Analytische Chemie II SS 2010 Mitschrift

Analytische Chemie II SS 2010
Selektivität ist eine Eigenschaft aus einer Menge von Objekten mehrere Objekte
auszuwählen. Analyten können in Gegenwart anderer störender Komponenten
nachgewiesen werden, die nachgewiesenen Substanzen haben dabei eine
Eigenschaft gemeinsam. zB. selektive Elektroden (F -, Na+, K+, H+ = pH-Elektrode)
Spezifität ist eine Eigenschaft aus einer Menge von Objekten ein Objekt
auszuwählen.
Systematik der analytischen Chemie:
I.
Grundlagen der Trennverfahren
Trennverfahren sind notwendig, weil:
 Die Selektivität spektroskopischer Methoden oder Sensoren nicht ausreicht,
da Begleitstoffe und Matrix stören.
 Mehrere Komponenten können in einem chromat. Durchgang bestimmt
werden = Multiverfahren
 Komplexität der Probe erfordert Trennung von der Matrix und Begleitstoffen.
Trennung erfolgt aufgrund einer spezifischen Eigenschaft (zB. Polarität)
Man unterscheidet zwischen:
 Präparative Trennmethoden (therm. Verfahrenstechnik): Destillation,
Kristallisation, Fällung, Filtration
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
Analytische Trennung: beruht auf unterschiedlichen
Wanderungsgeschwindigkeiten 2er Substanzen entlang einer Trennstrecke.
Hierbei unterscheidet man zwischen:
o Chromatographisches Verfahren: Verteilung zwischen 2 miteinander
nicht mischbaren Phasen (stationär – mobil) Grundlage: Adsorption
(Anreicherung an der Oberfläche einer Phase) LSC & GSC bzw.
Verteilung zwischen zwei nicht mischbaren Phasen LLC & GLC
o Nicht-Chromatographisches Verfahren: keine stationäre Phase, andere
Prinzipien: zB. (Kapillar-)Elektrophorese (elektrisch geladene Teilchen
in einem elektrischen Feld), Isotachophorese, Field-Flow
Fractionation(FFF)
Verteilung einer Komponente zwischen 2 nicht mischbaren Phasen
Nach Phasentrennung stellt sich das Verteilungsgleichgewicht ein:
Verteilungskoeffizient K = a2/a1 2: org. 1: wässrig
Gilt nur, wenn keine Dissoziation, Assoziation (Bildung von Dimeren, Oligomeren),
Komplexbildung oder Reaktion stattfindet.
zB. Ausschütteln von Organochlorpestiziden, endokriner Effekt: stören GGW des
Hormonsystems, Beeinträchtigung der Reproduktionsfähigkeit.
K wird oft als log KOW angegeben. (Octanol – Wasser)
Verteilung einer dissoziierenden Substanz zw. 2 nicht mischbaren Phasen
(1) Verteilungsverhältnis D = a2/(a1(undiss.) + a1(diss.)) hängt von K, Ks und pH ab
Ks = a1(diss.)*a1(H)/a1(undiss.) (2) a1(diss.) = Ks*a1(undiss.)/a1(H)
Verteilungskoeff. K umgeformt: (3) a2 = K*a1(undiss.)
(2) und (3) in (1) einsetzen: D = K*a1(undiss.) /(a1(undiss.) + Ks*a1(undiss.)/a1(H))
 D = K/(1+Ks/ a1(H)) wobei a1(H) ~ 1/pH
Interpretation: D wird groß, wenn:
K groß ist (sehr lipophile Substanz)
Ks klein ist (schwache Säure)
a1(H) groß ist (saure Lösung, kleiner pH-Wert)
Die pH-Abhängigkeit der Löslichkeit wird technisch zB. bei der Rauchgaswäsche
nach Verbrennungsprozessen genützt.
Vorteile chromat. Verfahren gegenüber Ausschütteln im Scheidetrichter:
(Halb)automatisierung möglich, weniger Lösungsmittel erforderlich  weniger Kosten
durch Ankauf und Entsorgung
K in Abhängigkeit von Masse des Analyten und Volumina der Phasen:
K = a2/a1 ~ c2/c1 = (m2/V2)/(m1/V1) = (m2/m1)/(V2/V1) = G/V
G = m2/m1 = Massenverhältnis
V = V2/V1 = Volumensverhältnis
 G = K*V Kapazitätsfaktor, gibt Ausmaß des Stoffübergangs an
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Verteilung einer Masse m0 nach einmaligem Ausschütteln
m0 = m1 + m2
K = G/V = m2*V1/m1*V2
m2 = K*m1*V2/V1
mit m1 = m0 – m2
m2 = K*(m0 – m2)*V2/V1 umgeformt nach m2
m2 = m0*K*V/(1+K*V)
extrahierte Masse
mit m1 = m0 – m2 m1 = m0/(1+K*V)
Für eine quantitative Trennung muss die extrahierte Masse 99,9% betragen, was mit
einem Verteilungskoeffizienten K von 999 in einen Extraktionsschritt mit V = 1
erreicht wird. Ist ein Extraktionsschritt nicht ausreichend, so ist eine multiplikative
(mehrstufige) Verteilung notwendig.
Multiplikative Verteilung
1) Einkomponentensystem
Mit V = 1  G = K, gesucht m1 und m2 nach n Extraktionsschritten
n = 1 m2(1) = m0*G/(1+G)
m1(1) = m0/(1+G)
n = 2 m2(2) = m1(1)*G/(1+G)
m1(1) = m1(1)/(1+G)
n
n = n m2(n) = ∑m0*G/(1+G)
m1(n) = m0/(1+G)n
Das n-fache Ausschütteln ist quantitativer als das Ausschütteln mit dem n-fachen
Volumen an zweiter Phase was mit einfachen Zahlenwerten nachgerechnet werden
kann.
2) Mehrkomponentensysteme
Trennung zweier Komponenten wird beschrieben durch den Trennfaktor oder
Selektivitätsfaktor α = K1/K2 > 1
Komponente 1 besser extrahiert
Für gleiche Konzentrationen und Volumina erfolgt eine quant. Trennung bei
m2(2)/m1(2) < 0,001 bzw. α > 1000, was in einem Trennschritt kaum zu erreichen ist.
Abhilfe: a) mehrstufige Trennung oder b) Gegenstromverteilung (auch mehrstufig)
Gegenstromverteilung nach Craig:
Nachteil: die Konzentrationen nehmen mit den Extraktionsschritten ab
Früher praktische Durchführung mittels Extraktionsbatterie nach Craig.
Heute Gegenstromverteilungschromatographie (CCC)
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Extraktion von Metallen
Erfolgt durch die Bildung eines organophilen bzw. hydrophoben Ionenpaares, das
insgesamt neutral geladen ist, die Ladung des Metallions wird durch die
Chelatliganden maskiert. Neutrale Metallchelate sind in der org. Phase gut, in der
wässrigen schlecht löslich.
Chelatbildner: zB. Thiocyanat, Dithizon, Oxin, Cupferon, EDTA
Durch die Veränderung der e--Verteilung kommt es häufig zu Farbänderungen.
Eine Trennung kann schon erfolgen, wenn Metalle nur spezifische Komplexe bilden,
zB. bildet Ni keinen SCN-Komplex, Co aber schon.
Extraktionsvorgang in 4 Teilschritten: Chelatbildner oft schwache org. Säure = HR
1) Verteilung:
(HR)aq  (HR)org
KHR = cHR org/cHR aq
+
2) Dissoziation
HR  H + R
KS = cH+*cR-/cHR
n+
3) Komplexbildung
M + nR  MRn
KB = cMRn/cMn+*cnR4) Verteilung des Komplexes (MRn)aq  (MRn)org
KMRn = cMRn org/cMRn aq
n+
+
∑:
(M )aq + n(HR) org  (MRn)org + n(H )aq
K‘∑
K‘∑ = KMRn*KB*KnS/KnHR
es wird durch KHR dividiert, da dieser Schritt die Extraktion
hemmt.
Verteilungsverhältnis D = cMRn org/cMRn aq = KMRn*KB*KnS/KnHR * cHR org/cH+ aq
D = K‘∑ * cHR org/cH+ aq
Damit hängt D und somit die Effizienz nur von der Reagenskonzentration cHR org und
dem pH-Wert ab. D wird größer mit steigender Reagenskonzentration und pH-Wert.
K‘∑ wird größer mit steigendem KMRn, KB, KS und mit sinkendem KHR
Die Trennleistung wird analog einem Mehrkomponentensystem bei konst. pH-Wert
und konst. Reagenskonzentration mit α = D1/D2 = KB1*KMRn1/KB2*KMRn2 beschrieben.
Die Trennung von Metallkomponenten kann durch pH-Einstellung(Puffer) gelingen.
zB. Metalldithizonate in CCl 4
Zusätzlich kann eine Extraktion von Komponenten verhindert werden, wenn sie
bevorzugt mit einem Maskierungsmittel (ebenfalls Komplexbildner wie zB. CN -)
wasserlösliche Komplexe bilden.
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II.
Theorie der Chromatographie
Chromatograph. Methoden sind die wichtigsten zur Trennung komplexer Gemische:
 (Hochdruck-)Flüssigkeitschromatographie (HPLC): flüssige mobile Phase
 Gaschromatographie (GC): gasf. mob. Phase
 Dünnschichtchromatographie (DC)
Können sowohl zur präparativen Trennung, als auch zu analytischen Zwecken
genützt werden.
Die Trennwirkung beruht auf der Einstellung eines dynamischen, selektiven GGWs
zwischen einer mob. und einer stat. Phase.
Einteilung der Verfahren nach den verwendeten Phasen:
mob. Phase
stat. Phase
Verfahren
flüssig
fest
LSC zB. DC, NP(normal
phase)-HPLC
flüssig
flüssig (immobilisiert)
LLC zB. RP(reverse
phase)-HPLC
gasförmig
fest
GSC zB.
GC(Adsorbtionsch.)
gasförmig
flüssig (immobilisiert)
GLC zB.
GC(Verteilungsch.)
Theorien der chromat. Trennung
 Trennstufenmodell
 Kinetische Theorie
 Dynamische Theorie
Durch math. Formeln kann die Konzentration der Analyten in Abhängigkeit von Ort
(der Trennstrecke) und Zeit berechnet werden.
Außerdem kann die chromat. Trennung und Leistungsfähigkeit berechnet und somit
optimiert werden.
Trennstufenmodell
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Beim Trennstufenmodell (oder Bodentheorie) werden kleine Bereiche angenommen,
in denen die GGW-Einstellung erfolgt. Ein solcher Bereich wird theoretische
Trennstufe (vgl. Verteilungsstufe nach Craig, theoretischer Boden bei Destillation in
der VT) genannt und besitzt eine gewisse Höhe. Über die gesamte Säulenlänge
erstreckt sich eine gewisse Anzahl von Trennstufen. Die Trennung wird mit dem
Übergang der Komponenten in die nächste Trennstufe und erneuter GGWEinstellung erklärt, dadurch kann auch die gaußsche Form der Peaks erklärt werden.
Die Effizienz nimmt mit steigender Zahl der Trennstufen und abnehmender
Trennstufenhöhe zu.
Kinetische Theorie
Folgende Annahmen werden getroffen:
 Verschiedene Stoffe durchwandern die Trennstrecke in unterschiedlicher Zeit
 Der eigentliche Stofftransport erfolgt mit konstanter Geschw. (=Flussgeschw.
der mob. Phase)
 Durch unterschiedlichen Verweildauern in bzw. an der stat. Phase durch
Verteilung bzw. Adsorption kommt es zu unterschiedlichen Retentionszeiten
Chromatogramm:
tm = Totzeit, Zeit, die eine nicht zurückgehaltene (keine WW mit stat. Phase)
Komponente für die Trennstrecke benötigt, Totzeit  durchschnittl. Flussgeschw. u
tRi = Retentionszeit, brutto-Retentionszeit, Maximum der Substanz detektiert
tri = korrigierte Retentionszeit, netto-Retentionszeit = tRi – tm, ist stoffspezifisch 
qualitative Information, Fläche  Quantifizierung
mit L = Säulenlänge folgt:
durchschnittl. Wanderungsgeschw. des Analyten
v = L/tR
durchschnittl. Wanderungsgeschw. des Laufmittels u = L/tm
Peaks haben Form einer Gaußschen Glockenkurve mit Maximum bei der
Retentionszeit tRi mit detektierter Konzentration Ci max
Die Gaußfunktion hat math. folgende Form:
f(x) = Höhe des Maximums*e-1/2*(x-m/σ)^2 m: Mittelpunkt, σ: Standartabweichung 
f(t) = Ci max*e-1/2*(t-tRi/σ)^2
die Fläche kann durch Integration berechnet werden
Das Peakmaximum Ci max ist proportional zur injizierten Probenmenge und umgekehrt
proportional zum Säulendurchmesser und zur Trennstufenhöhe H i. Mit geringem
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Säulendurchmesser und geringer Trennstufenhöhe kann also die Trennleistung
gesteigert werden.
WW der Komponente A mit stat. Phase wird beschrieben durch das VerteilungsGGW
 Verteilungskoeffizient KA = cA,stat/cA,mob
Zusammenhang zwischen Retentionszeit und Verteilungskoeffizient:
v = u*(Analytenstoffmenge in der mob. Phase/Gesamtstoffmenge des Analyten)
v=
Kapazitätsfaktor k`=K*Vs/Vm
vgl. Kapazitätsfaktor G = K*V
Mit Phasenverhältnis β = Vm/Vs folgt k`= K/β und v = u/(1+k`)
Ist β klein, d.h. Vs groß, so bleibt der Analyt lange in der Säule
mit k`=tr/tm können alle Größen aus den chromat. Daten berechnet werden.
Wird das Peakmaximum bei der Konzentration cA max detektiert, so ist genau die
Hälfte des Analyten im Volumen VR bereits eluiert, die andere Hälfte befindet sich in
der stat. Phase Vs und der mob. Phase Vm
Stoffbilanz: nR = ns + nm
VR*cA mob = Vm*cA mob + Vs*cA stat
VR = Vm + Vs*KA
Vr = VR – Vm = Vs*KA
Die kinetische Theorie beschreibt die Retentionen, befasst sich aber nicht mit der
Peakverbreiterung, was überwiegend auf Diffusionseffekte ( dynamische Theorie)
zurückzuführen ist. Können die Effekte, die zur Bandenverbreiterung führen, erklärt
werden, so hat man damit auch ein Maß für die Leistungsfähigkeit einer Säule, also
für die Trennleistung. Je schmaler die Peaks sind, desto mehr Komponenten können
auf der gleichen Trennstrecke, bzw. in kürzerer Zeit getrennt werden. Somit kann die
Trennleistung im Trennstufenmodell durch die Trennstufenhöhe H i bzw. die Anzahl
der theoretischen Trennstufen N beschrieben werden. Je kleiner die
Trennstufenhöhe ist, desto größer ist die Säuleneffizienz und damit die erzielbare
Auflösung. Die Auflösung beschreibt die Fähigkeit einer Säule, zwei Komponenten
zu trennen und ist abhängig von der Anzahl der Trennstufen.
Hi = L/N
N = 5,54(tR/b0,5)2 b0,5 = Halbwertsbreite (Breite auf halber Höhe) = 2,35σ
Theorie der Gaschromatographie
In der GC werden Retentionen mit Standards (homologe Reihe der n-Alkane,
ähnliche γ, SP steigen an) verglichen. Relative Retentionsvolumina können
angegeben werden durch:
Vrrel = Vr i/Vr st = tri/trst = (γst*pst°)/(γi*pi°) pi° = Dampfdruck der reinen Komponente,
γi = Aktivitätskoeffizient, Maß für die WW mit der stat. Phase
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Für den Dampfdruck einer Komponente in einer idealen Mischung (alle WW gleich,
Partialdrücke entsprechen den Molenbrüchen) gilt das Raoult`schen Gesetz:
pi = xi*pi°
In einer realen Mischung (WW sind nicht gleich, Raoult`sches Gesetz gilt nicht mehr)
wird das Raoult`sche Gesetzt mit dem Aktivitätskoeffizienten γ i,3 korrigiert.
pi = xi*γi,3*pi°
Für die Trennung zweier Substanzen gilt:
(p1/x1)/(p2/x2) = (p1°* γ1,3)/(p2°* γ2,3) ~ tr2/tr1 = Trennfaktor α
Um Retentionsgrößen mit Standards zu vergleichen, wurde der Kovats-Index /yT
eingeführt.
/yT = 100*z + 100*(log(tri)-log(trz))/( log(trz+1)-log(trz))
trz = korrigierte Retentionszeit des Alkans vor dem Analyten
trz+1 = korrigierte Retentionszeit des Alkans nach dem Analyten
Vorteil: Peaks können anhand ihres Kovats-Indizes identifiziert werden, unabhängig
von den Trennbedingungen.
Dynamische (NichtGGW-)Theorie
Da die vorangegangenen Theorien die Peakverbreiterung als Folge von
Diffusionsvorgängen und damit in Abhängigkeit von der Strömungsgeschw. nicht
erklären konnten, beschäftigt sich die dynamische Theorie mit diesen Effekten. Die
Bewegung der Moleküle wird als „zufällige“ Abfolge von Aufenthalten und
Wanderungen durch die Säule aufgefasst. Die Peakverbreiterung hat somit folgende
Ursachen:
 Eddy-Diffusion (Streudiffusion): Analyten legen nicht die gleiche Weglänge
zurück.
 Longitudinal-Diffusion: zufällige Bewegungen in und gegen die Stromrichtung.
 Stoffübergangswiderstand: der Phasenübergang erfolgt verzögert.
Die Trennstufenhöhe Hi in Abhängigkeit von der Flussgeschw. u (also eine Funktion)
wird beschrieben durch die van Deemter Gleichung:
Hi(u) = A + B/u + (C+D)*u
Allgemein sind zu große Flussgeschwindigkeiten zu vermeiden, da in diesem Fall die
GGW-Einstellung nicht ausreichend erfolgt.
A-Term: beschreibt die Streudiffusion (Eddy-Diffusion), die durch die stat. Phase
zustande kommt. Große Partikel  längerer Weg, Verbreiterung
A = 2*λ*d
λ = statistische Unregelmäßigkeit d. Packung, d = Partikeldurchmesser
B-Term: beschreibt Longitudinaldiffusion (Diffusion in Richtung der Längsachse)
B = 2*γ*Di,m Konstanten sind von T und v abhängig, >T und <v  mehr Diffusion
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C-Term: Diffusion in der mob. Phase
Es werden nur laminare Strömungen angenommen: Analyten im Zentrum einer
Strömung erreichen Oberfläche der stat. Phase schwerer.
D-Term: Diff. in der stat. Phase, groß, bei Partikeln mit großer Oberfläche (Krater)
Bei Kapillarsäulen ist keine Packung vorhanden, somit ist der A-Term 0.
Interpretation: A steigt mit der Partikelgröße und hat außerdem den größten Einfluss
auf die Trennstufenhöhe. A hebt die Funktion über den gesamten Geschw.bereich.
B/u ist eine Hyperbel, wird also mit steigender Flussgeschw. kleiner. (C+D)*u nimmt
aber mit u zu, womit die Funktion ein Minimum (optimaler Arbeitsbereich) ausbildet.
Eine weitere wichtige Kenngröße ist die Auflösung R (resolution). Die Auflösung
zweier (gleich breiter) Peaks ist definiert durch:
R = (tRj – tRi)/wb
mit wb = 4σRi wird R groß, bei großem ΔtR und kleiner σ.
Allgemein hängt die Auflösung Rij von folgenden Parametern ab:
Auflösung kann beeinflusst werden zB. durch T, Art der mob. und stat. Phase.
α = Selektivitätsfaktor Kj/Ki > 1 j-Komponente langsamer
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III.
Gaschromatographie
Bei der GC befindet sich der Analyt in der Gasphase. Die GC ist für alle Substanzen,
die bis 450°C (darüber therm. Instabilität des Analyten und der stat. Phase)
unzersetzt verdampfbar sind, einsetzbar. Sehr polare oder große Moleküle sind in
der Regel schwieriger zu verdampfen. Durch eine vorgeschaltete Derivatisierung (zB.
Veresterung, Acylierung, Silylierung) können auch polare oder wenig-flüchtige
Substanzen verdampft werden. Es reicht auch aus, wenn sich ein ausreichender
großer Anteil in der Gasphase befindet, der Dampfdruck ist dabei der entscheidende
Parameter. Die chromat. Trennung beruht nur auf der WW des Analyten mit der stat.
Phase. Die mob. Phase ist inert und hat eine reine Transportfunktion (carriergas). Die
GC ist apparativ einfach, populär und im Stande etwa 80% der Analyten auf der
schwarzen Liste zu analysieren.
Die GC besteht aus einer Gasversorgung mit
Strömungsregler, einem Injektor (Probeneinlass), der
termosthatisierten Säule, dem Detektor und der
Signalverarbeitung (Verstärker, PC, Schreiber usw.)
Trägergase
 He: sehr verbreitet, gute Trennleistung, teuer
 H2: bessere Trennleistung, explosiv
 N2: schlechtere Trennleistung, sicher, billig
Trennleistung hängt ab von der Molekülgröße, Diffusionsvermögen und der Viskosität
Injektor (Probeneinlass)
Funktion: schlagartige Verdampfung der Probe, längere
Probenaufgabe führt zu Peakverbreiterung.
Aufbau: beheizter Metallblock, Trägergasversorgung und
Säulenanschluss
Geringes Injektionsvolumen (0,1 – 10μl), bei Kapillarsäulen noch
kleiner (1nl). Automatisierung durch Autoinjektor + Autosampler
möglich.
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Charakteristika – Säulentypen
Gepackte Säulen (mit chromat. aktiver Substanz): erlauben größere Probenvolumina
da mehr stat. Phase vorhanden ist. Außerdem sehr robust. Nur 1/10 der Länge einer
Kappillarsäule, bei längeren gepackten Säulen, kommt es zu starkem Druckabfall.
 Konventionell gepackt: aus Stahl oder Glas, ID: 1-3mm, AD: 2-6mm, Länge:
0,5-3m
 Mikrogepackt: ID: 0,1-0,5mm, Länge < 1,5m
Kappillarsäulen (open tubular column): sehr geringe Probenvolumina  splitting,
durch die nicht-vorhanden Partikeln wird der A-Term der van Deemter Gleichung 0 
große Anzahl von Trennstufen  sehr gute Trennleistung (>Auflösung und
Empfindlichkeit). Außerdem können sehr lange Säulen gebaut verwendet werden
ohne störenden Druckabfall. Bestehen aus Glasfasern, außen beschichtet gegen
Scherspannung.
 Dünnfilmkappilarsäule (wall coated OT): ID: 0,1-0,5mm, typische Länge: 2050m
 Kapillaren mit beschichtetem Trägermaterial (support coated OT) oder (porous
layer OT): ID: 0,2-0,5mm,ähnliche Längen wie WCOT
Stationäre Phasen
Es gilt das Prinzip „Gleiches löst sich in Gleichem“ (Analyt  stat. Phase) Polarität
der stat. Phase sollte der, der Probenkomponenten entsprechen. Geordnet nach
steigender Polarität:
 Methylsilikone
 Methylphenylsilikon: Methylgruppen sind zu gewissem Prozentsatz durch
Phenylgruppen ersetzt
 Cyanopropylsilikone
 Methyltrifluoropropylsilikone
 Hochmulekulare Polyethylenglykole
Charakterisierung der stat. Phase durch Rohrschneider-Konstanten ΔI:
Es werden die Differenzen der Retentionsindizes (Kovats-Indizes) von Benzol(x),
Ethanol(y), Butanon-2(z), Nitromethan(u) und Pyridin(s) mit der völlig apolaren stat.
Phase Squalan gebildet. Durch die erhaltene Tabelle können die optimalen Phasen
zu Trennung zweier Komponenten gefunden werden. Der Kovats-Index erlaubt keine
Aussage über die Trennbarkeit.
Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD)
Aufbau: Thermostatisierter Metallblock mit 2
identischen Messzellen (1Messzelle, 1
Referenzzelle)
Funktionsprinzip: Änderung der
Wärmeleitfähigkeit des Gasstroms durch
Probenmoleküle, Heizdraht gibt Wärme an
Metallblock ab, Änderung des Widerstandes
messbar  Wheatstone`sche Brücke
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Vorteile: einfacher, billiger, robuster Aufbau, zerstörungsfrei (bezüglich der Probe) 
Serienschaltung möglich, relativ hoher linearer dynamischer Bereich LDR (Signal
nimmt mit c linear zu; 105)
Nachteile: unspezifisch (bei universeller Verwendung irrelevant), relativ
unempfindlich (>10ng)
Flammenionisationsdetektor (FID)
Funktionsprinzip: Probe wird in Wasserstoff/Luft-Plasma
geleitet und elektr. gezündet, org. Substanzen verbrennen
und bilden Kationen, deren Anzahl ~ zur Substanzmenge ist.
Die freigesetzten Elektronen werden von der
Sammelelektrode (Anode) aufgenommen und detektiert.
Vorteile: sehr empfindlich (10pg), extrem großer LDR (10 7), universell einsetzbar
Nachteile: Es werden nur oxidierbare C-Verbindungen detektiert, unempfindlich
gegenüber halogenierten, oxidierten C-Verbindungen, zerstörend
Stickstoff-/Phosphor-Detektor (NPD)
Aufbau: modifizierter FID, Rb-Salz-Perle befindet sich im
Brennraum
Funktionsprinzip: Rb-Salz-Perle unterdrückt Bildung von
Carbenium-Ionen und fördert stattdessen die Bildung von Noder P-haltige Anionen. Bei Folgereaktionen entstehen
detektierbare freie Elektronen.
Vorteile: selektiv gegenüber N und P (Pflanzenschutzmittelanalyse)
Nachteile: Empfindlich gegenüber Kontamination, zerstörend
Elektroneneinfangdetektor (ECD)
Aufbau: β-Strahler (schnelle e-, 63Ni oder Tritium) und
Gegenkathode (Anode) werden vom Gas umspült, N 2
beigemischt, falls nicht als Trägergas verwendet
Funktionsprinzip: schnelle e- (praktisch nicht einfangbar)
ionisieren N-Moleküle, die dann langsamere,
detektierbare e- freisetzten und diese werden als
konstanter Nullstrom detektiert. Befinden sich
Substanzen mit stark elektronegativen Substituenten
(Halogenide, Reste mit O) im Gas, so fangen diese die
e- ein und verringern den Nullstrom ~ zur Konzentration.
Vorteile: selektiv, sehr hohe Empfindlichkeit, besonders für vielfach halogenierte
Substanzen (Elektronen-abziehende Wirkung, <pg)
Nachteile: begrenzte Selektivität, geringer LDR, Response stark substanzabhängig
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Flammenphotometrischer Detektor (FPD)
Funktionsprinzip: Gas wird in H2-Flamme
verbrannt, P und S werden angeregt und
emittieren elementspezifisches Licht, welches mit
einem Photomultiplier detektiert wird.
P: 526nm, LDR 104, Empfindlichkeit: 10pg
S: 394nm, LDR < 103, Empfindlichkeit > 100pg
Vorteile: gute Selektivität für S bei mittlerer und P bei guter Empfindlichkeit
Nachteile: S nicht-linearer Response
Kopplungstechniken
Die selektiven Detektoren reichen für die eindeutige Analyse oft nicht aus,
besonders, falls die Zusammensetzung der Probe unbekannt ist. Daher sind andere
Detektoren notwendig, die charakteristische (spektroskopische) Informationen liefern.
 Kopplung von GC an spektroskop. Detektionstechniken = Kopplungstechniken
(hyphenated techniques):
 GC + Massenspektrometrie (GC-MS)
 GC + Fourier-Transforamtions-Infrarotspektroskopie (GC-FTIR)
 GC + Atomemissiondetektion (GC-AED)
IV.
Flüssigkeitschromatographie
Die Flüssigkeitschromatographie ist sehr bedeutend, da 85% aller org. Verbindungen
nicht unzersetzt verdampfbar sind, da sie zu polar oder hochmolekular sind und
daher nicht mittels GC analysiert werden können. Außerdem kann durch Variation
der mobilen und stat. Phase (R in Abhängigkeit von α und k`) die Selektivität
beeinflusst werden. Anders als bei der GC wechselwirkt der Analyt nicht nur mit der
stat. Phase, sondern auch mit der mob. Phase, die bei der GC nur Transportfunktion
hatte.
Gebräuchliche Phasen:
stat. Phase
Kieselgel (evtl. modifiziert)
Aluminumoxid
Polyamid
Cellulose
Papier
Aktivkohle
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mob. Phase (Eluotrope Reihe, geordnet nach
steigender Polarität und somit steigender
Elutionskraft = Flussgeschw. bezgl. NP-LC)
Hexan
CCl4
Benzol
Dichlormethan
Chloroform
Ether
EEEther
Aceton
Isopropanol
Ethanol
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Methanol
Wasser
NP: normal phase, stat. Phase ist polar, zB. unmodifiziertes Kieselgel
Interpretation der Reihe:
 Polare Analyten werden stärker zurückgehalten (Prinzip: Gleiches löst sich in
Gleichem).
 Elutionskraft der mob. Phase nimmt mit Polarität zu.
 Retentionszeit wird kürzer, je stärker die Elutionskraft der mob. Phase ist.
Bei RP: reverse phase, kehren sich die Aussagen um
Papier(PC)- und Dünnschichtchromatographie(TLC)
Planare Chromatographie: flache, dünne stat. Phase. (Papier, Kieselgel oder
Aluminiumoxid auf Trägermaterial aufgebracht), geringe Probenvolumina werden mit
Mikropipette oder Kapillare aufgetragen, die Plättchen werden in Lsg.mittel-Kammern
entwickel, nach Abbruch des Trennlaufes wird die Position der Analyten relativ zur
Laufmittelfront ausgewertet.
Rf = Strecke des Analyten/Strecke des Laufmittels
PC: ascending & descending
Durch Sprüh- oder Tauchreagenzien können die Flecken sichtbar gemacht werden
(Derivatisierung, zB. Plättchen mit Fluoreszenzfarbstoff imprägnieren, durch
Reflexionsmessung sogar (Halb-)quantifizierung möglich). Neben der gewöhnlichen
eindimensionalen DC gibt es außerdem die Zirkular-Technik, die 2D-Technik und die
TRT (Trennungs-Reaktions-Trennungs)Technik
Typische stat. Phasen:
 wässrig: Wasser wird gut von Cellulose adsorbiert, Auftrennung polarer
Substanzen
 hydrophil: Methanol, Formamid, Glycol, Glycerin an Cellulose adsorbiert
 hydrophob: Papier zuerst acetyliert, dann mit Siliconöl imprägniert.
Aromatische oder aliphatische KW als Laufmittel
Typische mob. Phasen:
für hydrophile Substanzen: bla
schwach hydrophile: bla
hydrophobe: bla
Vorteile der DC:
 alle Trennprinzipien realisierbar
 Schnelle Trennung: kann abgebrochen werden, viele Trennungen gleichzeitig
 Gute Empfindlichkeit
 Zahlreiche Detektionsmöglichkeiten
 Qualitative und quant. Aussage
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
Minimaler Aufwand, geringe Kosten, proportional gute Leistung  Vorprobe
für Säulen
Säulenchromatographie
Klassische Niederdruck-SC (LC) – beruht auf Adsorption
Flash-Chromatographie
Charakteristika: Adsorptionschromatographie, routinemäßige Reinigung org.
Substanzen, mittlere Auflösung, rasche und preiswerte Auftrennung großer Mengen
(10g), stat. Phase: Kieselgel mit relativ großem Partikeldurchmesser  van Deemter:
mittlere Trennleistung, Detektor: Brechungsindexdetektor
Vorteile Flash-SC gegenüber Niederdruck-SC:
Bessere, schneller Trennung, billiger, da viel weniger Lsg.mittel und Zeitersparnis
Hochdruck-/Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Verteilungschromatographie, das Trägermaterial
sollte möglichst klein und gleichmäßig sein,
durch die dichteren Packungen kommt es jedoch
zu Druckabfall. Die selektiven Trennphasen sind
an der Oberfläche des Trägermaterials
immobilisiert. (chem. Modifikation, typisch:
Silanisierung)
Typische Parameter: 5-30cm lang (limitiert durch
Druckabfall), 1-4mm ID, Partikeldurchmesser 310μm, Druck bis 400 bar (in Spezialfällen sogar
1kbar), 50.000 Trennstufen/m  ca.
10.000/Säule, im Vergleich GC: 4.000/m, bei
25m : 100.000/Säule
Vergleich LC: 10-50mm ID, Druck < 2bar, Partikel 100-200μm
Bauteile
Thermostat: GGW sind Temperatur-abhängig, Druck führt zu Reibung und damit zu
zusätzlicher Wärme, für reproduzierbare Ergebnisse muss die Säulentemp.
unabhängig von der Umgebung sein.
mehrere Vorratsbehälter mit div. Laufmitteln
Vorrichtung zur Entfernung gelöster Gase (Entgaser): Kompressibilität der Gase
führt zu Problemen
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HPLC-Pumpen:
Fördern Laufmittel gegen großen Strömungswiderstand der stat. Phase und hohen
Säulendruck, konstante Flussrate erforderlich
Kugelventile (aus industr. Saphir, in Ventilsitz) regeln
Laufmittelzu- und Abfuhr. Volumen sehr genau einstellbar,
jedoch diskontinuierlicher Druckaufbau durch
Einkolbenpumpe. Überlagerung mit 2. Pumpe im Gegentakt
und zusätzlicher Dämpfung führt zu relativ konstantem Druck.
 Doppelkolbenpumpe, Die Laufmittelzufuhr zu den Pumpen
erfolgt durch Kunststoffleitungen (Niederdruck), die Abfuhr
durch Mittelstahlleitungen
Bei der Laufmittelzufuhr unterscheidet man zwischen:
 Isokratischer Elution: konstante Zusammensetzung, stark zurückgehalten
Substanzen geben breite Peaks (schlechter zu quantifizieren), Zeitaufwand
und Laufmittelvolumen steigt.
 Gradientenelution: Durch die Änderung der Zusammensetzung der mob.
Phase mit der Zeit wird die Elutionskraft gesteigert und somit eine bessere
Trennleistung erreicht: spät detektierte, breite Peaks eluieren früher und
schmaler. Zur Realisierung gibt es Niederdruck- und Hochdrucksysteme
Niederdruck-Gradientensystem
Getrennte Pumpen fördern je nach Zusammensetzung und
mischen verschiedene Laufmittel in der Mischkammer, das
Gemisch wird dann mit einer Hochdruckpumpe der Säule
zugeführt.
Nachteil: Verwendung einer Mischkammer führt zu großem
Totvolumen (Volumen an mob. Phase, das zum Füllen aller
Hohlräume benötigt wird, verschlechtert Trennleistung).
Hochdrucksysteme
Mischung erfolgt bereits mit Hochdruckpumpen, die mit Proportionalventilen
ausgestattet sind. Öffnungen/Sekunde der einzelnen Laufmittel mit hoher Frequenz
bestimmen die Zusammensetzung.
Vorteile: fast kein Totvolumen, einfachere Handhabbarkeit, Zusammensetzung
besser reproduzierbar.
Probeneinlasssystem
Prinzipiell ist das Injizieren gegen 400bar nicht möglich, daher erfolgt die
Probenaufgabe drucklos oder über ein Sechsweg-Ventil.
Load-Position: Probenschleife wird über
Nadeleinlass befüllt, Pumpe fördert Laufmittel.
Das Probevolumen kann durch Variation der
Schleife eingestellt werden, typisch: 1-50μl
Inject-Position: Probe wird durch die Pumpe, die
jetzt auf die Schleifenleitung drückt, auf die
Säule aufgebracht.
Vorsäule: billige, kurze Schutzsäule mit größeren Partikeln, bei Störung (Fällung,
Verunreinigung, Verstopfung) wird zuerst diese beschädigt und die teurere Säule
kann evtl. gerettet werden.
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Stationäre Phase
In 5-30cm langen Stahlsäulen, wichtiger als mob. Phase, bestimmt Selektivität der
Trennung  muss entsprechend dem Trennproblem gewählt werden. Sehr populär:
Silicagel weil es sehr druckbeständig und chemisch modifizierbar ist. Durchmesser
der Partikel: 3-10μm mit Mikroporen  extrem große spezifische Oberfläche
Man unterscheidet zwischen:
 normal phase: polare stat. Phase (unmodif. Kieselgel oder Aluminiumoxid),
apolare mob. Phase (Hexan, chlorierte Lsg.mittel)
 reverse phase: apolare stat. Phase (modif. Kiselgel), polare mob. Phase
(Wasser, Methanol, Acetonitril)
NP-HPLC: Trennung durch adsorptive WW der Analytenmoleküle mit den SilanolGruppen oder der hydratisierten Oberfläche des Aluminiumoxids, Trennvorgang stark
vom Wassergehalt abhängig (Hydratisierung der Oberfläche, Veränderung der
Retentionszeiten), heute nur untergeordnete analytische Bedeutung, da die GC
(mittelpolare, apolare Substanzen verflüchtigbar) das Anwendungsgebiet mit
besserer Trennleistung abdeckt, aber noch präparative Bedeutung.
RP-HPLC: Kieselgel wird mit (Phenyl, Alkyl (C2 – C18), Cyano) Resten modifiziert,
größer werdende Reste halten apolare Substanzen stärker zurück, Wassergehalt
kaum Einfluss.
Elutionsreihenfolge für 3 Substanzen
abnehmender Polarität A > B > C
Bei der NP-HPLC kann die Elution durch
ein polareres Laufmittel beschleunigt
werden (da langsamste Komponente nun
schneller eluiert), bei der RP-HPLC
durch sehr apolare.
Einfluss der Partikelgröße auf die Trennung:
Kleiner werdende Partikel ändern die Retentionszeit und die Selektivität nicht,
verbessern aber die Trennleistung, van Deemter Gleichung: Trennstufenhöhe ist
stark von der Partikelgröße abhängig: höhere Flussgeschwindikeiten realisierbar.
HPLC-Detektoren
Man unterscheidet zwischen Detektoren, die:
 stoffspezifische Eigenschaften detektieren (Absorbtion im UV/VIS oder IR,
Fluoreszenz, MS) = analytselektive Detektoren
 Lösungseigenschaften selektiv detektieren (Brechungsindex, Leitfähigkeit) =
bulk-Eigenschafte
Brechungsindexdetektor
Eine Messzelle wird auf einer Seite von reinem Lsg.mittel als Referenzlösung, auf
der anderen Seite vom Eluat durchflossen, dabei wird ein einfallender Lichtstrahl
gebrochen, falls gerade eine Analyt eluiert. Aus dem Brechungswinkel kann auf den
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Brechungsindex geschlossen werden. Die Abweichung ist abhängig vom
Brechungsindex des Analyten und von der Konzentration, die Differenz zum reinen
Lsg.mittel (keine Gradientenelution möglich) bestimmt die Empfindlichkeit, Analyten
mit sehr ähnlichen Brechungsindizes können daher schwerer detektiert werden.
Detektion des Lichtstrahls erfolgt entweder an einer einzelnen Photodiode, die die
Lichtintensität misst, oder an einem DAD, der die Verschiebung misst.
Der RI-Detektor kommt in 2 Ausführungen vor:
 Reflexions-Technik
 Ablenk-(Defelxions-)Technik
UV/VIS und DA-Detektor
Prinzip: Sind die am häufigsten eingesetzten Detektoren für HPLC.
Funktionsweise: ein (monochromatischer) Lichtstrahl wird durch spezifische
Absorption der Probe abgeschwächt. Die Absorption hängt mit der Konzentration
nach dem Lambert-Beer`schen Gesetzt zusammen.
Messzellen werden sehr kleine gehalten (μl, wegen Totvolumen).
Messbereich: 190-850nm
Typ1: Festwellenlängen-Detektor: Mit einem Monochromator wird aus einer
polychromatischen Strahlungsquelle eine Wellenlänge herausgefiltert, durch die
Messzelle geleitet und detetktiert.
Vorteile: hohe Lichtstärke  gutes Signal/Rausch-Verhältnis
Nachteil: keine spektrale Information
Typ2: Photodiodenarray-Detektor (DAD)
Polychromatisches Licht wird durch die
Messzelle geleitet (Z-förmiger Verlauf). Nach
Absorption wird das Licht am Gitter spektral
zerlegt und auf ein Diodenarray geleitet.
Vorteil: gesamtes Spektrum wird erfasst  3DChromatogramm
Nachteil: geringere Empfindlichkeit durch
schlechteres Signal/Rausch-Verhältnis
Fluoreszenzdetektor
Elektrochemischer Detektor
Leitfähigkeitsdetektoren (konduktometrisch): verbreiteter bei der IC
Polarographischer Detektor: Elektrochemisch aktive Substanzen (oxidierbar,
funktionelle Gruppen  sehr universell) werden durch Stromfluss detektiert, der
Strom ist ~ zur Konzentration. Durch das eingestellte Elektrodenpotential kann
gewisse Selektivität erzielt werden. Multi-Elektroden-Arrays liefern mehr
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Informationsgehalt. Eluierte Flüssigkeit wird zuerst an einer Arbeitselektrode und
anschließend an einer Referenelektrode vorbeigeleitet.
Die HPLC wird unter anderem in der Umweltanalytik (Pestizide), Pharmaanalytik
(Wirkstoffe), industr. Analytik (Polymere) und Bioanalytik eingesetzt.
Spezielle HPLC-Techniken
 Größenausschluss-Chromatographie (Gelpermeations-C): Trennt Analyten
nach Größe ~ Molekulargewicht
 Ionenchromatographie: trennt Ionen (Kat/Anionen verschiedene Richtung)
 Bioaffinitätschromatographie: zur Trennung von Biomolekülen (Enzyme,
Antikörper)
Gelpermeations-C (GPC) bzw. Größenausschluss-C (SEC)
Trennprinzip: Probe wird über ein Gel (stat. Phase) mit nm-Poren geleitet. Kleine
Moleküle treten in die Poren ein, haben daher längere Diffusionswege und
Retentionszeiten als größere Moleküle.
Stat. Phase: Silica-basierende Materialien mit kontrollierter Oberflächenporosität im
nm-Bereich (controlled pore glass, CPG) oder unterschiedlich stark quervernetzte
Polymere.
Anwendung: zur Trennung großer Moleküle; aus der Retentionszeit kann auf die
Molekülgröße und somit auch auf das Molekulargewicht geschlossen werden, falls
die nötige Symmetrie vorhanden ist.
In der Polymeranalytik: Bestimmung von MG und Polymerisationsgrad-Verteilung
Bioanalytik: Bestimmung von MG von Biomolekülen
Ionenaustausch- und Ionenchromatographie
Ionenaustauschchromatographie (IEC) wird zum Abtrennen, Ionenchromatographie
(IC) wird zur Auftrennung geladener Teilchen (anorg. Ionen, kleine org. Ionen, auch
Biomoleküle) genutzt.
Stat. Phase: polymere Netzwerke oder Silikapartikel mit jeweils ionischen
Ankergruppen an der Oberfläche
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Arten von Ionenaustauschern
Ankergruppe
Kationenaustauscher SO3- (Sulfonsäure, stark sauer)
COO- (Carbonsäure, schwach sauer)
Anionenaustauscher NR3+ (quart. Amine, stark basisch)
NH3+ (prim. Amine, schwach basisch)
Gegenion
zB. H+, Na+
zB, OH-, Cl-
Typische Säulendimensionen:
IEC: 0,5-10cm ID, 10-100cm lang, große Kapazität: 3-4 mol/kg
IC: 1-4mm ID, 10-25cm lang, niedrige Kapazität: ca. 0,02 mol/kg, 10-50μl Probe,
Empfindlichkeit: 5ppb, Trennzeit: 5-30min
Austauschreaktionen:
R-SO3-H+ + K+Cl-  R-SO3-K+ + H+ClR-NR3+OH- + K+Cl-  R-NR3+Cl- + K+OHJe nach Art des Ions und der mob. Phase kommt es zu unterschiedlichen
Retentionszeiten und somit zur Trennung
Kann nicht auf alle Analyten angewandt werden:
 Hydrolisierende Ionen (zB. Sn4+, Bi3+, Al3+, Fe3+ liegen auch bei sehr
niedrigem pH als Hydroxide vor)
 Wenig-dissoziierte Analyten werden kaum zurückgehalten
 Starke Oxidationsmittel zerstören den Ionenaustauscher
Elutionsreihenfolge:
Anionen: F-, Formiat- (Salz der Ameisensäure), Acetat-, Cl-, NO2-, Br-, NO3-, SO42-,
Oxalat2Kationen: Li+, Na+, NH4+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+
Interpretation: größere Ionen werden stärker zurückgehalten, Ladung hat noch
stärkeren Effekt
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IC unterscheidet sich von IEC durch:
 Kleinerer ID und Länge
 Stat. Phase mit kleineren Partikeln und wesentlich geringerer
Ionenaustauschkapazität
 Mob. Phase mit wesentlich geringerer Ionenstärke
 Leitfähigkeitsdetektor und Suppressor (unterdrückt Grundleitfähigkeit der mob.
Phase)
 Gradienten zur Verbesserung der Trennleistung
Säulensuppressoren sind Ionenaustausch-Säulen mit hoher Kapazität, die im
Anschluss an die analytische Säule mit umgekehrter Polarität gebaut sind.
Beispiel: analytische Säule: anionische Ankergruppen, geringe Kapazität,
Suppressorsäule: kationische Ankergruppe, hohe Kapazität, bindet alle Anionen aus
der mob. Phase und ersetzt diese durch Gegenionen (OH-)  Herabsetzten der
Leitfähigkeit der mob. Phase durch Bildung von H 2O:
R-NR3+OH- + H+Cl-  R-NR3+Cl- + H2O
Heute Membransuppressoren als Alternative, da eine ständige Regeneration erfolgt.
Bio-/ Immunoaffinitätchromatographie
Affinitätschromatographie trennt Substanzen durch WW von Enzymen mit ihren
Substraten (Katalysator, Reaktionspartner von biochem. Reaktionen mit Enzymen)
und Antigenen mit ihren Antikörpern.
Prinzip der Bioaffinitätschromatographie, bestehend aus zweistufigem
diskontinuierlichem Prozess:
Geeignete Liganden (Substrat oder Coenzym eines
Enzyms, Antigen eines Antikörpers) kovalent an stat.
Phase (Polyamid, Cellulose, Silica-Perlen mit
kontrollierter Porosität – controlles pore glass beads:
CPG) gebunden, Probe wird aufgetragen, gesuchte
Biomoleküle binden sich selektiv an die Liganden,
andere Substanden werden fast nicht zurückgehalten.
Nach Probelauf wird der Analyt mit selektiver Elution
„herausgewaschen“. Das Lösen mittels selektivem
Eluens ist unwirtschaftlich, pH-Änderung ist eine
Alternative, Enzyme verlieren jedoch Funktionalität
(zB. Denaturierung)
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Analytischer Einsatz ist eher untergeordnet, meist präparative Verwendung
(Trennung, Nachweis, Reinigung von Biomolekülen).
V.
Elektrophoretische Trennverfahren
Elektrophorese
Trennprinzip: Ionen bewegen sich in einem elektrischen Feld abhängig von Radius
und Ladung unterschiedlich schnell. Kein chromat. Trennverfahren. Sie zählt heute
wegen ihrer Schnelligkeit und Leistung zu den wichtigsten Trennmethoden.
Verschiedenen Formen der Durchführung
 Flach oder absteigend auf Papier oder Gel
 Kapillarelektrophorese (CE), viel bedeutender als gewöhnliche
Elektrophorese, es wird Hochspannung von ca. 30kV angelegt, Trennung
erfolgt in fused silica-Kapillaren (< 0,25mm ID, ähnlich den Kapillarsäulen bei
der GC)
 Kopplung an andere Trenntechniken möglich
Theoretische Grundlagen
In einem elektrischen Feld E wirkt auf die Ladung q (z*e) folgende elektrische Kraft:
Fe = zi*e*E
zi = Ladungszahl des Analyten i, e = Elementarladung
In einer Flüssigkeit (gewisse Viskosität η) wirkt der Bewegung die Reibungskraft F R
(Stokes`sche Reibung) für sphärische (kugelförmig) Körper entgegen:
FR = 6π*r*η*vi
r = hydrodynamischer Radius des hydratisierten Ions
Durch KräfteGGW und Umformung ergibt sich folgende Wanderungsgeschwindikeit:
vi(r,z) = zi*e*E/6π*r*η
Daraus ergibt die in Abhängigkeit von E die elektrophoretische Mobilität μ i:
μi = vi/E = zi*e/6π*r*η
Es können also nur Ionen getrennt werden.
Durchführung
Probe wird auf Papier/Gel aufgebracht (Elektrophorese) oder in Kapillare injiziert
(CE).
Gleichstrom wird angelegt: 20V (E) bis 30kV (CE)
Kationen wandern zur Kathode, Anionen zur Anode.
Verwendung von Pufferlösungen, da durch stattfindende Elektrolyse lokal der pHWert sehr stark variieren würde  Substanzen könnten beschädigt werden,
Trennleistung nicht konstant, Elektrolyt leitet Strom
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Träger-Elektrophorese
Verwendung eines Trägermaterials (Celluloseacetat,
Papier) zur Trennung von Proteinen. Ablauf einer
Trennung: Auftrennung  Anfärben der
Substanzflecken (zB. mit Amidoschwarz)  Entfärben
(des Farbstoffüberschusses)  Träger transparent
machen  densitometrische Messung (quant.
Messung der Farbdichte, UV-Scanner?)
Einsatzbereich: biochem. und klinische Analytik
Gel-Elektrophorese
Als Träger wird ein Gel (zB. Agarose, Polyacrylamid-Gele: PAGE) verwendet. Das
Gel mit der Pufferlösung kann sich auf einer Kunststoffunterlage befinden, die
luftdicht in eine Kunststoffschablone eingesetzt wird, oder das Gel befindet sich direkt
in einem Automaten mit zahlreichen Taschen. Die Probe wird mit sogenannten
Stempeln in die Taschen injiziert. Die Gel-Elektrophorese eignet sich zur Trennung
von Proteinen (DNA, RNA). Zum Trenneffekt durch die Elektrophorese kommt noch
der Siebeffekt des Gels (Gelpermeations-Chromatographie). Durch die beiden
Trenneffekte kommt es manchmal zu ungünstigen Überlagerungen dieser, daher
wird die Ladung oft durch Zusatz von Tensiden (zB. SDS: Na-Dodecylsulfat)
abgeschrimt. Die Porosität kann durch die Konzentration des Gels variiert werden. Es
gibt sowohl Röhrchen-, als auch Flachbettanordnungen. Nach der Auftrennung wird
mit Färbebädern fixiert und gefärbt und mit Entfärbebädern der überschüssige
Farbstoff entfärbt, die getrennten Proteine sind dann als blaue Streifen sichtbar.
Kapillar-Elektrophorese
Hochspannung bis 30kV, Kapillaren sind aus unbeschichtetem Quarz (fused-silica)
oder Teflon mit 10-100μ ID und einer Länge von 20-100cm. Die Detektion erfolgt mit
einem UV-VIS-Detektor (on column). Durch den Widerstand der Kapillare entsteht
bei Stromfluss Joule`sche Wärme, geringerer Kapillardurchmesser führt die Wärme
besser ab.
Elektroosmose (Elektroosmotischer Fluss EOF, überlagert elektroph. Mobilität)
Als Elektroosmose wird die Bewegung einer Flüssigkeit parallel zu einer Oberfläche
im elektrischen Feld bezeichnet. Sie ist die Grundlage vieler elektrophoretischer
Verfahren. Obwohl die Flüssigkeit in Summe neutral ist, bildet sich an der
Kontaktfläche des Elektrolyten mit dem Grenzmaterial (Glas, Quart, Teflon) eine
elektrochem. Doppelschicht aufgrund von Oberflächenladungen (Diss. der Si-OH
Gruppen) aus. Die Materialfläche ist dann negativ, der Elektrolyt positiv geladen. Die
positiv geladenen Teilchen bewegen sich dann zur Kathode, es entsteht ein EOF,
der die gesamte Flüssigkeit transportiert. Das Fließprofil ist annähernd kantenförmig
(günstig, da weniger Peakverbreiterung) im Gegensatz zu herkömmlichen
hydrodynamischen Fließprofilen (parabelförmig).
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Kapillar-Zonen-Elektrophorese (CZE)
In beiden Reservoiren wird der gleiche Puffer (Grundelektrolyt) verwendet, dessen
Konzentration im Vergleich zum Analyten hoch ist. Dadurch bestimmt der Puffer den
pH und die Leitfähigkeit. Die Trennung kann optimiert werden, in dem die
Pufferzusammensetzung verändert wird  pH-Wert ändert sich  Diss.grad ändert
sich und somit die Mobilität des Analyten, die vom pK-Wert abhängig ist.
Charakteristika:
Peakverbreiterung nur durch longitudinale Diffusion. Eine scharfe Probenaufgabe
(1nl) ist erforderlich. Wird vorwiegend in der biochem. und klinischen Analytik zur
Trennung von Aminosäuren, Proteinen und Nukleinsäuren verwendet.
Vorteile (gegenüber klassischer Gel-Elektrophorese): 1.000.000 Trennstufen/m,
schnelle Trennung
Nachteil: Detektion schwierig da Detektorvolumen < 0,5nl
Isotachophorese
Trennprinzip: Ionen werden in die Grenzflächen 2er Elektrolytenlösungen
aufgetragen, durch die unterschiedliche Ionenbeweglichkeit im elektrischen Feld
ordnen sie sich in scharfen Banden an und wandern dann mit gleicher
Geschwindigkeit die Säule entlang.
Aufbau: Kapillarsäule mit 0,5-1mm ID und bis zu 1m Länge, zu Beginn ist die Säule
mit dem Elektrolyten mit der größeren Ionenbeweglichkeit (leading electrolyte, zB.
OH-) gefüllt, dahinter befindet sich ein Elektrolyt mit geringerer Ionenbeweglichkeit
(terminating electrolyte, zB. Tartrat-, gleiches Gegenion). An der Grenzfläche wird die
Probe (0,1-100μl, pH: 2-12) injiziert. Nach Anlegen der Spannung ordnen sich die
Ionen entsprechend ihrer Ionenbeweglichkeit in scharfen Grenzen an (Eigenschaften
sind in diesen Bereichen konstant), anschließend erfolgt die Wanderung mit gleicher
Geschw. Detektion erfolgt dabei mittel UV-Absorptions-Detektor oder PotentialGradienten-Detektor (beim Übergang von einer zur anderen Substanz wird ein
Potentialsprung durch 2 Pt-Elektroden detektiert). Aus dem Signal kann die Substanz
qualitativ zugeordnet werden, aus der Dauer des Signals erfolgt die quant.
Information.
Empfindlichkeit: 10-9 – 10-10 mol/l
Anwendung für anorg. und org. Ionen:
Biochemie (Proteine, Aminosäuren, Nucleotide)
Pharmaindustrie (Antibiotika, Amine)
Lebensmittelindustrie (Zitronen-, Milchsäure)
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VI.
Skalierung von Trennverfahren
Durch Dimensionierung (Säulenlänge, Partikeldurchmesser, ID) kann Trennleistung
(Auflösung, Trenneffizienz), Geschwindigkeit und Kapazität verändert werden.
Skalierung sinnvoll, um Trennung zu verbessern, zu beschleunigen oder um höhere
Kapazitäten zu ermöglichen. Außerdem sind ökonomische Überlegungen zu treffen,
abhängig vom Wert des Produktes und den Kosten der Phasen.
Betrachtung der van Deemter Gleichung:
Je kleiner der Partikeldurchmesser (gepackte Säule), desto kleiner ist die
Trennstufenhöhe, dadurch wird die Trennleistung erhöht, es kommt jedoch zu einem
Druckanstieg.
HPLC mit noch höheren Drücken  UPLC (ultra-high pressure liquid c.)
Mit kleinen Partikeldurchmesser dp, aber großem Fluss und langer Säule kommt es
zu sehr hohem Druckabfall, dies kann durch spezielle Konstruktion (vorwiegend
Pumpen) und Erhöhung der Temperatur (geringere Viskosität) kontrolliert werden.
UPLCs erreichen eine sehr gute Auflösung in sehr kurzer Zeit.
HPLC-Maßstab:
Abhängig davon, ob HPLC zu Analyse, in Prozessen oder zu präparativen Zwecken
verwendet wird, unterscheidet man instrumentelle Realisierungen:
Flußrate & Druck, wird von Pumpe kontrolliert
Detektor muss an die Konzentration angepasst sein
bei Weiterverwendung  Fraktionssammler
Allgemein gilt natürlich, je mehr Probe, desto größer muss das Trennsystem sein.
Bei der Skalierung orientiert man sich an einer Skala (Maßstab), der der Zweck der
Trennung angepasst ist:
Maßstab
Chromat. Zielsetzung
Analytisch
Quali. & quant. Informationen sammeln
Semi-präparativ
Zusätzliche Gewinnung von Substanzen < 0,5g
Präparativ
Trennung von Substanzen > 0,5g
Prozess/Industriell
Produktionen bis kg
Kapazität ist proportional zum Säulenvolumen bzw. zum Volumen der stat. Phase.
Vcolumn = L*ID ~ Vstat
Präparativ: 1-50mm ID, 20-500mm lang
Die Partikelgröße bestimmt die Trennleistung (mit L) und den Druckabfall.
DAUMENREGEL???
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Präparative Chromatographie
Überladung der Säulen aus wirtschaftlichen Überlegungen sinnvoll, um Maximierung
der Produktivität zu erreichen und maximal Kapazität zu ermitteln.
Kapazität einer Säule definiert durch:
A = Konstante, vm Vol der mob. Phase in einer Trennstufe
mit Vm = vm*N und VS = vS*N lässt dich herleiten:
Man unterscheidet dabei zwischen:
 Volumsüberladung: falls Probe wenig löslich in mob. Phase  großes
Probenvolumen mit geringer Konzentration
 Konzentrationsüberladung: falls Probe gut löslich in mob. Phase  konstantes
Probenvolumen mit hoher Konzentration
Scale-up: Redimensionierung in Bezug auf Flussrate, Beladung usw.
Das bedeutet, dass ein zuvor in Laborversuchen an Maßstab-Modellen ermittelte
Parameter auf die Anwendungen übertragen wird.
X = Parameter (A(nalytisch), P(räparativ)), πr2 = Säulenquerschnitt
Praktische Vorgehensweise:
1. Optimierung der analytischen Trennung
2. Beladungsstudie
3. Scale-up
Miniaturisierung von Trennverfahren (Downscaling) führt zu:
 geringerem Reagensverbrauch
 schnellerer Trennung (evtl, geringere Leistung)
 schnellerem Stoffaustausch (geringere Diffusionswege)
 größerer Bedeutung von Oberfläche gegenüber dem Volumen
 hauptsächlich laminare Strömungen
 bessere Wirkung der elektrochem. Doppelschicht
 Massenproduktion, Parallelisierbarkeit
Bei chromat. Trennverfahren für Miniaturisierung durch die kürzere Säule zu
Verschlechterung der Trennleistung, falls der Partikeldurchmesser nicht ~ reduziert
wird.
Bei elektrochem. Verfahren hängt die Trennleitung nicht ausschlaggebend von der
Länge ab, daher erfolgt bevorzugt Miniaturisierung von CE-Systemen, bei GC und
HPLC ist es außerdem schwierig, miniaturisierte Pumpen (Dichtheit, Druck,
Robustheit) zu konstruieren. Es wurden jedoch GC und HPLC auf Silizium-Wafern
ebenso realisiert, wie CE-Systeme.
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Miniaturisierung von CE erfolgt am einfachsten in der Form eines Mikrochips (Labon-a-chip).
μ-TAS (micro-total analysis system)
μ-TAS ist ein integriertes miniaturisiertes
Analysensystem mit integrierten MikroElektromechanischen-Systemen (MEMS),
enthält Probenvorbereitung/Reaktor,
Trennung und Detektionssystem auf
einem Chip, ähnlich einem Sensor
Anwendung bei Prozesskontrolle,
Hochdurchsatzscreening, Militär,
Raumfahrt, portable Diagnostik
Mikromischer: enge Strömungskanäle: geringe Reynoldszahl  laminare
Strömungen, Durchmischung der Reaktanden allein durch Diffusion
Materialien:
Silizium: sehr gut strukturierbar, aber teuer, Isolator (wenn undotiert), nicht
transparent
Glas/Quarz: vorteilhafte optische Eigenschaften, chemische Resistenz, aber
schwierige Strukturierung und teuer
Kunststoff: günstige Massenfertigung aber unvorteilhafte optische Eigenschaften und
chemisch nicht sehr resistent
Techniken:
Abgeleitet aus Mikroelektronik/Chipherstellung (Beschichtung + Maske, Ätzen)
Abform Techniken auf thermoplastischen Kunststoffen (auf Form gießen)
Mikromechanische Verfahren: Ultraschall, Laserbearbeitung, Sandstrahlen
(powderblasting), Mikrosägen, -schleifen, -fräsen
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VII.
Signale und Rauschen
Analytische Messung besteht aus:
 Signal (Träger erwünschter Information)
 Rauschen (Noise, unerwünschte Information)
Der Rauschpegel (noise level) für limitiert die Empfindlichkeit einer Messung.
Rauschen ist die Differenz des gemessenen und des idealisierten, aber nicht direkt
zugänglichen Signals. Rauschen kann somit die Aussagekraft von Daten
beeinflussen.
Der Absolutwert des Rauschens hat dabei wenig Aussagekraft, interessant ist aber
das Signal/Rausch-Verhältnis (signal/noise ratio SNR), mit dem ein Verfahren
charakterisiert werden kann. Das Rauschen ist dabei durch die Standardabweichung
s des Signals beschrieben. NV: 99% aller Werte liegen im Intervall +- 2,5s.
RSD = rel. S
Quellen von Rauschen
 Chemisches Rauschen: unkontrollierte chem. Faktoren (Luftfeuchtigkeit, pHWert, Verunreinigung oder Zersetzung von Chemikalien)
 Instrumentelles Rauschen: durch elektrische, elektronischen Komponenten
(Lichtquelle, Detektor, Messumwandlung, Signalverarbeitung, Signalausgabe)
o Thermisches Rauschen (thermal noise)
o Schrotrauschen (shot noise)
o Flackerrauschen (flicker noise)
o Umgebungsrauschen (environmental noise)
Chemisches Rauschen
Vor allem bei Chromatographie und Spektroskopie
Instrumentelles Rauschen
Thermisches Rauschen (Johnson-Rauschen):
Zufällige, ungerichtete Bewegungen von Elektronen in leitenden Materialien führen
zu Rauschen, das mit steigender Temperatur zunimmt. Im zeitlichen Mittel erfolgt
kein Stromfluss. Thermisches Rauschen verschwindet nur am abs. Nullpunkt.
Therm. Rauschen Urms = √4kRTΔf
Bandbreite Δf eines Messgerätes: umgekehrt ~ zur Anstiegszeit tr
Anstiegszeit ist jene Zeit, die ein Instrument benötigt, um einer sprunghaften
Signaländerung zu folgen (10%  90%)
Thermisches Rauschen kann durch Verringerung des Widerstandes oder
Verringerung der Temperatur (Kühlung des Detektors mit fl. N 2) reduziert werden. Es
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hängt nicht von der Frequenz des Signals, aber von der Bandbreite ab. Da es alle
Frequenzen enthält, wird es auch als weißes Rauschen bezeichnet.
Schrotrauschen
Ursache: Bewegung von Elektronen über eine Potentialbarriere (Grenzfläche), zB. in
Halbleitern, Photozellen, Vakuumröhren
Durch statistische Schwankungen beim Übergang der Ladungsträger kommt es auf
makroskopischer Ebene zu Stromschwankungen, das ebenfalls alle Frequenzen
enthält, nicht temperaturabhängig ist aber mit der Bandbreite verringert werden kann.
Irms = √2IeΔf
Funkel-, Flackerrauschen (1/f noise, pink noise)
Tritt immer auf, vielleicht durch Fehlstellen in Halbleitern oder kosmische Strahlung
verursacht.
Rauschintensität nimmt mit 1/f ab
Irms ~ 1/f
Bei kleinen Frequenzen (Gleichstrom) großes Rauschen
Bei Frequenzen > 1kHz praktisch unbedeutend
Kann durch Schirmung oder durch Lock-in-Verstärker reduziert werden.
Umgebungsrauschen
Elektromagnetische Wellen oder E/B-Felder aus der Umgebung stören.
Frequenzabhängigkeit ähnlich dem 1/f-Rauschen
Es gibt einige ruhige Bereiche, die messtechnisch genutzt werden. Das Rauschen
kann durch Lock-in-Verstärker reduziert werden.
Verbesserung des SNR durch:
 Hardware-Maßnahmen (instrumentell)
o Erdung und Abschirmung: gegen Umgebungsrauschen, wichtig bei
hochohmigen (geringer Strom) Messgeräten (zB. pH-Elektrode)
o Differenzverstärker: subtrahiert vom Messsignal zuerst das
Referenzsignal, bevor verstärkt wird. Signale liegen in gleicher Phase
 weniger Rauschen im Differenzsignal
o Analog-Filter: als Tiefpassfilter eingesetzt, eliminiert hochfrequentes
Rauschen bei halbwegs konstantem Signal, als Hochpassfilter
eingesetzt eliminiert es niederfrequentes Rauschen (Drift-,
Flackerrauschen) aus sich schnell ändernden Signalen, RC-Schaltkreis
o Modulation:
 Niederfrequentes oder Gleichstromsignal wird mit gewisser
Frequenz moduliert  Signal mit enger Frequenzverteilung
 Verstärkung des Signals
 Entfernung des 1/f-Rauschens durch Hochpassfilter
 Demodulierung  verstärktes Signal mit ursprünglicher f
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o Chopping: Transformation in höheren Frequenzbereich, bereits an der
Lichtquelle (optische Spektroskopie  bewegtes Blendenrad, f ergibt
sich aus Kreisfrequenz und Anzahl der Segmente) möglich (früher =
günstiger) oder Chopping des elektr. Signals am Detektor.
Signal wird durch Chopping zerhackt 
Wechselstrom gleicher Amplitude, dann
verstärkt, positiver Teil abgeleitet, RCSchaltung glättet Signal
o Lock-in-Verstärker: Referenzsignal (Lock) mit gleicher f und Phase
benötigt, Modulation (inkl. Verstärkung) beider Signale durch Chopping,
ein synchroner Demodulator fügt die beiden Signale zusammen, durch
seine periodische Umkehr erhält man ein sehr rauscharmes Signal.

Software-Maßnahmen
o Coaddition: Verbesserung durch Coaddition und Mittelung von n
Datensätzen, sowohl digital, als auch analog realisierbar.
S ~ n, aber N ~ √n  S/N = √n S/N
o Boxcar-Filterung: einfacher digitaler Filter, jeweils n Datenpunkte
werden durch Mittelwert ersetzt
Filter
Analoge Filter: elektronische Schaltkreise oder Operationsverstärker  Signal als
Spannung oder Stromstärke
Digitale Filter: Verarbeitung durch math. Algorithmen, Signal wird zunächst durch
einen ADC (Analog-to-Digital Converter) digitalisiert (diskrete Zahlenwerte), digital
gefiltert (geglättet) und mit einen DAC wieder zurückgewandelt.
Vorteile digitaler Filter:
 Programmierbarkeit: Modifikation ohne Austausch der Hardware
 Einfach programmierbar, testbar und implementierbar
 Zeitlich stabil und unempfindlich gegenüber äußeren Einflüssen
 Anwendbar auf sehr niedrige und sehr hohe Frequenzen
 Adaptierbarkeit bei Veränderungen: Anpassen an Fragestellung
Funktionsweise von digitalen Filtern
Signal ist eine sich kontinuierlich ändernde Spannung U(t) = x(t).
Signal wird in konstanten Zeitabständen Δt registriert.
x0 = x(t=0); x1 = x(t1) = x(t+Δt); x2 = x(t2) = x(t+2Δt)
Somit hat man zum Zeitpunkt tn n Datenpunkte xn.
Daten (Inputwerte) xn werden durch einen digitalen Filter in digitalisierte
Ausgabewerte (Outputwerte) yn umgewandelt.
yn wird dabei aus xn berechnet, auf welche Weise hängt dabei vom Filter ab.
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Beispiele digitaler Filter
 Nicht verstärkender Filter (unity gain filter) 0.O
yn = xn
 Verstärkungsfilter (simple gain filter) 0.O
yn = Kxn K = konstant
 Verzögerungsfilter (pure delay filter) 1.O
yn = xn-1
xneg in der Regel 0
 Zweigliedriger Mittelwertfilter (two term average filter) 1.O
yn = (xn-1 + xn)/2
einfachste Form eines Tiefpassfilter, mit dem
hochfrequentes Rauschen eliminiert werden kann
 Dreigliedriger Mittelwertfilter (three term average filter) 2.O
yn = (xn-2 + xn-1 + xn)/3
 Zweigliedriger Differenzfilter (two term difference filter) 1.O
yn = xn – xn-1
 Zentrierter Differenzfilter (central difference filter) 2.O
yn = (xn – xn-2)/2
Ordnung eines Filters: Anzahl der verwendeten Inputwerten, die zur Berechnung
eines Outputwertes benötigt werden, Inputwerte mit gleichem Index werden dabei
nicht gezählt. Alle Filter lassen sich in folgender Form ausdrücken:
m. Ordnung: yn = a0xn + a1xn-1 + ….. + amxn-m am= Filterkoeffizienten
Die bis jetzt erwähnten Filter werden als nicht-rekursiv bezeichnet, dabei werden zur
Berechnung ausschließlich aktuelle und vorhergehende Inputwerte verwendet.
Bei rekursiven (zurückgehend) Filtern werden zusätzlich Outputwerte
vorhergehender Zyklen benützt. Rekursive Filter sind in der Regel effektiver, da
weniger Werte für den gleichen Algorithmus benötigt werden.
Die Ordnung eines rekursiven Filters ist die größte Zahl der vorangehenden Inputbzw. Outputwerten, die zur Berechnung des aktuellen Outputwertes benötigt wird. In
den meisten Fällen ist die Zahl der vorhergehenden Inputwerten gleich der Zahl
vorhergehender Outputwerte.
Fourier-Filterung
Originaldaten werden der Fast-Fourier-Transformation (FFT) unterzogen:
Annäherung des Spektrums durch cos-Funktionen. Amplituden der cos-Funktionen
sind die (diskreten) Fourierkoeffizienten. Kann hoch. und niederfrequentes Rauschen
herausfiltern. Durch Fourierrücktransformation erhält man das ursprüngliche
Spektrum.
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Moderne spektroskopische Methoden
Definition der spektroskopischen Analyse:
Gewinnung von Informationen über den Analyten mittels physikalischer Reagenzien,
wie etwa Photonen (hv), atomare oder molekulare Ionen (Ar+, O2+,…),
Nuklearteilchen (n, p, α-, γ-Strahlung,…) oder Elektronen (e-). Die Reagenzien
decken einen riesigen Energiebereich von 10 -4 – 107 eV (1eV = 1,6*10-19J) ab. Die
Reagenzmenge wird oft als Teilchenzahl pro Zeiteinheit (counts/s) angegeben oder
in einer davon abgeleitete Einheit.
Ein Analyt ist charakterisiert durch:
 Stoffliche Zusammensetzung
 Aggregatzustand (Plasma als 4. AZ)
 3D Anordnung (Elemente, Moleküle, Komplexe, Aggregate, Cluster)
 Chemische und biochemische Eigenschaften
Die Eigenschaften eines Analyten sind abhängig von so genannten Energieniveaus
und jeder Analyt ist definiert durch einen Satz von Energiezuständen.
Atome:
Kernniveaus
Elektronenniveaus
Elektronenspinniveaus
Moleküle:
Atomare Elektronenniveaus (AOs)
Molekulare Elektronenniveaus (MOs)
Schwingungs- und Rotationszustände
Kernmagnetische Niveaus
Elektronenspinniveaus
Die spektroskopische Analyse beruht auf der Anregung solcher Energiezustände und
deren Messung
Absorptionsspektr. A + R  A* + R`
Emmisionsspektr. A**  A* + S
Das Signal R` bzw. S kann ebenfalls ein Photon, Elektron, usw. sein. Es besitzt eine
gewisse Energie bzw. Energieverteilung und eine Intensität.
Folgende Informationen über Analyten können gewonnen werden, dabei liefern
spektroskopische Methoden die meisten und aussagekräftigsten Informationen:
 Art der vorhandenen Elemente
 Konzentration/Menge
 Chemische Bindungen
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



3D-Anordnung
Elektronische Struktur
Dynamisches Verhalten
Biochemisches, biologisches Verhalten
Arten von spektroskopischen Methoden, die diese Informationen liefern:
 Qual. und quant. Elementar- und Molekularanalyse
 Qual. und quant. verbindungsspezifische Analyse (speciation analysis)
 Molekülstrukturanalyse
 Räumliche Element- und Molekülanalyse
 Spektroskopie elektronischer Zustände
 Dynamische Element- und Strukturanalyse
 Qual., quant. und räumliche Analyse von Komplexen, Cluster und Aggregaten
Charakteristika spektr. Methoden:
 Hohe absolute Sensitivität (Ultraspurenanalyse bis zu 10-21g,
Einzelmoleküldetektion mittels Fluoreszenzspektr., gewöhnlich aber ng)
 Hohe relative Sensitivität
 Hoher Informationsgehalt
 Hohe Richtigkeit (Übereinstimmung von Durchschnittswert mit Referenzwert)
 Hohe Präzision (Übereinstimmung voneinander unabh. Messungen)
 Hohe Selektivität und manchmal Spezifität (nur gesuchten Parameter/Analyten
erfassen, Selektivität abh. Von experimentellen Bedingungen, Spezifität
ausgehend vom Parameter/Analyten)
 High-troughput (HTP) Technik
 Hoher instrumenteller Aufwand
 Probenvorbereitung oft zeit/arbeitsaufwendig
 Matrixeffekte oft signifikant ( systematische Fehler) aber durch
Probenvorbereitung kontrollierbar
 Signale/Spektren sind oft schwer/nicht eindeutig zuordenbar/interpretierbar
 Trennung von Analyt-Signal und Hintergrund-Signal oft schwierig
(Chemometrie)
In der Spektroskopie erfolgt die Charakterisierung durch Messung von typischen
Wellenlängen, die durch die WW von Licht mit Materie (Absorption, Emission,
Streuung,…) zustande kommen.
Eigenschaften von Licht als Welle
Magnetisches Feld und elektrisches Feld stehen immer normal aufeinander.
Eine Welle wird beschrieben durch Wellenlänge λ, Amplitude A, Frequenz v,
Wellenzahl ṽ (=1/λ) und Intensität.
λ = c/v
λ*v = c0/n
n = Brechungsindex = c0/ci
Energie einer Welle: E = h*v = h*c/λ = h*c*ṽ
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Spektroskopisches Messprinzip – 5 Bauteile
 Strahlungsquelle (Strahler)
 Wellenlängenselektor
 WW-Bereich mit Probe
 2. Wellenlängenselektor (Monochromator)
 Detektor
WW zwischen Strahlung und Materie
Absorption
Emission
Brechung (refraction)
Interferenz und Beugung (interference and diffraction)
Streuung (sacttering)
Drehung von linear polarisiertem Licht (rotation)
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Absorption
A + hv  A*
Trifft Strahlung auf einen Festkörper, eine Flüssigkeit oder eine Gasschicht, so
werden bestimmte Wellenlängen selektiv durch Absorption herausgefiltert, dabei wird
Energie auf die Atome bzw. Moleküle der Probe übertragen. Durch die
Energieübertragung werden Elektronen aus ihrem Grundzustand in energiereichere
angeregte Zustände angehoben. Atome bzw. Moleküle besitzen diskrete
Energieniveaus, somit muss die Energie der Strahlung exakt der Energiedifferenz
entsprechen, um Elektronen anzuregen. Die Energiedifferenzen sind eindeutig und
somit kann eine quali. Charakterisierung der Probe erfolgen. Zu diesem Zweck
erstellt man A/λ-Diagramme bzw. Int/E-Diagramme.
Absorptionsspektren können sehr unterschiedlich sein, je nach Komplexität und
Aggregatzustand. Bei der Atomabsorption kommt es zu einfachen Spektren mit
scharfen Peaks, da bei monoatomaren Teilchen nur eine kleine Zahl möglicher
Elektronenübergänge möglich ist.
Absorptionsspektren von Molekülen sind wesentlich komplexer, da die Zahl der
Energiezustände viel größer ist. Zu den elektronischen Zuständen kommen nun noch
Schwingungs- und Rotationszustände, wobei Rotationsz. > Schwingungsz. > e. Z.
Durch IR-Strahlung werden nur
Schwingungs- und Rotationszustände
angeregt, VIS- und UV-Strahlung können
Valenzelektronen in höhere Energieniveaus
anregen.
Durch Molekülabsorption kommt es zu Absorptionsspektren, die keine scharfen,
definierten Linien mehr aufweisen, sondern charakteristische Banden, man spricht
von einem Bandenspektrum. Zusätzlich beeinflusst der Aggregatzustand der Probe
das Aussehen des Absorptionsspektrum. Bei flüssigen Proben, Festkörpern oder
gelösten Proben kommt es zu kontinuierlichen Banden bis hin zu einem
kontinuierlichem Spektrum, wobei die Banden bei Festkörpern noch breiter sind.
Emission
Durch Relaxation angeregter Elektronen in energieärmere Zustände wird der
Energieüberschuss in Form von Photonen abgegeben. Bei der Emission
unterscheidet man 2 Arten:
 Emission durch vorhergehende Absorption führt zu
Photolumineszenzvorgängen (Fluoreszenz (kurzlebig) und
Phosphoreszenz(länger))
A + hv  A*  A + hv
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
Zufuhr von chem., elektr. oder therm. Energie führt zu Emission-,
Biolumineszenz- oder Chemilumineszenvorgängen
Die Emissionsspektren sind wie die Absorptionsspektren vom Aggregatzustand
abhängig.
Brechung
Tritt Strahlung vom Vakuum in ein Medium, so wird die Geschwindigkeit kleiner,
abhängig von der Art und Konzentration der Atome bzw. Moleküle und von der
Wellenlänge. Der Brechungsindex ist ein Maß für die WW mit der Strahlung und ist
definiert durch:
ni = c/vi bei einer bestimmten Frequenz bzw. Wellenlänge i. Leitet man
polychromatisches Licht durch ein Prisma, so erhält man aufgrund der Brechung ein
Spektrum monochromatischer Strahlung. Die Änderung des Brechungsindexes mit
der Wellenlänge nennt man Dispersion.
Tritt Strahlung vom einen ins andere Medium, so ändert sich ebenfalls die
Geschwindigkeit, der Strahl wird gebrochen. Nach Snellius gilt:
sinα/sinβ = n2/n1 = v1/v2 = const.
Aus dem gemessenen Brechungsindex kann die Konzentration, Art und Qualität
einer Probe bestimmt werden.
Interferenz und Beugung
Interferenz ist die Überlagerung von Wellen, dabei kann es zu konstruktiver
(Maximum trifft auf Maximum) und destruktiver Interferenz (Maximum trifft auf
Minimum) kommen.
Unter der Beugung von Licht versteht man die Richtungsänderung von Licht beim
Passieren von Kanten oder Hindernissen. Dabei muss das Hindernis in der
Größenordnung der Wellenlänge liegen, also im oberen nm-Bereich. Wird nun Licht
am Gitter oder am Spalt gebeugt und bringt man dahinter einen Schirm an, so
entstehen durch Interferenz Maxima und Minima.
In der Analytik findet Beugung Anwendung in der Strukturaufklärung von Kristallen.
Die Atome haben einen Abstand von einigen A und werden mit Röntgenstrahlen
beschossen. Nur Wellenlängen, die der Bragg-Gleichung n*λ = 2*d*sinϴ
entsprechen, werden reflektiert und ergeben ein Interferenzmuster, aus dem auf die
Anordnung der Atome im Kristall geschlossen werden kann.
Streuung
Streuung an großen Partikeln
Durch Reflexion an der Oberfläche kommt es zur Streuung. Da die Intensität mit der
Partikelgröße zunimmt, ist die Streuung an großen Partikeln mit bloßem Auge zu
erkenne. Außerdem kann aus der Intensität auf die Größe der Teilchen und die
Teilchenzahl geschlossen werden. Anwendung: Nephelometrie
Raman-Streuung
Tritt bei sehr kleinen, polarisierbaren Molekülen auf. Die einfallende Strahlung regt
Elektronen an. Die emittierte Strahlung besitzt eine andere Frequenz als die
Anregungsfrequenz. Die Differenz ist dabei charakteristisch für die Probe.
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Rayleigh-Streuung
Tritt bei Teilchen auf, die deutlich kleiner sind als die Wellenlänge der Strahlung und
ist um Größenordnungen intensiver als die Raman-Strahlung.
Drehung von linear polarisiertem Licht
Linear polarisiertes Licht (konstante Ebenen) wird beim Durchdringen der Probe
gedreht. Bewegte Elektronen wechselwirken mit Strahlung. Der Drehwinkel ist dabei
proportional zur Länge der Messküvette und zur Konzentration und abhängig von der
Art der Probe.
Elementanalytik
Absorptionsmethoden
Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)
Anregungsprinzip: Ag + hv  Ag*
Lichtanregung, Resonanzbed. muss erfüllt sein
Quant. Zusammen hang zwischen Anregungsgrad N 1/N0 und der Temperatur:
N1/N0 = g1/g0 * e-ΔE/kT
Die quantitative Information erhält man aus der Intensitätsschwächung nach
Lambert-Beer: A = log(Int0/Int1) = ε*d*c
Schematisches Gerätediagramm:
Das Probeneinführungssystem sollte im Optimalfall für feste, flüssige und gasförmige
Proben geeignet sein.
Für eine atomspektroskopische Untersuchung müssen die Probenteilchen als Atome
vorliegen, die Probe muss also atomisiert werden, bevor sie der Strahlung
ausgesetzt wird. Bei der AAS verwendet man folgende Atomisierungsmethoden:
Flamme (kontinuierlich), elektrotherm. Energie (diskret), Hydridtechnik
Bei der Atomisierung unterscheidet man zwischen kontinuierlichen und diskreten
Atomisatoren.
Flammenatomisierung
Beim kontinuierlichen Typ wird die Probe zuerst zerstäubt, dann durch Desolvation,
d. h. unter Verdampfung des Lsg.mittels in feste Aerosole überführt schließlich in die
erhitzte Region geleitet, wo die Probe atomisiert, teilweise ionisiert wird.
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Als Aerosolgeneratoren verwendet man:
Pneumatische Zerstäuber (geringe Effizienz)
Ringzerstäuber
Siebzerstäuber
Ultraschallzerstäuber (mittlere Effizienz)  AES mit Plasma-Anregung
Platte schwingt mit Ultraschlallfrequenz
und zerstäubt somit Probe, allerdings
lagern sich Probenreste ab  MemoryEffekt, hohe Salzkonzentration führen zu
Ablagerungen auf der Platte 
Probenverlust
Hydraulischer Hochdruckzerstäuber (gute Effizienz)
Nachteil: Prallkugel wird mit Probe
kontinuierlich kontaminiert und muss
daher mit Lösungsmittel gewaschen
werden.
Nach der Zerstäubung und der Desolvation wird die Probe in die Flamme geleitet.
Verschiedene Elemente absorbieren verschieden stark über den Flammenbereich,
deshalb wird über den gesamten Bereich gemessen. Je nach benötigter Temperatur
(abh. von Bindungsenergie) werden unterschiedliche Brenngase (H 2, Propan,
Acetylen) und Oxidationsmittel (Luft, Lachgas, O 2) verwendet.
Vorteile der Flammen AAS:
Nachteile:
Einfache Technik
Geringe Empfindlichkeit
Robustes Verfahren
Hoher Probenbedarf
Geringe Störanfälligkeit
Geringe Zerstäubungseffizienz
HTP-Technik
Automatisierbarkeit
Elektrothermische Atomisatoren
Hierbei wird etwas Probe in ein Graphitrörchen injiziert, dass dann unter Strom
gesetzt wird. Nachdem das Lösungsmittel verdampft ist und die Probe verascht
wurde, wird der Strom sehr stark erhöht, was durch die hohen Temperaturen zur
Atomisierung führt. Gemessen wird dann entlang des Röhrchens. Manche Elemente
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bilden bei hohen Temperaturen mit C Carbide, in diesem Fall wird ein Tantalröhrchen
verwendet. Pyrolytischer Graphit verhindert die Diffusion der Probe in das Material 
keine Carbidbildung. Die ET-Technik ist empfindlicher als die Flammen-AAS.
Vorteile der ET-Graphitrohrtechnik: Nachteile:
Festsubstanzen möglich
Apparativ aufwendig
Temperatursteuerung möglich
Kein HTP-Verfahren
Geringer Probenbedarf
Viele Interferenzen (zB: Reaktionen) möglich
Hohe Empfindlichkeit
Hydridtechnik für hydridbildende Elemente wie As, Se, Sb, Pb, Ge
BH4- + 3 H2O + H+  H3BO4 + 8 HNa-asc
6 HNa-asc + SeO32- + 2 H+  3 H2O + H2Se
H2Se + H*  HSe + H2
HSe + H*  Seg + H2
Realisiert wird diese Technik mittels Fließinjektionsanalyse (FIA):
Gerätetechnik bei der AAS
Strahlungsquellen:
Hohlkathodenlampe (HKL)
Die HKL besteht aus einer Anode und einer zylindrischen Katode, die in einer
Vakuum-Glasröhre mit Argon als Inertgas versiegelt sind. Das Metall der Kathode
bestimmt dabei die emittierte Strahlung. Wenn nun eine große Spannung angelegt
wird, wird das Inertgas ionisiert. Die Kationen werden dabei zur Katode beschleunigt
und schlagen Metallatome aus der Oberfläche heraus. Ein Teil der Metallatome
befindet sich im angeregten Zustand und emittiert dann beim Rückfall in den
Grundzustand die charakteristische Strahlung.
Elektrodenlose Entladungslampe (EDL)
Die EDL enthält eine kleine Menge des Metalls oder Metallsalzes in einer Quarzröhre
mit Inertgas unter Vakuum versiegelt. Statt der Elektroden ist die EDL von
Hochfrequenzspulen umgeben, die die Lampe mit Energie versorgt und somit Argon
ionisiert, das dann wiederum Metallatome anregt.
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Photoelektrische Detektoren
Bei der Detektion erhält man 2 Arten von Spektren, je nachdem, ob man einen
Kontinuumstrahler oder einen monochromatischen Linienstrahler verwendet hat.
Bei den Detektoren unterscheidet man den Side-on-Typ und den Head-on-Typ
Bei den AAS-Geräten unterscheidet man Einstrahl- und ZweistrahlSpektralphotometer. Bei B erfolgt die Strahlteilung durch einen verspiegelten
Chopper. Zur Multielementdetektion stehen mehrere Strahlungsquellen und
Detektoren je nach Wellenlängen zur Verfügung
Um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, gibt es bestimmte
Reinheitsanforderungen an Gefäßmaterialien (zB. Na in Glas), Reagenzien,
Standards, Inertgas, Brenngas und Oxidationsgas (Reinigung).
Die AAS wird angewendet in der Industrie zur Qualitätskontrolle, bei Abfall und
Altlasten, in der Biochemie und Mikrobiologie, Medizin, Toxikologie, Hygiene, Agrarund Ernährungswissenschaft, Arbeits- und Umweltschutz, Forensik und in der
Archäometrie.
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Emissionsmethoden
Anregungsprinzip: A + Etherm  A*  A + hv
Therm. Anregung, Zusammenstöße von Atomen, Ionen und Elektronen.
Bei konstanter Temperatur kann man aus der Intensität der emittierten Strahlung auf
die Anzahl der Atome schließen.
Schematisches Gerätediagramm:
Atomisierungsmethoden: Flamme, induktiv gekoppeltes Plasma, GleichstromPlasma, Lichtbogen, Funkenentladung
Atomemissionsspektroskopie (AES)
Flammenphotometer
Ähnelt dem Aufbau eines Flammen-AAS sehr, die Anregung der Atome nach
Zerstäubung erfolgt durch eine Flamme. Diese Methode eignet sich vor allem zur
Bestimmung von Na, K, Li und Ca in Blut, Glas, Metallen, Zement, Keramik und
Mineralien. Als Brenngas wird Propan, Butan und Acetylen verwendet. Als
Oxidationsmittel reicht Luft aus.
Anregung durch induktiv gekoppeltes Plasma ICP (inductively coupled plasma)
Die ICP-Methode ist die populärste
Anregungsmethode bei der AES wegen ihrer hohen
Empfindlichkeit, hohen Präzision, geringen
Matrixeffekten und Möglichkeit zur
Multielementanalyse. Der Plasmabrenner wird mit
Argongas versorgt. Die Hochfrequenzspulen (mit
Argon gekühlt) werden mit 27MHz versorgt. Die
Anfangsionisierung erfolgt durch einen Funken aus
einer Tesla-Spule. Durch das Magnetfeld der Spulen
werden die Ionen auf Kreisbahnen geleitet. Ihr
Widerstand gegen die Bewegung führt zu
Temperaturen bis zu 10.000 K. Die Probe, die durch
einen weiteren Argonstrom in die die Plasmaflamme
eingespeist wird, wird somit angeregt und emittiert
weiter oben Strahlung. Die Messung der Strahlung
kann im 90°-Winkel erfolgen (höhere Stabilität) oder
entlang der Brennerachse (höhere Empfindlichkeit).
Bei modernen Multielement ICP AES Geräten wird
der Strahl mit einem Spalten-Array auf einen
Photomultiplier geleitet und kann so
wellenlängenspezifisch detektiert werden.
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Anregung durch Lichtbogen (electric arc)
Die Probe(fest, flüssig, gasförmig, gut verteilt) wird in die Zwischenzone zweier
Elektroden (Graphit) gebracht. Bei geringem Abstand wird der Bogen durch einen
Funken gezündet und durch die entstandenen Ionen bildet sich ein Lichtbogen aus,
der mit starkem Strom (2200 – 4400V) die thermische Ionisierung unterhält. Durch
die aufgebrachte Energie gelangen Atome durch Desorption in die Gasphase und
werden angeregt.
Anregung durch Funkenentladung
Durch Funkenentladung kann eine höhere Präzision erreicht werden. Diese Methode
ist geeignet für leitende Festkörper, also Metalle und Legierungen. Dabei wird die
Probe über einer Wolframelektrode plaziert, wo dann der Funken entsteht. Zur
Analyse werden dann Referenzmaterialien herangezogen.
Laseranregung
Dabei wird die Energie in Form eines Lasers zugeführt, entweder kontinuierlich oder
pulsed. Das abgetragene Volumen wird dabei kleiner. Diese Methode hat den Vorteil,
dass damit ganze Oberflächen analysiert werden können.
Die AES wird angewendet im Bergbau und Industrie, bei Abfall und Altlasten, in der
Medizin, Toxikologie, Archäometrie, Geologie und Astronomie und beim Arbeits- und
Umweltschutz.
Röntgenfluoreszenzanalyse (RFA)
Funktionsprinzip: Die Probe wird mit Röntgenstrahlen
beschossen, durch die hohe Energie werden kernnahe
Elektronen herausgeschlagen, beim Zurückfallen
energetisch höher liegender Elektronen wird
elementspezifische Strahlung emittiert. Als
Konkurenzreaktion kann auch ein weiteres Elektron
emittiert werden, welches dann Auger-Elektron genannt
wird.
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Die Anzahl der erlaubten Elektronen
Übergänge ist dabei beschränkt.
Auswahlregeln: Δl = +-1(Orbitaltyp muss um 1
gewechselt werden: p  s), Δj = 0, +-1
(Orbitalindex muss gleich bleiben oder um 1
wechsel: p2  s1) Man unterscheidet zwischen
der L-Serie (langwellig, geringere Energie,
Rückfall auf das L-Niveau) und der K-Serie
(kurzwellig, höhere Energie, Rückfall auf das KNiveau). Die griechischen Buchstaben
beschreiben, aus welcher Schale das Elektron
kommt, α bedeutet aus der nächst höheren,
usw. Der Index nach dem griechischen
Buchstaben beschreibt zusätzlich noch das
Niveau innerhalb der Schalen, so ist die
Energiedifferenz α1 etwa größer als α2. Die Kα
und die Lα-Linien sind dabei die wichtigsten im
Spektrum.
Bei der RFA unterscheidet man zwischen wellenlängendispersiven und
energiedispersiven Geräten.
Wellenlängendisperisve Geräte WD-RFA
Die Probe wird mit Röntgenstrahlen beschossen,
der Kollimator lässt nur die parallelen
Fluoreszenstrahlen durch, die dann auf einem
Kristall gebeugt werden und dann zum Detektor
gelangen, somit wird immer nur einer Wellenlänge
detektiert, je nach Lage des Kristalls und des
Detektors, die beweglich sein müssen, der Detektor
muss sich dabei doppelt so schnell drehen wie der
Kristall. Wellenlängedispersive Geräte haben eine
bessere Empfindlichkeit und Auflösung, sind aber
teurer und benötigen mehr Zeit.
Energiedispersive Geräte ED-RFA
Bei dieser Variante erfolgt die Detektion aller Wellenlängen zeitgleich mit einem
Halbleiter-Detektor. Den Wellenlängen können dabei Energien zugeordnet werden.
Dadurch können alle Elemente in kurzer Zeit detektiert werden.
Strahlungsquelle - Röntgenröhre
In der evakuierten Röhre befindet sich ein
Wolfram-Heizdraht als Katode und eine massive
Metall-Anode. Beim Anlegen der Spannung an
der Katode werden Elektronen emittiert und zur
Anode beschleunigt, beim Abbremsen wird
Bremsstrahlung in Form von Röntgenstrahlung
frei, die dann durch ein Be-Fenster (gut
durchlässig) auf die Probe gerichtet wird.
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Detektoren
Szintillationsdetektor für WD-RFA(?)
Beim Auftreffen der Fluoreszenzstrahlung auf einen
Szintillationskristall (NaI) werden Photonen proportional
der Energie emittiert, durch einen PM in einen elektr.
Impuls umgewandelt und von der Elektronik ausgewertet.
Si(Li)-Detektor für ED-RFA
Die Strahlung gelangt durch ein Be-Fenster auf
den Kristall und wird im Lithium-dotierten Bereich
absorbiert, dabei entstehen Elektronen, die zur nleitenden Schicht wandern, und Elektronenlöcher,
die zur p-leitenden Schicht wandern. Die dadurch
gemessen Stromstärke ist proportional zur
Energie der absorbierten Strahlung.
Die Quantifizierung der emittierten Fluoreszenzstrahlung erfolgt über die Intensität.
Intsek = k*Intpr*Ni*p*ω*c
Ni = Zahl der Ionisationen des Orbitals pro einfallendem Photon
p = Übergangwahrscheinlichkeiten
ω = Fluoreszenzausbeute, Wahrscheinlichkeit, dass ein Photon, statt einem Elektron
emittiert wird
Vorteile der RFA
Nachteile
Hohe Empfindlichkeit 0,1-1ppm
Geringe Eindringtiefe  nur Oberfläche
analysierbar
Hohe Richtigkeit 1%
Probe als planarer Film nötig
Multielemtanalyse
Totalrefelxion RFA (TRFA) – energiedispersiv
Bei dieser speziellen Methode wird der
Röntgenstrahl in einem sehr kleinen
Winkel auf die Probe gerichtet, sodass
er totalreflektiert wird. Dadurch dringt
der Strahl kaum ein und es werden nur
die obersten Schichten angeregt, somit
erhält man ein besseres
Signal/Rausch-Verhältnis. Der Detektor
ist über der Probe angeordnet,
bekommt somit keine Primärstrahlung
und Streustrahlung ab.
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Probenvorbereitung
Vorteile der TRFA
Noch höhere Empfindlichkeit <0,1ppb
Größerer LDR
Geringere Matrixeffekte
Nachteile
Wie RFA
Molekülanalytik
Molekülspektroskopie
Methode
benützte Strahlung
Elektronenspektroskopie
UV
UV
Fluoreszenz
UV/VIS
Circulardichroismus
UV/VIS
VIS
VIS
Schwingungs-/Rotationsspektroskopie
Raman
VIS/nIR
IR
mIR/fIR
Anregung von
Elektronen
Elektronen
Elektronen
Elektronen
Schwingungszustände
Schwingungs-/Rotationsz.
Photolumineszenz - Fluoreszenz
Werden Moleküle durch Absorption von Strahlung angeregt, so emittieren sie
Lumineszenzstrahlung in alle Richtungen. Man unterscheidet dabei zwischen:
 Fluoreszenz (kurzlebig, ns)
 Phosphoreszenz (langlebiger, s)
 zweitverzögerte Fluoreszenz (kein analytischer Nutzen)
Vergleicht man das Anregungsspektrum und das Fluoreszenzspektrums eines
Moleküls, so ist das Fluoreszenzspektrum in der Regel gegen größere Wellenlängen,
also kleinere Energien verschoben. Beim Anregen der Elektronen nehmen diese
verschiedene Schwingungszustände im angeregten Zustand an. Die Elektronen
relaxieren schneller in den Grundzustand des angeregten Zustandes und geben
dabei minimal Energie an die Umgebung in Form von Wärme ab. Erst danach fallen
sie in den Grundzustand zurück (dabei wird Fluoreszenz emittiert) und nehmen da
auch wieder verschiedene Schwingungszustände an, aus denen sie dann wieder
strahlenlos in den Grundzustand relaxieren. Daraus folgt, dass das
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Emissionsspektrum unabhängig vom Absorptionsspektrum ist und dass die Struktur
der Schwingungsniveaus die Struktur der Spektren bestimmt.
Fluoreszenzintensität F
F = Int*Φ*(2,303*ε*c*b)
ε = molarer Absorptionskoeffzient bei emittierter λ, vgl. Lambert-Beer
Φ = Fluoreszenzaubeute, emittierte Photonen/absorbierte Photonen
Anforderungen an die Geräteteile bei Fluoreszenzspektrometern
Lichtquelle: über gesamten spektralen Bereich konstante Intensität
Filter/Monochromator: über gesamten Bereich gl. effizient, unabh. von Polarisation
Detektor: bei allen Wellenlängen gleicher Response
2 unterschiedliche Gerätetypen:
Filterfluorometer, optimaler Winkel 90°
Spektralfluorometer
Anwendung der Fluoreszenz in der Bioanalytik und org. Analytik
Intrinsische Fluoreszenz
Proben emittieren selbständig Fluoreszenzstrahlung nach Anregung.
Fluoreszenzmodulierende Faktoren:
3D-Struktur
Puffer
Lösungsmittel
Detergentien (Reinigungsmittel)
Matrix
Temperatur: Intensität sinkt mit steigender Temperatur
Innerer Filtereffekt
Extrinsische Fluoreszenz
Die Probenmoleküle müsse modifiziert (Fluoreszenzmarkierung) werden, damit sie
Fluoreszenzstrahlung emittieren, dies geschieht mit so genannten
Fluoreszenzsonden:
 Kovalent gebunden (-NH2 oder –SH)
 Nicht-kovalent gebunden
Beispiele für fluoreszierende Reagentien: Fluoresceinisothiocyanat, Dansylchlorid
Reagentien, die selbst nicht fluoreszierend sind, aber ein fluoreszierendes Produkt
ergeben: Fluorescamin, OPA
Anwendungen der Fluoreszenzspektroskopie:
DNA-Analyse, gekoppelt mit CE
Qual. und quant. Bestimmung von NO
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Chemi- und Biolumineszenz
Chemilumineszenz tritt bei organischen Molekülen auf, Biolumineszenz hingegen bei
biologischen Molekülen wie etwa Enzyme. Die Anregung der Probe erfolgt dabei
nicht durch Strahlung, sonder durch chemische, elektrische oder thermische Energie.
Funktionsweise
Anwendungen - Chemilumineszenz:
Knicklicht, chemische Reaktion
Reaktion von Luminol, die durch Metallionen, Oxidasen und Substraten katalysiert
wird  Oxidasen, Metallionen in Zellen detektierbar, DNA, Proteine, Blut
(Hämoglobin) nachweisbar
Biolumineszenz: Nukleinsäuren nachweisen
Vorteile UV/VIS und
Nachteile
Fluoreszenz/Chemo/Biolumineszenspektroskopie
UV/VIS geringer instrumenteller Aufwand Geringe Selektivität
Einfach Handhabung
Komplexe Probenvorbereitung
HTP-Technik
Eingeschränkte Linearität
Kurze Analysenzeit
Komplexe Matrix
Breite Einsetzbarkeit
Hohe Richtigkeit
Strukturspezifisch (selektiv)
Chemo- und Biosensoren
Sensorik
Sensoren besitzen bestimmte Vorteile gegenüber der instrumentellen Analytik in den
Bereichen Biomedizin, Umweltanalytik, Prozesskontrolle, Sicherheitsüberwachung
und PAT:
 Echtzeitinformationen
 Anwendungen in explosionsgeschützen Räumen
 Messung toxischer Substanzen ohne direkten Kontakt
 Intensivüberwachung in der Medizin
 Zeit- und ortsaufgelöste Überwachung von Umweltschadstoffen
 Kontinuierliche Beobachtung: on-line (im Reaktor, Überwachung von
Synthese, Zwischenprodukten, Reaktion außer Kontrolle?), off-line (Probe
muss entnommen werden), at-line (große Nähe zu Reaktor 0,5m), in-line
(Leitung zur Analyse und Rückleitung)
Konzept eines Sensors
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Moleküle binden sich an Rezeptor, Bindung wird vom Transducer in Signal
umgewandelt und von der Elektronik verwertet. Ist der Sensor gesättigt, so ist die
Beladungskapazität erreicht, was dem oberen Limit bei der Quantifizierung
entspricht. Man unterscheidet zwischen Singleanalyt- und Multianalytsensoren.
Der Multianalytsensor besitzt eine Sensorschicht, deren Rezeptoren die spezifischen
Moleküle binden. Im Idealfall erzeugt jeder Rezeptor das gleiche Signal am
Transducer. Das Signal wird dann über einen Multiplexer zur Elektronik
weitergeleitet.
Optische Transducer
Arbeiten nach den Prinzipien: Absorption, Transmission, Emission, Reflexion,
Polarisation, Streuung und Brechung
Vorteile: sind miniaturisierbar, einsetzbar in der Telemetrie (Fernmessung) und
explosionsgeschützen Räumen und sind wenig störanfällig gegenüber eletromag.
Feldern.
Extrinsischer optischer Transducer
Besteht aus einem gekreuztem Glasfaserkabel. Am Ende ist ein Membran
angebracht, der Fluorophormoleküle enthält. Lagern sich Analytmoleküle an die
Membranmoleküle an, so werden sie durch die einfallende Strahlung aus der einen
Glasfaserhälfte angeregt und emittieren Fluoreszenzstrahlung, die dann über die
zweite Hälfte zur Elektronik geleitet wird. Vorteile: einfacher Aufbau, geeignet für invivo Anwendungen, chemische Inertheit, thermische Unempfindlichkeit
Intrinsischer optischer Transducer
Fluoreszenz: An der Grenzfläche einer Glasfaser sind Fluorophormoleküle
angebracht, die Fluoreszenzstrahlung emittieren, welche im Inneren total reflektiert
wird, lagern sich nun Analytenmoleküle an, so kommt es zu Änderungen im
Fluoreszenzverhalten.
Brechungsindex: An den Stellen, wo Totalreflexion auftritt, kommt es zur Ausbildung
evaneszenter Felder. Lagern sich nun Analytenmoleküle an, so ändern sich die
Felder  über diese Felder lassen sich Grenzflächenprozesse in dünnen Filmen
beobachten
Die Parameter werden durch die Struktur des Wellenleiters und des Analyten
bestimmt. Eine örtlich aufgelöste Abfrage wird erreicht mit besserer
Stralungsausbeute.
Elektrochemischer Transducer
Sie erfassen teilchenspezifische Änderungen von Strömen, frequenzabh.
Leitfähigkeit, Grenzflächenpotentialen, Spannungen, Widerständen und Kapazitäten.
Geeignet für Gase und Flüssigkeiten. Der bedeutendste elektrochemische
Gassensor ist die Lambda-Sonde, dabei wird der Sauerstoffgehalt der Außenluft mit
dem Restsauerstoff im Abgas verglichen. Außerdem: Blutglukosesensor
Massensensitiver Transducer
Schwingquarze: ein in Resonanz schwingender Kristall reagiert auf Veränderungen
der Massenbeladung
Cantilever: ist ein wenige mm langer, frei schwingender Hebel, dessen Frequenz auf
die Massenbeladung reagiert. Die Messung erfolgt beispielsweise mittels
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Laserreflexion. Die auf den Cantilever aufgebrachte Schicht bestimmt die zu
analysierende Moleküle, Zukunft: C-Nanotubes als Cantilever
Kalorimetrischer Transducer
Die freiwerdende Reaktionswärme führt zur Temperaturerhöhung kleiner
Thermoelementanordnungen  Messung der Temperaturänderung; Besonders zum
Nachweis von enzymgesteuerten Reaktionen geeignet, zB. Pilze in Kläranlagen
Sensorschichten
Chemische Polymerfilme oder Halbleiterstrukturen
Reversibel aber geringe Selektivität
Biochemische Schichtsysteme
Selektiv, nicht besonders stabil und müssen regeneriert werden.
Charakteristika zur Leistungsfähigkeit einer Sensorschicht:
 Selektivität: beschreibt die Fähigkeit, aus einer Anzahl von
Reaktionsmöglichkeiten eine bevorzugt auszusuchen
Ist die Selektivität nicht ausreichend, so können unterschiedliche Schichten
eines Sensorarrays oder numerische Verfahren die Selektivität erhöhen
 Spezifität: spricht auf ausschließlich eine Möglichkeit an
 Sensitivität (Empfindlichkeit): entspricht der Steigung der Kalibrierkurve, große
Sensitivität: starke Änderung des Signals bei kleiner Änderung der Parameter
 Reversibilität: Umkehrbarkeit der Reaktion  kontinuierliche Messung
 Stabilität: Lagerung, physikalische Einflüsse wie Licht, Temperatur,…
Halbleiter&
Halbleiterstrukturen
Sind sehr inert, gebräuchlich bei gasförmigen Analyten, hitzebeständig, billig, durch
Dotierung kann partielle Selektivität erreicht werden, sogar Temperaturgradienten
möglich, WW beruht meist auf Physisorption
Polymerfilme
Einsatz in der Chromatographie, locker quervernetzte Polymere können quellen und
somit Analytenmoleküle festhalten.
Molecular Imprinted Polymers (MIP)
Die zu untersuchende Moleküle befinden sich bei der Herstellung im Polymer und
werden dann herausgelöst, somit werden später nur entsprechende
Analytenmoleküle aufgenommen.
Indikatorfarbstoffe: sind in Membrane eingebettet und zeigen Farbumschläge bei
WW mit Analytenmolekülen.
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Flüssigkristalle: bei WW mit Analyten wird der Polarisationszustand gestört, kann mit
Transducer beobachtet werden.
Supramolekulare Rezeptoren:
Ähnlich wie bei MIPs werden solche Strukturen synthetisiert, die später selektiv
Analytenmoleküle aufnehmen können, die Reaktion kann sogar spezifisch sein.
Zukunftsentwicklung: Miniaturisierung und Implantierung (zB. Formänderung 
Magnetfeldänderung)
Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA)
Prinzip: Die Oberfläche wird mit einem sehr präzisen Elektronenstrahl (5-100nm) von
typischerweise 20keV beschossen, der Strahl dringt in die Probe ein und durch die
WW formt sich eine Anregungsbirne. Es wird charakteristische Röntgenstrahlung
durch Ionisierung emittiert (qual. Information), zusätzlich entstehen
Sekundärelektronen als Konkurenzreaktion durch Anregung und
Rückstreuelektronen durch elastische Streuung an Kernen. Es kann, je nachdem wie
der Strahl geleitet wird, eine Punk-, Linien- oder Flächenanalyse durchgeführt
werden.
Vergleich Elektron – Photon
Elektron: hat einen höheren WW-Querschnitt σ  höhere Signale, aber Vakuum
notwendig; Der Strahl kann durch das Magnetfeld einer Spule beeinflusst werden
und somit sehr scharf fokussiert werde
Ionisation
Innere, kernnahe Orbitale
A + ep  A+* + 2eA+*  A+ + hv (Röntgenstrahlung für ESMA)
A+*  A2+ + e- (Auger-Elektron, char. Energie)
Valenzorbitale
A + ep  An+ + ne- (SE)
Nur oberflächennahe Elektronen können die Probe verlassen 
Oberflächenmorphologie: hohe Sensitivität, hohe Tiefenschärfe
Winkelabhängigkeit: steilere Stücke haben ein größeres Volumen, emittieren also
mehr SE und erscheinen daher am Bildschirm heller. Durch Erhebungen kommt es
außerdem zu Abschirmungseffekten, wodurch weniger Elektronen zum Detektor
gelangen (mit Spannung angesaugt) und daher die Stelle dunkler erscheint. Die
Bilddarstellung erfolgt früher über die synchrone Führung des Elektronenstrahls über
der Oberfläche und auf dem Bildschirm (Katodenstrahlröhre). Heute erfolgt die
Bildverarbeitung digital. Die Auflösung der erhaltenen Bilder ist abhängig vom
Durchmesser des Elektronenstrahls.
Die emittierte Röntgenstrahlung entsteht durch Rückfall von Elektronen vom
angeregten Zustand in den Grundzustand, dabei sind die Übergänge durch die
Auswahlregeln beschränkt.
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Elastische Streuung an Kernen (nur Richtungsänderung, kein Energieverlust)
Treffen Elektronen auf die Probe, so wird ein Teil absorbiert, ein Teil als BSE
rückgestreut. Das Verhältnis von absorbierten Elektronen zu BSE wird mit steigender
Kernladungszahl Z kleiner, schwerere Elemente erzeugen also mehr BSE und
erscheinen somit heller. Um Proben überhaupt analysieren zu können, müssen sie
im Vakuum beständig sein und elektrisch leitend sein. Isolatoren können unter
anderem durch eine leitende Beschichtung (mit Au oder C bedampfen) analysiert
werde. Die Probe muss außerdem geerdet werde, da eine lokale Aufladung zu
starken elektrostatischen Abstoßungen führen würde, was die Probe zerstören
würde. Die Messung von BSE kann Informationen über die ungefähre
Zusammensetzung der Probe ermöglichen, speziell, wenn die Inhalte bekannt sind.
Da die Helligkeit von der mittleren Kernladungszahl abhängig ist, würden etwa Oxide
dunkler erscheinen.
Inelastische Streuung an Kernen
Folgen der Inelastischen Streuung sind die Bildung von SE (aus Valenzorbitalen,
dünner Strahl im Vergleich zu den BSE, da nur die obersten Elektronen die Probe
verlassen können).
Elastische Streuung an Elektronenhülle
Anwendung bei sehr dünnen, elektronentransparenten Proben. Es können
hochaufgelöste Abbildungen durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
oder Beugungsmuster durch Elektronenbeugung (THEED) gewonnen werden, diese
Techniken sind jedoch Inhalte anderer Vorlesungen.
Analytische Volumina
SE entstehen zwar in der gesamten Anregungsbirne, können jedoch nur eine Schicht
von 5nm verlassen, in diesem Bereich ist der Elektronenstrahl noch sehr schmal,
was eine hohe Auflösung durch SE begünstigt.
BSE kommen aus einer Tiefe von 100 – 200nm. Sie erlauben nur eine grobe
Unterscheidung von Ordnungszahlen.
Röntgenstrahlung wird noch aus einer Tiefe von einigen μm emittiert. Sie ist jedoch
spezifisch und somit kann eine qualitative Zuordnung durch
Röntgenfluoreszenzanalyse erfolgen. Die Quantifizierung erfolgt über die Intensität.
Int = k*Is*R*Ni*p*ω*c
Is = PE-Strom, R = Rückstreufaktor, p = Übergangwahrscheinlichkeiten
Durch den Vergleich mit einem Standard, dessen Zusammensetzung grob der, der
Probe entspricht, kann in erster Näherung durch Int A/IntS = cA/cS eine Quantifizierung
erfolgen. Die Fluoreszenzausbeute ω steigt mit steigender Kernladungszahl, somit
sind leichte Elemente schwer zu messen (Limitierung).
Analytische Charakteristika
Erfassungsgrenze: 0,01 – 0,1%
Richtigkeit bei Hauptbestandteilen gut, bei Nebenbestandteilen mittel, für Spuren
jedoch sehr schlecht  keine Spurenanalyse
Elementbereich: B  U
Somit ist die ESMA sinnvoll als qual. und quant. Mikrobereichsanalyse von Hauptund Nebenbestandteilen, jedoch nicht von Spuren (quant.).
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Gerätetechnik
Der austretende Elektronenstrahl wird
durch mag. Kondensatorlinsen (Spulen)
fokussiert, über 2 Abtastspulen kann der
Strahl in x- und y-Richtung verschoben
werden ( Rasterung), die Objektbühne
ist in alle Richtungen und auf allen
Achsen verstellbar, das gesamte Gerät
steht unter extremen Vakuum.
Die Erzeugung des Vakkum erfolgt durch Turbo Molekular Pumpen, deren Blätter mit
einer höheren Geschwindigkeit rotieren, als die Bewegung der Gasmoleküle.
Elektronenerzeugung
Ein stromdurchflossener Wolframdraht (endliche
Lebensdauer) emittiert bei hohen Strömen Elektronen,
ein Wehnelt-Zylinder, der relativ zum Wolframdraht ein
negatives Potential besitzt konzentriert die Elektronen
in den unteren Bereich (neq. Potential stößt Elektronen
ab, einziges Loch unten).
Detektoren
Für Röntgenstrahlen: Proportionalzähler, Halbleiterdetektor, Szintillationsdetektor
Für Elektronen: Halbleiterdetektor, Szintillationsdetektor
Spezielle Halbleiterdetektor: ist die Oberfläche
glatt, so detektieren beide Hälften den gleichen
Strom und die Differenz ist 0, anderfalls resultiert
ein Gesamtstromfluss.
Propotionalzählrohr:
Einfallende Röntgenstrahlen ionisiert Argon,
freiwerdende Elektronen führen zu einer
Ionisationskaskade, die Elektronen können als
Stromfluss detektiert werden.
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Wellenlängendispersive Detektion:
Durch die Brechung der Strahlung an Kristallen
nach dem Bragg`schen Gesetz wird jede
Wellenlänge einzeln detektiert  bessere
Auflösung der Peaks
Energiedispersive Detektion:
Erfolgt über Halbleiter-Detektor, die gemessene
Stromstärke ist dabei proportional der Energie der
auftreffenden Röntgenstrahlung, jedoch relativ
große Totzeit
Vorteile EDS: Multielementanalyse, keine Fokussierung notwendig
Nachteile: limitierter Elementbereich (fensterlos ab B, mit Be-Fenster ab Na),
geringere Auflösung, geringere Empfindlichkeit
Gerätetypen
Elektronenstrahl-Mikrosonde
Durchmesser Elektronenstrahl: 100nm, WDS, EDS Auflösung: 1-5μm, Einsatz zur
qual. und quant. Elementaranalyse
Rasterelektronenmikroskopie
Durchmesser: 5-10nm, EDS > WDS, Auflösung 5nm für SE, 100-200nm für BSE,
Einsatz zur Abbildung, qual. und semiquant. Elementaranalyse
Niedervakuum und Environmental SEM
Allgemein führt die Streuung an den Gasmolekülen zu schlechterer Auflösung. Durch
einen Konus wird der Arbeitsabstand verkürzt, somit kann eine zufriedenstellende
Auflösung erzielt werden. Diese Methoden werden angewandt, um auch Proben zu
untersuchen, die im extremen Vakuum nicht beständig sind, aber auch für Isolatoren
ergibt sich eine Möglichkeit. Durch die Stöße mit den Gasmolekülen, existieren
positive Ladungsträger in der Luft, die Probe ist durch den Beschuss negativ
geladen, aber die Ladung wird durch die positiven Ladungen kompensiert, somit lädt
sich ein Isolator nicht auf und kann auch untersucht werden.
Large-field-Detektion: Die emittierten SE stoßen auf Gasmoleküle, was eine Kaskade
zur Folge hat, dadurch kann sogar das Signal verstärkt werden.
In das Vakuum wird ein Gas eingebracht, oft Wasser, um den Partialdruck zu heben
(biologische Systeme geben kein Wasser ab  detektierbar)
Wenn man sich das Phasendiagramm für Wasser anschaut, so gibt es sogar einen
Arbeitsbereich, in dem wässrige Flüssigkeiten untersucht werden können
(Temperatur nur gering über Nullpunkt)
Anwendung
SE  Morphologie
BSE  grobe Unterscheidung der mittlernen Kernladungszahl
Röntgenstrahlen  qual. und quant. Elementinformationen
Einsatz in Geologie, Umweltforschung, Medizin, Materialwissenschaft
Limitierung: atomare Auflösung nicht möglich, 1-3μm wegen Anregungsbirne
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