Poster Jahrestagung Biotechnologen.ai - mv.uni

Molekulare Werkzeuge zur Identifikation von Fucoidanasen
T. Hahn1, L. Kilian2, K. Muffler1,S. Lang2, R. Ulber1
1
Technische Universität Kaiserslautern, Lehrgebiet Bioverfahrenstechnik, Gottlieb-Daimler-Straße 44, 67663 Kaiserslautern
2
Technische Universität Braunschweig, Institut für Biotechnologie, Spielmannstraße 7, 38106 Braunschweig
1. Einleitung
Wirkstoffe aus natürlichen Ressourcen, wie Pflanzen oder Pilzen, erfreuen sich derzeit größter Beliebtheit, wie nicht nur
der Boom des “Functional Food” beweist. Diese natürlichen bioaktiven Stoffe sind jedoch auch im Interesse der
heutigen Forschung, da ihre meist komplexe Struktur eine chemische “de novo”-Synthese erschwert und diese
Substanzen oft ein geringes Toxizitätspotential aufweisen. Eines dieser Stoffe ist das Fucoidan, ein aus Braunalgen
(z.B. Fucus vesiculosus, s. Abbildung 1) isoliertes sulfatiertes Polysaccharid. Es ist ein α-1,4 und α-1,3- verknüpftes
Biopolymer, dessen Hauptmonomer Fucose an den Positionen 2 und 4 Sulfatester besitzt. Das gestiegene Interesse an
diesem nachweislich antiviralem und antibakteriellem Naturstoff zeigt sich durch den sprunghaften Anstieg der Anzahl
an Veröffentlichungen in wissenschaftlichen Zeitschriften der letzten Jahre[1].
Abbildung 1: Die Alge Fucus vesiculosus[2]
Fucoidane besitzen eine vielfältige biologische Aktivität, welche in engem Zusammenhang mit Sulfatgehalt, Monosaccharidzusammensetzung
und Molekulargewicht steht. Zum Erreichen des für die biologische Aktivität notwendigen Molekulargewichts bietet sich die Säurehydrolyse wie
auch der enzymatische Abbau mittels fucoidanabbauenden Enzymen, den Fucosidasen und Fucoidanasen an. Ein hoher Sulfatgehalt resultiert
wiederum in einer erhöhten Bioaktivität. Die durch den Sulfatgehalt stark anionische Ladung führt zu einer verbesserten Bindung des
Polysaccharids an Zellen und inhibiert so die Anbindung von Bakterien und Viren[3].
.
3. Ganzzelltransformation
2. Säurehydrolyse zur Fragmentierung
OH
O
S
O
O
OH
60°C, pH 2
O
R
S
O
O
R
O
O
O
S
H 2O
O
SO 42 -
HO
S
OH
O
B a 2+
B aSO 4
Abbildung 2: Spaltung der Sulfatesterbindungen
bei pH 2 und 60 °C; Nachweis der
Sulfatbindungen durch BaSO4-Präziptiation
Säurehydrolysen
zur
Verringerung
des
Molkekulargewichts
von
Polysacchariden
erfordern drastische Bedingungen (Spaltung
6-Desoxyzucker: 1 M TFA; 100°C; 1h). Die
Spaltung der Sulfatester des Fucus vesiculosus
Fucoidans wird bereits bei pH 2 und 60°C
erreicht,
der
Nachweis
erfolgte
mit
BaSO4-Fällung (vgl. Abb. 2). Säurehydrolyse
resultiert damit auch in einer Verringerung der
Bioaktivität, da die anionische Komponente des
Zur Fragmentierung wurde die Hydrolyse durch
Fucosidasen aus Bakterien untersucht. Die in der
Literatur beschriebenen zum Fucoidanabbau
befähigten
Bakterien
wurden
unter
imprimierenden Bedingungen kultiviert. Der
Abbau erfolgte mit aktiven Bakterien und dem
Überstand des Lysats. Die Resultate, für
Pseudoalteromonas atlantica dargestellt (vgl.
Abb. 3), lassen auf inaktive Gene oder schwach
exprimierte Proteine schließen.
Abbildung 3: Größemausschlusschromatigramme des Abbaus einer
2,5 ml Fucoidanlösungmit 0,5 ml des
Zelllysats zu verschiedenen Zeiten
4. Expression von rekombinanten Fucosidasen in Escherichia coli
Abbildung 4: SEM Bild von Pseudoalteromonas
atlantica t6c[5]
Abbildung 5: Fucosidasegene von M. fucanivorans
und P. atlantica T6c aus der Datenbank NCBI
dargestellt mit dem Programm pdraw32
Die Hydrolyse der Fucoidane durch Säurehydrolyse und Ganzzelltransformation zeigte nicht zufriedenstellende
Ergebnisse. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, Fucosidasegenen mit bekannten Sequenzen in E.coli
rekombinant zu exprimieren. Ebenso sollten die Bakterien aus denen die Gene kloniert werden, in der Literatur für ihre
Fähigkeit, Fucoidan abzubauen beschrieben sein. Die Aktivität der Fucosidasen Fucoidane abzubauen variiert stark
mit der Zusammensetzung der sulfatierten Polysaccharide, da die Fucoidane eine hohe Diversität besitzen. Zu diesem
Zweck wurde das Bakterium Pseudoalteromonas atlantica T6c ausgewählt, da dessen Genom vollständig sequenziert
wurde und eine Veröffentlichung auf den Abbau von Fucoidan aus Fucus vesiculosus durch das Bakterium hinweist[4].
Zusätzlich zu Pseudoalteromonas atlantica T6c werden Fucosidasen in E. coli exprimiert, die sich in der Länge der
Nucleotidsequenz deutlich unterscheiden mit der Intention Endo- und Exofucosidasen zu erhalten (vgl. Abbildung 5)
Ein Großteil der marinen Bakterien, die in der
Lage sind, Fucoidane zu
6. Conclusion
hydrolysieren, werden in unmittelbarer Nähe zum Substrat, sprich im Habitat der
Braunalgen zu finden sein. Daher werden Proben von der Oberfläche der Algen
genommen, die Vielzahl an Bakterien wird im Labor kultiviert und charakterisiert. Zur
Identifikation der Fucoidanaseaktivität eignet sich die Kultivierung unter
imprimierenden Bedinungen wie gezeigt nicht. Ein Aminosäuresequenzvergleich
durch das Programm Blastx mit einem der beiden Fucosidasegene des Bakteriums
Pseudoalteromonas atlantica T6c zeigt eine hohe Homologie mit bereits bekannten
Sequenzen anderer Fucosidasegene (siehe Tabelle 1). Die molekularbiologische
Identifikation der Gene über konservierte Domänen und degenerierte Primer ist
damit der herkömmlichen Vorgehensweise vorzuziehen.
B akterium
Gramella forsetii K T0803
Treffer
430
-110
Rhodopirellula baltica S H 1
403
3·10
P seudoalteromonas atlantica T6c
391
1·10
Thermobaculum terrenum A TC C B A A -798
386
3·10
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum D S M 571
375
8·10
D ictyoglomus turgidum D S M 6724
370
7·10
D ictyoglomus thermophilum H-6-12
369
1·10
C aldivirga maquilingensis IC -167
366
1·10
[C andidatus K oribacter versatilis E llin345
365
9·10
B acteroides cellulosilyticus D S M 14838]
358
1·10
Tabelle 1: Die ersten zehn Treffer des
Aminosäureequenzvergleichs von Pseudoalteromonas
atlantica T6c mit Blastx (Datenbank NCBI)
[1]
A.Holtkamp, S. Kelly, R. Ulber, S. Lang, Fucoidans and Fucoidanases - focus on techniques for molecular structure elucidation and modification of marine polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009. 82: p. 1-11
http://www.fimr.fi/en/galleria/galleriakuvat/en_GB/underwater_gulf_of_finland/_print/?mode=text
Li, B., Fucoidan: Structure and Bioactivity. Molecules, 2008. 13: p. 1671-1695
Yaphe, W., Enzymic hydrolysis of fucoidin by Pseudomonas atlantica and Pseudomonas carrageenovora. Nature, 1959. 183: p. 761-762
[5]
http://genome.jgi-psf.org/pseat/pseat.home.html
[2]
[3]
[4]
Dieses Projekt wird durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft unter dem Förderkennzeichen UL 170/3-3 unterstützt
http://www.mv.uni-kl.de/biovt
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Fachbereich Maschinenbau
und
Verfahrenstechnik
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