4 Chiroptische Methoden

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4 Chiroptische Methoden
Circulardichroismus (CD)
Optische Rotationsdispersion (ORD)
4.1 Polarisiertes Licht
Linear polarisiertes Licht
Linear polarisiertes Licht setzt sich aus rechts- und links-circular polarisiertem Licht
zusammen. Der Betrag sowie die Drehfrequenzen von EL und ER sind gleich.
Circular polarisiertes Licht
Erzeugung aus zwei linear polarisierten Wellen, die 90 ° phasenverschoben sind.
Links circular
polarisierter Licht
E
E2 läuft E1 voraus → links circular polarisiertes Licht
E2 hinkt E1 hinterher → rechts circular polarisiertes Licht
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4.2 Circulardichroismus
Die Extinktionskoeffizienten für rechts- und links circular polarisiertes Licht sind für
eine optisch aktive Substanz unterschiedlich.
Messaufbau
Monochromator
Eλ
E λ,45°
Billings- ER,L
Sample
cell
Detector
θ
Modulator
λ
Double refracting material
Computer
Optical axes
Optical axes
Extraordinary beam
Ordinary beam
⇒ different velocities
Erzeugung von circular polarisiertem Licht mit dem λ/4-Plättchen bestehend aus
einem doppelbrechenden Material definierter Dicke.
Doppelbrechende Materialien sind aufgrund ihrer Gitterstruktur optisch anisotrop. In
ihnen breitet sich das Licht inverschiedenen Richtungen mit unterschiedlichen
Geschwindigkeiten aus. Bei Eintritt eines Lichtstrahls wir dieser in zwei Teilstrahlen
aufgespalten, einen ordentlichen und einen außerordentlichen Strahl., die in
aufeinander senkrecht stehenden Ebenen polarisiert sind. Wenn Licht senkrecht zur
optischen Achse auftrifft, dann breiten sich die beiden Strahlen in der gleichen
Richtung aus, aber ihre Geschwindigkeiten sind unterschiedlich. Sie verlassen den
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Kristall mit erin Phasendifferenz, die von dessen Plattendicke und von der
Wellenlänge des einfallenden Lichts abhängt. Benutzt man ein solches Plättchen mit
einer Dicke von λ/4, so treten zwei senkrecht aufeinander stehende Strahlen, die um
90 ° phasenverschoben sind, aus dem Plättchen aus.
Optisch aktive Moleküle
Ein elektronischer Übergang ist erlaubt, wenn ein von Null verschiedenes
Übergangsdipolmoment existiert.
el
µ21
= Ψ 2 | µ el | Ψ 1
Die Oszillatorstärke
D21 = µ12el ⋅ µel21 ∼
ε (ν )
dν
∫
ν
band
Einige Übergänge sind elektronisch verboten, aber magnetisch erlaubt. Diese haben
ein nicht verschwindendes magnetisches Übergangsmoment:
m
µ21
= Ψ 2 | µm | Ψ 1
Die Rotationsstärke
(
Θ ν
) ∫ ν( )dν
m
R21 = Im µ 21el ⋅ µ21
∼
band
In symmetrischen Molekülen ist das magnetische Übergangsmoment immer
senkrecht zum elektrischen Übergangsmoment, deshalb ist R21 = 0.
Es muss eine Parallelkomponente von µel zu µm existieren. Jedes Molekül, welches
kein Symmetriezentrum besitzt zeigt optische Aktivität (Quantentheorie der optischen
Aktivität von Rosenfeld, 1929)
Coronen
Hexahelicen
(optisch inaktiv)
(optisch aktiv)
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Was wird gemessen?
Die Messgröße ist die Differenz der Extinktionskoeffizienten des rechts und links
polarisierten Lichts. Also gilt nach Lambert-Beer:
∆E = EL − ER = ( ε L − ε R ) c d
Angegeben wird allerdings die Elliptizität Θ:
Θ=
1
180°
ln10
(ε L − ε R ) c d
π
4
b
E
ER
Θ
EL
| EL |≈ TL
b = ER + ΕL
a
a = ER − EL
| ER |≈ TR
| E |: Länge des E-Feld-Vektors des circular polarisierten Lichts (R: rechts, L: links)
T : Transmission
tan Θ =
ER − EL
ER + ΕL
erweitern mit
tanΘ =
(
=
TR − TL
TR + TL
TR + TL
=
a
b
) liefert
TR − TL
TR + 2 TR TL + TL
Der Unterschied zwischen TR und TL ist klein, daraus folgt:
tan Θ ≅ Θ
und
TR + 2 TR TL + TL ≅ 4T
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Θ=
∆T
4T
mit ∆T = TR − TL
Nach Lambert gilt:
logT = −EL
(
)
log T + ∆T = −ER
und
Reihenentwicklung um ∆T = 0:
(
)
ln T + ∆T = lnT +
(
∆T
T
)
log T + ∆T = logT +
∆T
1
⋅
T ln10
EL − ER = −(ER − EL ) = logT +
∆E = EL − ER =
Θ=
∆T
4T
=
∆T
T
⋅
∆T
1
∆T
1
⋅
− logT =
⋅
T ln10
T ln10
1
ln10
1
⋅ ln10 ⋅ ∆E
4
∆E = ε c d = ( ε L − ε R ) c d
Θ=
1
180°
ln10
(ε L − ε R ) c d
π
4
Spezifische Elliptizität
[ Θ] =
Θ
in
cd
grad cm2 g-1
zur Berechnung benötigt man die genaue Konzentration
bei Proteinen:
ε190 = 8.500 -11.400 M-1 cm-1 pro Aminosäurerest (nicht genau genug)
ε280 (in 6 M GuHCl) = x Trp ⋅ 5.690 M-1 + y Tyr ⋅ 1.280 M-1
Molare Elliptizität
[Θ]M =
[Θ] M
100
in
grad cm2 dmol-1 (100 hat historische Gründe)
M = molare Masse des Moleküls
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Mean residue weight ellipticity
[Θ]MRW
=
[Θ] MRW
100
in
grad cm2 dmol-1
MRW = mittlere molare Masse des Monomers des Polymers
4.2.1 Elektronische CD von Proteinen
Circulardichroismus wird in dem Bereich der elektronischen Übergange der Moleküle
gemessen.
UV-Spektrum
CD-Spektrum
Poly-L-Alanin (α-Helix)
Poly-L-Alanin (α-Helix)
Bestimmung von Sekundärstrukturen in Proteinen
Sind über ein Protein keine kristallographischen Daten verfügbar, so hilft die CDSpektroskopie, die Sekundärstrukturanteile in einem Protein zu bestimmen.
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Poly-L-Lysin
Annahme: Ein CD-Spektrum eines Proteins ist die Summe der CD-Spektren der
einzelnen Sekundärstrukturelemente
A) Bestimmung von Sekundärstrukturen mittels Referenzspektren von Poly-L-Lysin
ΘT = χhelix Θhelix ( λ ) + χ sheet Θsheet ( λ ) + χrandom Θrandom ( λ )
B) Bestimmung von Sekundärstrukturen mittels Referenzspektren eines ProteinDatensatzes (Röntgenkristallstrukturdaten)
CONTIN
(S. Provencher, Comput. Phys. Commun. 1982, 27, 213-227, 229-242)
SELCON3
(N. Sreerama & R.W. Woody, J.Mol.Biol. 1994, 242, 497-507)
Varselec
(L.A. Compton, L. A. & W. C. Johnson, Anal. Biochem. 1986, 155, 155167. P. Manavalan & W. C. Johnson, Anal. Biochem. 1987, 167, 76-85.)
K2D - neural network method (Andrade et al. Prot Engineering 1993, 6, 383-390)
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Hämoglobin
Hemoglobin
Tumor necrosis factor
Eco RI
α-Helix:
β-Sheet:
RC:
α-Helix:
β-Sheet:
RC:
68 %
5%
27 %
68 %
0%
32 %
Tumor Nekrose-Faktor
Hemoglobin
Tumor necrosis factor α
Eco RI Endonuclease
α-Helix:
β-Sheet (antiparallel):
β-Sheet (parallel):
β-Turns:
RC:
33 %
20 %
5%
17 %
27 %
α-Helix:
β-Sheet (antiparallel):
β-Sheet (parallel):
β-Turns:
RC:
26 %
20 %
8%
25 %
21 %
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Kinetische Betrachtung der Proteinfaltung und -entfaltung
Rückfaltung von Lysozym nach Guanidiumhydrochlorid (6 M) Verdünnung.
Insertion von Peptiden in Lipidmembranen
offene Kreise: POPC
geschlossene Kreise POPG
cB: gebundenes Peptid
cf: freies Peptid
cL: Gesamt-Lipidkonzentration
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4.2.2 Elektronische CD von Nukleinsäuren
AMP: Purine besitzen keine Asymmetrie und demnach ist das Molekül optisch
inaktiv. Eine leichte Asymmetrie wird in das Nukleotid durch die N-glykosidische
Bindung zur Desoxyribose eingeführt, so dass optische Aktivität im CD-Spektrum
beobachtet werden kann.
dApA: Das Dinukleotid zeigt durch die Kopplung der beiden Basen bereits deutlich
optische Aktivität.
Poly-A: In einem Polymer liegt eine starke Kopplung vor, so dass die Elliptizität stark
zunimmt. Zudem tragen die Anordnung der Basen im Raum zusätzlich zur optischen
Aktivität bei.
Sekundärstruktur von DNA
CD-Spektren von DNA geben Aufschluss über die Konformation der DNA in Lösung.
Pohl und Jovin (1972) entdeckten mittels CD-Spektroskopie die Z-Form der DNA.