-bearing dogs in our study with leukocytosis were negative for serum VEGF.
Serum VEGF concentrations in cancer patients and healthy controls are higher when
compared with plasma VEGF levels in the same patient, but platelets and leukocytes of
cancer patients contain more VEGF than those of healthy controls (SALVEN et al. 1999;
SALGADO et al. 2001). For this reason some authors support the use of serum for the
measurement of circulating VEGF, because it has a higher biological significance. The
majority of published studies measured preoperative serum VEGF concentrations and
showed a positive correlation between high serum VEGF levels and tumour progression
and/or survival (LEE et al. 2000; POON et al. 2003).
55
Manuskript II
Due to the fact that in both groups only two dogs had detectable VEGF concentrations, a
correlation between VEGF concentration, white blood cell (WBC) count and platelet count
were not tested.
In our research, we measured serum VEGF concentrations in dogs with mammary gland
tumours and a healthy control group using a commercial canine ELISA. Serum VEGF was
neither detectable in most dogs with mammary gland tumours nor in healthy dogs.
The results of this study suggest that the measurement of serum VEGF using a canine
ELISA cannot be used as a diagnostic and/or prognostic marker for mammary gland
tumours.
4.2.6
References
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Manuskript II
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60
Manuskript II
18
16
14
Serum VEGF (pg/ml)
12
10
8
6
4
2
0
-2
1
2
Median
25%-75%
Non-Outlier Range
Outliers
Extremes
Fig. 1 Box plot of serum VEGF concentrations in dogs with mammary gland tumours (n=32;
group 1) and healthy dogs (n=23; group 2)
61
Manuskript II
Table 1
Serum VEGF concentrations in dogs with different diseases, measured with a
canine and human ELISA
No.
Dogs
Diagnosis
(Histopathology)
Canine
ELISA
Serum VEGF
(pg/ml)
0
Human
ELISA
Serum VEGF
(pg/ml)
11,8
1
Mixed breed
Diabetes mellitus
2
Jack Russell Terrier
Diabetes mellitus and
Pancreatitis
71,0
92,2
3
German Spaniel
Dog
Pancreatitis
0
5,4
4
Mixed breed
Pancreatitis
0
13,3
5
Parson Russell
Terrier
Heat
0
0
6
German Shepherd
Multiple ovarian cysts
0
0
7
Slovensky Kopov
Heat; Ovarian cysts
0
0
8
Mixed breed
Heat
0
0
9
Australian Shepherd
Polycystic liver
0
0
10
Golden Retriever
Mammary gland
tumour
(Carcinosarcoma)
0
4,9
11
Shapendoes
Mammary gland
tumour (Complex
carcinoma)
0
0
12
Bavarian Mountain
Scenthound
Mammary gland
tumour (Simple
carcinoma)
0
0
13
Labrador Retriever
Mammary gland
tumour
(Adenocarcinoma)
0
0
62
Manuskript II
Continuation of table 1
Serum VEGF concentrations in dogs with different diseases,
measured with a canine and human ELISA
No.
Dogs
Diagnosis
(Histopathology)
Canine
ELISA
Serum VEGF
(pg/ml)
0
Human
ELISA
Serum VEGF
(pg/ml)
0
14
Mixed breed
Mammary gland
tumour (Simple
carcinoma)
15
Old German
Cattledog
Mammary gland
tumour (Complex
carcinoma)
0
0
16
Mixed breed
Splenic lesion
(Splenitis)
0
5,1
17
Golden Retriever
Mast cell tumour
0
0
18
German Shorthaired
Pointer
Pyometra
0
0
63
Übergreifende Diskussion
5
Übergreifende Diskussion
Der Wachstumsfaktor VEGF gilt als fundamentaler Regulator der Tumorangiogenese und ist
daher für das Tumorwachstum und dessen Metastasierung von höchster Bedeutung.
Die Untersuchung der VEGF Konzentration in Serum und/oder Plasma von Hunden mit
Tumoren fand daher in zahlreichen Studien statt, um Aussagen über die Bedeutung und den
prognostischen Nutzen von VEGF zu machen. Die quantitative Bestimmung von VEGF
erfolgte in der Regel mithilfe eines humanen VEGF ELISA (Fa. R&D Systems, Minneapolis),
dessen Funktionsfähigkeit zur Messung caniner VEGF-Konzentrationen von TROY et al.
(2006) validiert wurde.
Erst seit 2007 ist auch ein kommerzieller caniner VEGF ELISA (Fa. R&D Systems,
Minneapolis) erhältlich, der hauptsächlich die dominante canine Isoform VEGF 164
nachweist.
Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der Serum-VEGF Konzentrationen in Hunden
mit Milzläsionen (Hämangiosarkom oder Hämatom) und Gesäugetumoren im Vergleich zu
einer gesunden Kontrollgruppe unter Verwendung des caninen VEGF ELISA.
Da eine Differenzierung von Milzläsionen bis heute nur anhand einer histopathologischen
Untersuchung möglich ist, lag der Schwerpunkt der 1. Studie zusätzlich auf der Überprüfung,
ob der Serum-VEGF Level geeignet ist, zwischen Hämangiosarkomen in der Milz und nichtmalignen Milzläsionen (Hämatomen) zu unterscheiden.
Den Nachweis erhöhter VEGF-Konzentrationen in Hunden mit tumoröser Erkrankung im
Vergleich zu gesunden Probanden haben bereits etliche veterinärmedizinische Studien
erbracht (GENTILINI et al. 2005; KATO et al. 2007; TAYLOR et al. 2007; SOBCZYNSKARAK 2009; ARESU et al. 2012).
Erste Ergebnisse zu VEGF-Konzentrationen bei Hunden mit Hämangiosarkomen lieferten
CLIFFORD et al. (2001). Sie stellten mithilfe des humanen VEGF ELISA signifikant erhöhte
Plasma-VEGF Level in erkrankten Hunden gegenüber gesunden Hunden fest. Eine
Beziehung
zwischen
VEGF-Konzentrationen
und
Erkrankungsstadium
konnte
nicht
nachgewiesen werden. YONEMARU et al. (2006) und CAMPOS et al. (2012) beschäftigten
sich später mit der VEGF-Expression in Hämangiosarkomen und Hämangiomen bei Hunden.
Beide Studien zeigten immunhistochemisch eine signifikant höhere VEGF-Expression in
64
Übergreifende Diskussion
Hämangiosarkomen
Zusammenhang
als
in
zwischen
Hämangiomen.
Diese
VEGF-Expression
Ergebnisse
und
maligner
deuten
auf
Proliferation
einen
von
Hämangiosarkomen hin.
Die Untersuchung von Serum-VEGF Konzentrationen in Hunden mit Hämangiosarkomen in
der Milz mithilfe des neuen caninen ELISA sowie der Vergleich mit nicht-malignen
Milzläsionen wurde unserer Kenntnis nach bisher nicht durchgeführt.
Die Ergebnisse unserer ersten Studie stimmen dabei mit bisher veröffentlichten
veterinärmedizinischen Studien, die einen humanen VEGF ELISA einsetzten, überein.
Hunde mit Milzläsionen (Hämangiosarkom oder Hämatom) zeigen hier signifikant erhöhte
Serum-VEGF Level im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe. Die Serum-VEGF
Konzentrationen
waren
jedoch
nicht
geeignet,
zwischen
Hämangiosarkom-
und
Hämatompatienten zu unterscheiden. Auch wenn Hunde mit Milzläsionen (10/15) signifikant
häufiger detektierbare Serum-VEGF Konzentrationen als gesunde Hunde (2/23) aufwiesen,
zeigte sich zwischen Hämangiosarkom- (4/7) und Hämatompatienten (6/8) kein statistisch
signifikanter Unterschied in Bezug auf den VEGF Nachweis.
Die an einem Hämangiosarkom erkrankten Hunde, die bereits Fernmetastasen in der Leber
ausgebildet hatten, waren allesamt positiv für Serum-VEGF. Ob diese Beobachtung von
prognostischer Bedeutung sein könnte, müssen weiterführende Studien an einem größeren
Kollektiv mit unterschiedlichen Erkrankungsstadien klären.
Die Auswertung unserer zweiten Studie ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied
zwischen Hunden mit Gesäugetumoren und gesunden Hunden in Bezug auf den Nachweis
von VEGF.
KATO et al. (2007) hingegen kamen bei Hunden mit Gesäugetumoren zu gegensätzlichen
Ergebnissen. Unter Verwendung des humanen VEGF ELISA waren im Vergleich zu
gesunden Probanden sowohl Plasma- als auch Serum-VEGF Konzentrationen in Hunden mit
Gesäugetumoren signifikant erhöht. Außerdem lagen innerhalb der Gesäugetumorgruppe
signifikant
höhere
Serum-
und
Plasma-VEGF
Level
in
Hunden
mit
malignen
Gesäugetumoren als bei Hunden mit benignen Gesäugetumoren vor. Eine zusätzliche
Einteilung in Gruppen mit postoperativen Lungenmetastasen und ohne Metastasen ergab
ebenfalls deutlich erhöhte Serum- und Plasma-VEGF Konzentrationen bei den Hunden mit
postoperativen Metastasen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten im Gegensatz zu unserer
Studie darauf hin, dass VEGF bei caninen Gesäugetumoren von prognostischer Bedeutung
65
Übergreifende Diskussion
sein könnte. Bestätigt wird dies auch von QIU et al. (2008a). Hier konnte eine signifikant
erhöhte VEGF-Expression in caninen malignen Gesäugetumoren als in normalem
Mammagewebe und benignen Gesäugetumoren nachgewiesen werden.
Humanmedizinische Studien bei Brustkrebspatienten weisen ähnliche Ergebnisse auf. HEER
et al. (2001) und ADAMS et al. (2000) stellten signifikant erhöhte Serum- und/oder PlasmaVEGF Level in Krebspatienten im Vergleich zu gesunden Probanden fest.
Mögliche Ursachen dafür, dass unsere Ergebnisse nicht mit bisher veröffentlichten Studien
übereinstimmen, sind zum einen die Verwendung des caninen ELISA und zum anderen die
angiogene Beteiligung anderer Wachstumsfaktoren (z. B. basic fibroblast growth factor)
sowie von VEGF-Isoformen, die nicht vom caninen ELISA detektiert werden.
Auch wenn die Aminosäuresequenz von VEGF zwischen Hund und Mensch nahezu
identisch ist (95% Homologie, nach SCHEIDEGGER et al. 1999), unterscheiden sich der
canine und humane ELISA von R&D Systems vor allem durch ihre Sensitivität.
So liegt die minimal detektierbare Dosis (MDD) beim caninen ELISA mit 19,5 pg/ml deutlich
über der des humanen ELISA mit 9,0 pg/ml. Die schlechtere Sensitivität mag eine Erklärung
dafür sein, dass nahezu alle Hunde mit Gesäugetumor negativ für VEGF waren bzw. die
zwei VEGF positiven Hunde mit Gesäugetumor (6,9 und 10,3 pg/ml) nur errechnete
Serumkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze des ELISA aufwiesen.
In der Studie von KATO et al. (2007) erreichten die mit dem humanen ELISA gemessenen
Serum-VEGF Konzentrationen in den an Gesäugetumoren erkrankten Hunden einen Wert
von nicht-detektierbar bis 992,9 pg/ml, wobei ein Medianwert von 14,85 pg/ml vorlag. Der
niedrige Medianwert von 14,85 pg/ml bestätigt zum Teil die negativen Ergebnisse unserer
Studie. Andererseits konnte KATO et al. (2007) auch VEGF Level nachweisen, die deutlich
über der minimal detektierbaren Dosis beider ELISA lagen.
Unsere Entscheidung zur Versuchsdurchführung mit dem caninen VEGF ELISA lag nicht nur
in der erst kürzlich kommerziellen Verfügbarkeit begründet, sondern auch in dem
Studienresultat von SEKIS et al. (2009). In der Studie wird das für Zellkulturüberstände
validierte canine und humane DuoSet ELISA von R&D Systems verglichen. Die Ergebnisse
weisen auf eine adäquatere Messung von caninem VEGF durch den caninen ELISA hin,
während der humane ELISA die canine VEGF Konzentration eher unterschätzt.
66
Übergreifende Diskussion
In der Literatur mangelt es bisher an einer Vergleichsstudie, die den humanen und caninen
Quantikine-ELISA, die auch für Serum- und Plasmaproben validiert wurden, auf
Unterschiede hinsichtlich der Detektierbarkeit von VEGF und VEGF-Konzentrationen im
Serum und/oder Plasma von Hunden überprüft.
Nach Herstellerangaben besteht beim caninen Quantikine ELISA eine Kreuzreaktivität von
100% zu rekombinanten VEGF 165, während diese beim humanen ELISA lediglich 67% zu
rekombinanten caninen VEGF ausmacht. Damit ist hier ebenfalls anzunehmen, dass die
Verwendung
des
humanen
Testkits
bei
Hunden
zur
Messung
niedriger
VEGF
Konzentrationen führt als eigentlich vorhanden. Allerdings ist zu klären, ob sich diese
Ergebnisse bei Messung von natürlichem VEGF in Serum und/oder Plasmaproben
bestätigen lassen. Daher haben wir in einer Voruntersuchung anhand von 18 Hunden mit
unterschiedlichen Erkrankungen beide Test-Kits verglichen. Unter Verwendung des
humanen ELISA konnten wir in sechs Hunden Serum VEGF nachweisen (4,9-92,2 pg/ml),
während nach der Messung mittels caninem ELISA nur einer dieser Hunde VEGF positiv war
(71 pg/ml). Die VEGF Konzentrationen der übrigen fünf Hunde lagen unterhalb der
Nachweisgrenze des caninen ELISA. Diese Ergebnisse deuten auf eine schlechtere
Sensitivität des caninen ELISA hin und widersprechen sowohl den oben genannten Angaben
des Herstellers und den Ergebnissen der Vergleichsstudie von SEKIS et al. (2009).
Zum Vergleich des humanen und caninen Quantikine Testkits sind weitere Untersuchungen
an einem homogenen Kollektiv erforderlich, um fundierte Aussagen machen zu können.
Eine andere mögliche Ursache für das Abweichen unserer Studienergebnisse von KATO’s
„Gesäugetumorstudie“ (2007) ist die angiogene Beteiligung weiterer Isoformen von VEGF.
Durch alternatives Splicing entstehen fünf canine VEGF-A Isoformen (VEGF 120, VEGF 144,
VEGF 164, VEGF 188 und VEGF 205) (SCHEIDEGGER et al.
1999).
Nach
Herstellerangaben wird mittels caninem ELISA hauptsächlich die dominante Isoform VEGF
164 gemessen. Der Nachweis anderer Isoformen wie z.B. VEGF 120, die laut
SCHEIDEGGER et al. (1999) ebenfalls bedeutend ist, wurde nicht getestet.
Neben VEGF-A scheint ein weiteres Mitglied der VEGF-Familie in Gesäugetumoren von
Bedeutung
zu
sein.
VEGF-C
ist
wegen
seiner
hochaffinen
Bindung
an
die
Rezeptortyrosinkinase VEGFR-3 (Flt-4/fms like tyrosine kinase), dessen Expression in
normalem adulten Gewebe auf lymphatische Endothelzellen beschränkt ist, hauptsächlich an
67
Übergreifende Diskussion
der Lymphangiogenese beteiligt. Zusätzlich ist VEGF-C ein Ligand für VEGFR-2, der als der
Hauptvermittler der angiogenen Effekte von VEGF gilt (YLA-HERTTUALA et al. 2007).
QIU et al. (2008a) berichteten von einer signifikant erhöhten VEGF-C mRNA Expression in
caninen malignen Gesäugetumoren im Vergleich zu benignen Gesäugetumoren oder
normalem Mammagewebe. Zusätzlich zeigte sich eine deutlich höhere VEGF-C Expression
in Tumoren mit Lymphknotenmetastasen als in denen ohne Metastasen.
Die Studie von KUREBAYASHI et al. (1999) beschäftigte sich mit dem Expressionsmuster
verschiedener VEGF Familienmitglieder in Brustkrebs und wies neben VEGF-A auch VEGFB, VEGF-C und VEGF-D in allen untersuchten Brustkrebs-Zelllinien nach. Darüber hinaus
stellten sie eine VEGF-C Expression nur in nodal-positiven Brustkrebsproben fest
(KUREBAYASHI et al. 1999). Diese Beobachtung ebenso wie die in QIU’S Studie (2008a)
nachgewiesene
erhöhte
VEGF-C
Expression
in
Gesäugetumoren
mit
Lymphknotenmetastasen deuten auf einen Zusammenhang zwischen VEGF-C Expression
und lymphatischer Tumorausbreitung hin.
Das VEGF-C auch eine Rolle bei der Blutgefäßentwicklung (Angiogenese) spielt, zeigen in
vivo und in vitro Studien von CAO et al. (1998) und PEPPER et al. (1998).
Humanmedizinische Studien an Plattenepithelkarzinomen und Brustkrebs deuten ebenfalls
auf den „zusätzlichen“ angiogenen Effekt von VEGF-C hin. KITADAI et al. (2001) stellten in
ösophagealen Plattenepithelkarzinomen eine signifikant erhöhte Gefäßdichte in VEGF-C
positiven im Vergleich zu VEGF-C negativen Tumoren fest. Auch in MOHAMMEDS’s Studie
an primären Mammakarzinomen war eine hohe VEGF-C Expression signifikant mit hoher
Blutgefäß- sowie Lymphgefäßdichte assoziiert. Zusätzlich ging die hohe VEGF-C Expression
mit einer schlechteren Prognose (verkürzte Gesamtüberlebenszeit und krankheitsfreies
Intervall) für die Patientin einher (MOHAMMED et al. 2007). VALTOLA et al. (1999)
demonstrierten die Hochregulierung des VEGFR-3 im Endothelium von Blutgefäßen in
Brustkrebs und das VEGF-C als angiogener Wachstumsfaktor für Blutgefäße fungiert.
Auch für VEGF-D, welche mit VEGF-C eine VEGF-Unterfamilie bildet, ist eine Beteiligung an
der Angiogenese und Erhöhung der Gefäßpermeabilität nachgewiesen (RISSANEN et al.
2003; YLA-HERTTUALA et al. 2007).
In welchem Ausmaß VEGF-C und VEGF-D letztendlich an der Tumorangiogenese beim
Hund beteiligt sind, müssen weiterführende Untersuchungen klären.
68
Übergreifende Diskussion
Neben
der
Evaluierung
der
VEGF-A
und
VEGF-C
Konzentrationen
sollte
die
Mikrogefäßdichte im Tumor herangezogen werden, um den Grad der Angiogenese und
mögliche Zusammenhänge mit der Höhe der VEGF-A sowie VEGF-C Konzentrationen und
damit deren angiogenes Potential zu ermitteln.
Möglicherweise liefern zukünftige Studien auch Antworten darauf, warum einige Hunde mit
Milzläsionen (Hämangiosarkom oder Hämatom) ebenfalls nicht detektierbare Serum VEGF
Konzentrationen aufwiesen.
Das Ziel der Dissertation, neben der Evaluierung von Serum VEGF Konzentrationen in
Hunden mit Milzläsionen und Gesäugetumoren, mithilfe des caninen Quantikine ELISA auch
einen diagnostischen und prognostischen Nutzen von VEGF zu ermitteln, ist nur teilweise
gelungen.
Hunde mit Milzläsionen zeigten zwar signifikant erhöhte Serum VEGF Konzentrationen im
Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe, aber eine Differenzierung zwischen
Hämangiosarkom- und Hämatompatienten anhand der VEGF Level war nicht möglich.
Limitiert wird diese Studie durch die kleine Probandenanzahl. Zusätzlich zu HämatomPatienten sollten zukünftig Hunde mit weiteren benignen Milzläsionen miteinbezogen
werden.
Inwieweit die Verwendung des caninen ELISA zu unseren Ergebnissen, die nicht mit
anderen Gesäugetumor- bzw. Brustkrebsstudien übereinstimmen, beigetragen hat, ist
ebenfalls in Folgestudien zu klären.
69
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Meike Frenz
Untersuchungen
zur
Analytik
und
diagnostischen
Aussagekraft
des
Wachstumsfaktors Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) bei Hunden mit
tumorösen Erkrankungen
Das Zytokin Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ist ein bedeutender vaskulärer
Wachstumsfaktor und spielt daher eine Schlüsselrolle bei der Tumorangiogenese bzw. dem
Tumorwachstum und der hämatogenen Metastasierung.
VEGF wird nachweislich von Tumorzellen und deren Stroma sezerniert. Zahlreiche humanund tiermedizinische Studien mit unterschiedlichen tumorösen Erkrankungen belegen
ansteigende Serum- und/oder Plasma-VEGF Level im Vergleich zu gesunden Probanden.
Die quantitative Bestimmung von VEGF erfolgte dabei in der Regel mithilfe eines humanen
VEGF ELISA (Fa. R&D Systems, Minneapolis), dessen Funktionsfähigkeit zur Messung
caniner VEGF-Konzentrationen validiert wurde. Erst seit kurzem ist auch ein kommerzieller
caniner VEGF ELISA (Fa. R&D Systems, Minneapolis) erhältlich, der hauptsächlich die
dominante canine Isoform VEGF 164 nachweist.
Ziel dieser Dissertation war daher die Untersuchung der Serum-VEGF Konzentrationen in
Hunden mit den häufig auftretenden Neoplasien Hämangiosarkom und Gesäugetumor im
Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe unter Verwendung des caninen VEGF ELISA.
Im Rahmen der vorliegenden Studien wurden bei insgesamt 15 Hunden mit Milzläsionen
und 32 Hunden mit Gesäugetumoren präoperativ die VEGF Serum Konzentration bestimmt.
Hunde mit Milzläsionen wurden nur in die Studie aufgenommen, wenn histopathologisch ein
Hämangiosarkom oder Hämatom vorlag. Als Kontrollgruppe dienten 23 klinisch gesunde
Hunde unterschiedlicher Rasse und unterschiedlichen Alters.
Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in zwei Manuskripten dokumentiert.
70
Zusammenfassung
1.
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with haemangiosarcoma and
haematoma
Hunde mit Milzläsionen (Hämangiosarkom und Hämatom) zeigen hier signifikant erhöhte
Serum-VEGF Level (4.83 ‒ 183.5 pg/ml) im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe (3 ‒ 17
pg/ml). Die Serum-VEGF Konzentrationen waren jedoch nicht geeignet, zwischen
Hämangiosarkom- und Hämatompatienten zu unterscheiden. Zwar wiesen Hunde mit
Milzläsionen (10/15) signifikant häufiger detektierbare Serum-VEGF Konzentrationen auf als
gesunde Hunde (2/23), ein signifikanter Unterschied in Bezug auf den VEGF-Nachweis
zwischen Hämangiosarkom- (4/7) und Hämatompatienten (6/8) zeigte sich aber nicht. Die an
einem Hämangiosarkom erkrankten Hunde, die bereits Fernmetastasen in der Leber
ausgebildet hatten, waren allesamt positiv für Serum VEGF.
Zusammenfassend ist ein potentiell klinischer Nutzen von Serum VEGF bei Hunden mit
Milzläsionen als diagnostischer Marker zu erkennen, auch wenn eine Differenzierung
zwischen Hämangiosarkom- und Hämatompatienten anhand der VEGF Level nicht möglich
war.
2.
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with mammary gland
tumours
Die Auswertung der 2. Studie ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen
Hunden mit Gesäugetumoren und gesunden Hunden in Bezug auf den Nachweis von VEGF.
VEGF war nicht detektierbar in 30 von 32 Serumproben von Hunden mit Gesäugetumoren
sowie in 21 von 23 Serumproben der gesunden Kontrollgruppe.
Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Messung der Serum VEGF
Konzentration mittels caninem ELISA nicht als diagnostischer und/oder prognostischer
Marker für Hunde mit Gesäugetumoren geeignet ist.
Die Ergebnisse stehen im Widerspruch zu bisherigen Untersuchungen, die einen humanen
ELISA verwendet haben. Daher müssen Folgestudien klären, inwieweit die Verwendung des
caninen ELISA, der sich in seiner Sensitivität vom humanen ELISA unterscheidet,
zu
unseren Ergebnissen beigetragen hat. Weiterhin ist die mögliche angiogene Beteiligung
anderer Wachstumsfaktoren und VEGF-Isoformen auszuschließen.
71
Summary
7
Summary
Meike Frenz
Studies on the analysis and diagnostic value of the growth factor Vascular Endothelial
Growth Factor (VEGF) in dogs with neoplastic diseases
The cytokine VEGF is a potent angiogenic growth factor and has therefore a key role in
tumor angiogenesis influencing tumor growth and haematogenous metastasis.
VEGF is proved to be produced and secreted by tumor cells and tumor-associated stromal
cells. Numerous human and veterinary studies have shown increased serum and/or plasma
VEGF levels in the presence of tumorous diseases compared to healthy subjects. To detect
VEGF-levels most studies used a commercial ELISA test kit for human VEGF (Quantikine,
Fa. R&D Systems, Minneapolis), which was previously validated for its use in dogs. A canine
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has only recently become commercially
available and is designed to measure the dominant canine isoform VEGF 164.
The purpose of this dissertation was the examination of serum VEGF concentrations in dogs
with haemangiosarcoma and mammary gland tumor compared to a healthy control group,
using a canine VEGF ELISA.
In the context of the present studies preoperative sera obtained from fifteen dogs with splenic
masses and thirty-two dogs with mammary gland tumors were assayed in order to determine
their VEGF concentrations. Only dogs with histological diagnosis of haemangiosarcoma or
haematoma were included in this study. The control group consisted of 23 healthy dogs of
diverse breeds and ages.
The results of our research are documented in two manuscripts.
72
Summary
1.
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with haemangiosarcoma and
haematoma
Dogs with splenic masses (haemangiosarcomas and haematomas) showed significantly
higher serum VEGF levels (4.83-183.5 pg/ml) compared with healthy dogs (3-17 pg/ml), but
there was no significant difference between dogs with haemangiosarcomas and
haematomas. Dogs with splenic masses had a higher probability of showing detectable
serum VEGF concentrations (10/15) than healthy dogs (2/23), but there was no significant
difference in the VEGF detection when comparing dogs with haemangiosarcomas and
haematomas. All dogs with haemangiosarcomas and distant metastases in the liver had
detectable serum VEGF concentrations.
In summary there is a potential utility of serum VEGF as a diagnostic marker for dogs with
splenic
lesions,
although
it
was
not
possible
to
make
a
distinction
between
haemangiosarcoma and haematoma based on the VEGF levels.
2.
Serum vascular endothelial growth factor in dogs with mammary gland tumours
The evaluation of our second analysis showed no significant difference in the detection of
VEGF in dogs with mammary gland tumors and healthy subjects. VEGF was below
detectable limits in 30 of 32 serum samples from dogs with mammary gland tumors and in 21
of 23 serum samples from healthy dogs.
The results of this study suggest that the measurement of serum VEGF using a canine
ELISA cannot be used as a diagnostic and/or prognostic marker for dogs with mammary
gland tumors.
The results of this analysis differ from previous studies who used a human ELISA. Therefore
follow-up studies have to clarify to which extent the use of the canine ELISA, which differ in
his sensitivity from the human ELISA, has contributed to our results. Furthermore the
possible involvement of other pro-angiogenic factors and VEGF isoforms is to be excluded.
73
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receptors (flt-1, flk-1, and flg-1) in canine vascular tumors.
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Danksagung
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Danksagung
Danken möchte ich Prof. Dr. Franz-Josef Kaup für die Überlassung des Themas, seine
konstruktiven Vorschläge und die schnellen, gründlichen Korrekturen.
Danke, Prof. Dr. Stephan Neumann für die Unterstützung und Beratung bei der Umsetzung
der Fragestellung und die Möglichkeit eine unvergessliche Zeit als Doktorandin und
Tierärztin verbringen zu dürfen.
Vielen Dank an alle Mitarbeiter der Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes der GeorgAugust-Universität für die Unterstützung bei der Beschaffung von Probanden, der
Aufbereitung des Probenmaterials und jeglicher Hilfe rund um die Doktorarbeit.
Besonderer Dank gilt meinen Mitdoktoranden Silvia Henecke und Ihrer Labor-Crew für die
Bereitstellung der Kühlzentrifuge sowie Alex Becker und Christian Prachar für viele tolle
Stunden als Konglomerat in Sachen Doktorarbeit und die gemeinsamen ersten Gehversuche
als frischgebackene Tierärzte.
Besonderer Dank gilt außerdem Almuth für unzählige Stunden, die du mir unermüdlich
geholfen hast sowie moralischen Beistand und schöne Hundespaziergänge.
Ein großer Dank an Melanie für das Korrekturlesen und deine Englischkenntnisse.
Danke an meine Kollegin Uta, die mich während dieser Arbeit mit Probenmaterial versorgt
hat und immer ein offenes Ohr für Fragen jeglicher Art hatte.
Vielen Dank an Thomas Kinder aus der Rinderhygiene für die Benutzung seines Labors.
Vielen Dank an die allerbeste Mama, Jürgen, meine Schwestern und vor allem Madick für
die tatkräftige Unterstützung in allen Lebenslagen.
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