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Abteilung Virologie
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Hämagglutinin und Polymerase als
Virulenzfaktoren des Influenza-A-Virus
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Iris Körner
geboren in Ulm
Januar 2010
Dekan: Prof. Dr. A. Aertsen
Promotionsvorsitzender: Prof. Dr. E. Schäfer
Referent: Prof. Dr. P. Stäheli
Koreferent: Dr. H. Jumaa (Gutachter der Arbeit), Dr. T. Brummer (Koreferent bei der
Prüfung)
Tag der Verkündung des Prüfungsergebnisses: 6.5.2010
Veröffentlichungen
Koerner, I., G. Kochs, U. Kalinke, S. Weiss, and P. Staeheli. 2007. Protective role of beta
interferon in host defense against influenza A virus. J Virol 81:2025-30.
Kochs, G., I. Koerner, L. Thiel, S. Kothlow, B. Kaspers, N. Ruggli, A. Summerfield, J.
Pavlovic, J. Stech, and P. Staeheli. 2007. Properties of H7N7 influenza A virus strain SC35M
lacking interferon antagonist NS1 in mice and chickens. J Gen Virol 88:1403-9.
Grimm, D., P. Staeheli, M. Hufbauer, I. Koerner, L. Martinez-Sobrido, A. Solorzano, A.
Garcia-Sastre, O. Haller, and G. Kochs. 2007. Replication fitness determines high virulence
of influenza A virus in mice carrying functional Mx1 resistance gene. Proc Natl Acad Sci U S
A 104:6806-11.
Rolling, T., I. Koerner, P. Zimmermann, K. Holz, O. Haller, P. Staeheli, and G. Kochs. 2009.
Adaptive mutations resulting in enhanced polymerase activity contribute to high virulence of
influenza A virus in mice. J Virol 83:6673-80.
Beiträge zu wissenschaftlichen Tagungen
-
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie
München 15. – 18. März 2006
Koerner, I., G. Kochs, S. Weiss, and P. Staeheli
Protective role of IFN-β in host defense against influenza A virus
Art der Präsentation: Poster
-
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie
Nürnberg 1. – 5. September 2007
Koerner, I., D. Grimm, M. Matrosovich, O. Haller, P. Staeheli, and G. Kochs
Contribution of viral glycoproteins to high virulence of influenza A virus in mice
Art der Präsentation: Poster
I
-
2nd EU Fluinnate Meeting
Siena, Italien 18. – 19. Januar 2008
Koerner, I., T. Rolling, D. Grimm, M. Matrosovich, O. Haller, P. Staeheli,
and G. Kochs
Contribution of hemagglutinin and polymerase proteins to high virulence of influenza
A virus in mice
Art der Präsentation: Vortrag
-
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie
Heidelberg 5. – 8. März 2008
Koerner, I., M. Matrosovich, O. Haller, P. Staeheli, and G. Kochs
Contribution of HA protein to high virulence of influenza A virus in mice
Art der Präsentation: Poster
-
3rd EU Fluinnate Meeting
Paris, Frankreich 22. – 23. Januar 2009
Koerner, I., P. Zimmermann, T. Rolling, M. Matrosovich, N. Robb, E. Fodor, O.
Haller, P. Staeheli, and G. Kochs
Contribution of the influenza A virus hemagglutinin and polymerase complex to high
virulence in mice
Art der Präsentation: Vortrag
-
1st EU Joint Bird Flu Meeting
Barcelona, Spanien 2. – 4. Februar 2009
Koerner, I., P. Zimmermann, T. Rolling, M. Matrosovich, E. Fodor, O. Haller, P.
Staeheli, and G. Kochs
Hemagglutinin and polymerase contribute to high virulence of influenza A virus in
mice
Art der Präsentation: Vortrag
II
-
28th Annual Meeting of the American Society for Virology
Vancouver, Kanada 11. – 15. Juli 2009
Koerner, I., M. Matrosovich, O. Haller, P. Staeheli, and G. Kochs
Analysis of adaptive mutations in the hemagglutinin of influenza virus A/PR/8/34
contributing to high virulence in mice
Art der Präsentation: Vortrag
-
5th Orthomyxovirus Research Conference
Freiburg 9. – 12. September 2009
Koerner, I., M. Matrosovich, O. Haller, P. Staeheli, and G. Kochs
Analysis of adaptive mutations in the hemagglutinin of influenza virus A/PR/8/34
contributing to high virulence in mice
Art der Präsentation: Poster
III
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1
1.1
Das Influenza-A-Virus
1
1.1.1 Geschichte der Influenza
1
1.1.2 Klassifizierung
2
1.1.3 Partikelstruktur und Genomaufbau
2
1.1.4 Replikationszyklus
5
1.2
1.3
1.4
1.1.5 Wirtsspektrum
10
1.1.6 Pathogenes Potenzial
11
Virulenzfaktoren des Influenza-A-Virus
13
1.2.1 Die Glykoproteine
13
1.2.2 Die Polymeraseproteine
17
hvPR8, ein Influenza-A-Virus mit hoher Virulenz in der Maus
19
1.3.1 hvPR8 und lvPR8
19
1.3.2 Die Mx1+/+-Maus als Modellorganismus
20
1.3.3 Außergewöhnliche Virulenz von hvPR8 in Mx1+/+-Mäusen
20
1.3.4 Mx1-Sensitivität und IFN-Induktion durch hvPR8
21
1.3.5 Replikationseigenschaften von hvPR8
21
1.3.6 Virulenzfaktoren von hvPR8
22
1.3.7 Schlussfolgerungen
24
Zielsetzung dieser Arbeit
25
IV
Inhaltsverzeichnis
2
Material und Methoden
26
2.1
Material
26
2.1.1 Antikörper
26
2.1.2 Mäuse
27
2.1.3 Oligonukleotide
28
2.1.4 Plasmide
30
2.1.5 Viren
32
2.1.6 Zelllinien
33
2.1.7 Feste-Phase-Enzym-Test zur Bestimmung der Rezeptoraffinität
des HA-Proteins
2.2
34
2.1.8 Fusion von Viren mit Erythrozyten
35
2.1.9 Immunfluoreszenz mit MDCK-/MDCK-H-Zellen
35
2.1.10 Immunfluoreszenz mit Lungen-Paraffinschnitten
35
2.1.11 Luziferase-Reportergen-Fusionstest
35
2.1.12 Herstellung von Zelllysaten und Western Blot-Analyse
36
2.1.13 Mutagenese-PCR und Klonierung
38
2.1.14 Narkose der Mäuse
39
2.1.15 Plaque Assay mit Avicel
39
2.1.16 RNA-Isolation und Reverse Transkription
39
2.1.17 Virus-Rescue
40
2.1.18 Zellkultur
41
Methoden
42
2.2.1 Zellkulturexperimente
42
2.2.1.1 Kultivierung der Zellen
42
2.2.1.2 Herstellung eines anti-PR8-Virus Serums
42
2.2.1.3 Immunfluoreszenz zum Virusnachweis in infizierten
MDCK-H- Zellen
42
2.2.1.4 Immunfluoreszenz zum Virusnachweis in infizierten,
NH4Cl behandelten MDCK-Zellen
2.2.1.5 Immunfluoreszenz zur Bestimmung des Virustiters
43
43
V
Inhaltsverzeichnis
2.2.1.6 Luziferase-Reportergen-Fusionstest (nach Su et al. (2008) (140))
43
2.2.1.7 Untersuchung der Abhängigkeit der Virusreplikation
von Trypsin im Plaque Assay mit Avicel
44
2.2.1.8 Untersuchung der Fusionsaktivität von Viren mit Erythrozyten
45
2.2.1.9 Virus-Rescue: Transiente Transfektion
45
2.2.1.10 Virus-Rescue: Plaque Assay (Plaque-Reinigung)
46
2.2.2 Proteinchemische Methoden
2.2.2.1 Gewinnung von Lysaten für den Western Blot
47
47
2.2.2.2 Diskontinuierliche Proteinelektrophorese im SDSPolyacrylamidgel
2.2.2.3 Western Blot
47
47
2.2.2.4 Feste-Phase-Enzym-Test zur Bestimmung der Rezeptoraffinität
des HA-Proteins (nach Gambaryan et al. (1992) (32))
2.2.3 Molekularbiologische Methoden
2.2.3.1 HA-Mutagenese: Mutagenese-PCR und Verdau mit LguI
48
51
51
2.2.3.2 HA-Mutagenese: Ligation und Transformation kompetenter
2.2.3.3
Bakterienzellen
53
Präparation von Plasmid-DNA
53
2.2.4 Tierexperimentelle Methoden
54
2.2.4.1 Virus-Rescue: Virusanzucht in bebrüteteten Hühnereiern
54
2.2.4.2 Infektion von Mäusen
54
2.2.4.3 Ermittlung der LD50 von Viren in Mäusen
54
2.2.4.4 Lungenentnahme für die Virustitration
55
2.2.4.5 Gewinnung von Lungenhomogenaten für die Virustitration
55
2.2.4.6
55
Lungenentnahme für die Anfertigung von Paraffinschnitten
2.2.5 Färbung von Lungen-Paraffinschnitten
56
2.2.5.1 Anfertigung von Lungen-Paraffinschnitten
56
2.2.5.2 Doppelfärbung von Lungen-Paraffinschnitten
56
VI
Inhaltsverzeichnis
3
Ergebnisse
58
3.1
Bedeutung der Polymeraseproteine für die Virulenz von hvPR8
59
3.1.1 Beitrag der Polymeraseuntereinheiten zur Virulenz von hvPR8
59
3.1.1.1 Polymeraseaktivität
59
3.1.1.2 LD50 in Mx1+/+-Mäusen
60
-/-
3.1.1.3 Virusreplikation in Mx1 -Mäusen
61
3.1.2 Identifizierung der für die Virulenz von hvPR8 entscheidenden
Aminosäuren in PB2 und PA
62
3.1.2.1 Polymeraseaktivität
62
3.1.2.2 LD50 in Mx1+/+-Mäusen
63
3.1.2.3 Virusreplikation in Mx1-/--Mäusen
64
+/+
3.1.3 Herstellung neuer Viren mit erhöhter Virulenz in Mx1
3.1.3.1
-Mäusen
Rolle der Aminosäureaustausche in PB1 und in PA
des Virus PR-ma2
3.2
65
67
Bedeutung des Hämagglutinins für die Virulenz von hvPR8
70
3.2.1 Einfluss der Glykoproteine auf die Virusreplikation in der Maus
70
3.2.2 Einfluss der Glykoproteine auf das Eindringen des Virus in die Zelle
71
3.2.3 Funktionelle Analyse des Hämagglutinins
74
3.2.3.1
Rezeptorbindung
74
3.2.3.2
Fusionsaktivität
79
3.2.3.3 Spaltbarkeit in Abhängigkeit von Trypsin
3.2.4 Genetische Analyse des Hämagglutinins
3.2.4.1
Einfluss von Aminosäureaustauschen in HA auf die Virulenz
85
88
88
3.2.4.2 Einfluss von Aminosäureaustauschen in HA auf dessen
Rezeptorbindung und Fusionsaktivität
96
VII
Inhaltsverzeichnis
4
Diskussion
100
4.1
Bedeutung der Polymeraseproteine für die Virulenz von hvPR8
101
4.1.1 PB2 und PA sind für eine Erhöhung der Polymeraseaktivität und für die
Virulenz von hvPR8 entscheidend
101
4.1.2 Weitere Viruspassagierungen in der Maus bringen hochvirulente Viren
mit unterschiedlichen Mutationen in den Polymeraseproteinen hervor
4.2
Bedeutung des Hämagglutinins für die Virulenz von hvPR8
103
105
4.2.1 Die Glykoproteine von hvPR8 ermöglichen ein effizientes Eindringen
des Virus in L929- und MDCK-H-Zellen
105
4.2.2 rlvPR8 und rhvPR8 unterscheiden sich nicht in der Spaltbarkeit ihres
HA-Proteins
105
4.2.3 Rolle der Rezeptorbindung des HA-Proteins für die Virulenz von hvPR8 106
4.2.4 Rolle der Fusionsaktivität des HA-Proteins für die Virulenz von hvPR8
110
4.2.5 Identifizierung Virulenz beeinflussender Aminosäuren im HA-Protein
von hvPR8
112
5
Zusammenfassung
117
6
Abkürzungsverzeichnis
119
7
Literaturverzeichnis
124
8
Danksagung
135
VIII
Einleitung
1
Einleitung
Im März und frühen April diesen Jahres infizierten sich Menschen in Mexiko und den USA
mit einem neuen, aus dem Schwein stammenden Influenza-A-Virus des H1N1-Subtyps. Das
Virus breitete sich in den folgenden Monaten rasch weltweit aus. Bis heute sind bei Menschen
in über 208 Ländern Infektionen mit den sogenannten „Swine-origin H1N1 influenza
viruses“, S-OIVs, bekannt geworden (Stand 11. Dezember 2009 nach WHO, http://www.
who.int/csr/don/2009_12_11a/en/index.html). Bei einem Vergleich mit saisonalen Influenzavirus-Epidemien wurde im Zusammenhang mit den S-OIV-Erkrankungen bisher allerdings
keine erhöhte Sterberate festgestellt (101). Warum versetzt der Virusausbruch die menschliche Bevölkerung trotzdem in Alarmbereitschaft?
Dies wird anhand der in Kapitel 1.1 geschilderten Eigenschaften von Influenza-A-Viren
verständlich, welche ihnen das Potential verleihen, sich zu sehr gefährlichen Pathogenen zu
entwickeln. In diesem Zusammenhang ist von Interesse, welche viralen Proteine und molekularen Mechanismen für die Virulenz eines Influenza-A-Virus entscheidend sind. In Kapitel
1.2 werden die viralen Glyko- und Polymeraseproteine als wichtige Virulenzfaktoren von
Influenza-A-Viren vorgestellt. Es wurde gezeigt, dass diese Proteine für die außergewöhnliche Virulenz in der Maus des in dieser Arbeit untersuchten Influenza-A-Virus entscheidend
sind (40). Kapitel 1.3 beschreibt die bisherigen, mit dem Virus durchgeführten Studien, an
welche diese Arbeit anknüpfte.
1.1
Das Influenza-A-Virus
1.1.1
Geschichte der Influenza
Influenza-A-Viren sind die Verursacher der Vogelgrippe und der saisonalen Grippeepidemien
sowie sporadisch auftretenden, unvorhersehbaren Grippepandemien in der menschlichen Bevölkerung. Erste Berichte über eine Erkrankung, die der Grippe oder „Influenza“ mit den
klassischen Symptomen wie trockenem Husten, hohem Fieber, Schüttelfrost, Gliederschmerzen ähnelte, stammen von Hippokrates aus dem Jahr 412 vor Christus. Die Bezeichnung
„Influenza“ kommt aus dem Italienischen und steht für „Influenza di freddo“, „Kälteeinfluss“,
was auf das gehäufte Auftreten von Influenzainfektionen in den kalten Wintermonaten
anspielt (64). 1931 fand Richard Shope heraus, dass die Influenza durch ein filtrierbares
1
Einleitung
Agens ausgelöst wird und lieferte damit den ersten Hinweis, dass es sich bei dem Erreger der
Krankheit um ein Virus handelt (126). 1933 gelang es erstmals Christopher Andrewes,
Wilson Smith und Patrick Laidlaw, ein Influenza-A-Virus aus dem Menschen zu isolieren
(129). Werner Schäfer konnte schließlich 1955 beweisen, dass es sich bei dem Erreger der
Vogelgrippe ebenfalls um ein Influenzavirus handelt (122).
1.1.2
Klassifizierung
Influenza-A-Viren bilden neben Influenza-B-, Influenza-C-, Thogoto- und Isaviren ein Genus
der Familie der Orthomyxoviridae (griechisch: „orthos“ = richtig, „myxo“ = Schleim). Die
Klassifizierung der Influenzaviren in Typ A, B oder C basiert auf antigenen Unterschieden im
Nukleoprotein (NP) und Matrixprotein (M1) der Viren, sowie auf unterschiedlichen molekularen Eigenschaften (54). Influenza-A-Viren werden weiterhin hinsichtlich der Antigenität
ihrer Oberflächenproteine Hämagglutinin (HA oder H) und Neuraminidase (NA oder N) in
Subtypen unterteilt. Derzeit sind 16 H-Subtypen und 9 N-Subtypen bekannt (101). Die
Bezeichnung von Influenza-A-Viren erfolgt nach dem Schema „A (für den InfluenzavirusTyp)/ Wirt/ geographischer Ursprung/ Nummer des Isolates/ Jahr der Isolierung (H- und NSubtyp)“ (67).
1.1.3
Partikelstruktur und Genomaufbau
Die Viruspartikel von Influenza-A-Viren zeigen eine pleomorphe Gestalt (Abbildung (Abb.)
1b). Es wurden sowohl sphärische Partikel mit einem Durchmesser von 100 nm als auch
filamentöse, über 300 nm lange Partikel nachgewiesen (67). Der Aufbau eines Influenza-AVirus-Partikels ist in Abb. 1a schematisch dargestellt: Die Viruspartikel besitzen eine von der
Wirtsmembran abstammende Hüllmembran, in welche die viruskodierten Glykoproteine HA
und NA eingelagert sind. Sie liegen im Verhältnis vier zu eins vor. Die Glykoproteine werden
im Elektronenmikroskop als sogenannte „Spikes“ sichtbar, die ca. 10-14 nm aus der Membran
der Viruspartikel herausragen (Abb.1b). Das HA-Protein bildet Trimere, während das NAProtein in der Form von Tetrameren auftritt. Neben HA und NA existiert noch ein drittes
Membranprotein, das Matrixprotein 2 (M2), das als tetramerer Komplex die Aufgabe eines
Protonenkanals übernimmt. Das Matrixprotein 1 (M1) ist mit der Innenseite der Hüllmembran
des Viruspartikels assoziiert und kleidet diese aus. Darüber hinaus interagiert es mit den
viralen Ribonukleoproteinkomplexen (vRNPs), die sich im Inneren des Viruspartikels befin-
2
Einleitung
den. Die vRNPs setzen sich aus acht mit Proteinen assoziierten RNA-Segmenten zusammen,
die ca. 13600 Basen umfassen. Die enthaltene RNA liegt einzelsträngig vor und besitzt
negative Polarität. Jedes RNA-Segment ist mit zahlreichen Kopien des NP-Proteins über seine
gesamte Länge komplexiert. Darüberhinaus sind Polymerasekomplexe, bestehend aus den
Untereinheiten PB1 („polymerase basic protein 1“), PB2 („polymerase basic protein 2“) und
PA („polymerase acidic protein“), mit den teilweise komplementären 3’- und 5’-Enden der
RNA-Segmente assoziiert. An diesen Enden befinden sich die nichtkodierenden Regionen
(„noncoding regions“, NCRs), welche die offenen Leserahmen („open reading frames“,
ORFs), die für die viralen Proteine kodieren, umrahmen und die regulatorische Sequenzen
wie etwa das Verpackungssignal oder die Promotorregion enthalten. Aufgrund der sich über
kurze Bereiche erstreckenden Komplementarität der NCRs kommt es zur Ausbildung einer
pfannenstielähnlichen Struktur der vRNPs (Abb.1c), die als „Panhandle“ bezeichnet wird
(66). Neben dem M1-Protein und den vRNPs befindet sich außerdem das nukleäre
Exportprotein („nuclear export protein“, NEP, früher „nonstructural protein 2“, NS2, genannt)
im Inneren der Viruspartikel. Aus Tabelle (Tab.) 1 wird ersichtlich, für welche der insgesamt
12 viralen Proteine die 8 RNA-Segmente kodieren. Die bisher nicht behandelten Strukturproteine PB1-F2 und NS1 („nonstructural protein 1“) werden im Zusammenhang mit dem
Replikationszykus des Influenza-A-Virus besprochen. Kürzlich wurde außerdem ein weiteres
Protein, N40, identifiziert, das von der PB1-mRNA synthetisiert wird, dessen Funktion jedoch
noch nicht gut untersucht ist (157).
Segment
Protein
Länge
[Nukleotide]
1
PB2
2341
2
PB1, PB1-F2, N40
2341
3
PA
2233
4
HA
1778
5
NP
1565
6
NA
1413
7
M1, M2
1027
8
NS1, NEP
890
Tab. 1: RNA-Segmente von Influenza-A-Viren
und die von ihnen kodierten Proteine. (Verändert nach S. Modrow, D. Falke, U. Truyen, Molekulare Virologie, 2003).
3
Einleitung
a)
NEP
M1
M2
NP
PB2
PA
NA
PB1
HA
b)
c)
Influenzavirus-RNP
ss(-)RNA
Polymeraseuntereinheiten
NP
Abb. 1: Aufbau des Viruspartikels von Influenza-A-Viren. a) Schematische Darstellung (verändert nach
Doktorarbeit Daniel Grimm), „ss(-)RNA“ = einzelsträngige RNA negativer Polarität. b) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Influenza-A-Virus-Partikeln (L. Stannard, Department of Medical Microbiology, University of Cape Town). c) Detaillierte Darstellung des Influenza-A-Virus-Ribonukleoproteinkomplexes (RNP)
(verändert nach P. Digard, Department of Pathology, University of Cambridge), „ss(-)RNA“ siehe a).
4
Einleitung
1.1.4
Replikationszyklus
Eindringen des Virus in die Zelle:
Der Replikationszyklus von Influenza-A-Viren beginnt mit der Adsorption ihrer HA-Oberflächenproteine an endständige Sialinsäuren auf der Oberfläche von Wirtszellen (123). Falls
das Andocken nicht erfolgreich ist und keine Endozytose auslöst, können die viralen NAProteine durch Abspaltung der endständigen Sialinsäuren von der Zelloberfläche die
Viruspartikel wieder von der Zelle lösen und einen erneuten Andockversuch ermöglichen
(104). Ist dieser erfolgreich, gelangen die Partikel durch rezeptorvermittelte Endozytose in die
Endosomen der Zelle. Aufgrund der durch zelluläre Protonenpumpen vermittelten Ansäuerung der Endosomen kommt es zur Konformationsänderung des HA-Proteins. Dabei wird
eine fusogene Region am N-Terminus der HA2-Einheit des Proteins, das sogenannte Fusionspeptid, freigelegt, das daraufhin die Fusion der Virusmembran mit der Endosomenmembran
einleitet (21). Gleichzeitig findet über den Protonenkanal M2 eine Ansäuerung im Inneren der
Viruspartikel statt, die zur Aufhebung der Interaktion zwischen vRNPs und M1 führt (111).
Die losgelösten vRNPs gelangen daraufhin durch die Fusionsporen ins Zytoplasma der Zelle
(„Uncoating“).
Transport des viralen Genoms in den Kern und primäre Transkription:
Anschließend erfolgt durch aktiven Import das Einschleusen der vRNPs in den Kern.
Wenngleich alle in den vRNPs enthaltenen Proteine Kernlokalisationssignale („nuclear
localization signals“, NLSs) aufweisen, so wurde festgestellt, dass eines der NLSs von NP für
den Import entscheidend ist (19). Im Kern kommt es zur Primärtranskription der vRNPs.
Hierbei bedient sich der Polymerasekomplex des sogenannten Cap-Stehlens („capsnatching“), bei dem er 5’-Cap-Strukturen von zellulären prä-mRNAs etwa 15 Nukleotide
strangabwärts der Caps abspaltet und als Primer für die Transkription der viralen RNA
verwendet (70). Durch das Cap-Stehlen kann das Virus zusätzlich einen sogenannten „Virushost-shutoff“ bewirken, d. h. die zellspezifische Transkription und Translation werden
beeinträchtigt bzw. abgeschaltet, und es findet eine „Umprogrammierung“ der Zelle auf die
Produktion viraler Proteine statt. Während für das Binden des Caps die PB2-Untereinheit
zuständig ist, kann die Abspaltung des Caps mit Hilfe der kürzlich identifizierten Endonukleaseaktivität der PA-Untereinheit bewerkstelligt werden (25, 159). Die PB1-Untereinheit
besitzt die Polymerase-Aktivität, d. h. sie sorgt für die Kettenverlängerung (9). Die Trans-
5
Einleitung
kription stoppt ca. 15-20 Nukleotide vor dem 5’-Ende der Genomsegmente. Der Grund hierfür könnte sein, dass die einzelsträngigen RNA-Sequenzen in dieser Region in die pfannenstielähnlichen Doppelstrangbereiche übergehen und dies eine physikalische Barriere für den
Polymerasekomplex bildet, so dass sich die Polymerisation verlangsamt. Aufgrund einer konservierten, uridinreichen Sequenzfolge am 5’-Ende der Genomsegmente wird die Transkription mit der Polyadenylierung der viralen mRNAs abgeschlossen (112). Durch Spleißen eines
Teils der Transkripte von Segment 7 und 8 entstehen neben den mRNAs, die für M1 bzw.
NS1 kodieren, verkürzte mRNAs, von welchen M2 bzw. NEP translatiert werden (72, 73).
Es wurde beobachtet, dass die mRNAs für NP und NS1 in der frühen Phase der Infektion
vermehrt vorkommen, was in Einklang damit steht, dass diese Proteine zu frühen Zeitpunkten
für das Virus von Nutzen sind. Die Aufgabe des NP-Proteins wird im Zusammenhang mit der
cRNA- und vRNA-Synthese erklärt.
Das NS1-Protein ist multifunktionell (43): Es beeinträchtigt u. a. die Prozessierung und den
Transport zellulärer mRNAs und begünstigt die Translation viraler mRNAs. Diese Vorgänge
haben den bereits erwähnten „Virus-host-shutoff“ zur Folge. Darüberhinaus spielt NS1 eine
entscheidende Rolle als Interferon (IFN)-Antagonist (36). Es konnte in Mausexperimenten
gezeigt werden, dass Typ I-Interferone, Mitglieder des sofort nach Infektion induzierten
angeborenen Immunsystems, bei der Abwehr von Influenza-A-Viren eine entscheidende
Rolle spielen (45). Dem NS1-Protein kommt demnach eine wichtige Funktion als IFNAntagonist zu. Die IFN-antagonistische Wirkung von NS1 ist sehr vielfältig. Einige Beispiele
sind im Folgenden aufgeführt. NS1 wirkt dem Virus-Sensor RIG-I („retinoic acid-inducible
gene I“) entgegen (110), indem es vermutlich einen Komplex mit ihm bildet. Dadurch wird
die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren für die IFN-Synthese und folglich auch die
Induktion IFN stimulierter Genprodukte verhindert (35). NS1 hemmt außerdem die Aktivierung wichtiger Spieler der angeborenen Immunantwort, wie der Proteinkinase R (PKR)
(49, 91) und der 2’-5’-Oligoadenylat-Synthetase (OAS), deren Wirken die RNase L stimuliert
(90).
Export der viralen mRNAs und Translation im Zytoplasma:
Der Export der viralen mRNAs wird durch ein Zusammenwirken von zellulären und viralen
Komponenten, wie dem NS1-Protein, vermittelt. Während die mRNAs für die nichtmembranassoziierten Proteine PB1, PB2, PA, NP, NS1, NEP und M1 an freien Ribosomen translatiert
6
Einleitung
werden, findet die Translation der membranassoziierten Proteine HA, NA und M2 an der
Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) statt. HA, NA und M2 werden daraufhin
vom ER über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert, wobei sie sich zu trimeren bzw. tetrameren Komplexen zusammenfinden und Glykosylierungen (HA, NA), Acyl(HA) sowie Palmitinsäure- und Phosphat-Modifikationen (M2) durchgeführt werden (67)
(92). HA-Proteine, die eine multibasische Spaltstelle besitzen (siehe 1.2.1), werden außerdem
durch ubiquitär vorkommende zelluläre Proteasen wie Furin in die Untereinheiten HA1 und
HA2 gespalten (139). Dadurch werden die HA-Proteine fusionskompetent. Die vorzeitige
Induktion ihrer Fusionsaktivität wird durch das Protonenkanal bildende M2 verhindert,
welches dafür sorgt, dass eine Senkung des pH-Werts in den Golgi-Vesikeln ausbleibt (16).
Gegebenenfalls kommt es neben der Translation der erwähnten viralen Proteine noch zur
Synthese des Nichtstrukturproteins PB1-F2. Dieses wird durch einen alternativen offenen
Leserahmen des PB1-Segments der meisten aviären und humanen Influenza-A-Viren kodiert.
Es wurde beobachtet, dass PB1-F2 in den Mitochondrien infizierter Zellen lokalisiert ist und
Zellen sensibilisiert, in Apoptose zu gehen, indem es mit Komponenten des PTPCs
(„permeability transition pore complex“) interagiert (160). Es spielt eine Rolle für die Pathogenität von Influenza-A-Viren, in dem es eine verstärkte Immunpathologie in der Lunge auslösen und die Anfälligkeit und den Schweregrad sekundärer bakterieller Infektionen erhöhen
kann (17, 87).
Virale Replikation im Zellkern:
Nach ihrer Synthese im Zytoplasma werden die Proteine des Polymerasekomplexes sowie
NP, NS1, NEP und M1 in den Zellkern transportiert, wobei ihre NLSs die Interaktion mit der
zellulären Importmaschinerie vermitteln. Es wird vermutet, dass PB1 und PA als Subkomplex
über einen nichtklassischen Weg durch Importin RanBP5 („Ran binding protein 5“) in den
Kern transportiert werden (24) und dass PB2 über einen klassischen Weg durch Importin-α5
in den Kern gelangt (142). Dort vereinigt sich PB2 mit dem PB1-PA-Dimer zum funktionellen Polymerasekomplex (55).
Zur Replikation der viralen RNA (vRNA) wird diese in einem ersten Schritt als Matrize für
die „complementary RNA“ (cRNA)-Synthese verwendet. In einem zweiten Schritt dient die
positivsträngige cRNA der viralen Polymerase als Matrize für die Synthese negativsträngiger
genomischer vRNA, die mit PB1-, PB2-, PA- und NP-Proteinen zu vRNPs assoziiert. Es
7
Einleitung
wurde festgestellt, dass die cRNA- und die vRNA-Synthese primerunabhängig sind, und dass
in beiden Fällen unter Auflösung der pfannenstielähnlichen Strukturen an den Genomenden
vollständige RNA-Stränge gebildet werden (67).
Wie die virale Polymerase von der Transkription zur Replikation übergeht, ist weitgehend
ungeklärt. Es wurde beobachtet, dass die cRNA-Synthese von einer de novo Proteinsynthese
abhängig ist, und dass freies lösliches NP vorhanden sein muss (6, 52). Daraufhin wurde
spekuliert, dass die Verfügbarkeit von neu gebildetem löslichem NP das Umschalten von
Transkription auf Replikation kontrolliert. Einem anderen Modell zufolge synthetisiert die in
den Zellkern gelangte virale Polymerase sowohl mRNA als auch cRNA. Allerdings wird die
cRNA in der frühen Phase der Infektion abgebaut, solange, bis ausreichend neu synthetisierte
NP-Proteine sowie Polymerasekomplexe vorhanden sind, welche die cRNA komplexieren
und damit vor dem Abbau schützen (150). Es wird außerdem vermutet, dass zellulären Faktoren eine wichtige Rolle bei der Regulation der viralen Replikation zukommt (93, 94, 13).
Export der vRNPs aus dem Kern und Zusammensetzung und Sprossung neuer Viruspartikel:
Während NP und NS1, wie bereits erwähnt, zu einem frühen Zeitpunkt gebildet werden,
findet die Synthese von HA, NA und M1 spät statt, was darauf hindeutet, dass diese Proteine
erst dann zum Einsatz kommen. So vermutet man, dass M1 das Ende der viralen mRNASynthese induziert (109, 153). Außerdem scheint es mit den vRNPs zu interagieren und
zusammen mit NP und NEP am Export der vRNPs aus dem Zellkern ins Zytoplasma beteiligt
zu sein (20).
Nach dem Kernexport werden die vRNPs an die Plasmamembran transportiert, wobei Stellen
mit großen Mengen an eingelagerten HA-, NA- und M2- Proteinen angesteuert werden.
Hierbei interagiert vermutlich das vRNP assoziierte M1 mit den zytoplasmatischen Anteilen
der Oberflächenproteine. Beim sogenannten „Budding“, für das neueren Untersuchungen
zufolge angenommen wird, dass HA und NA (14), und nicht, wie früher vermutet, M1
essentiell sind (39), stülpt sich die Membran aus und umschließt die vRNPs. Durch Knospung
der membranumgebenen vRNPs werden neue Viruspartikel von der Zelle abgegeben (67)
(92). Die Freisetzung der Partikel wird durch die NA-Proteine gewährleistet, indem diese
endständige Sialinsäuren von den zellulären und viralen Oberflächenproteinen abspalten und
somit verhindern, dass die Viruspartikel miteinander oder mit zellulären Membranbestand-
8
Einleitung
teilen verkleben (105). Der beschriebene Replikationszyklus ist in Abb. 2 schematisch dargestellt.
NEP,
M1
NEP, PB1-F2, N40
Abb. 2: Replikationszyklus von Influenza-A-Viren. (Verändert nach S. Modrow, D. Falke, U. Truyen, Molekulare Virologie, 2003).
9
Einleitung
1.1.5
Wirtsspektrum
Influenza-A-Viren befallen Vögel, Menschen und andere Säugetiere wie Schweine, Pferde
und Robben. Man nimmt an, dass wilde Wasservögel das natürliche Reservoir der Viren und
die Quelle aller Influenza-A-Viren anderer Tierspezies darstellen (154). Unter den Viren der
Wasservögel sind alle bisher identifizierten HA- und NA-Subtypen vertreten. Die Viren verursachen in den Wasservögeln normalerweise keine Krankheit, was darauf hindeutet, dass sie
eine optimale Anpassung an diesen Wirt erreicht haben. Im Folgenden werden die InfluenzaA-Viren, die Vögel und Menschen befallen („aviäre“ bzw. „humane“ Viren), genauer behandelt.
Aviäre Influenza-A-Viren werden in niedrig- und hochpathogene Stämme unterteilt. Niedrigpathogene Virusstämme verursachen bei Vögeln lokale, gastrointestinale und respiratorische
Infektionen, während hochpathogene Stämme, die bisher alle den Subtypen H5 und H7
zugeordnet wurden, eine systemische Infektion bei Vögeln auslösen können (54). Die hieraus
resultierende Erkrankung wird als Vogelgrippe oder Geflügelpest bezeichnet und wurde vor
allem bei Hühnern und Truthähnen beobachtet. Während niedrigpathogene Viren durch mit
Fäkalien kontaminiertes Wasser oral von den Tieren aufgenommen werden, wurde im Fall der
hochpathogenen Viren darüber hinaus eine schnelle Übertragung von virushaltigem Material
innerhalb dicht gehaltener Vogelbestände über die nasale und orale Route beobachtet.
Humane Influenza-A-Viren werden durch virushaltige Aerosole übertragen und verursachen
beim Menschen die klassische Virusgrippe, die eine mit hohem Fieber verbundene Erkrankung der Atemwege darstellt und eine lebensbedrohliche Lungenentzündung zur Folge
haben kann. Bisher wurde bei den Subtypen H1N1, H2N2, H3N2 und H1N2 eine effiziente
Mensch zu Mensch Übertragung beobachtet. Gegenwärtig zirkulieren in der Bevölkerung
Virusstämme des H1N1- und H3N2-Subtyps (101).
Ob Influenza-A-Viren für den Menschen oder Vogel infektiös sind, hängt von ihrer Rezeptorspezifität ab, die zu den wichtigsten Faktoren zählt, die den Wirtstropismus bestimmen.
Humane Viren binden mit ihren HA-Proteinen bevorzugt an Rezeptoren, die Sialyloligosaccharide mit endständigen, an Galaktose in α2,6-Form gebundene N-Acetyl-Neuraminsäuren (2,6-SA) enthalten (118). N-Acetyl-Neuraminsäure wird im Folgenden mit dem
gebräuchlichen Oberbegriff Sialinsäure („sialic acid“, SA), der N- und O-Derivate der Neuraminsäure umfasst, abgekürzt. 2,6-SA-Rezeptoren finden sich u. a. auf Epithelzellen der
10
Einleitung
menschlichen Luftröhre und ermöglichen somit dort eine effiziente Infektion. Dahingegen
vermitteln die HA-Proteine der aviären Viren bevorzugt die Adsorption an endständige, in der
α2,3-Form mit Galaktose verknüpften N-Acetyl-Neuraminsäuren (2,3-SA), die in Luftröhre
und Darm der Vögel vorhanden sind und dort folglich eine Infektion möglich machen (54).
1.1.6
Pathogenes Potenzial
Die Pathogenität von Viren wird u. a. dadurch bestimmt, wie wirkungsvoll sie der Erkennung
durch das Immunsystem des Wirts entkommen können. Die Plastiziät ihres Genoms kommt
Influenza-A-Viren hierbei zu Gute: Zum einen zeigen sie eine hohe Mutationsrate der Oberflächenproteine („antigenic drift“), wodurch kontinuierlich leicht veränderte Viren entstehen,
die der Erkennung durch neutralisierende, hauptsächlich gegen HA gerichtete Antikörper
entgehen und für das Auftreten saisonaler Grippeepidemien verantwortlich sind. Zum anderen
können die Viren im Fall einer Doppelinfektion mit anderen Influenza-A-Viren Gensegmente
mit diesen austauschen, was zur Bildung von sogenannten Reassortanten führt („antigenic
shift“). Die Entstehung solcher drastisch veränderter Viren bringt die Gefahr einer Grippepandemie mit sich. So nimmt man an, dass humane Viren, die durch Reassortantenbildung ein
Gensegment von aviären Influenza-A-Viren erhalten, das für einen neuen, dem menschlichen
Immunsystem unbekannten HA-Subtyp kodiert, auf wenig oder keine Herdimmunität in der
Bevölkerung stoßen und sich zu Viren entwickeln können, die von Mensch zu Mensch
übertragbar sind und eine Pandemie auslösen (106).
Man schätzt, dass in den letzten Jahrhunderten alle 8 bis 41 Jahre Pandemien in der menschlichen Bevölkerung auftraten (144). Berühmte Beispiele für Pandemien im 20. Jahrhundert
sind die „Asiatische Grippe“ von 1957 und die „Hongkong-Grippe“ von 1968, auf die der
oben beschriebene Mechanismus der Entstehung eines Pandemievirus zutrifft: Beide Pandemien wurden durch Reassortanten verursacht, die aus einem aviären und einem humanen
Virus hervorgegangen waren, und das aviäre H2- bzw. H3-HA in die menschliche Bevölkerung einführten. Die verheerendste Pandemie des 20. Jahrhunderts war die „Spanische
Grippe“ von 1918, die weltweit ca. 50 Millionen Menschen das Leben kostete (60). Man geht
davon aus, dass es sich bei dem Erreger dieser Pandemie um ein aviäres H1N1-Influenza-AVirus handelte, welches sich an den Mensch adaptiert hatte (145). In diesem Fall wurde das
menschliche Immunsystem somit nicht aufgrund einer Reassortantenbildung einem neuarti-
11
Einleitung
gen HA ausgesetzt, sondern durch die direkte Übertragung eines aviären Virus auf den
Menschen.
Zu einem direkten Übergang von aviären Viren auf den Menschen kam es auch innerhalb der
letzten 10 bis 15 Jahren bei Infektionen mit den Subtypen H5N1, H7N7 und H9N2 (54). Bis
jetzt beschränkte sich hierbei allerdings die Mensch zu Mensch Übertragung auf wenige Fälle.
Es besteht die Sorge, dass Viren dieser Subtypen die Fähigkeit erlangen, effizient von Mensch
zu Mensch übertragen zu werden und eine neue Pandemie in der für H5-, H7- bzw. H9naiven Bevölkerung auslösen.
Momentan stehen allerdings die zirkulierenden, aus dem Schwein stammenden H1N1-Viren,
die S-OIVs, im Mittelpunkt der Medien. Man nimmt an, dass sie durch „Reassortment“ im
Schwein von nordamerikanischen H3N2- und H1N2-Schweineviren, die Tripel-Reassortanten
aus Viren von Schwein, Vogel und Mensch darstellen, mit einem eurasischen vogelvirusähnlichen Schweinevirus entstanden sind. Es handelt sich also um sogenannte QuadrupelReassortanten (101). Man geht davon aus, dass Schweine für humane und aviäre Viren
zugänglich sind, weil sie sowohl 2,3- als auch 2,6-SA-Rezeptoren auf ihren Epithelzellen der
Luftröhre tragen. Schweine werden auch als „Mixing vessel“ bezeichnet, in denen InfluenzaA-Viren, die aus unterschiedlichen Spezies wie Vogel und Mensch stammen, ihre Gensegmente „mischen“ können (100). Untersuchungen ergaben, dass die S-OIVs keine der bisher
bekannten Kennzeichen aufweisen, die mit einer hohen Pathogenität in Verbindung gebracht
werden (101). Doch es wird befürchet, dass sie sich durch die bereits beschriebenen Mechanismen des „antigenic drift“ oder „antigenic shift“ verändern und Viren mit stärker pathogenen Eigenschaften hervorbringen. In Kombination mit der Fähigkeit der S-OIVs, sehr effizient von einem Menschen auf den anderen überzugehen, könnten diese Viren sehr gefährlich
werden.
Wie schon im letzten Abschnitt erwähnt wurde, gibt es einige Kennzeichen, die auf eine hohe
Pathogenität von Influenza-A-Viren hinweisen. Zu solchen Kennzeichen gehören bestimmte
Eigenschaften von viralen Proteinen. Im folgenden Kapitel werden die viralen Glyko- und
Polymeraseproteine als Beispiel für entscheidende Virulenzfaktoren genauer betrachtet.
12
Einleitung
1.2
Virulenzfaktoren des Influenza-A-Virus
1.2.1
Die Glykoproteine
Hämagglutinin (HA): Das HA-Protein ist ein Typ I-Membranprotein und gilt als Prototyp
der viralen Fusionsproteine der Klasse I. Es wird als Vorläuferprotein HA0 synthetisiert,
welches zu Homotrimeren assoziiert. Damit das HA-Protein die Fähigkeit erhält, die Fusion
von Membranen einzuleiten, was eine Voraussetzung für das Eindringen der Viruspartikel in
Zellen darstellt, muss jedes Monomer des HA0-Trimers in die Untereinheiten HA1 und HA2
gespalten werden. Diese bleiben nach der Spaltung über Disulfidbrücken verbunden. Das HATrimer besteht aus einem Stamm, der Aminosäuren von HA1 und HA2 umfasst und eine
dreisträngige sogenannte „Coiled-coil“- Struktur bildet, die aus der Membran ragt. Am membrandistalen Ende des Stamms befindet sich eine globuläre Domäne aus anti-parallelen
β-Faltblättern, die ausschließlich Aminosäuren von HA1 beinhaltet. Das Trimer ist über die in
HA2 enthaltenen Transmembrandomänen der Monomere in der Membran verankert. Auf der
Innenseite der Membran schließt sich eine zytoplasmatische Domäne an (127, 155). Abb. 3
zeigt den Aufbau des HA-Proteins, -Monomers und -Trimers.
Die Spaltbarkeit von HA0 stellt eine wichtige Eigenschaft von Influenza-A-Viren dar, welche
die Viruspathogenität beeinflusst. Sie wird durch die Aminosäuresequenz an der Spaltstelle
bestimmt. Niedrigpathogene aviäre und nichtaviäre Viren (mit Ausnahme von equinen H7N7Viren) besitzen eine monobasische Spaltstelle, d. h. sie tragen ein einzelnes Arginin an der
Spaltstelle. Die Spaltung findet auf der Zelloberfläche oder auf freigesetzten Viruspartikeln
statt. Sie wird durch trypsinähnliche Proteasen im respiratorischen und/oder intestinalen Trakt
durchgeführt (7, 65, 101). Das auf diese Organe beschränkte Vorhandensein der Proteasen
grenzt somit die Virusreplikation lokal ein. Dagegen besitzen hochpathogene H5- und H7Viren eine multibasische Spaltstelle mit dem Spaltmotiv R-X-R/K-R (R = Arginin, X =
beliebige Aminosäure, K = Lysin), das intrazellulär von subtilisinähnlichen Proteasen wie
Furin erkannt wird (62, 139). Da diese Proteasen ubiquitär im Organismus exprimiert werden,
können die Viren eine systemische Infektion auslösen. Man nimmt an, dass u. a. die ubiquitäre und intrazellulär effizient stattfindende Spaltung von HA0 für die virulenten Infektionen
von H5- und H7-Viren in Vögeln und H5-Viren in Menschen (1997 in Hongkong) verantwortlich ist (136).
13
Einleitung
Fusionspeptid
a)
RBS
NH2-
HA1
Signalpeptid
HA1
HA2
-COOH
Spaltstelle Transmembranregion und
zytoplasmatische Domäne
c)
HA2
Spaltstelle
b)
Fusionspeptid
Fusionspeptid
Abb. 3: Aufbau des Hämagglutinins. a) Schema des HA0-Vorläuferproteins. b) Ungespaltenes HA0-Monomer mit den Untereinheiten HA1 (blau) und HA2 (rot). Die Rezeptorbindestelle (RBS) befindet sich am
membrandistalen Ende des Proteins (siehe grau unterlegter Bereich). Das Fusionspeptid ist gelb markiert. Teilweise sind Aminosäurepositionen (H3 Nummerierung) in dieser Region angebenen. Verändert nach Steinhauer
et al. (1999). c) Gespaltenes HA-Trimer, bestehend aus HA1 (blau) und HA2 (rot). Das Fusionspeptid ist gelb
markiert. Verändert nach Cross et al. (2009).
Durch die Spaltung von HA0 entsteht ein freies N-terminales Ende der HA2-Untereinheit mit
fusogener Aktivität, das Fusionspeptid. Es umfasst die ersten 23 Aminosäuren am N-Terminus von HA2, zeigt hydrophoben Charakter und ist die am stärksten konservierte Domäne
innerhalb des Proteins (21). Als Folge der Spaltung von HA0 nimmt das Protein eine metastabile Konformation („neutral pH conformation“) ein, bei der das Fusionspeptid in eine Vertiefung mit negativ geladenen Aminosäuren eintaucht. Man nimmt an, dass dies das sogenannte „Priming“-Ereignis für die Fusion darstellt (127). Durch das Absinken des pH-Werts
im Endosom wird ein kritischer pH-Wert erreicht, der, je nach Virus normalerweise zwischen
pH 6,0 und pH 5,0 liegt und eine starke Umfaltung des HA-Proteins in die Fusionskonformation („fusion pH-induced conformation“) auslöst, die dem niedrigsten Energie-
14
Einleitung
zustand entspricht. Dabei wird das Fusionspeptid freigelegt, gelangt in Richtung Zielmembran und dringt in Form einer boomerangähnlichen Struktur in eine der Lipidschichten der
Membran ein (47). Außerdem wird das HA-Protein so gebogen, dass das Fusionspeptid und
der virale Membrananker an demselben Ende des Proteins zu liegen kommen. Es wird
vermutet, dass die Boomerang-Struktur des Fusionspeptids dabei hilft, die Endosomenmembran sehr nah an die Virusmembran zu ziehen, was schließlich die Fusion der Membranen auslöst.
Es ist wenig darüber bekannt, inwieweit die Fusionsaktivität von Influenza-A-Viren ihre
Virulenz beeinflusst. In einer Studie wurde gezeigt, dass eine Mutation innerhalb des Fusionspeptids von HA, die an Position 352 eingeführt wurde, eine Senkung des Fusions-pH-Werts
vermittelte und gleichzeitig die Virusreplikation in vitro reduzierte und die LD50 des betroffenen Virus in Mäusen drastisch erhöhte (58). Es wurde außerdem beobachtet, dass InfluenzaA-Viren bei der Adaptation an Mäuse Aminosäureaustausche erwarben, die ihrem HA-Protein
bei einem veränderten pH-Wert Fusionsaktivität verliehen und ihre Virulenz erhöhten (48, 63,
128). Die Aminosäureaustausche gingen allerdings mit weiteren veränderten Eigenschaften
wie einer neuartigen Rezeptorbindung einher (48, 63), sodass nicht klar ist, ob die Fusionsaktivität die Virulenz vermittelte. Darüberhinaus wurden im Rahmen einer neuen Studie Hinweise dafür gewonnen, dass Mutationen in HA, die den Fusions-pH-Wert verändern, die
Replikation, Pathogenität und Übertragbarkeit von H5N1-Viren beeinflussen (116).
Wie bereits in 1.1.5 erwähnt wurde, ist die Rezeptorspezifität des HA-Proteins eine wichtige
Determinante für den Wirtstropismus von Influenza-A-Viren. Sie beruht auf der Interaktion
von endständigen Sialinsäuren mit den Rezeptorbindestellen („receptor binding sites“, RBSs)
des HA-Trimers. Die RBSs befinden sich an der membrandistalen Spitze der Trimere in den
aus Aminosäuren von HA1 bestehenden globulären Domänen. Die Seiten einer RBS werden
durch die Sekundärstrukturen der „190-Helix“ (Aminosäuren (As) 190-198), des „130-Loops“
(As 135-138) und des „220-Loops“ (As 221-228) gebildet. Die Basis der RBS besteht aus den
konservierten Aminosäuren Tyrosin (an Position (Pos.) 98), Tryptophan (Pos. 153), Histidin
(Pos. 183) und Tyrosin (Pos. 195) (127). Alle Positionsangaben beziehen sich auf die Aminosäurenummerierung im HA des H3-Subtyps (103). Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen innerhalb der 190-Helix, des 130-Loops bzw. 220-Loops darüber entscheiden, ob das
HA-Protein bevorzugt an den aviären 2,3-SA- oder den humanen 2,6-SA-Rezeptor bindet. Für
eine Änderung der Spezifität von 2,3- zu 2,6-SA waren im Fall des Spanische Grippe 1918-
15
Einleitung
Virus die Aminosäureaustausche E190D und G225D ausschlaggebend, während bei humanen
H2- und H3-Viren die Austausche Q226L und G228S entscheidend waren (83, 149). Zu den
Mutationen, die eine Adaptation von H5N1-Isolaten an den humanen Rezeptor bewirkten,
zählten die Austausche S227N (31), L133V plus A138V (4) und N186K plus Q196R (158).
Es wird vermutet, dass das HA-Protein darüber hinaus eine Rolle beim Budding und der
Viruspartikelbildung spielen könnte (14). Eine weitere wichtige Eigenschaft des HA-Proteins
ist seine hohe Variabilität (siehe 1.1.6), durch die Influenza-A-Viren neutralisierenden Antikörpern, die hauptsächlich gegen das HA-Protein gerichtet sind, entkommen können. Da diese
Eigenschaften nicht im Vordergrund dieser Arbeit standen, werden sie nicht weiter diskutiert.
Neuraminidase (NA): Bei dem NA-Protein handelt es sich um ein homotetrameres Typ IIMembranprotein, das enzymatische Aktivität für die Abspaltung endständiger Sialinsäuren
von Glykoproteinen oder –lipiden besitzt. Das Protein besteht aus einem propellerähnlichen,
das enzymatische Zentrum enthaltenden Kopfteil, der über einen Stiel mit der Transmembranund Zytoplasmadomäne verbunden ist (67).
Neben den in 1.1.4 erwähnten Aufgaben von NA, ein erfolgreiches Andocken sowie das
Freisetzen von Viruspartikeln zu ermöglichen, kommt dem NA-Protein noch eine wichtige
Funktion vor der Infektion von Zellen zu: Es desialysiert die sialinsäurereichen Muzinschichten des respiratorischen Epithels. Infolgedessen können die Viruspartikel diese leichter durchdringen und zu ihren Zielzellen gelangen (1, 11, 85).
Damit eine effiziente Infektion von Zellen stattfinden kann, müssen die rezeptorbindende
Aktivität von HA und die rezeptorzerstörende Aktivität von NA ausbalanciert sein. In Einklang hiermit steht, dass bei einem aviären Virus mit einem NA des Subtyps N2 beim Übergang auf den Menschen eine Zunahme der Spaltaktivität für α2,6-SA beobachtet wurde, d. h.
es kam zu einer Anpassung an die Spezifität des HA für den α2,6-SA-Rezeptor im Menschen
(5, 68).
Neben der Substratspezifität scheint auch die Länge des Stiels von NA für die Virusvirulenz
von Bedeutung zu sein. Aviäre Viren mit verkürzten Stielen, darunter hochpathogene H5N1Viren, zeigten virulente Eigenschaften in Geflügel. Die H5N1-Viren, die aus Patienten in
Hongkong isoliert wurden und vermutlich von Geflügel auf den Menschen übertragen worden
16
Einleitung
waren, besitzen ebenfalls einen verkürzten NA-Stiel (41, 84). Im Rahmen einer neuen Studie
wurde durch Einführung einer Deletion in das NA-Protein eines Wildenten-Virusisolates ein
Virus mit erhöhter Virulenz in Hühnern gewonnen (96).
Eine weitere die Pathogenität bestimmende Eigenschaft ist die Säureresistenz der NA-Aktivität, mit der dem Virus das saure Milieu des oberen Intestinaltrakts im Wirt zugänglich wird.
Hierdurch zeichnen sich aviäre Viren aus, die primär im Intestinaltrakt replizieren (141). Es
überraschte somit nicht, als beobachtet wurde, dass hochpathogene H5N1-Viren im menschlichen Darm replizierten, gastrointestinale Symptome auslösten und in großen Mengen ausgeschieden wurden (23).
1.2.2
Die Polymeraseproteine
PB2: Das PB2-Protein ist ein Bestandteil des Polymerasekomplexes und übt als Capbindendes Protein eine wichtige Funktion beim Cap-Stehlen aus (siehe 1.1.4). In mehreren
Studien wurde festgestellt, dass PB2 die Viruspathogenität beeinflusst. Es konnte gezeigt
werden, dass die PB2- und HA-Proteine des Spanische Grippe-Virus für seine Tröpfenübertragung entscheidend sind (147). Außerdem wurden die Positionen 627 und 701 in PB2
als wichtige Determinanten der Virulenz in Säugetieren identifiziert. So wiesen an Säugetiere
adaptierte H7N7- und H5N1-Viren als auch ein an die Maus adaptiertes, humanes H3N2Virus an Position 701 einen Austausch von Asparaginsäure zu Asparagin auf, welcher ihnen
eine erhöhte Virulenz in ihrem neuen Wirt verlieh (10, 28, 76). Es wird angenommen, dass
die Erhöhung der Virulenz zum Teil darauf beruht, dass der Austausch zu Asparagin an Position 701 eine effiziente Bindung von PB2 an zelluläres Importin zur Folge hat und damit der
Transport von PB2 in den Kern begünstigt wird (29). Was Position 627 in PB2 betrifft, wurde
beobachtet, dass diese sowohl für das Wirtsspektrum in Zellkultur als auch für die Pathogenität in Säugetieren entscheidend ist. So zeigte sich zum Beispiel bei der Untersuchung verschiedener H5N1-Viren, dass Virusisolate mit der bei aviären Viren vorkommenden Glutaminsäure an Position 627 (PB2-E627) für Mäuse apathogen waren, während Isolate, die das
für humane Viren typische Lysin an Position 627 (PB2-K627) trugen, einen pathogenen
Charakter zeigten (50). PB2-K627 wurde sowohl in humanen Isolaten hochpathogener H5N1Viren als auch in einem H7N7-Virus nachgewiesen, das aus einem während der Geflügelepidemie 2003 in den Niederlanden verstorbenen Patienten stammte (27, 97, 121). Mehrere
Studien konzentrierten sich auf den Mechanismus, welcher der Virulenz im Zusammenhang
17
Einleitung
mit Position 627 zu Grunde liegt. Es wurde beobachtet, dass Position 627 für die Virusreplikation entscheidend ist. Dabei könnte eine inhibitorische Aktivität in Säugetierzellen eine
effiziente Replikation durch Polymerasen mit PB2-E627 verhindern (88) und/oder die Interaktion von PB2-E627 mit NP, das an Säugetierzellen angepasst ist, beeinträchtigt sein (114).
Weiterhin stellte sich heraus, dass PB2-K627 die virale Replikation bei 33 °C ermöglicht
(81). Dies könnte eine Erklärung dafür sein, dass Viren mit PB2-K627 im Gegensatz zu Viren
mit PB2-E627 im oberen, ca. 33 °C aufweisenden Respirationstrakt von Säugetieren effizient
replizieren können (51). Die Beobachtung, dass ein K627E-Austausch im PB2 humaner Viren
zu einer eingeschränkten Übertragbarkeit in Meerschweinchen führte, deutet weiterhin darauf
hin, dass eine Replikation im oberen Respirationstrakt die Übertragbarkeit der Viren erleichtert (135).
PB1 und PA: Die zwei weiteren Untereinheiten des Polymerasekomplexes sind die Proteine
PB1 und PA. Während PB1 die eigentliche Polymeraseaktivität besitzt, so wurde kürzlich
veröffentlicht, dass PA als Endonuklease wirkt und die Abspaltung der zellulären Cap-Strukturen durchführen kann (siehe 1.1.4). Über den Beitrag der PB1- und PA-Untereinheiten zur
Virulenz von Influenza-A-Viren ist weniger bekannt. Es wird angenommen, dass die PB1Proteine der Pandemieviren der „Spanischen Grippe“ von 1918, der „Asiatischen Grippe“ von
1957 und der „Hongkong-Grippe“ von 1968 zur hohen Virulenz dieser Viren beitrugen (61,
107, 125). In allen Fällen handelt es sich um ein von einem Vogelvirus abstammendes PB1.
Diese aviären PB1-Proteine könnten eine erhöhte Aktivität in Säugetieren besitzen, da in
Minireplikonsystemen gezeigt wurde, dass die Replikation in Säugetierzellen mit einem
aviären PB1 anstelle eines humanen PB1 effizienter ablief (98). Darüberhinaus wurde berichtet, dass ein aviäres PB1 humanen Viren in der Maus Virulenz verlieh (15). Was PA betrifft,
so gibt es Hinweise, dass dieses Protein für die Virulenz von hochpathogenen H5N1-Viren in
Vögeln und Säugetieren wichtig ist (56, 76). In einer neueren Studie wurde außerdem gezeigt,
dass Isoleucin an Position 97 in PA zur Virulenz eines H5N2-Virus in der Maus beitrug (130).
18
Einleitung
1.3
hvPR8, ein Influenza-A-Virus mit hoher Virulenz in der
Maus
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Influenza-A-Virus hvPR8. Im Folgenden werden das
Virus und das in den Experimenten verwendete Mausmodell vorgestellt. Darüberhinaus sind
die von Daniel Grimm im Rahmen seiner medizinischen Doktorarbeit durchgeführten, bereits
veröffentlichten Studien zur Virulenz von hvPR8 (40) zusammengefasst.
1.3.1
hvPR8 und lvPR8
Mit dem in dieser Arbeit untersuchten Virus, bei dem es sich um ein Influenza A/Puerto
Rico/8/34 (PR8) H1N1-Virus handelte, wurde bei der Infektion von Mäusen, die das antiviral
wirkende Mx1-Protein besaßen, eine interessante Beobachtung gemacht: Das Virus zeigte in
diesen Mäusen, die normalerweise Infektionen mit hohen Virusdosen von PR8-Viren überlebten, eine ungewöhnlich starke Virulenz. Diese wurde durch weitere Passagen in Mx1+/+Mäusen zunehmend erhöht (44). Das Virus wurde „highly virulent“ PR8 (hvPR8) genannt.
Beim Sequenzvergleich mit anderen PR8-Stämmen wurde festgestellt, dass hvPR8 dem
Cambridge PR8-Virus am ähnlichsten ist (156). Bei der Untersuchung des hvPR8-Virus
wurde ein weiteres PR8-Virus zum Vergleich herangezogen. Hierbei handelte es sich um ein
an Mx1-/--Mäuse adaptiertes, dem Mount Sinai PR8-Stamm ähnliches Virus (124), das sich in
Mx1+/+-Mäusen avirulent verhielt. Es wurde somit als „low virulent“ PR8 (lvPR8) bezeichnet.
Tab. 2 zeigt, durch welche Aminosäureaustausche sich hvPR8 von lvPR8 unterscheidet.
+, E142A
+ R,
Ins 133
R133
A57T, P78L, N131T, N133T, Del
E142A,
P186S, E190D, N193K, T206S, I252V, M255R,
Y294F, Y328S, H354Q, T383S, I390T
L15M, K143R, S146N, E329K, K389E, M418I, S467T
NEP
Tab. 2: Aminosäureaustausche in
den viralen Proteinen in hvPR8
verglichen mit lvPR8. Bei HA beziehen sich die Angaben auf die Positionen im HA-Protein des H3-Subtyps.
Bei NA beziehen sich die Angaben
auf die Positionen im NA-Protein des
N2-Subtyps. „Ins“ bezeichnet die Insertion eines Arginins im HA-Protein
von hvPR8 verglichen mit lvPR8. Die
Position „133+“ bezeichnet die Insertion einer Aminosäure zwischen Position 133 und 134 im HA-Protein des
H3-Subtyps. Verändert nach Grimm
et al. (2007).
19
Einleitung
1.3.2
Die Mx1+/+-Maus als Modellorganismus
Mx-Proteine sind IFN-induzierte, antiviral wirkende Proteine, deren Vertreter Mx1 einen
entscheidenden Effektor der Maus gegen Influenza-A-Viren darstellt (3, 46, 69, 134). 1962
wurde beobachtet, dass sich Mäuse des Inzuchtstammes A2G gegenüber einer für andere
Laborstämme letalen Dosis des Influenza-A-Virus resistent verhielten (79). Die Resistenz
konnte auf ein autosomal dominant vererbtes Gen zurückgeführt werden. Dieses wurde
aufgrund seiner Eigenschaft, Resistenz gegenüber Orthomyxoviren zu vermitteln, Mx
(„myxovirus resistance“) genannt (78). Genetische Analysen enthüllten, dass dieses Gen in
Wildmäusen und dem Inzuchtstamm A2G intakt ist, wohingegen die meisten Mausinzuchtstämme ein defektes Mx-Gen tragen (133). Bei dem identifizierten Mx-Gen handelte es sich
um Mx1, das auf Chromosom 16 der Maus lokalisiert ist. Man nimmt an, dass die antivirale
Wirkung des nukleär vorkommenden Mx1 darauf beruht, dass die Primärtranskription von
Influenza-A-Viren gehemmt wird (108). Wie dies vonstatten geht, ist allerdings nicht genau
geklärt.
Da auch der Mensch IFN-induzierbare Mx-Gene besitzt, die u. a. für das antiviral wirkende
MxA-Protein kodieren, ist davon auszugehen, dass eine Infektion von Mx1+/+-Mäusen mit
Influenza-A-Viren am besten eine natürliche Infektion mit diesen Viren, wie sie beim
Menschen stattfindet, widerspiegelt.
In den bereits zu hvPR8 durchgeführten Studien (40, 119) und in dieser Arbeit kamen Mäuse
des Stammes C57BL/6 (B6) und B6.A2G-Mx1 zum Einsatz. Letztere wurden durch Rückkreuzung des Mx1-Allels des Mausstammes A2G auf den C57BL/6-Hintergrund erhalten. Im
Folgenden werden die C57BL/6- und B6.A2G-Mx1-Mäuse als „Mx1-/--“ bzw. „Mx1+/+Mäuse“ bezeichnet.
1.3.3
Außergewöhnliche Virulenz von hvPR8 in Mx1+/+-Mäusen
Um das Maß der Virulenz von hvPR8 im Vergleich zu lvPR8 zu bestimmen, wurde die
lethale Dosis 50 (LD50) der Viren, bei der 50% der Tiere sterben, in Mx1-/-- und Mx1+/+Mäusen ermittelt. hvPR8 zeigte in beiden Mausstämmen im Vergleich zu lvPR8 eine sehr
geringe LD50. Diese betrug sowohl in Mx1-/-- als auch in Mx1+/+-Mäusen ca. 10 ffu („focus
forming units“). Dagegen lagen die LD50-Werte von lvPR8 bei 3x103 ffu in Mx1-/--Mäusen
und >106 ffu in Mx1+/+-Mäusen. hvPR8 ist somit im Vergleich zu einem Standard-PR8-Virus
20
Einleitung
wie lvPR8 außergewöhnlich virulent in der Maus, selbst in Mäusen, die den Resistenzfaktor
Mx1 besitzen.
1.3.4
Mx1-Sensitivität und IFN-Induktion durch hvPR8
Um zu überprüfen, ob die hohe Virulenz von hvPR8 in Mx1+/+-Mäusen auf eine Resistenz des
Virus gegenüber Mx1 zurückzuführen ist, wurde das Überleben von hvPR8 infizierten
Mx1+/+-Mäusen beobachtet, in welchen bereits vor der Infektion durch eine IFN-Behandlung
Mx1 induziert worden war. Während die Kontrolltiere der Virusinfektion erlagen, waren die
vorbehandelten Mäuse vor der Virus induzierten Krankheit geschützt. Dieses Verhältnis
spiegelte sich auch in den Lungenvirustitern der Tiere wider: 24 h nach Infektion lagen die
Virustiter der Kontrolltiere 10.000-fach höher als bei den vorbehandelten Mäusen. Bei der
Durchführung des gleichen Experiments in Mx1-/--Mäusen stellte sich heraus, dass die IFNBehandlung weder die Tiere vor dem Tod schützte noch eine signifikante Senkung der
Lungenvirustiter bewirkte. Dies spricht dafür, dass der durch IFN erzielte, antivirale Schutz
fast ausschließlich durch Mx1 vermittelt wird.
Als nächste mögliche Ursache für die hohe Virulenz von hvPR8 wurde eine besonders
effektive Hemmung der IFN-Induktion durch das NS1-Protein des Virus in Betracht gezogen.
Es wurde jedoch in mehreren Testsystemen festgestellt, dass hvPR8 zwar ein extrem guter
IFN-Suppressor ist, lvPR8 ihm aber in dieser Eigenschaft um nichts nachsteht. Die hohe
Virulenz von hvPR8 lässt sich somit nicht mit seiner Hemmung der IFN-Antwort erklären.
1.3.5
Replikationseigenschaften von hvPR8
Bei einer Analyse der Replikationseigenschaften von hvPR8 stellte sich heraus, dass sich das
Virus sowohl in Zellkultur (MDCK-Zellen) als auch in der Mauslunge durch ein extrem
schnelles Wachstum auszeichnet. Der Unterschied zwischen hvPR8 und lvPR8 in den erzielten Virustitern war in der Mauslunge besonders eindrücklich und noch größer als in Zellkultur: hvPR8 erreichte 24 h nach Infektion verglichen mit lvPR8 1000-fach höhere Titer.
Dass der Unterschied in den Titern der beiden Viren in der Mauslunge größer ausfiel als in
Zellkultur, lässt darauf schließen, dass maus- und/oder lungenspezifische Faktoren die Replikation von hvPR8 beeinflussen könnten.
21
Einleitung
Um zu untersuchen, ob frühe Stadien des Replikationszyklusses für das schnelle Wachstum
von hvPR8 von Bedeutung sind, wurden murine L929-Zellen infiziert, von denen bekannt
war, dass sie keine produktive, d. h. multizyklische Infektion von PR8 zulassen (40). Virales
NP konnte in hvPR8 infizierten Zellen zu früheren Zeitpunkt nach der Infektion nachgewiesen werden als in lvPR8 infizierten Zellen. Dies spricht dafür, dass tatsächlich frühe Ereignisse im Replikationszyklus entscheidend sind. Im Einklang damit stehen auch die Ergebnisse
eines Minigenom-Tests in L929-Zellen.
Es wurde schließlich noch geklärt, inwieweit sich hvPR8 und lvPR8 in ihren Polymeraseaktivitäten unterscheiden. In einem Minireplikonsystem erzielte der Polymerasekomplex von
hvPR8 eine 2-fach höhere Aktivität als der Komplex, der aus den Polymerasuntereinheiten
von lvPR8 bestand. Dies weist darauf hin, dass das schnelle Wachstum von hvPR8 u. a. auf
einer erhöhten Polymeraseaktivität beruht.
1.3.6
Virulenzfaktoren von hvPR8
Um die viralen Segmente von hvPR8 zu identifizieren, die für seine Virulenz entscheidend
sind, wurden Reassortantenviren hergestellt, die 7 Segmente von hvPR8 und ein Segment von
lvPR8 besaßen. Es wurde schließlich untersucht, ob der jeweilige Austausch von einem der 8
viralen Segmente gegen das entsprechende Segment von lvPR8 die LD50 der Viren in Mx1+/+Mäusen beeinflusst. Im Vergleich zum rekombinanten hvPR8 (rhvPR8), dass wie das parentale hvPR8 eine LD50 von <102 ffu besaß, wurde im Fall der Viren mit den Segmenten 1
(PB2), 2 (PB1), 4 (HA) und 6 (NA) von lvPR8 ein Anstieg der LD50 auf 3x102 ffu, 1x102 ffu,
1x103 ffu bzw. 6x102 ffu beobachet (Tab. 3). Diese Daten weisen darauf hin, dass die
Glykoproteine und die Polymeraseproteine für die Virulenz von hvPR8 entscheidend sind.
Bei der von Grimm et al. (2007) verwendeten Nomenklatur der Viren, die auch in dieser
Arbeit beibehalten wird, wird zunächst angegeben, ob der „Segmenthintergrund“ von hvPR8
oder lvPR8 stammt. Danach werden die Proteine aufgeführt, die sich nicht von demselben
Virus ableiten, wie der Segmenthintergrund (bei hvPR/lvHA stammt z. B. Segment 1,2,3,5,
6,7,8 von hvPR8, aber Segment 4 von lvPR8).
22
Einleitung
LD50 [ffu]
Tab. 3: LD50-Werte der parentalen und
reassortanten PR8-Viren. (Verändert nach
Grimm et al. (2007).
2 x 104
Um den Beitrag der kritischen Segmente genauer zu untersuchen, wurden weitere Reassortanten mit verschiedenen Segmentkombinationen hinsichtlich ihrer LD50 in Mx1+/+-Mäusen
getestet. Da die viralen Glykoproteine in ihrem Wirken aufeinander abgestimmt sind (siehe
1.2.1), wurden die Segmente 4 und 6 in Kombination ausgetauscht. Erstaunlicherweise war
das Virus hvPR/lvHN komplett attenuiert (LD50 >106 ffu, siehe Tab. 3), was die Annahme
unterstützt, dass die Glykoproteine eine entscheidende Rolle für die Virulenz spielen. Um zu
erfahren, inwieweit die Virulenz durch den Besitz von HA und/oder NA von hvPR8 erhöht
werden kann, wurden Viren mit den hierfür kodierenden Segmenten und einem sich von
lvPR8 ableitenden Hintergrund hergestellt. Während das Virus lvPR/hvHA im Vergleich zu
dem rekombinanten lvPR8 (rlvPR8) an Virulenz gewann, indem es eine 12-mal niedrigere
LD50 aufwies, blieb das Virus lvPR/hvNA vollständig attenuiert. Dies weist darauf hin, dass
HA eine größere Bedeutung für die Virulenz zukommt als NA. Meine sich an die Arbeit von
Grimm et al. (2007) anschließenden Studien mit größeren Tierzahlen ergaben eine im Vergleich zum veröffentlichten Wert leicht veränderte LD50 des Virus lvPR/hvHN von 2x104 ffu
(5x104 ffu in Grimm et al. (2007)). Ein Vergleich mit der LD50 von 5x104 ffu des Virus
lvPR/hvHA lässt darauf schließen, dass das NA von hvPR8 einen kleinen Beitrag zur Virulenz leistet, der darin begründet sein könnte, dass NA für eine optimale Kooperation mit HA
gebraucht wird.
23
Einleitung
Das Verhältnis der LD50-Werte der Viren rlvPR8, rhvPR8, lvPR/hvHN und hvPR/lvHN
spiegelte sich auch in den 72 h nach Infektion erzielten Lungentitern in Mx1+/+-Mäusen wider.
Um den Beitrag der Polymeraseproteine zur Virulenz zu klären, wurde das Virus
lvPR/hvPPP, das die für die Polymeraseuntereinheiten kodierenden Segmente von hvPR8 und
die restlichen Segmente von lvPR8 enthielt, getestet. Das Virus war avirulent (LD50 >106 ffu,
siehe Tab. 3), d. h. der Besitz der Polymeraseuntereinheiten von hvPR8 konnte keine
Erhöhung der Virulenz bewirken. Dagegen erzielte das Virus lvPR/hvPPPHN, das neben den
Polymeraseproteinen zusätzlich die Glykoproteine von hvPR8 enthielt, eine LD50 von
<102 ffu, d. h. die Virulenz von hvPR8 wurde komplett wiederhergestellt. Diese Daten deuten
darauf hin, dass der Beitrag der Polymeraseproteine zur Virulenz nur dann zum Tragen kommen kann, wenn ein Virus mit den Glykoproteinen von hvPR8 ausgestattet ist.
1.3.7
Schlussfolgerungen
Aus den Studien von Grimm et al. (2007) kann geschlussfolgert werden, dass die Virulenz
von hvPR8 weder auf einer im Vergleich zu lvPR8 effizienteren Hemmung der IFN-Induktion, noch auf der Resistenz gegenüber dem antiviralen Faktor Mx1 beruht. Stattdessen stellen
Grimm et al. (2007) die Hypothese auf, dass hvPR8 aufgrund seiner Fähigkeit, extrem schnell
zu replizieren, dem angeborenen Immunsystem „davonrennt“, bevor dieses sich vollständig
aufgebaut hat, d. h. bevor u. a. der entscheidende Faktor Mx1 seine Wirkung entfaltet. Die
Daten weisen darauf hin, dass frühe Ereignisse im Replikationszyklus für die schnelle Replikation von hvPR8 ausschlaggebend sind. Aus den Untersuchungen mit den Reassortantenviren geht außerdem hervor, dass die Glykoproteine essentiell aber nicht ausreichend sind, um
die Virulenz von hvPR8 zu vermitteln. Für eine vollständige Herstellung der Virulenz sind die
Polymeraseproteine entscheidend. Ihre Virulenz fördernden Eigenschaften kommen jedoch
nur in Anwesenheit der Glykoproteine von hvPR8 zur Geltung. Unter den Glykoproteinen
scheint dem HA-Protein die größere Bedeutung zuzukommen. Diese Beobachtungen führen
zu der Annahme, dass HA im Zusammenwirken mit NA ein effizientes Eindringen des Virus
in die Zelle vermittelt, und dass dann die Polymeraseproteine ins Spiel kommen, die vermutlich u. a. durch eine hohe Polymeraseaktivität zur schnellen Replikation von hvPR8 beitragen.
24
Einleitung
1.4
Zielsetzung dieser Arbeit
Es wird immer noch unzureichend verstanden, welche Faktoren die hohe Virulenz von Influenza-A-Viren vermitteln, und welche molekularen Mechanismen dabei zum Tragen kommen. In dieser Arbeit erfolgte eine genauere Charakterisierung der Virulenz bestimmenden
viralen Faktoren am Beispiel des Influenza-A-Virus hvPR8. Wie bereits gezeigt wurde,
zählen hierzu die Glykoproteine und die Polymeraseproteine des Virus, wobei bisherige
Daten darauf hinweisen, dass dem HA- eine bedeutendere Rolle als dem NA-Protein zukommt (40).
Bei der Untersuchung des Beitrags des HA- und der Polymeraseproteine zur Virulenz von
hvPR8 waren in dieser Arbeit folgende Fragestellungen von Interesse: Welche Polymeraseuntereinheiten und welche Aminosäuren dieser Untereinheiten sind für die Virulenz entscheidend? Durch welche für die Virulenz relevanten Eigenschaften zeichnet sich das HA-Protein
aus? Welche Aminosäuren von HA beeinflussen die Virulenz? Welche Eigenschaften von HA
könnten durch die Virulenz steigernden Aminosäuren vermittelt werden?
25
Material und Methoden
2
Material und Methoden
Das Material und die Methoden bezüglich der in 3.1 aufgeführten Ergebnisse wurden bereits
veröffentlicht und können der Arbeit von Rolling et al. (2009) oder der Doktorarbeit von
Thierry Rolling entnommen werden. Dieses Kapitel beschränkt sich auf das Material und die
Methoden, die sich auf die Ergebnisse des in 3.2 beschriebenen Hauptteils dieser Arbeit beziehen.
2.1
Material
Im Folgenden sind die entscheidenden Materialien für die in 3.2 beschriebenen Experimente
aufgeführt. Zunächst geben sechs Tabellen über die verwendeten Antikörper, Mäuse, Oligonukleotide, Plasmide, Viren und Zelllinien Auskunft. Anschließend sind wichtige Reagenzien
den entsprechenden Experimenten zugeordnet. In den Laboren von Prof. Dr. Stäheli und Prof.
Dr. Kochs verwendete Standardmaterialien sind nicht extra aufgelistet.
2.1.1
Antikörper
Primärantikörper:
Nr.
Beschreibung
Anwendung
Quelle
#84 anti-FLU
Polyklonales, postinfektiöses
Serum aus FPV-B-Truthahninfizierten Kaninchen
IF (Immunfluoreszenz) 1:1000
J. Pavlovic
#178 anti-FLU
Polyklonales Serum aus
Kaninchen, die mit
inaktivierten PR8-Viren
immunisiert worden waren
(siehe 2.2.1.2)
IF 1:10.000
S. Kothlow
Polyklonales Mensch antiInfluenza-A-Virus Serum
IF Paraffinschnitte
1:100
Diagnostik
Virologie
Freiburg
#188 anti-proSP-C
Polyklonales Kaninchen antipro-Surfactant Protein-C
Serum
IF Paraffinschnitte
1:100
Chemikon
Millipore,
Frankreich
#181 anti-Podo
Monoklonaler Hamster antiPodoplanin Antikörper
IF Paraffinschnitte
1:1000
Abcam,
England
-
Name
anti-FLU 979
26
Material und Methoden
Nr.
Name
Beschreibung
Anwendung
Quelle
#110 anti-FLU
Polyklonales Kaninchen antiPR8-Virus Serum
WB (Western Blot)
1:5000
P. Stäheli
#257 anti-NP
Monoklonaler Maus antiInfluenza-A-Virus-NP
Antikörper
IHC (Immunhistochemie) 1:1000
Serotec,
Düsseldorf
#172 anti-Aktin
Polyklonales Kaninchen antiAktin Serum
WB 1:750
Sigma-Aldrich,
München
#174 anti-Tubulin
Monoklonaler Maus antiβ-Tubulin Antikörper
WB 1:1000
Sigma-Aldrich,
München
WB 1:2000
Sekundärantikörper:
Nr.
Beschreibung
Anwendung
Quelle
#1008 Esel anti-Kaninchen
Alexa Fluor 555
IF 1:500
Invitrogen, Karlsruhe
#1041 Ziege anti-Mensch DTAF
IF Paraffinschnitte 1:100
Dianova, Hamburg
#1050 Ziege anti-Hamster Cy3
IF Paraffinschnitte 1:500
Dianova, Hamburg
#187 Kaninchen anti-Maus HRP
(„horseradish peroxidase“)
IHC 1:2000
Dako, Dänemark
-
Esel anti-Kaninchen HRP
WB 1:10.000
GE Healthcare,
England
-
Schaf anti-Maus HRP
WB 1:2000
GE Healthcare,
England
Tab. 4: Antikörper
2.1.2
Mäuse
Mauslinie
Quelle/ Referenz
C57BL/6 (B6) = Mx1-negativ (Mx1-/-)
Harlan, Borchen
B6.A2G-Mx1 = Mx1-positiv (Mx1+/+)
Staeheli et al. (1985) (132)
(erhalten durch Rückkreuzung des Mx1-Allels
aus Stamm A2G)
Tab. 5: Mäuse
27
Material und Methoden
2.1.3
Oligonukleotide
Beschreibung
Sequenz
Quelle
#279 Forward-Primer pDZ
5’ GCTCCTGGGCAACGTGCTGG 3’
AG Kochs
#280 Reverse-Primer pDZ
5’ GCTCAAGGGGCTTCATGATG 3’
AG Kochs
#491 Forward-Primer
kleingedruckte Nt
(Nukleotide): beinhalten
Schnittstelle für LguI,
großgedruckte Nt:
lv/hvPR8 Segment 4,
Nt 1-20
5’ gacagctcttcgggg
AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACC 3'
AG Kochs
#490 Reverse-Primer
kleingedruckte Nt:
beinhalten Schnittstelle für
LguI, großgedruckte Nt:
lv/hvPR8 Segment 4,
Nt 1744-1775
5' gacagctcttctatt
AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTCCTCATATTTC 3'
AG Kochs
#498 Forward-Primer
lv/hvPR8 Segment 4,
Nt 613-632
5' GTATTCATCACCCGCCTAAC 3'
AG Kochs
#484 Forward-Primer
kleingedruckte Nt:
beinhalten Schnittstelle für
LguI, großgedruckte Nt:
lv/hvPR8 Segment 6,
Nt 1-27
5' gacagctcttcgggg
AGCGAAAGCAGGGGTTTAAAATGAATC 3'
AG Kochs
#483 Reverse-Primer
kleingedruckte Nt:
beinhalten Schnittstelle für
LguI, großgedruckte Nt:
lv/hvPR8 Segment 6,
Nt 1387-1413
5' gaca gctcttct att
AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAACAG 3'
AG Kochs
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(T57A)
5’ GGCATAGCCCCACTACAATTGGGGAAATG 3’
5’ GTAGTGGGGCTATGCCTTTTAATCTACATAG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(L78P)
5’ GAATGCGACCCACTTCTTCCAGTGAGATC 3’
5’ GGAAGAAGTGGGTCGCATTCTGGGTTTCC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(T131N)
5’ CCCAACCACAACACAACCAGAGGAGTAACG 3’
5’ CTGGTTGTGTTGTGGTTGGGCCATGAGC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(T133N)
5’ CCACACCACAAACAGAGGAGTAACGGCAGCATGC 3’
5’ GTTACTCCTCTGTTTGTGGTGTGGTTGGGCCATG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(Del R133+)
5’ CACCACAACCGGAGTAACGGCAGCATGCTC 3’
5’ CCGTTACTCCGGTTGTGGTGTGGTTGGGCC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(A142E)
5’ GCTCCCATGAGGGGAAAAGCAGTTTTTACAG 3’
5’ GCTTTTCCCCTCATGGGAGCATGCTGCCG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(S186P)
5’CATCACCCGCCTAACAGTAAGGATCAACAG 3’
5’TTACTGTTAGGCGGGTGATGAATACCCCAC 3’
diese Arbeit
28
Material und Methoden
Beschreibung
Sequenz
Quelle
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(D190E)
5’ CAGTAAGGAACAACAGAAACTCTATCAGAATG 3’
5’ GTTTCTGTTGTTCCTTACTGTTAGACGGGTG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(K193N)
5’ GATCAACAGAATCTCTATCAGAATGAAAATGC 3’
5’ CTGATAGAGATTCTGTTGATCCTTACTGTTAG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(S206T)
5’ CTCTGTAGTGACTTCAAATTATAACAGGAG 3’
5’ GTTATAATTTGAAGTCACTACAGAGACATAAG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(V252I)
5’ GGAAATCTAATAGCACCAAGGTATGCTTTC 3’
5’ CTTGGTGCTATTAGATTTCCATTTGCCTC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(R255M)
5’ GTAGCACCAATGTATGCTTTCGCACTGAGTAG 3’
5’ CGAAAGCATACATTGGTGCTACTAGATTTCC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(F294Y)
5’ GTCTCCCTTACCAGAATATACACCCAGTCAC 3’
5’ GTATATTCTGGTAAGGGAGACTGCTGTTTATAGC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(S328Y)
5’ GTCCATTCAATACAGAGGTCTATTTGGAGCC 3’
5’ TAGACCTCTGTATTGAATGGACGGAATGTTCC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(Q354H)
5’ GTATGGTTATCATCATCAGAATGAGCAGGGATC 3’
5’ CATTCTGATGATGATAACCATACCATCCATC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(S383T)
5’ CAAGGTGAACACTGTTATCGAGAAAATGAAC 3’
5’ CGATAACAGTGTTCACCTTGTTTGTAATCC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(T390I)
5’ GAAAATGAACATTCAATTCACAGCTGTGGG 3’
5’ GTGAATTGAATGTTCATTTTCTCGATAACAG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(lv3x)
=T131N, T133N, Del R133+
(Del = Deletion)
5’ CCCAACCACAACACAAACGGAGTAACGGCAGCATGC 3’
5’ CGTTACTCCGTTTGTGTTGTGGTTGGGCCATGAGC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
hvHA(D190E, K193N)
5’ CAGTAAGGAACAACAGAATCTCTATCAGAATG 3’
5’ GATTCTGTTGTTCCTTACTGTTAGACGGGTG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
lvHA(P78L)
5’ GAATGCGACCTACTGCTTCCAGTGAGATC 3’
5’ GGAAGCAGTAGGTCGCATTCTGGGTTTCC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
lvHA(N133T)
5’ CCACAACACAACCGGAGTAACGGCAGCATGC 3’
5’ CGTTACTCCGGTTGTGTTGTGGTTGGGCCATG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
lvHA(Ins R133+)
(Ins = Insertion)
5’ CAACACAAACAGAGGAGTAACGGCAGCATGCTC 3’
5’ CCGTTACTCCTCTGTTTGTGTTGTGGTTGGGCC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
lvHA(N193K)
5’ GGAACAACAGAAACTCTATCAGAATGAAAATGC 3’
5’ CTGATAGAGTTTCTGTTGTTCCTTACTGTTAGG 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
lvHA(H354Q)
5’ GTATGGTTATCAGCATCAGAATGAACAGGGATC 3’
5’ GTTCATTCTGATGCTGATAACCATACCATCCATC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
lvHA(hv3x)
=N131T, N133T, Ins R133+
5’CCCAACCACACCACAACCAGAGGAGTAACGGCAGCATGC 3’
5’CCGTTACTCCTCTGGTTGTGGTGTGGTTGGGCCATGAGC 3’
diese Arbeit
Mutagenese-Primerpaar
lvHA(E190D, N193K)
5’ CAGTAAGGATCAACAGAAACTCTATCAGAATGAAAATG 3’
5’ CATTCTGATAGAGTTTCTGTTGATCCTTACTGTTAGGC 3’
diese Arbeit
Tab. 6: Oligonukleotide
29
Material und Methoden
2.1.4
Plasmide
Nr.
Bezeichnung
Beschreibung
Quelle
#3110
pDZ
Vektor für die in dieser Arbeit
durchgeführten Influenza-A-Virus
Rescues, enthält wie auch die im
Folgenden, sich von pDZ ableitenden
Plasmide : Schnittstellen für LguI, einen
humanen Pol I- und einen pCAGGSPromoter (bidirektional), AmpR
(Ampicillin-Resistenz)
P. Palese,
A. Garcia-Sastre
#3151.I14
pDZ-Seg1 hvPR8
pDZ mit PB2-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3149.M8
pDZ-Seg2 hvPR8
pDZ mit PB1-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3147.I4
pDZ-Seg3 hvPR8
pDZ mit PA-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3121.9
pDZ-Seg4 hvPR8
pDZ mit HA-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3127.S2
pDZ-Seg5 hvPR8
pDZ mit NP-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3125.2
pDZ-Seg6 hvPR8
pDZ mit NA-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3117.1
pDZ-Seg7 hvPR8
pDZ mit M-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3113.5.1
pDZ-Seg8 hvPR8
pDZ mit NS-Gen von hvPR8
G. Kochs
#3152.K13
pDZ-Seg1 lvPR8
pDZ mit PB2-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3150.H34
pDZ-Seg2 lvPR8
pDZ mit PB1-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3148.K14
pDZ-Seg3 lvPR8
pDZ mit PA-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3122.13
pDZ-Seg4 lvPR8
pDZ mit HA-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3128.5
pDZ-Seg5 lvPR8
pDZ mit NP-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3126.6
pDZ-Seg6 lvPR8
pDZ mit NA-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3118.11
pDZ-Seg7 lvPR8
pDZ mit M-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3114.15.5
pDZ-Seg8 lvPR8
pDZ mit NS-Gen von lvPR8
G. Kochs
#3304
pDZ-Seg4 hvPR8 T57A
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3305
pDZ-Seg4 hvPR8 L78P
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3306
pDZ-Seg4 hvPR8 T131N
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3307
pDZ-Seg4 hvPR8 T133N
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
+
#3308
pDZ-Seg4 hvPR8 Del R133
#3309
pDZ-Seg4 hvPR8 A142E
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3310
pDZ-Seg4 hvPR8 S186P
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3311
pDZ-Seg4 hvPR8 D190E
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3312
pDZ-Seg4 hvPR8 K193N
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3313
pDZ-Seg4 hvPR8 S206T
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3314
pDZ-Seg4 hvPR8 V252I
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3315
pDZ-Seg4 hvPR8 R255M
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3316
pDZ-Seg4 hvPR8 F294Y
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
30
Material und Methoden
Nr.
Bezeichnung
Beschreibung
Quelle
#3317
pDZ-Seg4 hvPR8 S328Y
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3318
pDZ-Seg4 hvPR8 Q354H
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3319
pDZ-Seg4 hvPR8 S383T
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3320
pDZ-Seg4 hvPR8 T390I
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3321
pDZ-Seg4 hvPR8 lv3x
(= T131N, T133N, Del R133+)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3322
pDZ-Seg4 hvPR8 lv4x
(= T131N, T133N, Del R133+,
K193N)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3323
pDZ-Seg4 hvPR8 lv5x
(= T131N, T133N, Del R133+,
D190E, K193N)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3324
pDZ-Seg4 hvPR8 lv6x
(= T131N, T133N, Del R133+,
K193N, L78P, Q354H)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3325
pDZ-Seg4 hvPR8 lv7x
(= T131N, T133N, Del R133+,
D190E, K193N, L78P, Q354H)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3326
pDZ-Seg4 hvPR8
L78P, Q354H
pDZ mit mutiertem HA-Gen von hvPR8
diese Arbeit
#3327
pDZ-Seg4 lvPR8 P78L
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3328
pDZ-Seg4 lvPR8 N133T
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3329
pDZ-Seg4 lvPR8 Ins R133+
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3330
pDZ-Seg4 lvPR8 N193K
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3331
pDZ-Seg4 lvPR8 H354Q
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3332
pDZ-Seg4 lvPR8 hv3x
(= N131T, N133T, Ins R133+)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3333
pDZ-Seg4 lvPR8 hv5x
(= N131T, N133T, Ins R133+,
E190D, N193K)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3334
pDZ-Seg4 lvPR8 hv7x
(= N131T, N133T, Ins R133+,
E190D, N193K, P78L, H354Q)
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#3335
pDZ-Seg4 lvPR8
P78L, H354Q
pDZ mit mutiertem HA-Gen von lvPR8
diese Arbeit
#1851
pRL-SV40
Renilla-Luziferase-Reportergen,
SV40-Promotor, AmpR
Promega,
Mannheim
#2472
pCAGGS-T7
T7-Polymerase-Gen,
pCAGGS- Promotor, AmpR
G. Kochs,
F. Weber
#2473
pTM1-FFLuc
Firefly-Luziferase-Reportergen,
T7-Promotor, AmpR
G. Kochs,
F. Weber
Tab. 7: Plasmide
31
Material und Methoden
2.1.5
Viren
Bei allen, in dieser Arbeit verwendeten Viren (mit Ausnahme der am Ende von Tab. 8 aufgeführten Kontrollviren für den Rezeptorbindetest) handelte es sich um Influenza A/Puerto
Rico/8/34 H1N1-Viren. Im Folgenden wird für die Viren die Nomenklatur, die von Grimm et
al. (2007) eingeführt wurde, beibehalten.
Nr.
Bezeichnung
Zusammensetzung
#141 rlvPR8
lv1,2,3,4,5,6,7,8
#142 rhvPR8
hv1,2,3,4,5,6,7,8
#148 hvPR/lvNA
lv6 hv1,2,3,4,5,7,8
#153 lvPR/hvHN
lv1,2,3,5,7,8 hv4,6
#154 hvPR/lvHN
lv4,6 hv1,2,3,5,7,8
#213 hvHA(T57A)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T57A
#214 hvHA(L78P)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* L78P
#222 hvHA(T131N)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T131N
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T133N
#202 hvHA(Del R133 )
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* Del R133+
#203 hvHA(A142E)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* A142E
#223 hvHA(S186P)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* S186P
#204 hvHA(D190E)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* D190E
#216 hvHA(K193N)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* K193N
#217 hvHA(S206T)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* S206T
#218 hvHA(V252I)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* V252I
#224 hvHA(R255M)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* R255M
#225 hvHA(F294Y)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* F294Y
#226 hvHA(S328Y)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* S328Y
#219 hvHA(Q354H)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* Q354H
#227 hvHA(S383T)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* S383T
#220 hvHA(T390I)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T390I
#221 hvHA(lv3x)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T131N, T133N, Del R133+
#257 hvHA(lv4x)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T131N, T133N, Del R133+, K193N
#258 hvHA(lv5x)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T131N, T133N, Del R133+, D190E , K193N
#215 hvHA(T133N)
+
32
Material und Methoden
Nr.
Bezeichnung
Zusammensetzung
#259 hvHA(lv6x)
#260 hvHA(lv7x)
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T131N, T133N, Del R133+, K193N,
lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
* T131N, T133N, Del R133+, D190E , K193N, L78P,
#261 hvHA(L78P, Q354H) lv6 hv1,2,3,4*,5,7,8
#234 lvHA(L78P)
L78P, Q354H
Q354H
* L78P, Q354H
lv4*,6 hv1,2,3,5,7,8 * P78L
#241 lvHA(N133T)
lv4*,6 hv1,2,3,5,7,8 * N133T
+
#235 lvHA(Ins R133 )
lv4*,6 hv1,2,3,5,7,8 * Ins R133+
#243 lvHA(N193K)
lv4*,6 hv1,2,3,5,7,8 * N193K
#236 lvHA(H354Q)
lv4*,6 hv1,2,3,5,7,8 * H354Q
#245 lvHA(hv5x)
lv4*,6 hv1,2,3,5,7,8 * N131T, N133T, Ins R133+, E190D , N193K
#248 lvHA(hv7x)
lv4*,6 hv1,2,3,5,7,8 * N131T, N133T, Ins R133+, E190D, N193K, P78L,
H354Q
A/Ente/Minnesota/1525/81
(H5N1)
M. Matrosovich
A/Wildente/Alberta/47/98
(H4N1)
M. Matrosovich
A/Memphis/14/96 (H1N1)
M. Matrosovich
Tab. 8: Viren
2.1.6
Zelllinien
Zelllinie
Spezies
Zelltyp und Quelle/Referenz
MDCKs
(„Madin-Darby canine
kidney epithelial cells“)
Canis familiaris (Hund)
Epitheliale Nierenzellen, AG Kochs
MDCK-H
Canis familiaris (Hund)
Epitheliale Nierenzellen,
die keine endogene Protease enthalten, AG Matrosovich (Marburg)
MDCK-SIAT
Canis familiaris (Hund)
Epitheliale Nierenzellen,
=> MDCK-H- Zellen, die stabil mit
cDNA für humane α2,6-Sialyltransferase (SIAT) transfiziert wurden
(82), AG Matrosovich (Marburg)
293T
Homo sapiens (Mensch)
Epitheliale Nierenzellen, AG Kochs
L929
Mus musculus (Maus)
Fibroblasten, AG Kochs
Tab. 9: Zelllinien
33
Material und Methoden
2.1.7
Feste-Phase-Enzym-Test zur Bestimmung der Rezeptoraffinität des
HA-Proteins
ELISA 96-Lochplatten Microlon
Greiner Bio-One, Frickenhausen
Tween-80
Calbiochem, Darmstadt
BSA-NA
hergestellt von
Dr. Mikhail Matrosovich,
(82)
Fetuin-HRP
hergestellt von
Dr. Mikhail Matrosovich,
(82)
2,3-Fetuin-HRP
hergestellt von
= α2,3-Sialinsäure enthaltendes Fetuin-HRP
Dr. Mikhail Matrosovich,
(82)
2,6-Fetuin-HRP
hergestellt von
= α2,6-Sialinsäure enthaltendes Fetuin-HRP
Dr. Mikhail Matrosovich,
(82)
3’SL-PAA-biot
von Dr. Nicolai Bovin
= 3’Sialyllactose-Poly[N-(2-Hydroxyethyl)acrylamid]
Lectinity Holding, Inc., Russland
-Biotin
(8)
6’SLN-PAA-biot
von Dr. Nicolai Bovin
= 6’Sialyl-N-Acetyllactosamin-
Lectinity Holding, Inc., Russland
Poly[N-(2-Hydroxyethyl)acrylamid]-Biotin
(8)
ImmunoPure® Streptavidin HRP
Pierce, USA
Oseltamivir Carboxylat
Roche, England
erhalten von
Dr. Mikhail Matrosovich
OPD (O-Phenylendiamindihydrochlorid)
Sigma-Aldrich, England
34
Material und Methoden
Waschpuffer:
0,02% Tween-80 in 0,2xPBS
Reaktionspuffer:
in PBS:
0,02% BSA-NA
0,02% Tween-80
1 µM Oseltamivir Carboxylat
2.1.8
Fusion von Viren mit Erythrozyten
Humane Erythrozyten
2.1.9
Iris Körner
Immunfluoreszenz mit MDCK-/MDCK-H-Zellen
SlimFast
Allpharm, Messel
2.1.10 Immunfluoreszenz mit Lungen-Paraffinschnitten
Normal Goat Serum
Vector Laboratories, USA
Fluor SaveTM Reagent
Calbiochem, Darmstadt
2.1.11 Luziferase-Reportergen-Fusionstest
Nanofectin Kit
PAA Laboratories, Österreich
TPCK
Sigma-Aldrich, München
(L-1-Tosylamido-2-Phenylethyl-Chloromethyl-Keton)
-Trypsin
Dual-Luciferase® Reporter Assay System
Promega, Mannheim
35
Material und Methoden
2.1.12 Herstellung von Zelllysaten und Western Blot-Analyse
Lysepuffer:
50 mM Tris (pH 7,5)
280 mM NaCl
10% Glycerin
1% NP-40
0,2 mM EDTA
2 mM EGTA
1 mM DTT
100 U/ml Benzonase
¼ Tablette Proteaseinhibitor/ml
5 mM NaVO
Protease Inhibitor Tabletten (EDTA frei)
Roche, Mannheim
Benzonase (25 U/µl)
Novagen, USA
Proteingel-Kammern PROTEAN II
Bio-Rad, München
Nassblot-System PROTEAN II
Bio-Rad, München
Immobilon-P Transfer Membran (PVDF)
Millipore, Schwalbach
ECL Western Blot Detektionsreagenz
Amersham Biosciences, Freiburg
Prestained SDS-PAGE Standard (Low Range)
Bio-Rad, München
Whatman-Papier
Schleicher & Schuell, Dassel
SlimFast
Allpharm, Messel
Tween-20
Sigma-Aldrich, München
36
Material und Methoden
4x Lämmlipuffer:
400 mM Tris-HCl pH 6,8
40% Glycerin
8% SDS
0,004% BPB
20% β-ME
10 % Trenngel (10 ml):
3,3 ml 30 % Acrylamid-Lösung (0,8 % Bisacrylamid)
2,5 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8
4,1 ml H2O
100 μl 20% SDS
für die Polymerisierung:
50 μl 10 % APS + 5 µl TEMED
5 % Sammelgel (5 ml):
820 μl 30 % Acrylamid-Lösung (0,8 % Bisacrylamid)
1,25 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
2,8 ml H2O
50 μl 20 % SDS
25 μl 10 % APS
5 μl TEMED
10x Laufpuffer:
30 g Tris Base
145 g Glycin
50 ml 20 % SDS
ad 1l H2O
Transferpuffer:
25 mM Tris-HCl
186 mM Glycin
20% Methanol
0,2% SDS
37
Material und Methoden
2.1.13 Mutagenese-PCR und Klonierung
Herculase® II Fusion Enzyme with dNTPs Combo
Stratagene, USA
Desoxyribonukleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
Fermentas, St. Leon-Rot
Agarose
Serva, Heidelberg
DNA-Gel-Kammer Wide Mini Sub Cell
Bio-Rad, München
DNA-Größenmarker GeneRulerTM
Fermentas, St. Leon-Rot
peqGOLD Gel Extraction Kit
PEQLAB Biotech, Erlangen
Enzym LguI
Fermentas, St. Leon-Rot
10x Tango Puffer
Fermentas, St. Leon-Rot
Enzym CIAP („calf intestine alkaline phosphatase“)
Fermentas, St. Leon-Rot
Rapid DNA Ligation Kit
Fermentas, St. Leon-Rot
XL1-Blue E.coli
Stratagene, USA
Ampicillin
Bayer, Leverkusen
Plasmid Midi/Maxi Prep Kit NucleoBond
Machery-Nagel, Düren
peqGOLD Plasmid Miniprep Kit I
PEQLAB Biotech, Erlangen
LB Medium:
10 g/l Bacto Trypton
5 g/l Hefeextrakt
5 g/l NaCl
add 1000 ml ddH2O
pH 7
38
Material und Methoden
2.1.14 Narkose der Mäuse
Für Infektionsexperimente:
Ketamin-Xylazine-Narkosemischung (5ml):
500 µl
10% Ketamin (Ketavet®) (1%)
Essex Tierarznei, München
125 µl
2% Xylazine (Rompun®) (0,05%)
Bayer, Leverkusen
4375 µl
0,9% NaCl (0,8%)
=> pro Maus: Injektion von 10µl pro Gramm Körpergewicht
Für Finalexperimente:
Ketamin-Xylazine-Narkosemischung (siehe oben)
Isofluran (Forene®)
=> pro Maus: Injektion von 2ml
Abbott, Wiesbaden
2.1.15 Plaque Assay mit Avicel
Avicel
Avicelmedium (20 ml):
FMC Biopolymer, Belgien
10 ml DMEM 2x (+2x Penicillin/Streptomycin, Glutamin)
10 ml 1,2% Avicel
100 µl 10% BSA
Tween-80
Calbiochem, Darmstadt
True BlueTM Peroxidase Substrate
KPL, USA
2.1.16 RNA-Isolation und Reverse Transkription
peqGOLD TrifastTM
PEQLAB Biotech, Erlangen
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit
Fermentas, St. Leon-Rot
39
Material und Methoden
2.1.17 Virus-Rescue
Transiente Transfektion:
Optimem
Gibco, Wiesbaden
LipofectamineTM 2000
Invitrogen, Karlsruhe
TPCK-Trypsin
Sigma-Aldrich, München
Virusanzucht in bebrüteten Hühnereiern:
VALO SPF (Spezifiziert Pathogen Frei)-Eier
Lohmann Tierzucht, Cuxhaven
Plaque Assay (Plaque-Reinigung):
Agar-Medium (50ml):
6,5 ml steriles H2O
0,5 ml 1M HEPES (0,01 M)
25 ml 2x DMEM (+2x Penicillin/Streptomycin,
Glutamin) (1x)
1 ml 10% BSA (0,2%)
0,5 ml 1% DEAE Dextran (0,01%)
1 ml 5% NaHCO3 (0,1%)
15 ml 2% Oxoidagar (0,6%)
Kristallviolett-Lösung (400ml):
4 g Kristallviolett (1%)
40 ml Formaldehyd (3,6%)
4 ml Methanol (1%)
80 ml Ethanol (20%)
ad 400 ml Aqua dest.
Immunfluoreszenz (Virustiterbestimmung):
SlimFast
Allpharm, Messel
40
Material und Methoden
2.1.18 Zellkultur
PBS
Detaillierte Angaben zur Herstellung von PBS machten Mayr et al. (1974) (86).
In der folgenden Arbeit wurde PBS sowohl mit als auch ohne Ca2+ und Mg2+
verwendet.
DMEM („Dulbecco’s modified Eagle’s medium“)
Invitrogen, Karlsruhe
„high glucose“
FCS
Biochrom, Berlin
PAA, Österreich
Glutamin
Life Technologies, Wiesbaden
Penicillin/Streptomycin
Life Technologies, Wiesbaden
Trypsin-Versengemisch
Gibco BRL, Wiesbaden
HEPES
Roth, Karlsruhe
BSA
Sigma-Aldrich, München
96-Loch-Platten
Greiner Bio-One, Frickenhausen
6/24-Loch-Platten
Greiner Bio-One, Frickenhausen
2
2
25 cm /75cm -Kulturflasche
Greiner Bio-One, Frickenhausen
35 mm/94 mm Schale
Greiner Bio-One, Frickenhausen
1 ml/5 ml/10 ml/25 ml Einwegpipetten
Corning Inc., USA
1,5 ml/ 2 ml Eppendorfröhrchen
Eppendorf, Hamburg
50 ml/ 15 ml Falcon-Röhrchen
Becton Dickinson, Heidelberg
Ultrazentrifugenröhrchen
Beckman Instruments, Inc., USA
(Ultra-ClearTM Tubes 25x89 mm)
Vollständiges Kulturmedium:
DMEM „high glucose“-Basismedium
10% FCS
525,6 µg/ml l-Glutamin
50 U/ml Penicillin
50 µg/ml Streptomycin
41
Material und Methoden
2.2
Methoden
2.2.1
Zellkulturexperimente
2.2.1.1 Kultivierung der Zellen
Die in 2.1.6 aufgelisteten Zelllinien wurden nach den von Doyle et al. (1996) beschriebenen
Zellkulturtechniken gehalten (26). Als Medium diente DMEM („Dulbecco’s modified Eagle’s
medium“) „high glucose“, dem 5%/10% FCS sowie Glutamin und Penicillin/Streptomycin
zugefügt wurde. Das Waschen der Zellen erfolgte mit PBS ohne Ca2+ und Mg2+. Zum
Ablösen der Zellen von der Kulturschale wurde eine 1:4-Trypsin-Versen-Mischung verwendet. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer Luftfeuchte und 5% CO2
kultiviert. Alle Zelllinien wurden wöchentlich mindestens zweimal gesplittet.
2.2.1.2 Herstellung eines anti-PR8-Virus Serums
Zur Herstellung eines anti-PR8-Virus Serums (#178, siehe 2.1.1) wurde PR8-Viren
enthaltende, aus Eiern gewonnene Allantoisflüssigkeit gepoolt, im Verhältnis 1:1 mit PBS
gemischt und 15 min bei 4000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde auf ca. 30
ml fassende Ultrazentrifugenröhrchen verteilt und für 2 h bei 24.000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 200 µl PBS-0,1% Triton X-100 gründlich resuspendiert und über
Nacht bei RT inkubiert. Mit den somit inaktivierten, denaturierten Viren wurde ein Kaninchen
immunisiert. Die Immunisierung wurde von Sonja Kothlow (München) durchgeführt.
2.2.1.3 Immunfluoreszenz zum Virusnachweis in infizierten MDCK-H-Zellen
MDCK-H-Zellen wurden in 24-Lochplatten eingesät. Nach Erreichen der Konfluenz wurden
die Zellen mit einer MOI („multiplicity of infection“) von 0,5 des jeweiligen in PBS-0,3%
BSA verdünnten Virus infiziert. Das Inokulum wurde nach einstündiger Inkubation bei RT
abgesaugt und durch vollständiges Kulturmedium (siehe 2.1.18) ersetzt. Nach 6-stündiger
Inkubation im Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer Luftfeuchte und 5% CO2 wurden die
Zellen mit PBS gewaschen und 15 min mit 3% PFA fixiert. Nach der Fixierung der Zellen
und den nachfolgenden Schritten wurde jeweils dreimal mit PBS gewaschen. Um die Zellen
zu permeabilisieren, wurde für 15 min PBS-0,5% Triton X-100 zugefügt. Für die Färbung
wurde ein polyklonales anti-FLU Kaninchenserum #84 (1:1000 im PBS-1% SlimFast) bzw.
#178 (1:10.000 in PBS-1% SlimFast) als Primärantikörper und anschließend ein Esel anti42
Material und Methoden
Kaninchen Alexa Fluor 555 Sekundärantikörper #1008 (1:500 in PBS-1% SlimFast)
eingesetzt. Die Inkubation erfolgte für Primär- und Sekundärantikörper je 1 h bei RT, im Fall
des Sekundärantikörpers unter Lichtausschluss. Die Auswertung fand mit Hilfe eines Polyvar
2 Mikroskops (Leica) statt.
2.2.1.4 Immunfluoreszenz zum Virusnachweis in infizierten, NH4Cl behandelten
MDCK-Zellen
In eine 24-Lochplatte ausgesäte, konfluente MDCK-Zellen wurden mit einer MOI von 1 des
jeweiligen in PBS-0,3% BSA verdünnten Virus für 1 h bei RT in Anwesenheit von verschiedenen NH4Cl-Konzentrationen inkubiert. Die jeweilige NH4Cl-Konzentration wurde anschließend auch in dem das Inokulum ersetzenden Kulturmedium (siehe 2.1.18) beibehalten. Nach
6-stündiger Inkubation im Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer Luftfeuchte und 5% CO2
wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und gefärbt wie in 2.2.1.3.
2.2.1.5 Immunfluoreszenz zur Bestimmung des Virustiters
MDCK-Zellen wurden in eine 96-Lochplatte ausgesät und nach Erreichen der Konfluenz
infiziert. Hierzu wurde mit den gewünschten Viren eine logarithmische Verdünnungsreihe in
PBS-0,3% BSA hergestellt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 50 µl der
Virusverdünnungen für 1 h bei RT inkubiert. Im Anschluss wurde das Inokulum entfernt, und
es folgte eine 16-stündige Inkubation im Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer Luftfeuchte
und 5% CO2. Danach wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und gefärbt wie in 2.2.1.3.
Durch Auszählen der infizierten Zellen konnte der Virustiter der Ausgangslösung als „focusforming-units“ (ffu) pro ml bestimmt werden.
2.2.1.6 Luziferase-Reportergen-Fusionstest (nach Su et al. (2008) (140))
293T-Zellen wurden in 6-Lochplatten mit einer Dichte von 60% eingesät. Nachdem sich die
Zellen vollständig abgesetzt hatten, wurde die Hälfte der Zellen (Ansatz 1) mit einem
Expressionsplasmid für HA (2 µg/Loch), einem unter Kontrolle des T7-Promotors stehenden
Firefly-Luziferase Gen kodierenden Plasmid (1 µg/Loch) und einem unter Kontrolle des
SV40-Promotors stehenden Renilla-Luziferase Gens kodierenden Kontrollplasmid (50 ng/
Loch) transfiziert. Die andere Hälfte der Zellen (Ansatz 2) wurde mit einem Expressionsplasmid für die T7-Polymerase (3 µg/Loch) transfiziert. Die Transfektion wurde mit Hilfe
eines Nanofektion Kits (siehe 2.1.11) durchgeführt. Nach 40 h wurden die Zellen mit PBS
43
Material und Methoden
gewaschen und die Zellen von Ansatz 2 wurden mit PBS-0,02% EDTA abgelöst und Ansatz 1
zugefügt. Es erfolgte eine 5-stündige Inkubation mit vollständigem Kulturmedium (siehe
2.1.18) im Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer Luftfeuchte und 5% CO2. Daraufhin wurden
die Zellen mit PBS gewaschen und das auf den Zellen von Ansatz 1 exprimierte HA wurde
durch eine zweiminütige Behandlung mit TPCK-Trypsin (1 µg/ml in DMEM + Glutamin,
Penicillin-Streptomycin, 0,3% BSA, 0,01 mM HEPES) bei 37°C gespalten. Nach erneutem
Waschen mit PBS wurden die Zellen 2 min bei 37°C unterschiedlichen pH-Werten ausgesetzt. Zur Herstellung der pH-Lösungen wurde PBS mit Zitronensäure (0,15M) auf die jeweiligen pH-Werte eingestellt. Nach erneuter Inkubation im Brutschrank wurden die Zellen 7 h
später lysiert. Die im Fall einer Fusion der Zellen von Ansatz 1 und 2 produzierte FireflyLuziferase wurde durch Zugabe von Luziferin und anschließender Messung der Lumineszenz
im Luminometer (Siriu, Berthold) detektiert. Die für die Lyse und Lumineszenz-Messung
verwendeten Reagenzien stammten aus einem Luziferase Reporter Assay Kit (siehe 2.1.11).
2.2.1.7 Untersuchung der Abhängigkeit der Virusreplikation von Trypsin im
Plaque Assay mit Avicel
MDCK-H Zellen wurden in eine 96-Lochplatte eingesät und nach Erreichen der Konfluenz
mit einer MOI von 0,01 des jeweiligen in PBS-0,3% BSA verdünnten Virus infiziert. Pro
Virus wurde eine Spalte der Lochplatte (8 Löcher) verwendet. Nach einstündiger Inkubation
bei RT wurde das Inokulum abgesaugt und die Zellen wurden mit Avicelmedium (0,6%)
(siehe 2.1.15) überschichtet. In Reihe 1 der Lochplatte wurde das Avicelmedium auf eine
Trypsinkonzentration von 0,5 µg/ml eingestellt. Ausgehend von Reihe 1 bis Reihe 8 wurde
schließlich eine 1:2 Verdünnung des Trypsin enthaltenden Avicelmediums durchgeführt. Die
mit Avicelmedium überschichteten Zellen wurden im Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer
Luftfeuchte und 5% CO2 für 24 h inkubiert. Anschließend wurden sie mit PBS gewaschen
und 30 min mit 3% PFA bei 4 °C fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS erfolgte die
Permeabilisierung der Zellen mit PBS-0,5% Triton X-100, 20 mM Glycin für 15 min bei RT.
Nach diesem und den nachfolgenden Schritten wurde jeweils dreimal mit PBS-0,05% Tween80 gewaschen. Als Primärantikörper wurde ein monoklonaler Maus anti-NP Antikörper #257
(1:1000 in PBS-0,05% Tween-80, 10% FCS) und als Sekundärantikörper ein polyklonales
Kaninchen anti-Maus, HRP-gekoppelte Antikörper enthaltendes Serum #187 (1:2000 in PBS0,05% Tween-80, 10% FCS) verwendet. Die Inkubation erfolgte für Primär- und Sekundär-
44
Material und Methoden
antikörper je 1 h bei RT. Zur Sichtbarmachung der Virus infizierten Zellen wurde als Substrat
für die HRP True BlueTM Peroxidase Substrat für 30 min bei RT zugefügt. Anschließend
wurde die Lochplatte mit H2O dest. gewaschen und getrocknet.
2.2.1.8 Untersuchung der Fusionsaktivität von Viren mit Erythrozyten
Menschliche Erythrozyten wurden durch Blutabnahme, Zentrifugation des Blutes für 15 min
bei 1200 rpm und 10 °C und anschließendem dreimaligem Waschen des Pellets mit PBS
gewonnen. Das Erythrozyten-Pellet wurde in 8 ml PBS aufgenommen und mit 2 ml
Allantoisflüssigkeit versetzt, die einen Virustiter von 6x108 ffu/ml enthielt. Zur Agglutination
der Zellen wurde das Erythrozyten-Virus-Gemisch für 10 min auf Eis gestellt. Nach
vorsichtigem Resuspendieren wurden 0,5 ml Aliquots in 1,5 ml Eppendorfröhrchen transferiert und für 1 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde den
Pellets 0,5 ml einer Lösung mit bestimmtem pH-Wert zugefügt. Hierfür waren 15 Lösungen
hergestellt worden, bei welchen PBS mit Zitronensäure (0,15 M) auf pH-Werte zwischen 7,4
und 4,7 eingestellt worden war. Zur Induktion der Fusion der Viren mit den Erythrozyten
wurden die Proben 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden sie 1 min bei 14.000 rpm
zentrifugiert. Freigesetztes Hämoglobin wurde durch Messung der Absorption bei 575 nm im
Spektrometer (Smart Spec Plus, Bio-Rad) quantifiziert.
2.2.1.9 Virus-Rescue: Transiente Transfektion
Als erster Schritt des Virus-Rescues wurde eine Transfektion einer 293T-MDCK-Mischkultur durchgeführt. Hierzu wurden je 0,5 µg der 8 Rescue-Plasmide (pDZ-Seg1-8 PR8, siehe
2.1.4) in 50 µl Optimem verdünnt. In einem Polystyrolröhrchen wurden 250 µl Optimem
vorgelegt und 8 µl LipofectamineTM 2000 zugefügt. Nach 5 min wurde der DNA-OptimemAnsatz auf das Lipofectamine-Optimem-Gemisch im Polystyrolröhren getropft und anschließend durch leichtes Schütteln gemischt. Um die Bildung von DNA-Liposomen-Komplexen
zu gewährleisten, wurde der Transfektionsansatz 20-30 min bei RT inkubiert. Währenddessen
wurden je 75 cm² in Medium suspendierte 293T- und MDCK-Zellen zusammengegeben und
5 min bei 900 rpm und 10 °C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 3,5 ml DMEM + Glutamin,
Penicillin-Streptomycin, 0,01% FCS, 0,3% BSA resuspendiert. Nach Verstreichen der Inkubationszeit des Transfektionsansatzes wurden diesem 250 µl Zellsuspension zugefügt.
Abschließend wurde mit 1 ml DMEM + Glutamin, Penicillin-Streptomycin, 0,01% FCS,
0,3% BSA aufgefüllt, und der Inhalt des Polystyrolröhrchens wurde auf eine 35 mm Schale
45
Material und Methoden
gegeben. Nach 20-stündiger Inkubation der transfizierten Zellen im Brutschrank bei 37 °C,
95% relativer Luftfeuchte und 5% CO2 erfolgte ein Mediumwechsel. Es wurden 1,5 ml
DMEM + Glutamin, Penicillin-Streptomycin, 0,3% BSA, 0,01 mM HEPES, 1 µg/ml TPCKTrypsin zugefügt. Nach weiterer 24-stündiger Inkubation im Brutschrank wurden die Überstände der Zellen geerntet und einer 1. Eipassage unterzogen (siehe 2.2.4.1 Virus-Rescue:
Virusanzucht in bebrüteten Hühnereiern).
2.2.1.10 Virus-Rescue: Plaque Assay (Plaque-Reinigung)
Um einen konfluenten Zellrasen zum Infektionszeitpunkt zu erhalten, wurden MDCK-SIATZellen am Vortag der Infektion in 6-Lochplatten ausgesät. Mit den Virus enthaltenden, von
der 1. Eipassage gewonnenen Allantoisflüssigkeiten (siehe 2.2.4.1) wurde eine logarithmische
Verdünnungsreihe in PBS-0,3% BSA hergestellt. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS
folgte die Infektion mit 900 µl der Virusverdünnungen für 1 h bei RT. Im Anschluss wurde
das Inokulum abgesaugt und der Zellrasen mit dem auf 42 ºC erwärmten Agarmedium (siehe
2.1.17) überschichtet. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer Luftfeuchte
und 5% CO2 inkubiert, bis Plaques sichtbar waren. Um die Viren zu reinigen, wurde in
einzelne Plaques gepickt, und die aufgenommenen Agarstückchen wurden in 600 µl PBS0,3% BSA gelöst. Diese Viruslösungen wurden für eine 2. Eipassage eingesetzt (siehe 2.2.4.1
Virus-Rescue: Virusanzucht in bebrüteten Hühnereiern).
Die Fixierung der MDCK-SIAT-Zellen erfolgte für ca. 15 min mit 3% PFA. Nach Entfernung
des erstarrten Agars wurde der Zellrasen für ca. 15 min mit einer Kristallviolett-Lösung (siehe
2.1.17) gefärbt. Das Auszählen der nicht angefärbten Plaques ergab den Virustiter der eingesetzten Allantoisflüssigkeit in „plaque forming units“ (pfu) pro ml.
pfu/ml = x * 10y
x: Anzahl der Plaques pro Loch
y: Positiver Exponent der Virusverdünnung, mit der die Zellen in diesem Loch infiziert worden waren
46
Material und Methoden
2.2.2
Proteinchemische Methoden
2.2.2.1 Gewinnung von Lysaten für den Western Blot
Bei denen in dieser Arbeit mittels Western Blot untersuchten Proben handelte es sich
einerseits um Virus infizierte L929-Zellen (siehe 3.2.2) und um mit Expressionsplasmiden für
lvHA bzw. hvHA transfizierte 293T-Zellen (siehe 3.2.3.3). Letztere wurden unter Verwendung des in 2.1.11 erwähnten Nanofectin Kits transfiziert und nach 48-stündiger Inkubation
im Brutschrank mit verschiedenen Trypsin-Konzentrationen für 20 min bei 37 °C inkubiert.
Die L929-Zellen und 293T-Zellen wurden mit Lysepuffer (siehe 2.1.12) dem Benzonase
(100 U/ml) und Proteaseinhibitor (1/10 Tablette/ml) zugefügt worden war, versetzt (150 µl
pro Loch in 6-Lochplatte) und anschließend 10 min auf Eis inkubiert.
Außerdem wurden Lysate, die im Luziferase-Reportergen-Fusionstest eingesetzt worden
waren (siehe 3.2.3.2 und 3.2.4.2), auf die Expression von viralem HA und zellulärem Tubulin
mittels Western Blot analysiert. Den Proben wurde ebenfalls Benzonase (100 U/ml) und Proteaseinhibitor (1/10 Tablette/ml) zugefügt. Die Lagerung aller Lysate erfolgte bei -20°C.
2.2.2.2 Diskontinuierliche Proteinelektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel
Zur elekrophoretischen Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht wurde die
Methode von Lämmli (71) angewendet. Um die Proteine zu denaturieren, wurden die Zelllysate vor dem Gellauf in reduzierendem 1x Lämmlipuffer (siehe 2.1.12) für 5 min bei 95 °C
aufgekocht. Schließlich wurden sie auf diskontinuierliche Minigele aufgetragen, die aus
einem Trenngel (10%) (siehe 2.1.12) und einem Sammelgel (5%) (siehe 2.1.12) bestanden.
Die Gele wurden in einer mit 1x Laufpuffer gefüllten Bio-Rad Mini-Proteingel-Kammer eingesetzt. Die Elektrophorese fand für ca. 60 min bei einer Spannung von 150 V statt.
2.2.2.3 Western Blot
Die im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine (siehe 2.2.2.2) wurden in einer
Elektroblotting Apparatur auf eine PVDF-Membran transferiert. Hierzu wurde das Gel auf
eine zurechtgeschnittene Membran gelegt, die zuvor in Methanol aktiviert und mit
Transferpuffer (siehe 2.1.12) äquilibriert worden war. Gel und Membran wurden zwischen je
zwei mit Transferpuffer vollgesogenen Whatman-Papieren und Schwämmen eingebettet
(Abb. 4) und in die Blotting-Apparatur so eingesetzt, dass die negativ geladenen Proteine aus
47
Material und Methoden
dem Gel in Richtung Anode auf die Membran „geblottet“ wurden. Der Transfer erfolgte 2 h
bei 150 mA oder 1h bei 300mA.
Abb. 4: Aufbau einer Western Blot-Apparatur
Zum immunologischen Nachweis der transferierten Proteine wurde die Membran zunächst
über Nacht bei 4 °C oder 1 h bei RT in PBS-0,1% Tween-20 (PBS-T) mit 4% SlimFast
inkubiert, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu blockieren. Anschließend wurde
der Primärantikörper (siehe 2.1.1) in geeigneter Verdünnung in PBS-T mit 1% SlimFast für
90 min bei RT hinzugefügt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-T (3x 10 min) zur
Entfernung nichtgebundener Antikörper erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper
(siehe 2.1.1), ebenfalls in geeigneter Verdünnung in PBS-T mit 1% SlimFast für 1 h bei RT.
Die Membran wurde erneut mit PBS-T (2x 10 min) gewaschen. Nach einem letzten 10minütigen Waschschritt mit PBS wurde der HRP-gekoppelte Antikörper mit dem ECLReagenz gemäß der Anleitung des Herstellers sichtbar gemacht. Antikörper-Signale wurden
mit Hilfe eines Chemiedoc-Geräts (Bio-Rad) detektiert.
2.2.2.4 Feste-Phase-Enzym-Test zur Bestimmung der Rezeptoraffinität
(nach Gambaryan et al. (1992) (32))
ELISA 96-Lochplatten wurden mit dem Glykoprotein Fetuin (10 µg/ml in PBS) beschichtet.
Die Platten wurden 2 d bei 4 °C inkubiert und anschließend 6-mal mit Wasser gewaschen und
getrocknet. Die zu untersuchenden Viren wurden über ein Sucrose-Kissen aufgereinigt. Hierzu wurde die Virus enthaltende, aus Eiern gewonnene Allantoisflüssigkeit im Verhältnis 1:1
mit PBS gemischt und 15 min bei 4000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde
48
Material und Methoden
auf ca. 30 ml fassende Ultrazentrifugenröhrchen verteilt und mit 7 ml PBS-30% Sucrose
unterschichtet. Die Zentrifugation in der Ultrazentrifuge fand für 2 h bei 24.000 rpm und 4 °C
statt. Das Pellet wurde in 500 µl PBS-60% Glycerol gründlich resuspendiert.
Um die Viruskonzentration zu ermitteln, die im Test zur Bestimmung der Affinität für
verschiedene Sialinsäure-Konjugate eingesetzt werden sollte, wurde ein Vortest mit FetuinHRP durchgeführt: Von den gereinigten Viren wurde eine 1:2-Verdünnungsreihe in 0,1 M
Tris HCl pH 7,4 angelegt und je 50 µl/Loch auf die Fetuin beschichteten Platten übertragen.
Nach einstündiger Inkubation bei RT wurden die Platten dreimal mit PBS (200 µl/Loch)
gewaschen. Unspezische Bindungsstellen wurden durch Zugabe von PBS-0,05% BSA-NA
(100 µl/Loch) für 1 h bei RT geblockt. Es folgte zweimaliges Waschen mit Waschpuffer
(siehe 2.1.7) (200 µl/Loch). Schließlich wurde Fetuin-HRP (1:500 in Reaktionspuffer, siehe
2.1.7) (50 µl/Loch) für 1 h bei 4°C zugefügt. Danach wurde 5- bis 6-mal zügig mit auf Eis
vorgekühltem Waschpuffer (200-300 µl/Loch) gewaschen und HRP-Substrat zugefügt. Dieses
wurde 10 min vor der Anwendung durch Zugabe einer 1000er Pipettenspitze OPD zu 11 ml
0,05 M NaAcetat pH 5,2 vorbereitet. Kurz vor Substrateinsatz wurden 5 µl H2O2 beigemischt.
Das Zufügen des Substrats (100 µl/Loch) hatte eine gelbe Farbentwicklung zur Folge. Nach
ca. 15-30 min wurde die Reaktion mit 5% H2SO4 (50 µl/Loch) abgestoppt. Die Quantifizierung des Farbproduktes erfolgte durch Messung der Absorption bei 490 nm mit einem
3550 Microplate Reader (Bio-Rad).
In den folgenden Tests zur Bestimmung der Affinität der Viren für verschiedene SialinsäureKonjugate wurden die Viren in einer Verdünnung eingesetzt, bei welcher im Test mit FetuinHRP eine Absorption von ca. 1 erhalten worden war. Pro Virus wurde eine Spalte der Lochplatte (8 Löcher) verwendet. Die Inkubation der Fetuin-beschichteten Platten mit Virus und
das Blocken erfolgte wie im Test mit Fetuin-HRP.
Bei den getesteten Konjugaten handelte es sich um α2,3- bzw. α2,6-verknüpfte Sialinsäure
(2,3- bzw. 2,6-SA) enthaltendes, an HRP gekoppeltes Fetuin (2,3- bzw. 2,6-Fetuin-HRP)
sowie um Sialylglykopolymere, die aus 2,3-SA enthaltender 3’Sialyllaktose (3’SL) bzw. 2,6SA enthaltendem 6’Sialyl(N-Acetyllactosamin) (6’SLN) bestanden, welche in zahlreichen
Kopien auf einem Polyacrylsäure-Träger (PAA) befestigt waren. Die Sialylpolymere waren
zusätzlich an Biotin (biot) gekoppelt.
49
Material und Methoden
Die Konjugate wurden in Reaktionspuffer verdünnt: Für 2,3- und 2,6-Fetuin-HRP wurde eine
1:250-Verdünnung, für 3’SL-PAA-biot und 6’SLN-PAA-biot eine 1:100-Verdünnung hergestellt. Daraufhin wurde von dem jeweiligen verdünnten Konjugat eine 1:2-Verdünnungsreihe
in Reaktionspuffer angelegt und 50 µl/Loch auf die Platten übertragen. Im Fall von 2,3- und
2,6-Fetuin-HRP wurde weiterhin verfahren wie im Test mit Fetuin-HRP. Stattdessen wurde
nach Inkubation mit 3’SL-PAA-biot und 6’SLN-PAA-biot für 1 h bei 4 °C ImmunoPure®
Streptavidin HRP (1:500 in Reaktonspuffer) (50 µl/Loch) zugefügt. Danach wurde auch hier
wie im Test mit Fetuin-HRP verfahren.
Die Affinität der Viren für das jeweilige Konjugat wurde durch eine Affinitätskonstante (Kaff)
ausgedrückt. Zur Berechnung von Kaff wurden sogenannte Scatchard Plots erstellt. Hierbei
wurde A490/C auf der y-Achse und A490 auf der x-Achse aufgetragen, wobei C der Konzentration des Konjugates und A490 der Absorption bei 490 nm im zugehörigen Loch entsprach.
Kaff wurde durch Berechnung der Steigung der Geraden ermittelt. Für Kaff ergab sich die
Einheit „ml/U“ im Fall der Konjugate 2,3- und 2,6-Fetuin-HRP, deren Ausgangskonzentration als 1000 Units (U) pro ml festgelegt wurde (82), und „µM-1“ im Fall von 3’SL-PAAbiot und 6’SLN-PAA-biot, die eine Ausgangskonzentration von 100 µM besaßen.
50
Material und Methoden
2.2.3
Molekularbiologische Methoden
2.2.3.1 HA-Mutagenese: Mutagenese-PCR und Verdau mit LguI
Um gewünschte Nukleotidaustausche in den Vektor pDZ-Seg4 hvPR8 oder pDZ-Seg4 lvPR8
einzuführen, wurde zunächst mit zwei PCRs („polymerase chain reactions“) begonnen, deren
Ansatz im Folgenden aufgeführt ist. In PCR1 kamen der Mutagenese-Forward-Primer mit
dem Reverse-Primer #490, in PCR2 der Mutagenese-Reverse-Primer mit dem ForwardPrimer #491 zum Einsatz.
Ansatz (50 µl):
10 µl 5x Herkulase Puffer
1 µl Herkulase Polymerase
1,25 µl dNTP 10 mM
1,25 µl Forward-Primer 10 µM
5 min 94 °C
1 min 94 °C
30 sec 58 °C 30 Zyklen
1 min 64 °C
1,25 µl Reverse-Primer 10 µM
200 ng pDZ-Seg4 lv/hvPR8
10 min 64 °C
35,25 µl ddH2O
Nach Auftrennung der PCR-Produkte mittels Gel-Elektrophorese und anschließender Aufreinigung unter Verwendung des peqGOLD Gel Extraction Kits (siehe 2.1.13) wurden die
Produkte von PCR1 und 2, Fragment A und B im Verhältnis 1:1 in folgender PCR eingesetzt:
Ansatz (50 µl):
10 µl 5x Herkulase Puffer
1 µl Herkulase Polymerase
1,25 µl dNTP 10 mM
20 µl Fragment A+B
17,75 µl ddH2O
5 min 94 °C
1 min 94 °C
1 min 58 °C
10 Zyklen
2,5 min 64 °C
10 min 64 °C
51
Material und Methoden
Das aus Fragment A plus B entstandene Produkt wurde nach Zugabe von je 1,25 µl der
Primer #490 (10 µM) und #491 (10 µM) nach dem folgenden Protokoll amplifiziert:
5 min 94 °C
1 min 94 °C
30 sec 58 °C
20 Zyklen
2,5 min 64 °C
10 min 64 °C
Das entstandene PCR-Produkt wurde mittels Gel-Elektrophorese und unter Verwendung des
peqGOLD Gel Extraction Kits gereinigt. Das PCR-Produkt wurde dabei in 50 µl ddH2O
eluiert. Schließlich wurden der Vektor pDZ #3110 sowie das PCR-Produkt mit dem Enzym
LguI für 5 h bei 37 °C verdaut. Folgende Ansätze wurden verwendet:
4 µg pDZ #3110
25 µl PCR-Produkt
5 µl 10x Tango Puffer
5 µl 10x Tango Puffer
2 µl LguI
2,5 µl LguI
add 50 µl ddH2O
17,5 µl ddH2O
Der Ansatz mit dem verdauten Vektor wurde danach über Nacht bei 37 °C mit 2 µl CIAP
inkubiert. Die verdauten Proben wurden mittels Gel-Elektrophorese und und unter Verwendung des peqGOLD Gel Extraction Kits gereinigt. Das PCR-Produkt wurde dabei in 30 µl
ddH2O, der Vektor in 50 µl ddH2O eluiert. Die Ligation erfolgte gemäß 2.2.3.2.
52
Material und Methoden
2.2.3.2 HA-Mutagenese: Ligation und Transformation kompetenter Bakterienzellen
Das PCR-Produkt und der Vektor pDZ #3110 wurden nach dem Verdau mit LguI (siehe
2.2.3.1) 45 min bei RT nach folgendem Protokoll ligiert:
Ansatz (20 µl):
1 µl verdauter pDZ #3110
7 µl verdautes PCR-Produkt
4 µl Rapid Ligation Puffer 5x
1 µl Ligase
7 µl ddH2O
5 µl des Ligationsansatzes wurden 50 µl kompetenter XL1-Blue E.coli zugefügt und 30 min
auf Eis inkubiert. Danach wurde der Ansatz auf LB-Ampicillin-Agarplatten ausgestrichen und
über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die gewachsenen Bakterienkolonien wurden gepickt und in
LB-Ampicillin-Medium kultiviert. Die Isolierung der Plasmid-DNA aus den Bakterien wurde
gemäß 2.2.3.3 durchgeführt.
2.2.3.3 Präparation von Plasmid-DNA
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien fand mit Hilfe des peqGOLD Plasmid
Miniprep Kit I bzw. dem Plasmid Midi/Maxi Prep Kit NucleoBond (siehe 2.1.13) statt.
53
Material und Methoden
2.2.4
Tierexperimentelle Methoden
2.2.4.1 Virus-Rescue: Virusanzucht in bebrüteten Hühnereiern
Die geernteten, virushaltigen Überstände transfizierter Zellen (siehe 2.2.1.9) bzw. die bei der
Plaque-Reinigung in 600 µl PBS-0,3% BSA aufgenommenen, virushaltigen Agarstückchen
(siehe 2.2.1.10) wurden zur Virusvermehrung in Hühnereiern eingesetzt. Dabei wurden die
Zellüberstände zunächst 5 min bei 2000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. 150 µl der
Zellüberstände bzw. der 600 µl aus der Plaque-Reinigung hervorgehenden Viruslösungen
wurden in 8-10 d alte bebrütete Hühnereier injiziert. Nach 48-stündiger Inkubation im
Brutschrank bei 37 °C, 95% relativer Luftfeuchte und 5% CO2 wurden die Eier zum Abtöten
der Hühnerembryonen über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde die Allantoisflüssigkeit
geerntet. Die nach Injektion der Zellüberstände gewonnene Allantoisflüssigkeit (1. Eipassage)
wurde im Plaque Assay zur Plaque-Reinigung (siehe 2.2.1.10) eingesetzt, die nach Injektion
der Viruslösungen der Plaque-Reinigung gewonnene Allantoisflüssigkeit (2. Eipassage) wurde hinsichtlich ihres Virustiters mittels Immunfluoreszenz (siehe 2.2.1.5) geprüft und im Fall
eines ausreichend hohen Titers aliquotiert und bei -80 °C für folgende Experimente mit den
Viren weggefroren.
2.2.4.2 Infektion von Mäusen
Die zu verabreichenden Viren wurden in PBS-0,3% BSA verdünnt. Die Mäuse wurden durch
intraperitoneale Injektion der in 2.1.14 aufgeführten Ketamin-Xylazine-Narkosemischung mit
einer Dosis von 10 µl pro Gramm Körpergewicht betäubt. Die Infektion erfolgte intranasal
mit 50 µl der Viruslösung.
2.2.4.3 Ermittlung der LD50 von Viren in Mäusen
Die Mäuse wurden wie unter 2.2.4.2 beschrieben infiziert. Schließlich wurde ihr Gewicht
über mehrere Tage beobachtet und protokolliert. Bei deutlichen Krankheitssymptomen wie
Apathie, struppigem Fell, eingefallenen Flanken und Gewichtsverlust ≥ 30% wurden die Tiere
durch eine Überdosis des Inhalationsnarkotikums Isofluran getötet. Die LD50 wurde nach
Reed und Muench (1938) ermittelt (115).
54
Material und Methoden
2.2.4.4 Lungenentnahme für die Virustitration
Die Mäuse wurden, wie bereits in 2.2.4.3 beschrieben, getötet. Anschließend wurden die
Arteriae subclaviae angeschnitten, was das Ausbluten der Tiere zur Folge hatte. Nach ein paar
Minuten wurden die Lungen entnommen und in einem Eppendorfröhrchen in flüssigem
Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Lungen erfolgte bei -80 °C.
2.2.4.5 Gewinnung von Lungenhomogenaten für die Virustitration
Die gefrorenen Mauslungen (Lungenentnahme siehe 2.2.4.4) wurden mit Hilfe eines Pistills
in Mörsern mit drei Spatelspitzen Quarzsand unter Zugabe von flüssigem Stickstoff zerrieben
und in PBS zu einem Homogenat verarbeitet. Nach 5-minütiger Zentrifugation der Proben bei
4 °C und 2000 rpm wurde der Überstand abgenommen und bis zur Durchführung der
Virustitration (siehe 2.2.1.5) bei -80 °C gelagert.
2.2.4.6 Lungenentnahme für die Anfertigung von Paraffinschnitten
Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von 2 ml der in 2.1.14 aufgeführten
Ketamin-Xylazine-Narkosemischung getötet. Anschließend wurde die Aorta angeschnitten,
was das Ausbluten der Tiere zur Folge hatte. Lunge und Luftröhre wurden freigelegt. Die
Luftröhre wurde im oberen Teil abgeklemmt. Unterhalb der Abklemmung wurden 1-1,5 ml
PBS-4% Formaldehyd, pH 7,0 in die Luftröhre injiziert, was ein Aufblähen der Lunge
bewirkte. Zwischen Einstichstelle und Lunge, am untersten sichtbaren Bereich der Luftröhre,
wurde diese abgebunden. Die aufgeblähte Lunge wurde herausgetrennt und in PBS-4%
Formaldehyd, pH 7,0 bei 4 °C über Nacht inkubiert. Die Weiterverarbeitung erfolgte nach
2.2.5.1.
55
Material und Methoden
2.2.5
Färbung von Lungen-Paraffinschnitten
2.2.5.1 Anfertigung von Lungen-Paraffinschnitten
Die fixierten Lungen (siehe 2.2.4.6) wurden in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden mit
Hilfe eines Mikrotoms (RM 2155, Leica) 5 µm dünne Schnitte angefertigt.
2.2.5.2 Doppelfärbung von Lungen-Paraffinschnitten
Die Schnitte wurden mit Hilfe der im Folgenden aufgeführten Alkoholreihe in die wässrige
Phase überführt:
5 min Xylol
5 min Xylol
5 min Ethanol 100%
5 min Ethanol 100%
5 min Ethanol 95%
5 min Ethanol 70%
5 min Ethanol 50%
Nach 5-minütigem Waschen mit PBS wurden die Schnitte zur Permeabilisierung in PBS0,1% Triton X-100 5 min inkubiert. Nach erneutem 5-minütigem Waschen mit PBS wurden
unspezifische Bindungsstellen mit Ziegenserum (1:100 in PBS) 30 min bei RT geblockt
(Block-Lösung). Nach diesem und den nachfolgenden Schritten wurde jeweis dreimal 5 min
mit PBS gewaschen.
Um Typ I-Pneumozyten und Virus bzw. Typ II-Pneumozyten und Virus nachzuweisen,
wurden als Primärantikörper folgende Kombinationen eingesetzt:
A) Monoklonaler Hamster anti-Podoplanin Antikörper #181 (1 :1000 in Block-Lösung)
B) Polyklonales Mensch anti-Influenza-A-Virus Serum (1:100 in Block-Lösung)
bzw.
C) Polyklonales Kaninchen anti-pro-Surfactant Protein-C Serum #188
(1:100 in Block-Lösung)
D) Polyklonales Mensch anti-Influenza-A-Virus Serum (1:100 in Block-Lösung)
56
Material und Methoden
Als Sekundärantikörper wurden verwendet :
A) Ziege anti-Hamster Cy3 #1050 (1:500 in Block-Lösung)
B) Ziege anti-Mensch DTAF #1041 (1:100 in Block-Lösung)
bzw.
C) Esel anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 #1008 (1:500 in Block-Lösung)
D) Ziege anti-Mensch DTAF #1041 (1:100 in Block-Lösung)
Die Inkubation erfolgte für Primär- und Sekundärantikörper je 1 h bei RT, im Fall des
Sekundärantikörpers unter Lichtausschluss. Nach einer letzten Waschrunde wurden die
Objektträger kurz in H2O dest. gehalten. Schließlich wurde ein Tropfen Fluor SaveTM Reagent
und ein Deckglas auf die Schnitte gegeben. Die Schnitte wurden mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (Axioplan2 Imaging, Zeiss) analysiert.
57
Ergebnisse
3
Ergebnisse
Dieser Doktorarbeit gingen Studien voraus, in denen Daniel Grimm während seiner Medizinischen Doktorarbeit die viralen Glykoproteine und die virale Polymerase als wichtige
Virulenzfaktoren des Virus hvPR8 identifizierte (40). (Die Ergebnisse der Studien von Daniel
Grimm sind in der Einleitung zusammengefasst.)
Der erste Teil meiner Arbeit beschreibt die weiterführenden Untersuchungen zur Bestimmung
des Beitrags der Polymerase zur Virulenz von hvPR8. Nachdem ich anfänglich allein dieses
Thema bearbeitet hatte, stieg Thierry Rolling in das Polymerase-Projekt mit ein. Er führte die
im Folgenden geschilderten Untersuchungen zur Polymerase im Rahmen seiner Medizinischen Doktorarbeit durch, wobei ich ihn durch meine Mithilfe unterstützte. In 3.1 möchte
ich die aus den Studien hervorgehenden, bereits veröffentlichten Ergebnisse (119) in Kürze
beschreiben.
Grimm et al. (2007) zeigten, dass neben der viralen Polymerase auch die viralen Glykoproteine für die Virulenz von hvPR8 von Bedeutung sind. Dabei wiesen Studien der LD50 in
Mx1+/+-Mäusen darauf hin, dass die Neuraminidase (NA) eine untergeordnete Rolle spielt,
während dem Hämagglutinin (HA) eine größere Bedeutung zukommt (siehe 1.3.6). Den
Schwerpunkt meiner Doktorarbeit bildete die Untersuchung der Bedeutung des HA-Proteins
für die Virulenz von hvPR8. Diese Studien werden als Hauptteil unter 3.2 ausgeführt.
58
Ergebnisse
3.1
Bedeutung der Polymeraseproteine für die Virulenz von
hvPR8
3.1.1
Beitrag der Polymeraseuntereinheiten zur Virulenz von hvPR8
Um zu analysieren, welche Rolle die Polymeraseunterheiten PB2, PB1 und PA für die
Virulenz von hvPR8 spielen, wurde ihr Beitrag zur Aktivität des Polymerasekomplexes im
Minireplikonsystem, ihr Einfluss auf die Virusvirulenz in Mx1+/+-Mäusen sowie auf die
Virusreplikation in Mx1-/--Mäusen bestimmt.
3.1.1.1 Polymeraseaktivität
Zur Untersuchung des Beitrags von PB2, PB1 und PA zur Polymeraseaktivität von hvPR8,
wurde die Aktivität von Polymerasekomplexen, die aus verschiedenen Kombinationen der
Polymeraseuntereinheiten von lvPR8 oder hvPR8 bestanden, in einem Minireplikonsystem in
murinen L929-Zellen ermittelt. Dabei wurden die Zellen mit Expressionsplasmiden für PB2,
PB1 und PA sowie für das virale Nukleoprotein (NP) transfiziert. Als Reportergen-Konstrukt
wurde ein influenzavirusähnliches Minigenom, das ein Firefly-Luziferase-Gen beeinhaltete,
verwendet. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert, und es wurde die Aktivität der Firefly-Luziferase, als Maß für die Polymeraseaktivität, bestimmt. Es zeigte sich, dass hauptsächlich PB2
und zu einem geringeren Maß PA für eine erhöhte Polymeraseaktivität von hvPR8 verantwortlich sind (Abb. 5). Dieses Ergebnis wurde unabhängig von der Herkunft des NP-Proteins
Relative Aktivität [x-fach]
(hvPR8/lvPR8) erhalten (119).
Abb. 5: PB2 und PA vermitteln die erhöhte
Polymeraseaktivität von hvPR8. L929-Zellen
wurden mit einem Firefly-Luziferase kodierenden
viralen Minigenomkonstrukt, einem Renilla-Luziferase kodierenden Kontrollplasmid und Expressionsplasmiden für NP von lvPR8 sowie für PB2,
PB1 und PA von lvPR8 („L“) oder hvPR8 („H“)
transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert,
und die Aktivitäten der Firefly- und Renilla-Luziferase wurden bestimmt. Die Firefly-LuziferaseWerte wurden mit den Renilla-Luziferase-Werten
normalisiert. Der erzielte Wert des Polymerasekomplexes, bestehend aus den Polymeraseuntereinheiten von lvPR8, wurde auf 1 gesetzt. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten. Die Aktivitäten der Polymerasekomplexe mit PB2 bzw. PA von hvPR8 waren
im Vergleich zur Aktivität des Komplexes mit
den Untereinheiten von lvPR8 signifikant erhöht.
(P < 0,02 nach GraphPad QuickCalcs: t test
calculator).
59
Ergebnisse
3.1.1.2 LD50 in Mx1+/+-Mäusen
Um den Einfluss der Polymeraseunterheiten auf die Virusvirulenz in Mx1+/+-Mäusen zu
untersuchen, wurden reassortante Viren hergestellt, deren Segmente 1 bis 3, die für die Polymeraseproteine kodieren, von lvPR8 oder hvPR8 stammten. In Segment 4 bis 8 stimmten alle
reassortanten Viren überein. Sie besaßen die für die Glykoproteine kodierenden Segmente 4
und 6 von hvPR8 und die restlichen Segmente von lvPR8 (Abb. 6). Diese Hintergrundkonstellation wurde gewählt, da in Grimm et al. (2007) beobachtet worden war, dass der
Einfluss der Polymeraseproteine auf die Virulenz von hvPR8 nur nachgewiesen werden kann,
wenn ein Virus mit den Glykoproteinen von hvPR8 ausgestattet ist. Schließlich wurden die
hergestellten Viren hinsichtlich ihrer LD50 in Mx1+/+-Mäusen untersucht. Abb. 6 zeigt die
schematisch dargestellten Viren, die jeweils eine Polymeraseuntereinheit von hvPR8 besaßen,
mit ihren LD50-Werten. Als Vergleichsvirus diente lvPR/hvHN (in Rolling et al. (2009) mit
„hvHN“ abgekürzt), dessen Polymeraseproteine sich von lvPR8 ableiteten. Seine LD50 betrug
2x104 ffu (Abb. 6). Ein Austausch von lvPB2 zu hvPB2 in lvPR/hvHN ließ die LD50 des
resultierenden Virus hvHN+hvPB2 von 2x104 ffu auf <102 ffu absinken. Damit erreichte
dieses Virus die LD50 von hvHN+hvPPP, bei dem alle Polymeraseproteine von hvPR8
stammten. Ein Austausch von lvPA zu hvPA in lvPR/hvHN führte auch zu einem Absinken
der LD50, allerdings nur auf 5x102 ffu (hvHN+hvPA). Im Gegensatz dazu erhöhte ein
Austausch von lvPB1 zu hvPB1 in lvPR/hvHN die LD50 auf 2,5x105 ffu (hvHN+hvPB1).
60
Ergebnisse
Virussegment
LD50 [ffu]
1
2
3
4
5
6
7
8
lvPR/hvHN (hvHN)
lv
lv
lv
hv
lv
hv
lv
lv
2x104
hvHN+hvPB2
hv
lv
lv
hv
lv
hv
lv
lv
<102
hvHN+hvPB1
lv
hv
lv
hv
lv
hv
lv
lv
2,5x105
hvHN+hvPA
lv
lv
hv
hv
lv
hv
lv
lv
5x102
hvHN+hvPPP
hv
hv
hv
hv
lv
hv
lv
lv
<102
Abb. 6: hvPB2 und hvPA sind für die Virusvirulenz in Mx1+/+-Mäusen entscheidend. Durch Infektion mit
verschiedenen Dosen der aufgeführten Viren mit Austauschen in ihren Polymeraseproteinen wurde die LD50 der
Viren in Mx1+/+-Mäusen ermittelt. Die Zusammensetzung der Gensegmente der jeweiligen Viren ist durch rote
bzw. blaue Kästen dargestellt, die Segmente von hvPR8 bzw. lvPR8 symbolisieren. Die Tiere wurden getötet,
wenn sie starke Krankheitssymptome zeigten oder einen Gewichtsverlust von ≥30% aufwiesen.
3.1.1.3 Virusreplikation in Mx1-/--Mäusen
Neben der LD50 in Mx1+/+-Mäusen wurde auch die Virusreplikation in den Lungen von
Mx1-/--Mäusen nach Infektion mit den bereits beschriebenen Viren mit den Polymeraseuntereinheiten von lvPR8 oder hvPR8 ermittelt. Durch den Einsatz von Mx1-/--Mäusen konnte die
Virusreplikation unabhängig von dem Einfluss des Mx1-Systems untersucht werden. Die
Tiere wurden mit 1000 ffu der Viren intranasal infiziert. 20 h nach der Infektion wurden die
Lungen entnommen und hinsichtlich ihres Virustiters untersucht. Es stellte sich heraus, dass
eine inverse Korrelation zwischen den ermittelten Lungenvirustitern und den LD50-Werten
der entsprechenden Viren besteht (Abb. 7).
61
lv
PR
/h
vH
N
(h
vH
N)
Virustiter [log10 ffu/ml]
Ergebnisse
Abb. 7: hvPB2 und hvPA vermitteln eine erhöhte
Virusreplikation in der Mauslunge. Mx1-/--Mäuse
wurden mit 1000 ffu der Viren lvPR/hvHN,
hvHN+hvPB2, hvHN+hvPB1 bzw. hvHN+hvPA
infiziert. Nach 20 h wurden die Lungen der Tiere
entnommen und bezüglich ihres Virustiters untersucht. Der Virusnachweis erfolgte mit einem virusspezifischen Serum mittels Immunfluoreszenz. Jeder
Kreis repräsentiert den Virustiter der Lunge eines
Tieres. Die horizontalen Balken geben die Mittelwerte der Virustiter der jeweiligen Tiergruppen an.
Die Titer der Viren unterschieden sich signifikant in
Bezug auf den Titer des Kontrollvirus lvPR/hvHN
(P ≤ 0,01 nach GraphPad QuickCalcs: t test
calculator). Die gepunktete Linie kennzeichnet die
Nachweisgrenze von 200 ffu pro ml Lungenextrakt.
Der Pfeil weist darauf hin, dass der betreffende
Virustiter unter der Nachweisgrenze lag.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass PB2 und zu einem geringeren Anteil PA für die
Polymerasaktivität und die Virulenz von hvPR8 in Mx1+/+-Mäusen entscheidend sind.
3.1.2
Identifizierung der für die Virulenz von hvPR8 entscheidenden
Aminosäuren in PB2 und PA
Nachdem die für die Virulenz von hvPR8 kritischen Polymeraseuntereinheiten PB2 und PA
identifiziert worden waren, stellte sich die Frage, welche Aminosäuren in PB2 bzw. PA die
Virulenz fördernden Eigenschaften der beiden Polymeraseuntereinheiten vermitteln. Die
Fragestellung wurde durch Einführung gezielter Mutationen in PB2 bzw. PA und eine anschließende Analyse des Einflusses der Mutationen auf die Polymerasaktivität und die Virulenz in der Maus untersucht.
3.1.2.1 Polymeraseaktivität
Beim Sequenzvergleich von hvPR8 mit lvPR8 wurden drei Aminosäureunterschiede in PB2
(I105M, N456D und I504V) und zwei Aminosäureunterschiede in PA (Q193H und I550L)
nachgewiesen. Jeweils eine der kritischen Aminosäuren wurde in lvPB2 bzw. lvPA ausgetauscht. Anschließend wurden Polymerasekomplexe, die das mutierte lvPB2 bzw. lvPA enthielten, auf ihre Aktivität im Minireplikonsystem in L929-Zellen getestet (Abb. 8).
62
Ergebnisse
Im Fall von PB2 erzielte der Polymerasekomplex, der lvPB2 mit der I504V-Mutation enthielt,
nahezu eine gleich hohe Aktivität wie der Komplex mit hvPB2. Bildete lvPB2 mit den Mutationen N456D bzw. I105M einen Teil des Polymerasekomplexes, konnte, verglichen mit dem
Komplex, der lvPB2 ohne Mutationen enthielt, kein Anstieg in der Aktivität festgestellt werden.
Im Fall von PA handelt es sich bei dem Austausch I550L um die entscheidende Mutation. Der
Polymerasekomplex, der lvPA mit der I550L-Mutation beeinhaltete, erreichte die Aktivität
des Komplexes mit hvPA, während die Q193H-Mutation in lvPA keinen signifikanten Effekt
Relative Aktivität [x-fach]
zeigte.
Abb. 8: Die Aminosäureaustausche I504V in
PB2 und I550L in PA sind für eine hohe Polymeraseaktivität entscheidend. L929-Zellen wurden mit verschiedenen Kombinationen an Expressionsplasmiden für die Polymeraseuntereinheiten
von lvPR8 („L“), hvPR8 („H“) und sich von lvPR8
ableitendes PB2 bzw. PA mit den angegebenden
Aminosäureaustauschen transfiziert. Die Aktivität
der entstehenden Polymerasekomplexe wurde wie
zuvor beschrieben (siehe Legende von Abb. 5)
ermittelt. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte von
drei unabhängigen Experimenten. Beim Vergleich
der Aktivitäten der Polymerasekomplexe mit
lvPB2(I504V) bzw. lvPA(I550L) mit der Aktivität
des Komplexes bestehend aus den Untereinheiten
von lvPR8 ergaben sich P-Werte von 0,0597 bzw.
0,0392 (nach GraphPad Quick Calcs: t test
calculator).
3.1.2.2 LD50 in Mx1+/+-Mäusen
Um zu erfahren, ob die für die Polymeraseaktivität kritischen Aminosäureaustausche I504V
in PB2 und I550L in PA auch für die Virusvirulenz in Mx1+/+-Mäusen entscheidend sind,
wurden Viren mit dem mutierten lvPB2 bzw. lvPA in Kombination mit den verbleibenden
Segmenten in der Konstellation des Virus lvPR/hvHN hergestellt. Anschließend wurde die
LD50 der resultierenden Viren hvHN+lvPB2(I504V) sowie hvHN+lvPA(I550L) in Mx1+/+Mäusen ermittelt. Beide Viren erreichten nahezu die LD50-Werte der Reassortanten, die
hvPB2 bzw. hvPA enthielten (Abb. 9, Vergleich hvHN+lvPB2(I504V) mit hvHN+hvPB2
bzw. hvHN+lvPA(I550L) mit hvHN+hvPA).
63
Ergebnisse
Virussegment
LD50 [ffu]
1
2
3
4
5
6
7
8
lvPR/hvHN (hvHN)
lv
lv
lv
hv
lv
hv
lv
lv
2x104
hvHN+hvPB2
hv
lv
lv
hv
lv
hv
lv
lv
<102
X
lv
lv
hv
lv
hv
lv
lv
102
hvHN+lvPB2(I504V)
X
= I504V
hvHN+hvPA
lv
lv
hv
hv
lv
hv
lv
lv
5x102
hvHN+lvPA(I550L)
lv
lv
X
hv
lv
hv
lv
lv
6x102
X
= I550L
Abb. 9: Die Aminosäureaustausche I504V in PB2 und I550L in PA vermitteln eine hohe Virusvirulenz in
Mx1+/+-Mäusen. Durch Infektion mit verschiedenen Dosen der aufgeführten Reassortanten, darunter die Viren
mit Austauschen in ihren Polymeraseproteinen sowie mit Einzel-Aminosäureaustauschen in PB2 bzw. PA,
wurde die LD50 der Viren in Mx1+/+-Mäusen ermittelt. Die Durchführung des Experimentes entsprach derjenigen
der in 3.1.1.2 beschriebenen LD50-Bestimmung (siehe Legende von Abb. 6). Die Zusammensetzung der Gensegmente der jeweiligen Viren ist durch rote bzw. blaue Kästen dargestellt, die Segmente von hvPR8 bzw. lvPR8
symbolisieren. Das rot unterlegte „X“ symbolisiert einen Aminosäureaustausch von lv nach hv an den angegebenen Aminosäurepositionen.
3.1.2.3 Virusreplikation in Mx1-/--Mäusen
Um die Virusreplikation in der Lunge von Mäusen zu ermitteln, wurden, wie für die Viren
mit den Austauschen in den Polymeraseuntereinheiten beschrieben, Mx1-/--Mäuse mit einer
Dosis von 1000 ffu der Viren hvHN+lvPB2(I504V) sowie hvHN+lvPA(I550L) infiziert. Nach
20 h wurden die Lungenvirustiter bestimmt. Es zeigte sich, dass sich die Viren nicht nur in
Bezug auf ihre LD50 sondern auch bezüglich der erreichten Titer in der Mauslunge sehr
ähnlich wie die Viren hvHN+hvPB2 bzw. hvHN+hvPA verhielten (Abb. 10).
64
Abb. 10: Die Aminosäureaustausche I504V in
PB2 und I550L in PA sind für eine hohe Virusreplikation in der Mauslunge entscheidend. Mx1-/-Mäuse wurden mit 1000 ffu der Viren lvPR/hvHN,
hvHN+hvPB2, hvHN+lvPB2(I504V), hvHN+hvPA
bzw. hvHN+lvPA(I550L) infiziert. Nach 20 h wurden die Lungen der Tiere entnommen und bezüglich
ihres Virustiters untersucht. Der Virusnachweis erfolgte mit einem virusspezifischen Serum mittels
Immunfluoreszenz. Jeder Kreis repräsentiert den
Virustiter der Lunge eines Tieres. Die horizontalen
Balken geben die Mittelwerte der Virustiter der
jeweiligen Tiergruppen an. Die Titer der Viren
unterschieden sich signifikant in Bezug auf den Titer
des Kontroll-virus lvPR/hvHN (P ≤ 0,01 nach
GraphPad Quick Calcs: t test calculator).
lv
PR
/
hv
HN
(h
vH
N)
Virustiter [log10 ffu/ml]
Ergebnisse
Bei den Mutationen I504V in PB2 und I550L in PA handelt es sich somit um die entscheidenden Virulenz steigernden Aminosäureaustausche, die in der Lage sind, die virale Polymeraseaktivität zu erhöhen.
3.1.3
Herstellung neuer Viren mit erhöhter Virulenz in Mx1+/+-Mäusen
Schließlich interessierte uns, ob die beobachteten Aminosäureaustausche I504V in PB2 und
I550L in PA bei einer erneuten Durchführung von Passagen eines niedrigvirulenten PR8
Virus in der Maus wieder auftreten würden. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wählten
wir als Ausgangsvirus hvPR/lvPPP (PR) mit einer LD50 von 1x104 ffu (Abb. 11). Während
die Segmente 4 bis 8 bei diesem Virus von hvPR8 stammten und somit bereits eine
Anpassung an die Mx1+/+-Maus erfahren hatten, leiteten sich Segment 1 bis 3 des Virus von
lvPR8 ab und wurden deshalb als besonders empfänglich für Virulenz steigernde Mutationen
eingeschätzt. Zwei unabhängige Passagierungs-Experimente wurden in Mx1+/+-Mäusen
durchgeführt. Die daraus hervorgehenden Viren PR-ma1 und PR-ma2 bewiesen mit LD50Werten von <102 ffu und 3x102 ffu eine hohe Virulenz (Abb. 11). Die Sequenzierung der
gesamten kodierenden Regionen von PR-ma1 und PR-ma2 und der anschließende Vergleich
mit der Sequenz von PR ergab, dass in Segment 1 von PR-ma1 ein Aminosäureaustausch
65
Ergebnisse
I504V stattgefunden hatte, während es in PR-ma2 zu zwei Mutationen gekommen war,
K208R in PB1 und E349G in PA. In PR-ma1 war somit derselbe Aminosäureaustausch aufgetreten wie in hvPR8. Dieser konnte, wie bereits in 3.1.2 geschildert, die Virulenz entscheidend
steigern.
LD50 [ffu]
Virussegment
hvPR/lvPPP (PR)
1
2
3
4
5
6
7
8
lv
lv
lv
hv
hv
hv
hv
hv
1x104
PR-ma1
<102
PR-ma2
3x102
Abb. 11: Die Passagierung des Virus PR in Mx1+/+-Mäusen bringt Viren mit erhöhter Virulenz hervor. In
zwei unabhängigen Experimenten wurde das Virus PR in Mx1+/+ -Mäusen passagiert. Durch Infektion mit verschiedenen Dosen der aus den Passagierungen hervorgehenden Viren PR-ma1 und PR-ma2 wurde die LD50 der
Viren in Mx1+/+-Mäusen ermittelt. Die Durchführung des Experimentes entsprach derjenigen der in 3.1.1.2
beschriebenen LD50-Bestimmung (siehe Legende von Abb. 6). Die Abbildung zeigt die Zusammensetzung der
Gensegmente der jeweiligen Viren aus roten bzw. blauen Kästen, die Segmente von hvPR8 bzw. lvPR8 symbolisieren, bzw. aus braunen und gelben Kästen, die Segmente von PR-ma1 bzw. PR-ma2 darstellen.
66
Ergebnisse
3.1.3.1 Rolle der Aminosäureaustausche in PB1 und in PA des Virus PR-ma2
Welche Rolle die Aminosäureaustausche K208R in PB1 und E349G in PA des Virus PR-ma2
spielen, wurde erneut im Minireplikonsystem zur Bestimmung der Polymeraseaktivität und in
Mausstudien zur Ermittlung der LD50 und der Virusreplikation analysiert.
Wurden die Austausche K208R in lvPB1 bzw. E349G in lvPA eingebracht und diese
mutierten Untereinheiten als Bestandteil von Polymerasekomplexen im Minireplikonsystem
getestet, so führten jeweils beide Austausche zu einer Erhöhung der Polymeraseaktivität.
Wurde lvPB1(K208R) mit lvPA(E349G) im Polymerasekomplex kombiniert, so erreichte
dieser die Aktivität des Komplexes, bestehend aus den Polymeraseuntereinheiten von hvPR8
Relative Aktivität [x-fach]
(Abb. 12).
Abb. 12: Die Aminosäureaustausche K208R in
lvPB1 und E349G in lvPA vermitteln eine erhöhte
Polymeraseaktivität. L929-Zellen wurden mit verschiedenen Kombinationen an Expressionsplasmiden
für die Polymeraseuntereinheiten von lvPR8 („L“),
hvPR8 („H“) und sich von lvPR8 ableitendes PB1
bzw. PA mit den angegebenden Aminosäureaustauschen transfiziert. Die Aktivität der entstehenden Polymerasekomplexe wurde wie zuvor beschrieben (siehe Legende von Abb. 5) ermittelt. Die Abbildung
zeigt die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten. Die Aktivitäten der Polymerasekomplexe
lvPB1(K208R), lvPA(E349G) bzw. lvPB1(K208R) +
lvPA(E349G) waren im Vergleich zur Aktivität des
Komplexes mit den Untereinheiten von lvPR8 signifikant erhöht. (P < 0,05 nach GraphPad QuickCalcs: t
test calculator).
Als nächster Schritt wurden Viren mit lvPB1(K208R) und/oder lvPA(E349G) in Kombination
mit den verbleibenden Segmenten in der Konstellation des Virus hvPR/lvPPP (PR) hergestellt. Beide Aminosäureaustausche, K208R in lvPB1 als auch E349G in lvPA, führten zu
einem Absinken in der LD50 in Mx1+/+-Mäusen, wobei die Mutation E349G einen größeren
Effekt zeigte (Abb. 13, siehe Virus PB1(K208R) und Virus PA(E349G)). Das Virus, in dem
beide Mutationen in Kombination vorlagen (abgekürzt PB1(K208R)PA(E349G)), erzielte mit
3x102 ffu den LD50-Wert von PR-ma2.
67
Ergebnisse
LD50 [ffu]
Virussegment
hvPR/lvPPP (PR)
1
2
3
4
5
6
7
8
lv
lv
lv
hv
hv
hv
hv
hv
PR-ma2
PB1(K208R)
PA(E349G)
PB1(K208R)
1x104
3x102
lv
lv
lv
X
lv
X
= K208R
lv
X
hv
hv
hv
hv
hv
3x102
X
hv
hv
hv
hv
hv
5x102
X
= E349G
X
hv
hv
hv
hv
hv
3x102
PA(E349G)
X
=
X
K2 = E3
08
49
R
G
Abb. 13: Die Aminosäureaustausche K208R in lvPB1 und E349G in lvPA sind entscheidend für eine hohe
Virusvirulenz in Mx1+/+-Mäusen. Durch Infektion mit verschiedenen Dosen der Viren mit Aminosäureaustauschen in lvPB1 bzw. lvPA wurde die LD50 der Viren in Mx1+/+-Mäusen ermittelt. Die Durchführung des
Experimentes entsprach derjenigen der in 3.1.1.2 beschriebenen LD50-Bestimmung (siehe Legende von Abb. 6).
Die Zusammensetzung der Gensegmente der jeweiligen Viren ist durch rote bzw. blaue Kästen dargestellt, die
Segmente von hvPR8 bzw. lvPR8 symbolisieren, bzw. aus gelben Kästen, die Segmente von PR-ma2 darstellen.
Das gelb unterlegte „X“ symbolisiert einen Aminosäureaustausch von lv zu der Aminosäure von PR-ma2 an den
aufgeführten Aminosäurepositionen.
In Einklang mit diesen Ergebnissen steht, dass nach Infektion von Mx1-/--Mäusen bei den
Viren, welche K208R in lvPB1 bzw. E349G in lvPA besaßen, erhöhte Lungenvirustiter im
Vergleich zu hvPR/lvPPP (PR) festgestellt wurden. Wurden beide Mutationen kombiniert,
erreichte das betreffende Virus ungefähr denselben Titer, der bei PR-ma2 beobachtet wurde
(Abb. 14).
68
Virustiter [log10 ffu/ml]
Ergebnisse
P
PP
v
/l
PR
v
h
R)
(P
Abb. 14: Die Aminosäureaustausche K208R in
PB1 und E349G in PA vermitteln eine hohe
Virusreplikation in der Mauslunge. Mx1-/-Mäuse wurden mit 1000 ffu der Viren
hvPR/lvPPP (PR), PR-ma2, PB1(K208R),
PA(E349G) bzw. PB1(K208R)PA(E349G) infiziert. Nach 20 h wurden die Lungen der Tiere
entnommen und bezüglich ihres Virustiters
untersucht. Der Virusnachweis erfolgte mit einem virusspezifischen Serum mittels Immunfluoreszenz. Jeder Kreis repräsentiert den Virustiter der Lunge eines Tieres. Die horizontalen
Balken geben die Mittelwerte der Virustiter der
jeweiligen Tiergruppen an. Die Titer der Viren
unterschieden sich signifikant in Bezug auf den
Titer des Kontrollvirus lvPR/hvHN (P ≤ 0,01
nach GraphPad QuickCalcs: t test calculator).
Diese Ergebnisse zeigen, dass neben den Austauschen I504V in PB2 und I550L in PA auch
die Mutationen K208R in PB1 und E349G in PA eine Steigerung der Virusvirulenz in der
Maus und eine Erhöhung der Polymeraseaktivität bewirken.
Es schließt sich die Frage an, welche Virulenz fördernden Eigenschaften der Polymeraseuntereinheiten durch die beschriebenen kritischen Aminosäureaustausche vermittelt werden,
d. h. welcher molekulare Mechanismus der Virulenz zu Grunde liegt. Petra Zimmermann
bearbeitet dieses Thema momentan im Rahmen ihrer Doktorarbeit und führt somit das Polymerase-Projekt weiter.
Die LD50-Studien mit reassortanten Viren in Mx1+/+-Mäusen von Grimm et al. (2007) bringen
eine weitere wichtige Frage auf, deren Untersuchung den Schwerpunkt dieser Arbeit bildete:
Welche Rolle spielt der zweite entscheidende Virulenzfaktor von hvPR8, das HA, das im
Zusammenwirken mit NA erst ermöglicht, dass die Polymeraseproteine ihre Virulenz fördernde Wirkung ausüben können?
69
Ergebnisse
3.2
Bedeutung des Hämagglutinins für die Virulenz von hvPR8
Neben der viralen Polymerase wurden die viralen Glykoproteine HA und NA als Virulenzfaktoren von hvPR8 identifiziert, wobei LD50-Studien mit reassortanten Viren in Mx1+/+Mäusen zeigten, dass HA im Vergleich zu NA die entscheidendere Rolle zukommt (siehe
1.3.6, (40)). Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Bedeutung von HA für die Virulenz von
hvPR8 genauer zu untersuchen. Da das Wirken von HA und NA aufeinander abgestimmt ist
(151), kamen in den Experimenten Viren zum Einsatz, bei welchen sich HA und NA von
demselben Virus (hvPR8 oder lvPR8) ableiteten.
3.2.1
Einfluss der Glykoproteine auf die Virusreplikation in der Maus
Zunächst wurde an die in Grimm et al. (2007) durchgeführten LD50-Studien mit reassortanten
Viren in Mx1+/+-Mäusen angeknüpft. Wie bereits in 1.3.6 genauer erläutert wurde, stellten
sich bei der Rekonstruktion der Virulenz von hvPR8 die Segmente 4 und 6, die für HA und
NA kodieren, als unerlässlich heraus. Eine Ausstattung mit HA und NA von hvPR8 war die
Voraussetzung dafür, dass die Virulenz steigernde Wirkung der Polymerasekomplexes von
hvPR8 zum Tragen kam. Dies legte die Hypothese nahe, dass HA und NA von hvPR8 für das
effiziente Eindringen des Virus in die Zelle essentiell sind. Es wurde außerdem gezeigt, dass
sich hvPR8 durch eine extrem schnelle Replikation in der Maus auszeichnet. Zu einem späten
Zeitpunkt, 72 h nach Infektion, konnte ein signifikanter Beitrag von HA und NA zur Replikation von hvPR8 nachgewiesen werden, indem das Virus lvPR/hvHN, das die für die Glykoproteine kodierenden Segmente 4 und 6 von hvPR8 und die restlichen Segmente von lvPR8
enthielt, ca. 50-fach höhere Lungentiter in Mx1+/+-Mäusen erzielte als lvPR8 (siehe 1.3.6,
(40)). Um zu untersuchen, inwieweit die Glykoproteine von hvPR8 die Virusreplikation in der
Maus auch schon zu frühen Zeitpunkten nach Infektion steigern können und somit einen
Beitrag zur schnellen Vermehrung und Ausbreitung von hvPR8 leisten könnten, wurde eine
Wachstumskinetik des Virus lvPR/hvHN im Vergleich zu den parentalen rekombinanten
Viren lvPR8 und hvPR8 (rlvPR8 und rhvPR8) in der Maus erstellt. Mx1-/--Mäuse wurden mit
104 ffu des jeweiligen Virus infiziert. Nach 4 h, 6 h, 9 h, 12 h und 24 h wurden die Lungen
der Mäuse entnommen und die Virustiter des Lungengewebes bestimmt. Abb. 15 zeigt, dass
lvPR/hvHN bereits nach 6 h einen Wachstumsvorteil gegenüber rlvPR8 besaß. Zu allen
70
Ergebnisse
Zeitpunkten lag der Titer des Virus lvPR/hvHN zwischen denjenigen von rlvPR8 und
rhvPR8. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit den LD50-Werten der Viren (siehe 1.3.6).
Virustiter [log10 ffu/Lunge]
9
8
7
6
rhvPR8
lvPR/hvHN
rlvPR8
5
4
3
2
1
0
4h
6h
9h
12 h
24 h
Abb. 15: Die Glykoproteine von hvPR8 vermitteln eine beschleunigte und erhöhte Virusreplikation in
Mx1-/--Mäusen. Mx1-/--Mäuse wurden mit jeweils 104 ffu der Viren rhvPR, lvPR/hvHN und rlvPR infiziert. Zu
den angegebenen Zeitpunkten nach Infektion wurden die Lungen der Tiere entnommen. Die Lungenvirustiter
wurden mit einem virusspezifischen Serum mittels Immunfluoreszenz bestimmt. Die Abbildung zeigt die
Mittelwerte der Virustiter von zwei Tieren.
3.2.2
Einfluss der Glykoproteine auf das Eindringen des Virus in die Zelle
Nachweis von viralem NP nach Infektion von L929-Zellen:
Die in Grimm et al. (2007) beobachtete, schnelle Akkumulation von viralem NP in hvPR8
infizierten L929-Zellen, die keine produktive Replikation von PR8 zulassen, zeigte, dass
frühe Schritte des Replikationszyklusses von hvPR8 sehr effizient ablaufen und bestärkten
somit die Vermutung, dass HA und NA von hvPR8 ein effizientes Eindringen des Virus in die
Zelle vermitteln könnten. Um zu untersuchen, inwieweit die Akkumulation von viralem NP
nach Infektion von L929-Zellen von den Glykoproteinen von hvPR8 abhängt, wurden die
Zellen mit einer MOI („multiplicity of infection“) gleich 0,5 der Viren rlvPR8, rhvPR8,
lvPR/hvHN bzw. hvPR/lvHN infiziert. Da die Paare rlvPR8 und lvPR/hvHN bzw. rhvPR8
und hvPR/lvHN über identische Polymerasekomplexe verfügten, konnten Unterschiede in den
mit den jeweiligen Viren erzielten Ergebnissen auf die Glykoproteine zurückgeführt werden.
Nach 8 h wurden Lysate hergestellt, die anschließend im Western Blot hinsichtlich ihres NPGehalts analysiert wurden. Bei den Viren, die über HA und NA von hvPR8 verfügten, wurde
71
Ergebnisse
ein deutlich stärkeres NP-Signal sichtbar als bei den Viren, deren HA und NA sich von lvPR8
ableitete (Abb 16a).
Virusnachweis nach Infektion von MDCK-H-Zellen:
Im Einklang mit diesem Ergebnis steht eine parallel durchgeführte Untersuchung, bei der
MDCK-H-Zellen zum Einsatz kamen. In diesen Zellen kann, so wie in L929-Zellen, eine
Multizyklus-Infektion ausgeschlossen werden, da MDCK-H-Zellen keine endogene Protease
besitzen, welche die für eine Multizyklus-Infektion erforderliche HA-Spaltung ausführt. Die
Zellen wurden wie im vorherigen Fall mit einer MOI gleich 0,5 der Viren rlvPR8, rhvPR8,
lvPR/hvHN bzw. hvPR/lvHN infiziert. Nach 6 h wurden die Zellen fixiert und mit einem
virusspezifischen Serum, das hauptsächlich NP erkennt, mittels Immunfluoreszenz analysiert.
Auch hier war das Signal in den Zellen, die mit Viren infiziert wurden, welche HA und NA
von hvPR8 besaßen, stärker und nicht vorwiegend auf den Zellkern beschränkt (wie im Fall
der Viren mit Glykoproteinen von lvPR8), sondern auch im Zytoplasma (Abb. 16b). Dies
lässt ein schnelleres Voranschreiten des Replikationszyklusses im Fall der Viren mit HA und
NA von hvPR8 vermuten.
Die Ergebnisse der beiden beschriebenen Experimente deuten darauf hin, dass die Glykoproteine von hvPR8 in der frühen Phase der Virusinfektion entscheidend sind. Da HA, nach
den LD50-Studien reassortanter Viren in Mx1+/+-Mäusen zu urteilen, die entscheidendere
Rolle der beiden Glykoproteinen zukommt, konzentrierte ich mich beim weiteren Vorgehen
auf die Funktionen des HA, die für die frühe Phase der Virusreplikation von Bedeutung sind.
72
a)
HN
R/
lv
hv
P
R/
hv
HN
l vP
R8
rh
vP
rlv
P
R8
Ergebnisse
anti-NP
anti-Aktin
b)
rlvPR8
rhvPR8
hvPR/lvHN
lvPR/hvHN
Abb. 16: Die Glykoproteine von hvPR8 vermitteln ein schnelles Eindringen des Virus in die Zelle. a) L929Zellen wurden mit einer MOI gleich 0,5 der Viren rlvPR8, rhvPR8, lvPR/hvHN bzw. hvPR/lvHN infiziert. Nach
8 h wurden Lysate hergestellt. Virales NP und zelluläres Aktin wurden mit spezifischen Antikörpern im Western
Blot nachgewiesen. b) MDCK-H-Zellen wurden mit einer MOI gleich 0,5 der Viren rlvPR8, rhvPR8,
lvPR/hvHN und hvPR/lvHN infiziert. Nach 6 h wurden die Zellen fixiert. Virus infizierte Zellen wurden mit
einem virusspezifischen Serum mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht.
73
Ergebnisse
3.2.3
Funktionsanalyse des Hämagglutinins
Wie bereits in 1.2.1 genau geschildert wurde, besitzt das HA-Protein zwei wichtige Funktionen in der frühen Phase der Virusreplikation: die Bindung an zelluläre Rezeptoren, an die sich
die Endozytose des Viruspartikels anschließt, und die Vermittlung der Fusion der viralen
Membran mit der Endosomenmembran, was die Freisetzung des viralen Genoms ins Zytoplasma der Zelle ermöglicht.
Um zu untersuchen, ob die erwähnten die frühe Infektionsphase bestimmenden Ereignisse für
die Virulenz vermittelnden Eigenschaft des HA-Proteins von hvPR8 (hvHA) ausschlaggebend
sein könnten, wurde überprüft, ob sich hvHA in seiner Rezeptorbindung und/oder Fusionsaktivität vom HA-Protein von lvPR8 (lvHA) unterscheidet.
3.2.3.1 Rezeptorbindung
Bindung an α2,3- bzw. α2,6-verknüpfte Sialinsäuren:
Um Aufschluss darüber zu erhalten, ob hvHA und lvHA eine unterschiedliche Affinität für
endständige Sialinsäuren besitzen, wurde ein Feste-Phase-Enzym-Test (nach Gambaryan et
al. (1992) (32)), der einem Sandwich-ELISA glich, mit α2,3- bzw. α2,6-verknüpfter
Sialinsäure (2,3- bzw. 2,6-SA) enthaltendem Fetuin (2,3- bzw. 2,6-Fetuin) durchgeführt. In
Abb. 17a ist der Test schematisch dargestellt. 96-Lochplatten wurden mit dem Glykoprotein
Fetuin beschichtet und anschließend mit gereinigten Viren inkubiert. Verschiedene Konzentrationen an 2,3- bzw. 2,6-Fetuin, das an eine Meerrettich-Peroxidase („horseradish peroxidase“, HRP) gekoppelt war, wurden zugefügt. Durch Zugabe von HRP-Substrat, was zur
Bildung eines farbigen Produkts führte, konnte die Bindung an 2,3- bzw. 2,6-Fetuin-HRP
sichtbar gemacht und durch Messung der Absorption bei 490 nm quantifiziert werden.
Abb. 17b zeigt die ermittelten Affinitätskonstanten (Kaff , Berechnung siehe 2.2.2.4) für die
Viren rlvPR8 und rhvPR8, wobei hohe Kaff-Werte eine hohe Affinität widerspiegeln. Im Fall
von rhvPR8 wurde eine Bindung an 2,3- als auch an 2,6-Fetuin detektiert, während rlvPR8
nur Affinität für die 2,3-Form zeigte. Im Vergleich zu rlvPR8 besaß rhvPR8 eine geringere
Affinität für 2,3-Fetuin.
74
Ergebnisse
HRP
a)
Substrat
III)
II)
I)
2,3-Fetuin-HRP
2,6-Fetuin-HRP
b)
c)
90
7
80
6
70
4
*
3
Kaff [µM-1]
*
5
Kaff [ml/U]
3‘SL-PAA-biot
6‘SLN-PAA-biot
60
50
40
30
2
20
1
10
0
Kontrolle aviär human rlvPR8 rhvPR8
*
*
0
Kontrolle aviär human rlvPR8 rhvPR8
P = 0,0036
P = 0,0029
Abb. 17: rlvPR8 und rhvPR8 unterscheiden sich in ihrer Affinität für α2,3- und α2,6-verknüpfte Sialinsäuren. a) Feste-Phase-Enzym-Test: I) Die Viren wurden in Fetuin beschichteten Platten inkubiert. Endständige
α2,3- bzw. α2,6-verknüpfte Sialinsäuren sind durch orange bzw. grün gefärbte Kugeln symbolisiert. II)
Verschiedene Konzentrationen an α2,3- oder α2,6-Sialinsäure enthaltendem Fetuin, das mit einer MeerrettichPeroxidase („horseradish peroxidase“ = HRP) gekoppelt war (2,3- bzw. 2,6-Fetuin-HRP), wurden zugefügt. III)
Die Zugabe von HRP-Substrat führte zur Bildung eines farbigen Produkts, welches durch Messung der Absorption bei 490 nm quantifiziert wurde. b) Der in a) beschriebene Test wurde mit den Viren rlvPR8 und rhvPR8
durchgeführt. Durch die mehrmalige Durchführung des Tests mit verschiedenen Viruskonzentrationen konnten
Standardabweichungen ermittelt werden. Hohe Werte für die Affinitätskonstante (Kaff) spiegeln eine hohe Affinität wider. Die angeführten P-Werte sprechen für die Signifikanz der Ergebnisse (nach GraphPad Quick Calcs:
t test calculator). „Kontrolle“ = Inkubation mit Puffer statt Virus, „aviär“ = aviäres Kontrollvirus: A/Ente/
Minnesota/1525/81 (H5N1), „human“ = humanes Kontrollvirus: A/Memphis/14/96 (H1N1) c) Die Viren rlvPR8
und rhvPR8 wurden zusätzlich bezüglich ihrer Affinität für zwei weitere Rezeptoranaloga, α2,3-verknüpfte
Sialinsäure enthaltende 3’Sialyllaktose (3’SL) bzw. α2,6-verknüpfte Sialinsäure enthaltendes 6’Sialyl-(N-Acetyllactosamin) (6’SLN), getestet. Die Zuckergruppen waren in zahlreichen Kopien auf einem PolyacrylsäureTräger („polyacrylic acid carrier“, PAA) befestigt. Aufgrund der Verknüpfung von 3’SL bzw. 6’SLN mit Biotin
(biot) konnte durch Zugabe von Streptavidin-HRP die Bindung von 3’SL bzw. 6’SLN an die Viren sichtbar
gemacht werden. Ansonsten entsprach die Vorgehensweise dem 2,3-/2,6-Fetuin-Test. „Kontrolle“ = Inkubation
mit Puffer statt Virus, „aviär“ = aviäres Kontrollvirus: A/Wildente/Alberta/47/98 (H4N1), „human“ = humanes
Kontrollvirus: A/Memphis/14/96 (H1N1).
75
Ergebnisse
Neben den Rezeptoranaloga 2,3- und 2,6-Fetuin wurden zusätzlich Sialylglykopolymere
eingesetzt, um die Rezeptorbindung von hvPR8 im Vergleich zu lvPR8 zu untersuchen. Bei
ihnen handelte es sich um 2,3-SA enthaltende 3’Sialyllaktose (3’SL) und 2,6-SA enthaltendes
6’Sialyl(N-Acetyllactosamin) (6’SLN), wobei diese Zuckergruppen in zahlreichen Kopien auf
einem Polyacrylsäure-Träger befestigt waren. Demzufolge wurden polyvalente Interaktionen
zwischen den HA-Proteinen der Viren und den endständigen 2,3- bzw. 2,6-SAs der Zuckergruppen verstärkt, und man konnte hohe Affinitäten erwarten. Es war von Interesse, ob
rlvPR8 auch in diesem Test nicht an 2,6-SA binden würde. Dies war jedoch nicht der Fall:
Beide Viren banden sowohl an 3’SL als auch an 6’SLN, wobei rlvPR8 erneut eine höhere
Affinität für die 2,3-Form zeigte, und rhvPR8 eine höhere Affinität für die 2,6-Form besaß
(Abb. 17c).
Aufgrund dieser Daten kann spekuliert werden, dass sich hvPR8 im Gegensatz zu lvPR8
durch günstige Bindungseigenschaften für 2,3- und 2,6-SA auszeichnet, die ein besonders
effizientes Eindringen des Virus in die Zelle und/oder einen bestimmten Zelltropismus
vermitteln, der die Virulenz des Virus erhöht.
Zelltropismus der Viren im alveolaren Gewebe:
In Grimm et al. (2007) wurde gezeigt, dass sich hvPR8 durch eine extrem schnelle Replikation in der Mauslunge auszeichnet. Um zu untersuchen, ob hierbei ein anderer Zelltyp als bei
der Replikation von lvPR8 befallen wird, wurden Mx1+/+ -Mäuse mit der 100-fachen LD50
von rlvPR8 und rhvPR8 infiziert. Nach 24 h, 48 h, 72 h und 96 h wurden die Lungen der
getöteten Tiere durch tracheale Injektion mit PBS-4% Formaldehyd pH 7,0 aufgebläht und
fixiert. Nach Entnahme der Lungen wurden diese zur Herstellung von Paraffinschnitten
verwendet. Der Virusnachweis erfolgte mit einem virusspezifischen Serum mittels Immunfluoreszenz. Die Analyse des alveolaren Gewebes zeigte, dass bei beiden Viren die Zahl der
Virus infizierten Zellen und das Ausmaß der Gewebezerstörung von 24 h bis 96 h nach
Infektion in einem vergleichbaren Maß zunahm. Eine Doppelfärbung nach Virus und nach
Typ I- bzw. Typ II-Pneumozyten mit spezifischen Antikörpern erbrachte zu allen Zeitpunkten
das Ergebnis, dass sich rhvPR8 in seinem Zelltropismus im alveolaren Gewebe nicht von
rlvPR8 unterscheidet. Abb. 18 beschränkt sich auf die Aufnahmen der Lungen 48 h nach
76
Ergebnisse
Infektion. Für beide Viren zeigte sich eine Kolokalisation der Virus- mit der Typ II(Abb.18a), nicht jedoch mit der Typ I-Pneumozyten-Färbung (Abb. 18b).
a)
anti-Typ I
anti-Virus
Überlagerung
rlvPR8
rhvPR8
ohne 1.AK
uninfiziert
Abb. 18: rlvPR8 als auch rhvPR8 infizieren nicht Typ I- sondern Typ II-Pneumozyten in der Lunge.
Mx1+/+-Mäuse wurden mit einer 100-fachen LD50 von rlvPR8 bzw. rhvPR8 infiziert. Nach 48 h wurden die
Lungen der Tiere entnommen und Paraffinschnitte angefertigt. Virus (grün) und a) Typ I-Pneumozyten (rot)
bzw. b) Typ II-Pneumozyten (rot) (siehe nächste Seite) wurden mit spezifischen Antikörpern mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen. In Spalte 4 ist eine Vergrößerung des jeweiligen weiß umrahmten Ausschnittes in
Spalte 3 gezeigt.
77
Ergebnisse
b)
anti-Typ II
anti-Virus
Überlagerung
rlvPR8
rhvPR8
ohne 1.AK
uninfiziert
78
Ergebnisse
3.2.3.2 Fusionsaktivität
Neben der Rezeptorbindung wurde die Fusionsaktivität von hvHA als eine weitere die frühe
Infektionsphase bestimmende Eigenschaft untersucht. Wie in 1.1.4 und 1.2.1 bereits geschildert wurde, gelangt ein Influenzaviruspartikel durch rezeptorvermittelte Endozytose ins
Endosom einer Zelle, wo sein HA-Protein, sobald der pH-Wert im Endosom auf einen
bestimmten Wert abgefallen ist, die Fusion der Virusmembran mit der Endosomenmembran
einleiten kann (Abb. 19a). Mit den im Folgenden beschriebenen Experimenten wurde die pHAbhängigkeit der Fusionsaktivität von hvHA analysiert.
Infektion von MDCK-Zellen in Anwesenheit von Ammoniumchlorid (NH4Cl):
Um die Sensitivität von hvHA im Vergleich zu lvHA gegenüber einer durch NH4Cl induzierten pH-Erhöhung zu bestimmen, wurden MDCK-Zellen mit einer MOI gleich 1 der Viren
rlvPR8, rhvPR8, lvPR/hvHN bzw. hvPR/lvHN in Anwesenheit verschiedener NH4Cl-Konzentrationen infiziert. Nach 6 h wurden die Zellen fixiert und Virus infizierte Zellen wurden
mit einem virusspezifischen Serum mittels Immunfluoreszenz detektiert. Es zeigte sich, dass
die Viren, die über hvHA verfügten, selbst bei höheren NH4Cl-Konzentrationen die Zellen
infizieren konnten, während die Viren, die lvHA besaßen, erst bei niedrigeren NH4Cl-Konzentrationen in den Zellen nachweisbar waren (Abb. 19b). Das Experiment wurde dreimal bei
Einsatz der NH4Cl-Konzentrationen 1,0 bis 3,0 mM durchgeführt und quantifiziert (Abb.
19c). Dabei konnte die Beobachtung, dass Viren mit hvHA höhere pH-Werte tolerieren, bestätigt werden.
79
Ergebnisse
a)
H+
aus: Whittaker, G. R., M. Kann, and A. Helenius. 2000.
Viral entry into the nucleus. Annu Rev Cell Dev Biol 16:627-51.
NH4Cl [mM]
b)
4,0
-
2,0
2,5
3,0
lvP
hv
PR
R/h
rlv
rhv
/lv
PR
vH
PR
H
8
N
N
8
3,5
c)
100
Infizierte Zellen [%]
90
80
rhvPR8
70
60
lvPR/hvHN
50
rlvPR8
40
30
hvPR/lvHN
20
10
0
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
NH4Cl [mM]
Abb. 19: Viren mit hvHA tolerieren einen durch NH4Cl induzierten höheren pH-Wert im Endosom. a)
Schema des Eindringens eines Influenzaviruspartikels in die Zelle durch rezeptorvermittelte Endozytose und
Fusion der Virus- mit der Endosomenmembran. b) MDCK-Zellen wurden mit einer MOI gleich 1 der Viren
rlvPR8, rhvPR8, lvPR/hvHN bzw. hvPR/lvHN in Anwesenheit verschiedender NH4Cl-Konzentrationen infiziert.
Nach 6 h wurden die Zellen fixiert. Virus infizierte Zellen wurden mit einem virusspezifischen Serum mittels
Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. c) Das in b) beschriebene Experiment wurde dreimal bei Einsatz der
NH4Cl-Konzentrationen 1,0 bis 3,0 mM durchgeführt und quantifiziert. Die y-Achse zeigt den Anteil der
infizierten Zellen bei der jeweiligen NH4Cl-Konzentration in Bezug auf die Anzahl der infizierten Zellen bei
fehlender NH4Cl-Behandlung. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten. Die
Werte von rhvPR8 in Bezug auf die Werte von rlvPR8 unterschieden sich signifikant (P < 0,05 nach GraphPad
QuickCalcs: t test calculator).
80
Ergebnisse
Fusion der Viren mit Erythrozyten:
Die pH-Abhängigkeit der Fusionsaktivität von hvHA wurde zusätzlich mit einem HämolyseTest untersucht, in dem die Fusion von Viren mit Erythrozyten ausgelöst wird (Abb. 20a). In
diesem Fall wurden die Viren rlvPR8 und rhvPR8 (da hvPR/lvHN aufgrund eines zu
niedrigen Virustiter nicht eingesetzt werden konnte, beschränkt sich der Versuch auf die
parentalen Viren) mit humanen Erythrozyten inkubiert und anschließend verschiedenen pHWerten ausgesetzt. Zur Induktion der Fusion wurden die Proben 20 min bei 37 °C inkubiert.
Das durch die Hämolyse freigesetzte Hämoglobin diente als Maß für die Fusion der Viren mit
den Erythrozyten und wurde durch Messung der Absorption bei 575 nm quantifiziert. Es
wurde beobachtet, dass das hvHA bereits ab einem pH-Wert von 5,8 Fusionsaktivität zeigte,
während lvHA erst ab einem pH-Wert von 5,3 aktiv wurde (Abb. 20b). Dieser Test bestätigte
die Beobachtung des NH4Cl-Experiments, dass hvHA bei höheren pH-Werten die Fusion
einleiten kann.
a)
b)
2,2
OD 575nm
2,0
1,8
crhvPR8
lvrlvPR8
1,6
hPBS-Kontrolle
1,4
1,2
1,0
7,4
6,5
6,0
5,5
5,0
pH
Abb. 20: hvHA vermittelt die Fusion mit Erythrozyten bei höheren pH-Werten. a) Schema der Fusion eines
Viruspartikels mit einem Erythrozyten, in deren Folge es zum Austritt von Hämoglobin kommt. b) Humane
Erythrozyten wurden mit rlvPR8 und rhvPR8 inkubiert. Lösungen mit verschiedenen pH-Werten wurden
zugefügt. Nach 20-minütiger Inkubation der Proben bei 37 °C wurde das ausgetretene Hämoglobin durch
Messung der Absorption bei 575 nm ermittelt. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten. Bei pH 5,8 bis 5,3 zeigte rhvPR8 im Vergleich zu rlvPR8 signifikant höhere Werte (P < 0,02 nach
GraphPad QuickCalcs: t test calculator).
81
Ergebnisse
Bestimmung der Fusionsaktivität im Luziferase-Reportergen-Fusionstest:
Als weitere Methode zur Bestimmung der Fusionsaktivität von HA wurde ein LuziferaseReportergen-Fusionstest angewendet (nach Su et al. (2008) (140)), der gegenüber dem
Hämolyse-Test den Vorteil besitzt, dass cDNA-Expressionskonstrukte für HA eingesetzt
werden können und somit ein einfacher Test für die spätere Analyse von HA-Mutanten
etabliert wurde. Das zu untersuchende HA kommt direkt zum Einsatz, indem 293T-Zellen mit
einem für das Protein kodierende Expressionsplasmid transfiziert werden. Außerdem werden
die Zellen mit einem Firefly-Luziferase-Gen kodierenden Plasmid ausgestattet. Das folglich
auf der Zelloberfläche exprimierte HA wird durch Trypsin gespalten und anschließend
verschiedenen pH-Werten (in diesem Fall pH 5,5 , 5,3 und 5,1) ausgesetzt. Falls das HA bei
dem jeweiligen pH-Wert Fusionsaktivität besitzt, kommt es zur Fusion mit Nachbarzellen.
Die Nachbarzellen wurden zuvor mit einer T7-Polymerase ausgestattet. Diese gelangt bei der
Fusion in die HA exprimierenden Zellen, die das Firefly-Luziferase Konstrukt enthalten. Da
das Firefly-Luziferase-Gen unter Kontrolle des T7-Promotors steht, kommt es zur Produktion
von Luziferase, die durch Zugabe von Luziferin und anschließender Messung der Lumineszenz quantifiziert werden kann. Der Versuchsablauf ist in Abb. 21 dargestellt.
82
Ergebnisse
a)
II
Pol
II
Pol
HA
T7
T7
FF-Luc
293T
0
SV4
293T
Ren-Luc
HA
T7
HA
b)
+
FF-Luc
HA
HA
RenLuc
T7
HA
HA
+ Trypsin,
+ pH 5,5 / 5,3 / 5,1
c)
Abb. 21: Ermittlung der Fusionsaktivität von lvHA und hvHA mit Hilfe eines Luziferase-ReportergenFusionstests. a) 2 Ansätze an 293T-Zellen wurden transfiziert: Ansatz 1 wurde mit einem Expressionsplasmid
für HA, einem unter Kontrolle des T7-Promotors stehenden Firefly-Luziferase („FF-Luc“)-Gen kodierenden
Plasmid und einem unter Kontrolle des SV40-Promotors stehenden Renilla-Luziferase („Ren-Luc“)-Gen kodierenden Kontrollplasmid transfiziert. Ansatz 2 wurde mit einem Expressionsplasmid für die T7-Polymerase
transfiziert. b) Ansatz 2 wurde nach 40 h Ansatz 1 zugefügt. Nach 5 h wurde das auf den Zellen von Ansatz 1
exprimierte HA durch eine zweiminütige Trypsin-Behandlung gespalten. Es folgte die zweiminütige Inkubation
der Zellen bei verschiedenen pH-Werten. Nach 7 h wurden die Zellen lysiert. Die im Fall einer Fusion der Zellen
von Ansatz 1 und 2 produzierte Firefly-Luziferase wurde durch Zugabe von Luziferin und anschließender
Messung der Lumineszenz detektiert. c) Hohe Firefly-Luziferase-Werte korrelierten mit dem Erscheinen von
deutlich erkennbaren Synzytien: Das linke Foto entstand kurz vor der Lysatherstellung. Das rechte Foto zeigt die
Negativkontrolle.
83
Ergebnisse
Der Test wurde mit hvHA und lvHA für den Bereich der pH-Werte 5,5 bis 5,1 durchgeführt,
in welchem rhvPR8 bei pH 5,5 und rlvPR8 bei pH 5,1 eine hohe Fusionsaktivität im Hämolyse-Experiment erreicht hatten. Es zeigte sich, in Übereinstimmung mit dem HämolyseExperiment, dass hvHA bereits bei pH 5,5 Fusionsaktivität besaß, während die Aktivität von
lvHA bei pH 5,5 nur knapp über dem Wert der Kontrolle lag und erst bei pH 5,3 anstieg
(Abb. 22). Bei pH 5,5 war die Aktivität von hvHA im Vergleich zu lvHA ca. 9-fach höher.
Bei pH 5,3 stieg die Aktivität sowohl bei hvHA als auch bei lvHA an. hvHA schien bei
diesem pH-Wert seine optimale Aktivität erreicht zu haben, da diese bei pH 5,1 wieder
absank. Im Gegensatz dazu, stieg die Aktivität von lvHA bei pH 5,1 im Vergleich zu pH 5,3
noch weiter an.
Relative Aktivität [x-fach]
25
20
15
lvHA
10
hvHA
5
Kontrolle
0
pH
5,5
5,3
5,1
anti-HA
anti-Tubulin
Abb. 22: hvHA zeigt bei höheren pH-Werten Fusionsaktivität im Luziferase-Reportergen-Fusionstest. Die
Fusionsaktivität von 293T-Zellen exprimierenden lvHA bzw. hvHA wurde mit dem in Abb. 21 präsentierten
Luziferase-Reportergen-Fusionstest bestimmt. Die Firefly-Luziferase-Werte wurden mit den Renilla-LuziferaseWerten normalisiert und als x-fache Aktivität relativ zum Wert von lvHA bei pH 5,5 berechnet. Der von lvHA
bei pH 5,5 erzielte Wert wurde auf 1 gesetzt. Die gestrichelte Linie gibt den Mittelwert der Kontrolle an. Als
Kontrolle dienten Zellen, die nicht mit einem Expressionsplasmid für HA sondern für NA transfiziert wurden.
Die Abbildung zeigt die Mittelwerte von zwölf unabhängigen Experimenten. Es wurden signifikante Unterschiede zwischen den Aktivitäten von hvHA und lvHA bei allen pH-Werten festgestellt (P ≤ 0,02 nach
GraphPad QuickCalcs: t test calculator). Die Expression von lvHA bzw. hvHA und zellulärem Tubulin wurde
mittels Western Blot-Analyse kontrolliert.
84
Ergebnisse
Die zur Untersuchung der Fusionseigenschaft von HA durchgeführten Experimente zeigten
alle, dass hvHA im Vergleich zu lvHA bei höheren pH-Werten Fusionsaktivität besitzt. Dies
lässt vermuten, dass hvHA beim Absinken des pH-Wertes im Endosom schon früh eine
Fusion der Virus- mit der Endosomenmembran einleiten kann.
Neben der Rezeptorbindung und der Fusionsaktivität wurde hvHA schließlich noch bezüglich
seiner Spaltbarkeit untersucht, die eine Voraussetzung für die Infektiösität von Influenza-AViren darstellt und mit der Pathogenität der Viren in Verbindung gebracht wird (siehe 1.2.1).
3.2.3.3 Spaltbarkeit in Abhängigkeit von Trypsin
Wie in 1.2.1 erläutert wurde, wird die Spaltbarkeit des HA-Proteins in die Untereinheiten
HA1 und HA2 durch die Aminosäuresequenz an der Spaltstelle bestimmt. Ein Vergleich der
Aminosäuresequenzen von hvHA und lvHA zeigte, dass beide Proteine eine mono- und keine
multibasische Spaltstelle besitzen, wie sie bei hochpathogenen H5- und H7-Viren gefunden
wird (siehe 1.2.1). Interessanterweise wies hvHA verglichen mit lvHA jedoch an Position 328
einen Tyrosin zu Serin Austausch (Y328S) auf. Position 328 liegt sehr nah an der Spaltstelle
des HA-Proteins (Die Spaltung erfolgt an der C-terminalen Seite des Arginins an Position 329
(103)). Folglich lag die Vermutung nahe, dass die Y328S-Mutation in hvHA einen Einfluss
auf die Spaltbarkeit des Proteins ausüben könnte.
Um zu untersuchen, ob sich hvHA und lvHA in ihrer Spaltbarkeit unterscheiden, wurde
überprüft, ob hvHA gegenüber lvHA einen Vorteil besitzt, indem es schon bei niedrigeren
Proteasekonzentrationen gespalten wird. Da bei beiden HA-Proteinen eine monobasische
Spaltstelle festgestellt worden war, die durch trypsinähnliche Proteasen gespalten wird (siehe
1.2.1), wurde Trypsin als Ersatz für die endogenen Proteasen in der Mauslunge eingesetzt.
Transfektion von 293T-Zellen:
In einem ersten Experiment wurden 293T-Zellen mit Expressionsplasmiden für hvHA bzw.
lvHA transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen mit verschiedenen Trypsin-Konzentrationen
für 20 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden Lysate hergestellt, die auf Spaltprodukte von HA mit einem virusspezifischen Serum im Western Blot untersucht wurden.
Abb. 23a umfasst die Banden des ungespaltenen HA-Proteins „HA0“, und des HA-
85
Ergebnisse
Spaltproduktes „HA1“, das über eine erfolgte HA-Spaltung Aufschluss gab. Wie aus
Abb. 23a ersichtlich ist, bestand kein deutlicher Unterschied zwischen dem Ergebnis für
hvHA und lvHA. In beiden Fällen stellt die Trypsin-Konzentration von 0,3 µg/ml die
geringste Konzentration dar, bei der gerade noch ein HA-Spaltprodukt erkennbar war.
Multizyklus-Infektion in MDCK-H-Zellen:
Die Spaltbarkeit von HA wurde zusätzlich im Rahmen einer Virusinfektion getestet. Hierbei
wurde der Einfluss der Trypsin-Konzentration auf die multizyklische Infektion von rhvPR8
und rlvPR8 untersucht. MDCK-H-Zellen, die über keine endogene Protease verfügen, wurden
mit einer MOI gleich 0,01 der Viren rlvPR8 und rhvPR8 infiziert und mit Avicelmedium
(0,6%), das unterschiedliche Trypsin-Konzentrationen enthielt, überschichtet. Nach 24 h wurden die Zellen fixiert und virales NP mit einem spezifischen Antikörper mittels Immunhistochemie nachgewiesen. Abb. 23b zeigt, dass in Anwesenheit der Trypsin-Konzentrationen
0,5 µg/ml bis 0,13 µg/ml im Fall beider Viren Plaques gebildet wurden, auch wenn die
Plaques bei rlvPR8 kleiner und undeutlicher erschienen. Bei einer Trypsin-Konzentration von
0,06 µg/ml war bei beiden Viren keine Plaque-Bildung mehr erkennbar, was darauf schließen
lässt, dass in beiden Fällen keine Multizyklus-Infektion mehr stattfinden konnte. Wie im
zuvor beschriebenen Experiment konnte somit kein Unterschied in der Trypsin-Abhängigkeit
der HA-Spaltbarkeit zwischen hvHA und lvHA festgestellt werden.
86
Trypsin [µg/ml]
un
t
a)
ra
ns
fiz
ie
rt
Ergebnisse
0
0,2
0,3
0,6
1,3
2,5
5,0
10,0
HA0
lvHA
HA1
anti-Tubulin
HA0
hvHA
HA1
anti-Tubulin
b)
R8
R8
P
P
v
v
rh
rl
Trypsin [µg/ml]
0,50
0,25
0,13
0,06
Abb. 23: rlvPR8 und rhvPR8 unterscheiden sich nicht in der Trypsinabhängigkeit ihrer HA-Spaltung. a)
293T-Zellen wurden mit Expressionsplasmiden für lvHA bzw. hvHA transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen
mit verschiedenen Trypsin-Konzentrationen für 20 min bei 37 °C inkubiert. Nach Herstellung von Lysaten
wurden virales HA und zelluläres Tubulin mit spezifischen Antikörpern im Western Blot nachgewiesen. b) Um
den Einfluss der Trypsin-Konzentration auf die multizyklische Infektion der Viren rhvPR8 und rlvPR8 zu untersuchen, wurden MDCK-H-Zellen mit einer MOI gleich 0,01 der Viren rlvPR8 und rhvPR8 infiziert und mit
Avicelmedium (0,6%) mit den angegebenen Trypsin-Konzentrationen überschichtet. Nach 24 h wurden die Zellen fixiert und virales NP mit einem spezifischen Antikörper mittels Immunhistochemie nachgewiesen.
87
Ergebnisse
Um zu untersuchen, welche Aminosäuren in HA die Virulenz von hvPR8 beeinflussen, und
ob diese die beobachteten Eigenschaften von hvHA bezüglich der Rezeptorbindung und
Fusionsaktivität vermitteln könnten, wurde die im Folgenden beschriebene genetische Analyse durchgeführt.
3.2.4
Genetische Analyse des Hämagglutinins
3.2.4.1 Einfluss von Aminosäureaustauschen in HA auf die Virulenz
Zur Identifizierung Virulenz beeinflussender Aminosäuren in hvHA wurden reassortante
Viren hergestellt, in deren HA Mutationen einführt wurden. Um zu überprüfen, ob diese
Mutationen eine veränderte Virulenz hervorriefen, wurden die entsprechenden reassortanten
Viren hinsichtlich ihrer LD50 in Mx1+/+-Mäusen untersucht.
Ein Sequenzvergleich zeigte, dass sich hvHA von lvHA in 17 Aminosäuren unterscheidet
(siehe 1.3.1 Tab. 2). Da es einfacher schien, die Virulenz, die durch diese 17 Aminosäuren
vermittelt wird, durch Austausch einzelner Aminosäuren in hvHA zu zerstören, als durch
Austausch einzelner Aminosäuren in lvHA aufzubauen, wurden zunächst Einzel-Aminosäureaustausche in hvHA eingebracht, in der Hoffnung, dass diese eine Erhöhung der LD50 in
Mx1+/+-Mäusen hervorrufen würden. In allen im Folgenden beschriebenen Analysen wurden
reassortante Viren eingesetzt, die das modifizierte HA in einem Hintergrund besaßen, der
Segment 1, 2, 3, 5, 7 und 8 von hvPR8 und Segment 6 von lvPR8 umfasste (lv6 hv1,2,3,5,7,8)
(Abb. 24). Die resultierenden Viren konnten somit mit den Viren hvPR/lvNA und hvPR/lvHN
verglichen werden, welche denselben Segment-Hintergrund und hvHA bzw. lvHA besaßen
(Abb. 24). Wie aus den Studien von Grimm et al. (2007) (siehe 1.3.6) hervorgeht, lagen die
Viren hvPR/lvNA und hvPR/lvHN bezüglich ihrer LD50 um mehr als den Faktor 1600
auseinander. Anhand dieses großen Spielraums konnte spekuliert werden, dass ein intermediärer Phänotyp der Viren mit modifiziertem HA detektiert werden könnte. Im Folgenden
sind die Aminosäurepositionen im HA in der H3-Nummerierung angegeben, d. h. in der
Nummerierung, die sich auf das HA des H3-Subtyps bezieht (103). Die Position „133+“
bezeichnet die Insertion einer Aminosäure in hvHA zwischen Position 133 und 134 des H3Proteins.
88
Ergebnisse
Einzel-Aminosäureaustausche in hvHA:
Um zu untersuchen, ob die Einführung von Einzel-Aminosäureaustauschen in hvHA zu einer
Erniedrigung der Virulenz, d.h. einer Erhöhung der LD50 führt, wurde jeweils eine der 17 von
lvHA unterschiedlichen Aminosäuren in hvHA gegen die lv-Version ausgetauscht. Die hierfür
entscheidende Nukleotid-Mutation wurde durch Mutagenese-PCR in das Virus-Rescue-Plasmid für hvHA eingebracht, das schließlich bei der Virusherstellung zum Einsatz kam. In den
gewonnen Viren wurden die modifizierten Sequenzen im HA-Gen durch Sequenzierung
überprüft. Jedes Virus wurde zweimal in unabhängigen Rescues hergestellt, sodass die LD50,
die mit dem ersten Rescue-Virus ermittelt wurde, mit dem zweiten Rescue-Virus bestätigt
werden konnte.
Abb. 24 zeigt eine schematische Darstellung der Vergleichsviren hvPR/lvNA und hvPR/lvHN
sowie der Viren mit modifiziertem hvHA und dem oben erwähnten Segment-Hintergrund
lv6 hv1,2,3,5,7,8. Rechts daneben sind die LD50-Werte der Viren in Mx1+/+-Mäusen aufgeführt.
Die Aminosäureaustausche in hvHA sind durch ein blau unterlegtes „X“ symbolisiert.
Außerdem zeigt eine Aufschlüsselung für „X“, welcher Aminosäureaustausch in HA im Virus
vorlag. Hervorgehoben sind 5 der 17 Aminosäureaustausche, welche die Mutationen Leucin
zu Prolin an Position 78 (L78P), Threonin zu Asparagin an Position 133 (T133N), Lysin zu
Asparagin an Position 193 (K193N), Glutamin zu Histidin an Position 354 (Q354H) und eine
Deletion an Position 133+ (Del R133+) umfassen. Diese ließen die LD50 der betroffenen Viren
im Vergleich zu hvPR/lvNA ansteigen. Dabei erzielte das Virus hvHA(Del R133+) mit
2x104 ffu den höchsten Wert, was einer 30-fachen Erhöhung bezüglich der LD50 des Virus
hvPR/lvNA entsprach. Bei den anderen 4 Viren mit den Mutationen L78P, T133N, K193N
bzw. Q354H wurde dagegen nur eine leichte Erhöhung der LD50 um Faktor 3 bis 8 festgestellt.
89
Ergebnisse
LD50 [ffu]
Virusbezeichnung :
hv
hv
hv
hv
hv
lv
hv
hv
6x102
hvPR/lvNA
hv
hv
hv
lv
hv
lv
hv
hv
>106
hvPR/lvHN
hv
hv
hv
X
hv
lv
hv
hv
X
=
T57A
<103
hvHA(T57A)
=
L78P
2x103
hvHA(L78P)
=
T131N
<103
hvHA(T131N)
=
T133N
5x103
hvHA(T131N)
=
Del R133+ 2x104
=
A142E
<103
hvHA(A142E)
=
S186P
<103
hvHA(S186P)
=
D190E
<103
hvHA(D190E)
=
K193N
2x103
hvHA(K193N)
=
S206T
<103
hvHA(S206T)
=
V252I
<103
hvHA(V252I)
=
R255M
<103
hvHA(R255M)
=
F294Y
<103
hvHA(F294Y)
=
S328Y
<103
hvHA(S328Y)
=
Q354H
3x103
hvHA(Q354H)
=
S383T
<103
hvHA(S383T)
=
T390I
<103
hvHA(T390I)
hvHA(Del R133+)
Abb. 24: 5 von 17 Einzel-Aminosäureaustausche im hvHA-Protein erniedrigen die Virulenz des Virus
hvPR/lvNA. Zur Bestimmung der LD50 der Viren mit Einzel-Aminosäureaustauschen im hvHA-Protein wurden
Mx1+/+-Mäuse mit verschiedenen Dosen der Viren infiziert. Die Durchführung des Experimentes entsprach
derjenigen der in 3.1.1.2 beschriebenen LD50-Bestimmung (siehe Legende von Abb. 6). Die Zusammensetzung
der Gensegmente der jeweiligen Viren ist durch rote bzw. blaue Kästen dargestellt, die Segmente von hvPR8
bzw. lvPR8 symbolisieren. Das blau unterlegte „X“ symbolisiert einen Aminosäureaustausch von hv nach lv an
den aufgeführten Aminosäurepositionen. Diejenigen Viren, deren Aminosäureaustausche zu einer Erhöhung der
LD50 führten, sind umrandet.
90
Ergebnisse
Einzel- und Mehrfach-Aminosäureaustausche in lvHA:
Schließlich wurde versucht, durch Austausch von Aminosäuren in lvHA gegen die hv-Version die Virulenz zu erhöhen. Dabei wurde zunächst jeweils eine der Aminosäuren an den als
kritisch identifizierten Positionen 78, 133, 193 und 354 ausgetauscht bzw. Arginin an Position
133+ eingeführt. Die Herstellung der Viren mit dem modifizierten lvHA erfolgte wie im Fall
der Viren mit modifiziertem hvHA. Abb. 25 zeigt die Vergleichsviren hvPR/lvNA und
hvPR/lvHN und die Viren mit modifiziertem lvHA mit ihren LD50-Werten in Mx1+/+-Mäusen.
In diesem Fall sind die Aminosäureaustausche in lvHA durch ein rot unterlegtes „X“
symbolisiert.
Während die Einführung einer Deletion an Position 133+ in hvHA die LD50 deutlich
beeinflusst hatte, so bewirkte die Insertion von Arginin an Position 133+ (Ins R133+) in lvHA
keine Veränderung in der LD50 in Bezug auf das Vergleichsvirus hvPR/lvHN (>106 ffu).
Außerdem zeigte sich, dass die N193K-Mutation in lvHA nur einen sehr schwachen Einfluss
auf die LD50 hatte, indem sie diese auf 106 ffu sinken ließ, während die Einführung der
Mutation P78L ein stärkeres Absinken der LD50 auf 105 ffu bewirkte.
Bei den bisher beschriebenen Viren mit Aminosäureaustauschen in HA konnte in allen Fällen
die ermittelte LD50 eines ersten Rescue-Virus mit einem zweiten Rescue-Virus bestätigt
werden. Im Fall des Virus mit dem Austausch H354Q (lvHA(H354Q)) wurde jedoch ein 10facher Unterschied in der LD50 der Viren des ersten und zweiten Rescues festgestellt. Dies
lässt vermuten, dass sich die beiden Viren durch zusätzliche, unerwünschte Mutationen unterschieden, die außerhalb der durch Sequenzierung geprüften Sequenz in HA lagen, und dass
sich diese in verschiedener Weise auf die LD50 auswirkten. Es könnte z. B. bei der PlaqueReinigung der Viren, einem Schritt während der Virusherstellung (siehe 2.2.1.10), ein Virus
gepickt worden sein, dass sich durch Anreicherung zusätzlicher, Virulenz verstärkender
Mutationen neben anderen Virus-Quasispezies durchsetzen konnte. Zu diesem Ereignis
könnte es auch im Fall des Virus mit dem Austausch N133T (lvHA(N133T)) gekommen sein,
denn hier gingen aus mehrfachen Rescue-Versuchen nur Viren mit zusätzlichen, unerwünschten Mutationen in der geprüften HA-Sequenz hervor. Der Einfluss eines N133T-Austausches
allein konnte deshalb nicht bestimmt werden (Abb. 25).
Da mit den untersuchten Einzelaustauschen in lvHA nur im Fall der P78L-Mutation eine
deutliche Erhöhung der Virulenz ermittelt werden konnte, wurde untersucht, ob Kombina-
91
Ergebnisse
tionen von Aminosäureaustauschen an den als kritisch identifizierten Positionen die Virulenz
steigern könnten. Folglich wurden Viren mit Mehrfach-Aminosäureaustauschen in lvHA
hergestellt und auf ihre LD50-Werten in Mx1+/+-Mäusen getestet (Abb. 25). Da die Insertion
von Arginin an Position 133+ in lvHA allein keine Wirkung gezeigt hatte, aber mit einer
Deletion an dieser Stelle in hvHA die LD50 deutlich beeinflusst werden konnte, wurde
spekuliert, dass das Arginin an Position 133+ nur im Zusammenwirken mit den naheliegenden, zusätzlichen Aminosäureaustauschen in hvHA eine Wirkung erzielen könnte. Aus
diesem Grund wurden neben der Ins R133+-Mutation die Austausche N131T, N133T in lvHA
eingebracht. Das betroffene Virus lvHA(hv3x) (Abb. 25) konnte allerdings trotz mehrfachen
Rescue-Versuchen nicht hergestellt werden. Dagegen war ein Rescue des Virus, das ebenfalls
lvHA mit der Dreifach-Mutation „hv3x“ besaß, jedoch im Unterschied zu dem Virus
lvHA(hv3x) die übrigen Segmente von lvPR8 enthielt, möglich. Nach mehrfachem Rescue
dieses Virus zeigte sich bei der Sequenzierung der kritischen Region in HA, dass alle gewonnenen Viren neben den drei gewünschten Mutationen zwei weitere Nukleotidaustausche aufwiesen, die zu den Aminosäureaustauschen E190V und N192R führen. Da hvHA im Vergleich zu lvHA Austausche an Position 190 und 193 besaß, die wie die Positionen 131, 133
und 133+ mit der Rezeptorbindung von HA in Verbindung gebracht werden konnten (83),
wurde spekuliert, dass die Aminosäureänderungen an den Positionen 131, 133, 133+, 190 und
193 zusammen in lvHA eingebracht werden müssen, um eine effiziente Rezeptorbindung des
HA-Proteins zu ermöglichen. Das resultierende Virus lvHA(hv5x) konnte im Gegensatz zu
lvHA(hv3x) hergestellt werden. Ebenso war ein Rescue des Virus lvHA(hv7x) möglich, bei
dem im Vergleich zu lvHA(hv5x) zusätzlich Aminosäureaustausche an den verbleibenden
kritischen Positionen 78 und 354 eingebracht worden waren. So wie im Fall des Virus
lvHA(N133T) wurde bei lvHA(hv5x) und lvHA(hv7x) mit dem ersten und zweiten RescueVirus kein übereinstimmendes Ergebnis für die LD50 erhalten (Abb. 25). Es ist anzunehmen,
dass die Zusammensetzung aus dem jeweiligen modifizierten lvHA in Kombination mit dem
gewählten Segment-Hintergrund einen ungünstigen Aufbau für die Viren darstellte, so dass
sie vermutlich entweder nicht effizient replizieren konnten (lvHA(hv3x)) oder wahrscheinlich
zusätzliche Mutationen anreicherten, die für sie von Vorteil waren und die Virulenz unterschiedlich beeinflussten (lvHA(hv5x) und lvHA(hv7x)). Da die Struktur von hvHA auf einem
komplexen Zusammenspiel der 17 von lvHA unterschiedlichen Aminosäuren und den übrigen
Aminosäuren im HA-Protein beruht, ist es denkbar, dass sich die Virulenz nicht durch
92
Ergebnisse
„Zugabe einzelner Bausteine“ von hvHA erhöhen lässt. Stattdessen ist anzunehmen, dass die
Einführung weniger Aminosäureaustausche in lvHA die Struktur des Proteins ungünstig
beeinflusst und die Anreicherung kompensierender Mutationen in HA und/oder eventuell in
anderen viralen Proteinen nach sich zieht.
X
LD50 [ffu]
Virusbezeichnung:
hv
hv
hv
hv
hv
lv
hv
hv
6x102
hvPR/lvNA
hv
hv
hv
lv
hv
lv
hv
hv
>106
hvPR/lvHN
hv
hv
hv
X
hv
lv
hv
hv
= P78L
105
lvHA(P78L)
= N133T
_*
lvHA(N133T)
= Ins R133+
>106
lvHA(Ins R133+)
= N193K
106
lvHA(N193K)
= H354Q
1. R.: 106
lvHA(H354Q)
2. R. : 105
=
N131T, N133T, Ins R133+
_**
lvHA(hv3x)
1. R.: 103
lvHA(hv5x)
hv3x
=
N131T, N133T, Ins R133+, E190D, N193K
hv5x
=
N131T, N133T, Ins R133+, E190D, N193K, P78L, H354Q
2. R.: 104
1. R.: 5x104 lvHA(hv7x)
hv7x
2. R.: 105
Abb. 25: Analyse der LD50 von Viren mit Einzel- und Mehrfach-Aminosäureaustauschen in lvHA. Zur
Bestimmung der LD50 der aufgeführten Viren mit Einzel- und Mehrfach-Aminosäureaustauschen in lvHA
wurden Mx1+/+-Mäuse mit verschiedenen Dosen der Viren infiziert. Die Durchführung des Experimentes
entsprach derjenigen der in 3.1.1.2 beschriebenen LD50-Bestimmung (siehe Legende von Abb. 6). Die
Zusammensetzung der Gensegmente der jeweiligen Viren ist durch rote bzw. blaue Kästen dargestellt, die Segmente von hvPR8 bzw. lvPR8 symbolisieren. Das rot unterlegte „X“ symbolisiert einen Aminosäureaustausch
von lv nach hv an den aufgeführten Aminosäurepositionen. „R“ = Rescue, * = Es konnte kein Virus mit diesem
Aminosäureaustausch im HA gewonnen werden, da zusätzliche unerwünschte Mutationen in lvHA auftraten.
** = Dieses Virus konnte trotz mehrmaligen Rescue-Versuchen nicht hergestellt werden.
93
Ergebnisse
Mehrfach-Aminosäureaustausche in hvHA:
Aufgrund der beschriebenen Erfahrungen und Überlegungen schien eine Weiterführung der
Analyse, die auf der Einführung von Aminosäureaustauschen in lvHA basiert, nicht sinnvoll.
Stattdessen wurde die Untersuchung der Funktion der Aminosäuren in hvHA fortgesetzt. Es
wurden Mehrfach-Austausche an denselben Positionen wie bei der lvHA-Analyse eingeführt.
Die bei der lvHA-Analyse aufgefallene Position 190 wurde dabei auch miteinbezogen.
Wurde die Deletion des Arginins an Position 133+ mit den Mutationen T131N, T133N in
hvHA kombiniert, so stieg die LD50 des betroffenen Virus hvHA(lv3x) auf 4x104 ffu an (Abb.
26). Wird dieser Wert mit der LD50 des Virus hvHA(Del R133+) von 2x104 ffu (Abb. 24)
verglichen, so lässt sich ein nur geringfügiger Anstieg der LD50 feststellen. Mit 5x104 ffu erzielten die Viren hvHA(lv4x) und hvHA(lv6x) fast denselben Wert wie hvHA(lv3x). Die
zusätzliche Einführung der Austausche K193N (bei hvHA(lv4x)) bzw. K193N, L78P und
Q354H (bei hvHA(lv6x)) wirkte sich somit nicht deutlich auf die LD50 aus. Bei den Viren
hvHA(lv5x) und hvHA(lv7x), die sich von hvHA(lv4x) bzw. hvHA(lv6x) nur durch den
zusätzlichen Austausch D190E unterschieden, stieg die LD50 jedoch weiter auf 5x105 ffu an.
Dies weist auf eine entscheidende Rolle der Position 190 in der untersuchten Aminosäurekonstellation hin. Bei dieser Analyse stimmten für alle untersuchten Viren die LD50-Werte des
ersten und zweiten Rescue-Virus überein.
94
Ergebnisse
LD50 [ffu] Virusbezeichnung:
X
hv
hv
hv
hv
hv
lv
hv
hv
6x102
hvPR/lvNA
hv
hv
hv
lv
hv
lv
hv
hv
>106
hvPR/lvHN
hv
hv
hv
X
hv
lv
hv
hv
4x104
hvHA(lv3x)
5x104
hvHA(lv4x)
5x105
hvHA(lv5x)
5x104
hvHA(lv6x)
lv7x 5x105
hvHA(lv7x)
=
T131N, T133N, Del R133+
=
T131N, T133N, Del R133+, K193N
=
T131N, T133N, Del R133+, D190E, K193N
=
T131N, T133N, Del R133+, K193N, L78P, Q354H
=
T131N, T133N, Del R133+, D190E, K193N, L78P, Q354H
lv3x
lv4x
lv5x
lv6x
Abb. 26: Mehrfach-Aminosäureaustausche in hvHA erniedrigen die Virulenz des Virus hvPR/lvNA. Zur
Bestimmung der LD50 der aufgeführten Viren mit Mehrfach-Aminosäureaustauschen in hvHA wurden Mx1+/+Mäuse mit verschiedenen Dosen der Viren infiziert. Die Durchführung des Experimentes entsprach derjenigen
der in 3.1.1.2 beschriebenen LD50-Bestimmung (siehe Legende von Abb. 6). Die Zusammensetzung der Gensegmente der jeweiligen Viren ist durch rote bzw. blaue Kästen dargestellt, die Segmente von hvPR8 bzw. lvPR8
symbolisieren. Das blau unterlegte „X“ symbolisiert einen Aminosäureaustausch von hv nach lv an den aufgeführten Aminosäurepositionen.
Es stellte sich die Frage, ob die Virulenz steigernden Aminosäureaustausche für die beobachtete Rezeptoraffinität für α2,3- und α2,6-SA und/oder die Fusionsaktivität von hvHA
entscheidend sind.
95
Ergebnisse
3.2.4.2 Einfluss von Aminosäureaustauschen in HA auf dessen Rezeptorbindung und
Fusionsaktivität
Rezeptorbindung der Viren mit Aminosäureaustauschen in hvHA:
Um zu überprüfen, ob sich die Virulenz beeinflussenden Aminosäureaustausche in hvHA auf
die Rezeptorbindung an 2,3- und 2,6-Fetuin auswirken würden, wurde das Virus hvHA(Del
R133+) und die Viren mit Mehrfach-Austauschen in hvHA mit Hilfe des in 3.2.3.1 beschriebenen Feste-Phase-Enzym-Tests untersucht. Diese Viren waren ausgewählt worden, da sie die
Aminosäureaustausche beeinhalteten, die den größten Einfluss auf die LD50 gehabt hatten. Es
wurde spekuliert, dass die Austausche demnach auch die Rezeptorbindung am stärksten
beeinflussen sollten. In dem Test kamen außerdem die Vergleichsviren rlvPR8, rhvPR8,
hvPR/lvNA und hvPR/lvHN zum Einsatz. Die Ergebnisse repräsentieren die Bindungstendenzen, in denen drei unabhängige Versuche übereinstimmten. (Es wurden von Experiment zu
Experiment Schwankungen der absoluten Werte der Affinitätskonstanten beobachtet, die auf
mehrere Faktoren wie Unterschiede in der Temperatur, den Inkubationszeiten, Fetuin-Beschichtung der Platten usw. zurückgeführt werden können. Aus diesem Grund wurden keine
Mittelwerte der drei Experimente gebildet, Abb. 27 beschränkt sich auf eines der drei Experimente.)
Für rlvPR8 und rhvPR8 konnte der zuvor beobachtete Trend bestätigt werden: rhvPR8 zeigte
Affinität für die 2,3- und die 2,6-Form, während rlvPR8 nur an die 2,3-Form band, wobei
seine Affinität für die 2,3-Form höher ausfiel als bei rhvPR8 (Abb. 27 und Abb. 17). Das
Virus hvPR/lvNA, das über hvHA verfügte, zeigte erwartungsgemäß ein ähnliches Verhalten
wie rhvPR8. Durch Einsatz dieses Virus wurde der Einfluss von lvNA auf die Affinität der
Viren kontrolliert. Wie erwartet, da im Test ein NA-Inhibitor eingesetzt worden war, beeinflusste lvNA die Affinität nicht, d. h. die ermittelten Affinitäten aller Viren konnten ausschließlich auf die Funktion von HA zurückgeführt werden. Die Deletion des Arginins an
Position 133+ in hvHA bewirkte, dass das betroffene Virus hvHA(Del R133+) im Vergleich
zu rhvPR8 eine erhöhte Affinität für 2,3- als auch für 2,6-Fetuin aufwies. hvHA(Del R133+)
verhielt sich somit bezüglich der Bindung an 2,3-Fetuin ähnlich wie rlvPR8. Bezüglich der
Bindung an 2,6-Fetuin zeigte es eine höhere Affinität als rhvPR8. Die Einführung zusätzlicher
Aminosäureaustausche in hvHA bei den Viren hvHA(lv3x), hvHA(lv4x) und hvHA(lv6x)
veränderte die Rezeptoraffinität im Vergleich zu hvHA(Del R133+) nicht. Interessanterweise
ging die Bindung an 2,6-Fetuin bei den Viren hvHA(lv5x) und hvHA(lv7x), die verglichen
96
Ergebnisse
mit hvHA(lv4x) bzw. hvHA(lv6x) zusätzlich über den D190E-Austausch verfügten, komplett
verloren. hvHA(lv5x) und hvHA(lv7x) glichen somit in ihren Bindeeigenschaften rlvPR8.
Das Virus hvPR/lvHN zeigte, wie aufgrund des Besitzes von lvHA erwartet, ein ähnliches
Verhalten wie rlvPR8.
18
2,3-Fetuin-HRP
16
2,6-Fetuin-HRP
Kaff [ml/U]
14
12
10
8
6
4
2
rhv
PR
8
hvP
R/l
vN
hvH
A
A(D
el R
133 +
)
hvH
A(l
v3x
)
hvH
A(l
v4 x
)
hvH
A(l
v5 x
)
hvH
A(l
v6x
)
hvH
A(l
v7x
)
hvP
R/l
vH
N
R8
rlvP
hum
an
r
avi
ä
Ko
ntro
l
le
0
Abb. 27: Rezeptoraffinität der Viren mit Aminosäureaustauschen in hvHA. a) Die angegebenen Viren mit
Aminosäureaustauschen in hvHA sowie die Vergleichsviren rlvPR8, rhvPR8, hvPR/lvNA und hvPR/lvHN
wurden, wie in Abb. 17 vorgestellt, hinsichtlich ihrer Affinität für 2,3- und 2,6-Fetuin-HRP untersucht. „Kontrolle“ = Inkubation mit Puffer statt Virus, „aviär“ = aviäres Kontrollvirus: A/Wildente/Alberta/47/98 (H4N1),
„human“ = humanes Kontrollvirus: A/Memphis/14/96 (H1N1).
97
Ergebnisse
Fusionsaktivität des durch Aminosäureaustausche modifizierten hvHA-Proteins:
Um außerdem zu erfahren, wie die für die Virulenz kritischen Aminosäureaustausche in
hvHA seine Fusionsaktivität beeinflussen, wurden die hvHA-Proteine mit den entscheidenden
Einzel- bzw. Mehrfachaustauschen mit Hilfe des in 3.2.3.2 beschriebenen Luziferase-Reportergen-Fusionstests untersucht. Da lvHA und hvHA bei dem pH-Wert 5,5 den größten Unterschied in ihrer Fusionsaktivität gezeigt hatten (Abb. 20 und 22), wurden die modifizierten
HA-Proteine bei diesem pH-Wert getestet. Es zeigte sich, dass die Einführung der als kritisch
identifizierten Einzelaustausche in hvHA nicht zu einer Erniedrigung der Fusionsaktivität von
hvHA führte (Abb. 28a). Mit einer zunehmenden Anzahl an Mehrfachaustauschen in hvHA
sank die Fusionsaktivität (Abb. 28b). Der deutlichste Unterschied zu hvHA ergab sich bei den
Proteinen hvHA(lv6x) und hvHA(lv7x). Da hvHA(lv6x) und hvHA(lv7x) beide über Austausche an den Positionen 78 und 354 verfügten, wurde der Beitrag von Position 78 und 354
genauer untersucht (Abb. 28c). Die Einführung der Austausche L78P und Q354H in hvHA
ließ die Fusionsaktivität von hvHA auf ca. ein Drittel absinken. Umgekehrt führte die Einführung der Austausche P78L und H354Q in lvHA zu einem Anstieg der Fusionsaktivität von
lvHA auf ca. ein Viertel der Aktivität von hvHA. Bei der Untersuchung von hvHA(lv4x) und
hvHA(lv5x) mit den jeweils zusätzlich eingeführten Austauschen L78P oder Q354H schien
keine der beiden Positionen bezüglich ihres Einflusses auf die Fusionsaktivität klar zu dominieren.
Abschließend wurde geprüft, ob das Absinken der Fusionsaktivität, das bei der Einführung
der Austausche L78P und Q354H in hvHA beobachtet worden war, mit einer Erniedrigung
der Virulenz korrelierte. Es zeigte sich, dass dies der Fall war: Das Virus hvHA(L78P,
Q354H) erreichte mit 5x103 ffu eine im Vergleich zu hvPR/lvNA um den Faktor 8 erhöhte
LD50 in Mx1+/+-Mäusen (Abb. 28d).
98
Ergebnisse
Relative Aktivität [x-fach]
c)
b)
a)
20
16
12
8
4
Kontrolle
0
anti-HA
anti-Tubulin
lvHA
hvHA
hvHA(L78P)
hvHA(T133N)
hvHA(Del R133+)
hvHA(K193N)
hvHA(Q354H)
lvHA
hvHA
hvHA(lv3x)
hvHA(lv4x)
hvHA(lv5x)
hvHA(lv6x)
hvHA(lv7x)
lvHA
hvHA
hvHA(L78P,Q354H)
lvHA(P78L,H354Q)
hvHA(lv4x,L78P)
hvHA(lv4x,Q354H)
hvHA(lv5x,L78P)
hvHA(lv5x,Q354H)
d)
LD50 [ffu]
Virusbezeichnung:
hv
hv
hv
hv
hv
lv
hv
hv
6x102
hvPR/lvNA
hv
hv
hv
lv
hv
lv
hv
hv
>106
hvPR/lvHN
hv
hv
hv
X
hv
lv
hv
hv
5x103
hvHA(L78P,Q354H)
X
= L78P, Q354H
Abb. 28: Die Aminosäureaustausche L78P und Q354H in hvHA vermitteln eine reduzierte Fusionsaktivität von hvHA und eine Senkung der Virusvirulenz. a-c) Die Fusionsaktivität bei pH 5,5 von in 293TZellen exprimiertem lvHA, hvHA, lvHA(P78L,H354Q) bzw. hvHA mit Einzel- oder Mehrfach-Aminosäureaustauschen wurde mit dem in Abb. 21 präsentierten Luziferase-Reportergen-Fusionstest bestimmt. Die Firefly-Luziferase-Werte wurden mit den Renilla-Luziferase-Werten normalisiert und als x-fache Aktivität relativ
zum Wert von lvHA berechnet. Der von lvHA bei pH 5,5 erzielte Wert wurde auf 1 gesetzt. Die gestrichelte
Linie gibt den Mittelwert der Kontrolle an. Als Kontrolle dienten Zellen, die nicht mit einem Expressionsplasmid für HA sondern für NA transfiziert wurden. Die Abbildungen zeigen jeweils die Mittelwerte von drei
unabhängigen Experimenten. hvHA(lv6x), hvHA(lv7x) und hvHA(L78P,Q354H) zeigten signifikant niedrigere
Werte verglichen mit hvHA. Die Aktivität von lvHA(P78L,H354Q) war signifikant erhöht in Bezug auf die
Aktivität von lvHA (P ≤ 0,04 nach GraphPad QuickCalcs: t test calculator). Die Expression von lvHA bzw.
hvHA und zellulärem Tubulin wurde mittels Western Blot-Analyse kontrolliert. d) Zur Bestimmung der LD50
des Virus hvHA(L78P, Q354H) wurden Mx1+/+-Mäuse mit verschiedenen Dosen des Virus infiziert. Die
Durchführung des Experimentes entsprach derjenigen der in 3.1.1.2 beschriebenen LD50-Bestimmung (siehe
Legende von Abb. 6). Die Zusammensetzung der Gensegmente der jeweiligen Viren ist durch rote bzw. blaue
Kästen dargestellt, die Segmente von hvPR8 bzw. lvPR8 symbolisieren. Das blau unterlegte „X“ symbolisiert
einen Aminosäureaustausch von hv nach lv an den aufgeführten Aminosäurepositionen.
99
Diskussion
4
Diskussion
In dieser Arbeit wurden am Beispiel des Influenza-A-Virus hvPR8, das im Vergleich zu
Standard-PR8-Viren, wie lvPR8, eine außergewöhnliche Virulenz in Mx1+/+-Mäusen besitzt,
das HA-Protein und die Polymeraseuntereinheiten hinsichtlich ihres Beitrags zur Virulenz
untersucht. Wie bereits in der Einleitung ausführlich erläutert wurde, konnten diese Proteine
als entscheidende Virulenzfaktoren einiger Influenza-A-Viren identifiziert werden, darunter
das Spanische Grippe-1918-Virus und H5N1-Viren (siehe 1.2).
Die erhöhte Virulenz von hvPR8 in Mx1+/+-Mäusen ist von besonderem Interesse, da MxProteine entscheidende Faktoren in der Interferon induzierten Wirtsabwehr von Influenza-AViren darstellen. Da auch der Mensch über ein intaktes Mx-System verfügt, stellen Mx1+/+- im
Vergleich zu Mx1-/--Mäusen ein besseres Tiermodell für die Untersuchung von Influenza-AVirus-Infektionen dar.
Basierend auf den vorausgegangenen Studien von Grimm et al. (2007) wurde die Hypothese
aufgestellt, dass hvPR8 der Interferon vermittelten Abwehr durch eine extrem schnelle Replikation entgeht. Diese könnte u. a. durch ein effizientes, durch die viralen Glykoproteine
vermitteltes Eindringen des Virus in die Zelle und dem folgenden Wirken der Polymeraseuntereinheiten, u. a. durch ihre hohe Polymeraseaktivität, ermöglicht werden.
In dieser Arbeit wurden zunächst Studien zum Beitrag der Polymeraseproteine zur Virulenz
von hvPR8 vorgestellt.
100
Diskussion
4.1
Bedeutung der Polymeraseproteine für die Virulenz von
hvPR8
4.1.1
PB2 und PA sind für eine Erhöhung der Polymeraseaktivität und
für die Virulenz von hvPR8 entscheidend
Mit Hilfe von LD50-Studien in Mx1+/+-Mäusen, bei welchen Reassortantenviren zum Einsatz
kamen, die je eine Polymeraseuntereinheit von hvPR8 besaßen, konnten PB2 und PA als
entscheidende Virulenz bestimmende Polymeraseuntereinheiten identifiziert werden. So
bewirkte PB2 von hvPR8 eine Erniedrigung der LD50 auf denselben Wert (<102 ffu), den das
Virus erzielte, das über alle drei Polymeraseuntereinheiten von hvPR8 verfügte. Mit PA von
hvPR8 sank die LD50 dagegen nicht ganz so stark ab (5x102 ffu). Außerdem bewirkten PB2
bzw. PA von hvPR8 eine Erhöhung der Virustiter in den Lungen von Mx1-/--Mäusen und eine
Erhöhung der Polymeraseaktivität im Minireplikonsystem, wobei PB2 von hvPR8 in beiden
Fällen einen größeren Einfluss als PA zeigte. Man kann schlussfolgern, dass PB2 und in
einem geringerem Maß PA zur Virulenz von hvPR8 beitragen, und dass ihre Virulenz
fördernde Eigenschaft u. a. auf der Erhöhung der Polymeraseaktivität und damit der Replikationsgeschwindigkeit beruht.
Es zeigte sich, dass PA von hvPR8 die Polymeraseaktivität nicht im selben Ausmaß erhöhte,
wie es eine Senkung der LD50 und eine Erhöhung der Lungenvirustiter bewirkte. Es kann
somit spekuliert werden, dass PA neben der Erhöhung der Polymeraseaktivität weitere
Eigenschaften besitzt, welche die Virulenz maßgeblich beeinflussen. In einer kürzlich veröffentlichten Studie, in der hvPR8 zum Einsatz kam, wurde vorgeschlagen, dass sowohl PB2 als
auch PA dazu beitragen, die zelluläre Transkription zu unterbinden, indem sie den Abbau der
zellulären RNA Polymerase II induzieren. Hierbei könnte PB2 die Funktion von PA regulieren, wobei eine proteolytische Aktivität von PA am Abbau der RNA Polymerase II beteiligt
sein könnte (117).
Erstaunlicherweise bewirkte die Polymeraseuntereinheit PB1 von hvPR8 eine Erniedrigung
der Virusvirulenz und der Polymeraseaktivität, wenn sie mit PB2 und PA von lvPR8
kombiniert wurde. Da PB1 das Bindeglied zwischen PA und PB2 darstellt, könnte sich PB1
von hvPR8 in seiner Interaktion mit den anderen Untereinheiten von hvPR8 so gut an diese
101
Diskussion
angepasst haben, dass es nur in Kombination mit ihnen optimal funktionieren kann.
Andererseits könnte der scheinbar „negative“ Effekt des PB1 von hvPR8 dem Virus einen
Vorteil bieten, indem er einer weiteren Steigerung der Polymeraseaktivität entgegen wirkt, die
sich, wie schon beschrieben wurde (28), nachteilig auf die Virulenz auswirken könnte. Somit
würde PB1 dazu beitragen, dass ein Optimum der Polymeraseaktivität erhalten wird. Im
Einklang mit dieser Annahme steht, dass das Virus hvPR/lvPB1, das sich von hvPR8 durch
den Besitz des PB1 von lvPR8 unterscheidet, eine leicht geringere Virulenz als hvPR8 zeigt
(40).
Weiterhin wurde ermittelt, welche der drei bzw. zwei Aminosäuren in PB2 bzw. PA, die sich
zwischen hvPR8 und lvPR8 unterscheiden, für die Virusvirulenz und Polymeraseaktivität
ausschlaggebend sind. In der Einleitung wurden die Aminosäureaustausche Glutaminsäure zu
Lysin an Position 627 und Asparaginsäure zu Asparagin an Position 701 in PB2 hervorgehoben, die eine erhöhte Virulenz von Influenza-A-Viren in Säugetieren vermittelten (50)
(28). Da lvPR8 und hvPR8 jedoch beide ein Lysin an Position 627 und ein Asparagin an
Position 701 in PB2 tragen, konnte geschlussfolgert werden, dass andere Positionen für die
erhöhte Virulenz und Polymeraseaktivität von hvPR8 entscheidend sind. Ebenso konnte
ausgeschlossen werden, dass Position 97 in PA, deren Beitrag zur Virulenz in einem Mausmodell gezeigt wurde (130), ausschlaggebend ist, da hvPR8 und lvPR8 an dieser Position in
PA übereinstimmten.
Es stellte sich heraus, dass hauptsächlich der Isoleucin zu Valin Austausch an Position 504
(I504V) in PB2 und der Isoleucin zu Leucin Austausch an Position 550 (I550L) in PA den
Proteinen ihre Virulenz und Polymeraseaktivität steigernde Wirkung verleihen. Dies ist
erstaunlich, wenn man bedenkt, dass es sich um konservative Austausche handelt, bei
welchen sich die beteiligten Aminosäuren nur minimal unterscheiden. Die Analyse von PB2und PA-Sequenzen einer Vielzahl von Virusisolaten aus Säugetieren und Vögeln (PB2Analyse: 2317 Viren, PA-Analyse: 2190 Viren) zeigte, dass Valin gegenüber Isoleucin an
Position 504 in PB2 und Leucin gegenüber Isoleucin an Position 550 in PA die bevorzugten
Aminosäuren in der Natur darstellen (119). Diese Aminosäuren scheinen somit für die
Polymerasefunktion der meisten Viren von Vorteil zu sein.
Die Position 504 in PB2 liegt in einer Region, von der angenommen wird, dass sie ein
bewegliches Bindeglied zwischen der Cap-Bindedomäne (Position 318-483) (42) und der
102
Diskussion
sogenannten 627-Domäne von PB2 (Position 538-693) (143) bildet. Position 504 könnte
folglich für die Interaktion mit anderen Polymeraseuntereinheiten oder zellulären Faktoren
wichtig sein. Weiterhin lässt sich spekulieren, dass Position 504 den Kerntransport von PB2
beeinflusst, da sie in der Nähe einer Region liegt, der die Funktion einer NLS-Sequenz
(Position 449-495) zugewiesen wurde (95). Valin an Position 504 könnte, so wie es für
Asparagin an Position 701 in PB2 eines mausadaptierten H7N7-Virus diskutiert wurde (29),
eine verbesserte Interaktion mit der Kernimportmaschinerie vermitteln und somit einen
effizienten Transport von PB2 in den Kern bewirken.
Ein Aminosäureaustausch an Position 556 in PA, nicht weit entfernt von der in dieser Arbeit
vorgestellten, kritischen Position 550, wurde schon im Zusammenhang mit einer Adaptation
eines humanen H3N2-Virus an die Maus beschrieben. Allerdings wurde nicht nachgewiesen,
dass dieser Austausch eine Erhöhung der Virulenz vermittelte (10). Position 550 liegt laut
neueren Strukturdaten in einer Region, deren Funktion noch unklar ist. Der β-Strang, auf dem
sich Position 550 befindet, ist allerdings an der Bildung einer vermuteten RNA-Bindegrube
und eines Polymeraseaktivität beeinflussenden Kanals im PA-Protein beteiligt (53). Es bleibt
zu klären, ob Position 550 einen Einfluss auf diese Strukturen und die assoziierten Funktionen
hat.
4.1.2
Weitere Viruspassagierungen in der Maus bringen hochvirulente
Viren mit unterschiedlichen Mutationen in den Polymeraseproteinen hervor
In zwei unabhängigen Passagierungs-Experimenten in Mx1+/+-Mäusen, für die das Virus
hvPR/lvPPP (PR) als Ausgangsvirus gewählt worden war, wurde getestet, ob die Aminosäureaustausche I504V in PB2 und I550L in PA wieder auftreten würden und somit eine
entscheidende Aminosäurekonstellation der Polymeraseproteine darstellten, mit der lvPR8
Virulenz gewinnt. Die aus den beiden Experimenten hervorgehenden Viren PR-ma1 und PRma2 zeigten eine hohe Virulenz in Mx1+/+-Mäusen, die bei PR-ma1 auf einen einzigen
Aminosäureaustausch, I504V in PB2, der auch bei hvPR8 aufgetreten war, und bei PR-ma2
auf die Austausche Lysin zu Arginin an Position 208 (K208R) in PB1 und Glutaminsäure zu
Glycin an Position 349 (E349G) in PA zurückgeführt werden konnte. Im Fall von PR-ma1
103
Diskussion
wurde somit mit dem Austausch I504V in PB2 einer der Virulenzmarker von hvPR8
wiedergefunden. Doch wie anhand von PR-ma2 klar wurde, konnte das Ausgangsvirus auch
mit einer anderen Aminosäurekonstellation der Polymeraseproteine Virulenz gewinnen. Die
Austausche K208R in PB1 und E349G in PA besaßen beide eine Virulenz und Polymeraseaktivität steigernde Wirkung, wobei die E349G-Mutation einen größeren Effekt zeigte.
Wurden die beiden Mutationen kombiniert, so wurde ein additiver Effekt der Austausche
beobachtet, d. h. zusammen stellten sie die maximale Polymeraseaktivität und die Virulenz
von PR-ma2 her.
Während Position 349 in PA in einer Region mit unbekannter Funktion liegt, befindet sich
Position 208 in PB1 innerhalb des einen Teils (Position 203-216) der zweiteiligen NLSRegion (99) des Proteins und könnte somit den Kerntransport des PB1-PA Subkomplexes
beeinflussen. Interessanterweise wurde der Austausch K208R auch in PB1 von hvPR8
nachgewiesen. Hier scheint er allerdings in Kombination mit anderen Aminosäureaustauschen
PB1 eine Virulenz und Polymeraseaktivität senkende Wirkung zu verleihen.
Aus der Analyse von PB1- und PA-Sequenzen von Virusisolaten aus Säugetieren und Vögeln
(PB1-Analyse: 2033 Viren, PA-Analyse: 2190 Viren) ging in diesem Fall hervor, dass
Arginin im Vergleich zu Lysin an Position 208 in PB1 und Glycin im Vergleich zu Glutaminsäure an Position 349 in PA sehr seltene Aminosäuren darstellen (119). Daraus kann man
schließen, dass es einerseits bestimmte Aminosäurekonstellationen in den Polymeraseproteinen gibt, die sich bevorzugt in der Virusevolution durchsetzen, und, falls diese Virulenz
vermitteln, als Virulenzmarker bei der Beurteilung neuer Viren dienen können. Andererseits
muss man damit rechnen, dass ein Virus, wie sich am Beispiel von PR-ma2 zeigte, auch mit
einem neuartigen Aminosäuremuster der Polymeraseproteine Virulenz gewinnen kann.
104
Diskussion
4.2
Bedeutung des Hämagglutinins für die Virulenz von hvPR8
Der Hauptteil meiner Arbeit konzentrierte sich auf den Beitrag des HA-Proteins zur Virulenz
von hvPR8, das, wie bereits gezeigt worden war, zusammen mit NA eine Mindestausstattung
für die Virulenz des Virus bildet (40). Die Hypothese, dass dies darauf beruht, dass HA und
NA ein effizientes Eindringen von hvPR8 in die Zelle vermitteln, wurde in dieser Arbeit
zunächst durch weitere Tests überprüft.
4.2.1
Die Glykoproteine von hvPR8 ermöglichen ein effizientes
Eindringen des Virus in L929- und MDCK-H-Zellen
Aus einer Wachstumskinetik in Mx1-/--Mäusen ging hervor, dass das Virus lvPR/hvHN mit
den Glykoproteinen von hvPR8 schon zu sehr frühen Zeitpunkten nach Infektion einen
Replikationsvorteil gegenüber rlvPR8 besitzt. Es wurde untersucht, ob dieser Replikationsvorteil darauf beruht, dass die Glykoproteine von hvPR8 in der frühen Phase der Virusreplikation ein effizientes Eindringen des Virus in die Zellen des Respirationstrakts der Maus
vermitteln. Für diese Hypothese sprach, dass nach Infektion von L929- und auch MDCK-HZellen, die keine multizyklische Infektion von PR8 zulassen, bei den Viren, die über die
Glykoproteine von hvPR8 verfügten, eine frühere Akkumulation des NP-Proteins beobachtet
wurde. Da die Rezeptorbindung und Fusionsaktivität des HA-Proteins für ein effizientes
Eindringen von hvPR8 in die Zelle eine Rolle spielen könnten, wurde das Virus diesbezüglich
im Vergleich zu lvPR8 untersucht. Neben der Rezeptorbindung und Fusionsaktivität wurde
die HA-Spaltbarkeit als eine wichtige, die Pathogenität von Influenza-A-Viren bestimmende
Eigenschaft von hvPR8 analysiert.
4.2.2
rlvPR8 und rhvPR8 unterscheiden sich nicht in der Spaltbarkeit
ihres HA-Proteins
Eine Sequenzanalyse ergab, dass das HA-Protein von hvPR8 keine multibasische Spaltstelle
besitzt, die mit der hohen Pathogenität von H5- und H7-Viren in Verbindung gebracht wird
(siehe 1.2.1). Allerdings wurde im HA von hvPR8 an Position 328, die sehr nah an der
Spaltstelle liegt (siehe 3.2.3.3), ein Tyrosin zu Serin Austausch (Y328S) nachgewiesen. Die
Vermutung lag nahe, dass diese Mutation auf die HA-Spaltung Einfluss haben könnte. Die
Viren rhvPR8 und rlvPR8 unterschieden sich jedoch nicht in ihrer Abhängigkeit von der
105
Diskussion
Protease Trypsin bei der Spaltung ihrer in 293T-Zellen exprimierten HA-Moleküle und in
ihrer Multizyklus-Infektion in MDCK-Zellen. Diese Daten deuten darauf hin, dass hvPR8
keinen Vorteil dadurch erzielt, dass sein HA-Protein aufgrund einer erhöhten Proteasesensitivität besonders leicht gespalten werden kann. Es bleibt allerdings offen, inwieweit man
von Trypsin auf die relevanten, endogenen Proteasen in der Mauslunge schließen darf. Die
Vermutung, dass Position 328 für die durch hvHA vermittelte Virulenz kritisch sein könnte,
wurde bei der Analyse der 17 Aminosäureaustausche in hvHA nicht bekräftigt: Wurde an
Position 328 in hvHA Serin zu Tyrosin zurückgetauscht, so zeigte das betreffende Virus keine
erhöhte LD50 in Mx1+/+-Mäusen. Man kann allerdings spekulieren, dass ein die Virulenz
beeinflussender Effekt von Position 328 nur mit einhergehenden Mutationen an den anderen
16 kritischen Positionen manifest wird.
4.2.3
Rolle der Rezeptorbindung des HA-Proteins für die Virulenz von
hvPR8
Neben der Spaltbarkeit stellt die Rezeptorbindung des HA-Proteins eine wichtige Eigenschaft
dar, die für das Eindringen des Virus in die Zelle essentiell ist. Mit Hilfe eines Feste-PhaseEnzymtests wurde die Spezifität und Affinität von rhvPR8 für α2,3- bzw. α2,6-verknüpfte
Sialinsäure (2,3- bzw. 2,6-SA) enthaltendes Fetuin als auch für die Sialylglycopolymere 2,3SA enthaltende 3’Sialyllaktose bzw. 2,6-SA enthaltendes 6’Sialyl-(N-Acetyllactosamin) im
Vergleich zu rlvPR8 untersucht. Es stellte sich heraus, dass rhvPR8 im Vergleich zu rlvPR8
eine höhere Affinität für 2,6-SA und eine niedrigere Affinität für 2,3-SA besitzt.
Man kann spekulieren, dass hvPR8 aufgrund seiner von lvPR8 unterschiedlichen Rezeptorbindung Zellen effizienter infizieren kann und/oder einen von lvPR8 verschiedenen Zelltropismus im Respirationstrakt der Maus besitzt. Hierbei könnten Zellen befallen werden, die
ein effizientes Eindringen von hvPR8 begünstigen. Um zu überprüfen, ob die extrem schnelle
Replikation von hvPR8 in der Mauslunge damit zusammenhängt, welchen Zelltyp das Virus
befällt, wurden Mx1+/+-Mäuse mit rhvPR8 bzw. rlvPR8 infiziert und hinsichtlich Virus infizierter Zellen im Alveolargewebe ihrer Lungen untersucht. Dabei wurden Paraffinschnitte der
Lungen zu verschiedenen Zeitpunkten, im Rahmen von 24-96 h nach Infektion, mittels
Immunfluoreszenz analysiert. Für beide Viren zeigte sich dasselbe Bild: Die Virus- und
Typ II-Pneumozyten-Färbung kamen vollständig zur Deckung. rhvPR8 und rlvPR8 schienen
106
Diskussion
im Alveolargewebe, bestehend aus langgestreckten Typ I- Pneumozyten, kugeligen, Surfactant-produzierenden Typ II-Pneumozyten und gegebenenfalls eingewanderten Immunzellen,
ausschließlich die Typ II-Zellen infiziert zu haben. Dies deutet darauf hin, dass rhvPR8
keinen von rlvPR8 verschiedenen Zelltropismus im Alveolargewebe besitzt. Dieses Experiment gab keinen Hinweis darauf, dass Immunzellen wie eingewanderte Makrophagen von
den Viren infiziert werden. Dies muss jedoch mit geeigneten Antikörpern, die mir bisher nicht
zur Verfügung standen, genauer untersucht werden. Außerdem wäre es interessant zu klären,
welche Zellen hvPR8 und lvPR8 in anderen Teilen des Respirationstrakts befallen. Um dem
nachzugehen, könnten die Viren auf ihren Tropismus und ihr Wachstum in murinen
Trachealepithelzellkulturen getestet werden, wie uns von Andrew Pekosz, der diese Kulturen
etabliert hat, angeboten wurde.
Nimmt man an, dass hvPR8 keinen von lvPR8 verschiedenen Zelltropismus besitzt, so
könnten ihm jedoch seine Rezeptorbindungseigenschaften zu einem effizienteren Eindringen
in die Typ II-Zellen verhelfen. Die Literatur ist hinsichtlich der Rezeptoren, die auf Typ IIZellen exprimiert werden, nicht eindeutig. Bis heute wurden nur wenige Studien durchgeführt, die sich mit der Verteilung von 2,3- bzw. 2,6-SA in den respiratorischen Organen der
Maus beschäftigten. Bezüglich 2,3-SA stimmten alle Studien überein, dass der Rezeptor im
gesamten Respirationstrakt der Maus exprimiert wird. Dahingegen detektierte ein Teil der
Forschungsgruppen 2,6-SA in der Lunge (37, 80, 102), andere jedoch nicht (30, 57). Im
Gegensatz zu Gagneux et al. (2003) und Ibricevic et al. (2006) berichteten Ning et al. (2009),
dass 2,6-SA in der Luftröhre exprimiert wird. Zum Nachweis der Rezeptoren wurden in allen
Studien an Zuckergruppen bindende Lektine eingesetzt. Es ist allerdings nicht klar, inwieweit
sich diese (u. a. durch verschiedene Hersteller bedingt) unterschieden. Für die voneinander
abweichenden Ergebnisse der Arbeiten könnten außerdem unterschiedliche Methoden zur
Fixierung der untersuchten Gewebe oder eine variierende Expression der für die Synthese von
2,6-SA erforderlichen Sialyltransferase verantwortlich sein (57).
Da Lektine nur für terminale Zuckerverknüpfungen hochspezifisch sind, kann mit ihnen nur
zwischen 2,3- und 2,6-SA unterschieden werden. In den letzten Jahren häuften sich jedoch
Hinweise dafür, dass sich die Rezeptorspezifität des HA-Proteins von Influenza-A-Viren nicht
nur auf die Unterscheidung der 2,3- oder 2,6-Verknüpfung der Sialinsäure mit Galaktose
beschränkt. Es wurde gezeigt, dass HA-Proteine in direkten Kontakt mit vielen subterminalen,
sich an die Galaktose anschließenden Zuckergruppen treten, welche die Spezifitität der Viren
107
Diskussion
für 2,3- bzw. 2,6-SA beeinflussen (12, 33, 131). Um ein genaues Profil der Rezeptorspezifität
von hvPR8 verglichen mit lvPR8 zu erhalten, könnte die sogenannte „Glycan Microarray“Technologie angewendet werden, bei der die Interaktion der HA-Proteine mit Hunderten auf
einem Chip befestigten, verzweigten oder unverzweigten, modifizierten oder unmodifizierten
Zuckergruppen, die alle mit 2,3- bzw. 2,6-SA enden, untersucht werden kann (137). Es lässt
sich schlussfolgern, dass man mit einer genaueren Analyse der Rezeptorbindeeigenschaften
von lvPR8 und hvPR8, weiteren Infektionsstudien bezüglich des Tropismus der Viren und mit
einer gegenüber der Lektin-Methode verbesserten Technik zur Bestimmung der Rezeptorverteilung im Gewebe, der Frage nach der Virulenz vermittelnden Rezeptorbindung von
hvPR8 auf den Grund gehen könnte.
Man kann spekulieren, inwieweit die Affinität von hvPR8 für 2,3- bzw. 2,6-SA für seine
Virulenz von Bedeutung sind. Ibricevic et al. (2006) zeigten Daten, die für die Expression des
2,3-SA-, aber nicht des 2,6-SA-Rezeptors auf Typ II-Pneumozyten der Mauslunge sprechen.
Außerdem wurde beobachtet, dass ein H5N1-Virus mit Spezifität für 2,3-SA Typ II-Pneumozyten in der Maus infizierte (148). Geht man demnach davon aus, dass die Affinität für 2,3SA für die Infektion von Typ II-Zellen entscheidend ist, wäre es erstaunlich, dass hvPR8 mit
einer niedrigeren Affinität für 2,3-SA gegenüber lvPR8 einen Vorteil besitzt. Dieser könnte
jedoch darin bestehen, dass eine geringere Rezeptoraffinität des HA-Proteins ein erleichtertes
Ablösen der Viruspartikel von den Rezeptoren im Fall einer ausbleibenden Endozytose
ermöglicht. Es wird vermutet, dass Viruspartikel mehrere „Andockversuche“ unternehmen,
bis sie in Zellen eindringen. Hierbei ist auch eine an die Aktivität von HA angepasste
Neuraminidase von Bedeutung (104, 151). Es wäre interessant zu erfahren, ob sich hvPR8
und lvPR8 in ihrer NA-Aktivität unterscheiden. Für eine genaue Messung der enzymatischen
Aktivität der NA-Proteine stand mir bisher jedoch kein geeigneter Antikörper zur Quantifizierung des NA-Gehalts der Viren zur Verfügung. Im Zusammenhang mit der NA-Aktivität
könnte der Aminosäureaustausch Asparagin (lvNA) zu Serin (hvNA) an Position 146 in NA
von Bedeutung sein, da beobachtet wurde, dass er die Glykosylierung an dieser Stelle
verhindert und die enzymatische Aktivität des NA-Proteins beeinflusst (75).
Die geringere Affinität von hvPR8 für 2,3-SA könnte u. a. auch verhindern, dass Muzine im
respiratorischen Trakt der Maus das Virus abfangen. Es wird zum Beispiel angenommen, dass
im Menschen 2,3-SA bindende Viren stärker durch die humanen bronchialen, vorwiegend
2,3-SA enthaltenden Muzine gehemmt werden als 2,6-SA bindende Viren (18, 74).
108
Diskussion
Mit der Annahme, dass eine geringe Affinität für 2,3-SA für die Virulenz von hvPR8 entscheidend ist, wäre vereinbar, dass im Fall des Virus hvHA(Del R133+) ein durch die Deletion an Position 133+ erzielter Gewinn an Affinität für 2,3-SA mit einem Virulenzverlust
einherging.
Man kann andererseits auch spekulieren, dass die höhere Affinität von hvPR8 für 2,6-SA eine
entscheidende Rolle für seine Virulenz spielt. Hierfür spricht, dass die Viren hvHA(lv5x) und
hvHA(lv7x) durch den Austausch Asparaginsäure zu Glutaminsäure an Position 190 (D190E)
im Vergleich zu hvHA(lv4x) bzw. hvHA(lv6x) an Virulenz verloren, und dass dieser Austausch mit einem kompletten Verlust der Bindung an 2,6-SA einherging. Da, wie bereits
erwähnt wurde, mehrere Forschungsgruppen 2,6-SA in der Mauslunge detektieren konnten,
wäre es denkbar, dass der 2,6-SA-Rezeptor auf Typ II-Zellen exprimiert wird, und folglich
die höhere Affinität von hvPR8 für 2,6-SA für das Virus von Vorteil ist. Andererseits könnte
auch die Expression des 2,6-SA-Rezeptors auf anderen Zellen im Respirationstrakt, eingewanderte Immunzellen wie alveolare Makrophagen eingeschlossen, von Bedeutung sein.
Es wurden mehrere Studien durchgeführt, in denen die Rezeptorbindung des HA-Proteins mit
einer erhöhten Virulenz in der Maus korreliert wurde. Interessanterweise wurde berichtet,
dass die beiden Isolate A/South Carolina/1/1918 und A/New York/1/1918 des Spanische
Grippe H1N1-Virus wie hvPR8 Asparaginsäure an Position 190 in ihrem HA-Protein tragen,
und dies ihnen Spezifität für 2,6-SA und eine erhöhte Virulenz in der Maus verleiht (113).
Dies spricht dafür, dass die erhöhte Affinität von hvPR8 für 2,6-SA entscheidend ist. In
weiteren Studien mit Viren des H3-Subtyps wurden mehrere Aminosäurepositionen in bzw. in
der Nähe der Rezeptorbindestelle identifiziert, die mit einer erhöhten Virulenz in der Maus in
Verbindung gebracht wurden (89, 63). Diese unterschieden sich allerdings von den in dieser
Arbeit identifizierten, Virulenz vermittelnden und die Rezeptorbindung beeinflussenden Positionen 131, 133, 133+, 190 und 193 im HA-Protein von hvPR8 (siehe 4.2.5).
109
Diskussion
4.2.4
Rolle der Fusionsaktivität des HA-Proteins für die Virulenz von
hvPR8
Als weitere Eigenschaft, die für das Eindringen des Virus in die Zelle entscheidend ist, wurde
die Fusionsaktivität von HA untersucht. Durch die Fusionsaktivität, die das Protein durch das
Absinken des pH-Werts in zellulären Endosomen gewinnt, kann es die Fusion der viralen
Membran mit der Endosomenmembran einleiten, was die Freisetzung des viralen Genoms ins
Zytoplasma der Zelle zur Folge hat.
Mit verschiedenen Tests konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass hvHA verglichen mit
lvHA Fusionsaktivität bei höheren pH-Werten besitzt. Dies könnte für hvPR8 den Vorteil
bieten, dass sein HA-Protein beim Absinken des pH-Werts im Endosom schneller fusionsaktiv wird und folglich das virale Genom schneller ins Zytoplasma gelangt (48). Dies würde
den Replikationszyklus beschleunigen. Darüberhinaus würde dadurch das Risiko sinken, dass
das Virus im Lysosom abgebaut wird (116).
Es wurde mehrfach beobachtet, dass Influenza-A-Viren bei einer Adaptation an die Maus
Fusionsaktivität bei höheren pH-Werten erwarben (48, 63, 152). Es könnte sich dabei somit
auch um eine Anpassung an veränderte Bedingungen in den Endosomen von Mauszellen
handeln.
Es ist wenig darüber bekannt, inwieweit die Fusionsaktivität bei höheren pH-Werten
Influenza-A-Viren Virulenz verleiht. Ein Aminosäureaustausch an Position 352 in HA, nicht
weit entfernt von der die Fusion von hvPR8 beeinflussenden Position 354, bewirkte neben
einer Senkung des Fusions-pH-Werts eine reduzierte Virusreplikation in vitro und eine erhöhte LD50 des betroffenen H7N7-Virus in Mäusen (58). Inwieweit sich der Virulenzverlust
des Virus auf den erniedrigten Fusions-pH-Wert zurückführen lässt, wurde allerdings nicht
genauer untersucht. Studien mit mausadaptierten H3N2-Viren zeigten, dass Aminosäureaustausche an Position 162, 210, 218, 156 plus 218 (63) und 246 (48), die eine Fusion bei
erhöhten pH-Werten vermittelten, zu einer gesteigerten Virulenz führten. Da jedoch neben der
Fusionsaktivität bei höheren pH-Werten eine veränderte Rezeptorbindung erworben wurde,
ist nicht klar, inwieweit die Fusionseigenschaften für die erhöhte Virulenz der Viren
ausschlaggebend ist. Die erwähnten Aminosäureaustausche sind nicht bei der Analyse der
Fusionsaktivität des in dieser Arbeit untersuchten hvPR8 aufgefallen. Stattdessen konnte ein
110
Diskussion
Einfluss der Positionen 78 und 354 auf die Fusionsaktivität nachgewiesen werden (siehe auch
4.2.5).
Es muss weiterhin geklärt werden, inwieweit die Rezeptorbindungs- und Fusionseigenschaften tatsächlich Virulenz vermitteln oder nur Sekundäreffekte darstellen, und andere Eigenschaften des HA-Proteins von hvPR8 für die HA vermittelte Virulenz verantwortlich sind.
Eine kürzlich veröffentlichte Studie mit H5N1-Viren zeigte, dass NA einen Einfluss auf den
pH-Wert der Fusionsaktivität von HA in vitro ausübte (116). Es wäre interessant, zu untersuchen, inwieweit die NA-Proteine von lvPR8 und hvPR8 ebenfalls die Fusionsaktivität der
HA-Proteine der Viren beinflussen.
Es könnte darüberhinaus noch übergeprüft werden, ob hvHA Resistenz gegenüber α− und βInhibitoren verleiht, wie im Fall anderer HA-Proteine von mausadaptierten Viren festgestellt
wurde. β-Inhibitoren sind Mannose bindende Lektine, die das Andocken von HA-Proteinen
an zelluläre Rezeptoren durch Bindung an Zuckergruppen des HA-Proteins verhindern (2).
Bei α-Inhibitoren handelt es sich um Sialinsäure enthaltende Rezeptoranaloga (128). Studien
mit mausadaptierten H1- und H3-Viren zeigten, dass diese Aminosäureaustausche erworben
hatten, die ihnen neben der Virulenz in der Maus, Resistenz gegenüber α- und β-Inhibitoren
(128) bzw. β-Inhibitoren (48) verliehen.
Geht man von einem auf der Rezeptorbindung und/oder Fusion basierenden, effizienten
Eindringen des Virus in Zellen aus, kann man spekulieren, dass die erforderlichen Bedingungen bezüglich der Expression von SA-Rezeptoren und/oder dem Milieu in Endosomen
sowohl in L929-Zellen, MDCK-H-Zellen als auch in Zellen im Respirationstrakt der Maus
gegeben sind, damit die Eigenschaften von hvPR8 zum Tragen kommen. Es ist bekannt, dass
MDCK-Zellen 2,3- und 2,6-SA-Rezeptoren besitzen (59) und somit Andockstellen für Viren
mit 2,3-SA- als auch 2,6-SA-Spezifität bieten. Interessanterweise zeigten H3N2-Viren, die
hinsichtlich ihrer Fähigkeit, in MDCK-Zellen zu wachsen, selektioniert wurden, Fusionsaktivität bei höheren pH-Werten (77, 120), was in dieser Arbeit auch für hvPR8 beobachtet
wurde. Somit kann spekuliert werden, dass eine Fusion bei höheren pH-Werten eine Anpassung an ein Milieu darstellen könnte, das in MDCK-Zellen und den Zellen, die von hvPR8
in im Respirationstrakt der Maus befallen werden, ähnlich ist. Andererseits könnte es sich um
einen Mechanismus handeln, durch den Viren unabhängig von einem bestimmten Zelltyp
Virulenz gewinnen.
111
Diskussion
4.2.5
Identifizierung Virulenz beeinflussender Aminosäuren im HAProtein von hvPR8
Um Aufschluss darüber zu erhalten, welche Aminosäuren im HA-Protein von hvPR8 für die
Virulenz des Virus kritisch sein könnten, wurden reassortante Viren, in deren HA-Protein
Aminosäureaustausche an den zwischen hvPR8 und lvPR8 variierenden 17 Positionen eingefügt worden waren, hinsichtlich ihrer LD50 in Mx1+/+-Mäusen untersucht. Die Schwierigkeit dieser Analyse bestand darin, dass man nicht sicher sein konnte, dass die 17 kritischen
Aminosäuren in hvHA einen additiven, Virulenz steigernden Effekt hatten. Viel wahrscheinlicher schien es, dass sie mit einem Virulenz steigernden wie senkenden Effekt in einer
unvorhersehbaren, zufälligen zeitlichen Abfolge im Laufe des Anpassungsprozesses an die
Maus aufgetreten waren und sich in einem komplexen Zusammenspiel miteinander und mit
den übrigen Aminosäuren im Protein für das Virus bewährt hatten. Demzufolge war es nicht
verwunderlich, dass sich das „Aufbauen der Virulenz“ durch Einführung weniger Aminosäureaustausche in lvHA schwierig gestaltete. Das Virus lvHA(hv3x) (mit den Mutationen
N131T, N133T und Ins R133+) konnte trotz mehrmaligen Rescue-Versuchen nicht hergestellt
werden. Der Grund hierfür könnte sein, dass die Einführung weniger Aminosäureaustausche
in lvHA die Struktur des Proteins und damit seine Funktion ungünstig beeinflusste, sodass das
Virus nicht effizient replizieren konnte. Bei den übrigen Viren mit Austauschen in lvHA war
ein Rescue möglich. Bei fast allen Viren konnte jedoch das Ergebnis des ersten Rescue-Virus
nicht mit dem des zweiten Rescue-Virus bestätigt werden. Es ist denkbar, dass sich aufgrund
des ungünstigen Einflusses der Austausche kompensierende Mutationen in lvHA durchsetzten, die sich unterschiedlich auf die LD50 auswirkten. Hierfür spricht, dass das Virus, das
lvHA mit der Dreifach-Mutation „hv3x“ besaß, jedoch im Unterschied zu dem Virus
lvHA(hv3x) die übrigen Segmente von lvPR8 enthielt, zwei unerwünschte Nukleotidaustausche in seinem HA-Gen aufwies (3.2.4.1), die zu den Aminosäureaustauschen E190V
und N192R führen.
Während die Analyse von Viren mit Aminosäureaustauschen in lvHA aufgrund der
beschriebenen Schwierigkeiten nicht weiterverfolgt wurde, verlief die Analyse von Viren mit
Aminosäureaustauschen in hvHA problemlos, und es konnten reproduzierbare Ergebnisse
gewonnen werden. Bei dieser Analyse sollte die Virulenz der Viren durch die Austausche
„zerstört“ werden. Ein Aminosäureaustausch an den Positionen 78, 133, 193 bzw. 354 in
112
Diskussion
hvHA ließ die LD50 des betreffenden Virus leicht ansteigen. Den größten Effekt erzielte die
Einführung der in lvHA vorkommenden Deletion an Position 133+, welche eine 30-fache
Erhöhung der LD50 bewirkte.
190-Helix
E190D N193K
N131T
N133T
Ins R133+
130-Loop
P78L
220-Loop
Fusionspeptid
H354Q
Abb. 29: HA-Trimer mit den kritischen Aminosäureaustauschen in hvPR8. Die in dieser Arbeit identifizierten, für die Virulenz von hvPR8 kritischen Aminosäureaustausche wurden im HA-Modell des Influenza
A/Puerto Rico/8/34 Mount Sinai-Virus (Gamblin et al. (2004)) in einem der drei Monomere lokalisiert. „Ins“ bezeichnet die Insertion eines Arginins in hvHA verglichen mit lvHA. Die Position „133+“ bezeichnet die Insertion
einer Aminosäure zwischen Position 133 und 134 im HA-Protein des H3-Subtyps. Die Seiten der Rezeptorbindestelle aus 190-Helix, 130-Loop und 220-Loop, sowie das Fusionspeptid, sind rot markiert.
113
Diskussion
Position 133+ liegt in der Nähe der Rezeptorbindestelle (RBS), nicht weit von den Aminosäuren 135 bis 138 entfernt, welche den sogenannten „130-Loop“ bilden (Abb. 29). Diese
Aminosäuren interagieren direkt mit der gebundenen Sialinsäure und nicht mit den sich an die
Sialinsäure anschließenden Zuckergruppen. Man konnte spekulieren, dass eine große Veränderung wie die Deletion eines positiv geladenen Arginins an Position 133+, die Bindung an
Sialinsäure beeinflussen würde. Diese Annahme wurde bestätigt: Bei der Bindung an 2,3bzw. 2,6-Fetuin zeigte das Virus hvHA(Del R133+) im Vergleich zu rhvPR8 eine höhere
Affinität für 2,3- und auch für 2,6-Fetuin. Es erzielte eine ungefähr gleich hohe Affinität für
2,3-Fetuin wie rlvPR8. Der Erwerb dieser Eigenschaft könnte für den Virulenzverlust des
Virus hvHA(Del R133+) verantwortlich sein.
Aufgrund ihrer Nachbarschaft zu Position 133+ und des in der Nähe liegenden „130-Loops“
konnte spekuliert werden, dass die Threonin zu Asparagin Austausche an Position 131 und
133 in hvHA auch die Rezeptorbindung beeinflussen könnten. Beim Vergleich der Viren
hvHA(Del R133+) und hvHA(lv3x) (Austausche in hvHA an Position 131 und 133, sowie
Deletion an Position 133+) bezüglich ihrer Bindung an 2,3- bzw. 2,6-Fetuin wurde jedoch
kein signifikanter, zusätzlicher Effekt der Austausche an Position 131 und 133 festgestellt.
Bezüglich der LD50, bewirkten die beiden Austausche nur einen minimalen Anstieg des Virus
hvHA(lv3x) gegenüber dem Virus hvHA(Del R133+). Hierfür könnte der Austausch an
Position 133 verantwortlich sein, der, wurde er allein in hvHA eingeführt, einen ca. 8-fachen
Anstieg der LD50 bewirkte.
Ein additiver Effekt der Aminosäureaustausche schien auch bei der Kombination „lv4x“
(Austausche in hvHA an Position 131, 133 und 193, sowie Deletion an Position 133+) plus
dem Austausch Asparaginsäure zu Glutaminsäure an Position 190 (D190E) vorzuliegen. Die
Einführung des Austausches D190E in das HA-Protein des Virus hvHA(lv4x) bewirkte einen
10-fachen Anstieg der LD50. Dieser Austausch erzielte denselben Effekt, wenn er in das HAProtein des Virus hvHA(lv6x) (Austausche in hvHA an Position 131, 133, 193, 78 und 354
sowie Deletion an Position 133+) eingeführt wurde. Erstaunlicherweise ging die Bindung der
Viren hvHA(lv4x) und hvHA(lv6x) an 2,6-Fetuin durch den Austausch D190E in ihrem HAProtein komplett verloren. Die resultierenden Viren hvHA(lv5x) und hvHA(lv7x) zeigten mit
einer erhöhten Affinität für 2,3-Fetuin und der ausbleibenden Bindung an 2,6-Fetuin dieselben Eigenschaften wie rlvPR8. Man kann spekulieren, dass diese den Virulenzverlust der
Viren verursachten.
114
Diskussion
Position 190 ist Teil der „190-Helix“ der Rezeptorbindestelle (Abb. 29). Die Bedeutung
dieser Position für die Bindung von 2,6-SA steht im Einklang mit Studien, die belegen, dass
der Austausch von Glutaminsäure zu Asparaginsäure an Position 190 eine Präferenz von
H1N1-Viren für den 2,6-SA-Rezeptor vermittelt (83, 38). Es wird vermutet, dass dieser
Austausch die Rezeptorbindegrube vergrößert und dadurch die Affinität für die 2,6-Verknüpfung der Sialinsäure erhöht wird (138). Die Kristallstruktur des HA-Proteins des Virus
A/Schwein/Iowa/30 H1N1 in Komplex mit 2,6-SA enthaltenden Sialopentasacchariden zeigte, dass die Asparaginsäure an Position 190 eine Interaktion mit der zweiten Zuckergruppe
(GlcNAc = N-Acetlyglucosamin) eingeht, die auf die Sialinsäure folgt (34). Diese Interaktion
wird auch für die Isolate A/South Carolina/1/1918 bzw. A/New York/1/1918 des Spanische
Grippe H1N1-Virus angenommen (131), deren Spezifität für 2,6-SA mit einer erhöhten Virulenz in der Maus einherging (113).
Bei einem Vergleich der Viren hvHA(lv4x) und hvHA(lv6x), sowie hvHA(lv5x) und
hvHA(lv7x), lässt sich feststellen, dass die Einführung der Aminosäureaustausche Leucin zu
Prolin an Position 78 (L78P) und Glutamin zu Histidin an Position 354 (Q354H) keinen
zusätzlichen Effekt auf die LD50 und die Bindung an 2,3- und 2,6-Fetuin hatte. Bei der
Analyse der Fusionsaktivität von hvHA zeigte sich jedoch, dass die Austausche L78P und
Q354H, wurden sie zusammen in die HA-Proteine hvHA(lv4x) bzw. hvHA(lv5x) eingeführt,
einen senkenden Einfluss auf die Fusionsaktivität bei pH 5,5 hatten. Umgekehrt konnte die
Fusionsaktivität von lvHA bei pH 5,5 durch die Austausche P78L und H354Q erhöht werden.
Es lässt sich somit schlussfolgern, dass die Positionen 78 und 354 für die Fusionsaktivität von
hvHA essentiell, aber nicht ausreichend sind. Interessanterweise bewirkte die Einführung der
Austausche L78P und Q354H in hvHA einen ca. 8-fachen Anstieg der LD50, sodass spekuliert
werden kann, dass ein Verlust der Fusionsaktivität bei pH 5,5 einen Verlust der Virusvirulenz
verursacht. Es muss geprüft werden, inwieweit diese Mutationen andere Eigenschaften von
hvHA beeinflussen. In Kombination mit weiteren Aminosäureänderungen an Position 131,
133, 133+ und 193 bzw. 131, 133, 133+, 190 und 193 hatten sie keinen Einfluss auf die
Bindung an 2,3- und 2,6-Fetuin.
Position 78 liegt in der HA1-Untereinheit unterhalb der Rezeptorbindestelle und ist gegenüber
dem äußeren Milieu exponiert (Abb. 29). Seine Lage ist für eine Position, die den pH-Wert
der Fusion ändert, untypisch. Üblicherweise liegen diese Positionen innerhalb oder in der
Nachbarschaft des Fusionspeptids, oder an Kontaktstellen zwischen verschiedenen Domänen
115
Diskussion
des Proteins, die sich bei der Ansäuerung im Endosom neu anordnen (146). Da Prolin dafür
bekannt ist, dass es die Faltung von Proteinen erheblich beeinflussen kann, könnte der Austausch von Prolin nach Leucin an Position 78 Konformationsänderungen in seiner Nachbarschaft auslösen, welche die Energiebarriere erniedrigen, die beim Eingehen der Fusionskonformation des HA-Proteins überwunden werden muss.
Position 354 liegt in der HA2 Untereinheit und schließt sich an das Fusionspeptid an, das die
N-terminalen 23 Aminosäuren der HA2-Untereinheit (Position 330-352) umfasst (21). Man
kann spekulieren, dass der Aminosäureaustausch an Position 354 aufgrund seiner Nähe zum
Fusionspeptid die Energiebarriere, die bei einer Fusion überschritten werden muss, herabsetzt,
indem es die Lage des Fusionpeptids in der mit negativ geladenen Aminosäuren ausgekleideten Vertiefung (siehe 1.2.1) destabilisiert. Dies wird für andere Mutationen innerhalb oder
in der Nähe des Fusionspeptids angenommen (22).
Fasst man die Daten zur Untersuchung der Rolle des HA-Proteins für die Virulenz von hvPR8
zusammen, so kann man vermuten, dass HA im Zusammenwirken mit NA ein effizientes
Eindringen des Virus in die Zellen des Respirationstrakts der Maus vermittelt, so wie es bei
der Infektion von L929- und MDCK-H-Zellen beobachtet wurde. Dies könnte auf günstigen
Rezeptorbindeeigenschaften, die u. a. durch die Aminosäureinsertion an Position 133+ und die
Aminosäureaustausche an den Positionen 131, 133, 190 und 193 vermittelt werden, sowie auf
einer Fusionsaktivität bei höheren pH-Werten im Endosom basieren, zu welcher die Aminosäureaustausche an den Positionen 78 und 354 beitragen.
116
Zusammenfassung
5
Zusammenfassung
In Anbetracht des Potenzials von Influenza-A-Viren, saisonale Epidemien und verheerende
Pandemien in der menschlichen Bevölkerung auszulösen, besteht großes Interesse, die Virulenz vermittelnden Mechanismen dieser Viren zu verstehen. In dieser Arbeit wurden wichtige
Virulenzfaktoren von Influenza-A-Viren untersucht, das Hämagglutinin (HA) und die virale
Polymerase. Diese waren in vorherigen Studien als entscheidende Virulenz bestimmende Faktoren des Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1-Virus (hvPR8) identifiziert worden, welches
eine außergewöhnlich hohe Virulenz in Mäusen besitzt. Es wurde angenommen, dass das
Oberflächenprotein HA von hvPR8 für ein effizientes Eindringen des Virus in die Zelle
essentiell ist, und dass daraufhin die virale Polymerase bestehend aus den Untereinheiten
PB2, PB1 und PA ihren Virulenz fördernden Effekt ausüben kann. In dieser Arbeit wurde
gezeigt, dass Valin an Position 504 in PB2 und Leucin an Position 550 in PA die entscheidenden Aminosäuren darstellen, welche die Virulenz und Polymeraseaktivität erhöhen. Die
Herstellung neuer, hochvirulenter PR8-Viren in der Maus bewies, dass auch andere Aminosäuren der Polymerase, wie Glycin an Position 349 in PA und Arginin an Position 208 in
PB1, hohe Virulenz und eine gesteigerte Polymeraseaktivität vermitteln können.
Es wurden weitere Hinweise gewonnen, dass HA für ein effizientes Eindringen von hvPR8 in
Wirtszellen verantwortlich ist. Da die Rezeptorbindung und Fusionsaktivität von HA hierbei
eine Rolle spielen könnten, wurde hvPR8 diesbezüglich im Vergleich zu einem niedrigvirulenten Standard-PR8-Virus (lvPR8) untersucht. Hinsichtlich der Rezeptorbindung zeigte sich,
dass HA von hvPR8 eine höhere Affinität für α2,6-verknüpfte Sialinsäure (SA) und eine geringere Affinität für α2,3-verknüpfte SA als HA von lvPR8 besitzt. Aufgrund dieser Eigenschaften könnte hvPR8 seine Zielzellen besonders effizient infizieren und/oder einen von
lvPR8 verschiedenen Zelltropsimus besitzen. Letzteres scheint im Alveolargewebe der Mauslunge nicht der Fall zu sein, da für beide Viren ein Tropismus für Typ II-Pneumozyten festgestellt wurde. Weiterhin zeigte sich, dass HA von hvPR8 bei höheren pH-Werten fusionsaktiv ist als HA von lvPR8. Dies könnte hvPR8 ermöglichen, während des Absinkens des pHWertes im zellulären Endosom schneller ins Zytoplasma zu gelangen und einem lysosomalen
Abbau zu entgehen. Durch die Analyse von Viren mit mutiertem HA wurden für die Virulenz
sowie Rezeptorbindung oder Fusion kritische Aminosäuren im HA von hvPR8 identifiziert.
Diese Analyse deutet darauf hin, dass eine günstige Rezeptorbindung in Kombination mit der
117
Zusammenfassung
Fusionsaktivität bei höheren pH-Werten im Endosom das effiziente Eindringen von hvPR8
vermitteln und damit dem Virus einen Replikationsvorteil verschaffen.
118
Abkürzungsverzeichnis
6
Abkürzungsverzeichnis
A (Aminosäure)
Alanin
A (Base)
Adenin
A490
Absorption bei 490 nm
Abb.
Abbildung
Aminosäure
R
AS
Amp
Ampicillin-Resistenz
APS
Ammoniumperoxosulfat
β-ME
β-Mercaptoethanol
BPB
Bromphenolblau
B6
C57BL/6
BSA
„bovine serum albumin“
C
Cytosin
CIAP
„calf intestine alkaline phosphatase“
cDNA
„complementary DNA“
cRNA
„complementary DNA“
C-Terminus
Carboxyterminus
D
Asparaginsäure
dATP
Desoxyadenosintriphosphat
dCTP
Desoxycytidintriphosphat
dGTP
Desoxyguanosintriphosphat
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
dTTP
Desoxythymidintriphosphat
Del
Deletion
dest.
destilliert
ddH2O
„double-distilled water“
DMEM
„Dulbecco’s modified Eagle’s medium“
DNA
„desoxyribonucleic acid“
DTT
1,4-Dithiothreitol
E
Glutaminsäure
ECL
„enhanced chemiluminescence“
E.coli
Escherichia coli
119
Abkürzungsverzeichnis
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA
Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’N’-tetraessigsäure
ELISA
„enzyme-linked immunosorbent assay“
ER
Endoplasmatisches Retikulum
F
Phenylalanin
FCS
„fetal calf serum“
2,3-Fetuin
α2,3-Sialinsäure enthaltendes Fetuin
2,6-Fetuin
α2,6-Sialinsäure enthaltendes Fetuin
ffu
„focus forming unit“
FF-Luc
Firefly-Luziferase
FLU
Influenza
FPV
„fowl plague virus“
G (Aminosäure)
Glycin
G (Base)
Guanin
H
Histidin
h
Stunde(n)
H/HA
Hämagglutinin
HCL
Salzsäure
HEPES
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
HRP
„horseradish peroxidase“
hv
„highly virulent“
I
Isoleucin
IHC
Immunhistochemie
IFN
Interferon
Ins
Insertion
K
Lysin
Kaff
Affinitätskonstante
L
Leucin
LD
Letale Dosis
lv
„low virulent“
M
molar/Matrixprotein
M (Aminosäure)
Methionin
M1
Matrixprotein 1
M2
Matrixprotein 2
120
Abkürzungsverzeichnis
MDCKs
„Madin-Darby canine kidney epithelial cells“
MOI
„multiplicity of infection“
Mx
„myxovirus resistance“
mRNA
„messenger“ RNA
N
Asparagin
GlcNAc
N-Acetlyglucosamin
N/NA
Neuraminidase
NaAcetat
Natriumacetat
NaCl
Natriumchlorid
NaVO
Ammoniumvanadat
NCRs
„noncoding regions“
NEP
„nuclear export protein“
NLS
„nuclear localization signal“
nm
Nanometer
NP
Nukleoprotein
NP-40
Nonidet P-40
NS1
„nonstructural protein 1“
NS2
„nonstructural protein 2“
N-Terminus
Aminoterminus
Nt
Nukleotide
ORF
„open reading frame“
OAS
2'-5'-Oligoadenylat-Synthetase
OPD
O-Phenylendiamindihydrochlorid
P
Prolin
PA
„polymerase acidic protein“
PAGE
Polyacrylamidgelelektrophorese
PB1
„polymerase basic protein 1“
PB2
„polymerase basic protein 2“
PBS
„phosphate buffered saline“
PBS-T
PBS-0,1% Tween-20
PCR
„polymerase chain reaction“
PFA
Paraformaldehyd
pfu
„plaque forming unit“
PKR
„protein kinase R“
121
Abkürzungsverzeichnis
Podo
Podoplanin
Pos.
Position
PR8
Puerto Rico/8/34
PTPC
„permeability transition pore complex“
PVDF
Polyvinyliden-Fluorid
Q
Glutamin
R
Arginin
r
„recombinant“
RBS
„receptor binding site“, Rezeptorbindestelle
RanBP5
„Ran binding protein 5“
Ren-Luc
Renilla-Luziferase
RIG-I
„retinoic acid-inducible gene I“
RNA
„ribonucleic acid“
RNase
Ribonuklease
rpm
„rotations per minute“
RT
Raumtemperatur
S
Serin
ss(-)RNA
einzelsträngige RNA negativer Polarität
SA
„sialic acid“, Sialinsäure
SDS
„sodium dodecyl sulphate“
sec
Sekunden
SIAT
Sialyltransferase
3’SL-PAA-biot
3’Sialyllactose-Poly[N-(2-Hydroxyethyl)acrylamid]-Biotin
6’SLN-PAA-biot
6’Sialyl-N-Acetyllactosamin-Poly[N-(2-Hydroxyethyl)
acrylamid]-Biotin
S-OIVs
„swine-origin H1N1 influenza viruses“
SP-C
„surfactant protein C“
SPF
Spezifiziert Pathogen Frei
ssRNA
„single-stranded RNA“
T (Aminosäure)
Threonin
T (Base)
Thymin
Tab.
Tabelle
TEMED
N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
TPCK
L-1-Tosylamido-2-Phenylethyl-Chloromethyl-Keton
122
Abkürzungsverzeichnis
Tris
Tris(hydroximethyl)aminomethan
Triton X-100
t-Octylphenoxypolyethoxy-Ethanol
U
„unit“
V
Valin
vRNA
virale RNA
vRNP
viraler Ribonukleoproteinkomplex
WHO
„world health organization“
Y
Tyrosin
123
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virus PB1-F2 protein induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDAC1.
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134
Herzlichen Dank...
...an meinen Doktorvater Prof. Dr. Peter Stäheli für die Möglichkeit, bei ihm diese Doktorarbeit anfertigen zu können, für die lehrreichen Diskussionen und seine stete Bereitschaft,
mich bei meiner Arbeit zu unterstützen und zu beraten. Darüberhinaus vielen Dank für die
leckeren Weihnachts- und Spargelessen und den unvergesslich schönen Ausflug zum Großen
Mythen.
…an Prof. Dr. Georg Kochs für seine guten Tipps bei der Durchführung meiner Experimente
und seine große Hilfsbereitschaft, sich in meine Arbeit zu vertiefen, mit mir zu diskutieren
und mich zu beraten…und das alles mit einer Prise seines unvergleichlichen Humors.
Außerdem möchte ich mich für die schönen Treffen außerhalb des Labors mit ihm, Daniel
und Co. bedanken.
...an Prof. Dr. Otto Haller, meinen EU-Projekt-Betreuer, für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit im Rahmen von „Fluinnate“ durchführen zu können, für seine stets motivierende Art,
sein Bemühen, eine gute Atmosphäre in den Arbeitsgruppen aufrechtzuerhalten, und die
schönen, von ihm organisierten Betriebsausflüge.
…an Dr. Mikhail Matrosovich für die ausgezeichnete Beratung auf dem Gebiet des
Hämagglutinins, die lehrreichen Diskussionen und die Möglichkeit, Experimente in seinem
Labor durchführen zu können. Danke auch an seine Frau und seine Doktorandinnen Isabel,
Miriam, Eva und besonders Jenni, für ihre Hilfe und herzliche Aufnahme im Labor.
…an alle jetzigen und ehemaligen Mitglieder der Stäheli-, Kochs-, Weber- und SchwemmleArbeitsgruppen für die sehr angenehme Arbeitsatmosphäre, die große Hilfsbereitschaft und
die lustigen, aufbauenden, lieben und interessanten Gespräche im Kaffeeraum, im Hof oder
zwischen Tür und Angel. Besonders danken möchte ich meinem Nebensitzer Carsten für die
super Nachbarschaft, Sandra, mit der ich mich besonders in der Endspurtphase unserer
Doktorarbeit über Freud und Frust austauschen konnte, Kirsten für ihre guten Tipps und ihre
Hilfsbereitschaft und meinem ersten Nebensitzer Andy für die lustige Nachbarschaft.
...an meine „Labor-Familie“: an Petra, Alex, Simone W., Simone G., Florens und Nicola (als
„Fast-Kochs“ so wie ich) und an die Ehemaligen des Kochs-Clans Daniel, Thierry, Sabine,
Marc, Silke, Carola, Ellen, Jan und Nico, bei denen ich mich sehr wohl gefühlt habe! Danke
an die beiden Mediziner Thierry und Daniel sowie an meine Projektkollegin Petra, mit denen
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mir die Zusammenarbeit sehr viel Spaß gemacht hat. Ein besonderes Dankeschön an Simone
W., Daniel und die lieben drei Musketiere Nicola, Petra und Alex für ihre Freundschaft - ich
werde Euch sehr vermissen!
...an meine Eltern, die immer für mich da waren, für ihre liebe Unterstützung, ihren Rat und
ihr Interesse an meiner Arbeit.
...an meinen Bruder für die guten Tipps und interessanten Diskussionen in den gemeinsamen
Essenspausen…und für seinen Humor!
...an meine Freunde für ihr Interesse an meiner Arbeit. Besonders danken möchte ich Kerstin
für das Korrekturlesen und den wohltuenden „Schnack“ beim allwöchentlichen Schwimmen,
sowie Laure für ihre Unterstützung und liebe Begleitung während der letzten Jahre aus der
Ferne.
Und zuletzt danke ∞ an meinen Freund Antoine, der rund um die Uhr für mich da war.
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