Bedeutung des Insulin-like growth factor

Tierärztliche Hochschule Hannover
Klinik für Rinder
Bedeutung des Insulin-like growth factor - Systems
während der Oozytenreifung und
präimplantorischen Embryonalentwicklung
des Rindes
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der
Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Friederike Poppicht
Lohne
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Christine Wrenzycki
Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und
Andrologie der Groß- und Kleintiere mit
tierärztlicher Ambulanz,
Professur für Molekulare Reproduktionsmedizin
Justus-Liebig-Universität Gießen
Prof. Dr. Pablo Steinberg
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische
Analytik
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Anatomisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter:
Prof. Dr. Pablo Steinberg
2. Gutachterin:
Apl. Prof. Dr. Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung:
27.04.2015
Die vorliegende Arbeit wurde durch die H. W. Schaumann Stiftung gefördert.
Für Thomas
in Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................. 1
2. Literatur
............................................................................................................. 4
2.1 Insulin-like growth factor – System ................................................................... 4
2.1.1 Liganden des IGF-Systems ........................................................................ 4
2.1.2 Rezeptoren des IGF-Systems .................................................................... 6
2.1.3 Bindungsproteine des IGF-Systems ........................................................... 8
2.1.4 Rolle des IGF1 während der Pubertät und Trächtigkeit von Rindern.......... 9
2.2 In-vitro-Produktion von Embryonen ................................................................ 12
2.2.1 Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen bovinen
Embryonalentwicklung in vitro ................................................................. 15
2.2.3 Genomaktivierung in bovinen Embryonen ................................................ 24
2.3 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen
Embryonen..................................................................................................... 26
2.3.1 Insulin-like growth factor 1 - Rezeptor während der bovinen
Embryonalentwicklung ............................................................................. 26
2.3.2 Insulin-like growth factor – Bindungsproteine ........................................... 27
2.3.3 Glukosetransporter ................................................................................... 28
2.3.4 Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische
Gene (BCL2-assoziiertes X Protein) der BCL2-Familie ........................... 30
2.4 Ziele des vorliegenden Projektes ................................................................... 32
3. Material und Methoden....................................................................................... 33
3.1 In-vitro-Produktion .......................................................................................... 33
3.1.1 Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe .............................................. 33
3.1.2 In-vitro-Maturation .................................................................................... 35
3.1.3 In-vitro-Fertilisation ................................................................................... 37
3.1.4 In-vitro-Kultivierung................................................................................... 39
3.2 Beurteilung der Reifung durch Färbung mit Hoechst 33342 ........................... 40
3.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium...................... 41
3.4 Teilungs- und Entwicklungsraten.................................................................... 45
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________
3.5 Lebend-Tot-Färbung mit Hoechst und Ethidium homodimer .......................... 46
3.6 Nachweis apoptotischer Zellen durch TUNEL-Färbung ................................. 48
3.7 MessengerRNA - Analyse mittels RT-qPCR .................................................. 50
3.7.1 Isolierung der mRNA ................................................................................ 50
3.7.2 Reverse Transkription .............................................................................. 52
3.7.3 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion .................................................. 53
3.8 Darstellung des IGF1R-Proteins..................................................................... 57
3.8.1 Gelelektrophorese .................................................................................... 57
3.8.2 Western blot ............................................................................................. 58
3.8.3 Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge . 59
3.8.4 Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Rind ......................................... 60
3.9 Immunfluoreszenzfärbung des IGF1R ............................................................ 62
3.9.1 Vorbehandlung der Embryonen und Inkubation mit dem 1. Antikörper .... 63
3.9.2 Inkubation mit dem 2. Antikörper, Zellkernfärbung und Darstellung der
Färbung ................................................................................................... 63
3.10 Statistische Auswertungen ........................................................................... 65
3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau........................................................................ 66
3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau........................................................................ 66
3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF1-Konzentrationen . 66
3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF-1 Konzentrationen ... 66
3.11.2 Vergleichende Untersuchung der Expression des IGF1R ...................... 67
4. Ergebnisse .......................................................................................................... 68
4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten ............................................ 68
4.2 Bestimmung der Kernreifungsraten ................................................................ 71
4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium .................................... 74
4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung ................................................................ 76
4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen................................................... 79
4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte .......................................... 81
4.6.1 MessengerRNA-Expression ausgewählter Gene nach IVM mit
verschiedenen Zusätzen .......................................................................... 81
4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R ................................... 83
II
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________
4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R .................................................. 83
4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot ....................................................... 84
4.7.2 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenzfärbung.................................. 87
4.8 Vergleich der stadienspezifischen mRNA- und Proteinexpression des
IGF1R ............................................................................................................ 89
5. Diskussion .......................................................................................................... 90
5.1 Einfluss einer IGF1-Supplementation auf die morphologische Qualität
boviner Embryonen ........................................................................................ 91
5.2 Expressionsmuster spezifischer Gentranskripte nach In-vitro-Maturation
boviner KOK mit IGF1 .................................................................................... 94
5.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium...................... 97
5.4 Vergleichende Expression des IGF1R in Stadien der frühen
Embryonalentwicklung ................................................................................... 99
5.5 Schlussfolgerung .......................................................................................... 102
6. Zusammenfassung ........................................................................................... 105
7. Summary ......................................................................................................... 109
8. Anhang
......................................................................................................... 112
8.1 Medien der IVP............................................................................................. 112
8.1 Medien für Proteinbestimmungen................................................................. 118
8.3 Medien für die Färbungen ............................................................................ 122
8.4 Labormaterial und Geräte............................................................................. 123
8.5 Einzeldaten der durchgeführten Untersuchungen ........................................ 126
9. Verzeichnisse.................................................................................................... 129
9.1 Abkürzungsverzeichnis................................................................................. 129
9.2 Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 134
9.3 Verzeichnis der Tabellen .............................................................................. 137
9.4 Literaturverzeichnis ...................................................................................... 140
Veröffentlichungen ............................................................................................... 168
Erklärung
......................................................................................................... 169
Danksagung ......................................................................................................... 170
III
Einleitung
___________________________________________________________________
1. Einleitung
Beim Rind ist die Analyse der frühen embryonalen Entwicklung durch den Einsatz
biotechnologische
Methoden
zu
einem
bedeutenden
Bereich
in
der
Reproduktionsmedizin geworden. Die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen wird
heute routinemäßig zur Gewinnung einer großen Anzahl Nachkommen bestimmter
Zuchttiere genutzt und findet daher auch in der Forschung häufig Anwendung, um
die daraus resultierenden Probleme und Fragestellung zu untersuchen. So können
Einflüsse
äußerer
Einwirkungen,
wie
die
Gaskonzentration
oder
die
Zusammensetzung des Kultivierungsmediums, auf den Embryo und dessen
Genexpression analysiert werden. Diese Studien dienen dem besseren Verständnis
entwicklungsrelevanter Prozesse und gestatten es, Aussagen über die Qualität der
Embryonen zu treffen, da deren Entwicklung von der korrekten Ausführung des
genetischen Programms abhängig ist (WRENZYCKI et al. 1998). Die meisten
Untersuchungen auf molekularer Ebene fanden im bovinen Embryo bisher durch
Betrachtung der relativen Menge spezifischer Gentranskripte statt. Eine Reihe von
Vorgängen konnte bereits analysiert und in den Entwicklungskontext gebracht
werden, da diese Methode mit einer geringen Probenmenge und einem großen
Durchsatz durchführbar ist. Zur vollständigen Analyse der Qualität und Entwicklung
von Embryonen sind jedoch weitere Studien notwendig, die auf die Endprodukte der
Gensynthese, also die Proteine und deren Funktionalität, eingehen. Dabei kann die
Lokalisation eines Proteins zur Aufklärung von dessen Funktion beitragen. Erstere
wird durch die Methode der Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung
bestimmt. Die Quantität eines Proteins kann wiederum anhand der Messung der
Signalintensität definiert werden. Die Methode des Western blots eignet sich
ebenfalls zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Proteins, benötigt jedoch ein
großes
Probenvolumen.
Bisher
fanden
nur
wenige
Untersuchungen
auf
Proteinebene am präimplantorischen Embryo des Rindes statt. Aus diesem Grund ist
das Interesse groß, das Protein genauer zu untersuchen und zu ermitteln, inwieweit
sich dieses von bisherigen Studien der mRNA (messenger ribonucleic acid)
unterscheidet. Gerade die Genexpression des Embryos ist im Vergleich zu
somatischen Zellen in ihrer Art außergewöhnlich. Das frühe Entwicklungsprogramm
1
Einleitung
___________________________________________________________________
des Embryos wird zunächst von maternalen Transkripten und Proteinen kontrolliert
und widerfährt im Rind erst im 8- bis 16-Zellstadium eine Umstellung, auf die
Transkription embryo-spezifischer Gene, die sogenannte maternal-embryonic
transition (MET).
Das Insulin-like growth factor (IGF) - System ist eine wichtige Familie von Faktoren,
die an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt sind. Sie spielen eine
wesentliche Rolle beim Wachstum und der Entwicklung embryonaler, fetaler und
plazentarer Gewebe (BAUER et al. 1998, FOWDEN 2003). Zusätzlich konnte bei
dem Insulin-like growth factor 1 (IGF1) eine antiapoptotische Wirkung nachgewiesen
werden. So führte die Zugabe von IGF1 zum Maturations- oder Kultivierungsmedium
boviner Embryonen zu einer Abnahme apoptotischer Zellen (BYRNE et al. 2002,
WASIELAK u. BOGACKI 2007). Die IGF1-Signalübertragung erfolgt über die
spezifische Bindung an den membranständigen Insulin-like growth factor 1-Rezeptor
(IGF1R). Dieser Rezeptor spielt nachweislich eine entscheidende Rolle bei der
Embryonalentwicklung und ist in seiner Funktionalität entwicklungsrelevant. Die
Expression des IGF1-Rezeptors gilt zudem als ein potentieller Marker für die Qualität
in vitro produzierter Embryonen (LIU et al. 1997).
Ein Zusammenhang mit der Verfügbarkeit von IGF1 wurde unter anderem auch bei
dem PCO-Syndrom (Polyzystisches Ovarsyndrom) der Frau durch Untersuchungen
bei der Maus gefunden (CHI et al. 2000). So konnte nach Zugabe einer
supraphysiologischen Konzentration an IGF1 zum Kultivierungsmedium während der
IVP muriner Embryonen eine Herunterregulation des IGF1R-Proteins gemessen
werden, was zu einer gesteigerten Apoptose führte und der Grund für erhöhte
embryonale Mortalität sein könnte. Weiterhin reduzieren die Veränderungen, die
während der Phase der negativen Energiebilanz bei Hochleistungsrindern kurz vor
und nach der Abkalbung auftreten, die Bioverfügbarkeit von zirkulierendem IGF1,
was zu einer Verlangsamung des follikulären Wachstums und einer verspäteten
Ovulation führt (WATHES et al. 2007). Ferner führen die metabolischen
Veränderungen direkt oder indirekt durch Schädigung der follikulären Umgebung zu
einer
Verschlechterung
(WATHES
et
al.
der
2007).
Oozytenqualität
Für
eine
2
und
der
Optimierung
Embryonalentwicklung
der
Therapien
von
Einleitung
___________________________________________________________________
Fruchtbarkeitsstörungen und assistierten Reproduktionstechniken ist ein besseres
Verständnis von Schlüsselprozessen der frühen Embryonalentwicklung von großer
Bedeutung. Das Rind als Modellorganismus eignet sich besonders gut zur
Untersuchung dieser Prozesse, da gerade die bovine Embryonalentwicklung der
humanen in vielerlei Hinsicht ähnlich ist (WRENZYCKI et al. 2005).
Ziel dieses Projektes ist es, die Proteinexpression des Insulin-like growth factor 1 –
Rezeptors während der Maturation und der frühen embryonalen Entwicklung zu
untersuchen. Dafür erfolgt eine Austestung unterschiedlicher Antikörper, die einen
sensitiven Nachweis des IGF1R in bovinen Embryonen ermöglichen. Es soll ein
Western Blot durchgeführt werden, um spezifische Unterschiede in der Expression
des IGF1R zu untersuchen. Des Weiteren wird der Effekt der Supplementation einer
physiologischen
oder
supraphysiologischen
Konzentration
an
IGF1
zum
Reifungsmedium bei Ab- bzw. Anwesenheit von Apoptoseinduzierern auf die Anzahl
apoptotischer Zellen und die Expression des IGF-Systems untersucht. Dabei soll
gezeigt werden, ob die hinzugefügte Konzentration an IGF1 während der
Eizellreifung im Medium reduziert oder gesteigert wird. Außerdem soll anhand einer
Immunfluoreszenzfärbung die Lokalisation des Rezeptors in allen Stadien der
embryonalen Entwicklung bestimmt werden. Die Ergebnisse werden mittels
Untersuchungen des mRNA-Expressionsmusters von Genen des IGF-Systems,
apoptoserelevanten Transkripten und Transkripten des Glukosestoffwechsels
verglichen und könnten zur Aufklärung des Einflusses von IGF1 auf die Eizellreifung
und präimplantorische Entwicklung boviner Embryonen beitragen. Es könnten
überdies neue Erkenntnisse über mögliche Ursachen der frühen embryonalen
Mortalität bei Hochleistungsrindern nach der Abkalbung aufgedeckt werden. Letztlich
sollen die Ergebnisse dabei helfen, die Kultivierungssysteme für die IVP zu
verbessern und daraus resultierend zu einer Qualitätsverbesserung der Embryonen
führen.
3
Literatur
___________________________________________________________________
2. Literatur
2.1 Insulin-like growth factor – System
Das Insulin-like growth factor - System gehört zu einer komplexen Familie von
Wachstumsfaktoren, die an Wachstum, Entwicklung und Differenzierung von
Säugerzellen beteiligt sind. Sie besteht nach heutigem Wissensstand aus zwei
Liganden (IGF1 und IGF2), zwei Membranrezeptoren (IGF1R und IGF2R),
spezifischen Bindungsproteinen (IGFBP) und IGFBP-assoziierten Proteinen (HWA et
al. 1999). Isoliert und sequenziert wurden IGF1 und 2 erstmals 1976 von
Rinderknecht und Humbel, die den Namen Insulin-like growth factor aufgrund der
strukturellen Ähnlichkeit zu Proinsulin wählten, der daraufhin deutet, dass beide
Hormone aus einer Genduplikation vor über 600 Millionen Jahren hervorgegangen
sind (FROESCH 1985). Im Vergleich der Aminosäuresequenzen von Rind und
Mensch besteht eine 100-prozentige Homologie der Liganden IGF1 und IGF2
(HONEGGER u. HUMBEL 1986).
2.1.1 Liganden des IGF-Systems
Die Liganden IGF1 und IGF2 sind Polypeptide, bestehend aus ca. 70 Aminosäuren
und einem Molekulargewicht von ungefähr 7000 Dalton (RINDERKNECHT u.
HUMBEL 1978). Der Hauptsyntheseort von IGF1 und IGF2 als endokrine Faktoren
ist die Leber. Die Synthese wird durch das Wachstumshormon [Growth Hormone
(GH)] stimuliert (JONES u. CLEMMONS 1995). Weiterhin konnte eine lokale
Produktion von IGF1 und IGF2 als parakrin wirkende Faktoren in einigen Geweben,
wie
beispielsweise
der
Plazenta,
nachgewiesen
werden,
wo
sie
zur
Zelldifferenzierung beitragen (LARON et al. 2001). Ähnlich wie Insulin können IGF1
und
IGF2
die
Glukoseaufnahme
in
Fett-
und
Muskelzellen
stimulieren
(RINDERKNECHT u. HUMBEL 1978). Des Weiteren haben die Wachstumsfaktoren
einen regulatorischen Einfluss auf den Metabolismus, die Mitoserate und die
Steuerung des plazentaren und fetalen Wachstums (FOWDEN 2003). Die Liganden
4
Literatur
___________________________________________________________________
des IGF-Systems spielen beim Wachstum von Organismen eine entscheidende
Rolle. Die Hauptfunktion von IGF1 ist die pränatale und postnatale Stimulation der
Entwicklung. Eine fehlende IGF-Synthese führt sowohl prä- als auch postnatal zu
einer fetalen Wachstumsretardierung (LIU et al. 1997). IGF1-null-mutante Mäuse
sterben häufig schon vor der Geburt (95-prozentige perinatale Mortalität). Die
wenigen überlebenden Tiere sind unfruchtbar, entwicklungsgestört und weisen
zahlreiche Defekte in den Organsystemen auf (LIU et al. 1997).
Der Insulin-like growth factor 1 ist ein einkettiges, basisches Polypeptid, das sich in
einen A- und B-Strang gliedert, die durch drei Disulfidbrücken miteinander verbunden
sind (Abb. 1A). Die Signalübertragung von IGF1 erfolgt vorwiegend durch die
Bindung an den membranständigen Rezeptor Insulin-like growth factor 1 receptor
(KAYE 1997). Allerdings kann IGF1 auch durch Bindung an den Insulinrezeptor
metabolische Effekte, wie den Glukosetransport, steuern (KAYE 1997).
A
B
Abbildung 1: Proteinstruktur des IGF1 (A; SATO et al. 1993) und IGF2 (B; TORRES et
al. 1995). Proteinketten sind vom N- (Rot) zum C-Terminus (Blau) unter Verwendung
eines Regenbogenfarben-Spektrums coloriert dargestellt
Der Insulin-like-growth factor 2 ist in seiner Struktur und Sequenz dem IGF1 sehr
ähnlich. Das einsträngige Polypeptid gliedert sich in vier Domänen, die über drei
Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1B). Die Signalübertragung von
IGF2 erfolgt wie bei IGF1 durch die Bindung an den membranständigen IGF1R.
Jedoch kann IGF2 auch an den Insulin-like growth factor 2 - Rezeptor (IGF2R)
binden und bewirkt dort die Proliferation und Differenzierung von Zellen. Außerdem
5
Literatur
___________________________________________________________________
kommt es zu einer Art Reinigung der Umgebung von IGF2 durch die Bindung an den
IGF2R (HARRIS u. WESTWOOD 2012). Während der frühen Embryonalentwicklung
spielt IGF2 eine große Rolle, da es das normale Plazentawachstum und die frühe
Zellentwicklung fördert (HARRIS u. WESTWOOD 2012).
2.1.2 Rezeptoren des IGF-Systems
Strukturell ist der membranständige IGF1R ein Heterotetramer, das aus zwei
extrazellulären α-Untereinheiten und zwei transmembranen β-Untereinheiten besteht
(KATO et al. 1994). Die α-Untereinheiten weisen cysteinreiche Bindungsstellen für
die IGF-Liganden auf und sind durch Disulfidbrücken miteinander und zu den
β-Untereinheiten
verbunden.
Die
β-Untereinheiten
setzen
sich
aus
einer
intrazellulären Domäne mit einer Tyrosinkinase, einer Transmembrandomäne und
einer kurzen extrazellulären Domäne zusammen (KATO et al. 1994). Damit weist der
IGF1R viele strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten zum Insulinrezeptor auf und
kann neben IGF1 auch IGF2 und Insulin binden, zeigt jedoch die größte
Bindungsaffinität
zu
IGF1
(KAYE
1997).
Durch
Autophosphorylierung
der
Tyrosinkinase des Rezeptors werden intrazellulär zwei Hauptsignalkaskaden
aktiviert, der MAPK-Signalweg (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) und der PI3KSignalweg (Phosphoinositid-3-Kinase). Diese Signalkaskaden führen zur Aktivierung
verschiedener Transkriptionsfaktoren und lösen so eine spezielle Zellantwort aus, die
letztlich die Proliferation, das Wachstum und das Überleben der Zelle bewirken
(LARON
2001).
In
Abbildung
2
ist
Signalübertragung schematisch dargestellt.
6
das
gesamte
IGF-System
und
die
Literatur
___________________________________________________________________
IGFBP-Fragmente
IGFBP Protease
IGF1-Rezeptor
PI3K
IGF2-Rezeptor
MAPK
Abbildung 2: Insulin-like growth factor System mit Darstellung der spezifischen
Signalübertragung (mod. nach HWA et al. 1999)
Der IGF2R, auch kationunabhängiger Mannose-6-Phosphat (M6P) Rezeptor
genannt, ist ein vielseitiger Proteinrezeptor, der sowohl IGF2 an der Zellmembran
binden kann, als auch Mannose-6-Phosphat gebundene Proteine im Transgolgi
Netzwerk (HARRIS u. WESTWOOD 2012). In seiner Struktur besteht der
einsträngige IGF2R primär aus einer großen extrazellulären Domäne, die strukturell
homolog
zu
der
kollagenbindenden
Domäne
von
Fibronectin
ist,
einer
transmembranen Domäne und einem relativ kurzen cytoplasmatischen Schwanz
(BROWN et al. 2009). Die Signaltransduktion erfolgt hauptsächlich über die
Transaktivierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren, da der Rezeptor weder über
eine Tyrosinkinase, noch über eine Autophosphorylierungsstelle verfügt (EL-SHEWY
u. LUTTRELL 2009). Die weiteren Signalwege können sowohl fördernd auf die
Proliferation und das Wachstum der Zellen wirken, als auch die Migration der Zelle
auslösen (HARRIS u. WESTWOOD 2012). Insgesamt zeigt der IGF2R eine größere
Bindungsaffinität gegenüber IGF2 als IGF1 und kann Insulin nicht binden (HARRIS
und WESTWOOD 2012). Daher ist die Signalübertragung von IGF2 über den IGF2R
einer der Hauptmediatoren für die Regulation einer normalen Embryonalentwicklung
(HARRIS und WESTWOOD 2012).
7
Literatur
___________________________________________________________________
2.1.3 Bindungsproteine des IGF-Systems
Die
Insulin-like
growth
factor-Bindungsproteine
gehören
zur
Familie
der
sezernierenden Proteine, die IGF 1 und 2 mit einer höheren oder ähnlichen
Wahrscheinlichkeit wie der IGF1R binden und ein Molekulargewicht zwischen 24 und
45 kDa aufweisen (DUAN u. XU 2005). Die Primärstruktur aller IGFBP ist gleich und
gliedert sich in drei Domänen mit jeweils gleicher Größe: eine hoch konservierte
N-terminalen Domäne, eine konservierte C-terminale Domäne und eine variierende,
zentrale Domäne, auch linker (L-) Domäne genannt (HWA et al. 1999). Die
N-terminale Domäne enthält die Hauptbindungsstelle für IGF1 und -2, während die
C-terminale Domäne zwar zur Ligandenbindung beiträgt, aber zusätzlich mit anderen
Proteinen, wie zum Beispiel der unstabilen Säure-Untereinheit (acid-labile subunit),
interagieren kann (CLEMMONS 2001). Die L-Domäne ist variabel und enthält Stellen
mit posttranskriptionaler und –translationaler Aktivität, die Polyadenylierung,
Spleißen, aber auch Glykosylierung, Phosphorylierung und Proteolyse steuern
können (HWA et al. 1999). Zurzeit sind sechs verschiedene Bindungsproteine
(IGFBP-1 bis -6) beim Rind, Menschen und weiteren Spezies bekannt (SATO et al.
1993, CLEMMONS 2001, DUAN u. XU 2005). Das Vorkommen eines siebten IGFBP
wird weiterhin kontrovers diskutiert (LI et al. 2012). Das IGFBP-7, ebenso bekannt
unter IGFBP-related protein 1, mac25/angiomodulin oder tumor-derived adhesion
factor, ist ein Protein, welches eine hohe Strukturähnlichkeit zu den IGFBP-1 bis -6
aufweist, jedoch in seiner Funktion vorwiegend Insulin bindet und daher eine bisher
noch unbekannte biologische Rolle spielt (AKAOGI et al. 1996, OH et al. 1996, LI et
al. 2012). In extrazellulären Flüssigkeiten kommen die Liganden IGF1 und IGF2 zu
99 % gebunden an eines der sechs IGFBP vor (LARON 2001). Der Hauptteil des
zirkulierenden IGF1 ist an das IGFBP3 gebunden. Die Bindeproteine helfen beim
Transport der Liganden im Plasma und bei der Bindung der freien IGFs an ihre
Rezeptoren, um so ihre Verfügbarkeit für das Gewebe zu vermitteln (JONES u.
CLEMMONS 1995). Sie verlängern die Halbwertszeit des zirkulierenden IGF1 oder
IGF2 und regulieren ihre biologische Aktivität (JONES u. CLEMMONS 1995).
8
Literatur
___________________________________________________________________
2.1.4 Rolle des IGF1 während der Pubertät und Trächtigkeit von Rindern
Im Verlauf der Entwicklung des weiblichen Hausrindes bis zum Beginn der Pubertät
konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration registriert werden (ARMSTRONG et al.
1992, GARCIA u. SANTISTEBAN 2002). So steigt der IGF1-Serumgehalt im
Vergleich zu jüngeren Tieren kurz vor der Pubertät um mehr als 20 % an (GARCIA u.
SANTISTEBAN 2002). In Studien, bei denen die IGF1-Serumwerte durch eine aktive
Immunisierung gegen den Growth Hormone Releasing Factor (GRFi) herabgesetzt
wurden, zeigten die Tiere eine verspätet einsetzende Pubertät (SCHOPPEE et al.
1996, KÖLLE et al. 2003). Eine mögliche Ursache ist laut der Autoren die niedrige
IGF1-Konzentration, die eine Beeinträchtigung der Östradiol-17β (E₂)-Synthese im
Ovar bewirkt, was zu einer Verzögerung des LH-Anstiegs (Luteinisierendes Hormon)
führt und auf diese Weise die Heranreifung von Follikeln beeinflusst (SCHOPPEE et
al. 1996, KÖLLE et al. 2003). Zudem richtet sich die IGF1-Konzentration im Blut nach
der metabolischen Situation des Tieres und lässt sich durch das Futtermanagement
verändern (YAMBAYAMBA et al. 1996). Es wurde beobachtet, dass bei Tieren, die
ad libitum gefüttert werden, höhere IGF1-Konzentrationen im Blut messbar waren
und die Pubertät früher einsetzte als bei Tieren nach restriktiver Fütterung (YELICH
et al. 1996).
Nicht nur während der Pubertät, sondern auch bei der Trächtigkeit von Rindern,
spielt IGF1 eine entscheidende Rolle. In der späten Phase der Trächtigkeit und der
frühen Laktationsphase steigen die Nährstoffbedürfnisse des Rindes drastisch an.
Zum einen benötigt das Rind mehr Nährstoffe, um das fetale Wachstum zu
gewährleisten
und
zum
anderen,
um
(Abbildung 3).
9
die
Milchsynthese
zu
ermöglichen
Literatur
___________________________________________________________________
Energie (Kcal pro Tag)
Milchproduktion
Futter
Energiespeicher
des Körpers
Laktationstrimester
Abbildung 3: Darstellung des Energiehaushaltes während der Laktationsphase des
Rindes (mod. Nach EMMICK et al. 2000)
In
dieser
Situation
ist
das
Rind
außerstande,
den
Bedarf
über
die
Nahrungsaufnahme sicherzustellen. Daher wurde dieser Zustand als negative
Energiebilanz definiert (MCCLURE 1965). Besonders nach der Abkalbung wirkt sich
diese negative Energiebilanz bei Hochleistungsrindern direkt auf die Fertilität aus
(WATHES et al. 2007). In dieser Phase findet ein Zusammenspiel vieler einzelner
Faktoren statt. Die Veränderungen, die währenddessen auf der GH-IGF-Achse
auftreten, reduzieren zum einen durch eine verminderte Produktion von IGF1 in der
Leber die Bioverfügbarkeit von zirkulierendem IGF1 (FENWICK et al. 2008). Zum
anderen bewirkt eine verringerte Ausschüttung von IGFBPs eine Verkürzung der
Halbwertszeit von IGF1, wodurch weniger IGF1 zur Verfügung steht (LEROY et al.
2008). Außerdem bewirkt ein erhöhter Blutfluss durch die Leber, eine gesteigerte
Verstoffwechselung von IGF1, womit ebenfalls weniger zirkulierendes IGF1
vorhanden ist. Letztlich führen die Änderungen auf IGF1-Ebene zu einer
Verlangsamung des follikulären Wachstums und einer verzögerten Ovulation
10
Literatur
___________________________________________________________________
(WATHES
et
al.
2007).
Ausschlaggebend
für
die
Fruchtbarkeit
des
Hochleistungsrindes und dementsprechend wichtig für eine normale follikuläre
Entwicklung ist die IGF1-Konzentration im Serum (LEROY et al. 2008). Bei Rindern
mit einer stark ausgeprägten negativen Energiebilanz (SNEB) wurde ein reduzierter
IGF1-Gehalt im Serum beobachtet (FENWICK et al. 2008). Dieser lässt sich durch
eine reduzierte Verfügbarkeit von Glukose erklären, wodurch die Produktion von
IGF1 eingeschränkt wird. Aber auch die IGF1-Konzentration in der Follikelflüssigkeit
ist von entscheidender Bedeutung. Die metabolischen Veränderungen, die während
der NEB auftreten, können direkt oder indirekt durch Beeinträchtigung der follikulären
Umgebung zu einer Verschlechterung der Oozytenqualität führen (WATHES et al.
2007). Sogar wenn anschließend eine korrekte Fertilisierung stattgefunden hat,
können vorherige schlechte follikuläre Bedingungen während Eizellwachstum und –
reifung die Viabilität des resultierenden Embryos beeinflussen und damit zu einer
frühen embryonalen Mortalität führen (LEROY et al. 2011). Aus diesem Grund
wurden bereits zahlreiche Versuche durchgeführt, die an dieser Stelle in vitro
ansetzen, um möglichst genau die Zusammensetzung der Follikelflüssigkeit zu
definieren und den Einfluss auf die Eizelle zu untersuchen. Im Nachfolgenden Kapitel
(2.2.1) wird hierauf detaillierter eingegangen.
11
Literatur
___________________________________________________________________
2.2 In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion von Embryonen ist zu einer bedeutenden Methode der
assistierten Reproduktion bei Rindern geworden und gliedert sich in die drei
aufeinanderfolgenden Schritte der In-vitro-Reifung oder -Maturation (IVM), der Invitro-Befruchtung oder -Fertilisation (IVF) und der In-vitro-Kultivierung (IVC;
BAVISTER 1995; Abb. 4). Durch die Weiterentwicklungen in der Biotechnologie
werden mittlerweile jährlich eine große Anzahl kommerzieller Embryonen erzeugt. Im
Jahr 2013 wurden weltweit 546.628 transfertaugliche bovine Embryonen in vitro
produziert, von denen knapp 410.000 transferiert wurden (PERRY 2014). Die ersten
erfolgreichen In-vitro-Fertilisationen fanden beim Kaninchen in den späten 50er
Jahren statt (CHANG 1959). Ein Jahrzehnt später konnten Erfolge bei der Maus
verzeichnet werden (WHITTINGHAM 1968), worauf folgend die ersten humanen
Eizellen in vitro gereift und erfolgreich fertilisiert wurden (EDWARDS et al. 1969).
Beim Rind beschrieben Iritani und Niwa (1977) die erste Fertilisation einer Eizelle in
vitro. Das erste Kalb aus einem in vitro produzierten Embryo kam im Januar 1981 zur
Welt (BRACKETT et al. 1982). Seitdem erfolgte eine stetige Weiterentwicklung der
IVP, die heute hauptsächlich zur assistierten Reproduktion beim Menschen, Pferd
und beim Rind Anwendung findet.
Eizellwachstum
im Follikel
Unreife Eizelle
Reife Eizelle
Zygote 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 16-Zeller Morula Blastozyste
Abbildung. 4: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion boviner Embryonen
(mod. nach LONERGAN 2007)
12
Literatur
___________________________________________________________________
Für Forschungszwecke hat sich die Entnahme von Kumulus-Oozyten-Komplexen
(KOK) aus Ovarien geschlachteter Tiere bewährt. Durch Isolierung, Aspiration oder
„Slicen“ von Follikeln können unterschiedliche Mengen an KOK gewonnen werden
(GALLI et al. 2003). Im Anschluss an die Gewinnung erfolgt die Bewertung und
Selektion der KOK nach morphologischen Kriterien. Dabei kommt es nur zur
Verwendung von den KOK, die sich als IVP-tauglich einordnen lassen. Maßgebend
dafür sind ein homogenes Ooplasma und die Anzahl der die Eizelle umgebenden
Kumuluszellen(KASTROP et al. 1990). Die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche
Entwicklung zur Blastozyste in vitro steigt mit der Anzahl an Kumuluszellschichten
signifikant an (KHURANA u. NIEMANN 2000). Anschließend findet die Reifung der
KOK in einem spezifischen Medium statt. Während der Maturation der Eizelle wird
die Meiose fortgeführt. Unter natürlichen Bedingungen erfolgt dies unter Einfluss
eines LH-Peaks (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Nach 20-24 Stunden Inkubation ist
die Mehrzahl der Oozyten vollständig gereift und bereit, fertilisiert zu werden. Unter
optimalen Bedingungen erreichen mehr als 90 % der Eizellen das Metaphase-II–
Stadium (GALLI et al. 2003).
Für die darauf folgende Befruchtung der gereiften Oozyten wird hauptsächlich
tiefgefrorenes Sperma verwendet. Dies wird zum Beispiel mit Hilfe einer
Dichtegradientenzentrifugation aufbereitet, bei der sich die lebenden, motilen
Spermien in der Fraktion mit der höheren Dichte konzentrieren und die toten
Spermien daher leicht mit dem Überstand abpipettiert werden können. Des Weiteren
sind zur Spermienbehandlung Substanzen wie Heparin, Hypotaurin und Epinephrin
wichtig, um unter anderem die Kapazitation der bovinen Spermien einzuleiten und
sie so für die Befruchtung vorzubereiten. Die eigentliche Fertilisation erfolgt während
einer
19-stündigen
Ko-Inkubation
von
KOK
und
Spermien,
wodurch
Befruchtungsraten von 70-90 % erzielt werden können (WRENZYCKI et al. 2007). Im
Anschluss findet die Kultivierung der befruchteten Eizellen unter kontrollierten
physikalischen Bedingungen statt. Die Zygote beginnt sich anfänglich in jeweils
gleich
große
Zellen
zu
teilen.
Im
weiteren
Verlauf
dieser
sogenannten
Furchungsteilung kommt es zur Kompaktierung der Zellen zu einer Morula, die im
Rind aus etwa 32 Zellen besteht (VAN SOOM et al. 1997). Anschließend wird von
13
Literatur
___________________________________________________________________
den Zellen Flüssigkeit sezerniert, die zur Bildung eines Blastozoels führt. Während
der Blastulierung kommt es dann erstmals zu einer Differenzierung von Zellen in den
Trophoblasten, der sich später zum Chorion- und Amnionepithel entwickelt und der
inneren Zellmasse, dem sogenannten Embryoblasten, aus dem in der folgenden
Entwicklung der Embryo bzw. Fetus entsteht (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Die Invitro-Kultivierung von Rinderembryonen erfolgt in den meisten Fällen bis zum siebten
Tag, zum Stadium der expandierten Blastozyste. Bis zu diesem Zeitpunkt können
Entwicklungsraten von 20-40 % erzielt werden (RIZOS et al. 2002).
Bei der IVP haben primär die Kultivierungsmedien, einen entscheidenden Einfluss
auf die Entwicklung der Embryonen. Bei der Reifung boviner KOK kommt es
vorwiegend zur Verwendung komplexer Medien, wie das kommerziell erhältliche
Tissue Culture Medium 199 (TCM199), das für die Kultivierung somatischer Zellen
entwickelt
wurde
(SUTTON
et
al.
2003).
Üblicherweise
werden
dem
Maturationsmedium Hormone, wie humanes Choriongonadotropin (hCG) zugesetzt,
das die natürlichen Hormone FSH (follikelstimulierendes Hormon) und LH ersetzt
und zum Prozess der Reifung beiträgt (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Zusätzlich
findet eine Supplementation des Mediums mit Proteinen statt. Die häufigsten
Proteinzusätze sind dabei fetales Kälberserum (FCS) oder bovines Serumalbumin
(BSA) unterschiedlicher Reinheit (FARIN et al. 2001).
Neben der Qualität der Eizelle hat das Kultivierungsmedium den größten Einfluss auf
die Qualität der sich entwickelnden Embryonen. Bis heute gibt es zahlreiche Studien,
die den Einfluss unterschiedlicher Kultivierungsmedien und Zusätze auf die
Entwicklung boviner Embryonen untersucht haben (WRENZYCKI et al. 1999,
NATALE et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, LONERGAN et al.
2003). Kultivierungsmedien können ganz unterschiedlich zusammengesetzt sein.
Einfach balancierte Salzlösungen mit Kohlenhydraten bis hin zu komplexen Medien
mit vielen verschiedenen Inhaltsstoffen wurden bereits getestet (SAGIRKAYA et al.
2006). Eines der am häufigsten genutzten Medien für die In-vitro-Kultivierung boviner
Embryonen ist SOF-Medium (synthetic oviduct fluid). Die Basis dafür bildete eine
Untersuchung der ovinen Eileiterflüssigkeit auf biochemischer Ebene (TERVIT et al.
1972).
In
den
letzten
Jahrzehnten
14
fand
eine
stetige
Optimierung
der
Literatur
___________________________________________________________________
Zusammensetzung durch empirische Modifikationen wie z.B. durch die Zugabe von
Aminosäuren (FEUGANG et al. 2009) oder Wachstumshormonen (SIRISATHIEN u.
BRACKETT 2003) statt.
2.2.1 Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen bovinen
Embryonalentwicklung in vitro
Der Insulin-like growth factor 1 hat einen entscheidenden Einfluss auf das follikuläre
Wachstum und damit auf die Eizellreifung. Mit Zunahme des Follikeldurchmessers
ließ sich ein Anstieg der IGF1-Konzentration im Follikel von Rindern erkennen, der
wiederum mit der Plasmakonzentration korrelierte (SPICER u. ECHTERNKAMP
1995). Im Ovar verstärkt IGF1 die Wirkung von Gonadotropinen, die das
Follikelwachstum stimulieren (GIUDICE 1992). In einer Studie, in der IGF1
kontinuierlich intraovariell durch eine osmotische Minipumpe verabreicht wurde,
konnte gezeigt werden, dass die E2-Synthese in kleinen Follikeln (2-5 mm) anstieg
und die Follikelgröße dabei stetig zunahm (SPICER et al. 2000). IGF1 fördert
daneben die Proliferation der Granulosazellen im Follikel und die Eizellreifung
(KHAMSI et al. 2001). In einer anderen Studie, in der weibliche Rinder nach
intraovarieller
IGF1-Injektion
(500
ng/ml)
besamt
wurden,
konnten
keine
Unterschiede in der Entwicklungsrate oder der Gesamtanzahl an embryonalen Zellen
entdeckt werden, allerdings zeigte sich ein Anstieg der Proliferation des
Embryoblasten (VELAZQUEZ et al. 2012). Bei der Untersuchung des Einflusses
einer intrafollikulären Injektion von IGF1 (200 µg/ml) in den subdominanten Follikel
von Rindern während des physiologischen Östrus konnte beobachtet werden, dass
es zu einer Stimulation des subdominanten Follikels, bei gleichzeitiger Inhibierung
des dominanten Follikels, kam (SHAHIDUZZAMAN et al. 2010). Eine Stimulation
kennzeichnete sich hierbei durch ein voranschreitendes Wachstum mit Vergrößerung
des Gesamtdurchmessers und eine ansteigende Durchblutung der Follikelwand,
gemessen mit einer Doppler-Sonografie. Die Autoren bestätigten dadurch die
15
Literatur
___________________________________________________________________
stimulierende
Funktion
von
IGF1
während
des
Follikelwachstums
(SHAHIDUZZAMAN et al. 2010).
Die Expression von IGF1 auf mRNA-Ebene in der bovinen Eizelle wird bis heute
kontrovers diskutiert. Zum einen konnte gezeigt werden, dass IGF1 in der Oozyte
exprimiert wird und daher eine wichtige Rolle während des Follikelwachstums spielt
(WATSON et al. 1992). Zum anderen führten Untersuchungen an Rindereizellen
nicht zu einem Nachweis von IGF1, weshalb auf eine parakrine Wirkungsweise von
IGF1 in Oozyten geschlossen wurde (YASEEN et al. 2001).
Während der frühen Embryonalentwicklung führten Studien zur mRNA-Expression
von IGF1 in Embryonen ebenfalls zu gegensätzlichen Ergebnissen. In einigen
Studien konnte IGF1 in allen Stadien der präimplantatorischen Entwicklung
nachgewiesen werden (WATSON et al. 1992, MOORE et al. 2007). Andere
Arbeitsgruppen konnten dieses Ergebnis allerdings nicht bestätigen (LONERGAN et
al. 2000, YASEEN et al. 2001, WANG et al. 2009). Hier weisen die Autoren auf eine
parakrine Wirkungsweise von IGF1 über den IGF1R hin, der kontinuiertlich im
Embryo exprimiert wird (YASEEN et al. 2001). Grundsätzlich stimuliert IGF1 im
Embryo die DNA-Synthese und steigert dadurch die Mitoserate (FOWDEN 2003).
Darüber
hinaus
vermittelt
IGF1
die
Nährstoffaufnahme
und
reguliert
den
Glukosestoffwechsel in Embryonen (KAYE 1997). Weiterhin trägt IGF1 zur
Blastozystenbildung bei und fördert die Zellproliferation in der Inneren Zellmasse
(KAYE 1997). Zusätzlich wirkt IGF1 antiapoptotisch und kann die Anzahl an
apoptotischen Zellen im Embryo verringern (JOUSAN u. HANSEN 2007).
Zur Untersuchung des Einflusses von IGF1 auf die Oozytenreifung und frühe
Embryonalentwicklung
wurden
in
der
Vergangenheit
zahlreiche
Versuche
durchgeführt, die sich mit der Supplementation von IGF1 zur Maturation boviner
Eizellen (Tabelle 1) oder Kultivierung boviner Embryonen beschäftigten (Tabelle 2).
Bei einem Zusatz von 100 ng/ml IGF1 zum Maturationsmedium (TCM199) wurde
untersucht, ob dieser die Fortführung der zweiten Reifeteilung boviner Oozyten
beeinflusst. Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den Oozyten
der Supplementationsgruppe und denen der Kontrollgruppe gefunden werden
(RIEGER et al. 1998, MEIYU et al. 2014). Ferner erfolgte die Analyse der Wirkung
16
Literatur
___________________________________________________________________
von IGF1 im Medium auf die Gesamtzellzahl und das Vorkommen von Apoptose
während der Maturation. Dabei zeigte sich, dass IGF1 die Anzahl apoptotischer
Kumuluszellen (KÖLLE et al. 2003) bzw. die Apoptose in den Eizellen reduziert
(WASIELAK u. BOGACKI 2007), aber keinen Einfluss auf die Gesamtzellzahl der
resultierenden Embryonen ausübt. Des Weiteren wurde untersucht, ob IGF1 die
Anzahl an Embryonen, die sich nach einer In-vitro-Fertilisation weiter entwickeln,
verändert und damit die sogenannte Entwicklungsrate beeinflusst. Allerdings konnten
auch hier keine signifikanten Veränderungen der Anzahl an Morulae und
Blastozysten erzielt werden (RIEGER et al. 1998, MAKAREVICH u. MARKKULA
2002). Insgesamt wirkt IGF1 positiv auf Eizellen während der Maturation und fördert
ihren Stoffwechsel (RIEGER et al. 1998).
Tabelle 1: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Maturationsmedium und
dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung
Parameter
Maturations- Teilungs- Entwicklungsrate
rate
rate
Zellzahl Apoptose
Autor
KÖLLE et al.
(2003)
100 ng/ml
-
↓(Kumuluszellen) -
-
-
MAKAREVICH u.
MARKKULA
(2002)
100 ng/ml
n.s.
n.s. (Eizellen)
-
n.s.
n.s.
MEIYU et al.
(2014)
100 ng/ml
-
n.s. (Eizellen)
n.s.
n.s.
-
RIEGER et al.
(1998)
100 ng/ml
n.s.
-
n.s.
n.s.
n.s.
WASIELAK u.
↓ (Eizellen)
BOGACKI (2007) 100 ng/ml
n.s. = nicht signifikant; ↓ = signifikant reduziert; - = nicht untersucht
17
-
Literatur
___________________________________________________________________
Bei der Untersuchung des Einflusses von IGF1 während der Kultivierung boviner
Embryonen wurden unterschiedliche Konzentrationen an IGF1 (50, 100, 200,
1000 ng/ml) dem Kultivierungsmedium zugesetzt, die alle zu einer Steigerung der
Entwicklungsrate von Embryonen führten (Tabelle 2). Lediglich eine Studie konnte
auch eine Steigerung der Teilungsrate nach Supplementation von 50 ng/ml IGF1
zum Kultivierungsmedium beobachten (SIRISATHIEN u. BRACKETT 2003).
Außerdem wurde gezeigt, dass die Zugabe von IGF1 zu einer beschleunigten
Entwicklung führt (PALMA et al. 1997). Beim Zusatz von 50 und 100 ng/ml IGF1
erfolgte eine Erhöhung der Gesamtzellzahl boviner Blastozysten. Gleichzeitig kam es
zu einer Reduzierung der Anzahl apoptotischer Zellen. In einer Studie, in der dem
Kultivierungsmedium 1000 ng/ml IGF1 zugesetzt wurde, konnte allerdings eine
erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen bei gesteigerter Gesamtzellzahl gefunden
werden (VELAZQUEZ et al. 2011). Weiterhin zeigte die Supplementation von
100 ng/ml IGF1 im Kultivierungsmedium, dass es zu einer Verminderung der Anzahl
an IGF1R-Transkripten um 20 % kommt (BLOCK et al. 2008).
18
Literatur
___________________________________________________________________
Tabelle 2: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Kultivierungsmedium und
dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung
Parameter
Medium
Zellzahl
Apoptotische Teilungs- EntwicklungsZellen
rate
rate
BLOCK et al. (2008)
100 ng/ml
SOFaa
-
-
-
↑
BONILLA et al.
(2011)
100 ng/ml
KSOM
-
-
n.s.
↑
BYRNE et al. (2002)
100 ng/ml
SOFaa-BSA
↑
↓
-
↑
MAKAREVICH u.
MARKKULA (2002)
100 ng/ml
SOFaaci
↑
↓
n.s.
↑
MATSUI et al. (1997)
200 ng/ml
SOFaa
n.s.
-
-
↑
NEIRA et al. (2010)
50 ng/ml
SOFaa
↑
-
-
↑
PALMA et al. (1997)
100 ng/ml
TCM199
-
-
n.s.
↑
PRELLE et al. (2001)
100 ng/ml
SOF+
Polyvinylalkohol n.s.
(PVA)
-
-
↑
SIRISATHIEN u.
BRACKETT (2003)
50 ng/ml
SOFaa+Citrat
↑
↓
↑
↑
SIRISATHIEN et al.
(2003)
50 ng/ml
SOFaa+Citrat
↑
-
-
↑
VELAZQUEZ et al.
(2011)
100 ng/ml
SOFaa
n.s.
n.s.
n.s.
↑
Autor
VELAZQUEZ et al.
SOFaa
↑
↑
n.s.
↑
(2011)
1000 ng/ml
n.s. = nicht signifikant; ↑ = signifikant gesteigert; ↓ = signifikant reduziert; - = nicht untersucht
SOFaa = synthetic oviduct fluid with amino acids
KSOM = potassium simplex optimization medium
19
Literatur
___________________________________________________________________
2.2.2 Apoptose während der frühen bovinen Embryonalentwicklung
Der programmierte Zelltod beschreibt die Steuerung des eigenen Todes einer Zelle
über genetisch festgelegte Programme. Im Gegensatz dazu kann die Zelle eines
Organismus auch durch ungeregelte Mechanismen, der sogenannten Nekrose
sterben. Hierbei kommt es zu einem Zerfall der Zelle durch eine unkontrollierte
Volumenzunahme und Ruptur der Zellmembranen. Die zellulären Bestandteile
werden
freigesetzt
und
können
benachbarte
Zellen
schädigen
und
Entzündungsreaktionen auslösen (MAJNO u. JORIS 1995). Dagegen dient der
programmierte Zelltod der gezielten Entfernung von einzelnen, abnormalen oder
nicht benötigten Zellen, ohne dabei angrenzende Zellen zu beschädigen. Bis heute
sind acht verschiedene Formen des Zelltods bekannt, die durch das Nomenclature
Committee on Cell Death (NCCD) nach morphologischen Kriterien unterschieden
werden (KROEMER et al. 2005). Die bekannteste Form des programmierten Zelltods
ist die Apoptose. Dieser Begriff wurde erstmals 1972 eingeführt und lässt sich vom
griechischen Wort apoptosis (= Absterben) ableiten (KERR et al. 1972). Apoptose
beschreibt den häufig spontan oder als Antwort auf einen physiologischen Stimulus
auftretenden programmierten Zelltod einzelner Zellen. Die Definition dieses
Vorgangs fand aufgrund morphologischer Veränderungen der Zelle statt und gliedert
sich in eine Abfolge mehrerer Schritte (Abb. 6). Zunächst kommt es zum Schrumpfen
des Zellvolumens mit Abrundung der Zelle (‚Pyknose‘). Anschließend erfolgt eine
Kondensierung des Chromatins und Fragmentierung des Zellkerns (‚Karyorrhexis‘),
wobei die DNA durch Endonukleasen in definierte Stücke abgebaut wird. Letztlich
zerfällt die Zelle in ‚apoptotische Körperchen‘, die von benachbarten Zellen oder
Makrophagen phagozytiert werden (KROEMER et al. 2005).
20
Literatur
___________________________________________________________________
tierische
Zelle
Pyknose
Karyorrhexis
Zerfall in
apoptotische
Körperchen
Phagozytose von
benachbarten Zellen
oder Makrophagen
Abbildung 6: Schematische Darstellung des programmierten Zelltods (mod. nach
WEEDON et al. 1979)
Diese Prozesse sind sehr komplex und bedingen eine große Anzahl genetischer
Komponenten und Proteine. Als Hauptmediatoren der Apoptose wurden spezifische,
hoch konservierte Proteasen, sogenannte Caspasen, entdeckt, deren Aktivierung für
die korrekte Durchführung der Apoptose notwendig ist (EARNSHAW et al. 1999).
Des Weiteren kam es zur Identifikation von anti- (B-cell lymphoma 2-Familie) und
pro-apoptotischen
(Bcl2-assoziiertes
X
Protein)
Proteinen,
deren
Verhältnis
zueinander zur Auslösung von Apoptose in Zellen führen kann (WYLLIE 1995).
21
Literatur
___________________________________________________________________
In der frühen Embryonalentwicklung tritt Apoptose als physiologischer Prozess auf,
um eine normale Entwicklung zu garantieren und geschädigte oder fehlerhafte Zellen
zu entfernen (MATWEE et al. 2000). Allerdings wird auch der Arrest in der
Entwicklung boviner Embryonen mit Vorgängen der Apoptose verbunden (ANTUNES
et al. 2010). Im Stadium der Blastozyste findet zudem eine Regulierung der Zellzahl
mittels Apoptose statt (FABIAN et al. 2007).
Die wichtigste Methode zur Darstellung von Apoptose ist die mikroskopische Analyse
von Zellkernen mit Hilfe spezifischer Färbungen, wie die TUNEL (TdT-mediated
dUTP-biotin Nick End Labeling) – Analyse. Diese In-situ-Färbung von DNA-Brüchen
in Zellkernen basiert auf der Bindung markierter dUTP (deoxyuridin) gekoppelt an
terminale TdT (deoxynucleotidyl transferase) an freie 3`-OH Enden der DNA, welche
aufgrund von Fluoreszenz sichtbar gemacht werden (GAVRIELI et al. 1992).
Allerdings ist diese Untersuchung kritisch zu beurteilen, da eine Unterscheidung
zwischen nekrotischen und apoptotischen Zelluntergängen nur bedingt möglich ist.
Bei TUNEL-positiven Nuclei, die keine apoptotische Morphologie aufweisen, kann
eine Ursache für den Zelltod auch Nekrose sein (GJORRET et al. 2003). Des
Weiteren kann durch die Untersuchung der Genexpression der aktiven Caspasen
eine Aussage über den Grad an Apoptose getroffen werden. Sowohl auf mRNAEbene, als auch auf Proteinebene lässt sich insbesondere die Caspase 3 als
Apoptosemarker gut darstellen. Jedoch kommt es hier zu widersprüchlichen
Ergebnissen, die auf eine Aktivität von Caspase 3 ohne Apoptose hinweisen
(GJORRET et al. 2007).
In Eizellen und frühen embryonalen Stadien bis zum 8-Zellstadium wurde bisher
keine Apoptose beobachtet. Gründe dafür könnten das Fehlen bestimmter
Transkripte, wie beispielsweise das für das BCL2-assoziierte X Protein (BAX) sein,
die für die Induktion der Apoptose notwendig sind und erst nach Aktivierung des
embryonalen Genoms exprimiert werden (MATWEE et al. 2000). Ein erster
Nachweis von Apoptose während der Embryonalentwicklung des Rindes erfolgte in
vitro zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium, während in vivo erstmals bei Stadien mit
mindestens 21 Zellen Apoptose zu verzeichnen war (GJORRET et al. 2003). In
bovinen Blastozysten kommt es zu einem Anstieg der Menge apoptotischer Zellen,
22
Literatur
___________________________________________________________________
die sich hauptsächlich in der Inneren Zellmasse lokalisieren (BYRNE et al. 1999).
Blastozysten aus einer In-vitro-Kultivierung weisen dabei eine größere Anzahl
apoptotischer Zellen im Vergleich zu in vivo generierten Embryonen auf (MATWEE et
al. 2000, GJORRET et al. 2003). Bei der Gegenüberstellung der Anzahl
apoptotischer Zellen in parthenogenetischen und in vitro fertilisierten Embryonen
wurden in den parthenogenetischen Embryonen mehr apoptotische Zellen bei einer
insgesamt niedrigeren Zellzahl registriert (NEUBER et al. 2002). Auch die Zeit der
Entwicklung spielt eine wichtige Rolle. Es konnte nachgewiesen werden, dass in sich
schnell teilenden Embryonen weniger apoptotische Zellen als in sich langsam
teilenden vorkommen (BYRNE et al. 1999, GUTIERREZ-ADAN et al. 2004). Das
Kultivierungsmedium
hat
ebenfalls
einen
entscheidenden
Einfluss
auf
das
Vorkommen von Apoptose in Embryonen. So zeigt sich beispielsweise ein größeres
Vorkommen von Zelltod in bovinen Blastozysten, die aus der Kultivierung mit Serum
stammen (BYRNE et al. 1999). Ebenso zeigen Kumuluszellen während der
Eizellreifung in vitro Anzeichen von Apoptose. Im Durchschnitt weist ein kompakter
Cumulus oophorus weniger als 15 % apoptotische Zellen auf (WARZYCH et al.
2013).
Allerdings
konnte
eine
negative
Korrelation
zwischen
der
Entwicklungskompetenz der Eizelle und der Anzahl apoptotischer Zellen in ihrem
Cumulus oophorus entdeckt werden (YUAN et al. 2005). Kumuluszellen, die
entwicklungskompetente Eizellen umschlossen, wiesen dabei ein höheres Level an
Apoptose auf und zeigten ein verändertes Genexpressionsmuster (JANOWSKI et al.
2012). Allerdings ist der Grad der Apoptose weder verbunden mit der Morphologie,
noch mit dem Maturationsstadium der Eizelle (WARZYCH et al. 2013). Die
Maturationsbedingungen bewirken auch hier Unterschiede in der Ausprägung von
Apoptose, so reduziert eine Maturation mit Serum beispielweise die Apoptoserate in
Kumuluszellen im Vergleich zur Reifung ohne Serum (IKEDA et al. 2003).
Insgesamt kann die Untersuchung von Apoptose Auskunft über physiologische
Prozesse während der Embryonalentwicklung geben, die zu einer verbesserten
Qualität und Überlebensrate führen könnten (FABIAN et al. 2007).
23
Literatur
___________________________________________________________________
2.2.3 Genomaktivierung in bovinen Embryonen
Das frühe embryonale Entwicklungsprogramm wird durch maternale Transkripte und
Proteine kontrolliert, die bereits während der Oogenese produziert und bevorratet
wurden (TELFORD et al. 1990). Erst im 8- bis 16-Zellstadium findet beim Rind die
maternal-embryonic transition (MET) statt (Abb. 5). Dieser entscheidende Prozess
gliedert sich in den Abbau maternaler Transkripte durch Degradierung und
Translation, die Erzeugung neuer, embryo-spezifischer Transkripte und den
Austausch durch embryonale Transkripte (TELFORD et al. 1990).
maternal
embryonal
Befruchtung
kleine Aktivierung
GV
MII-Eizelle
2-Zeller
Hauptaktivierung
4-Zeller
8-Zeller
16-Zeller
Blastozyste
Abbildung 5: Schematische Darstellung der maternal-embryonic transition während
der präimplantatorischen Entwicklung boviner Embryonen (mod. nach GRAF et al.
2014)
Nach heutigem Wissensstand wird die MET in eine kleine Aktivierung und eine große
oder Hauptaktivierung unterteilt (MEMILI u. FIRST 1999). Während der kleinen
Aktivierung zwischen dem 2- und 4-Zellstadium kommt es zur Expression von
Genen, die an der Transkription, der Translation und dem Transport von RNA
beteiligt sind (VIGNEAULT et al. 2009). Später zur Hauptaktivierung zwischen dem
8- und 16-Zellstadium werden Gene exprimiert, die für die Fortführung der
embryonalen Transkription und Translation, für die Protein-Ubiquitinierung, sowie für
die Einleitung epigenetischer Prozesse verantwortlich sind (GRAF et al. 2014).
24
Literatur
___________________________________________________________________
Im Stadium der Blastozyste werden Gene exprimiert, die zur Regulation der frühen
Zelldifferenzierung und des intrazellulären Transports beitragen (GRAF et al. 2014).
Diese Vorgänge erfordern eine gut koordinierte Abfolge von nukleären und
zytoplasmatischen
Prozessen,
die
gewährleisten,
dass
eine
normale
Reprogrammierung der elterlichen Genome erfolgt (LATHAM 1999). Ohne die
Aktivierung der embryonalen Transkription ist die Embryonalentwicklung gestört. So
zeigte eine Untersuchung, dass Embryonen, deren Transkription mit Hilfe von
α-Amanitin inhibiert wurde, sich nur bis zum 8-Zellstadium teilen und nicht weiter
entwickeln können, da ab diesem Entwicklungsstadium embryonale Transkripte
notwendig sind (BARNES u. FIRST 1991).
25
Literatur
___________________________________________________________________
2.3 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen
Embryonen
Die frühe embryonale Entwicklung ist abhängig von der korrekten Durchführung des
genetischen Programms. Dazu zählt sowohl die Transkription der DNA in RNA, als
auch die spätere Translation der mRNA in Proteine und die epigenetischen
Modifikationen. Ein suboptimales Umfeld des Embryos kann die Transkription der
Gene beeinflussen und damit zu einer Veränderung des Proteingehaltes führen. Ein
Unterschied zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen wurde im
Transkriptionsmuster entwicklungsrelevanter Gene bereits beobachtet (WRENZYCKI
et al. 1998).
Weiterhin konnte ein Einfluss unterschiedlicher Kultivierungsbedingungen, wie der
Zusatz von synthetischen Makromolekülen oder Serum (WRENZYCKI et al. 1999,
WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, RIZOS et al. 2003), sowie
unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen auf die Genexpression gezeigt werden
(HARVEY et al. 2004). Aus diesem Grund ist es möglich, Aussagen über die Qualität
von Embryonen zu treffen, da Unterschiede in der Expression einiger Transkripte als
Qualitätsmerkmal definiert wurden. Nachfolgend wird auf
die Transkription
ausgewählter Gene, die an der Signalübertragung von IGF1 (IGF1R, IGFBP2,
IGFBP4), am Glukosestoffwechsel (SLC2A1, SLC2A3) und am Vorgang der
Apoptose (BAX, BCL2L1) beteiligt sind, näher eingegangen.
2.3.1 Insulin-like growth factor 1 - Rezeptor während der bovinen
Embryonalentwicklung
Wie bereits unter 2.1.2 beschrieben, findet die Signalübertragung von IGF1
größtenteils durch die Bindung an den membranständigen IGF1R statt. Auf mRNAEbene konnte der IGF1R zuvor in allen präimplantatorischen Stadien der
Embryonalentwicklung in vitro und in vivo produzierter Embryonen detektiert werden
und wurde daher als Qualitätsmarker definiert (YASEEN et al. 2001). Während
26
Literatur
___________________________________________________________________
dieser frühen Entwicklungsschritte konnte beim Rind eine stadienspezifische
Expression des IGF1R beobachtet werden. Dabei zeigte sich, dass die relative
Anzahl an Transkripten zunächst vom 2- bis zum 8-Zellstadium signifikant abnimmt
und anschließend bis zum Stadium der Blastozyste wieder ansteigt (LONERGAN et
al. 2000, YASEEN et al. 2001). Diese Ergebnisse stellen einen Zusammenhang der
Genexpression mit den Vorgängen her, die zwischen dem 8- und 16-Zellstadium bei
der MET stattfinden. Aus der spezifischen Expression wird ersichtlich, dass die
Anzahl maternaler Transkripte aus der Eizelle in frühen Teilungsstadien bis zum
8-Zeller abnimmt, es dann zur Aktivierung des embryonalen Genoms kommt und
damit die Transkription wieder ansteigt (YASEEN et al. 2001). Überdies konnte ein
Unterschied der IGF1R-Expression zwischen in vivo und in vitro generierten
Embryonen nachgewiesen werden. In vivo generierte Blastozysten zeigten eine
höhere Anzahl an IGF1R-Transkripten im Gegensatz zu in vitro generierten
(BERTOLINI et al. 2002). Im Vergleich zwischen In-vitro-Embryonen zu somatischen
Kerntransfer-Embryonen konnte kein Unterschied der Expression gefunden werden
(MOORE et al. 2007, SAWAI et al. 2007).
Zusätzlich wurde entdeckt, dass die relative Anzahl an IGF1R-Transkripten in
Blastozysten aus IGF1-Kultivierung (100 ng/ml) signifikant geringer war als in denen
der Kontrollgruppe (PRELLE et al. 2001, BLOCK et al. 2008). Demnach würden
bereits im frühen Embryo die Komponenten des IGF-Systems von exogenem IGF1
gesteuert (PRELLE et al. 2001). Eine mögliche Erklärung der Herunterregulation des
Rezeptors ist, dass die embryonale Zellantwort als Reaktion auf das verfügbare IGF1
abgeschwächt wird (BLOCK et al. 2008).
2.3.2 Insulin-like growth factor – Bindungsproteine
Die Bindungsproteine des IGF-Systems regulieren, wie zuvor unter 2.1.3
beschrieben, die Aktivität von IGF1 in unterschiedlicher Art und Weise. So verlängern
sie beispielsweise die Halbwertszeit von IGF1, helfen beim Transport zu den
Wirkungsorten und stimulieren oder inhibieren Effekte von IGF1 auf zellulärer Ebene
27
Literatur
___________________________________________________________________
(JONES u. CLEMMONS 1995). Während der frühen Embryonalentwicklung des
Rindes konnten die kodierenden mRNAs der Bindungsproteine 2 und 3 in allen
Stadien bis zur Blastozyste aufgezeigt werden (WINGER et al. 1997). Exogenes
IGF1 (100 ng/ml), das der In-vitro-Kultivierung zugesetzt wurde, führte in
Rinderembryonen zu einer signifikanten Steigerung der IGFBP3-Expression (BLOCK
et al. 2008, VELAZQUEZ et al. 2011). Die embryonale Antwort wird mit einer
Reduzierung des verfügbaren IGF1 durch Steigerung der Anzahl an IGFBP3
beschrieben, was letztlich dazu führt, dass mehr IGF1 in seiner gebundenen und
damit inaktiven Form vorliegt (BLOCK et al. 2008). Darüber hinaus kommt es zu
einer 1,6-fachen Hochregulation der IGFBP2-Transkripte in Blastozysten, generiert
mit IGF1-Supplementation in vitro (PRELLE et al. 2001). Weiterhin wurde festgestellt,
dass der Zusatz des Lösungsvermittlers DMSO (Dimethylsulfoxid; 14 mM) während
der Kultivierung boviner Embryonen zu einer signifikant gesteigerten Expression des
IGFBP2 führt (STINSHOFF 2009). Allerdings ist bekannt, dass weder eine
Überschuss noch ein Mangel an IGFBP2 einen Effekt auf eine normale embryonale
Entwicklung ausüben (PRELLE et al. 2001).
2.3.3 Glukosetransporter
Die Familie der Glukosetransporter (GLUT), die heute als Solute Carrier (SLC)
bezeichnet werden, ist eine Familie natriumunabhängiger Membranproteine, die den
Transport von Glukose entlang eines Konzentrationsgradienten vermitteln. Dabei
regulieren die Transporter energieunabhängig den Austausch von Glukose zwischen
inner- und extrazellulärer Matrix (OLSON u. PESSIN 1996). Beim Rind sind
insgesamt 13 unterschiedliche Isoformen der Glukosetransporter bekannt (JOOST et
al. 2002). Die Isoformen setzen sich zusammen aus 12 Transmembrandomänen,
den intrazellulär liegenden N- und C-Terminus, einer intrazellulären Schleife und
einer
extrazellulären
Domäne
(MUECKLER
et
al.
1985).
Zwischen
den
verschiedenen Isoformen gibt es Unterschiede hinsichtlich ihrer Kinetik und ihrer
Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen auf hormoneller oder metabolischer
28
Literatur
___________________________________________________________________
Ebene (PANTALEON u. KAYE 1998). Die Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1) und
Typ 3 (SLC2A3) werden in der frühen bovinen Embryonalentwicklung in allen
Stadien exprimiert und wurden daher als Haupttransporter für Glukose im Embryo
definiert (AUGUSTIN et al. 2001). Dabei ist die Hauptaufgabe von SLC2A3 der
Transport von Glukose aus der Umgebung in den Embryo, während SLC2A1 den
Transport an lateralen Membranen des Trophoblasten vermittelt und damit für den
interzellulären Transport verantwortlich ist (AUGUSTIN et al. 2001). Vom 2-Zeller bis
zur Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der SLC2A1- und SLC2A3Transkriptmenge beobachtet werden (LEQUARRE et al. 1997). Dieser ist dadurch zu
erklären, dass der Energiebedarf des Embryos mit vermehrten Furchungsteilungen
zunimmt. Die höchsten Anstiege sind dabei mit der Aktivierung des embryonalen
Genoms zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium und der Kompaktierung des Embryos
im Stadium der Morula verbunden (LEQUARRE et al. 1997). Letzteres wurde als das
Stadium definiert, in welchem der Embryo von Pyruvat und Laktat auf Glukose als
Energiequelle wechselt (RIEGER et al. 1992). Zudem steigt der Energiebedarf des
bovinen Embryos in Form von ATP während der Blastulierung an, um damit den
erhöhten Bedarf für die höhere Proteinsynthese zu kompensieren (THOMPSON et
al. 1996).
Beim Vergleich in vivo und in vitro produzierter Embryonen des Rindes konnte ein
Unterschied in der Expression von Blastozysten an Tag sieben nachgewiesen
werden (WRENZYCKI et al. 2001, BERTOLINI et al. 2002, KNIJN et al. 2002). IVPEmbryonen weisen eine deutlich geringere Transkriptmenge im Vergleich zu In-vivoEmbryonen auf, die nach Meinung der Autoren auf eine reduzierte Viabilität der Invitro-Blastozysten hindeutet (BERTOLINI et al. 2002). Eine höhere Anzahl der
SLC2A1-mRNA konnte aber nach Anreicherung des Kultivierungsmediums mit
Serum gezeigt werden (WRENZYCKI et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001).
Ebenfalls positiv auf die Expression der Glukosetransporter wirkte sich die
Supplementation des Kultivierungsmediums mit IGF1 (100 ng/ml) aus und zeigte
eine Tendenz, sie zu steigern (VELAZQUEZ et al. 2011). Auch das Geschlecht
scheint einen Einfluss auf die Transkription von SLC2A1 auszuüben. So kam es zu
einem Anstieg des Vorkommens männlicher Embryonen, wenn Eizellen aus Follikeln
29
Literatur
___________________________________________________________________
mit einer höheren Glukosekonzentrationen (>1,1 mM) stammen (ABELE et al. 2014).
Außerdem wurde herausgefunden, dass männliche Embryonen eine deutlich höhere
SLC2A1-Transkriptmenge aufweisen als weibliche (LOPES et al. 2007). Dies ist
wahrscheinlich auf die schnellere Entwicklung männlicher Embryonen unter In-vitroBedingungen zurückzuführen (AVERY et al. 1991). Zusätzlich konnte ein Einfluss der
Sauerstoffkonzentration auf die Expression der Glukosetransporter registriert werden
(HARVEY et al. 2004). Es wurde gezeigt, dass die Menge von SLC2A1-mRNA bei
einer Kultivierung der Embryonen mit 2 % O2 signifikant geringer ist als bei einer
Kultivierung mit 20 % O2. Allerdings ist die Expression der Glukosetransporter nicht
nur abhängig von äußeren Bedingungen oder dem Geschlecht, sondern auch von
der Qualität der Embryonen. So konnte eine höhere Glukoseaufnahmerate und eine
größere SLC2A1-Transkriptmenge in Embryonen von morphologisch guter Qualität
aufgezeigt werden (RENARD et al. 1980, WRENZYCKI et al. 2001, HARVEY et al.
2004, LOPES et al. 2007).
2.3.4 Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische
Gene (BCL2-assoziiertes X Protein) der BCL2-Familie
Mitglieder der BCL2-Familie spielen eine entscheidende Rolle in der Regulierung von
Apoptose. Hierzu zählen sowohl anti-apoptotische Gene, wie z.B. das B-cell
CLL/lymphoma 2 like 1 (BCL2L1), deren Synthese das Auftreten der Apoptose
verhindert, als auch pro-apoptotische Gene, wie das BCL2-assoziierte X Protein
(BAX), deren Transkription die Apoptose in Zellen fördert.
In Eizellen und embryonalen Entwicklungsstadien konnten BAX-Transkripte bereits
nachgewiesen werden, was auf eine besondere Bedeutung der BCL2-Familie
während der bovinen Embryonalentwicklung schließen lässt (MELKA et al. 2010). Im
Vergleich zu in vivo generierten Embryonen kam es zur Detektion größerer
Transkriptmengen für BAX in In-vitro-Embryonen. Diese deuten auf ein häufigeres
Vorkommen der Apoptose in IVP-Embryonen hin (RIZOS et al. 2002). Bei der IVP
wird die Expression anti- und pro-apoptotischer Gene zusätzlich durch verschiedene
30
Literatur
___________________________________________________________________
Kultivierungsbedingungen beeinflusst (RIZOS et al. 2002, WARZYCH et al. 2007).
So kam es zu einem gesteigerten Vorkommen von BAX-Transkripten nach
Kultivierung der Embryonen in SOF-Medium im Vergleich zu solchen aus einer
Kultivierung in TCM (RIZOS et al. 2002). Bei der Untersuchung unterschiedlicher
Supplementationen (FBS, PVA oder fatty acid free BSA) während der Kultivierung
boviner Embryonen wurde jedoch kein Unterschied in der Expression von BCL2L1oder BAX-Transkripten gefunden (WARZYCH et al. 2007). Weiterhin konnte bei einer
gezielten Induktion von Apoptose mit Staurosporin keine Veränderung der BCL2L1oder BAX-Transkripte beobachtet werden (VANDAELE et al. 2008). Insgesamt kam
es zum Nachweis einer Korrelation zwischen der Qualität und der BAX-Expression,
die sich besonders im 4-Zellstadium äußerte (MELKA et al. 2010). Zu diesem
Entwicklungszeitpunkt
wurden
signifikant
höhere
BAX-Transkriptmengen
in
Embryonen mit einer schlechteren Morphologie detektiert. Des Weiteren zeigte sich,
dass die IGF1-Supplementation keinen Einfluss auf das Vorkommen des antiapoptotischen Gens BCL2L1 ausübt, aber die Expression des pro-apoptotischen
Gens BAX steigert. Dabei bewirkt IGF1 jedoch keine Veränderung des Vorkommens
von Apoptose, welches mit einer TUNEL-Analyse untersucht wurde (BLOCK et al.
2011).
31
Literatur
___________________________________________________________________
2.4 Ziele des vorliegenden Projektes
Da die Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung
des Rindes kontrovers diskutiert wird (WATSON et al. 1992, YASEEN et al. 2001),
soll die vorliegende Arbeit zur Aufklärung des Einflusses von IGF1 beitragen. Dazu
soll das Proteinexpressionsmuster und die -lokalisation des IGF1R anhand
verschiedener Methoden (Western blot, Immunfluoreszenzfärbung) in bovinen
präimplantatorischen Embryonalstadien untersucht und mit dem stadienspezifischen
mRNA-Expressionsmuster verglichen werden.
Weiterhin soll der Effekt des Zusatzes einer physiologischen (100 ng/ml) oder
supraphysiologischen
IGF1-Konzentration
(1000
ng/ml)
zum
In-vitro-
Reifungsmedium bei Ab- bzw. Anwesenheit von Apoptoseinduzierern (Actinomycin D
und Campothecin) untersucht werden. Dabei wird eine Analyse des Einflusses auf
die Gesamtzellzahl, die Lebend-Tot-Ratio und die Anzahl apoptotischer Zellen
erfolgen. Außerdem wird mittels ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay) und
IRMA (Immunoradiometrischen Assay) untersucht, inwieweit die hinzugegebene
Konzentration IGF1 während der Eizellreifung beeinflusst wird. Die Ergebnisse sollen
mit
Hilfe
von
Untersuchungen
der
mRNA-Expression
von
spezifischen
Gentranskripten des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), apoptoserelevanten
Transkripten (BAX, BCL2L1) und Transkripten des Glukosestoffwechsels (SLC2A1,
SLC2A3) verglichen werden. Damit könnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu
beitragen, ein besseres Verständnis des IGF-Systems und dessen Wirkung auf die
Eizellreifung und die frühe Embryonalentwicklung zu erhalten.
32
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3. Material und Methoden
Die verwendeten Chemikalien stammten, sofern nicht anders angegeben, von der
Firma Sigma Aldrich (Steinheim, Deutschland). Eine Zusammenfassung der
verwendeten Geräte und Medien ist im Anhang zu finden.
3.1 In-vitro-Produktion
Die In-vitro-Produktion setzt sich aus den drei aufeinanderfolgenden Schritten der Invitro-Maturation, der In-vitro-Fertilisation und der In-vitro-Kultivierung zusammen.
3.1.1 Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die Kumulus-Oozyten-Komplexe für die IVP boviner Embryonen wurden aus Ovarien
frisch geschlachteter Tiere eines nahe gelegenen Schlachthofes gewonnen. Zum
einen handelte es sich hierbei um die VION GmbH (Bad Bramstedt, Deutschland)
und zum anderen um den Fleischmarkt Olpe (Olpe, Deutschland). Bei der Auswahl
der Ovarien wurde darauf geachtet, dass die Tiere weder krank noch trächtig und die
Ovarien frei von Zysten waren. Der Transport der abgetrennten Ovarien zum Labor
erfolgte in 37°C warmer PBS Complete in einem Thermobehälter (Duwer, KGW
Isotherm, Karlsruhe) in einer Zeit von ein bis zwei Stunden. Dort wurden sie dreimal
mit je 350 ml einer auf 37°C erwärmten 0,9%igen Natrium-Chlorid-Lösung
gewaschen. Mit Hilfe der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995) konnten die
Kumulus-Oozyten-Komplexe anschließend aus den Follikeln der Ovarien isoliert
werden. Die Ovarien wurden dafür in einer Glas-Petrischale (150 mm), in der sich
100 ml 37 °C warmes PBS Complete befand, durch eine Arterienklemme am
Mesovarium fixiert und mit einem Schneideblock bestehend aus zehn dicht
nebeneinander liegenden Rasierklingen angeschnitten, um die oberflächlichen und
tiefer liegenden Follikel zu öffnen und die KOK freizusetzen. Danach wurde die
gewonnene Flüssigkeit durch ein Teesieb in ein 500 ml Becherglas überführt, um
33
Material und Methoden
___________________________________________________________________
größere
Gewebeteile
aus
der
Flüssigkeit
zu
entfernen.
Nach
einer
Sedimentationsdauer von etwa 10 Minuten (min) bei Raumtemperatur wurde der
Überstand im Becherglas mit einer Vakuumpumpe (KNF Laboport, Freiburg) bis auf
ca. 80 ml abgesaugt und der Bodensatz auf mehrere 15 ml Zentrifugenröhrchen
(Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) mit einem Volumen von 15 ml verteilt.
Nach einer erneuten Sedimentationsdauer von etwa 10 min auf einer Wärmeplatte
(minitube, Tiefenbach) bei 37°C wurde das Sediment mit einer Pasteurpipette (Carl
Roth, Karlsruhe) in eine große Petrischale (60 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster,
Österreich) überführt und mit PBS Complete aufgefüllt. Die Durchsuchung der
Petrischale erfolgte unter einem Stereomikroskop (Olympus, Hamburg), integriert in
einen beheizten Tisch. Das Heraussammeln und Überführen der gefundenen KOK in
TCM air (bei Luftsauerstoff pH-stabiles Tissue Culture Medium) erfolgte mit einer
25 µl Glaskapillare und einem Pipettierhelfer (Brand, Wertheim). Dort verblieben sie,
bis
die
Sedimente
aller
Zentrifugenröhrchen
durchsucht
wurden,
um
sie
anschließend gemäß ihrer Qualität zu selektieren (KHURANA u. NIEMANN 2000).
Durch fünf Kategorien (Tab. 3 und Abb. 7) konnten die KOK ihrer Qualität nach
eingeteilt werden, wobei für die weitere IVP nur solche verwendet wurden, die in die
Kategorien 1, 2 oder 3 einzuordnen waren.
Tabelle 3: Qualitätskategorien der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Kategorien
1. Kategorie
2. Kategorie
3. Kategorie
4. Kategorie
5. Kategorie
Beschreibung
Homogenes, dunkles Ooplasma; kompakter drei- bis vierlagiger Cumulus
oophorus (Abb. 7: A)
Homogenes, dunkles Ooplasma; mindestens eine durchgehende Schicht
an Kumuluszellen (Abb. 7: B)
Homogenes,
dunkles
oder
helles
Ooplasma
oder
abweichend
heterogenes Ooplasma; einzelne anhaftende Kumuluszellen (Abb. 7: C)
Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorien 1 bis 3; keine
anhaftenden Kumuluszellen (Abb. 7: D)
Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorien 1 bis 3; deutliche
Expandierung des Cumulus oophorus (Abb. 7: E)
34
Material und Methoden
___________________________________________________________________
B
A
C
D
E
Abbildung 7: Kumulus-Oozyten-Komplexe der Qualitätskategorie 1 (A) bis 5 (E)
3.1.2 In-vitro-Maturation
Die IVP-tauglichen KOK wurden nach der Selektion zufällig in Gruppen von 20
Oozyten zusammengeführt und dreimal in unter Siliconöl befindlichen 100 µl-Tropfen
TCM + BSA pipettiert, um Zellreste und das TCM air durch Ausverdünnung zu
entfernen. Die so gewaschenen KOK konnten nun in das Reifungsmedium überführt
werden, das aus TCM + BSA + Suigonan® bestand und ebenfalls mit Siliconöl
überschichtet war. Suigonan® ist eine kommerziell erhältliche Lösung, die sowohl
10 IE Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG), als auch 5 IE humanes
Choriongonadotropin pro ml enthält.
Für
die
Supplementationsversuche
fand
ein
ölfreies
Kultivierungssystem
Verwendung, da einige der eingesetzten Substanzen lipophile Eigenschaften
besitzen. Hierzu fanden einzelne Wells einer Mikrotiterplatte (Greiner Bio one,
Kremsmünster, Österreich) Anwendung, die mit jeweils 200 µl des Reifungsmediums
befüllt wurden. Um einer eventuellen Verdunstung des Mediums vorzubeugen,
wurden die einzelnen Wells in eine kleine Petrischale (35 mm, Greiner Bio one,
35
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Kremsmünster, Österreich), in der sich 1 bis 2 ml destilliertes Wasser befanden,
gestellt (Abb. 8).
Abbildung 8: Petrischale mit Einzelwells für die ölfreie Maturation boviner Oozyten
Bei den Supplementationsversuchen kam es zu einer zufälligen Aufteilung der KOK
in 7 verschiedene Gruppen, mit je 30 Oozyten pro Well. Eine Auflistung der
einzelnen Versuchsgruppen ist in Tabelle 4 zu finden. Kumulus-Oozyten-Komplexe,
die in Reifungsmedium ohne weitere Zusätze kultiviert wurden, dienten als
Kontrollgruppe. Supplementiert wurde sowohl eine physiologische Konzentration
(100 ng/ml), als auch eine supraphysiologische Konzentration IGF1 (1000 ng/ml;
recombinant human IGF-I, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland). Um gezielt den
Einfluss von IGF1 auf die Unterbindung von Apoptose zu untersuchen, kam es zur
Supplementation
einer
Kombination
zweier
Apoptoseinduzierer
zum
Reifungsmedium. Zum einen handelte es sich hierbei um Actinomycin D, zum
anderen um S-(+)-Camptothecin (beides von Enzo Life Sciences, Lörrach,
Deutschland), die in einer Konzentration von 0,005 µg/ml bzw. 0,01 µg/ml eingesetzt
wurden. Da diese Komponenten in dem Lösungsvermittler DMSO gelöst wurden,
erfolgte die Untersuchung einer weiteren, sogenannten Vehikel-Kontrolle, in der dem
Reifungsmedium DMSO in der gleichen Konzentration zugesetzt wurde, wie zum
Lösen der Apoptoseinduzierer. Mindestens für eine Stunde vor Verwendung fand
eine Äqulibrierung des Reifungsmediums im Kulturschrank bei 39°C und 5 % CO2
statt.
Die
Reifung
der
KOK
erfolgte
für
24
Stunden
unter
einer
feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre im CO2-Inkubator (Heracell 150i, Thermo
Fisher, Braunschweig) bei 39°C und 5 % CO2. Im Anschluss an die Maturation kam
36
Material und Methoden
___________________________________________________________________
es zur Vorbereitung der Oozyten für die Fertilisierung. Das Maturationsmedium
wurde bis zur Messung der IGF1-Konzentration bei -20°C in sterilen 1,5 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg) gelagert.
Tabelle 4: Übersicht der Versuchsgruppen und ihrer jeweiligen Mediumszusätze
während der Maturation boviner Oozyten
Versuchsgruppe
Kürzel
Zusatz
Konzentration
1 Kontrolle
K
-
-
2 DMSO
D
DMSO
12,8 mM
Actinomycin
0,005 µg/ml
S-(+)-Camptothecin
0,01 µg/ml
DMSO
12,8 mM
3 Apoptoseinduzierer
A
4 IGF1 100
I 100
IGF1
100 ng/ml
5 IGF1 1000
I 1000
IGF1
1000 ng/ml
IGF1
100 ng/ml +
Actinomycin
0,005 µg/ml
S-(+)-Camptothecin
0,01 µg/ml
DMSO
12,8 mM
IGF1
1000 ng/ml +
Actinomycin
0,005 µg/ml
S-(+)-Camptothecin
0,01 µg/ml
DMSO
12,8 mM
6
IGF1 100 +
Apoptoseinduzierer
IGF1 1000 +
7 Apoptoseinduzierer
I+A 100
I+A 1000
IGF1 = Insulin-like growth factor 1
DMSO = Dimethylsulfoxid
3.1.3 In-vitro-Fertilisation
Für die Befruchtung der gereiften Oozyten wurde tiefgefrorenes bzw. aufgetautes
Sperma eines im Vorfeld auf seine IVF-Tauglichkeit getesteten Bullen verwendet.
Das Auftauen des Tiefgefrierspermas fand in einem Wasserbad (Memmert,
Schwabach) bei 30°C für 30 Sekunden (s) statt. Nach dem Auftauen erfolgte die
Beurteilung der Qualität von etwa 5 µl des Spermas unter dem Mikroskop bei
37
Material und Methoden
___________________________________________________________________
100-facher Vergrößerung nach den Kriterien Motilität und Morphologie. Anschließend
wurden die Spermien auf einen 90-prozentigen Gradienten aus Spermfilter® und
Fert-TALP-Gebrauchslösung in ein 2 ml Eppendorfgefäß geschichtet und bei 380 g
für 16 min in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert.
Danach wurde der Überstand bis auf etwa 50 µl abgenommen und verworfen. Es
folgte ein Resuspendieren des verbliebenen Restes mit 750 µl Fert-TALPGebrauchslösung und Zentrifugation für 3 min bei 380 g. Im Anschluss wurde der
Überstand bis auf etwa 50 µl abgenommen und verworfen. Durch diese
Zentrifugation trennten sich die motilen Spermien von den toten und nicht motilen
Spermien (ECKERT u. NIEMANN 1995). Daraufhin kam es zu einer Resuspension
des Pellets mit 750 µl Fertilisationsmedium, bestehend aus Heparin, Hypotaurin und
Epinephrin (HHE), gelöst in Fert-TALP-Gebrauchslösung, um unter anderem die
Kapazitation auszulösen. Nachdem die letzte Zentrifugation für 3 min bei 380 g
beendet war, wurde der Überstand bis auf etwa 100 µl abgenommen. Es folgte die
Beurteilung der Gesamtmotilität und Kapazitation der verbliebenen Spermien bei
100-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop. Die Bestimmung der Spermiendichte
fand mit Hilfe der Auszählung einer 1:50 mit destilliertem Wasser verdünnten
Spermiensuspension in einer Thoma-Kammer (Carl Roth, Karlsruhe) statt. Dafür
wurden beide Seiten der Thoma-Kammer mit je 10 µl verdünnter Suspension befüllt
und je 5 Großquadrate des Sichtfeldes ausgezählt. Unter Berücksichtigung der
Verdünnung der Spermiensuspension und des Volumens pro ausgezähltem
Großquadrat konnte die einzusetzende Menge berechnet werden, welche dem
Fertilisationsmedium zugegeben werden musste, um eine Dichte von einer Million
Spermien pro Milliliter Medium zu erhalten [einzusetzende Menge Spermien
(µl) = (gezählte Spermien x Verdünnung) / (Anzahl Kästchen x Volumen)].
Die gereiften KOK wurden inzwischen dreimalig durch 100 µl Tropfen Fert-TALPGebrauchslösung
unter
Siliconöl
pipettiert
und
anschließend
in
100
µl
Fertilisationsmedium unter Siliconöl überführt, das zuvor mindestens eine Stunde im
CO2-Inkubator bei 39°C und 5 % CO2 äquilibrierte. Nachdem die Aufbereitung der
Spermien abgeschlossen war, wurde die berechnete Menge an Spermien zu den
KOK in die Fertilisationstropfen pipettiert. Die Kokultivierung der Spermien und KOK
38
Material und Methoden
___________________________________________________________________
erfolgte für 19 Stunden im Kulturschrank bei 39°C und 5 % CO2 unter
feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre.
3.1.4 In-vitro-Kultivierung
Im Anschluss an die Fertilisation wurden die vermeintlichen Zygoten in eine kleine
Petrischale (35 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich), die 2 ml 37°C
warmes TCM air enthielt, überführt. Es folgte die Entfernung der Kumuluszellen, die
sogenannte Denudierung unter dem Stereomikroskop (Olympus, Hamburg) durch
Verwendung einer Mikropipette mit flexibler Pipettenspitze mit einem Durchmesser
von 135 µm (Stripper®, Gynemed GmbH, Lensahn). Dieser Vorgang ist wichtig für
die nachfolgende Kultivierung der Zygoten. Da Kumuluszellen ebenfalls einen
Stoffwechsel
aufweisen,
bei
dem
Nährstoffe
verbraucht
werden
und
Stoffwechselendprodukte entstehen, würde die weitere Kultivierung mit den
Kumuluszellen zu einer Nährstoffknappheit und gleichzeitiger Anreicherung von
schädlichen Stoffwechselendprodukten im Medium führen.
Nach dem Entfernen der Kumuluszellen wurden die vermeintlichen Zygoten durch
drei Tropfen TCM air pipettiert und außerdem dreimal in 80 µl Tropfen des
Kultivierungsmediums SOFaa unter Siliconöl gewaschen. Anschließend kamen die
Embryonen in einer Gruppengröße von sechs in die vorbereiteten 30 µl-Tropfen des
Kultivierungsmediums unter Siliconöl und wurden unter feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre im CO2-Inkubator bei 39°C, 5 % O2, 5 % CO2 und 90 % N2 für bis zu
8 Tage kultiviert.
39
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.2 Beurteilung der Reifung durch Färbung mit Hoechst 33342
Die Beurteilung des Maturationserfolges fand mit Hilfe einer Hoechst 33342 Färbung, modifiziert nach RACEDO et al. (2008), statt. Dazu wurden die Oozyten
nach 22- bis 24-stündiger Reifung zunächst wie unter 3.1.4 beschrieben denudiert
und in drei Tropfen einer PVA/PBS-Lösung (0,1 % PVA in PBS) gewaschen. Die
Färbung erfolgte in 0,002 % Hoechst 33342 für drei Minuten. Nach einem erneuten
Waschschritt in PVA/PBS wurden die Eizellen auf Objektträger (Carl Roth, Karlsruhe)
verbracht und mit Vaseline als Abstandshalter mit einem Deckgläschen (Carl Roth,
Karlsruhe) versehen. Die Beurteilung der angefärbten Oozyten fand bei 20- bis
40-facher
Vergrößerung
unter
dem
Fluoreszenzmikroskop
(IX73,
Olympus,
Hamburg, Deutschland) durch Einsatz eines UV-Filters (Olympus, Hamburg) statt.
Als gereift wurden solche Oozyten klassifiziert, die sich im Metaphase-II-Stadium
befanden und eine Metaphasenplatte, sowie ein sichtbares, ausgeschleustes
Polkörperchen aufwiesen. Eizellen mit einzeln vorliegenden Chromosomen, die sich
noch in der Metaphase-I befanden, galten als unreif. Abbildung 9 zeigt eine
beispielhafte Darstellung zur Beurteilung der Maturation.
Polkörper
Metaphasenplatte
Abbildung 9: Repräsentative Darstellung einer Oozyte im Metaphase-II Stadium
angefärbt mit Hoechst 33342;
40
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium
Für die Messung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium wurden insgesamt
vier kommerziell erhältliche Kits ausgetestet, deren Antikörper alle gegen den
humanen IGF1 gerichtet waren (Tab. 5). Zum einen fand die Methode des ELISA
Anwendung, die auf dem „Sandwichprinzip“ basiert, bei der die Bindung des zu
untersuchenden Antigens an den spezifischen Antikörper mit einem zweiten
Antikörper zu einer enzymatischen Farbreaktion führt. Zum anderen wurde ein IRMA
verwendet, bei dem das zu untersuchende Antigen mit einem radioaktiv markierten
Antigen um die Bindungsstellen am Antikörper konkurriert.
Tabelle 5: Auflistung der verwendeten Testkits zum Nachweis von IGF1
Testbezeichnung Hersteller
EIA-4140
UK58011
RIA-4701
A15729
DRG
Instruments
IBL
International
DRG
Instruments
Beckman
Coulter
Testprinzip
Nachweisgrenzen
Kreuzreaktivität
(ng/ml)
ELISA
9,75 – 600,0
ELISA
3,1 – 1137,0
Keine
IRMA
23,0 – 1200,0
Keine
IGF2 1,02 %
Insulin 3,3 %
Extrem niedrig
IRMA
2,0 – 1200,0
gegen Insulin,
Proinsulin, GH, IGF2
ELISA = Enzym-linked Immunosorbent Assay
Bei allen Tests wurden die Proben des Maturationsmediums in Eppendorfgefäßen
aufgetaut, auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt und zentrifugiert. Alle
nachfolgenden Schritte fanden bei Raumtemperatur statt.
Zunächst fand die Austestung des ELISA IGF-I 600 (EIA-4140, DRG Instruments
GmbH, Marburg, Deutschland) nach Herstellerangaben im Hormonlabor der Klinik für
Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Justus-Liebig-Universität Gießen statt.
41
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Dafür wurden zu 200 µl der Proben 20 µl 1N HCl zur Probenansäuerung
hinzugegeben und für 15 min inkubiert. Anschließend kam es zum Versetzen der
Proben mit 20 µl Neutralisierungspuffer. Dieser Schritt diente der pH-Neutralisierung.
Zur Berechnung der Messergebnisse wurde eine vom Hersteller empfohlene
Standardreihe mit einem Nullwert und 6 verschiedenen Konzentrationen (5, 10, 50,
150, 300 und 600 ng/ml) angesetzt. Außerdem dienten zwei Proben des Herstellers
mit einer Konzentration von 29,5 und 320,3 ng/ml als Kontrollproben. In die
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich), die
mit einem gegen das IGF1-Protein gerichteten Antikörper beschichtet war, wurden
50 µl der zu untersuchenden Proben, sowie der Standardproben und Kontrollen
pipettiert. Dort hinzu kamen 100 µl eines Enzymkonjugats, das nach kurzem
Schütteln für 2 Stunden inkubierte. Während dieser Zeit kam es zur spezifischen
Anlagerung des IGF1 aus dem Medium an die Bindungsstellen des Antikörpers.
Anschließend erfolgte die Entfernung des gesamten Inhalts der Platte und ein
Ausspülen der Wells mit 200 µl einer Waschlösung. Zum Schluss wurde die Platte
ein letztes Mal kräftig auf Saugtüchern ausgeklopft, um die Pufferreste gründlich zu
entfernen. Mit der Hinzugabe und Inkubation 100 µl eines Enzymkomplexes für eine
Stunde kam es zur spezifischen Anlagerung eines Meerrettich-Peroxidase
gekoppelten Zweitantikörpers an das gebundene IGF1. Es folgte eine Wiederholung
des Waschschrittes. Durch die Zugabe von 200 µl des spezifischen Substrates TMB
(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin) wurde ein Farbumschlag ausgelöst, der nach einer
Inkubation von 30 min mit 100 µl einer schwefelsäurehaltigen Stopplösung
angehalten wurde. Die optische Dichte der Proben, Kontrollen und Standards konnte
sofort im Anschluss mit Hilfe eines Dynex MRXe Mikrotiterplatten-Photometers
(Magellan Biosciences, VA, USA) gemessen und mit dem Programm Magellan
Software (Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland) ausgewertet werden. Anhand der
Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve, aus
der die Konzentrationen der untersuchten Proben berechnet wurden. Der
Messbereich dieses Kits lag zwischen 1,29 und 600 ng/ml mit einem Interassaybzw. Intraassay-Koeffizienten von 7,22 bzw. 4,72 %.
42
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Ein weiterer ELISA (IGF-1 ELISA, UK58011, IBL International GmbH, Hamburg,
Deutschland) wurde im endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover unter der Leitung von Juniorprofessorin Dr.
Marion Piechotta durchgeführt. Für die Messung kam es ebenfalls zum Ansatz einer
Standardreihe mit den Konzentrationen 0, 16, 32, 107, 357 und 1137 ng/ml. Als
Kontrollproben dienten zwei Proben des Herstellers, die auf eine Konzentration von
59,2 – 81,8 ng/ml bzw. 158 – 215 ng/ml eingestellt waren. Im Gegensatz zu dem in
Gießen durchgeführten Test fand in Hannover zunächst eine Vorbehandlung der
Proben statt. Dafür wurden je 100 µl der Proben mit 100 µl Verdünnungspuffer
versetzt, 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt und für 10 min
inkubiert. Die weitere Vorgehensweise dieses ELISA ist mit dem bereits
beschriebenen identisch. Die optische Dichte der Proben, Standards und Kontrollen
wurde in Hannover mittels Spectra II (Tecan Group, Männedorf, Schweiz) bestimmt
und mit dem Programm Magellan Software ausgewertet. Eine Standardreihe konnte
erstellt und die Konzentrationen der untersuchten Proben konnten abgelesen
werden. Der Messbereich lag zwischen 10 und 450 ng/ml mit einer analytischen
Sensitivität von 0,03 ng/ml. Der Intra-Assaykoeffizient betrug 3,5 % und der InterAssaykoeffizient 8,5 %. Kreuzreaktionen zu IGF2, Insulin und Proinsulin können
aufgrund der hohen Spezifität des Antikörpers ausgeschlossen werden.
Weiterhin kam es zur Austestung eines IRMA in Gießen (IGF-I RIA, RIA-4701, DRG
Instruments GmbH, Marburg, Deutschland). Auch hier wurde für die Bestimmung der
IGF1-Konzentration zunächst eine Standardreihe angesetzt. Diese bestand aus
einem Nullwert und 5 weiteren Konzentrationen (23, 67, 168, 438 und 1200 ng/ml).
Zusätzlich kamen zwei Kontrollproben zum Einsatz, die eine Konzentration an IGF1
von 158 ± 63 ng/ml bzw. 258 ± 77 ng/ml enthielten. Für den Test wurden 50 µl der
Proben vorab mit 50 µl einer Pretreatment-Lösung vermischt und für 30 min
inkubiert. Anschließend erfolgte die Hinzugabe von 1 ml Verdünnungspuffer. Bei
diesem Kit kamen 10 ml Röhrchen zum Einsatz, die mit einem spezifischen anti-IGF1
Antikörper beschichtet waren. Dort hinein wurden sowohl 100 µl der Proben,
Kontrollen und Standards pipettiert, als auch 200 µl Tracer-Lösung, die den
125
I-markierten Anti-IGF1-Antikörper enthielt. Zwei unbeschichtete Röhrchen wurden
43
Material und Methoden
___________________________________________________________________
ebenfalls mit der Tracer-Lösung befüllt und dienten der Auswertung der Totalaktivität.
In einer zweistündigen Inkubationszeit auf einem Rüttler bei 400 rpm konnte nun das
IGF1 in der Probe mit dem radioaktiv markierten IGF1 um die Bindungsstellen des
Antikörpers konkurrieren. Anschließend wurde der Inhalt der Röhrchen dekantiert
und mit 2 ml Waschlösung ausgespült. Die Röhrchen zur Bestimmung der
Totalaktivität waren von diesem Waschschritt ausgenommen. Daraufhin konnten die
gebundenen radioaktiv-markierten IGF1 in einem Gammacounter (LB200, Berthold
Technologies, Gütersloh, Deutschland) für je 60 s gemessen werden. Anhand der
Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve, aus
der die Konzentrationen der untersuchten Proben abgelesen werden konnten.
Ein zusätzlicher immunoradiometrischer Assay (IRMA IGF-1, A15729, Beckman
Coulter, Krefeld, Deutschland) wurde in den Laboren der Klinik für Rinder getestet.
Für die Messung erfolgte ebenfalls der Ansatz einer Standardreihe mit den
Konzentrationen 0, 30, 100, 300, 600 und 1200 ng/ml. Als Kontrollprobe diente eine
Probe des Herstellers, die auf eine Konzentration von 275 bis 413 ng/ml eingestellt
war. Zunächst fand eine Vorbehandlung der Proben und Kontrollen statt. Dafür
wurden je 25 µl der Proben und Kontrollen mit 500 µl Dissoziationspuffer versetzt
und 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt. Danach kamen
nacheinander 300 µl Tracer, und 50 µl der vorbereiteten Proben, Kontrollen und
Standards im Doppelansatz in die beschichteten Röhrchen dazu. Ebenso dienten
hier zwei weitere Röhrchen dem Nachweis der Totalaktivität der Antikörper und
waren nur mit 300 µl Tracer befüllt. Es folgte eine einstündige Inkubation auf einem
Schüttler (Peqlab, Erlangen) bei 350 rpm. Der gesamte Inhalt der Röhrchen wurde
daraufhin entfernt, indem die Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe (KNF Laboport,
Freiburg) abgesaugt und verworfen wurde. Anschließend erfolgte ein Waschschritt
der Röhrchen zweimal mit 2 ml Waschlösung. Daraufhin konnte das gebundene
radioaktiv-markierte IGF1 in einem Gammacounter (Perkin Elmer, MA, USA) für je
60 s gemessen werden. Die Menge des gemessenen markierten IGF1 war dabei
umgekehrt proportional zur Konzentration des IGF1 im Maturationsmedium. Anhand
der Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve,
aus der die Konzentrationen der untersuchten Proben abgelesen werden konnten.
44
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Der verwendete Antikörper ist höchst spezifisch für IGF1 und zeigt keine
Kreuzreaktionen gegen verwandte Moleküle (Insulin, Proinsulin, IGF2 und GH). Die
analytische
Sensitivität,
definiert
als
Mittelwert
minus
der
zweifachen
Standardabweichung des Standards 0, betrug 2 ng/ml. Der Intra-Assaykoeffizient
betrug 5,1 % und der Inter-Assaykoeffizient 9,3 %.
3.4 Teilungs- und Entwicklungsraten
Die Beurteilung der Entwicklung der Embryonen erfolgte sowohl am 7. Tag als auch
am 8. Tag der Kultivierung. An Tag 7 wurde zunächst die Teilungsrate der
Embryonen ermittelt, wofür sie aus dem Kulturschrank genommen und unter einem
Stereomikroskop auf einer 37°C vorgewärmten Heizplatte beobachtet wurden. Die
Anzahl der geteilten Embryonen wurde vermerkt, sodass die Teilungsrate bezogen
auf die Anzahl der eingesetzten vermeintlichen Zygoten in Prozent berechnet werden
konnte. Außerdem wurde die Anzahl an Embryonen notiert, die sich bereits im
Stadium der Morula oder Blastozyste befanden, um die Entwicklungsrate in Prozent
zu berechnen.
Befanden sich am 7. Tag der Kultivierung bereits Embryonen im Stadium der
expandierten Blastozyste, so wurden sie direkt gefärbt oder dreimalig durch
0,1 % PVA/PBS pipettiert und in einem möglichst geringen Volumen in sterilen 0,5 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäßen bei -80 °C bis zur Analyse in der RT-qPCR
eingefroren. An Tag 8 erfolgte eine erneute Begutachtung der Entwicklungsstadien
für die Berechnung der Entwicklungsrate von Tag 7 und Tag 8. Waren zu diesem
Zeitpunkt geschlüpfte Blastozysten zu sehen, wurden diese in Gruppen von bis zu 10
dreimal in PVA/PBS gewaschen und in sterilen Reaktionsgefäßen bei -80°C für die
Western blot – Versuche eingefroren.
45
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.5 Lebend-Tot-Färbung mit Hoechst und Ethidium homodimer
Embryonen im Stadium der expandierten Blastozyste wurden in einer Lebend-TotFärbung durch die Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33342 und Ethidium homodimer
gefärbt (STINSHOFF et al. 2011). Hoechst ist in der Lage intakte Zellmembranen zu
überwinden und sich an die DNA anzulagern. Ethidium homodimer kann dagegen
nur Membranen passieren, die aufgrund von Zelltod bereits permeabel sind und
bindet ebenfalls an die DNA. Für die Färbung wurden die Embryonen zunächst
dreimal in 0,1 % PVA/PBS gewaschen und dann für 15 min in 0,01 % Ethidium
homodimer in PVA/PBS bei RT unter Lichtausschluss gefärbt. Darauf folgte ein
dreimaliges Waschen der Embryonen in PVA/PBS und die Inkubation für 3 min in
einer Hoechst 33342 - Lösung mit einer Konzentration von 0,002 % in PVA/PBS.
Nach erneutem Waschen in PVA/PBS wurden die Embryonen auf einen Objektträger
(Carl Roth, Karlsruhe) übertragen und unter Verwendung von Vaseline als
Abstandshalter mit einem Deckgläschen (Carl Roth, Karlsruhe) versehen. Mit Hilfe
zweier Kanülen (20 Gauge, B. Braun, Melsungen) wurden die Embryonen unter dem
Deckgläschen zerdrückt, sodass alle Zellen in einer Ebene lagen und dadurch
besser gezählt werden konnten. Unter dem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus,
Hamburg, Deutschland) bei einer 20- bis 40-fachen Vergrößerung mit Hilfe eines
Grün-
bzw.
UV-Filters
(Olympus,
Hamburg)
erfolgte
die
Beurteilung
und
Dokumentation der Embryonen mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens
Dimension (Olympus, Hamburg) durch Einsatz einer monochromen CCD (chargecoupled device)-Kamera (Olympus, Hamburg). Durch die verschiedenen Farbstoffe
konnte zwischen lebenden und toten Zellen unterschieden werden, wobei sich die
lebenden Zellen durch Hoechst 33342 blau fluoreszierend darstellten und die toten
Zellen durch die Anlagerung von Hoechst und Ethidium homodimer rot. Die
Gesamtzellzahl ergab sich aus der Summe beider Auszählungen. Beispielhaft für
eine Aufnahme ist in Abbildung 10 ein Embryo dargestellt.
46
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Abbildung 10: Repräsentative Darstellung der Lebend-Tot-Färbung einer expandierten
Blastozyste; Blau: Lebende Zellen (Hoechst 33342); Rot: Tote Zellen (Ethidium
homodimer und Hoechst 33342)
47
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.6 Nachweis apoptotischer Zellen durch TUNEL-Färbung
Die Darstellung apoptotischer Zellen erfolgte mit einer TUNEL-Analyse, durchgeführt
mit dem in situ cell death detection kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach BYRNE
et al. (1999). Dafür wurden die Embryonen am 7. Tag aus dem Kultivierungsmedium
entnommen und dreimalig in 100 µl Tropfen 0,1 % PVA/PBS in einer kleinen
Petrischale (35 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) gewaschen.
Anschließend fand eine Fixierung der Embryonen in 500 µl 4 % Paraformaldehyd für
eine Stunde statt, woraufhin sie in PVA/PBS erneut gewaschen wurden. Zur
Permeabilisierung der Blastomeren folgte eine Inkubation der Embryonen in 100 µl
0,1 % Triton X-100 in PBS für 30 min. Nach einem Waschen in PVA/PBS konnten
die Embryonen in 500 µl der TUNEL-Reaktionslösung überführt und für eine Stunde
bei 37°C im Dunkeln gefärbt werden. Bei dieser Inkubation kommt es mit Hilfe eines
Substrates zur Anlagerung des TUNEL-Farbstoffes an die DNA, die aufgrund von
Apoptose fragmentiert vorliegt. Während für die Positivkontrolle einige Embryonen
zunächst in50 µl DNase I (50 U/ml) inkubiert und anschließend in die TUNELReaktionslösung pipettiert wurden, um eine DNA-Fragmentierung auszulösen, fand
für die Negativkontrolle eine Inkubation der Embryonen in Abwesenheit von TdT
statt, ohne das es nicht zur Anlagerung des Farbstoffes kommen konnte. Im
Anschluss wurde die Färbelösung mit PVA/PBS herausgewaschen und alle Zellen
der Embryonen mit 100 µl Hoechst 33342 (0,002 % in PVA/PBS) für 3 min bei 37°C
gegengefärbt.
Nach
Entfernen
des
Hoechst-Farbstoffes
durch
mehrmaliges
Pipettieren in PVA/PBS konnten die Embryonen auf einen Objektträger transferiert
und mit 4-5 µl Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, USA) überschichtet
werden. Nun wurden sie mit einem Deckgläschen (Carl Roth, Karlsruhe) versehen
und dieses durch zwei Kanülen (20 Gauge) angedrückt, sodass sich die Zellen in
einer Ebene darstellten und auszählen ließen. Mit Hilfe eines UV-Filters unter dem
Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland) bei einer 20- bis
40-fachen Vergrößerung wurden die Embryonen angeschaut und durch eine
integrierte Kamera (Olympus, Hamburg) fotografiert. Durch Hoechst waren alle
Zellen durch eine blaue Fluoreszenz deutlich zu erkennen, während apoptotische
48
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Zellen grün fluoreszierten. Bei Anregung beider Fluoreszenzen erfolgte eine gelbe
Darstellung der Zellkerne. Mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens
Dimension (Olympus, Hamburg, Deutschland) wurde die Gesamtzellzahl und die
Anzahl apoptotischer Zellen ausgezählt.
In Abbildung 11 ist beispielhaft eine expandierte Blastozyste zu sehen, die mit Hilfe
des TUNEL-Assays spezifisch angefärbt wurde.
Abbildung 11: Repräsentative Darstellung der TUNEL-Färbung einer expandierten
Blastozyste; Blau: TUNEL-negative Zellen (Hoechst 33342); Grün: TUNEL-positive
Zellen (TUNEL-Reaktionslösung)
49
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.7 MessengerRNA - Analyse mittels RT-qPCR
Zur vergleichenden Untersuchung des mRNA-Expressionsmusters von generierten
Embryonen, aus Oozyten, die unter unterschiedlichen Maturationsbedingungen
kultiviert wurden und von Embryonen für die Analyse der stadienspezifischen
Expression des IGF1R erfolgte eine Reverse Transkription mit anschließender
quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) nach STINSHOFF et al. (2011).
Dafür wurden Tag 7-Embryonen dreimal in 0,1 % PVA in PBS gewaschen und
einzeln in silikonisierten 0,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen bei -80°C eingefroren.
3.7.1 Isolierung der mRNA
Die Isolierung der mRNA aus Embryonen erfolgte mit dem Dynabeads® mRNA
DIRECT™ Micro Purification Kit (Life technologies, Thermo Fisher Scientific,
Darmstadt). Zunächst wurde die Dynabeads-Suspension auf einem Vortexer
(Peqlab, Erlangen) homogenisiert und je 10 µl pro zu untersuchende Probe in ein
Reaktionsgefäß überführt. Es folgte ein Waschen der Suspension mit Hilfe eines
Magnetic Particle Concentrators (MPC, Life Technologies, Darmstadt). Dafür wurde
das Reaktionsgefäß in den MPC gestellt und 10 s gewartet, bis sich die Dynabeads
durch die magnetische Wirkung deutlich sichtbar an einer Seite konzentrierten
(Abb. 12). Nun konnte der Überstand abgenommen und durch die gleiche Menge
Lysis/Binding-Puffer ersetzt werden. Nach einem erneuten Waschschritt war die
Vorbereitung der Dynabeads abgeschlossen und es wurde mit der Isolierung der
mRNA aus den Proben begonnen.
50
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Abbildung 12: Darstellung des Magnetic Particel Concentrators mit Dynabead-Lösung
(Pfeil)
Zu Beginn wurden zu jeder zu untersuchenden Probe 150 µl Lysis/Binding-Puffer
und als interner Standard 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/µl) hinzugegeben,
5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt, zentrifugiert und für 10 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Es folgte die Zugabe von je 10 µl der zuvor präparierten
Dynabeads zu jeder Probe und Inkubation für 5 min auf einem Thermoschüttler
(Peqlab, Erlangen) bei Raumtemperatur, bei der es zu einer Bindung der Dynabeads
an
den
PolyA-Schwanz
der
embryonalen
mRNA
kam.
Nach
diesem
Inkubationsschritt wurden die Reaktionsgefäße in den MPC gestellt, der Überstand
abgenommen und die Proben mehrmals gewaschen. Dafür wurden die Proben
einmal mit 100 µl des Waschpuffers A versetzt und in den MPC gestellt, um den
Überstand abzupipettieren. Anschließend folgte eine dreimalige Resuspension der
Proben mit 100 µl des Waschpuffers B mit Verwerfung des Überstandes. Nach dem
letzten Waschschritt erfolgte die Trennung der mRNA von den Dynabeads mit 11 µl
RNase-freiem Wasser (Ampuwa, Fresenius, Deutschland) für 3 min bei 65°C. Im
Anschluss an die Eluierung der mRNA wurden die Reaktionsgefäße in den MPC auf
Eis gestellt und der Überstand, der nun die isolierte mRNA enthielt, direkt für die
Reverse Transkription verwendet.
51
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.7.2 Reverse Transkription
Für die RT-Reaktion wurden zunächst zwei Mastermixe für fünf unterschiedliche
Ansätze mit Hilfe des GeneAmp® RNA PCR Core Kits (Life technologies, Thermo
Fisher Scientific, MA, USA) pipettiert. Die fünf Ansätze setzten sich zusammen aus
dem des Globin-Standards, der Proben und der Negativkontrolle der Reagenzien, bei
der Wasser statt RNA eingesetzt wurde (Mastermix I), sowie der Negativkontrolle für
Globin und der Negativkontrolle der Proben, bei denen keine RNAse-Inhibitoren und
keine Reverse Transkriptase hinzugegeben wurden (Mastermix II) und demnach
keine Umwandlung der mRNA in cDNA erfolgte. Nachfolgend dargestellt sind die
Mastermixe für eine Platte mit vier Embryonen (Tab. 6). Das Pipettieren der
Reagenzien fand stets auf Eis statt.
Tabelle 6: Mastermixe für die Reverse Transkription
Mastermix I
Konzentration Endkonzentration in µl
(7fach-Ansatz)
Mastermix II
in µl
MgCl2
50 mM
5 mM
14
12
PCR-Puffer
10 x
1x
14
12
dNTPs
10 mM
1 mM
14
12
Random
Hexamers
50 mM
2,5 µM
7
6
RNAse
Inhibitoren
20 U/µl
20 U
7
-
MuLV-RT
50 U/µl
50 U
7
-
Zusatz
(6fach-Ansatz)
Im Anschluss an das Pipettieren der Mastermixe erfolgte die Vorbereitung der fünf
unterschiedlichen Ansätze zusammen mit der präparierten mRNA. Die Ansätze
wurden mit Ampuwa auf ein Endvolumen von 20 µl gebracht (Tab. 7).
52
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Tabelle 7: Pipettierschema der Reversen Transkription mit einem Volumen von 20 µl
Zusatz
Globin
Standard
Embryo
Neg.
Reagenzien
Neg. RI/RT
Embryo
Neg. RI/RT
Mastermix I (µl)
9
9
9
-
-
Mastermix II (µl)
-
-
-
7
7
RNA (µl)
1
10,7
-
0,3
1
Add 20 µl H2O
10
0,3
11
12,7
12
Globin
Die Reverse Transkription fand in einem Thermocycler (T1, Biometra, Göttingen,
Deutschland) statt und gliederte sich in folgende Schritte:
• 10 min bei 25°C
• 60 min bei 42°C
• 5 min bei 99°C
Anschließend wurden die Proben direkt auf Eis gestellt und für die qPCR verwendet.
3.7.3 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion
Die gewonnene cDNA wurde zur Quantifizierung der Expressionsintensitäten
unterschiedlicher Gene in einer qPCR eingesetzt. Untersucht wurden sowohl
Gentranskripte des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3), als auch apoptose(BAX, BCL2) und entwicklungsrelevante (SLC2A1, SLC2A3). Die Primersequenzen
der untersuchten Gene sind in Tabelle 8 dargestellt.
53
Tabelle 8: Übersicht der verwendeten Primer für die RT-qPCR von Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen
Position des Amplifikatgröße Datenbanknummer
(bp)
(NCBI)
Primers
IGF1R
forward
CCA AAA CCG AAG CTG AGA AG
1619
reverse
TCC GGG TCT GTG ATG TTG TA
1817
IGFBP2
forward
GAC GGG AAC GTG AAC TTG AT
466
reverse
ACC TGG TCC AAT TCC TGC T
677
IGFBP3
forward
AAC TTC TCC TCT GAG TCC AAG C
714
reverse
CGT ACT TAT CCA CAC ACC AGC
904
BAX
forward
TCT GAC GGC AAC TTC AAC TG
301
reverse
TGG GTG TCC CAA AGT AGG AG
505
54
BCL2
forward
ATG GAG CCA CTG GCC ACA GCA GAA G
514
reverse
GTT GCG ATC CGA CTC ACC AAT ACC
820
SLC2A1
forward
CAG GAG ATG AAG GAG GAG AGC
894
reverse
CAC AAA TAG CGA CAC GAC AGT
1151
SLC2A3
forward
ATC CCT GTG GTC CTT GTC TG
295
reverse
GAT AAT CAG TCG GCC CAA GA
496
Globin
forward
GCA GCC ACG GTG GCG AGT AT
241
reverse
GTG GGA CAG GAG CTT GAA AT
555
199
NM_001244612
212
NM_174555.1
210
NM_174556.1
205
NM_173894
307
NM_001077486
256
M60448
202
NM_174603
257
X04751
Material und Methoden
Primersequenz (5‘-3‘)
Gen
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Die qPCR wurde mit dem kommerziell erhältlichen Kit iQ™ SYBR® Green Supermix
(Bio-Rad Laboratories, CA, USA) durchgeführt, dessen Mastermix sich aus
Reaktionspuffer, dNTPs, iTaq DNA Polymerase, MgCl2, SYBR Green I und
Fluoreszein zusammensetzt. Pro eingesetztem Primerpaar wurde ein Ansatz auf Eis
pipettiert, der aus dem Mastermix und dem jeweiligen Primerpaar bestand (Tab. 9).
Tabelle 9: Ansätze für die qPCR
Zusatz
Endkonzentration
Mastermix in µl
Mastermix
1x
10
Primer forward
0,2 µM
0,4
Primer reverse
0,2 µM
0,4
Nachdem der Mastermix auf die einzelnen Wells von sogenannten Einzelstreifen
(single stripes, Biozym, Hessisch Oldendorf) verteilt wurde, konnte die cDNA
hinzugefügt und auf ein Endvolumen von 20 µl mit Ampuwa aufgefüllt werden.
Abhängig von der Expressionsintensität des jeweiligen Gens wurde die eingesetzte
Menge an cDNA, als sogenanntes Embryonenäquivalent (EA), angepasst. Die
einzelnen Äquivalente sind in Tabelle 10 aufgelistet.
Tabelle 10: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden Gentranskripte
Embryonenäquivalent
Embryonenäquivalent
(einfacher Ansatz)
(doppelter Ansatz)
IGF1R
0,1
0,2
IGFBP2
0,05
0,1
IGFBP3
0,1
0,2
BAX
0,025
0,05
BCL2
0,025
0,05
SLC2A1
0,1
0,2
SLC2A3
0,025
0,05
Globin
0,05
0,1
Gen
55
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Nachdem alles in die Wells pipettiert worden war, konnten diese mit Deckeln
versehen und direkt in einen Thermocycler mit integrierter Real-time Einheit (Bio-Rad
C1000 mit CFX96, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) verbracht werden. Das
qPCR-Programm startete zunächst mit einem 10minütigen Denaturierungsschritt bei
95°C bevor sich 43 Zyklen anschlossen, die sich wie folgt zusammensetzen:
• 15 s bei 95°C
• 30 s bei 60°C
• 30 s bei 72°C
Während dieser Zyklen kam es zu einer Anlagerung sequenzspezifischer Primer an
die cDNA und einer Interkalation des SYBR Green Farbstoffes an die resultierende
doppelsträngige DNA. Durch die kontinuierliche Messung der Fluoreszenz nach
jedem Zyklus konnte die DNA quantifiziert werden. Die Verifizierung der PCRProdukte erfolgte mit Hilfe einer Schmelzkurve, die der Cycler durch schrittweise
Erhöhung der Temperatur um 0,5°C von 55°C auf 95°C erstellte.
Für die Quantifizierung der spezifischen mRNA-Expression wurden zunächst die
Schwellenwerte (Threshold Cycle, ct) der einzelnen Embryonen mit den ct des
internen Standards Globin zu einem Δct verrechnet [∆ct (Globin) = ct (Globin)
Standard (50 fg) - ct (Globin) Embryo]. Des Weiteren erfolgte die Berechnung des
∆ct der einzelnen Gentranskripte (Gene of interest, GOI) zu einem ∆ct [∆ct (GOI) = ct
(GOI) – ct (Globin) Embryo]. Zum Schluss wurde die Tageseffizienz (E) des
Standards und des GOI mit den ∆cts verrechnet, um eine relative Häufigkeit (fold
difference, FD) zu erhalten [FD = E(GOI)^-Δct
(GOI)
/ E(Globin)^-Δct
(Globin)
] (PFAFFL
2001).
Die Untersuchung jedes Gentranskriptes erfolgte mit mindestens 5 Wiederholungen.
56
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.8 Darstellung des IGF1R-Proteins
Für den semi-quantitativen Nachweis des IGF1R-Proteins in Embryonen fand die
Methode des Western blots Anwendung. Bei einem Western blot werden die Proben
mit einer Gelelektrophorese aufgetrennt und danach auf eine Membran übertragen.
Schließlich erfolgt die Detektion des zu untersuchenden Proteins durch spezifische
Antikörper.
3.8.1 Gelelektrophorese
Zunächst erfolgte eine elektrophoretische Auftrennung der Proben mit einer SDSPAGE (sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamidgelelektrophorese) nach LAEMMLI
(1970) unter denaturierenden Bedingungen. Hierzu wurden Polyacryamidgele in
einer Mini-Protean Tetra Cell Apparatur (Bio-Rad Laboratories GmbH, München)
erstellt. Erst kam es zur Produktion eines 8%igen Trenngels mit einer Geldicke von
1 mm, das mit Isopropanol überschichtet wurde, um ein Zurückbleiben von
Luftbläschen an der Oberfläche des Gels zu verhindern. Nach der Polymerisation
des Gels folgte die Entfernung des Isopropanols und Trocknung der Kammer mit
Whatmanpapier (Sigma Aldrich, Steinheim). Das Sammelgel wurde auf das Trenngel
gefüllt und ein Teflonkamm zur Formung der Ladungstaschen eingesetzt. Nach dem
Auspolymerisieren des Sammelgels kam es zur Positionierung des Gels in der
Gelelektrophoresekammer und Befüllung mit SDS-Laufpuffer. Jetzt konnte der
Kamm entfernt und das Gel mit den Proben und einem entsprechenden
Größenstandard (Marker) beladen werden.
Zum Austesten der unterschiedlichen Antikörper wurden gefrorene Gewebebiopsien
boviner Leber, Kotyledone, Karunkel und humaner Plazenta als Kontrollen verwendet
und Gruppen von jeweils 10 eingefrorenen Embryonen genutzt. Das Gewebe wurde
zum einen am Schlachthof gewonnen und wurde zum anderen von der Frauenklinik
Hannover zur Verfügung gestellt.
Um einen Aufschluss der Zellen zu erreichen, wurde eine Lyse durchgeführt. Der
dafür angefertigte Puffer bestand aus Boehringer Lysepuffer und den Inhibitoren
57
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Leupeptin,
AEBSF
(4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid),
Pepstatin
und
Phosphatase-Inhibitoren (Phosphatase Inhibitor Cocktail 2). Anschließend konnten
die Proben mit 4x SDS-Probenpuffer verdünnt und für 5 min auf 95°C erhitzt werden,
um eine vollständige Denaturierung der Proteine zu erreichen. Nach einer
10 sekündigen Zentrifugation bei 400 g wurden die Proben auf das Gel aufgetragen.
Die Elektrophorese im SDS-Laufpuffer erfolgte bis zum Einlaufen der Proben in das
Trenngel bei 100 V. Danach wurde die Spannung auf 150 V erhöht und bei Erreichen
des Gelendes nach etwa einer Stunde gestoppt.
3.8.2 Western blot
Nach der Gelelektrophorese erfolgte die Übertragung der Proteine auf eine
Nitrocellulosemembran (Sigma-Aldrich, Steinheim) mit einer Porengröße von
0,45 µm durch einen Western blot. Hierzu fand anfangs eine 10 minütige
Äquilibrierung des Gels und der Membran in Blotpuffer statt. Anschließend folgte der
Aufbau des Blots. Es wurden zwei Whatmanpapiere luftblasenfrei auf die Kathode
aufgebracht, gefolgt von dem Gel, der Nitrocellulosemembran und zwei weiteren
Whatmanpapieren. Als zusätzliche Schicht auf jeder Seite kam ein Fiberpad zum
Einsatz. Unter Berücksichtigung der Polung wurde der Aufbau fest in die MiniTransblot-Zelle eingesetzt und die Kühlung auf Raumtempertur durch ein
Kühlaggregat im Behälter gewährleistet. Die Blotdauer betrug eine Stunde bei 100 V.
Auf den Blot folgte das Blockieren der Membran in 5 % Magermilch, gelöst in TBS-T
(Tris-buffered Saline-Tween) für 45 min bei Raumtemperatur. Zur Immundetektion
wurde nun der primäre Antikörper hinzugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen für jeweils 10 min mit TBS-T erfolgte eine einstündige
Inkubation
mit
dem
Sekundärantikörper
bei
Raumtemperatur.
Als
Sekundärantikörper fand ein Meerretichperoxidase (HRP) gekoppelter Antikörper
Anwendung. Nach dreimaligem Waschen für jeweils 10 min mit TBS-T und
einmaligem Waschen für 10 min mit TBS wurde das Zweikomponentensubstrat
(Thermo Fisher Scientific) für 3 min über die Membran gegeben. Die an den
58
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Zweitantikörper gekoppelte HRP katalysierte die Umsetzung von Luminol im Substrat
in seine oxidierte Form, bei der eine Chemilumineszenz sichtbar wird, die detektiert
werden kann.
Die Detektion erfolgte mittels eines Chemilumineszenz-Imagingsystem (Vilber
Lourmat, Eberhardzell, Deutschland).
3.8.3 Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge
Für die Kontrolle des korrekten Ablaufs und zur semi-quantitativen Auswertung des
Western blots erfolgte eine Redetektion der Nitrocellulosemembran mit einem
Antikörper, der sich gegen β-Aktin richtet. Als Bestandteil des Zytoskeletts gehört
β-Aktin zu den sogenannten Housekeeping-Proteinen und kommt in allen Zellen vor
(MASSICOTTE et al. 2006).
Die Nitrocellulosemembran wurde zunächst nach der Detektion des IGF1RAntikörpers in TBS-T gewaschen. Für die Entfernung der gebundenen Antikörper,
fand eine Inkubation der Membran in Strippingpuffer mit einem pH von 2,2 für 30 min
statt. Nach erneutem Waschen in TBS wurden die freien Bindungsstellen für eine
Stunde mit 5%iger Magermilchlösung blockiert, bevor es zur Inkubation des β-AktinAntikörpers (sc47778, mouse anti- β-actin, Santa cruz biotechnology, CA, USA) für
eine Stunde bei Raumtemperatur kam. Die Behandlung mit dem Sekundärantikörper
fand wie zuvor für eine Stunde bei Raumtemperatur statt. Nach drei Waschschritten
in TBS-T wurde das Chemilumineszenzsubstrat aufgetragen und die Membran mit
Hilfe des Imagingsystems untersucht.
59
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.8.4 Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Rind
Im Zuge einer Masterthese (POPPICHT 2010) wurde der Nachweis des IGF1R via
Western blot mittels unterschiedlicher kommerziell erhältlicher Antikörper getestet.
Es konnte festgestellt werden, dass der Anti-IGF1-Rezeptor-Antikörper (Fa. Thermo
Fisher Scientific, MA, USA) zur Detektion eines schwachen Signals in einem Pool
von 100 Embryonen führte, das allerdings nicht zu einer quantitativen Auswertung
geeignet war (Abb. 13, orange Markierung). Aus diesem Grund wurde für die
vorliegende Arbeit ein Peptidantikörper von der Firma Seqlab (Göttingen, Germany)
im Kaninchen produziert, der speziell auf die Peptidsequenz der α-Untereinheit des
bovinen IGF1R abgestimmt ist (anti-popp IGF1R). Der Peptidantikörper setzte sich
aus zwei Peptidsequenzen zusammen, die eine Länge von 16 bzw. 19 Aminosäuren
vorweisen und keine Kreuzreaktionen zu anderen Sequenzen zeigen (Abb. 13, rote
Markierungen).
Zusätzlich zu diesem Antikörper erfolgte die Austestung von drei weiteren
kommerziell erhältlichen Antikörpern beim Rind. Der erste Antikörper richtet sich
gegen die α-Untereinheit des IGF1R (IGF1Rα, Abb. 13 grüne Markierung), während
der zweite (IGF1Rβ, schwarze Markierung) und dritte Antikörper (Anti-IGF1R
antibody, blaue Markierung) spezifisch für die β-Untereinheit sind. Die Antikörper
wurden zunächst in bovinem Gewebe (Leber und Plazenta) getestet, bevor sie zum
Einsatz mit bovinen Embryonen kamen.
60
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Abbildung 13: Peptidsequenz des IGF1R mit gekennzeichneten Positionen der
getesteten
Antikörper;
hellgrau:
α-Untereinheit
(Aminosäure 1-710), weiß:
β-
Untereinheit (Aminosäure 711-1367), dunkelgrau: Transmembrandomäne (Aminosäure
906-929)
Getestete Antikörper aus der Masterarbeit (POPPICHT 2010)
Anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen, Germany)
IGF1Rα (Santa cruz biotechnology, CA, USA)
IGF1Rβ (Santa cruz biotechnology, CA, USA)
Anti-IGF1R antibody (AVIVA systems biology, CA, USA)
61
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.9 Immunfluoreszenzfärbung des IGF1R
Für die Darstellung des IGF1R-Proteins in Embryonen wurde eine indirekte
Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Dafür kam als primärer Antikörper der
spezifisch produzierte Kaninchen-Antikörper der Firma Seqlab zum Einsatz (s. 3.8.4).
Der eingesetzte Zweitantikörper war an das Fluorochrom Alexa Fluor 488 gekoppelt
und richtete sich spezifisch gegen Kaninchen-Antikörper (goat anti-rabbit IgG-CFL
488, sc-362262, Santa cruz biotechnology, CA, USA).
Die Immunfluoreszenzfärbung setzte sich aus vier Schritten zusammen:
1. Vorbehandlung der Embryonen
2. Inkubation des 1. Antikörpers
3. Inkubation des 2. Antikörpers
4. Darstellung und Auswertung der Färbung
Mit Ausnahme der Blockierung und Inkubation des Erstantikörpers (4°C) und dem
RNase-Verdau (37°C) fanden alle Schritte bei Raumtemperatur statt. Für die
unterschiedlichen Inkubations- und Waschschritte fanden Petrischalen (60 mm,
Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) Verwendung. Das Umsetzen der
Embryonen fand mit Hilfe eines Strippers® (Gynemed GmbH, Lensahn) mit flexibler
Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 200 µm statt. Eine Negativkontrolle
wurde bei jedem Färbedurchgang mitgeführt, die weder im Erst-, noch im
Zweitantikörper
inkubierte,
um
eine
Eigenfluoreszenz
oder
unspezifische
Fluoreszenz der Embryonen auszuschließen. Außerdem wurde eine zweite Kontrolle
eingesetzt, bei der es nur zur Inkubation mit dem sekundären Antikörper kam, um
unspezifische Bindungen nachzuweisen.
62
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.9.1 Vorbehandlung der Embryonen und Inkubation mit dem 1. Antikörper
Die Embryonen wurden je nach zu untersuchendem Stadium am 2. bis 8. Tagen der
Kultivierung entnommen und dreimal in 100 µl PVP (Polyvinylpyrrolidon) in PBS
(1 mg/ml) in einer Petrischale gewaschen. Die Untersuchung von 2-Zellern erfolgte
an Tag 2, 4-Zeller an Tag 3 und 8-Zeller an Tag 4 der Kultivierung. Embryonen im
16-Zellstadium wurden an Tag fünf und Morulae an Tag sechs analysiert. An Tag
sieben und acht kam es zur Entnahme von Blastozysten und expandierten
Blastozysten.
Die Färbung begann mit einem Fixierungsschritt der Embryonen in 500 µl
4 % Paraformaldehyd in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Es folgte ein
erneutes dreimaliges Waschen in PVP/PBS. Zur Permeabilisierung kam es zur
Inkubation der Embryonen für eine Stunde in 500 µl 0,1 % Triton-X 100 in PBS.
Nachdem sie erneut dreimal in PVP/PBS gewaschen wurden, folgte ein
Blockierungsschritt, in dem unspezifische Bindungsstellen mit 500 µl 3 % BSA in
PBS für eine Stunde blockiert wurden. Jetzt konnte mit dem 1. Antikörper inkubiert
werden. Dafür kamen 500 µl des spezifisch produzierten anti-popp IGF1R in einer
Verdünnung von 1:100 in 3 % BSA/PBS über Nacht bei 4°C in einer Feuchtekammer
zum Einsatz, um eine mögliche Verdunstung zu verhindern.
3.9.2 Inkubation mit dem 2. Antikörper, Zellkernfärbung und Darstellung der
Färbung
Nach Ende der Inkubation mit dem 1. Antikörper wurden die Embryonen dreimal in
3 % BSA/PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Im
Anschluss erfolgte die Verdünnung des sekundären Antikörpers 1:200 in 3 % BSA
und Inkubation in 500 µl für 2 Stunden im Dunkeln. Nach dem Waschen in BSA/PBS
kam es zum RNase-Verdau für eine Stunde im Dunkeln bei 37°C in 50 µl einer
50 µg/ml RNase A-Lösung. Die Zellkernfärbung fand mittels 100 µl Propidiumiodid in
einer Konzentration von 25 µg/ml für 5 min im Dunkeln statt. Nach Entfernen des PI
63
Material und Methoden
___________________________________________________________________
durch dreimaliges Waschen in PVP/PBS wurden die Embryonen auf einen
Objektträger gebracht und mit 4-5 µl Vectashield überschichtet. Die Darstellung der
Immunfluoreszenzfärbung erfolgte direkt im Anschluss an die Färbung bei 10-facher
Vergrößerung mit einem Blau-Filter bzw. Grün-Filter (Olympus, Hamburg) an einem
Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland). Die Auswertung
fand mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens Dimension (Olympus,
Hamburg, Deutschland) statt. Zunächst wurde für jeden Embryo ein Bild zur
Darstellung der Zellkerne und ein Bild zur Darstellung der Immunfluoreszenz mit Hilfe
einer am Mikroskop integrierten Kamera aufgenommen. Zusätzlich konnte für jeden
Embryo eine Aufnahme der Immunfluoreszenz in Graustufen erstellt werden, um an
dieser die Verteilung der Graustufenintensitäten zu messen (TOLIVIA et al. 2006).
Dazu wurde die Fläche umfahren, die von den Blastomeren eingenommen wurde
und die Intensität aller Graustufen dieser Fläche erfasst. Von diesem Wert konnte die
durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz abgezogen werden, die sich durch
Umfahren einer kreisrunden Fläche am Rand ergab, die in etwa der Größe des
Embryos entsprach. Der so korrigierte Wert wurde daraufhin für den Vergleich der
Fluoreszenzintensitäten in unterschiedlichen Entwicklungsstadien verwendet. Eine
beispielhafte Auswertung eines Graustufenbildes ist in Abbildung 14 dargestellt.
64
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Abbildung 14: Repräsentative Darstellung einer beispielhaften Auswertung der
relativen Signalstärke der IGF1R-Fluoreszenz einer expandierten Blastozyste
3.10 Statistische Auswertungen
Für die statistischen Auswertungen wurde die Software SigmaStat 3.5 genutzt (Fa.
Systat Software GmbH). Dabei wurde zunächst auf die Normalverteilung der Werte
mit Hilfe eines Kolmogorov-Smirnov-Tests geprüft. Anschließend fand für alle
Untersuchungen
eine
einseitige
Varianzanalyse
(One-way
ANOVA)
mit
anschließendem Tukey-Test statt. Unterschiede von P ≤ 0,05 wurden als statistisch
signifikant angesehen. Unterschiede mit P ≤ 0,07 galten als Tendenz.
65
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau
3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF-1 Konzentrationen
In der nachfolgenden Grafik sind die Abläufe der Versuche zur Supplementation von
IGF1 während der Oozytenreifung schematisch dargestellt.
66
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.11.2 Vergleichende Untersuchung der Expression des IGF1R
Das nachfolgende Schema stellt die Einzelheiten zum Versuchsaufbau für die
vergleichende Untersuchung der Expression des Insulin-like growth factor 1 –
Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene dar.
67
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4. Ergebnisse
4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten
Während der Zeit von Februar 2011 bis einschließlich Juni 2012 wurden im Labor
der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Embryonen in
vitro produziert. In 60 Durchgängen wurden insgesamt 4800 Kumulus-OozytenKomplexe
gewonnen
und
in
der
IVP
eingesetzt
(Tab.
11).
Mit
einer
durchschnittlichen Teilungsrate von 57,4 ± 1,8 % und einer Entwicklungsrate von
27,6 ± 1,7 % an Tag acht entstanden insgesamt 1325 Embryonen, die in Gruppen
von bis zu 10 Embryonen bei -80°C für die Western blot – Analysen gelagert wurden.
Tabelle 11: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der IVPVersuche zur Gewinnung expandierter Blastozysten für die Western blot - Versuche
Raten [%]
Anzahl [n]
(MW ± SD)
KOK in der IVC
4800
Teilung
2755
57,4 ± 7,3
Entwicklung Tag 8
1325
27,6 ± 8,1
Durch den Ortswechsel der Arbeitsgruppe an die Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie
und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Gießen im
Jahr 2012, kam es, bedingt durch den Umbau von Laborräumen, zu einer
Unterbrechung der Versuche. Im April 2013 begann die routinemäßige Produktion
von Embryonen in vitro in den neuen Räumlichkeiten, sodass ab August 2013 die
Versuche wieder aufgenommen wurden. In insgesamt 61 Durchgängen wurden 8072
KOK gewonnen, in vitro gereift, befruchtet und kultiviert. Insgesamt teilten sich in der
Kontrollgruppe 953 der vermeintlichen Zygoten, was einer durchschnittlichen
Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % entsprach. Bis zu Tag sieben entwickelten sich
68
Ergebnisse
___________________________________________________________________
durchschnittlich 22,1 ± 6,4 % der Embryonen zum Stadium der Morula oder
Blastozyste. An Tag acht der IVC stieg die durchschnittliche Entwicklungsrate auf
24,1 ± 8,5 % an. Die Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen der
unterschiedlichen Versuchsgruppen sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12: Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie Teilungs- und
Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen Supplementationsgruppen
während der Oozytenreifung
Behandlungsgruppe KOK in
Teilungsrate
Entwicklungsrate
Entwicklungsrate
während der
der IVC
[%]
Tag 7 [%]
Tag 8 [%]
Oozytenreifung
(n)
(MW ± SD)
(MW ± SD)
(MW ± SD)
Kontrolle
1573
60,6 ± 8,1 a
22,1 ± 6,4 a
24,1 ± 8,5 a
DMSO
1191
62,2 ± 8,4 a
18,5 ± 8,0 ac
19,6 ± 8,1 ab*
Apoptoseind.
1192
59,1 ± 8,1 ab
15,1 ± 7,5 ab
16,8 ± 9,3 ab
IGF 100
1010
60,9 ± 8,6 ab
19,5 ± 6,4 ac
19,7 ± 8,8 ab*
IGF 100 + Apop.
938
60,2 ± 9,6 ab
13,5 ± 7,4 bc
15,4 ± 8,2 b
IGF 1000
1010
55,6 ± 7,3 ab
13,6 ± 6,2 bc
15,9 ± 7,6 ab
IGF 1000 + Apop.
1158
52,7 ± 6,9 b
7,9 ± 4,7 b
10,0 ± 4,8 b**
a:b:c P ≤ 0,05; *:** P ≤ 0,07
Zwischen
Embryonen
der
einzelnen
Versuchsgruppen
konnten
statistisch
signifikante Unterschiede in den Teilungsraten beobachtet werden (P ≤ 0,05). So
zeigte sich, dass die Supplementation des Medium mit IGF1 (1000 ng/ml) und
Apoptoseinduzierern die Teilungsrate signifikant im Vergleich zu Embryonen der
Kontroll- und DMSO-Gruppe reduziert.
Beim Vergleich der Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung
konnten ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen Embryonen einiger Gruppen
69
Ergebnisse
___________________________________________________________________
nachgewiesen werden (Abb. 15). An Tag sieben erreichten Embryonen der
Kontrollgruppe eine signifikant höhere Entwicklungsrate als die der IGF1Supplementationsgruppen IGF 100 + Apoptoseinduzierer, IGF 1000 und IGF 1000 +
Apoptoseinduzierer. Zudem konnten signifikant mehr Morulae und Blastozysten in
der DMSO- und der IGF 100 – Gruppe als in der IGF 1000 + Apoptoseinduzierer
beobachtet werden. An Tag acht der Kultivierung konnten bei Embryonen der
Kontrollgruppe erneut signifikant höhere Entwicklungsraten erzielt werden als bei
denen der IGF1-supplementierten Gruppen mit Apoptoseinduzierern. Außerdem
wurde eine tendenziell reduzierte Anzahl an Morulae und Blastozysten in der Gruppe
IGF 1000 + Apoptoseinduzierer im Vergleich zur Gruppe mit DMSO oder
IGF 100-Supplementation gefunden (P ≤ 0,07).
a
ab*
a
ab*
ac
ac
ab
b
ab
bc
ab
bc
b**
b
Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen
Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag sieben und Tag acht
(MW + SD); a:b P ≤ 0,05
70
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.2 Bestimmung der Kernreifungsraten
Nach 24-stündiger Reifung der Kumulus-Oozyten-Komplexe in Maturationsmedium
mit unterschiedlichen Zusätzen wurde die Kernreifungsrate bestimmt. Zunächst fand
eine
mikroskopische
unterschieden
sich
Untersuchung
die
des
einzelnen
Cumulus
oophorus
Versuchsgruppen
statt.
optisch
Dabei
in
der
Kumulusexpansion, wie in Abbildung 16 deutlich zu erkennen ist. KOK der
Kontrollgruppe, sowie der Supplementationsgruppen mit IGF in einer Konzentration
von 100 ng/ml und 1000 ng/ml wiesen eine deutliche Expansion des Kumulus
oophorus auf. Dagegen bewirkte der Zusatz von DMSO eine Reduktion der
Kumulus-Expansion (Abb. 16, B). Bei der Maturation mit Apoptoseinduzierern konnte
demgegenüber nur eine geringgradige bis keine Expansion identifiziert werden
(Abb. 16, C, E, G).
B
A
D
Abbildung
C
E
16:
Repräsentative
F
Illustration
G
der
Kumuluszellexpansion
in
den
unterschiedlichen Versuchsgruppen nach 24-stündiger Maturation; A: Kontrolle,
B: DMSO; C: Apoptoseinduzierer; D: IGF 100, E: I+A 100, F: IGF 1000, G: I+A 1000
71
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Im Anschluss an die Kumulusentfernung wurde aus durchschnittlich acht IVMDurchgängen die Maturationsrate von Oozyten der Kontroll- und der einzelnen
Versuchsgruppen mit einer Hoechst 33342-Färbung bestimmt. Es konnten
unterschiedliche Reifungsgrade registriert werden. Die zu erwartenden Stadien sind
beispielhaft in Abbildung 17 dargestellt.
A
B
C
Abbildung 17: Repräsentative Darstellung der nukleären Stadien boviner Oozyten
während der Reifung mit Hilfe einer Hoechst 33342-Färbung; A: Prophase I,
B: Telophase I, C: Metaphase II
Die Auszählung der Metaphase II-Oozyten nach Färbung mit Hoechst 33342 ergab
für die Oozyten der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Maturationsrate von
83,5 ± 6,9 %. Beim Vergleich der Maturationsraten von Oozyten aus der
Kontrollgruppe mit Oozyten aus den unterschiedlichen Supplementationsgruppen
kam es zu einer signifikanten Verringerung der nukleären Maturation in den
Versuchsgruppen, denen Apoptoseinduzierer hinzugefügt wurden (Tab. 13). IGF1 in
einer Konzentration von 1000 ng/ml als Zusatz in der Reifung verursachte ebenfalls
eine signifikante Abnahme der Maturationsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die
Supplementation mit DMSO bewirkte eine tendenzielle Reduzierung der Anzahl reifer
Eizellen (P ≤ 0,07). Hingegen konnte kein Einfluss eines IGF1-Zusatzes von
100 ng/ml zum Maturationsmedium beobachtet werden.
72
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Tabelle 13: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Maturationsraten von Oozyten der
unterschiedlichen Versuchsgruppen
Maturationsrate [%]
KOK in der IVC (n) (MW ± SD)
Kontrolle
242
83,5 ± 6,9 a*
DMSO
168
72,1 ± 5,4 ab**
Apoptoseind.
182
68,5 ± 8,3 b
IGF 100
199
75,1 ± 7,1 ab
IGF 100 + Apop.
190
69,5 ± 7,3 b
IGF 1000
186
70,2 ± 6,0 b
IGF 1000 + Apop.
191
70,9 ± 10,9 b
a:b P ≤ 0,05; *:** P ≤ 0,07
73
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium
Die
IGF1-Konzentration
im
Maturationsmedium
der
unterschiedlichen
Versuchsgruppen wurde sowohl vor als auch nach 24-stündiger Inkubation in
mindestens drei Wiederholungen gemessen. Für die Untersuchung kamen
insgesamt vier verschiedene kommerzielle Kits zum Einsatz, die auf zwei Methoden
beruhten, ELISA und IRMA.
Der erste ELISA, der Firma DRG Instruments GmbH erzielte als Messergebnis Werte
zwischen 0,7 und 25,0 ng/ml vor der Maturation und 54,8 und 367,4 ng/ml nach der
Maturation. Dabei konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration in allen Proben nach
24-stündiger Maturation gezeigt werden. Dieser Test erzielte als einziger Werte für
IGF1 in den Kontrollgruppen, denen kein IGF1 hinzugeführt wurde.
Der zweite ELISA (IBL International GmbH) erreichte Messwerte zwischen 837,8 und
1295,3 ng/ml vor Beginn der Maturation für die IGF1-supplementierten Gruppen.
Nach 24-stündiger Maturation wurden Konzentrationen zwischen 761,2 und
1416,0 ng/ml gemessen. Die Werte für die Kontroll-, die DMSO- und die
Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen hierbei unterhalb der Nachweisgrenze des Tests.
Für einige Gruppen konnte ein Anstieg in der IGF1-Konzentration verzeichnet
werden, während andere einen Abfall der Konzentration zeigten. Die erwarteten
Messwerte von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml in den Gruppen, denen diese
Konzentration hinzugefügt wurde, konnten anhand des Tests nicht bestätigt werden.
Des Weiteren wurde ein IRMA der Firma DRG Instruments GmbH ausgetestet, der
allerdings nicht zu einer Auswertung der Messung führte, da die Werte der
Standardkurve nicht linear ausfielen.
Mit Hilfe des zweiten IRMA (Beckman Coulter) konnten allerdings Werte erzielt
werden, die zu Beginn der Maturation zwischen 18,8 und 30,0 ng/ml in den Gruppen
mit IGF1-Zusatz lagen. Nach der Maturation wurden Konzentrationen zwischen
14,6 und 22,3 ng/ml gemessen. Bis auf eine Ausnahme konnte ein Abfall in der
IGF1-Konzentration durch die Maturation über 24 Stunden beobachtet werden. Die
Werte für die Kontroll-, DMSO- und Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen auch hier
unterhalb der Nachweisgrenze.
74
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Eine Übersicht aller Ergebnisse ist in Tabelle 14 dargestellt.
Tabelle 14: Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe
unterschiedlicher Methoden vor und nach 24-stündiger Oozytenmaturation
IGF1-Konzentration [ng/ml]
(MW ± SD)
ELISA IGF-I 600
DRG
Instruments
Sollwert
Kontrolle
DMSO
Apoptoseind.
IGF 100
IGF 100 +
IGF 1000 +
IBL International
vorher
IRMA IGF-1
Beckman
Coulter
nachher vorher nachher
(n=5)
(n=5)
(n=3)
(n=3)
(n=3)
(n=3)
-
0,7 ±
0,01
207,5 ±
12,1
na
na
na
na
-
4,3 ±
0,4
197,4 ±
1,4
na
na
na
na
-
2,2 ±
0,04
54,8 ±
0,9
na
na
na
na
100
15,5 ±
0,2
367,4 ±
10,7
837,8 ±
137,3
938,5
±194,4
25,8 ±
2,9
22,3 ±
3,3
100
25,0 ±
0,1
147,8 ±
6,6
1044,6 ±
177,4
761,2 ±
101,1
30,0 ±
1,4
20,3 ±
1,5
1000
2,9 ±
0,1
154,1 ±
1,2
1238,5 ±
342,5
1170,7 ±
45,0
29,5 ±
1,7
14,6 ±
1,6
1000
2,1 ±
0,2
133,4 ±
0,1
1295,3 ±
280,0
1416,0 ±
22,0
18,8 ±
8,4
20,9 ±
0,5
Apop.
IGF 1000
vorher nachher
IGF-1 ELISA
Apop.
na = nicht auswertbar
75
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung
Die Zellzahlfärbung mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 von expandierten
Blastozysten an Tag sieben der Kultivierung (Abb. 18) ergab für Embryonen der
Kontrollgruppe eine mittlere Gesamtzellzahl von 134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste.
Dabei lag die Anzahl toter Zellen bei durchschnittlich 7,4 ± 2,4 Zellen pro Blastozyste.
Daraus ergab sich für die Lebend-Tot-Zellratio ein Mittelwert von 19,1 ± 6,8.
Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst 33342
und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote Zellen
Beim Vergleich expandierter Blastozysten hinsichtlich ihrer Gesamtzellzahl konnte
eine statistisch signifikante Reduzierung in Blastozysten aus der Maturation mit IGF1
in einer Konzentration von 1000 ng/ml mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zur
Kontrollgruppe beobachtet werden (Tab. 15). Die Untersuchung der Anzahl toter
Zellen in expandierten Blastozysten der einzelnen Supplementationsgruppen ergab
keine signifikanten Unterschiede.
76
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Tabelle
15:
Gesamtzellzahlen,
Anzahl
toter
Zellen
und
Lebend-Tot-Zellratio
expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben
Gesamtzellzahl
Tote Zellen
(MW ± SD)
(MW ± SD)
Kontrolle (n=16)
134,9 ± 18,6 a
7,4 ± 2,4
DMSO (n=10)
116,8 ± 19,0 ab
10,0 ± 4,4
Apoptoseind. (n=11)
132,8 ± 21,4 ab
11,3 ± 4,9
IGF 100 (n=8)
111,1 ± 21,9 ab
11,8 ± 5,6
IGF 100 + Apop. (n=8)
112,0 ± 9,4 ab
8,1 ± 2,4
IGF 1000 (n=8)
134,4 ± 27,0 ab
9,6 ± 7,8
IGF 1000 + Apop. (n=11)
110,7 ± 20,3 b
10,6 ± 5,1
a:b P ≤ 0,05
Aus der Berechnung der Lebend-Tot-Ratio ging hervor, dass der höchste Wert in der
Kontrollgruppe erzielt wurde (Abb. 19). Demnach wiesen Blastozysten aus der
Kontrollgruppe die wenigsten toten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl auf.
Sowohl der Zusatz von IGF1 (100 ng/ml), als auch IGF1 (1000 ng/ml) zusammen mit
Apoptoseinduzierern, führte zu einer signifikanten Reduzierung der Lebend-TotRatio.
Weiterhin
bewirkte
die
Supplementation
mit
DMSO
und
Apoptoseinduzierern allein eine signifikant geringere Lebend-Tot-Ratio.
77
die
mit
Ergebnisse
___________________________________________________________________
a
ab
b
ab
b
b
b
n=16
n=10
n=11
n=8
n=8
n=8
n=11
Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der unterschiedlichen
Supplementationsgruppen (MW + SD); a:b P ≤ 0,05
78
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen
Bei der Untersuchung von Apoptose in mindestens sechs expandierten Blastozysten
pro
Supplementationsgruppe
wurden
mit
Hilfe
einer
TUNEL-Analyse
durchschnittliche Gesamtzellzahlen zwischen 127,0 und 143,4 Zellen pro Blastozyste
erzielt. In der Kontrollgruppe waren davon durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % der Zellen
TUNEL-positiv (Abb. 20, A). Eine Positivkontrolle, bei der Blastozysten mit DNase
behandelt wurden, um DNA-Brüche hervorzurufen, lief standardmäßig bei jeder
Färbung mit, um die Spezifität des Tests zu garantieren (Abb. 20, B).
B
A
Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach TUNELund Zellkernfärbung; A: Blastozyste der Kontrollgruppe; B: Positivkontrolle einer
DNase-behandelten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen; Grün: TUNEL-positive Zelle
Das Verhältnis des prozentualen Anteils TUNEL-positiver zu –negativer Zellen ist in
Abbildung 21 dargestellt. Es zeigte sich, dass in Embryonen der Gruppe, in der
Apoptoseinduzierer allein dem Maturationsmedium zugesetzt wurde, statistisch
signifikant mehr TUNEL-positive Zellen pro Blastozyste vorkamen als in Embryonen
der Kontrollgruppe (Tab. 16). Es konnte kein signifikanter Unterschied im
prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen zwischen Embryonen der anderen
Supplementationsgruppen und der Kontrollgruppe gefunden werden. Außerdem war
die Anzahl TUNEL-positiver Zellen in Embryonen der Gruppen, denen IGF1
zugesetzt wurde, im Vergleich zu denen der Gruppen, deren Maturationsmedien
neben IGF1 auch Apoptoseinduzierer enthielten, ähnlich.
79
Ergebnisse
___________________________________________________________________
n=14
n=8
n=9
n=10
n=6
n=9
n=7
Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und -negativer
Zellen in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen
Tabelle 16: Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen expandierter
Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben
TUNEL-negative [%] TUNEL-positive [%]
(MW ± SD)
Kontrolle (n=14)
DMSO (n=8)
Apoptoseind. (n=9)
IGF 100 (n=10)
IGF 100 + Apop. (n=6)
IGF 1000 (n=9)
IGF 1000 + Apop. (n=7)
(MW ± SD)
97,9 ± 1,1
2,1 ± 1,1 a
96,8 ± 1,0
3,2 ± 1,0 ab
95,5 ± 2,1
4,5 ± 2,1 b
96,3 ± 1,6
3,7 ± 1,8 ab
95,7 ± 2,1
4,3 ± 2,1 ab
96,0 ± 1,7
4,0 ± 1,7 ab
96,5 ± 1,9
3,6 ± 1,9 ab
a:b P ≤ 0,05
80
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte
4.6.1
MessengerRNA-Expression
ausgewählter
Gene
nach
IVM
mit
verschiedenen Zusätzen
Für die Untersuchung der Expression ausgewählter Gentranskripte wurde eine
RT-qPCR mit mindestens zwei Wiederholungen durchgeführt. Dabei konnten für das
anti-apoptotische
Gen
BCL2L1
statistisch
signifikante
Unterschiede
in
der
Expression zwischen Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen
nachgewiesen werden. Bei Betrachtung der relativen Transkriptmenge von BCL2L1
wird deutlich, dass das anti-apoptotische Gen in Embryonen aus der Maturation mit
IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen aus allen
anderen Supplementationsgruppen signifikant häufiger vorkommt (Abb. 22).
a
b
b
n=4
n=3
b
b
b
n=4
n=2
n=5
b
n=3
n=2
Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten Blastozysten
der verschiedenen Supplementationsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05
Für
Transkripte
des
IGF-Systems
(IGF1R,
IGFBP2,
IGFBP4),
des
Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) und für das pro-apoptotische Transkript
BAX wurden keine signifikanten Einflüsse der verschiedenen Zusätze während der
IVM in expandierten Blastozysten detektiert (Abb. 23 und 24).
81
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3 und BAX
in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben
(MW ± SEM)
Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1 und
SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag
sieben (MW ± SEM)
82
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R
Bei der Untersuchung der mRNA-Expression des IGF1R mit mindestens zwei
Wiederholungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der frühen Embryonalentwicklung
konnte eine stadienspezifische Expression detektiert werden (Abb. 25). Zu Beginn
der Furchungsteilungen, während des 2-Zellstadiums, wurde die größte relative
Anzahl an IGF1R-Transkripten gemessen (62,9 ± 24,3). Daraufhin folgte ein Abfall
der Transkriptmenge mit einem Minimum im 8-Zellstadium (4,1 ± 2,1). Vom 16-Zeller
bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der relativen
Menge
an
IGF1R-Transkripten erkannt werden.
Dabei wurden
signifikante
Unterschiede zwischen der mRNA-Expression des IGF1R im 2-Zellstadium und der
im
8-Zellstadium
entdekt.
Des
Weiteren
wurden
signifikant
niedrigere
Transkriptmengen des IGF1R im 16-Zeller und dem Stadium der Morula im Vergleich
zum 2-Zellstadium gezeigt.
a
ab
ab
ab
b
n=3
n=2
b
b
n=3
n=3
n=5
n=5
n=3
Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf der
frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05
83
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R
4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot
In insgesamt 24 Western blot-Analysen mit vier verschiedenen Antikörpern wurden
zum Nachweis des IGF1-Rezeptorproteins 440 Embryonen im Stadium der
geschlüpften Blastozyste eingesetzt.
Der
spezifische
Peptidantikörper
anti-popp
IGF1R
wurde
zunächst
an
Proteinextrakten von bovinem Gewebe getestet. Hierfür wurden Proben aus boviner
Leber, Karunkel und Kotyledone verwendet, die nachweislich den IGF1R enthielten
(BAUER et al. 1998, FOWDEN 2003). Nach der Lyse der Gewebeproben wurden die
Proteinkonzentrationen mittels BCA-Assay bestimmt, sodass eine Menge von 20 µg
eingesetzt werden konnte. Als zum wiederholten Mal ein Signal mit korrekter
Molekülmasse aufgezeigt wurde, folgte die Durchführung eines Western blots mit
bovinen Embryonen (Abb. 26).
1
2
3
4
125 kDa
44 kDa
Abbildung
26:
Oben:
Repräsentativer
Western
blot
mit
unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des Peptidantikörpers anti-popp IGF1R (Seqlab,
Göttingen);
Unten:
Ladungskontrolle
mit
β-Aktin,
1:
50
Embryonen,
2-4:
Positivkontrollen (bovine Leber, Karunkel, Kotyledone)
In insgesamt acht Wiederholungen konnte kein Signal des IGF1R in einer Gruppe
von 50 bovinen Blastozysten beobachtet werden. Auch durch das Heraufsetzen der
Anzahl an Embryonen auf 100 pro Versuch konnte der IGF1-Rezeptor nicht
nachgewiesen werden.
84
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Aus diesem Grund wurden drei weitere kommerziell erhältliche Antikörper zum
Nachweis des IGF1R im Western blot getestet.
Zunächst
erfolgte
die
Austestung
des
IGF-1Rα-Antikörpers
(santa
cruz
biotechnology, CA, USA) in bovinen Gewebeproben aus Leber und Plazenta, sowie
in humaner Plazenta. Im Western blot wurde durch diesen Antikörper ein schwaches
Signal in 20 µg Proteinextrakten detektiert (Abb. 27). Allerdings konnte dieses Signal
durch Variationen in den Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen nicht verstärkt
werden. Eine semi-quantitativen Auswertung des IGF1R-Proteins in insgesamt drei
Durchgängen erfolgte deshalb nicht.
1
2
3
4
100 kDa
44 kDa
Abbildung
27:
Oben:
Repräsentativer
Western
blot
mit
unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rα (santa cruz biotechnology, CA, USA);
Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone,
4: humane Plazenta
Daraufhin kam ein weiterer Antikörper der Firma santa cruz biotechnology zum
Einsatz (IGF-1Rβ Antikörper). Dieser Antikörper wurde ebenfalls eingangs in 20 µg
Proteinextrakten aus boviner Leber und Plazenta, sowie in humaner Plazenta
untersucht. Nach insgesamt drei Wiederholungen des Western blots konnte nur in
der humanen Plazenta ein Signal aufgezeigt werden (Abb. 28). Der Antikörper
konnte in bovinen Gewebeproben das Protein des IGF1R nicht nachweisen und
wurde daher nicht für den Nachweis in bovinen Embryonen eingesetzt.
85
Ergebnisse
___________________________________________________________________
1
2
3
4
200 kDa
44 kDa
Abbildung
28:
Oben:
Repräsentativer
Western
blot
mit
unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rβ (santa cruz biotechnology, CA, USA);
Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone,
4: humane Plazenta
Als dritter Antikörper kam der Anti-IGF1 Antikörper der Firma AVIVA systems
biotechnology (CA, USA) zum Einsatz, der ebenfalls in Proteinextrakten aus
Gewebeproben ausgetestet wurde. Nach dreimaligem Wiederholen des Western
blots mit Anpassung der Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen konnte kein
Signal in den Positivkontrollen detektiert werden. Der Antikörper führte nicht zu
einem Nachweis des IGF1R in Gewebeproben und wurde daher nicht zum Nachweis
in bovinen Embryonen herangezogen.
Zusammenfassend konnte mit Hilfe des speziell produzierten Peptidantikörpers
anti-popp IGF1R der Firma Seqlab eine qualitative Aussage über das Vorhandensein
des IGF1R in bovinen Embryonen getroffen werden. Allerdings konnte weder dieser
Antikörper, noch einer der kommerziell erhältlichen zur Quantifizierung des IGF1Rezeptorproteins eingesetzt werden.
86
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.7.2 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenzfärbung
Zur Bestimmung der Lokalisation des IGF1R und für die semi-quantitative
Auswertung der Graustufenintensitäten in insgesamt 61 bovinen Embryonen
unterschiedler Stadien wurde der spezifische Peptidantikörper anti-popp IGF1R
(Seqlab, Göttingen) verwendet. Lokalisiert wurde der IGF1R hauptsächlich in der
Plasmamembran der einzelnen Blastomeren, sowie im Zytoplasma (Abb. 29).
A
C
B
D
F
E
G
Abbildung 29: Repräsentative Darstellung der Proteinexpression des IGF1R im 2- (A),
4- (B), 8- (C), 16-Zellstadium (D), Stadium der Morula (E), der Blastozyste (F) und der
expandierten Blastozyste (G); Rot: Zellkernfärbung mit Propidiumiodid, Grün:
spezifische Antikörperfärbung mit Hilfe des anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen)
87
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Bei der Messung der Graustufenintensitäten konnte eine stadienspezifische
Expression des IGF1R beobachtet werden (Abb. 30). Dabei wurde die größte
Graustufenintensität im 2-Zellstadium gemessen (1007,8 ± 123,8), woraufhin es zu
einem
signifikanten
Abfall
der
Signalstärke
bis
zum
16-Zellstadium
kam
(417,6 ± 54,3). Das stärkste Fluoreszenzsignal konnte im Stadium der Blastozyste
detektiert
werden
(1319,6
±
116,3).
Es
wurde
eine
signifikant
größere
Proteinexpression des IGF1R im 2- und 4-Zeller im Vergleich zum 16-Zeller
nachgewiesen. Weiterhin kam es zur Detektion eines signifikant höheren IGF1RFluoreszenzsignals in Blastozysten und expandierten Blastozysten im Unterschied
zum 16-Zellstadium.
a
ac
a
ac
bc
bc
b
n=8
n=9
n=8
n=8
n=9
n=9
n=10
Abbildung 30: Darstellung der mittleren Graustufenintensitäten im Verlauf der frühen
Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b:c P ≤ 0,05
88
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.8 Vergleich der stadienspezifischen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R
Beim Vergleich der mRNA-Expression des IGF1R mit dessen Proteinexpression
konnten Übereinstimmungen in der stadienspezifischen Verteilung der Signalstärken
herausgefunden werden (Abb. 31). Die jeweils stärkste Expression konnte zu Beginn
der Entwicklung im 2- und 4-Zellstadium detektiert werden. Während die relative
Anzahl an IGF1R-Transkripten die geringste Intensität im 8-Zellstadium aufwies,
zeigte
die
Proteinexpression
ein
Minimum
im
16-Zellstadium.
Bei beiden
Untersuchungen konnte daraufhin ein Anstieg der Expression bis zum Stadium der
Blastozyste gezeigt werden.
F
Abbildung 31: Vergleich der relativen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R
während der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM), die Proteinexpression wurde
für Darstellungszwecke um ein Zehnfaches verringert
89
Diskussion
___________________________________________________________________
5. Diskussion
In den letzten Jahren konnte in der Reproduktionsmedizin eine deutliche
Weiterentwicklung biotechnologischer Methoden beobachtet werden, die zu einer
gesteigerten Produktion qualitativ hochwertiger Embryonen, vor allem bei der
Spezies Rind, geführt hat. Dennoch unterscheiden sich in vitro produzierte
Embryonen von ihren in vivo generierten Gegenstücken in vielerlei Hinsicht. So
wurden Unterschiede in der Morphologie und im Genexpressionsmuster, sowie in der
Einfrierbarkeit und der resultierenden Trächtigkeitsrate nachgewiesen (GREVE et al.
1987, WRENZYCKI et al. 1998). Es fanden bereits zahlreiche Versuche statt, die
Qualität der in vitro produzierten Embryonen zu verbessern. Zum einen wurde
versucht, die Auswahl der KOK nach morphologischen Kriterien zu standardisieren,
da die Entwicklungskompetenz der Oozyte nachweislich die weitere Entwicklung des
Embryos bestimmt (LONERGAN et al. 2003). Zum anderen wurde durch die
Optimierung des Kultivierungsmediums mit unterschiedlichen Zusätzen versucht, die
Qualität der resultierenden Embryonen zu erhöhen (WRENZYCKI et al. 1999,
NATALE et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, LONERGAN et al.
2003).
Auch in der Grundlagenforschung findet die IVP boviner Embryonen häufig
Anwendung. Dabei werden oft bestimmte Mechanismen nachgestellt, um spezifische
Funktionen und Wirkungsweisen von Einflussfaktoren zu untersuchen. So wurde in
der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der IVP die Funktion des Wachstumsfaktors IGF1
während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung untersucht. Im Detail
wurde die Aufgabe von IGF1 in Bezug auf das Auftreten von Apoptose in bovinen
Embryonen dargestellt. Weiterhin erfolgte die Untersuchung des Einflusses einer
supraphysiologischen Konzentration IGF1. Außerdem wurde untersucht, ob es zu
einer Verbesserung der Qualität boviner Embryonen durch den Zusatz einer
physiologischen Konzentration IGF1 während der Eizellreifung kommt. Die Qualität
der Oozyten und der sich entwickelnden Embryonen wurde mit morphologischen
Methoden, wie der Bestimmung der Maturations-, Teilungs- und Entwicklungsrate,
aber auch der Auszählung der Gesamtzellzahl und der Anzahl apoptotischer Zellen
ermittelt. Des Weiteren erfolgten Untersuchungen auf molekularer Ebene, wie die
90
Diskussion
___________________________________________________________________
Analyse des Expressionsmusters entwicklungsrelevanter Gentranskripte und das des
IGF1R-Proteins. Überdies fand eine vergleichende Analyse des Expressionsmusters
des Insulin-like growth factor 1-Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene während der
frühen bovinen Embryonalentwicklung statt.
5.1 Einfluss einer IGF1-Supplementation auf die morphologische Qualität
boviner Embryonen
Die in dieser Arbeit erzielten Maturationsraten in Oozyten der Kontrollgruppe von
83,5 ± 2,3 % lagen im Durchschnitt der für die In-vitro-Maturation zu erwarteten
Werte von 80 bis 90 % (GALLI et al. 2003). Der Zusatz von IGF1 in einer
Konzentration von 100 ng/ml führte nicht zu einer Beeinflussung der Maturationsrate
und entspricht bisherigen Untersuchungen, die zu dem gleichen Ergebnis führten
(RIEGER et al. 1998, MEIYU et al. 2014). Da reduzierte IGF1-Werte im Blut
allerdings nachweislich zu einer Verzögerung der Ovulation in vivo führen (WATHES
et al. 2007), wäre es interessant zu untersuchen, inwiefern in vitro der Zeitpunkt der
zweiten Reifeteilung durch die Supplementation des Maturationsmediums mit IGF1
beeinflusst wird. Dies könnte in einer nachfolgenden Arbeit durch Untersuchungen
der Maturationsstadien zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen. Außerdem stehen
die Vorgänge während der negativen Energiebilanz in direkter Verbindung zur
Fruchtbarkeit. So konnte gezeigt werden, dass eine geringere IGF1-Produktion in der
Leber zu einer reduzierten Verfügbarkeit von IGF1 im Blut führt, was wiederum einen
Einfluss auf die GnRH-FSH/LH-Achse ausübt. Damit kommt es direkt zu einer
Verschlechterung der Eizellqualität durch Beeinflussung der follikulären Umgebung,
was indirekt zu einer Verringerung der Fruchtbarkeit des Rindes führt (ZULU et al.
2002, WATHES et al. 2007). Letztlich beeinflusst die follikuläre Umgebung der
Eizelle auch nach einer erfolgreichen Befruchtung die Viabilität des resultierenden
Embryos und fördert damit die frühe embryonale Mortalität (BROWN et al. 2009).
Ferner kam es in der Gruppe von Eizellen, die 1000 ng/ml IGF1 ausgesetzt waren,
zu einer signifikanten Reduzierung der Reifungsrate. Zudem bewirkte die Zugabe
91
Diskussion
___________________________________________________________________
von Apoptoseinduzierern allein, ebenso wie zusammen mit IGF1, eine signifikant
geringere Maturationsrate. Diese Ergebnisse in bovinen Oozyten sind bisher die
ersten ihrer Art und weisen auf einen negativen Einfluss der Apoptoseinduzierer
Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin, sowie der supraphysiologischen IGF1Konzentration auf die nukleäre Maturation boviner Eizellen hin. Weiterhin konnten in
Embryonen der Kontrollgruppe durchschnittliche Teilungsraten von 60,6 ± 8,1 % und
Entwicklungsraten von 22,1 ± 6,4 % an Tag sieben und 24,1 ± 8,5 % an Tag acht der
Kultivierung erzielt werden. Diese Werte liegen im Durchschnitt der zu erwartenden
Werte von 20 bis 40 %, die mit dem angewendeten Kultursystem erzielt werden
können (RIZOS et al. 2002). Die Supplementation von 100 ng/ml IGF1 führte nicht zu
einer Veränderung der Teilungs- und Entwicklungsraten boviner Embryonen und
stimmt mit Ergebnissen aus vorherigen Studien überein (RIEGER et al. 1998,
MAKAREVICH u. MARKKULA 2002, MEIYU et al. 2014). Jedoch konnte ein
negativer
Einfluss
des
IGF1-Zusatzes
(1000
ng/ml)
zusammen
mit
Apoptoseinduzierern auf die Teilungs- und Entwicklungsrate beobachtet werden.
Dieses Ergebnis wurde für das Rind erstmals in der vorliegenden Arbeit gezeigt und
bestätigt,
dass
eine
Veränderung
der
Maturationsbedingungen,
die
Entwicklungskompetenz der Eizelle negativ beeinflussen kann (LONERGAN et al.
2003). Bisherige Untersuchungen dieser Art beim Rind, aber auch bei der Maus,
behandelten vorwiegend den Einfluss einer IGF1- und/oder ApoptoseinduziererSupplementation während der In-vitro-Kultivierung von Embryonen, wo ebenfalls
eine negative Beeinflussung der Teilungs- und Entwicklungsraten nachgewiesen
werden konnte (FABIAN et al. 2004, BLOCK et al. 2007).
Als weiterer Parameter zur Untersuchung der Embryonenqualität wurden die
Gesamtzellzahl und das Verhältnis von lebenden zu toten Zellen in expandierten
Blastozysten
bestimmt.
In
Embryonen
der
Kontrollgruppe
konnte
eine
durchschnittliche Gesamtzellzahl von 134,9 ± 4,7 Zellen pro Blastozyste erreicht
werden. Auch hier lagen die Werte im Bereich derer, die bereits in anderen Arbeiten
veröffentlicht wurden (NEDAMBALE et al. 2004). Erneut zeigte sich allein ein
Einfluss der Zugabe von 1000 ng/ml IGF1 mit Apoptoseinduzierern. Dieser Zusatz
führte zu einer signifikanten Verringerung der Gesamtzellzahl und zu einer
92
Diskussion
___________________________________________________________________
gesteigerten Anzahl toter Zellen pro Blastozyste, was erneut auf die negative
Beeinflussung der Entwicklungskompetenz der Eizelle während der Maturation
hindeutet und erstmals auf diese Art untersucht wurde.
Die
Untersuchung
des
Auftretens
von
Apoptose
während
der
frühen
Embryonalentwicklung stellt einen weiteren Parameter dar, anhand dessen externe
Einflüsse auf in vitro produzierte Embryonen geprüft werden können. Zu diesem
Zweck fand die Methode der TUNEL-Analyse Anwendung, die mit Hilfe eines
Fluoreszenzfarbstoffes apoptose-spezifische DNA-Brüche in Zellkernen sichtbar
macht. Allerdings ist diese Untersuchung nur bedingt spezifisch für Apoptose, da es
auch während des Vorgangs der Nekrose zum Zerfall von DNA kommt. Aus diesem
Grund wurde darauf geachtet, dass nur solche Zellen als TUNEL-positiv bezeichnet
wurden, die eine apoptotische Morphologie aufwiesen. Eine Supplementation des
IVM-Mediums mit 100 ng/ml IGF1 führte nicht zu einer Veränderung des Auftretens
von Apoptose in Blastozysten. Dieses Ergebnis bestätigt vorherige Arbeiten mit
einem vergleichbaren Versuchsaufbau (MAKAREVICH u. MARKKULA 2002).
Allerdings konnten andere Studien zeigen, dass die Anzahl TUNEL-positiver Eizellen
und der sie umgebenden Kumuluszellen durch die Hinzugabe von IGF1 deutlich
gesenkt wird (KÖLLE et al. 2003, WASIELAK u. BOGACKI 2007). Diese antiapoptotische Wirkung von IGF1 konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt
werden. Ein Grund dafür könnte sein, dass in diesem Versuchsaufbau ein anderes
Kultivierungsmedium verwendet wurde. Nachweislich haben die Medien, in denen
die Einzelschritte der IVP stattfinden, einen großen Einfluss auf die Entwicklung und
auch das Auftreten von Apoptose (LONERGAN et al. 2003). Die Anzahl TUNELpositiver Nuclei war dagegen in Blastozysten, resultierend aus Oozyten der IVMGruppe mit Apoptoseinduzierern, signifikant erhöht. Dies bestätigt die erwartete
Wirkung der Apoptoseinduzierer Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin und ist mit
Resultaten bisheriger Studien bei der Maus, beim Hamster und beim Rind zu
vergleichen (ALEXANDRE et al. 2000, MATWEE et al. 2000, FABIAN et al. 2004).
Gleichzeitig zeigte sich aber kein Einfluss der Apoptoseinduzierer auf die
Gesamtzellzahl
in
Blastozysten,
was
darauf
hindeutet,
dass
Apoptose
in
Blastozysten zur natürlichen Regulierung der Zellzahl auftritt (BYRNE et al. 1999,
93
Diskussion
___________________________________________________________________
MATWEE et al. 2000, GJORRET et al. 2003). Beim Vergleich der Embryonen aus
den Eizellen der IGF1-Supplementationsgruppen, die mit IGF1 allein oder zusammen
mit Apoptoseinduzierern inkubiert wurden, zeigten sich keine Unterschiede in der
Anzahl TUNEL-positiver Zellen in expandierten Blastozysten. Damit kann die antiapoptotische Wirkung von IGF1, die in vorherigen Arbeiten definiert wurde, nicht
bestätigt werden (BYRNE et al. 1999, MAKAREVICH u. MARKKULA 2002). Hinzu
kommt, dass die Entwicklungszeit der Embryonen in diesem Versuch nicht
berücksichtigt wurde. Nachweislich beschleunigt IGF1 die Eizellreifung und die sich
schneller teilenden Embryonen weisen eine geringere Anzahl TUNEL-positiver Zellen
auf (GUTIERREZ-ADAN et al. 2004, WATHES et al. 2007). Diese Art der
Untersuchung könnte in einer nachfolgenden Arbeit durchgeführt werden, um zu
klären, ob IGF1 auch in vitro eine Beschleunigung der Maturation hervorruft und
damit eine Reduzierung der Anzahl apoptotischer Zellen bewirkt.
5.2 Expressionsmuster spezifischer Gentranskripte nach In-vitro-Maturation
boviner KOK mit IGF1
Um die Expression spezifischer Gentranskripte in bovinen Embryonen zu
untersuchen, wurde die Methode der RT-qPCR gewählt. Diese Methode eignet sich
besonders, um den Einfluss externer Faktoren auf spezifische Vorgänge während
der Embryonalentwicklung zu detektieren. Allerdings muss bei der Interpretation der
Daten darauf geachtet werden, dass eine Relevanz für die Proteinebene nur
angenommen und nicht nachgewiesen werden kann (WRENZYCKI et al. 2007).
Weiterhin können mittels dieser Methode keine Aussagen über eine Beeinflussung
der RNA-Stabilität oder beispielsweise Veränderungen der Poly(A)-Schwanzlänge
getroffen werden (WRENZYCKI et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurden
insgesamt sieben spezifische Transkripte in expandierten Blastozysten untersucht,
die aus einer Eizellreifung mit IGF1 und weiteren Zusätzen resultierten. Davon zeigte
das Transkript BCL2L1 signifikante Unterschiede zwischen Embryonen der einzelnen
Supplementationsgruppen. Es konnte beobachtet werden, dass in Blastozysten aus
94
Diskussion
___________________________________________________________________
einer Eizellreifung mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern die Expression
des anti-apoptotischen Transkripts im Vergleich zu allen anderen Embryonen der
verschiedenen Versuchsgruppen signifikant gesteigert wurde. Dieses Ergebnis geht
einher mit einer signifikant reduzierten Gesamtzellzahl, was darauf hindeutet, dass
IGF1 zusammen mit Apoptoseinduzierern die Entwicklung des Embryos beeinflusst,
während der Embryo versucht, dies mit einer veränderten Expression des antiapoptotischen Gens BCL2L1 zu regulieren. Gleichzeitig konnte jedoch kein Einfluss
auf die mRNA-Expression des pro-apoptotischen Gens BAX oder des Vorkommens
von Apoptose in den resultierenden Embryonen gefunden werden. Daher könnte
davon ausgegangen werden, dass die Reduzierung der Gesamtzellzahl nicht durch
ein gesteigertes Vorkommen von Apoptose ausgelöst wird. Im Vergleich zu den
TUNEL-Ergebnissen
kann
durch
den
Nachweis
der
apoptosespezifischen
Gentranskripte keine genaue Aussage über das Auftreten von Apoptose getroffen
werden. Auch bisherige Studien zeigten, dass sich die Expression dieser Gene nicht
zur
Analyse
von
Apoptose
in
bovinen
Embryonen
eignete
(YANG
u.
RAJAMAHENDRAN 2002, VANDAELE et al. 2008). Dies wurde in der vorliegenden
Studie bestätigt. Nach Zusatz von Apoptoseinduzierern kam es nicht zu einer
spezifischen Veränderung der Transkripte von BAX und BCL2L1.
Der Insulin-like growth factor 1 – Rezeptor, der als Hauptaufgabe die spezifische
Signalweiterleitung von IGF1 hat, zeigte keine veränderte mRNA-Expression durch
die IGF1-Supplementation während der In-vitro-Maturation. Anders als zuvor in einer
Studie, in der eine physiologische Konzentration von IGF1 (100 ng/ml) zum
Kultivierungsmedium hinzugegeben wurde, kam es nicht zu einer Herunterregulation
des Rezeptors im Vergleich zu Embryonen der Kontrollgruppe (BLOCK et al. 2008).
Des Weiteren wurde nach Supplementation von IGF1 keine veränderte Expression
des IGFBP3 gefunden, dessen Hauptfunktion die Bindung von IGF1 darstellt, um es
in extrazellulären Flüssigkeiten zu transportieren und es für Gewebe verfügbar zu
machen. Dagegen zeigten andere Studien mit IGF1-Zusatz im Kultivierungsmedium,
dass die relative IGFBP3-Transkriptmenge signifikant gesteigert wurde (BLOCK et al.
2008, VELAZQUEZ et al. 2011). Die Autoren erklären dieses Vorkommen damit,
dass die Bioverfügbarkeit der größeren zur Verfügung stehenden Menge IGF1
95
Diskussion
___________________________________________________________________
dadurch verlängert wird. Allerdings könnte dieses Ergebnis in der vorliegenden Arbeit
über die Zeit in der Kultivierung abgeklungen sein. Denn sowohl nach der Maturation,
als auch nach der Fertilisierung kam es zu einem Medienwechsel ohne erneute
IGF1-Supplementation. In einer weiterführenden Studie könnte durch einen
kontinuierlichen Zusatz von IGF1 während der gesamten Kultivierung in vitro dieses
Phänomen weiter untersucht werden.
Die relativen mRNA-Gehalte für die Transkripte SLC2A1 und SLC2A3, deren
Aufgabe der Glukosetransport ist, zeigten keine Unterschiede im Vergleich von
Embryonen
der
einzelnen
Versuchsgruppen.
Demnach
wurde
der
Glukosemetabolismus durch die Zugabe von IGF1 und/oder Apoptoseinduzierern
nicht beeinflusst. Wie bereits vorherige Studien zeigten, wird die Expression der
Glukosetransporter nicht durch ein vermehrtes Vorkommen von IGF1 in der IVP
verändert (BLOCK et al. 2008, VELAZQUEZ et al. 2011). Ein Grund dafür könnte
sein, dass auch andere Transporter und damit andere Signalwege zur Regulierung
des Glukosestoffwechsels genutzt werden (AUGUSTIN et al. 2001).
Da bei mehreren untersuchten Transkripten keine signifikanten Unterschiede
zwischen Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen nachgewiesen wurde,
kann schlussfolgernd zusammengefasst werden, dass die Zugabe von IGF1 in einer
physiologischen
oder
supraphysiologischen
Konzentration
und/oder
Apoptoseinduzierern nicht zur Veränderung der Genexpression spezifischer
Transkripte in bovinen Embryonen führt. Dies könnte vor allem an der großen
interembryonalen Variabilität liegen. Allerdings könnten sich die Unterschiede, die
direkt nach der Eizellreifung aufgetreten sind, auch durch die In-vitro-Kultivierung
unter gleichen Bedingungen wieder aufgelöst haben, da keine Unterschiede in den
nachfolgenden
Teilungs-
und
Entwicklungsraten
auftraten.
Neben
der
Entwicklungskompetenz der Eizelle haben die Kultivierungsbedingungen einen
großen Einfluss auf die Qualität der resultierenden Embryonen (RIZOS et al. 2002).
Interessant wäre es daher an dieser Stelle, die Beurteilung der Qualität der Eizelle
nach Supplementation mit IGF1 und Apoptoseinduzierern auf molekularer Ebene zu
untersuchen und mit In-vivo-Oozyten zu vergleichen.
96
Diskussion
___________________________________________________________________
5.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal untersucht, ob die hinzugegebene Menge
IGF1 im Maturationsmedium nachweisbar ist und wie sie sich nach 24-stündiger
Inkubation verhält. Zunächst kam es daher zu einer Austestung unterschiedlicher
Nachweismethoden
von
IGF1
im
Medium.
Insgesamt
vier
verschiedene
kommerzielle Kits wurden in zwei unterschiedlichen endokrinologischen Laboren
getestet. Bis auf einen Test führten alle Methoden zu einem Nachweis von IGF1 im
Medium. Allerdings wurden mit den Tests sehr unterschiedliche Werte gemessen,
die nicht mit den hinzugegebenen Konzentrationen von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml
IGF1 in den Supplementationsgruppen übereinstimmten. So wurde mit dem ELISA
der Firma DRG Instruments GmbH IGF1-Konzentrationen zwischen 0,7 und
25,0 ng/ml vor der Maturation erzielt und ein Anstieg in allen Gruppen auf 54,8 bis
367,4
ng/ml
IGF1
nach
der
Maturation
verzeichnet.
Die
hinzugegebene
Konzentration von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml IGF1 konnte in den jeweiligen
Gruppen nicht gemessen werden. Dafür konnte in den Gruppen, denen kein IGF1
hinzugefügt wurde, eine geringe Menge detektiert werden. Dies könnte ein Nachweis
des bovinen IGF1 sein, das aufgrund seiner 98-prozentigen Homologie zum human
IGF1 ebenfalls vom Test erfasst wurde und durch den Zusatz von BSA ins
Maturationsmedium gelangt ist.
Mit Hilfe des IRMA (Beckman Coulter) konnte dagegen in den Mediumproben der
Kontroll-, DMSO- und Apoptoseinduzierer-Gruppe kein IGF1 nachgewiesen werden.
Allerdings zeigten die Medien der IGF1-supplementierten Gruppen ähnlich niedrige
Werte. In einer der Supplementationsgruppen konnte ein Anstieg der IGF1Konzentration nach der Maturation verzeichnet werden (IGF1000 + Apoptoseind.),
wohingegen die anderen Gruppen einen Abfall aufwiesen.
Durch den zweiten ELISA (IBL International) konnte ebenso in den Proben der
Kontroll-, der DMSO- und der Apoptoseinduzierer-Gruppe kein IGF1 nachgewiesen
werden. In allen anderen Gruppen wurden dafür deutlich erhöhte Werte gemessen,
die im Bereich von 837,8 und 1295,2 ng/ml vor Maturationsbeginn lagen und 761,2
bis 1416,0 ng/ml IGF1 nach 24-stündiger Maturation erreichten.
97
Diskussion
___________________________________________________________________
Die sehr breit gestreuten Ergebnisse der einzelnen Kits stellen deren Funktionalität in
Frage.
Durch
den
Nachweis
der
vom
jeweiligen
Hersteller
mitgelieferten
Kontrollproben konnte ein Fehler in der Funktionalität jedoch ausgeschlossen
werden, da alle Kontrollproben bei der Messung im Rahmen der Nachweisgrenze
lagen. Dennoch könnten die Kits nicht spezifisch funktional zum Nachweis des
verwendeten human recombinant IGF1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland)
sein. Selbst vor der 24-stündigen Maturation konnte das hinzugegebene IGF1 in
einer Konzentration von 100 ng/ml oder 1000 ng/ml nicht mit diesen Tests
nachgewiesen werden. Weiterhin könnte die Vorbereitung der IGF1-Lösung und das
Ansetzen der unterschiedlichen Konzentrationen in Maturationsmedium einen
Einfluss auf die Aktivität des IGF1 ausgeübt haben. Allerdings wurde das verwendete
IGF1 nach Herstellerangaben in destilliertem Wasser gelöst, aliquotiert und direkt bei
-20°C in sterilen 1,5 ml Eppendorfgefäßen gelagert. Da der Hersteller garantiert,
dass durch diese Vorbereitung kein Verlust der Aktivität von IGF1 auftritt, kann
ausgeschlossen werden, dass fehlerhaftes Handling zu den Ergebnissen geführt hat.
Dennoch bleibt unklar, ob sich die Bearbeitungsschritte negativ auf die Halbwertszeit
des IGF1 ausgewirkt haben. Diese beträgt im bovinen Serum nur etwa 2-10 min und
verlängert sich nur durch die Bindung an ein IGFBP (ARMSTRONG et al. 2002).
Über die Halbwertszeit des rekombinanten IGF1 wurden keine Angaben des
Herstellers gemacht und Untersuchungen dazu fanden bisher nicht statt.
Andere Arbeitsgruppen, die rekombinantes IGF1 (100 ng/ml) routinemäßig zum
Maturationsmedium boviner Oozyten hinzugeben, verwenden ein anderes Produkt
(LONG® R3 IGF-I human, I1271, Sigma Aldrich). Dieses führt jedoch hinsichtlich der
Maturations-, Teilungs- und Entwicklungsraten zu vergleichbaren Ergebnissen wie in
der vorliegenden Arbeit (LAZZARI et al. 2002). Gleichwohl fehlen zu diesem
rekombinanten IGF1 Untersuchungen zum Nachweis der tatsächlichen Menge im
Medium.
Die Problematik im Nachweis von IGF1 im Maturationsmedium könnte daher die
kontroversen Ergebnisse bereits veröffentlichter Arbeiten zur Supplementation von
IGF1 während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten erklären. So zeigte eine Arbeit
eine deutliche Verringerung der Anzahl apoptotischer Zellen in Blastozysten nach der
98
Diskussion
___________________________________________________________________
Hinzugabe von IGF1 zum Maturationsmedium (Wasielak und Bogacki 2007),
während in anderen Studien keine signifikanten Unterschiede erzielt wurden
(Makarevich und Markkula 2002, Meiyu et al. 2014).
Weiterhin
lassen
sich
Untersuchungsparameter
die
im
homogenen
Vergleich
Ergebnisse
der
der
einzelnen
unterschiedlichen
Supplementationsgruppen in der vorliegenden Arbeit mit den gemessenen
Hormonwerten erklären, denn in den meisten Fällen wurden keine signifikanten
Unterschiede zwischen Embryonen der Gruppen gefunden, was einhergehen würde
mit den ähnlichen Werten der IGF1-Konzentration. Allerdings hebt sich eine Gruppe
bei fast allen Untersuchungen hervor. Bei Eizellen, die mit Apoptoseinduzierern und
einer supraphysiologischen IGF1-Konzentration von 1000 ng/ml maturiert wurden,
konnte sowohl bei der Teilungs- und Entwicklungsrate, als auch bei der
Maturationsrate, der Gesamtzellzahl, der Lebend-Tot-Zellratio und der Expression
des Gens BCL2L1 ein negativer Einfluss der Supplementation gezeigt werden. Dies
könnte auf der einen Seite ein Resultat der Apoptoseinduzierer allein sein. Auf der
anderen Seite könnte die Kombination von IGF1 mit den Apoptoseinduzierern das
Maturationsmedium so verändert haben, dass es einen negativen Einfluss auf die
Eizellen ausübt. Damit bleibt unklar, ob die hier erzielten Ergebnisse auf der Wirkung
von IGF1 beruhen oder andere Faktoren eine Rolle spielten.
Daher sollte in nachfolgenden Studien versucht werden, einen geeigneteren Test
zum Nachweis von IGF1 im Maturationsmedium zu finden, um die hinzugegebene
Menge IGF1 nachzuweisen und diese im Verlauf der Zeit zu untersuchen.
5.4
Vergleichende
Expression
des
IGF1R
in
Stadien
der
frühen
Embryonalentwicklung
Für den Nachweis von IGF1 während der bovinen Embryonalentwicklung in vitro,
wurde die Expression des IGF1R sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene
untersucht. Diese eignet sich nachweislich, um eine Aussage über die spezifische
Signalweiterleitung von IGF1 zu treffen und als interner Qualitätsmarker in bovinen
99
Diskussion
___________________________________________________________________
und murinen Embryonen (LIU et al. 1997, KOWALIK et al. 1999, LONERGAN et al.
2003).
Die Auswertung der mRNA-Expression des IGF1R ergab ein stadienspezifisches
Muster. So wurde die größte relative Menge an IGF1R-Transkripten während des 2Zellstadiums detektiert, woraufhin ein signifikanter Abfall der Anzahl an Transkripten
zum 8-Zellstadium verzeichnet wurde. Im Anschluss kam es bis zum Stadium der
Blastozyste zu einem Anstieg der relativen Transkriptmenge. Dieses Muster
entspricht den Vorgängen, die während des maternal-embryonalen Übergangs
ablaufen (TELFORD et al. 1990). Zu Beginn der ersten Furchungsteilungen wird das
Entwicklungsprogramm des Embryos von maternalen Transkripten und Proteinen
bestimmt, die bereits während der Oogenese produziert wurden. Jedoch kommt es
schon bald zu einem Abbau und/oder zu einer erhöhten Translation dieser
Transkripte (TELFORD et al. 1990). Auch in dieser Arbeit wurde ein Abfall in der
Transkriptmenge des IGF1R vom 2- zum 8-Zellstadium beobachtet. Zwischen dem
8- und 16-Zellstadium beginnt die embryospezifische Produktion von Transkripten
und Proteinen, sodass es zu einem Anstieg der Transkriptmenge kommt. Dieser
Anstieg konnte in der vorliegenden Arbeit zwischen dem 8- und 16-Zellstadium für
den IGF1R nachgewiesen werden. Eine weitere Erhöhung der Transkriptmenge
wurde zwischen dem Stadium der Morula und der Blastozyste erfasst. Dieser lässt
auf eine erhöhte IGF1-Signalweiterleitung des Rezeptors schließen und deutet auf
die besondere Funktion von IGF1 während der Kompaktierung und der Bildung der
Blastozyste hin. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stimmen mit dem
Expressionsmuster aus vorherigen Arbeiten überein und weisen auf eine
entwicklungsrelevante
Funktion
des
IGF1-Systems
während
der
frühen
Embryonalentwicklung in vitro (YASEEN et al. 2001, LONERGAN et al. 2003).
Um diese Resultate mit der Proteinebene zu vergleichen, wurde zunächst nach
einem geeigneten Antikörper gesucht, der es ermöglicht, das Protein des Embryos
mit der Western blot - Methode zu quantifizieren. In der Literatur wurde diese
Methode zwar schon zur Quantifizierung von Proteinen in bovinen Embryonen
genutzt, jedoch gibt es bisher noch keine Studien, die sich mit dem Nachweis des
Insulin-like growth factor 1 - Rezeptorproteins beschäftigten. Bislang stellte meist die
100
Diskussion
___________________________________________________________________
große Probenmenge, die für einen Western blot benötigt wird, eine enorme Hürde für
viele Arbeiten dar, die nicht in Relation mit dem damit verbundenen Arbeitsaufwand
steht. Des Weiteren spielte die geringe Verfügbarkeit von kommerziell erhältlichen
Antikörpern für die Spezies Rind eine entscheidende Rolle. Dennoch wurden bereits
Studien
veröffentlicht,
in
denen
eine
stadienspezifische
Expression
entwicklungsrelevanter Proteine in bovinen Embryonen mit einem Western blot
erkannt
wurde
(GALL
et al.
2008, VIGNEAULT
et al. 2009).
In
einer
vorangegangenen Untersuchung wurde daher die Western blot - Methode zum
Nachweis des IGF1R-Proteins etabliert (POPPICHT 2010). In der nun vorliegenden
Arbeit konnte an das Ergebnis angeknüpft werden, dass zwar ein geeigneter
Antikörper zur Darstellung des IGF1R-Proteins gefunden wurde, dieser sich
allerdings nicht zur Quantifizierung des Signals eignete. Aus diesem Grund wurde
ein spezifischer Antikörper produziert, dessen größere Spezifität der Quantifizierung
des IGF1R-Proteins dienen sollte. Dennoch gelang es auch mit diesem Antikörper
nicht, ein aussagekräftiges Signal in bovinen Embryonen zu detektieren. Dies könnte
vor allem an der geringen Proteinmenge eines einzelnen Embryos liegen. Dabei
handelt es sich lediglich um etwa 0,152 µg Protein pro Embryo (THOMPSON et al.
1998). In den Versuchen wurden daher bis zu 100 Embryonen pro Western blot
gepoolt eingesetzt, was dennoch nicht ausreichte, um ein Signal zu detektieren.
Aufgrund dessen wurden weitere kommerziell erhältliche Antikörper zum Nachweis
des IGF1R getestet. Mit insgesamt drei weiteren Antikörpern gelang es nicht, das
Protein des Rezeptors nachzuweisen. Dieses Ergebnis lässt zum einen auf eine zu
geringe Spezifität der getesteten Antikörper schließen, die aufgrund kurzer
Sequenzlängen auftreten können, denn es besteht nachweislich ein Zusammenhang
zwischen der Bindungsstärke und Sequenzlänge. Zum anderen deutet das Ergebnis
des zuletzt getesteten Antikörpers (AVIVA systems biotechnology, CA, USA) auf eine
generelle fehlerhafte Funktionalität des Antikörpers hin, da es nicht zu einem
Nachweis des IGF1R-Proteins in der ausgewählten Positivkontrolle (humane
Plazenta) kommt, die nachweislich eine große Menge des Proteins enthält (FORBES
u. WESTWOOD 2008). Die Western blot - Versuche mussten daher ohne einen
erfolgreichen Abschluss beendet werden. Um dennoch eine Aussage über das IGF1-
101
Diskussion
___________________________________________________________________
Rezeptorprotein treffen zu können, wurde die Methode der Immunfluoreszenz
gewählt und mit dem spezifisch produzierten Antikörper anti-popp IGF1R (Seqlab,
Göttingen) durchgeführt. Für die Quantifizierung des Fluoreszenzsignals wurde die
mittlere Graustufenintensität eines festgelegten Bereichs ermittelt und mit der
Hintergrundfluoreszenz verrechnet (TOLIVIA et al. 2006). Das IGF1-Rezeptorprotein
konnte in allen Stadien der frühen Embryonalentwicklung detektiert werden, was zu
der Bestätigung einer anderen Studie führt (WANG et al. 2009). Erstmals konnte
jedoch eine stadienspezifische Proteinexpression des IGF1R nachgewiesen werden.
Die stadienspezifische Expression kennzeichnete sich durch ein Maximum während
des 2- bis 4-Zellstadiums, einen signifikanten Abfall der Signalstärke bis zum
16-Zellstadium und einen Anstieg der IGF1R-Proteinmenge bis zum Stadium der
Blastozyste.
Dieses
Ergebnis
entspricht
dem
zuvor
ermittelten
mRNA-
Expressionsmuster, mit einer zeitlichen Verschiebung von einer Furchungsteilung,
und damit den Vorgängen die während der MET ablaufen. So wurde nicht nur auf
mRNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene eine stadienspezifische Expression
des
IGF1R
aufgezeigt.
Schlussfolgernd
kann
dem
IGF1R
daher
eine
entwicklungsrelevante Funktion während der frühen Embryonalentwicklung des
Rindes zugeschrieben werden, da er sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene
in einem stadienspezifischen Muster exprimiert wird.
5.5 Schlussfolgerung
Die Umgebungsbedingungen der Eizelle im Follikel und daraus schließend die
Zusammensetzung des In-vitro-Maturationsmediums haben einen entscheidenden
Einfluss auf die Entwicklungskompetenz der Eizelle. So konnte in dieser Arbeit
verdeutlicht werden, dass eine Veränderung der Mediumbestandteile während der
bovinen Eizellreifung zu einer Verschlechterung der morphologischen, aber auch
molekularen Qualität resultierender Embryonen führen kann. Allerdings zeigte der
Großteil der untersuchten Transkripte in den resultierenden bovinen Embryonen
keine signifikante Veränderung in ihrer Expression. Daher ist es von großem
102
Diskussion
___________________________________________________________________
Interesse, eine Untersuchung der molekularen Qualität der Eizellen durchzuführen,
um den direkten Einfluss der Supplementation auf die Eizellqualität nachzuweisen.
Des Weiteren konnten vorherige Ergebnisse zur Wirkung von IGF1 während der
Maturation boviner Embryonen bestätigt werden. Es zeigte sich, dass eine
physiologische Konzentration an IGF1 (100 ng/ml), wie sie im bovinen Follikel
während des Östrus gemessen wurde, nicht zu einer Veränderung der Qualität
boviner Embryonen führte. Außerdem konnte beobachtet werden, dass der Zusatz
einer erhöhten Konzentration IGF1 (1000 ng/ml), die während der negativen
Energiebilanz nach der Abkalbung auftreten kann, zwar ebenfalls die Qualität von
Embryonen nicht beeinflusst, es aber zu einer signifikanten Reduzierung der Anzahl
gereifter Eizellen in vitro kommt. Die In-vitro-Simulation dieses komplexen Vorgangs
ergab, dass eine erhöhte Konzentration an IGF1 die Eizellreifung negativ beeinflusst.
Damit kann IGF1 als ein Faktor definiert werden, der in einer supraphysiologsichen
Konzentration zu einer verschlechterten Eizellqualität führen kann.
Die Untersuchung der Funktion von IGF1 in Bezug auf Apoptose während der frühen
bovinen Embryonalentwicklung resultierte nicht, wie in vorherigen Studien gezeigt
wurde, zu einer Verhinderung des Vorkommens von Apoptose. Die Hinzugabe der
Apoptose-induzierenden Faktoren Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin führte zu
einem signifikanten Anstieg der Anzahl TUNEL-positiver Zellen in bovinen
Embryonen, der durch die Supplementation zusammen mit IGF1 nicht reduziert
wurde.
Die Messung der IGF1-Konzentration im Medium, die erstmals in der vorliegenden
Arbeit vor Beginn und nach 24-stündiger Maturation durchgeführt wurde, ergab kein
eindeutiges Ergebnis. So konnten vier unterschiedliche Tests keine einheitlichen
Werte für die IGF1-Konzentration der einzelnen Supplementationsgruppen erzielen.
Ferner wurde mit keinem der Tests die Menge IGF1 gemessen, die vermeintlich
hinzugegeben wurde. Daher kann nicht eindeutig definiert werden, ob die erzielten
Ergebnisse allein auf der Supplementation mit IGF1 basierten. Weiterhin geben
diese unterschiedlichen Werte Anlass dazu, auch bereits veröffentlichte Studien
kritisch zu beurteilen.
103
Diskussion
___________________________________________________________________
Bei der Untersuchung der mRNA- und Proteinexpression des Insulin-like growth
factor 1 - Rezeptors während der frühen Embryonalentwicklung konnte ein
stadienspezifisches Muster nachgewiesen werden, das zu den Vorgängen der
maternal-embryonic transition passt. Erstmals wurden Ergebnisse der mRNAAnalyse des IGF1R mit denen auf der Proteinebene bestätigt. So zeigte sich indirekt,
dass die Proteinbiosynthese des IGF1R zunächst unter maternaler Kontrolle steht,
um dann mit voranschreitenden Furchungsteilungen auf eine embryo-spezifische
Transkription und Translation umgestellt zu werden. Dabei wurde der Rezeptor
durchgängig im Embryo detektiert, wodurch die Rolle von IGF1 während der frühen
Embryonalentwicklung als entwicklungsrelevant definiert werden konnte.
104
Zusammenfassung
___________________________________________________________________
6. Zusammenfassung
Friederike Poppicht
Bedeutung
des
Insulin-like
growth
factor
-
Systems
während
der
Oozytenreifung und präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mehr über die Funktion des Insulin-like
growth factor 1 und im Speziellen bei der Verhinderung von Apoptose während der
frühen Embryonalentwicklung des Rindes zu erfahren. Dies wurde zum einen durch
die Analyse der Expression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors auf mRNAund Proteinebene in bovinen Embryonen ermittelt. Zum anderen wurde der Einfluss
einer IGF1 - Supplementation des Mediums während der In-vitro-Reifung boviner
Eizellen auf die morphologische und molekulare Qualität der resultierenden
Embryonen untersucht. Dazu konnten in 121 IVP-Durchgängen insgesamt 12.872
Kumulus-Oozyten-Komplexe gewonnen, befruchtet und kultiviert werden. Zur
Untersuchung der Expression des IGF1R wurde eine RT-qPCR mit frühen
Embryonalstadien vom 2-Zeller bis zur expandierten Blastozyste durchgeführt.
Weiterhin fanden ein Western blot und eine Immunfluoreszenzfärbung Anwendung,
um
das
IGF1R-Protein
in
diesen
Stadien
zu
analysieren.
Für
die
Supplementationsversuche kam eine physiologische (100 ng/ml) oder eine
supraphysiologische Konzentration (1000 ng/ml) IGF1 zum Einsatz, die entweder
allein
oder
gemeinsam
mit
den
Apoptoseinduzierern
Actinomycin
D
und
S-(+)-Camptothecin dem Maturationsmedium supplementiert wurde. Die Inkubation
einer weiteren Gruppe KOK erfolgte in Medium mit Apoptoseinduzierern allein. Als
Kontrollgruppe diente sowohl eine Gruppe, dessen Medium den Lösungsvermittler
DMSO enthielt, als auch eine Gruppe, die ohne jeglichen Zusatz inkubiert wurde. Auf
morphologischer Ebene fand eine Untersuchung der Maturationsrate, der Teilungsund Entwicklungsrate, der Gesamtzellzahl, der Anzahl toter Zellen, der Lebend-TotZellratio und der Anzahl apoptotischer Zellen statt. Des Weiteren wurde auf
molekularer Ebene die Expression von sieben ausgewählten Genen in expandierten
Blastozysten analysiert (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, BCL2L1, SLC2A1,
105
Zusammenfassung
___________________________________________________________________
SLC2A3). Als Ergebnisse aus den Untersuchungen lassen sich folgende
Erkenntnisse festhalten:
1.
Die
durchschnittliche Kernreifungsrate
von
Eizellen
der Kontrollgruppe
(83,5 ± 6,9 %) war signifikant höher als in Eizellen, denen IGF1 (1000 ng/ml)
zugesetzt wurde (70,2 ± 6,0 %). Außerdem war in Eizellen, die mit
Apoptoseinduzierern allein oder zusammen mit IGF1 kultiviert wurden, die
Maturationsrate signifikant reduziert (P ≤ 0,05).
2.
Es konnte eine durchschnittliche Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % in Embryonen
der Kontrollgruppe und 62,2 ± 8,4 % in denen der DMSO-Gruppe erzielt
werden, die signifikant höher lagen als in der Gruppe IGF 1000 mit
Apoptoseinduzierern (52,7 ± 6,9 %; P ≤ 0,05).
3.
Die Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung wiesen
ebenfalls statistisch signifikante Unterschiede auf (P ≤ 0,05). So zeigte sich an
Tag sieben eine signifikant höhere Entwicklungsrate in Embryonen der
Kontrollgruppe (22,1 ± 6,4 %) im Vergleich zu Embryonen der Gruppen IGF 100
mit Apoptoseinduzierern (13,5 ± 7,4 %), IGF 1000 (13,6 ± 6,2 %) und IGF 1000
mit Apoptoseinduzierern (7,9 ± 4,7 %). An Tag acht der Kultivierung konnten bei
Embryonen der Kontrollgruppe (24,1 ± 8,5 %) erneut signifikant höhere
Entwicklungsraten erzielt werden als bei denen der IGF1-supplementierten
Gruppen mit Apoptoseinduzierern (15,4 ± 8,2 % bzw. 10,0 ± 4,8 %).
4.
Die
Untersuchung
der
Gesamtzellzahl
ergab
einen
Durchschnitt
von
134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste in der Kontrollgruppe, die im Vergleich zu
Blastozysten der Gruppe IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (110,7 ± 20,3)
signifikant höher ausfiel (P ≤ 0,05). Allerdings konnten keine Unterschiede in
der
Anzahl
toter
Zellen
zwischen
Blastozysten
der
Versuchsgruppen
beobachtet werden. Bei der Gegenüberstellung der Lebend-Tot-Zellratio konnte
jedoch eine signifikant größere Ratio in Blastozysten der Kontrollgruppe (19,1 ±
6,8) gegenüber denen der Gruppen DMSO (11,2 ± 4,7), Apoptoseinduzierer
(11,4 ± 5,6), IGF 100 (10,2 ± 5,1) und IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (8,8 ±
3,1) erkannt werden.
106
Zusammenfassung
___________________________________________________________________
5.
Bei
der
Untersuchung
von
Apoptose
in
Embryonen
wurden
in
der
Kontrollgruppe durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % TUNEL-positive Zellen pro
Blastozyste detektiert. Die Embryonen, die aus einer Maturation mit
Apoptoseinduzierern stammten, wiesen im Vergleich dazu eine signifikant
höhere prozentuale Anzahl apoptotischer Zellen auf (3,6 ± 1,9 %; P ≤ 0,05).
6.
Die Analyse der relativen Transkriptmenge ergab keine statistisch signifikanten
Unterschiede für die Gene IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, SLC2A1 und
SLC2A3. Die Expression von BCL2L1 war in Embryonen der Gruppe IGF 1000
mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen der anderen Gruppen
signifikant erhöht (P ≤ 0,05).
7.
Die Messung der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe verschiedener
kommerzieller Kits führte nicht zu einem eindeutigen Ergebnis. In allen
Supplementationsgruppen wurden ähnliche Werte gemessen, die nicht der
hinzugegebenen Konzentration IGF1 entsprachen.
8.
Die
Untersuchung
der
mRNA-Expression
des
IGF1R
in
frühen
Embryonalstadien zeigte ein stadienspezifisches Muster, welches die Vorgänge
der maternal-embryonic transition widerspiegelt. Zu Beginn der ersten
Furchungsteilungen konnte die größte, relative Transkriptmenge aufgezeigt
werden, woraufhin ein Abfall bis zum 8-Zellstadium verzeichnet wurde. Vom 16Zeller bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der
Expression registriert werden.
9.
Ein qualitativer Nachweis des IGF1-Rezeptorproteins war mit der Western blot Methode in expandierten Blastozysten möglich. Allerdings wurde aufgrund der
geringen Signalstärke keine Quantifizierung des Proteingehaltes durchgeführt.
10. Bei der Analyse des IGF1R mit einer Immunfluoreszenzfärbung in frühen
Stadien der Embryonalentwicklung konnte eine stadienspezifische Expression
detektiert werden. Dies zeichnete sich durch ein Maximum während des 2- und
4-Zellstadiums aus, woraufhin eine signifikante Abnahme bis zum 16-Zeller
folgte. Vom Stadium der Morula bis hin zur expandierten Blastozyste wurde ein
erneuter Anstieg der Proteinexpression des IGF1R gezeigt.
107
Zusammenfassung
___________________________________________________________________
11. Der Vergleich der spezifischen Expression des IGF1R auf mRNA- und
Proteinlevel zeigte ein ähnliches Muster, welches mit Vorgängen der maternalembryonic transition einhergeht und die Bedeutung des IGF-Systems während
der frühen Embryonalentwicklung des Rindes hervorhebt.
Schlussfolgernd kann daher zusammengefasst werden, dass IGF1 während der
präimplantatorischen Embryonalentwicklung eine entscheidende Rolle spielt, was
durch die stadienspezifische Expression sowohl auf mRNA- als auch auf
Proteinebene bestätigt wurde. Jedoch konnte eine Verhinderung von Apoptose durch
IGF1 im bovinen Embryo nicht beobachtet werden. Weiterhin kam es nicht zu einer
Verbesserung der Embryonenqualität durch den Zusatz einer physiologischen
Konzentration IGF1 während der Eizellreifung. Abschließend führte eine erhöhte
Konzentration IGF1, wie sie während der negativen Energiebilanz bei Milchrindern
während der Transitionsphase auftritt, zu einer negativen Beeinflussung der Qualität
boviner Embryonen.
108
Summary
___________________________________________________________________
7. Summary
Friederike Poppicht
Relevance of the Insulin-like growth factor system during oocyte maturation
and preimplantation embryonic development in cattle
The aim of the present study was to evaluate the function of the Insulin-like growth
factor 1 and specifically on apoptosis inhibition during preimplantation embryonic
development in cattle. On the one hand, this was investigated by analyzing the
expression of the insulin-like growth factor 1 receptor in bovine embryos at mRNA
and protein level. On the other hand, the influence of an IGF1 medium
supplementation during in vitro maturation of bovine oocytes was studied regarding
the morphological and molecular quality of the resulting embryos. Therefore, in a
total of 121 IVP runs 12.872 cumulus oocyte complexes were collected, matured,
fertilized and cultured. To analyze the IGF1R expression a RT-qPCR of early
embryonic stages from the 2-cell until the expanded blastocyst was performed.
Further on, a western blot and an immunofluorescence staining were used to
investigate the IGF1R protein. For the supplementation experiments a physiological
(100 ng/ml) or a supraphysiological concentration (1000 ng/ml) IGF1 were added
either alone or in combination with the apoptosis inducers actinomycin D and S-(+)camptothecin zo the IVM medium. Another group of COC was incubated only with
apoptosis inducers. DMSO alone in the maturation medium and medium without any
supplements served as controls. At morphological level the maturation rate, the
cleavage and developmental rates, the total cell number, the amount of dead cells,
the live-dead cell ratio and the number of apoptotic cells were analyzed.
Furthermore, at molecular level the expression of seven selected genes was
examined in expanded blastocysts (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, BCL2L1,
SLC2A1, SLC2A3). The following results were obtained:
1.
The average maturation rate of control group oocytes (83.5 ± 6.9 %) was
significantly higher compared to oocytes originating from IGF1 (1000 ng/ml)
supplementation (70.2 ± 6.0 %). Moreover oocytes stemming from a culture
109
Summary
___________________________________________________________________
with apoptosis inducers alone or together with IGF1 showed significant lower
maturation rates (P ≤ 0.05).
2.
An average cleavage rate of 60.6 ± 8.1 % in control group embryos and
62.2 ± 8.4 % in embryos of the DMSO group were achieved, which were
significantly higher as in embryos of the group IGF 1000 with apoptosis
inducers (52.7 ± 6.9; P ≤ 0.05).
3.
Developmental rates at day seven and eight of culture showed statistical
differences as well. At day seven, a significant higher developmental rate was
detected in embryos of the control group (22.1 ± 6.4 %) in contrast to embryos
of the group IGF 100 with apoptosis inducers (13.5 ± 7.4 %), IGF 1000
(13.6 ± 6.2 %) and IGF 1000 with apoptosis inducers (7.9 ± 4.7 %; P ≤ 0.05).
At day eight of culture, a significant higher developmental rate was obtained in
control group embryos (24.1 ± 8.5 %) compared to embryos of the IGF1 with
apoptosis inducers group (15.4 ± 8.2 % resp. 10.0 ± 4.8 %).
4.
On average, 134.9 ± 18.6 cells per blastocyst were counted in embryos of the
control group, which was significantly higher compared to blastocysts of the
group IGF 1000 with apoptosis inducers (110.7 ± 20.3; P ≤ 0.05). Although
there were no differences in the number of dead cells between blastocysts of
the different treatments, the comparison of live-dead cell ratio resulted in a
significant higher ratio in blastocysts of the control group (19.1 ± 6.8) to
blastocysts from DMSO (11.2 ± 4.7), apoptosis inducers (11.4 ± 5.6), IGF 100
(10.2 ± 5.1) and IGF 1000 with apoptosis inducers (8.8 ± 3.1).
5.
The analysis of apoptosis in embryos led to an average number of 2.1 ± 1.1 %
TUNEL-positive cells per control group blastocyst. In contrast to that, embryos
stemming from a maturation with apoptosis inducers showed a significant
higher percentage of TUNEL-positive cells (4.5 ± 2.1; P ≤ 0.05).
6.
No significant differences in the expression of IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX,
SLC2A1 and SLC2A3 could be detected in embryos of the different treatments.
The relative transcript abundance of the BCL2L1 gene was significantly
increased in embryos of the group IGF 1000 with apoptosis inducers in
comparison with embryos of all other groups.
110
Summary
___________________________________________________________________
7.
The measurement of the IGF1 concentration in media by different commercial
kits did not lead to a distinct result. Medium from all groups of supplementation
showed similar IGF1 concentrations, which were not consistent with the
supplemented amount of IGF1.
8.
The analysis of the IGF1R mRNA expression in early embryonic stages showed
a stage-specific pattern, which reflects the process of the maternal-embryonic
transition. At the beginning of the first cleavages the highest relative transcript
amounts could be detected. Thereupon, an expression decline until the 8-cell
stage was measured. From the 16-cell stage to the expanded blastocyst a
continuous increase of the relative transcript abundance was observed.
9.
A qualitative detection of the IGF1 receptor protein was possible in expanded
blastocysts employing a western blot. However, due to the weak signal strength
a quantification of the protein amount could not be performed.
10. A stage-specific expression of the IGF1R protein was detected in early stages
of embryonic development with immunofluorescence staining. This was
characterized by a maximum at the 2- to 4-cell stage, whereupon a significant
decrease until the 16-cell stage pursued. From the morula to the expanded
blastocyst a rise of the IGF1R protein expression could be observed.
11. The comparison of the specific IGF1R expression at the mRNA and protein
level showed similar patterns, which accompany the process of the maternalembryonic transition and emphasize the importance of the IGF system during
early embryonic development.
In conclusion, IGF1 plays an important role during preimplantation embryonic
development, which was confirmed by a stage-specific expression at the mRNA, as
well as at the protein level. However, a prevention of apoptosis by IGF1 in bovine
embryos could not be observed. Furthermore, no improvement of embryo quality due
to a physiological concentration of IGF1 during oocyte maturation could be achieved.
Finally, a higher concentration of IGF1 as seen during the negative energy balance in
high yielding dairy cows seems to have a negative influence of bovine embryo
quality.
111
Anhang
___________________________________________________________________
8. Anhang
8.1 Medien der IVP
Tabelle 17: PBS-Gebrauchslösung
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
g/l
9,7
Sigma-Aldrich
D 5773
Penicilline
IE/ml
50,0
Sigma-Aldrich
PENK
Streptomycinsulfate
µg/ml
50,0
Sigma-Aldrich
S 6501
Na-Pyruvate
µg/ml
36,0
Sigma-Aldrich
P3662
D-Glucose
mg/ml
1,0
Riedel-de-haen
16301
CaCl2 x H2O
µg/ml
133,0
Sigma-Aldrich
D 5773
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
Heparin
IE/ml
2,2
Serva
24900
BSA (Fraktion V)
mg/ml
1,0
Sigma-Aldrich
A 9647
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
TCM199
g/100 ml
1,5
Sigma-Aldrich
M 2520
Gentamycinsulfate
mg/100 ml
5,0
Sigma-Aldrich
G 3632
Na-Pyruvate
mg/100 ml
2,2
Sigma-Aldrich
P 3662
NaHCO3
mg/100 ml
35,0
Riedel-de-haen
31437
ad. X ml H2O
ml
100,0
Fresenius
Ampuwa
BSA (faf)*
mg/100 ml
100,0
Sigma-Aldrich
A 7030
Dulbecco’s phosphate
buffered saline
Tabelle 18: PBS-Complete
Tabelle 19: TCMair
pH durch Zugabe von 1M NaOH auf 7,2 einstellen
* nach Einstellung des pH dazugeben
112
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 20: TCM199-Gebrauchslösung
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
TCM199
g/100 ml
1,5
Sigma-Aldrich
M 2520
Gentamycinsulfate
mg/100 ml
5,0
Sigma-Aldrich
G 3632
Na-Pyruvate
mg/100 ml
2,2
Sigma-Aldrich
P 3662
NaHCO3
mg/100 ml
220,0
Riedel-de-haen
31437
ad. X ml H2O
ml
100,0
Fresenius
Ampuwa
BSA (faf)*
mg/100 ml
100,0
Sigma-Aldrich
A 7030
Suigonan* - PMSG
IE/ml
10,0
Intervet
Suigonan
IE/ml
5,0
- hCG
pH durch Rühren auf 7,4 einstellen
* nach Einstellung des pH dazugeben
Tabelle 21: Fert-TALP-Stocklösung
KonzenSubstrat
Einheit
Menge
tration
Produktnr.
Hersteller
(mM)
NaCl
mg/100 ml
665,8
114.0
Sigma-Aldrich
S 5886
KCl
mg/100 ml
23,9
3.2
Sigma-Aldrich
P 5405
NaHCO3
mg/100 ml
210,0
25.0
Riedel de Haen
P 3662
NaH2PO4 x H2O
mg/100 ml
4,1
0.3
Merck
S 5761
CaCl2 x 2 H2O
mg/100 ml
29,4
2.0
Sigma-Aldrich
C 7902
MgCl2
mg/100 ml
4,8
0.5
Sigma-Aldrich
M 2643
Phenolred
mg/100 ml
1,0
0.01µg/ml
Sigma-Aldrich
P 5530
Penicillinamine
mg/100 ml
0,3
20
Sigma-Aldrich
P 4875
Natriumlactate (60%)
mg/100 ml
186,0
10
Sigma-Aldrich
L 4263
ad. 100ml H2O
ml
Fresenius
Ampuwa
113
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 22: Fert-TALP-Gebrauchslösung
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
Fert-TALP Stocklösung
ml
10,14
Gentamycinsulfate
µg
50,0
Sigma-Aldrich
G 3632
BSA (Fraktion V)
mg
60,0
Sigma-Aldrich
A 9647
Na-Pyruvate
µg
280,0
Sigma-Aldrich
P 36623
Tabelle 23: Epinephrin-Lösung
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
Hypotaurin
mg
1,83
Sigma-Aldrich
E 4250
Na-Metabisulfit
mg
40,00
Fluka
71928
Na-Lactate (60 %)
mg
132,00
Sigma-Aldrich
L 4263
H2O
ml
10,0
Fresenius
Ampuwa
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
Hypotaurine
mg
1,09
Sigma-Aldrich
H 1384
H2O
ml
10,0
Fresenius
Ampuwa
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
Heparin
mg
2,82
Serva
24900
H2O
ml
10,0
Fresenius
Ampuwa
Tabelle 24: Hypotaurin-Lösung
Tabelle 25: Heparin-Lösung
114
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 26: HHE-Stocklösung
Substrat
Einheit
Menge
Epinephrin-Lsg.
M
4,0
Hypotaurin-Lsg.
ml
10,0
H2O
ml
26,0
Hersteller
Produktnr.
Fresenius
Ampuwa
Tabelle 27: HHE-Gebrauchslösung
Substrat
Einheit
Menge
HHE-Stocklsg.
µl
80,0
Heparin-Lsg.
µl
40,0
Tabelle 28: Fertilisationsmedium
Substrat
Einheit
Menge
Fert-TALP-Gebrauchslsg.
ml
2,0
HHE-Gebrauchslsg.
µl
120,0
Tabelle 29: Spermfilter-Gebrauchslösung
Substrat
Einheit
Menge
Hersteller
Produktnr.
Spermfilter
µl
900,0
Gynemed
3SF0010
Fert-TALP-Gebrauchslsg.
µl
100,0
115
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 30: SOF-Stocklösung A
Substrat
Einheit
Menge
NaCl
g/100ml
6,3
KCl
g/100ml
KH2PO4
Konzentration
Hersteller
Produktnr.
108
Sigma-Aldrich
S 5886
0,5
7,2
Sigma-Aldrich
P 5405
g/100ml
0,2
1,2
Sigma-Aldrich
P 5655
MgSO4
g/100ml
0,2
1,5
Sigma-Aldrich
M 2643
H2O
ml
98,4
Sigma-Aldrich
W 1503
Na-Laktat*
ml
0,6
Sigma-Aldrich
L 4263
Hersteller
Produktnr.
(mM)
4,2
*als letzte Reagenz hinzufügen
Tabelle 31: SOF-Stocklösung B
Konzentration
Substrat
Einheit
Menge
NaHCO3
g/100ml
2,10
25,0
Sigma-Aldrich
S 4019
Phenolred
g/100ml
0,01
1 mg / 100 ml
Sigma-Aldrich
P 5530
H2O
ml
100,0
Sigma-Aldrich
W 1503
Hersteller
Produktnr.
Sigma-Aldrich
P 3662
Sigma-Aldrich
W 1503
(mM)
Tabelle 32: SOF-Stocklösung C
Substrat
Einheit
Menge
Na-Pyruvate
mg
80,0
H2O
ml
10,0
Konzentration
(mM)
0,73
116
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 33: SOF-Stocklösung D
Substrat
Einheit
Menge
CaCl2 x 2 H2O
mg
262,0
H2O
ml
10,0
Konzentration
(mM)
1,78
Hersteller
Produktnr.
Sigma-Aldrich
C 7902
Sigma-Aldrich
W 1503
Hersteller
Produktnr.
Tabelle 34: Glutamin-Stocklösung
Konzentration
Substrat
Einheit
Menge
Glutamine
mg
292,0
Sigma-Aldrich
G 6392
Glutamin
H2O
ml
10,0
Sigma-Aldrich
W 1503
H2O
Hersteller
Produktnr.
(mM)
Tabelle 35: SOFaa-Kultivierungsmedium
Konzentration
Substrat
Einheit
Menge
Myo-Inositole
mg
50,0
2.77
Sigma-Aldrich
I 7508
Tri-Na-Citrate
mg
10,0
0.34
Sigma-Aldrich
S 4641
Gentamycine
mg
5,0
50µg/ml
Sigma-Aldrich
G 3632
H2O
ml
78,0
Sigma-Aldrich
W 1503
µl
100,0
0.2
Sigma-Aldrich
G 6392
Stocklsg. A
ml
10,0
4.2
Stocklsg. B
ml
10,0
Stocklsg. C
ml
1,0
Stocklsg. D
ml
1,0
BME 50x
ml
3,0
30µl/ ml
Sigma-Aldrich
B 6766
MME 100x
ml
1,0
10µl / ml
Sigma-Aldrich
M 7145
GlutamineStocklsg.
(mM)
117
Anhang
___________________________________________________________________
8.1 Medien für Proteinbestimmungen
Tabelle 36: Polyacrylamid-Gel
Substrat
Hersteller
Produktnr.
Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8)
Applichem
A 0843
Tris
Sigma-Aldrich
93362
SDS
Applichem
A 3950
APS
Merck
101200
TEMED
Serva
35930.02
Bromphenolblue
Serva
15375.02
BSA (Fraktion V)
Sigma-Aldrich
A 9647
SeeBlue®Plus2 Marker (SDS-PAGE)
Invitrogen
LC 5925
Detektionssubstrat
Pierce
34075
SuperSignal West Dura
Tabelle 37: Boehringer Lysepuffer
Substrat
Konzentration
(mM)
Hersteller
Produktnr.
Tris *
50
Sigma-Aldrich
93362
NaCl
150
Sigma-Aldrich
S 3014
NaF
40
Sigma-Aldrich
S 7920
EDTA
3
Merck
324506
EGTA
2
Sigma-Aldrich
E 3889
Nonidet P40
1%
Sigma-Aldrich
21-3277
Na-desoxycholat
0,1%
Applichem
A 1531
SDS
0,1%
Sigma-Aldrich
A 3950
Sigma-Aldrich
P 8340
Protease Inhibitoren
*pH auf 7,4 mit HCl einstellen
118
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 38: SDS-Probenpuffer (5x)
Substrat
Menge
Tris *
250 µl
Bromphenolblue
Konzentration
Hersteller
Produktnr.
Sigma-Aldrich
93362
1 µg
Applichem
A 2331
Glycerine
750 µl
Merck
356352
SDS
1 ml
0,1%
Applichem
A 3950
β-Mercaptoethanol**
20 µl
2%
Applichem
A 4338
Hersteller
Produktnr.
(mM)
1000
*pH auf 6,8 mit HCl einstellen
**erst vor Benutzung hinzugeben
Tabelle 39: 10x-Tris-Glycin-Puffer (TG)
Konzentration
Substrat
Menge
Tris
30,3 g
25
Sigma-Aldrich
93362
Glycine
144 g
192
Roth
HN07.3
ad. H2O
1000 ml
Hersteller
Produktnr.
(mM)
Tabelle 40: 10x-TBS
Konzentration
Substrat
Menge
Tris*
60,55 g
25
Sigma-Aldrich
93362
NaCl
90 g
150
Sigma-Aldrich
S 3014
ad. H2O
1000 ml
(mM)
*pH auf 7,4 mit HCl einstellen
119
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 41: TBS-T
Substrat
Menge
Tris*
60,55 g
NaCl
Konzentration
Hersteller
Produktnr.
25
Sigma-Aldrich
93362
90 g
150
Sigma-Aldrich
S 3014
Tween20
1 ml
0,1%
Merck
655205
ad. H2O
1000 ml
Hersteller
Produktnr.
Applichem
A 3950
Hersteller
Produktnr.
Roth
CP43.4
Hersteller
Produktnr.
Roth
CP43.4
(mM)
*pH auf 7,4 mit HCl einstellen
Tabelle 42: SDS-Laufpuffer
Konzentration
Substrat
Menge
10x TG-Puffer
100 ml
1x
SDS
10 ml
0,1%
ad. H2O
1000 ml
(mM)
Tabelle 43: Blottingpuffer
Konzentration
Substrat
Menge
10x TG-Puffer
100 ml
1x
Methanol
200 ml
20%
ad. H2O
1000 ml
(mM)
Tabelle 44: Blockierungslösung
Substrat
Menge
TBS-T
40 ml
Magermilchpulver
2g
Konzentration
(mM)
5%
120
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 45: Stripping-Puffer
Substrat
Menge
Glycine
15 g
SDS
Konzentration
Hersteller
Produktnr.
200
Roth
HN07.3
10 ml
1%
Applichem
A 3950
Tween20
100 µl
0,05%
Merck
655205
ad. H2O*
100 ml
(mM)
*pH auf 2,2 mit HCl einstellen
Tabelle 46: Paraformaldehyd-Lösung
Substrat
Menge
Konzentration Hersteller
Produktnr.
Paraformaldehyde
400 mg
4%
Sigma-Aldrich
158127
100 ml
Invitrogen
14190-136
Substrat
Menge
Konzentration Hersteller
Produktnr.
Triton X 100
1 mg
0,1 %
Sigma-Aldrich
93443
Invitrogen
14190-136
Dulbecco´s Phosphate
Buffered Saline
Tabelle 47: Triton-X100-Lösung
Dulbecco´s Phosphate
Buffered Saline
10 ml
Tabelle 48: Polyvinylpyrrolidon-Lösung
Substrat
Menge
Konzentration Hersteller
Produktnr.
Polyvinylpyrrolidon
10 mg
1 mg/ml
Sigma-Aldrich
PVP10
Invitrogen
14190-136
Dulbecco´s Phosphate
Buffered Saline
10 ml
121
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 49: BSA-Lösung
Substrat
Menge
Konzentration Hersteller
Produktnr.
BSA (faf)
30 mg
3%
Sigma-Aldrich
A 7030
Invitrogen
14190-136
Dulbecco´s Phosphate
Buffered Saline
10 ml
8.3 Medien für die Färbungen
Tabelle 50: PVA/PBS-Lösung
Substrat
Menge
Konzentration Hersteller
Produktnr.
Polyvinylalkohol
10 mg
0,1 %
Sigma-Aldrich
P8136
Invitrogen
14190-136
Dulbecco´s Phosphate
Buffered Saline
100 ml
Tabelle 51: Hoechst 33342-Stocklösung
Substrat
Menge
Konzentration Hersteller
Produktnr.
Hoechst 33342
2 mg
2 mg/ml
14533
ad. H2O*
1 ml
Sigma-Aldrich
Tabelle 52: Ethidium homodimer-Stocklösung
Substrat
Menge
Konzentration Hersteller
Produktnr.
Ethidium homodimer
1 mg
1 mg/ml
E1169
ad. H2O*
1 ml
122
Invitrogen
Anhang
___________________________________________________________________
8.4 Labormaterial und Geräte
Tabelle 53: Aufführung aller verwendeten Geräte
Geräte
Firma
Sitz
Bestellnummer
Blau-Filter für
Olympus
Hamburg
U-FBWA
Vilber Lourmat
Eberhardzell
Dynex MRXe Photometer
Magellan Biosciences
USA
99000210
Fluoreszenzmikroskop
Olympus
Hamburg
IX73
Gammacounter
Perkin Elmer
USA
2470-0150
Gammacounter
Berthold Technologies Gütersloh
LB200
Grün-Filter für Ethidium und PI
Olympus
Hamburg
U-FGW
Heracell 150i CO2 Inkubator
Thermo Fisher
Braunschweig
51026281
Mini-Protean Tetra Cell
Biorad
München
165-8025FC
Mini-spin Plus Zentrifuge
Eppendorf
Hamburg
5453000011
Monochrome CCD-Kamera
Olympus
Hamburg
DP73
Real-Time PCR Detection
Biorad
München
184-5096
Tecan Group
Männedorf
Immunfluoreszenz
Chemilumineszenz
Imagingsystem
System
Spectra II Photometer
Schweiz
Stereomikroskop
Olympus
Hamburg
SZX7
Thermocycler C1000
Biorad
München
185-2197
Thermocycler T1
Biometra
Göttingen
050-90
Thermoschüttler
Peqlab
Erlangen
90-TS-100
UV-Filter für Hoechst 33342
Olympus
Hamburg
U-FUW
Vakuumpumpe
KNF Laboport
Freiburg
Z288284
123
Anhang
___________________________________________________________________
Geräte
Firma
Sitz
Bestellnummer
Vortexer
Peqlab
Erlangen
90-V-1
Wärmeplatte
minitüb
Tiefenbach
HT200 W
Wasserbad
Memmert
Schwabach
ONE 10
Tabelle 54: Aufführung aller verwendeten Labormaterialien
Labormaterial
Firma
Sitz
Bestellnummer
Actinomycin D
Enzo Life Science
Lörrach
Deckgläschen
Carl Roth
Karlsruhe
NK75.1
Life technologies
Darmstadt
61021
Eppendorfgefäße (1,5 ml)
Eppendorf
Hamburg
30120086
IGF1
Sigma Aldrich
Steinheim
I3769
Kanüle G 20
B. Braun
Melsungen
4657500
Life technologies
Darmstadt
Dynal MPC®-S
micro-classic Pipettierhelfer
Brand
Wertheim
25900
Mikropipette The Stripper
Gynemed GmbH
Lensahn
MXL3-STR
Mikrotiterplatte
Greiner Bio one
Nitrocellulosemembran
Sigma Aldrich
Steinheim
GE10600016
Objektträger
Carl Roth
Karlsruhe
NK72.1
Pasteurpipette (Glas)
Carl Roth
Karlsruhe
4522.1
BML-GR3000005
Dynabeads® mRNA
DIRECT™ Micro Purification
Kit
Magnetic Particle
Concentrator
124
Kremsmünster
Österreich
655801
Anhang
___________________________________________________________________
Labormaterial
Firma
Sitz
Petrischale groß (60 mm)
Greiner Bio one
Petrischale klein (35 mm)
Greiner Bio one
S-(+)-Camptothecin
Enzo Life Science
single stripes
Biozym
Thermobehälter Duwer
KGW Isotherm
Karlsruhe
Thoma-Kammer
Carl Roth
Karlsruhe
T732.1
Whatman Papier
Sigma Aldrich
Steinheim
Z763187
Zentrifugenröhrchen (15 ml)
Greiner Bio one
Kremsmünster
Österreich
Kremsmünster
Österreich
Lörrach
Bestellnummer
628160
627160
ALX-350-015M050
Hessisch
Oldendorf
125
Kremsmünster
Österreich
188161
Anhang
___________________________________________________________________
8.5 Einzeldaten der durchgeführten Untersuchungen
Tabelle 55: Einzeldaten der Zellzahlfärbung mit Hoechst 33342 und Ethidium
homodimer
Laufende
Kontrolle
DMSO
Apop.
I100
I+A100
I1000
I+A1000
GZZ
TZ
GZZ TZ
GZZ TZ
GZZ TZ
GZZ TZ
GZZ TZ
GZZ TZ
1
113
4
104
3
118
14
96
8
115
9
101
8
122
3
2
170
8
131
19
134
11
89
10
110
11
120
2
108
9
3
126
11
92
11
153
13
108
5
117
10
156
25
88
8
4
160
8
154
7
149
18
108
12
114
9
96
7
120
17
5
124
5
109
7
133
11
146
22
94
4
132
5
122
11
6
148
12
136
12
147
18
107
8
112
8
172
6
120
11
7
112
8
101
11
91
15
92
18
127
5
151
18
83
13
8
147
8
120
14
120
8
143
11
107
9
147
6
103
3
9
139
8
103
8
170
4
114
8
10
134
9
118
8
120
7
86
19
11
130
8
126
5
152
14
12
127
8
13
156
8
14
149
4
15
110
5
16
114
4
Nr.
GZZ= Gesamtzellzahl; TZ= Anzahl toter Zellen
126
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 56: Einzeldaten der TUNEL-Analyse
Laufende
Kontrolle
DMSO
Apop.
I100
I+A100
I1000
I+A1000
GZZ T+
GZZ T+
GZZ T+
GZZ T+
GZZ T+
GZZ T+
GZZ T+
1
111
3
183
5
152
5
151
5
140
4
212
6
179
2
2
179
5
156
5
154
3
122
9
126
10
100
6
156
2
3
121
4
121
6
146
7
118
4
120
4
152
8
103
4
4
131
3
154
3
147
4
169
3
127
3
152
6
116
3
5
131
2
98
3
93
7
107
4
137
8
141
3
124
6
6
108
2
138
4
146
3
103
5
112
4
132
9
144
8
7
132
1
153
4
114
8
152
3
105
3
158
9
8
114
1
119
5
103
6
125
2
153
6
9
188
9
122
6
130
5
10
157
2
97
5
11
144
4
12
151
3
13
161
2
14
168
3
Nr.
GZZ= Gesamtzellzahl; T+= TUNEL-positive Zellen
Tabelle 57: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte IGF1R, IGFBP2 und
IGFBP4 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen
IGF1R
IGFBP2
IGFBP4
n
MW
SEM
n
MW
SEM
n
MW
SEM
Kontrolle
5
5,5
3,0
4
51,0
28,1
4
4,7
3,0
DMSO
3
2,2
2,5
3
22,9
16,6
3
2,7
2,7
Apop.
4
8,1
3,1
4
52,1
18,4
3
4,0
1,8
I100
3
1,8
1,6
3
32,6
18,6
3
2,1
1,1
I+A100
5
6,3
3,3
4
98,5
52,3
4
3,5
1,9
I1000
3
3,6
1,0
3
38,0
16,0
3
3,9
2,2
I+A1000
2
9,9
1,6
2
63,9
52,9
3
8,2
6,4
127
Anhang
___________________________________________________________________
Tabelle 58: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte BAX, BCL2L1, SLC2A1
und SLC2A3 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen
BAX
BCL2L1
SLC2A1
SLC2A3
n
MW
SEM
n
MW
SEM
n
MW
SEM
n
MW
SEM
Kontrolle
3
14,1
5,8
4
14,6
6,5
4
48,4
11,2
5
57,3
23,0
DMSO
3
20,9
15,0
3
9,8
8,1
2
23,0
21,0
2
20,9
16,4
Apop.
4
17,3
3,3
4
8,7
4,4
3
47,0
36,9
4
51,3
34,4
I100
3
11,4
5,2
3
7,3
1,0
2
20,2
14,2
3
32,8
31,2
I+A100
4
21,8
13,7
5
8,9
2,4
3
46,4
19,8
5
51,9
22,0
I1000
3
14,6
2,9
3
5,0
0,6
2
22,6
9,8
3
47,4
42,2
I+A1000
3
29,2
10,9
2
68,2
48,7
3
18,2
16,2
3
74,7
50,2
Tabelle
59:
Einzeldaten
der
mRNA-
und
Proteinanalyse
unterschiedlichen Stadien der Embryonalentwicklung
IGF1R mRNA
IGF1R Protein
n MW SEM n
MW
SEM
2-Zeller
4
62,8
24,3
8
1007,8
123,8
4-Zeller
3
47,4
18,1
9
934,1
165,0
8-Zeller
5
4,1
2,1
8
717,9
58,8
16-Zeller
4
6,2
1,7
8
417,6
54,3
Morula
6
15,9
4,8
9
577,7
35,0
Blastozyste
5
31,2
6,2
9
1319,6
116,3
Exp. Blastozyste 5
40,2
10,1
10
1215,3
110,5
128
von
IGF1R
in
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
9. Verzeichnisse
9.1 Abkürzungsverzeichnis
∆ct
Delta treshold cycle
°C
Grad Celcius
µl
Mikroliter
µm
Mikrometer
125I
Isotop Iod 125
Apop.
Apoptoseinduzierer
A
Adenin
aa
Aminosäurezusatz (amino acids)
Abb.
Abbildung
Add
Latein: zu
AEBSF
4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid
ANOVA
Varianzanalyse
BAX
Bcl2-assoziiertes X Protein
BCA
bicinchoninic acid
Bcl2
B-cell lymphoma 2
BCL2L1
B-cell CLL/lymphoma 2 like 1
bp
Basenpaare
BSA
bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
CA
Californien
ca.
circa
CCD
charge-coupled device
cDNA
complementary DNA
CO2
Kohlenstoffdioxid
ct
Treshold Cycle
C-Terminus
Carboxy-Terminus
D
DMSO
DMSO
Dimethylsulfoxide
129
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphate
dUTP
deoxyuridin
E
Tageseffizienz
E₂
Östradiol-17β
EA
Embryonenäquivalent
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
et al.
et alii (und andere)
faf
fatty acid free (fettsäurefrei)
FCS
fetales Kälberserum (fetal calf serum)
FD
Fold difference
Fert-TALP
Fertilisierungsmedium mit Tyrodes Albumin Laktat Pyruvat
FSH
Follikelstimulierendes Hormon
g
Erdschwerebeschleunigung
g
Gramm
GH
Growth hormone
GLUT
Glukosetransporter (ehemalige Bezeichnung)
GmbH
Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GnRH
Gonadotropin Releasing-Hormon
GOI
Gene of Interest
GRFi
Growth Hormone Releasing Factor
h
Stunde (hora)
H2O
Wasser
hCG
humanes Choriongonadotropin
HHE
Heparin-Hypotaurin-Epinephrin
HRP
Horseradish peroxidase
I 100
IGF1 in 100 ng/ml
I 1000
IGF1 in 1000 ng/ml
IE
Internationale Einheiten
IETS
International Embryo Transfer Society
IGF1
Insulin-like growth factor 1
130
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
IGF1R
Insulin-like growth factor 1 receptor
IGF2
Insulin-like growth factor 2
IGF2R
Insulin-like growth factor 2 receptor
IGFBP
Insulin-like growth factor binding protein
IRMA
Immunradiometrische Assay
IVC
In-vitro-Kultivierung (in vitro culture)
IVF
In-vitro-Fertilisierung
IVM
In-vitro-Maturation
IVP
In-vitro-Produktion
K
Kontrolle
Kcal
Kilokalorien (kilo calory)
kDa
kilo Dalton
KOK
Kumulus-Oozyten-Komplex
L-Domäne
Linker-Domäne
LH
Luteinisierendes Hormon
M
Molar
MA
Massachusetts
MAPK
Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MET
maternal-embryonic transition
mg
Milligramm
MgCl2
Magnesiumchlorid
min
Minuten
ml
Milliliter
mm
Millimeter
mM
Millimolar
mod.
modifiziert
MPC
Magnetic Particle Concentrator
mRNA
messenger ribonucleic acid
MW
Mittelwert
n
Anzahl
N2
Stickstoff
131
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
NCCD
Nomenclature Committee on Cell Death
Neg.
Negativ
ng
Nanogramm
nM
Nanomolar
ns
nicht signifikant
N-Terminus
Amino-Terminus
O2
Sauerstoff
OH
Hydroxygruppe
OPU
Ovum Pick-Up
P
Signifikanzwert
PBS
Phosphate buffered Saline
PCOS
Polyzystisches Ovarsyndrom
pg
Pikogramm
PI3K
Phosphoinositid-3-Kinase
PMSG
Pregnant Mare Serum Gonadotropin
PVA
Polyvinylalkohol
PVP
Polyvinylpyrrolidon
qPCR
quantitative Polymerase-Kettenreaktion
RI
Rnase Inhibitor
RNA
ribonucleic acid
rpm
rounds per minute
RT
Reverse Transkriptase
s
Sekunden
SD
Standardabweichung
SDS-PAGE
sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamidgelelektrophorese
SEM
Standardfehler des Mittelwertes
SLC
solute carrier
SLC2A1
solute carrier family 2 member 1
SLC2A3
solute carrier family 2 member 3
SNEB
severe (ausgeprägte) negative Energiebilanz
SOF
synthetic oviduct fluid
132
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
T
Tag
Tab.
Tabelle
Taq
Thermus aquaticus
TBS
Tris-buffered Saline
TBS-T
Tris-buffered Saline + Tween
TCM199
Tissue Culture Medium 199
TdT
deoxynucleotidyl transferase
TMB
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin
TUNEL
TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling
U
Units
USA
United States of America
UV
Ultraviolett
V
Volt
z. B.
zum Beispiel
α
alpha
β
beta
133
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
9.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Proteinstruktur des IGF1 (A; SATO et al. 1993) und IGF2 (B;
TORRES et al. 1995). Proteinketten sind vom N- (Rot) zum CTerminus (Blau) unter Verwendung eines RegenbogenfarbenSpektrums coloriert dargestellt.............................................................5
Abbildung 2:
Insulin-like growth factor System mit Darstellung der spezifischen
Signalübertragung (mod. nach HWA et al. 1999).................................7
Abbildung 3:
Darstellung des Energiehaushaltes während der Laktationsphase
des Rindes (mod. nach EMMICK et al. 2000) ................................... 10
Abbildung. 4: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion boviner
Embryonen (mod. nach LONERGAN 2007) ..................................... 12
Abbildung 6:
Schematische Darstellung des programmierten Zelltods (mod.
nach WEEDON et al. 1979) .............................................................. 21
Abbildung 5:
Schematische Darstellung der maternal-embryonic transition
während der präimplantatorischen Entwicklung boviner
Embryonen (mod. nach GRAF et al. 2014)
Abbildung 7:
24
Kumulus-Oozyten-Komplexe der Qualitätskategorie 1 (A) bis
5 (E) .................................................................................................. 35
Abbildung 8: Petrischale mit Einzelwells für die ölfreie Maturation boviner
Oozyten ............................................................................................ 36
Abbildung 9:
Repräsentative Darstellung einer Oozyte im Metaphase-II
Stadium angefärbt mit Hoechst 33342; ............................................. 40
Abbildung 10: Repräsentative Darstellung der Lebend-Tot-Färbung einer
expandierten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen (Hoechst 33342);
Rot: Tote Zellen (Ethidium homodimer und Hoechst 33342) ............ 47
Abbildung 11: Repräsentative Darstellung der TUNEL-Färbung einer expandierten
Blastozyste; Blau: TUNEL-negative Zellen (Hoechst 33342); Grün:
TUNEL-positive Zellen (TUNEL-Reaktionslösung) ........................... 49
Abbildung 12: Darstellung des Magnetic Particel Concentrators mit DynabeadLösung (Pfeil) .................................................................................... 51
134
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
Abbildung 13: Peptidsequenz des IGF1R mit gekennzeichneten Positionen der
getesteten Antikörper; hellgrau: α-Untereinheit (Aminosäure
1-710), weiß: β-Untereinheit (Aminosäure 711-1367), dunkelgrau:
Transmembrandomäne (Aminosäure 906-929) ................................ 61
Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen
Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag
sieben und Tag acht (MW + SD); a:b P ≤ 0,05 ................................. 70
Abbildung 16: Repräsentative Illustration der Kumuluszellexpansion in den
unterschiedlichen Versuchsgruppen nach 24-stündiger Maturation;
A: Kontrolle, B: DMSO; C: Apoptoseinduzierer; D: IGF 100, E: I+A
100, F: IGF 1000, G: I+A 1000.......................................................... 71
Abbildung 17: Repräsentative Darstellung der nukleären Stadien boviner Oozyten
während der Reifung mit Hilfe einer Hoechst 33342-Färbung; A:
Prophase I, B: Telophase I, C: Metaphase II ................................... 72
Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst
33342 und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote
Zellen ................................................................................................ 76
Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der
unterschiedlichen Supplementationsgruppen (MW + SD);
a:b P ≤ 0,05....................................................................................... 78
Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach
TUNEL- und Zellkernfärbung ............................................................ 79
Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und
-negativer Zellen in expandierten Blastozysten der
unterschiedlichen Supplementationsgruppen ................................... 80
Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten
Blastozysten der verschiedenen Supplementationsgruppen an
Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 ............................................. 81
Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3
und BAX in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen
Versuchsgruppen an Tag sieben ...................................................... 82
135
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1
und SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen
Versuchsgruppen an Tag sieben ...................................................... 82
Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf
der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 .......... 83
Abbildung 26: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des Peptidantikörpers
anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen); Unten: Ladungskontrolle
mit β-Aktin, 1: 50 Embryonen, 2-4: Positivkontrollen (bovine Leber,
Karunkel, Kotyledone)....................................................................... 84
Abbildung 27: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rα (santa cruz
biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin;
1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta .. 85
Abbildung 28: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen
Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rβ (santa cruz
biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin;
1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta .. 86
Abbildung 29: Repräsentative Darstellung der Proteinexpression des IGF1R im
2- (A), 4- (B), 8- (C), 16-Zellstadium (D), Stadium der Morula (E),
der Blastozyste (F) und der expandierten Blastozyste (G); Rot:
Zellkernfärbung mit Propidiumiodid, Grün: spezifische
Antikörperfärbung mit Hilfe des anti-popp IGF1R
(Seqlab, Göttingen) ........................................................................... 87
Abbildung 30: Darstellung der mittleren Graustufenintensitäten im Verlauf der
frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b:c P ≤ 0,05 ............. 88
Abbildung 31: Vergleich der relativen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R
während der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM), die
Proteinexpression wurde für Darstellungszwecke um ein
Zehnfaches verringert ....................................................................... 89
136
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
9.3 Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1:
Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum
Maturationsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche
Parameter der Embryonalentwicklung .......................................... 17
Tabelle 2:
Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum
Kultivierungsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche
Parameter der Embryonalentwicklung .......................................... 19
Tabelle 3:
Qualitätskategorien der Kumulus-Oozyten-Komplexe .................. 34
Tabelle 4:
Übersicht der Versuchsgruppen und ihrer jeweiligen
Mediumszusätze während der Maturation boviner Oozyten ......... 37
Tabelle 5:
Auflistung der verwendeten Testkits zum Nachweis von IGF1 ..... 41
Tabelle 6:
Mastermixe für die Reverse Transkription .................................... 52
Tabelle 7:
Pipettierschema der Reversen Transkription mit einem
Volumen von 20 µl ........................................................................ 53
Tabelle 8:
Übersicht der verwendeten Primer für die RT-qPCR von
Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen.................... 54
Tabelle 9:
Ansätze für die qPCR ................................................................... 55
Tabelle 10:
Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden
Gentranskripte .............................................................................. 55
Tabelle 11:
Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und
Entwicklungsraten der IVP-Versuche zur Gewinnung
expandierter Blastozysten für die Western blot - Versuche .......... 68
Tabelle 12:
Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie
Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen
Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung .............. 69
Tabelle 13:
Anzahl eingesetzter KOK, sowie Maturationsraten von Oozyten
der unterschiedlichen Versuchsgruppen ....................................... 73
Tabelle 14:
Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im
Medium mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vor und nach 24stündiger Oozytenmaturation ........................................................ 75
137
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
Tabelle 15:
Gesamtzellzahlen, Anzahl toter Zellen und Lebend-Tot-Zellratio
expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an
Tag sieben .................................................................................... 77
Tabelle 16:
Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen
expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an
Tag sieben .................................................................................... 80
Tabelle 17:
PBS-Gebrauchslösung ................................................................. 112
Tabelle 18:
PBS-Complete .............................................................................. 112
Tabelle 19:
TCMair .......................................................................................... 112
Tabelle 20:
TCM199-Gebrauchslösung ........................................................... 113
Tabelle 21:
Fert-TALP-Stocklösung ................................................................. 113
Tabelle 22:
Fert-TALP-Gebrauchslösung ........................................................ 114
Tabelle 23:
Epinephrin-Lösung ........................................................................ 114
Tabelle 24:
Hypotaurin-Lösung........................................................................ 114
Tabelle 25:
Heparin-Lösung ............................................................................ 114
Tabelle 26:
HHE-Stocklösung.......................................................................... 115
Tabelle 27:
HHE-Gebrauchslösung ................................................................. 115
Tabelle 28:
Fertilisationsmedium ..................................................................... 115
Tabelle 29:
Spermfilter-Gebrauchslösung ....................................................... 115
Tabelle 30:
SOF-Stocklösung A ...................................................................... 116
Tabelle 31:
SOF-Stocklösung B ...................................................................... 116
Tabelle 32:
SOF-Stocklösung C ...................................................................... 116
Tabelle 33:
SOF-Stocklösung D ...................................................................... 117
Tabelle 34:
Glutamin-Stocklösung ................................................................... 117
Tabelle 35:
SOFaa-Kultivierungsmedium ........................................................ 117
Tabelle 36:
Polyacrylamid-Gel ......................................................................... 118
Tabelle 37:
Boehringer Lysepuffer................................................................... 118
Tabelle 39:
10x-Tris-Glycin-Puffer (TG) ........................................................... 119
Tabelle 40:
10x-TBS ........................................................................................ 119
Tabelle 41:
TBS-T ........................................................................................... 120
Tabelle 42:
SDS-Laufpuffer ............................................................................. 120
138
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
Tabelle 43:
Blottingpuffer ................................................................................. 120
Tabelle 44:
Blockierungslösung ....................................................................... 120
Tabelle 45:
Stripping-Puffer ............................................................................. 121
Tabelle 46:
Paraformaldehyd-Lösung .............................................................. 121
Tabelle 47:
Triton-X100-Lösung ...................................................................... 121
Tabelle 48:
Polyvinylpyrrolidon-Lösung ........................................................... 121
Tabelle 49:
BSA-Lösung .................................................................................. 122
Tabelle 50:
PVA/PBS-Lösung.......................................................................... 122
Tabelle 51:
Hoechst 33342-Stocklösung ......................................................... 122
Tabelle 52:
Ethidium homodimer-Stocklösung ................................................ 122
Tabelle 53:
Aufführung aller verwendeten Geräte ........................................... 123
Tabelle 54:
Aufführung aller verwendeten Labormaterialien ........................... 124
Tabelle 55:
Einzeldaten der Zellzahlfärbung mit Hoechst 33342 und Ethidium
homodimer .................................................................................... 126
Tabelle 56:
Einzeldaten der TUNEL-Analyse .................................................. 127
Tabelle 57:
Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte IGF1R,
IGFBP2 und IGFBP4 in den unterschiedlichen
Supplementationsgruppen ............................................................ 127
Tabelle 58:
Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte BAX,
BCL2L1, SLC2A1 und SLC2A3 in den unterschiedlichen
Supplementationsgruppen ............................................................ 128
Tabelle 59:
Einzeldaten der mRNA- und Proteinanalyse von IGF1R in
unterschiedlichen Stadien der Embryonalentwicklung .................. 128
139
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Erklärung
___________________________________________________________________
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Bedeutung des Insulin-like growth
factor - Systems während der präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes“
selbstständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Doris Müller und Franziska Sechser (Unterstützung bei der IVP)
Dr. Nina Hambruch (Unterstützung bei Western blot Versuchen)
Sabine Feller (Unterstützung bei RIA/ELISA)
Juniorprof.
Marion
Piechotta
und
Martina
Baumgarten
(Durchführung
von
IRMA/ELISA)
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:
Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Anatomie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit
Tierärztlicher Ambulanz, Justus-Liebig-Universität Gießen
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die
vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit
entsprechend gemacht habe.
………………………………………………………………………………
Datum, Unterschrift
169
Danksagung
___________________________________________________________________
Danksagung
• Mein erster Dank geht an Prof. Dr. Christine Wrenzycki für die Bereitstellung
des Themas, die immerwährende große Hilfsbereitschaft während der
Versuchszeit und die zahlreichen Korrekturen bei der Anfertigung der Arbeit.
• Ein herzliches Dankeschön geht an die H. Wilhelm Schaumann Stiftung für die
finanzielle Unterstützung meiner Doktorarbeit.
• Danke an die Mitarbeiter der Firma VION GmbH in Bad Bramstedt und des
Fleischmarkts Olpe für ihre Geduld und Hilfe beim Sammeln der Ovarien.
• Ich danke außerdem Doris Müller für die Unterstützung im IVP-Labor und
Sandra Wilkening für die nette Einarbeitung und fortwährende Hilfe rund um
das Thema RT-qPCR, die netten Pausen und zahlreichen Bestellungen.
• Danke an Prof. Dr. Christiane Pfarrer und Dr. Nina Hambruch für die
Unterstützung bei den Western blot - Versuchen.
• Vielen Dank an Juniorprof. Dr. Marion Piechotta und Martina Baumgarten für
die Durchführung und Hilfe mit den Hormonanalysen in Hannover.
• Ferner danke ich meinen Mitstreitern in Hannover Nina, Nicole, Katharina,
Johanna, Katha und Basti für die vielen Fahrten zum Schlachthof und die
netten Stunden zusammen im Labor.
• Danke auch an Dr. Ana Kassens, die mir in Hannover immer eine große Hilfe
war und noch in Gießen Beistand per mail und Telefon geleistet hat.
• Nicht zu vergessen ist der Dank an meine Mitstreiter in Gießen Jule, Carina,
Judith und Nadja. Danke, dass ihr so viele Eizellen meiner Arbeit geopfert
habt und stets umsichtig mit meinen Launen umgegangen seid.
• Ein Dankeschön geht auch an die Kollegen in Gießen Sabine, Carmen,
Bettina und Gerhard, die stets meine zahlreichen Fragen beantwortet haben
und mir immer gern geholfen haben.
• Ein Riesen-Dankeschön geht an Franzi, unser fleißiges Bienchen im IVPLabor in Gießen. Ohne dich hätte ich die ganzen Versuche nie zu Ende
gebracht. Vielen lieben Dank für all die langen Abende und Samstage im
170
Danksagung
___________________________________________________________________
Labor und die ganze Hilfe. Halt den Laden weiterhin zusammen und lass dich
von den besser wissenden Doktoranden nie unter kriegen.
• Weiterhin danke ich Dr. Hanna Grothmann (für mich immer noch Stinshoff) für
die zahlreiche Hilfe in allen Lebenslagen, die Motivation, wenn es manchmal
gar nicht weiter ging und die Zeit in Gießen, die wir uns gegenseitig schöner
gemacht haben.
• Ich möchte zudem Danke sagen an alle meine neuen Kollegen am CeRA in
Münster. Danke Verena, dass du mich für diesen tollen Job ausgewählt hast
und mich jederzeit unterstützt. Und Danke an Prof. Stefan Schlatt und Prof.
Sabine Kliesch, die mich eingestellt haben und mir mit viel Verständnis und
Zeit für die Doktorarbeit sehr entgegen gekommen sind.
• Ich danke außerdem meinen Mädels in Hannover Bine, Sandra und Elly, die
mir die Zeit mit vielen Mädelsabenden versüßt, sich alles angehört und mich
stets aufgemuntert haben.
• Meinen Mädels aus der WG in Gießen, Sinah und Yasi, möchte ich Danken
für die gemeinsame Zeit. Ohne euch hätte ich es nicht so lange in Gießen
ausgehalten. Danke für die Motivation und die netten Stunden zusammen.
• Danke an alle aus meiner Clique, die in den letzten Jahren so viel Geduld mit
mir hatten und mir so viele abwechslungsreiche Wochenenden bereitet haben.
Ich habe so ein Glück mit euch allen. Ein besonderer Dank geht an Bibi für die
super schnelle Rechtschreibkorrektur!
• Ich danke zudem Annegret und Alfons, die stets Geduld mit mir hatten.
• Ein riesengroßer Dank geht an meine Familie. Meinem Schwesterherz Kati
möchte ich für die zahlreichen Telefonate und Aufmunterungen danken.
Mama und Papa, ihr habt mir immer beigestanden, in allen Lebenslagen und
Teilen meines Studiums. Danke für den Rückhalt und den Glauben an mich.
• Mein letzter und allergrößter Dank geht an Thomas. Ich möchte Dir unendlich
Danken für dein großes Verständnis und dein Vertrauen und dass du nie
aufgehört hast, mich zu unterstützen. In allen Höhen und Tiefen hast du bis
zum Schluss daran geglaubt, dass ich diese Arbeit fertigstelle und mir dabei
so viel Kraft gegeben. Danke, dass du immer für mich da warst. Ich liebe Dich.
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