Biochemische und strukturelle Charakterisierung von YopM

Biochemische und strukturelle
Charakterisierung von YopM aus Yersinia
enterocolitica WA-314 und dessen WirtsZielstrukturen
Dissertation
Zur Erlangung der Würde des Doktors der Naturwissenschaften
des Fachbereichs Biologie, der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften,
der Universität Hamburg
vorgelegt von
Dipl.-Biol. Andreas Rumm
aus Speyer
Hamburg, 2014
Die vorliegende Arbeit wurde von November 2009 bis Mai 2014 unter Anleitung von
Prof. Dr. Martin Aepfelbacher am Institut für Medizinische Mikrobiologie, Virologie und
Hygiene am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf durchgeführt.
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
im Fachbereich Biologie
der Universität Hamburg
vorgelegt von
Diplom-Biologe Andreas Rumm
aus Speyer
Dissertationsgutachter:
Prof. Dr. Martin Aepfelbacher
Prof. Dr. Wolfgang Streit
Tag der Disputation:
08. August 2014
I Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis
I Inhaltsverzeichnis ................................................................................................... 3
II Einleitung................................................................................................................ 5
II.1 Die Gattung Yersinia..................................................................................... 5
II.2 Yersinia enterocolitica................................................................................... 6
II.2.1 Klassifizierung .................................................................................... 6
II.2.2 Pathogenese und Infektionsroute ...................................................... 7
II.3 Virulenzfaktoren ............................................................................................ 7
II.3.1 Chromosomal vermittelte Virulenz ..................................................... 7
II.3.2 Das Virulenzplasmid .......................................................................... 9
II.5 LRR-Proteine .............................................................................................. 16
II.5.1 YopM in der Familie der LRR-Proteine ............................................ 18
II.6 DDX3 .......................................................................................................... 19
II.6 Zielsetzung ................................................................................................. 22
III Material und Methoden ....................................................................................... 23
III.1 Material ...................................................................................................... 23
III.1.1 Geräte ............................................................................................. 23
III.1.2 Verbrauchsmittel ............................................................................. 24
III.1.3 Kits, Enzyme und Reagenzien ........................................................ 25
III.1.4 Puffer und Lösungen ....................................................................... 26
III.1.5 Protein und DNA Leitern ................................................................. 31
III.1.6 Bakterienstämme ............................................................................ 32
III.1.7 Plasmide ......................................................................................... 32
III.1.8 Oligonukleotide ............................................................................... 35
III.1.9 Elektronische Datenverarbeitung .................................................... 38
III.2 Methoden ................................................................................................... 39
III.2.1 Mikrobiologische Methoden ............................................................ 39
III.2.2 Molekularbiologische Methoden ...................................................... 40
III.2.3 Biochemische Methoden ................................................................. 44
III.2.4 Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen ............................. 51
3
I Inhaltsverzeichnis
IV Ergebnisse .......................................................................................................... 54
IV.1 Strukturaufklärung von YopM .................................................................... 54
IV.1.1 Klonierung, Expression und Aufreinigung von YopM aus
Y. enterocolitica WA-314........................................................................... 54
IV.1.2 Überprüfung des Translationsstarts von YopM aus
Y. enterocolitica WA-314........................................................................... 56
IV.1.3 Analytische Größenbestimmung und Dispersitätskontrolle von YopM
.................................................................................................................. 58
IV.1.4 Strukturanalyse von YopM .............................................................. 59
IV.2 Überprüfung des inhibitorischen Effekts von YopM auf Caspase-1 ......... 70
IV.3 Interaktion von YopM mit der DEAD-Box-Helikase DDX3 ......................... 72
IV.3.1 GST-Pulldown ................................................................................ 72
IV.3.2 Heterologe Expression und Aufreinigung von DDX3 ...................... 73
IV.3.3 Struktur von DDX3_51-418 in Lösung ............................................ 75
IV.3.4 Bestimmung der Bindungsaffinität von YopM und DDX3 ................ 77
IV.3.5 Darstellung des Komplexes aus YopM und DDX3 mittels
Größenausschlusschromatographie ......................................................... 80
IV.4 Strukturanalyse des Komplexes aus YopM und DDX3 ............................. 84
IV.4.1 Kristallisation von YopM/DDX3 ....................................................... 84
IV.4.2 Struktur des Komplexes aus YopM und DDX3 in Lösung ............... 86
V Diskussion ........................................................................................................... 91
V.1 Struktur von YopM aus Y. enterocolitica WA-314 ............................... 91
V.2 YopM und Caspase-1 ......................................................................... 98
V.3 YopM und DDX3 ................................................................................. 99
VI Zusammenfassung ........................................................................................... 104
VIa Summary ......................................................................................................... 105
VII Literaturverzeichnis......................................................................................... 106
VIII Tabellenverzeichnis........................................................................................ 126
IX Abbildungsverzeichnis .................................................................................... 127
X Abkürzungsverzeichnis .................................................................................... 129
XI Danksagung ...................................................................................................... 132
XII Vorveröffentlichungen .................................................................................... 134
XIII Eidesstattliche Versicherung......................................................................... 135
4
II Einleitung
II Einleitung
Der menschliche Darm ist von einer Vielzahl an Bakterien besiedelt, die einen
unterstützenden Einfluss auf die Verdauung oder das Immunsystem des Menschen haben
können. Neben diesen Kommensalen gibt es jedoch auch eine Reihe potenziell pathogener
Erreger, die in den Darm gelangen. Das Darmepithel bildet hier eine wirksame Barriere, um
den Körper vor Infektionen durch Mikroorganismen zu schützen. Neben dem physikalischen
Schutz ist dieses Gewebe mit einer Vielzahl von Zellen des angeborenen sowie des adaptiven
Immunsystems besiedelt, die effektiv die Invasion durch Pathogene verhindern (Turner 2009).
Diese Barriere ist jedoch nicht absolut und so haben einige Erreger Wege gefunden, die
Mechanismen der Immunabwehr auszuhebeln und sich ihre Nische im menschlichen Körper
zu suchen. Das Eindringen dieser Mikroorganismen in den Körper kann zu
lebensbedrohlichen Infektionen führen.
II.1 Die Gattung Yersinia
Yersinien sind gram-negative, stäbchenförmige Bakterien aus der Familie der
Enterobacteriaceae.
Sie
wachsen
fakultativ
anaerob,
sind
Katalase-positiv,
Zytochromoxidase-negativ und bilden keine Sporen. Benannt ist die Gattung seit 1964 nach
Alexandre J. Yersin, dem es während der Hong Kong-Epidemie 1894, zeitgleich mit
Shibasaburo Kitasato, erstmals gelang Yersinia pestis aus menschlichem Gewebe zu
isolieren und zu beschreiben (Drancourt & Raoult 2002; Treille & Yersin 1894).
Unter den 11 bisher beschriebenen Arten sind lediglich drei humanpathogen: Yersinia
enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis und Yersinia pestis. Die Krankheiten, die diese
Erreger verursachen, reichen von einer harmlosen, selbstlimitierenden Gastroenteritis bis zur
Pest, die unbehandelt in 70-90 % der Fälle tödlich ist.
Y. pestis ist in der Lage bei Temperaturen von 4 bis 40°C zu wachsen, wobei das
Temperaturoptimum bei 28 bis 30°C liegt. Das Bakterium hat einen komplexen Lebenszyklus:
Der indische Rattenfloh (Xenopsylla cheopis), in dessen Magen sich die Bakterien vermehren,
überträgt diese als natürlicher Vektor auf den Menschen. Nach dem Biss des Flohs wandern
die Erreger von der subkutanen Eintrittsstelle in angrenzendes Lymphgewebe, wo sich nach
1-7 Tagen Inkubationszeit sogenannte Bubonen bilden. Von dort aus kann sich das Bakterium
über die Blutbahn weiter ausbreiten und Organe wie Leber, Nieren oder die Lunge befallen
(Perry & Fetherston 1997). Im Wesentlichen greift das Pathogen für diese parasitäre
Lebensweise auf Faktoren zurück die auf drei Virulenzplasmiden liegen (Wren 2003). pYV,
welches für ein Typ III-Sekretionssystem und eine Reihe von Effektorproteinen codiert, die
die Wirts-Immunabwehr unterdrücken, kommt in allen drei humanpathogenen Spezies vor. Im
Gegensatz dazu sind zwei weitere Plasmide ausschließlich in Y. pestis zu finden. Das
Plasmid pPla codiert unter anderem für einen Plasminogen-Aktivator und eine Coagulase,
welche für die subkutane Verbreitung innerhalb des Säugetier-Wirts notwendig sind
(Sodeinde et al. 1988). pMT1 wiederum ermöglicht durch das sogenannte „murine Toxin“ und
das „F1-capsule-like antigen“ das Überleben im Flohvektor (Hinnebusch et al. 1998;
Hinnebusch et al. 2002).
Durch die Aneignung und den Verlust dieser und anderer genetischer Faktoren hat sich
Y. pestis vor 1500-20000 Jahren aus Y. pseudotuberculosis zu einem obligat parasitären
Organismus entwickelt (Achtman et al. 1999).
5
II Einleitung
Y. pseudotuberculosis, das eine Homologie in der chromosomalen DNA von bis zu 97 % im
Vergleich mit Y. pestis besitzt, zeigt ein deutlich weniger dramatisches klinisches Bild. So
befällt dieser Erreger, der natürlicherweise in der Umwelt vorkommt, überwiegend Tiere
(Chain et al. 2004). Die Übertragung auf den Menschen findet ausschließlich durch den
Verzehr kontaminierter Lebensmittel oder Wasser statt. Nach Aufnahme der Bakterien,
gelangen diese in den Dünndarm, wo sie in der Lage sind über sogenannte M-Zellen in den
Peyerschen Plaques durch das Darmepithel in anliegendes Lymphgewebe zu translozieren
(Sansonetti 2004; Lian et al. 1987). Dort kommt es durch Entzündungserscheinungen zu den
typischen Symptomen der Gastroenteritis, welche sich bis zu einer mesenteren Lymphadenitis
entwickeln kann.
Trotz der genetisch nicht so nahen Verwandtschaft, zeigt Y. enterocolitica, der dritte
humanpathogene Erreger der Gattung, deutlich mehr Parallelen in Lebenszyklus und
Pathogenität zu Y. pseudotuberculosis als Y. pestis (Perry & Fetherston 1997). So stellt
Y. enterocolitica den zweiten Erreger der humanen Yersiniose dar (Vantrappen et al. 1977).
Er wird ebenso über kontaminiertes Fleisch sowie über Milchprodukte übertragen (Black et al.
1978). Nach Salmonella und Campylobacter ist Y. enterocolitica der dritthäufigste bakterielle
Durchfallerreger in Deutschland.
Allen drei humanpathogenen Yersinia-Spezies ist ihre Vorliebe für lymphatisches Gewebe
gemein. Durch ihre invasive Lebensweise bedingt sich eine gewisse Resistenz gegen die
körpereigene Immunabwehr. Dies gilt im Besonderen der Verhinderung der Phagozytose
durch Makrophagen und des Angriffs durch Leukozyten. Hierzu haben alle drei Pathogene,
teilweise unabhängig voneinander, eine Reihe chromosomaler oder plasmidär lokalisierter
Virulenzfaktoren erworben, die ihnen das Überleben im Organismus des Wirts ermöglichen
(Bleves & Cornelis 2000; Reuter et al. 2014). In den von ihnen ausgelösten Krankheitsbildern
unterscheiden sich die drei Spezies jedoch, wie dargestellt, enorm.
II.2 Yersinia enterocolitica
Erste Anzeichen auf Yersinia enterocolitica in der Literatur finden sich 1934 durch McIver und
Pike. Fünf Jahre später greifen Schleiffstein und Coleman die Entdeckung des Erregers auf
und geben ihm den Namen Bacterium enterocoliticum (Bottone 1997). Erst 1964 wurde die Art
durch Frederiksen der neuen Gattung Yersinia zugeordnet (Frederiksen 1964). Die Spezies ist
weit verbreitet und findet sich meist in aquatischen und tierischen Reservoiren, wobei das
Schwein das Hauptreservoir für humane Infektionen darstellt. Interessanterweise sind die
meisten Isolate, die nicht aus dem Hausschwein stammen apathogen (Bottone 1997).
II.2.1 Klassifizierung
Y. enterocolitica lässt sich auf Grundlage biochemischer Eigenschaften in 6 verschiedene
Biovare (1B, 1A, 2, 3, 4, 5) (Wauters et al. 1987) und durch Charakterisierung der O
(Lipopolysacharid)- und H (Geißel)-Antigene in über 60 Serovare einteilen. Unter den
Serotypen sind geographische Besonderheiten zu verzeichnen. So stellen O:4, O:8, O:13,
O:18, O:20 und O:21, die alle zu dem hoch pathogenen Biovar 1B gehören, die Hauptvertreter
in den USA dar (Aleksic & Bockemühl 1990), während in Europa eher die Stämme O:3,
O:5,27 und O:9 verbreitet sind (Kwaga et al. 1992). Diese gehören den weniger pathogenen
Stämmen 2-5 an. Biovar 1A ist apathogen. Neben der klassischen biochemischen
Charakterisierung findet heute vermehrt die Typisierung über Massenspektrometrie statt
(Stephan et al. 2011).
6
II Einleitung
II.2.2 Pathogenese und Infektionsroute
Analog zu Y. pseudotuberculosis gelangt der Mikroorganismus hauptsächlich durch
kontaminiertes Wasser oder durch den Genuss von befallenem Fleisch in den
Gastrointestinaltrakt (Aleksic & Bockemühl 1990), wodurch es zu akuter Enteritis,
Enterocolitis, mesenterischer Lymphadenitis oder terminaler Ileitis kommen kann (Bottone
1997). Angelangt im humanen Wirt, muss zunächst eine Anpassung der Oberflächenantigene
an die erhöhte Temperatur von 37°C stattfinden. Ein Teil dieser neu exprimierten Antigene ist
auf dem 64 bis 75 kb großen Virulenzplasmid pYV kodiert. Dieses Plasmid fehlt apathogenen
Stämmen (Portnoy et al. 1981). Es kodiert darüber hinaus für eine Reihe weiterer Proteine,
die dem Pathogen helfen zu invadieren und sich in seiner ökologischen Nische im
Extrazellularraum zu etablieren (Portnoy & Falkow 1981). Weitere wichtige Faktoren in dieser
Phase der Infektion sind chromosomal auf dem sogenannten „Attachment invasion locus“ Ail
kodiert (Miller & Falkow 1988). Im terminalen Ileum durchqueren die Bakterien das
Darmepithel durch sogenannte M-Zellen und besiedeln schließlich das darmassoziierte
lymphatische Gewebe der Peyerschen Plaques. Hierbei spielt das Membranprotein Invasin
eine große Rolle, indem es Kontakt mit zellulären β1-Integrinen vermittelt und nachgeschaltete
Signalwege induziert, die die Internalisierung der Bakterien zur Folge haben (Grassl et al.
2003). Nach der Translokation in die Peyerschen Plaques proliferiert das Bakterium im
Extrazellularraum und kann sich über abfließende lymphatische Gefäße bis in die
mesenteralen Lymphknoten ausbreiten (Trülzsch et al. 2007).
Um innerhalb des Wirts zu überleben und der angeborenen Immunabwehr zu entgehen,
bedient sich Y. enterocolitica einer Reihe von Virulenzfaktoren. Ein sehr großer Teil dieser
Faktoren liegt auf dem Virulenzplasmid pYV. Ebenso gibt es aber auch eine sehr große
Anzahl chromosomal vermittelter Virulenzdeterminanten, ohne die die invasive Lebensweise
des Pathogens nicht möglich wäre.
II.3 Virulenzfaktoren
II.3.1 Chromosomal vermittelte Virulenz
Im Gegensatz zu dem obligat parasitären Y. pestis kommt Y. enterocolitica als Umweltkeim im
Boden oder aquatischen Reservoiren vor und kann feuchte, natürliche Biotope sowie
Lebensmittel besiedeln. Hierfür ist ein hochadaptives Repertoir an Stoffwechseleigenschaften
von Nöten, wobei die Umgebungstemperatur eine wichtige Rolle bei deren Genexpression
spielt. So werden zum Beispiel Flagellen, die für die Motilität außerhalb des Wirts von
Bedeutung sind und das bakterielle Adhärenzprotein Invasin (Inv) bei gemäßigten
Temperaturen sehr stark exprimiert, bei 37°C jedoch kaum. (Straley & Perry 1995)
Yersinia spp. besitzen ein ca. 4,6 mb großes zirkuläres Genom mit einem durchschnittlichen
GC-Gehalt von 47 %. Neben den üblichen Haushaltsgenen, kam es durch horizontalen
Gentransfer zum Eintrag einer Reihe von Virulenzfaktoren, die zusammen mit plasmidär
kodierten Determinanten, eine optimale Anpassung an den Wirt darstellen. Diese Regionen
zeigen üblicherweise einen für die Spezies atypischen GC-Gehalt und sind als sogenannte
GC-Spitzen im Genom gut erkennbar.
7
II Einleitung
Abbildung 1: Genomvergleich von Y. enterocolitica WA-314 und 8081 (Garzetti et al. 2012).
Zirkuläre Darstellung des Genomvergleichs zwischen den Y. enterocolitica Stämmen WA-314 und 8081. GCGehalt des Stammes 8081 sowie die Position der wichtigsten Virulenzgene sind angezeigt.
Einer dieser Regionen ist die „High Pathogenicity Island“ (HPI). Dieser ca. 40 kb große
Bereich kodiert für ein Eisenaufnahmesystem und kommt in allen drei humanpathogenen
Spezies vor. Das System ermöglicht die Biosynthese und den Transport des Yersiniabactins
(Ybt). Dieses Siderophor komplexiert Eisenionen in der Wirtszelle und wird über das
Membranprotein FyuA („ferric yersiniabactin uptake“) von den Yersinien wieder
aufgenommen. Die HPI ist für eine systemische Infektion essentiell und daher meist bei
hochpathogenen Stämmen zu finden (Heesemann et al. 1993; Carniel et al. 1996; Brem et al.
2001).
Ein weiterer wichtiger chromosomaler Virulenzfaktor ist das 17 kDa Membranprotein AIL
(„Attachment Invasion Locus“), welches eine Rolle bei der Anheftung der Bakterien an
Epithelzellen spielt und die daraus resultierende Translokation in angrenzendes Gewebe
vermittelt. Im Gegensatz zu Invasin, welches bei Temperaturen über 30°C nur sehr gering
exprimiert wird, kommt AIL sowohl in der logarithmischen Wachstumsphase bei 30°C als auch
in der stationären Phase bei 37°C vor (Pierson & Falkow 1993). Entdeckt wurde das
Oberflächenantigen in einem E.coli-Screen auf genetisch übertragbare, invasionsvermittelnde
Faktoren. E.coli-Stämme, die das ail-Gen trugen, waren in der Lage an CHO-und Hep-2
Zellen zu adhärieren und in diese einzudringen (Miller & Falkow 1988). Bei Untersuchungen
zur Infektion im Maus-Modell spielte AIL, im Vergleich zu Invasin und dem weiter unten
beschriebenen YadA, jedoch eine untergeordnete Rolle (Pepe et al. 1995).
8
II Einleitung
Der wichtigste Internalisierungsfaktor der enteropathogenen Yersinia-Arten ist Invasin.
Entdeckt wurde das 103 kDa Oberflächenprotein, welches strukturelle Homologien zur Familie
der Intimine aufweist, zuerst in Y. pseudotuberculosis (Isberg et al. 1987) und später in
Y. enterocolitica (Pepe & Miller 1990). Hier beträgt das Molekulargewicht nur 92 kDa, was an
der Abwesenheit der Domäne D2 liegt (Grassl et al. 2003). Das Protein aus
Y. pseudotuberculosis vermittelt eine hochaffine Bindung an β1-Integrine der M-Zellen,
wodurch nachgeschaltet eine Reihe von Prozessen stattfindet, die zur Internalisierung der
Bakterien führt (Pepe & Miller 1993a; Pepe & Miller 1993b; Wiedemann et al. 2001). Für die
Bindung relevant sind hierbei die letzten 192 C-terminalen Aminosäuren (Leong et al. 1990).
In diesem konservierten Bereich ist das Y. enterocolitica Invasin, welches lediglich eine
molekulare Masse von 92 kDa besitzt, zu 79 % homolog. Die bevorzugte Expression bei
niedrigeren Temperaturen (23°C) belegt die Rolle des Invasins als wichtiger Virulenzfaktor der
frühen Phase der Infektion (Isberg & Leong 1988).
Neben den beschriebenen und vielen weiteren chromosomal vermittelten Virulenzfaktoren,
beherbergen alle pathogenen Yersinia-Arten ein ca. 70 kb großes Virulenzplasmid. Dieses,
meist pYV genannt, kodiert unter anderem für ein Typ III-Sekretionssystem und eine Reihe
von Effektorproteinen (Cornelis et al. 1998).
II.3.2 Das Virulenzplasmid
In den 1950er Jahren war bekannt, dass Y. pestis nicht in der Lage ist in Ca2+-defizientem
Medium bei 37°C zu wachsen. Ebenso wusste man, dass dieser Phänotyp verloren gehen
konnte und mit diesem Verlust eine Verringerung der Virulenz einherging (Cornelis et al.
1998). Wesentlich später entdeckte man, dass dieses als „low calcium response“ (lcr)
benannte Phänomen durch ein ca. 70 kb großes Plasmid hervorgerufen wurde (Gemski et al.
1980; Zink et al. 1980), welches heute unter dem Namen pYV bekannt ist. Die
Virulenzplasmide verschiedener Yersinia-Spezies sind sich alle äußerst ähnlich, doch sind im
Laufe der Evolution verschiedene Insertionen durch transposable Elemente und Phagen
aufgetreten. Der augenscheinlichste Unterschied zwischen den Plasmiden von
Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis ist jedoch eine Inversion, die nahezu das halbe
Plasmid betrifft (Biot & Cornelis 1988). Neben einem weiteren wichtigen Oberflächenprotein,
dem „Yersinia Adhesin A“ (YadA) und zahlreichen anderen Faktoren, kodiert das Plasmid für
ein Typ III-Sekretionssystem (TTSS) und die dadurch in die Wirtszelle translozierten
Effektorproteine, die „Yersinia outer proteins“ (Yops). Die genetische Organisation des
Virulenzplasmids pYVWA-314 aus Y. enterocolitica WA-314 ist in Abbildung 2 dargestellt.
9
II Einleitung
pYV-WA-314
66.845bp
Abbildung 2: Karte des Y. enterocolitica WA-314 Virulenzplasmids (Oberhettinger et al. 2011).
Dargestellt ist die genetische Organisation des 66.9 kb Virulenzplasmids pYVWA-314. Gene sind in blau gezeigt,
der Replikationsursprung in gelb. ysc: Gene des Typ III-Sekretionssystems, yop: Gene der Yops.
II.3.2.1 Typ III-Sekretionssystem (TTSS)
Seit 1991 ist bekannt, dass der Yop-Sekretionsapparat ebenso wie die Effektoren auf dem
Virulenzplasmid pYV kodiert ist (Michiels & Cornelis 1991). Die ysc-Gene kodieren für ein
sogenanntes Typ III-Sekretionssystem, das in der Lage ist, Effektorproteine über drei
Membranen zu translozieren. Dieser Multiproteinkomplex , der über ein Megadalton groß ist,
ähnelt dabei einer molekularen Spritze und ist bei gram-negativen Pathogenen weit verbreitet
(Gerlach & Hensel 2007). Strukturell und evolutionär ist der Apparat nahe verwandt mit
bakteriellen Flagellen.
Das Sekretionssystem in Yersinia ist aus mehr als 20 Proteinen aufgebaut, die durch die ysc
(„yersinia secretion proteins“)-Gene kodiert werden. YscC formt hierbei einen Ring in der
äußeren (Koster et al. 1997), YscD und YscJ in der inneren Bakterienmembran (Yip et al.
2005). Diese Ringe bilden das Gerüst für die Nadel und den Basalkörper. Der Basalkörper,
der die innere und äußere Bakterienmembran durchspannt, wird von den Proteinen YscD,
YscR, YscS, YscT, YscU und YscV gebildet (Dewoody et al. 2013). Er enthält darüber hinaus
eine ATPase (YscNKL), die strukturelle Ähnlichkeit zur Flagellen-Protonenpumpe FoF1 besitzt
(Woestyn et al. 1994) und einem C-Ring (YscQ). Dem Basalkörper schließt sich die von nur
einem Protein, YscF, gebildete, sogenannte Nadel an. Dieses Homomultimer kann in
Y. enterocolitica eine Länge von bis zu 600 Å (60 nm) annehmen und bildet die Brücke zur
10
II Einleitung
eukaryontischen Wirtszelle. Abgeschlossen wird der Apparat durch den aus YopBD und LcrV
gebildeten Porenkomplex (Neyt & Cornelis 1999; Montagner et al. 2011).
A
B
Porenkomplex
Nadel
Basalkörper
Abbildung 3: Aufbau des Typ III-Sekretionssystems.
A: Schematische Darstellung des Translokationsapparates in Y. enterocolitica (Dewoody et al. 2013). B: STEMAufnahme von LcrV (Mueller et al. 2005) und EM-Aufnahme des Translokationsapparates aus Shigella flexneri
(Blocker et al. 2001).
Mit diesem Apparat ist es den Yersinien möglich sechs Effektorproteine in die Wirtszelle
einzuschleusen, die dort auf unterschiedliche Art die Phagozytose verhindern, eine
Reorganisation des Zytoskeletts bewirken oder die Ausschüttung proinflammatorischer
Zytokine verhindern. Dadurch wird das Persistieren der Bakterien im Interzellularraum
ermöglicht (Cornelis & Wolf-Watz 1997). Die Proteine, die durch das TTSS in die Wirtszelle
injiziert werden besitzen keine klassischen Signal-Sequenzen (Michiels et al. 1990) und so ist
die Erkennung der Translokatoren durch den Injektionsapparat nicht vollends verstanden.
Ebenso herrscht Unklarheit über den exakten Mechanismus der Translokation. Hierfür gibt es
mehrere Modelle, bei denen die aus YopBD gebildete Pore entweder im Komplex mit den
translozierten Effektoren von der Nadel wegdiffundiert oder als fester Bestandteil des
Apparates an der Nadel verbleibt und lediglich als Öffnung der eukaryontischen Zellmembran
fungiert (Dewoody et al. 2013).
Die in vivo-Translokation der Effektoren erfolgt normalerweise nach Kontakt mit der Wirtszelle
durch die Yersinia-Adhäsine (Rosqvist et al. 1994). In vitro jedoch kann durch Depletion von
Ca2+ die Sekretion der Yops künstlich induziert werden (Heesemann et al. 1986). Bei einer
Inkubation der Yersinien bei 37 °C in einem Ca2+-defizienten Medium kommt es zum Stillstand
des bakteriellen Wachstums und die Sekretion der Effektoren in den Kulturüberstand erfolgt
(Carter et al. 1980).
Die sechs von Y. enterocolitica translozierten, immunmodulierenden Effektoren sind: YopT,
YopE, YopO, YopH, YopP und YopM. Diese sollen im Folgenden näher beschrieben werden.
11
II Einleitung
II.3.2.2 YopT: Eine Cystein-Transferase
YopT aus Y. enterocolitica ist ein ca. 35 kDA großes Protein, welches zur Gruppe der CACysteinproteasen gehört. Es bindet bevorzugt die Rho-GTPasen RhoA, Rac1 und CDC42
(Shao et al. 2002). Dabei spaltet es den C-terminalen Geranylgeranyl-Cystein-Rest, der den
GTPasen als Membrananker dient und bewirkt somit deren Translokation ins Zytosol (Shao et
al. 2003). Dies führt zur Inaktivierung und Akkumulierung der Proteine im Zytoplasma
(Zumbihl et al. 1999; Aepfelbacher et al. 2003). Über die Modifikation der Rho-GTPasen
inhibiert YopT schlussendlich die Phagozytose von Yersinien durch Makrophagen und
Neutrophile (Grosdent et al. 2002). Darüber hinaus wird die Reorganisation des AktinZytoskeletts an den sogenannten „phagocytic cups“ und an podosomalen
Adhäsionsstrukturen durch YopT-exprimierende Yersinien inhibiert. Dies führt zu einer
Störung der Chemotaxis der Makrophagen und erschwert somit das Auffinden der Pathogene
(Aepfelbacher 2004). In dem Effekt auf Rho-GTPasen überschneidet sich die Funktion YopTs
teilweise mit der von YopE. Somit kooperieren die beiden Proteine in der Modulation des
Aktin-Zytoskeletts und der damit verbundenen Verhinderung der Phagozytose (Aepfelbacher
et al. 2007).
II.3.2.3 YopE: Ein GTPase aktivierendes Protein (GAP)
YopE ist ein ca. 25 kDA großes GAP-Protein für Rho-GTP bindende Proteine (Black & Bliska
2000; Von Pawel-Rammingen et al. 2000; Andor et al. 2001). Obwohl YopE keine
Sequenzhomologie zu eukaryontischen GAPs zeigt, ist es doch strukturell diesen sehr ähnlich
(Scheffzek et al. 1998; Evdokimov et al. 2002). YopE inaktiviert die gebundenen GTPasen,
indem es die Hydrolyse von GTP zu GDP katalysiert. Da Rho-GTPasen eine Rolle in der
Organisation des Aktinzytoskeletts spielen, bewirkt deren Inaktivierung durch YopE eine
Umstrukturierung der Aktinmikrofilamente. Dies unterstützt die Phagozytoseresistenz der
Yersinien (Aepfelbacher & Heesemann 2001). Eine in vitro-GAP-Aktivität konnte für Rho, Rac
und cdc42 gezeigt werden (Von Pawel-Rammingen et al. 2000; Black & Bliska 2000). Neben
den Effekten auf die Aktinremodellierung, inhibiert YopE die Caspase-1 vermittelte Reifung
und Sekretion von Interleukin-1β und somit die Rekrutierung von Immunzellen (Schotte et al.
2004). Somit ist YopE ein wichtiger Bestandteil der Pathogenität der Yersinien, indem es
einerseits die Immunabwehr und andererseits die Phagozytose hemmt.
II.3.2.4 YopO: Eine Serin-/Threoninkinase
YopO (YpKA in Y. pseudotuberculosis) ist ein ca. 80 kDa großes Multidomänenprotein,
welches eine N-terminale Serin/Threoninkinasedomäne besitzt (Galyov et al. 1993). Darüber
hinaus ist der N-Terminus für die Sekretion durch das TTSS unabdingbar und zeigt eine
Membranbindedomäne (Håkansson et al. 1996; Dukuzumuremyi et al. 2000). Die C-terminale
Hälfte des Proteins besteht aus einer Rho-GTPase-Bindedomäne und die letzten 21
Aminosäuren interagieren mit Aktin (Dukuzumuremyi et al. 2000; Juris et al. 2000). HeLaZellen die mit einem YpKA überexprimierendem Stamm von Y. pseudotuberculosis infiziert
wurden, zeigten Abrundung, Ausbildung von Retraktionsfasern sowie Ablösungen des AktinZytoskeletts. Die Abrundung der Zellen lässt sich auf die Kinaseaktivität, die Ablösung des
Zytoskeletts auf die GDI-Domäne zurückführen (Prehna et al. 2006; Trasak et al. 2007). Die
Kinase-Domäne inhibiert darüber hinaus Gαq-Signalwege. Gαq gehört zur Familie der GProteine die Phospholipase-C-β stimulieren (Navarro et al. 2007). Diese Interaktion könnte zu
12
II Einleitung
dem „abnormalen Bluten“ von Pest-Patienten beitragen, da Gαq-Knockout-Mäuse zu erhöhter
Blutungsdauer und Defizienz in der Thrombozytenaktivierung neigen (Laskowski-Arce & Orth
2007).
II.3.2.5 YopH: Eine Tyrosin-Phosphatase
YopH ist ein 50 kDa großes Protein mit einer Tyrosin-Phosphatase-Domäne, die C-terminal
lokalisiert ist (Juris et al. 2002). YopH ist eine der potentesten bisher bekannten
Tyrosinphosphatasen und es wird spekuliert, dass das yopH-Gen ursprünglich durch
horizontalen Gentransfer aus eukaryonten Wirtszellen aufgenommen wurde (Guan & Dixon
1990). Unterstützt wird diese These durch die hohe strukturelle Ähnlichkeit des Enzyms zu
eukaryontischen Pendants (Phan et al. 2003; Sun et al. 2003). Das Protein dephosphoryliert
hauptsächlich Proteine des fokalen Adhäsionskomplexes, wie p130Cas, „focal adhesion
kinase“ (Fak), Paxillin, „Fyn-binding protein“ (FyB) und das Gerüstprotein SKAP-HOM (Viboud
& Bliska 2005; Cornelis 2002). Die Inaktivierung von p130Cas durch YopH-vermittelte
Dephosphorylierung, führt zum Abriss von Aktinstrukturen inklusive der fokalen Adhäsionen
und damit zu einer Inhibition der Phagozytose (Andersson et al. 1996). Neben den
antiphagozytischen Effekten hemmt YopH die „Chemoattractant-protein-1“ Produktion in
Makrophagen (Sauvonnet, Lambermont, et al. 2002) und die T-Zell-Aktivierung (Yao et al.
1999).
II.3.2.6 YopP: Eine Acetyltransferase
Das 33 kDa große Protein YopP (YopJ in Y. pestis und Y. pseudotuberculosis) interagiert mit
dem NFκB (nuclear factor κ B) aktivierenden IKK-Komplex und mehreren Kinasen der MAPKKinase-Familie (MKK), den Aktivatoren der MAPK (mitogen activated protein kinase). Daraus
resultiert eine Unterdrückung der Zytokinproduktion in Makrophagen (TNFa), Epithel- (IL-8)
und Endothelzellen (IL-6, IL-8) (Mills et al. 1997; Monack et al. 1997; Ruckdeschel et al. 1997;
Palmer et al. 1998; Schesser et al. 1998; Orth et al. 1999; Denecker et al. 2002). Lange Zeit
wurde angenommen, dass YopP/J aufgrund seiner vorhergesagten strukturellen Homologie
zu AVP und „ULP-1 like proteins“, die eine katalytische Triade besitzen, eine Cysteinprotease
sei (Orth et al. 2000). Dies deckte sich mit frühen Beobachtungen in YopJ
Überexpressionsstudien, dass das Vorhandensein von aktivem YopJ mit erhöhter DeUbiquitinierung und De-SUMOylierung einherging (Orth et al. 2000; Orth 2002; Viboud &
Bliska 2005). Sechs Jahre nach der Entdeckung des potenziellen aktiven Zentrums von YopJ
konnte dies jedoch, unabhängig voneinander, durch zwei Arbeitsgruppen widerlegt werden.
Sie konnten zeigen, dass YopJ als Acetyltransferase fungiert. Sie acetyliert wichtige Serinund Threoninreste in den Aktivierungsloops von Signalkinasen (MKKs und IKKs) und
verhindert damit deren aktivierende Phosphorylierung (Mittal et al. 2006; Mukherjee et al.
2006). Diese Ergebnisse konnten später glaubhaft belegt werden (Trosky et al. 2008).
13
II Einleitung
II.3.2.7 YopM: Ein Gerüstprotein
YopM ist ein ca. 50 kDa großes Protein und einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von
Yersinia spp. im Maus-Modell (Leung et al. 1990; Kerschen et al. 2004). Während die anderen
Yops in Größe und Sequenz hochkonserviert sind (Sequenzhomologien von bis zu 97 %), ist
bereits seit längerem bekannt, dass YopM durch alle drei Spezies in verschiedenen Isoformen
vorliegt (Boland et al. 1998). Dies fiel auf als Boland und Kollegen das SDS-PAGE-Profil der
sekretierten Yops eines neuen Y. enterocolitica O:8-Stammes (A127/90) überprüften. Im
Vergleich zu ihrem Referenzstamm (E40) fehlte die 41 kDa YopM-Bande, während eine
zusätzliche Bande bei 55 kDa auftauchte. Diese Bande zeigte positive Reaktion auf ein
polyklonales anti-YopM Serum.
Die unterschiedlichen Größen der Proteine verschiedener Yersinia-Stämme lassen sich durch
YopMs strukturellen Aufbau erklären. Bereits bei seiner ersten Charakterisierung 1989 war
durch Sequenzvergleiche aufgefallen, dass es sich um ein höchst repetitives Protein handelt,
das aus einer definierten Anzahl an Leucin-reichen Wiederholungen besteht. Zusätzlich
zeigten sich Ähnlichkeiten zu dem „human platelet surface protein“ GPIb (Leung & Straley
1989). Der Unterschied in der Größe der später von Boland und Kollegen untersuchten YopMIsoformen lag eben in diesem repetitiven Bereich, während die N- und C-Termini identisch
waren (Boland et al. 1998).
Die erwähnte Ähnlichkeit zwischen YopM und GPIb führte sogleich zu einem ersten
Aufklärungsversuch der Rolle YopMs in der Yersinien-Infektion. So legten Leung und Straley
1990 kurz nach der Entdeckung des Effektors dar, dass YopM im Extrazellularraum mit
Thrombin interagiert und dadurch antagonistisch die Thrombozytenaggregation verhindert
(Leung et al. 1990; Reisner & Straley 1992; Skrzypek & Straley 1996; Hines et al. 2001). Eine
spätere Studie ergab darüber hinaus, dass YopM in der Lage ist, extrazellulär α1-Antitrypsin
zu binden. Diese Interaktion zeigte jedoch keinen Einfluss auf dessen Funktion (Heusipp et al.
2006). Die Relevanz dieser Funde für die Virulenz YopMs ist jedoch zumindest fraglich, da
eindeutig bewiesen werden konnte, dass YopM, wie die anderen Yops nicht sezerniert wird,
sondern über das TTSS in die Wirtszelle transloziert (Boland et al. 1996). Zudem konnte bei
Versuchen YopM extrazellulär durch Antikörper zu neutralisieren, keine signifikante
Verschlechterung der Virulenz erreicht werden (Nemeth & Straley 1997).
In der Wirtszelle ist YopM in der Lage über einen Vesikel-assoziierten Prozess in den Nucleus
zu gelangen, wobei jedoch auch ein Teil des Proteins, oft in der Nähe der Kernmembran, im
Zytosol verbleibt (Skrzypek et al. 1998). Dieser Prozess scheint abhängig von Mikrotubuli zu
sein. Durch Struktur- und Sequenzvergleiche konnte kein klassisches Kernlokalisationssignal
(NLS) für YopM bestimmt werden. Jedoch konnten, mittels Deletionsmutanten in einem
Saccharomyces-Modell, zwei strukturelle Bereiche von YopM für dessen Transport in den
Nukleus verantwortlich gemacht werden. Diese Bereiche entsprechen den ersten drei LRRs
und den letzten 32 C-terminalen Aminosäuren und sind in allen bisher bekannten YopMIsoformen hochkonserviert (Skrzypek et al. 2003; Benabdillah et al. 2004). Die Tatsache, dass
ein klassisches NLS fehlt und stattdessen hochkonservierte Bereiche des YopM-Proteins für
dessen Translokation verantwortlich sind, spricht dafür, dass YopM über einen bisher
unbekannten Interaktionspartner in den Kern gelangen könnte. Diese neugewonnene
Erkenntnis der Kernlokalisation legte die Vermutung nahe, dass YopM einen Einfluss auf
transkriptionelle oder translationelle Prozesse der Wirtszelle nehmen könnte. Die Ergebnisse
14
II Einleitung
zweier Arbeitsgruppen hierzu waren jedoch widersprüchlich. So berichteten Sauvonnet und
Kollegen, dass YopM in der Lage war, in einem Infektionsmodell von J774-Zellen, die
Expression Zellzyklus und Zellwachstum regulierender Gene zu induzieren. Hoffmann und
Kollegen konnten unter sehr stringenten Bedingungen jedoch keine Regulation der
Genexpression durch YopM beobachten (Sauvonnet, Pradet-Balade, et al. 2002; Hoffmann et
al. 2004).
In verschiedenen Infektionsmodellen konnten eine Reihe von Hinweisen darauf gesammelt
werden, dass YopM eine entscheidende Rolle in der Unterdrückung der Immunantwort des
Wirts auf die Infektion mit Yersinien spielt. Im Maus-Modell zeigte sich, dass YopM-defiziente
Yersinia-Mutanten deutliche Wachstumsdefizite aufwiesen und bereits zwei Tage nach der
Infektion („post infection“, p.i.) eine deutlich reduzierte Zellzahl zeigten. Dies ging einher mit
einer sehr starken Aktivierung des Immunsystems. Am vierten Tag p.i. waren alle Bakterien
abgetötet. Im Gegensatz dazu zeigte der Wildtyp uneingeschränkte Vermehrung, was zum
Tod der Mäuse an Tag 6 p.i. führte (Kerschen et al. 2004). Dieser drastische Unterschied in
der Überlebensfähigkeit der Mutante war auch bei SCID-Mäusen, denen B- und T-Zellen
fehlen, zu beobachten. Weiter zeigten Leber und Milz der Mäuse stark erhöhte Werte für
proinflammatorische Zytokine wie IL-12, IL-18, TNF-α, IL-1β und IL-15 (Kerschen et al. 2004;
Ye et al. 2009). Ähnlich Effekte konnten durch Rüter und Kollegen bestätigt werden. Diese
legten dar, dass extrazelluläres YopM in der Lage war autonom (vermittelt durch die beiden Nterminalen α-Helices) in Makrophagen einzudringen und dort die Expression der Zytokine zu
unterdrücken (Rüter et al. 2010). Weiterhin konnte dieses YopM im Kern gefunden werden
(Scharnert et al. 2013).
Einen möglichen Erklärungsansatz für die Reduktion der Zytokinausschüttung durch YopMvermittelte Effekte lieferten LaRock und Kollegen. In einem Screen auf Yersinia-Effektoren,
die mit Caspase-1 interagieren, entdeckten sie YopM. Aktivierung der Cystein-Protease
Caspase-1 vermittelt eine Reihe von Prozessen, die zur Ausschüttung von Zytokinen wie IL1β und IL-18 führen und an deren Ende die Pyroptose steht. In einer Reihe von Experimenten
wurde dargestellt, dass YopM durch direkte Interaktion in der Lage ist, Caspase-1 in vivo und
in vitro zu hemmen. Dieser inhibitorische Effekt verhindert den durch Pyroptose vermittelten
programmierten Zelltod von Makrophagen und die dadurch induzierte Rekrutierung des
Inflammasoms (LaRock & Cookson 2012).
Als weitere Bindungspartner von YopM konnten bereits 2003 die „protein kinase C-like 2“
(PRK2/PKN2) und die „ribosomal S6 protein kinase 1 (RSK1) identifiziert werden (McDonald
et al. 2003). In einer direkten Interaktion bringt YopM hierbei die beiden Kinasen in einen
zuvor unbekannten Komplex, indem hyperphosphoryliertes RSK1, PKN2 phosphoryliert und
damit aktiviert. Die physiologischen Konsequenzen dieses neuen Signalwegs sind jedoch bis
dato unbekannt. In darauf aufbauenden Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Interaktion
mit YopM zu einer Blockade der Dephosphorylierung von RSK1 führt und diese somit
daueraktiviert. In dieser Arbeit wurde weiterhin offengelegt, dass YopM alle Mitglieder der
RSK-Familie (RSK1-4) sowie weitere Isoformen von PKN gleichermaßen bindet (Hentschke et
al. 2010). Durch Experimente zweier Arbeitsgruppen konnten die YopM-Epitope, die für die
Bindung der Kinasen verantwortlich sind, eingeengt werden. Die letzten sechs C-terminalen
Aminosäuren von YopM scheinen für die Interaktion mit RSK1 unabdingbar zu sein (McCoy et
al. 2010), während die Interaktion mit PKN2 über den Kernbereich LRR6-15 von YopM aus
15
II Einleitung
Y. pseudotuberculosis YPIII vermittelt wird (McPhee et al. 2010). Bei Deletion der für die
Interaktion verantwortlichen Molekülabschnitte zeigte sich eine verminderte, YopM-vermittelte
Pathogenität. Hierbei ist anzumerken, dass unterschiedliche Stämme mit verschiedenen
YopM-Isoformen für die Interaktionsstudien verwendet wurden, welche sich teilweise drastisch
in ihrem LRR-Gehalt unterscheiden.
In einer Studie, die die Ergebnisse von McDonald und Kollegen unter Infektionsbedingungen
reproduzieren sollte, konnte von Moritz Hentschke, neben den Mitgliedern der RSK- und PKNFamilie (Hentschke et al. 2010), auch ein weiterer, bisher unbekannter Interaktionspartner
identifiziert werden, die DEAD-Box-Helikase DDX3.
Die gesammelten Ergebnisse der YopM-Forschung zeigen, dass das Protein über keine
direkte katalytische Funktion verfügt, jedoch über eine Reihe von Interaktionen mit
Wirtsproteinen sowie durch zahllose, noch unaufgeklärte Prozesse unabdingbar für die volle
Entfaltung der Virulenz von Yersinia spp. ist. Die Strukturaufklärung von YopM aus Y. pestis
195/P (Evdokimov et al. 2000; Evdokimov et al. 2001) lieferte erste Eindrücke wie YopM diese
Mannigfaltigkeit an Interaktionen vermitteln könnte. YopM gehört zur Familie der LRRProteine, die in einer Vielzahl von Organismen vorhanden sind und hauptsächlich ProteinProtein-Interaktionen vermitteln.
II.5 LRR-Proteine
Der „Leucine Rich Repeat“ (LRR) ist ein weit verbreitetes, 20-30 Aminosäuren langes Motiv
aus zwei oder mehreren Leucin reichen Domänen. Es kommt in einer Vielzahl von Proteinen
aus allen Bereichen des Lebens, von Viren und Bakterien über Pflanzen bis zum Menschen
vor. Die Vertreter dieser Proteinfamilie stellen zum größten Teil sogenannte Gerüstproteine für
Protein-Protein-Interaktionen dar (Bella et al. 2008).
Jeder LRR besteht aus 20-30 Aminosäuren und hat einen ungewöhnlich hohen Anteil an
hydrophoben Leucinen. Das die Klasse definierende Element stellt die Konsensus-Sequenz
LxxLxLxxNxL (x, beliebige Aminosäure) dar (Kajava 1998), obwohl auch andere hydrophobe
Aminosäuren, wie Isoleucin oder Valin, an die Stelle des Leucins treten können.
Mitglieder der Familie können intrazelluläre, extrazelluläre oder Membranproteine mit weit
gefächerten biologischen Wirkungsspektren sein (Kresse & Schönherr 2001; Matilla &
Radrizzani 2005; Hohenester et al. 2006). Trotz der großen Spannbreite an unterschiedlichen
Funktionen, besitzen sie eine gemeinsame strukturelle Architektur, die sie dazu prädestiniert
Proteine zu binden. Die erste Kristallstruktur eines LRR-Proteins war der RibonucleaseInhibitor (RNI), welcher die Proteinfamilie prägte (Kobe & Deisenhofer 1993). Seit dessen
Entdeckung gibt es eine Unmenge weiterer LRR-Proteinstrukturen, mit jährlichem Zuwachs in
der PDB-Datenbank.
Protein-Domänen mit einer LRR-Architektur nehmen eine sogenannte „magnetspulenartige“
Form ein, in der jeder Repeat eine Windung der Spule darstellt (Bella et al. 2008). Dieser
Aufbau führt in der Konsequenz zu Proteinen, die je nach Länge ,Anzahl und Aufbau der
Repeats, in der Form von flachen, „hufeisenartigen“ bis zu helikalen Strukturen variieren
(Abbildung 4).
16
II Einleitung
A
B
Abbildung 4: Vergleichende Sekundärstruktur von LRR-Proteinen.
Vergleich zweier LRR-Proteine mit unterschiedlich starker Biegung A: Charakteristische, nahezu flache
Hufeisenform des Toll Like Receptor 3 (PDB Nr. 2A0Z) B: Stark gebogene Form von Internalin A (PDB Nr. 1V0T).
Ribbon-Repräsentation, dargestellt mit USCF Chimera (Pettersen et al. 2004). α-helikale Strukturen in orange, βFaltblätter in lila und verbindende Loops in grau gezeigt.
Die konkave Seite aller LRR-Proteine besteht aus einer geordneten β-Faltblattstruktur, zu der
jeder Repeat einen Strang beisteuert. Der Aufbau der konvexen Seite ist wiederum variabel
und abhängig von der Aminosäureanzahl einer einzelnen Wiederholungseinheit. Hier findet
man je nach Länge α-Helices, 310-Helices, Polyprolin II-Regionen, β-Turns oder sogar βFaltblattstrukturen. Der innere Kern der spulenartigen Struktur wird von den hydrophoben
Aminosäuren gebildet. Hier sind die konservierten Leucine und andere aliphatische
Aminosäuren dicht gepackt und die Seitenketten liegen isoliert von der Hydrathülle. Durch die
strenge Sequenztreue bilden Van der Waals-Kräfte zwischen benachbarten Repeats ein
äußerst stabiles hydrophobes Rückgrat (Bella et al. 2008). Dieser Aufbau bedingt auch das
Vorhandensein eines an den letzten Repeat angrenzenden Capping-Motivs, um den
hydrophoben Kern abzuschließen.
Ebenso geht man davon aus, dass die Repeats für die korrekte Faltung auf eine
vorgeschaltete, N-terminale Leitstruktur angewiesen sind. Diese Motive sind strukturell
äußerst divers und können, neben der Initiation der Faltung der LRRs, weitere biologische
Funktionen übernehmen (Kobe & Deisenhofer 1995).
Die gebogene LRR-Architektur scheint besonders für Protein-Protein-Interaktionen geeignet
zu sein und man geht generell davon aus, dass die konkave Seite der Proteine den
Hauptanteil an der Ligandenbindung trägt. Hierfür gibt es viele Beispiele in der Literatur, auch
bakterielle, wie der Komplex aus Internalin und E-Cadherin (Schubert et al. 2002). Die Stärke
der Bindung wird dabei zu einem großen Teil durch die Interface-Fläche bestimmt, was bei
großen Interaktionsbereichen zu Bindungen mit Dissoziationskonstanten (Kd) im bis zu
femtomolaren Bereich führen kann (Lee et al. 1989). Am Beispiel von Internalin und ECadherin wird jedoch klar, dass auch die Interaktion der Seitenketten einen großen Einfluss
auf die Bindungsstärke hat. So liegt die Kd in diesem Komplex im niedrigen mikromolaren
Bereich, lässt sich jedoch durch Mutationen der an der Bindung beteiligten Aminosäure um
das vierfache steigern (Schubert et al. 2002; Wollert et al. 2007)
Der repetetive Aufbau der LRR-Proteine lässt schließlich eine sehr große Variabilität der
internen Architektur zu. Durch Replikation, Deletion bzw. Neuorganisation einzelner LRRs
können neue Epitope geschaffen werden, ohne die Stabilität bzw. den generellen Aufbau des
Proteins drastisch zu verändern. Dieses Prinzip findet beispielsweise im Immunsystem vieler
17
II Einleitung
Vertebraten Anwendung. Hier sind Immunrezeptoren in der Lage durch unterschiedliche
Splicevarianten des selben Proteins, ein immer neues Set an Erkennungsdomänen zu
kreieren, um auf unterschiedlichste Antigene reagieren zu können (Street et al. 2006).
II.5.1 YopM in der Familie der LRR-Proteine
Bereits 2001 waren Evdokimov und Kollegen in der Lage YopM aus Y. pestis 195/P zu
kristallisieren und die Röntgenstruktur des Proteins mit einer Auflösung von 2,1 Å zu lösen
(Evdokimov et al. 2000; Evdokimov et al. 2001).
YopM ist ein typischer Vertreter der LRR-Proteine, der mit einer Repeat-Länge von 20 bzw. 22
Aminosäuren (LRR4, 6 und 8) eine sehr kurze Wiederholungseinheit besitzt. Die KonsensusSequenz der LRRs lautet:
**L*A/V**N*L**LPD/EL..PP*L.
Die 15 Repeats werden N-Terminal von zwei Alpha-Helices und C-Terminal von einem kurzen
Capping-Motiv umschlossen. Dieses Motiv erinnert mit seiner Sequenz (EDLRMN) an einen
unfertigen LRR. In der Kristallstruktur zeigten die ersten 33-N-terminalen und die letzten 24 Cterminalen Aminosäuren keine Elektronendichte. Wie bei allen Vertretern der LRR-Proteine
wird die konkave Seite durch β-Faltblattstrukturen gebildet. Die konvexe Seite besteht als
Konsequenz der Kürze der Repeats aus einem elongierten Bereich mit einer Polyprolin IIRegion, im Falle der 20-As Repeats, und einer kurzen 310-Helix, im Falle des 22-As Repeats.
Abbildung 5: YopM_195/P Monomerstruktur.
Struktur des YopM_195/P Monomers (1jl5) in Ribbon-Repräsentation. Dargestellt mit USCF Chimera (Pettersen et
al. 2004). α-helikale Strukturen in orange, β-Faltblätter in lila und verbindende Loops in grau gezeigt.
Die beiden N-terminalen α-Helices dienen wahrscheinlich der korrekten Faltung der
nachfolgenden Repeat-Struktur und so konnte kürzlich gezeigt werden, dass eine Chimäre
aus dem YopM-N-Terminus und der LRR-Einheit von InlB eine intakte Faltung aufweist.
Dieses Konstrukt war in der Lage den bekannten Interaktionspartner von InlB, den METRezeptor, mit einer ähnlichen Affinität wie das native Protein zu binden. Die Generierung
eines funktionalen Proteins, das lediglich aus dem LRR-Bereich bestand, war hingegen nicht
möglich (Breitsprecher et al. 2014).
Der kurze C-Terminus dient dem Schutz des hydrophoben Kerns des Proteins.
Interessanterweise trat YopM in mehreren von Evdokimov beschriebenen Kristallformen als
Tetramer in Erscheinung. In diesem kunstvollen Gebilde, sind zwei YopM-Monomere an ihren
C-Termini miteinander verbunden. Das „Tail-to-Tail“-Dimer lagert sich an ein weiteres, gleich
gebautes Dimer an und kreiert so eine Art Doppelhelix. Diese Helix bildet einen Tunnel mit
35 Å Durchmesser. Bei der Stabilisierung dieses Dimers spielen Ca2+-Ionen, die in hoher
18
II Einleitung
Konzentration im Kristallisationsansatz vorhanden waren, eine tragende Rolle. Ein Nachweis
des Tetramers in Lösung konnte jedoch nicht erbracht werden und so bleibt es zumindest
fraglich, ob es eine biologische Relevanz besitzt oder ein Kristallisationsartefakt darstellt.
A
B
Abbildung 6: YopM_195/P Kristall-Tetramer.
A: Struktur des YopM_195P Tetramers in Ribbon-Repräsentation, erstellt mit PyMol (Schrödinger LLC, USA).
B: Darstellung der an der Stabilisierung des Tetramers beteiligten Wechselwirkungen wichtiger Aminosäuren mit
2+
Ca (Evdokimov et al. 2001).
Die Ergebnisse von Evdokimov und Kollegen lieferten einen ersten Einblick in den
strukturellen Aufbau des YopM-Proteins. Wie unter III.3.2.7 erwähnt ist YopM jedoch äußerst
heterogen und kommt in unterschiedlichen Yersinia spp. bzw. unterschiedlichen Serotypen
ein und derselben Spezies in verschiedenen Isoformen vor. Aus Sequenzvergleichen geht
hervor, dass allen Proteinen der α-helikale N-Terminus und die ersten drei Repeats sowie der
letzte Repeat und der abschließende C-Terminus gemein sind. Durch Duplikationen bzw.
Deletionen einzelner LRRs kommt es jedoch zu einem hohen Maße an Variabilität im LRRKernbereich der Proteine. So reicht die Anzahl an LRR in bisher bekannten YopM-Isoformen
von 13 – 21, und auch die Zusammensetzung der Repeats ist deutlich heterogen (Boland et
al. 1998; Vieux & Barrick 2011).
II.6 DDX3
Wie unter II.3.2.7 beschrieben konnte durch Moritz Hentschke in einem J774-MakrophagenInfektionsmodell mit Y. enterocolitica WA-314, DDX3 als neuer Bindungspartner für YopM
identifiziert werden. Für diesen Versuch wurde ein TAP („Tandem Affinity Purification“)getaggtes YopM-Konstrukt kreiert, welches N-Terminal einen SBP („Streptavidin Binding
Peptide“) sowie einen CBP („Calmodulin Binding Peptide“)-Tag besitzt. Dieses Protein wurde
über das native TTSS der Yersinien in die Makrophagen injiziert. Nach erfolgter Infektion
wurden die Zellen lysiert und das TAP-YopM wurde sequentiell über Streptavidin- und
Calmodulin-Affinitätschromatographie gereinigt. Die co-präzipitierten Proteine wurden
anschließend mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie identifiziert.
DDX3 ist eine ATP-abhängige Helikase, die zur Familie der DEAD-Box-Helikasen gehört. Die
Mitglieder dieser Familie sind an verschiedenen Prozessen des mRNA-Metabolismus wie
Transkription, Splicing, Translation und RNA-Export beteiligt (Rocak et al. 2005; Cordin et al.
2006; Lai et al. 2008; Lee et al. 2008). Namensgebend für die Familie ist ein, aus den
Aminosäuren Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD) gebildetes Motiv im Kern des Enzyms, welches in
19
II Einleitung
allen Mitgliedern der Familie vorhanden ist. DEAD-Box Helikasen kommen in allen Eukaryoten
und einigen Prokaryoten vor. Ihr molekularer Aufbau besteht aus einer hochkonservierten
Helikase-Kernstruktur, die aus zwei Domänen gebildet wird. Diese beinhaltet die Bindestellen
für ATP und RNA (Caruthers & McKay 2002; Singleton et al. 2007; Fairman-Williams et al.
2010). Der Kern ist wiederum umgeben von variablen Strukturen, die die Spezifität der
einzelnen Proteine definieren.
Abbildung 7: Strukturelle Komposition der DEAD-Box-Helikase DDX3 (Högbom et al. 2007).
Aufbau von DDX3 mit den in allen DEAD-Box-Helikasen konservierten Motiven und gebundenem AMP. Details
siehe Text.
Der konservierte Kern besteht aus neun Konsensus-Sequenzen, die die funktionale Helikase
bilden. Motiv Q, I (Walker A mit dem Phosphat bindenden P-Loop), II (Walker B, DEAD-Box),
Ia, Ib und III liegen auf Domäne 1, während Motiv IV, V und VI auf Domäne II zu finden sind.
Strukturelle und biochemische Analysen ergaben, dass die verschiedenen Motive an der
Nukleotid-Bindung (Q, I und II), der RNA Bindung (Ia, Ib, IV und V) und an der ATP-Hydrolyse
(III und IV) beteiligt sind (Cordin et al. 2006). Strukturell besitzen beide Domänen eine Faltung
der RecA-Superfamilie mit fünf β-Faltblättern, die von fünf α-Helices umgeben sind.
DDX3 wird eine Reihe zellulärer Funktionen in Zellzykluskontrolle, Zellwachstum und
Proliferation zugeschrieben und so wurde herausgefunden, dass eine Dysregulation des
Enzyms zur Bildung von Brustkrebs oder hepatozellulären Karzinomen führen kann
(Botlagunta et al. 2008; Chang et al. 2006). Des Weiteren interagiert DDX3 mit dem
Translations-Initiationsfaktor eIF3 und nimmt somit Einfluss auf die Translation.
Neben diesen und zahlreichen weiteren zellulären Effekten scheint DDX3 eine wichtige Rolle
in der antiviralen Immunantwort zu spielen, indem es in Signaltransduktions-Prozesse
involviert ist, die bei der Erkennung von Viruspartikeln eine Rolle spielen und zur Freisetzung
von Interferon beta (IFNβ) führen. So wurde beschrieben dass DDX3 mit der „Tank binding
20
II Einleitung
kinase 1“ (TBK1) interagiert und dadurch die Ausschüttung von IFNβ beeinflusst. Hierbei
bewirken beide Proteine einen positiven synergistischen Effekt auf den IFNβ-Promotor. Dieser
Einfluss konnte gezeigt werden, da das K7 Protein von Pockenviren eben diesen Signalweg
durch Hemmung von DDX3 unterbindet (Soulat et al. 2008; Schröder et al. 2008).
Zahlreiche weitere Publikationen beschreiben DDX3 als Ziel viraler Manipulation. So ist DDX3
an der Replikation von HIV, HCV sowie Pockenviren beteiligt (Mamiya & Worman 1999;
Owsianka & Patel 1999; Schröder 2011). Darüber hinaus ist DDX3 ein essentieller Wirtsfaktor
für HIV. Das Rev-Protein interagiert mit DDX3 und dem nukleären Exportprotein CRM1
(„chromosome maintenance 1“) und bewirkt somit den Export ungespliceter oder teilweise
gespliceter RNA aus dem Kern (Schröder 2010). CRM1 bewerkstelligt den Export von
Proteinen aus dem Zellkern ins Zytoplasma (Fukuda et al. 1997). Über die Interaktion mit
CRM1 ist DDX3 schließlich in der Lage zwischen Zellkern und Zytoplasma zu pendeln
(Yedavalli et al. 2004).
Der Einfluss, den nun YopM als erster beschriebener bakterieller Effektor auf DDX3 hat, ist
bislang unbekannt und wird unabhängig von der hier dargelegten Arbeit untersucht. Erste
Resultate konnten jedoch bisher keine Auswirkungen der Interaktion auf die natürlichen
Funktionen, wie die ATPase oder Helikase Aktivität von DDX3 belegen. Ebenso konnte bisher
kein Einfluss auf die IFN-beta Produktion oder eine Auswirkung auf Transkriptionsfaktoren
festgestellt werden (Hentschke et al. unveröffentlicht)
21
II Einleitung
II.6 Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es das 20-LRR beinhaltende YopM aus Y. enterocolitica WA314 aufzureinigen und strukturell sowie biochemisch zu charakterisieren. YopM aus Y. pestis
195/P formte in der Kristallstruktur von Evdokimov ein kunstvoll designtes Tetramer, indem
sich zwei Monomere in einer „Tail-toTail“-Konformation zusammenlagerten und einen Strang
einer Doppelhelix bildeten (Evdokimov et al. 2001). Dass dieses Tetramer physiologisch ist,
konnte jedoch nicht bewiesen werden. Neben der hochauflösenden Kristallstruktur von
YopM_WA-314, sollte deshalb vor allem die Struktur des Proteins in Lösung Aufschluss über
dessen Oligomerisierungsgrad geben. Weiterhin sollte untersucht werden, welchen Einfluss
die fünf zusätzlichen LRRs auf die Grundarchitektur des Proteins nehmen. Hier sollte der
Vergleich mit der vorhandenen Struktur aus Y. pestis 195/P Gemeinsamkeiten bzw.
eventuelle Unterschiede offenlegen.
In einer Vorarbeit konnte die DEAD-Box-Helikase DDX3 als neuer Bindungspartner für YopM
in einem Infektionsmodell mit J774-Maus-Makrophagen identifiziert werden. Es sollte nun
zunächst mit biochemischen Experimenten überprüft werden, ob es sich dabei um eine direkte
Interaktion handelt. Hierzu mussten geeignete Expressionskonstrukte generiert werden, mit
denen es möglich war, eine direkte Interaktion nachzuweisen und zu charakterisieren.
Handelte es sich tatsächlich um eine direkte Bindung zwischen YopM und DDX3, so sollte die
Art der Bindung auch mit strukturbiologischen Mitteln analysiert werden. Die Ergebnisse aus
diesen Experimenten sollten Aufschluss darüber geben, wie YopM mit anderen Proteinen
interagiert. Da mittlerweile eine Vielzahl verschiedener Interaktionspartner intra- wie
extrazellulär beschrieben sind, sollte herausgefunden werden über welche Mechanismen
YopM in der Lage ist, diese zum Teil gleichzeitigen Interaktionen zu vermitteln.
Schließlich sollte der beschriebene inhibierende Einfluss auf Caspase-1 (LaRock & Cookson
2012) in einem in vitro-Experiment mit verschiedenen Isoformen von YopM überprüft werden.
Der dargelegte Effekt und die Auswirkung der Interaktion auf die Rekrutierung des
Inflammasoms könnten den ersten direkten Zusammenhang zwischen YopM und der
Immunabwehr der Wirtszelle bestätigen.
22
III Material
III Material und Methoden
III.1 Material
III.1.1 Geräte
Tabelle 1: Geräte
Gerät
Typ, Hersteller
DLS Gerät
Elektrophorese
SpectroSIZE 300 Nabitec (G)
Agarose-Gel: Roth, Karlsruhe (G);
SDS-PAGE: Mini-Protean II and Western Blot
apparatus, BioRad, Munich (G)
Curix 60, Agfa, Mortsel (B)
Hartenstein, Würzburg (G)
Äktapurifier; Äktaexplorer; Äktaprime plus, GE
Healthcare (UK)
-80°C: HERA freeze, Heraeus, Kendro Laboratory,
Hanau (G); -20°C: comfort, Liebherr-International
AG, Bulle (CH)
Gel dryer 543, BioRad, München(G)
Honeybee 961, Genomic Solutions ( USA)
Infinite M200, TECAN, Männedorf (CH)
Monolith NT.115, Nanotemper (G)
Mikroskop SZX12 mit Kamera DP10 ,
Olympus (J)
900W, Panasonic, Kadoma/Osaka (J)
PeqLab, Erlangen (G)
Seven easy, Mettler-Toledo, Giessen (G)
Ultrospec 3100 pro, Amersham/GE Healthcare
Europe, Munich (G)
2, 10, 20, 100, 200, 1000 µl, Gilson, Den Haag (NL);
5000 µl Eppendorf, Hamburg (G); Accu-jet pro, Brand,
Wertheim (G)
CanoScan 4400F, Canon, Amsterdam (NL)
Certomat BS-1, Sartorius, Göttingen (G)
Digital Sonifier 250-D, Branson, Danbury (USA)
Hera Safe, Thermo Scientific, Rockford (USA)
Petra III, DESY, Hamburg, Deutschland
Doris III, DESY, Hamburg, Deutschland
Entwickler für Röntgenfilme
Filmkassette
FPLC
Gefrierschränke
Geltrockner
Kristallisationsroboter
Microplate reader
Microscale Thermophoresis
Mikroskop
Mikrowelle
NanoDrop® ND-1000
pH-Meter
Photometer
Pipetten
Scanner
Schüttelinkubator
Sonifizierer
Sterilbank
Synchrotron
23
III Material
Messplätze
X33 SAXS beamline (DORIS)
P12 EMBL BioSAXS Beamline (PETRA)
Thermocycler
Transilluminator
UV-Transilluminator + Detektor
Vortex
Waage
Wasserbad
Western Blot-Apparatur
Zentrifugen
P14 EMBL Beamline Macromolecular Crystallography
II - MX2 Beamline (PETRA)
Primus-96, MWG-Biotech, Ebersberg (G);
Mastercycler gradient, Eppendorf, Hamburg (G)
Vilber Lourmat, ETX, Eberhardzell (G)
ChemiDoc XRS, BioRad, Munich (G)
REAX top, Heidolph Instruments, Schwabach (G)
440-47N, Kern, Balingen-Frommern (G)
GFL Typ 1013, GFL, Burgwedel (G)
OWL HEP-1, Thermo Scientific, Rockford (USA)
Sorvall RC-5B und RC 28S, Thermo Scientific,
Rockford (USA)
5417R and 5810R, Eppendorf, Hamburg (G)
Sigma centrifuge 3-18K, Sigma, Osterode (G)
III.1.2 Verbrauchsmittel
Tabelle 2: Verbrauchsmittel
Verbrauchsmittel
Typ, Hersteller
Chromatographiesäulen
Anionenaustauscher UnoQ6, Biorad, Berkeley (USA)
Gelfiltrationssäulen Superdex 75/200, GE Healthcare
Europe, München (G)
Glutathion Sepharose GSTrap FF, GE Healthcare Europe,
München (G)
Ni-NTA Sepharose HisTrapFF, GE Healthcare Europe,
München (G)
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, Thermo Fisher
Scientific (USA)
GE Healthcare, Uppsala (S)
Steritop™ Filter Units 0,22 µm, Merck Millipore, Darmstadt
(G)
190 g/m2, Hartenstein, Würzburg (G)
Dialysekassetten
Glutathion-Sepharose 4B
Flaschenfilter
Filterpapiere für Western
Blot
Monolith™ NT.115
Hydrophilic Capillaries
Monolith™ NT.115
Standard Treated
Capillaries
Multiwell-Platten
NanoTemper Technologies GmbH, München (G)
NanoTemper Technologies GmbH, München (G)
6- / 12-well Sarstedt, Nümbrecht (G); Nunclon 96-well flat
24
III Material
Ni-NTA Agarose
Polypropylensäulen 1 ml,
5ml
Reaktionsgefäße
Parafilm M
Pasteurpipetten
Pipettenspitzen
PVDF-Membran
Röntgenfilm
RedSafe Nucleic Acid
Staining Solution
Serologische Pipetten
Skalpell
Spritzen
Spritzenfilter
Zentrifugenröhrchen
Zentrifugenfilter
bottom black polystyrol, Thermo Scientific/Nunc, Rockford
(USA)
Qiagen, Hilden, (G)
Qiagen, Hilden, (G)
0.2 ml, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf (G); 0.5, 1.5,
2 ml Standard; 1.5 ml Protein LoBind, Eppendorf, Hamburg
(G)
Bemis®, Pechiney Plastic Packaging, Neenah (USA)
230 mm, Heinz Herenz Medizinalbedarf, Hamburg (G)
Sterile Biosphere filter tips and non-sterile 10, 200, 1000 µl,
Sarstedt, Nümbrecht (G); 5000 µl, Eppendorf, Hamburg (G)
Immobilon-P Membrane, Merck Millipore, Darmstadt, (G)
Super RX, Fuji medical X-ray film, Fujifilm, Tokyo (J)
HiSS Diagnostics GmbH, Freiburg (G)
Sterile 2, 5, 10, 25 ml, Sarstedt, Nümbrecht (G)
Sterile, B. Braun, Melsungen (G)
Sterile 5, 20 ml, B. Braun, Melsungen (G)
SFCA 0.2 µm, Thermo Scientific/Nalgene, Rockford (USA)
Sterile 15 ml/50 ml, Sarstedt, Nümbrecht (G)
Vivaspin® 6,15,20 MWCOs from 3 000 to 10000, GE
Healthcare Europe, München (G)
Ultrafree-MC, VV 0.1 µm, Millipore, Billerica (USA)
III.1.3 Kits, Enzyme und Reagenzien
Tabelle 3: Kits, Enzyme und Reagenzien
Kit, Enzym, Reagenz
Hersteller
BioRad Gel Filtration Standard
BioRad Protein Assay
EndoFree Plasmid Maxi Kit
FastAPTM (Alkaline Phosphatase)
FastDigest® restriction enzymes
Gel Filtration Molecular Weight Markers
Kit for Molecular Weights 6,500–66,000
Da
GoTaq® Hot Start Polymerase
HisProbe™-HRP
Kristallisationsscreen AmSO4 Suite
Kristallisationsscreen ClassicsSuite
Kristallisationsscreen ComPAS Suite
Kristallisationsscreen Cryos Suite
BioRad, München (G)
BioRad, München (G)
Life Technologies, Carlsbad (USA)
Thermo Scientific, Rockford (USA)
Thermo Scientific, Rockford (USA)
Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)
Promega, Madison (USA)
Thermo Scientific, Rockford (USA)
Qiagen, Hilden (G)
Qiagen, Hilden (G)
Qiagen, Hilden (G)
Qiagen, Hilden (G)
25
III Material
Kristallisationsscreen JCSG+ Suite
Kristallisationsscreen PACT premier
Kristallisationsscreen
Protein Complex Suite
Kristallisationsscreen
The Stura FootPrint
Kristallisationsscreen
Morpheus® HT-96
Monolith™ NT.115 Protein Labeling Kit
RED-NHS
NucleoSpin Extract II Kit
PCR Extender System
SuperSignal West Femto/ Pico
detection
T4-DNA-Ligase
Taq-DNA-Polymerase + Puffer
Thrombin
ZR Plasmid Miniprep Kit
Qiagen, Hilden (G)
Qiagen, Hilden (G)
Qiagen, Hilden (G)
Molecular Dimensions Limited, Suffolk (UK)
Molecular Dimensions Limited, Suffolk (UK)
NanoTemper Technologies GmbH, München
(G)
Macherey-Nagel, Düren (G)
5 Prime, Hamburg (G)
Thermo Scientific, Rockford (USA)
Roche, Mannheim (G)
Peqlab, Erlangen (G)
GE Healthcare Europe, München (G)
Zymo Research, Irvine (USA)
III.1.4 Puffer und Lösungen
Chemikalien und Puffer wurden von folgenden Firmen bezogen: Amersham/GE Healthcare,
München (G), BD Biosciences, Heidelberg (G), Invitrogen/Life Technologies, Roche,
Mannheim (G), Biozyme, Oldendorf (G), Merck, Darmstadt (G), PAA, Pasching (A),
PromoCell, Heidelberg (G), Roth, Karlsruhe (G), Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) sowie
Thermo Fisher Scientific, Waltham (USA).
Die Medien wurden für 20 min bei 121 °C und 1.4 bar autoklaviert. Puffer wurden entweder
ebenfalls autoklaviert oder bei hitzeempfindlichen Inhaltsstoffen mittels 0,22 µm
Filtereinheiten sterilfiltriert.
III.1.4.1 Wachstumsmedien
Tabelle 4: Wachstumsmedien
Medien
Zusammensetzung, Hersteller
LB-medium (Luria/Miller)
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l Natriumchlorid
pH 7,0
Carl Roth GmbH, Karlsruhe (G)
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l Natriumchlorid
15 g/l Agar
pH 7,0
Carl Roth GmbH, Karlsruhe (G)
LB-Agar (Luria/Miller)
26
III Material
Terrific-Broth
12 g/l Casein
24 g/l Hefeextrakt
9,4 g/l K2HPO4
2,2 g/l KH2PO4
Carl Roth GmbH, Karlsruhe (G)
Tabelle 5: Antibiotika, Zusätze
Antibiotika, Zusätze
Stammkonzentration
Ampicillin
Chloramphenicol
Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid
(IPTG)
Kanamycin
L-Arabinose
Tetrazyklin
100 mg/ml
20 mg/ml
1M
50 mg/ml
20 % (w/v)
20 mg/ml
III.1.4.2 Chemisch-kompetente E. coli
Tabelle 6: Chemisch-kompetente E.coli
Puffer
Zusammensetzung
TFB1
100 mM RbCl
50 mM MnCl2
30 mM Kaliumacetat
10 mM CaCl2
15 % (v/v) Glycerol
pH 5,8 mit Essigsäure
10 mM MOPS
10 mM RbCl
75 mM CaCl2
15 % (v/v) Glyverol
pH 8,0
TFB2
III.1.4.3 Proteinaufreinigung
Tabelle 7: Proteinaufreinigung
Puffer
Zusammensetzung
Anionenaustauscher
PufferA
Anionenaustauscher
PufferB
20 mM NaH2PO4
pH 6,0
20 mM NaH2PO4
1 M NaCl
27
III Material
Gelfiltrationspuffer
DDX3
Gelfiltrationspuffer
TEV-Protease
Gelfiltrationspuffer
YopM
GST-Elutionspuffer
His-Lysepuffer
His-Waschpuffer
His-Elutionspuffer
PBS (phosphate buffered
saline)
TEV-Reaktionspuffer
pH 6,0
50 mM Hepes
250 mM NaCl
2 mM DTT
10 % (v/v) Glycerol
pH7,5
25 mM NaH2PO4
100 mM NaCl
10 % (v/v) Glycerol
pH 7,5
50 mM Hepes
250 mM NaCl
2 mM DTT
pH 7,5
50 mM Tris-HCl
30 mM Glutathion
1 mM DTT
pH 7,5
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM Imidazol
pH 7,4
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
20 mM Imidazol
pH 7,4
50 mM NaH2PO4
300mM NaCl
250 mM Imidazol
10 % v/v Glycerol
pH 7,4
137 mM NaCl
2,65 mM KCl
10 mM Na2HPO4
1,76 mM KH2PO4
pH 7,5
50 mM Tris-HCl
0.5 mM EDTA
1 mM DTT
pH 8,0
28
III Material
Tabelle 8: Chemikalien und Zusätze
Chemikalien, Zusätze
Hersteller
1,4-Dithiothreitol (DTT)
cOmplete, EDTA-free
EDTA-Dinatriumsalz
TCEP (tris(2carboxyethyl)phosphine)
Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)
Roche, Basel (Ch)
Merck-Millipore, Darmstadt (USA)
Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)
III.1.4.4 Elektrophorese und Western Blot
Tabelle 9: Elektrophorese und Western Blot
Puffer
Zusammensetzung
Coomassie-Färbelösung
0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250
40 % (v/v) Methanol
10 % (v/v) Essigsäure
40 % (v/v) Methanol
10 % (v/v) Essigsäure
30 % (v/v) Glycerol
0,25 % (w/v) Bromphenolblau
0,25 % (w/v) Xylenblau
1x TAE Puffer
1.37 M NaCl
26.5 mM KCl
0.1 MNa2HPO4
17.6 mM KH2PO4
pH 7.7
1x PBS
0,1% Tween20
1.5 M Tris Base
0.004 % (w/v) SDS
pH 8,8
250 mM Tris/HCl pH 6,8
20 % (w/v) Glycerol
8 % (w/v) SDS
4 mg Bromphenolblau
(4% (v/v) β-Mercaptoethanol)
0.025 M Tris Base
0.192 M Glycin
0.1 % (w/v) SDS
0,5M Tris Base
0,004% (w/v) SDS
pH 6,8
Coomassie-Entfärbelösung
DNA-Ladepuffer
PBS 10x
PBST
Resolving Puffer
(SDS-PAGE)
SDS-PAGE Ladepuffer
(reduzierend)
SDS-PAGE Laufpuffer (10x)
Stacking Puffer
(SDS-PAGE)
29
III Material
TAE (50x)
TBS (10x)
TBST
Transfer-Puffer
(Western Blot)
2 M Tris-Acetat pH 8,3
0,5 M EDTA
pH 7.4
200 mM Tris-Base
1,5 M NaCl
pH 7,4
1x TBS
0.3 % Tween20
150 m M Tris-Base
25 mM Glycin
20 % (v/v) Methanol
III.1.4.4.1 SDS-Polyacrylamidgele
Tabelle 10: SDS-Polyacrylamidgele
Puffer/Bestandteil
Sammelgel
ddH2O
Stacking buffer
Resolving buffer
30 % Acrylamid
10 % APS
TEMED
3,1 ml
1,25 ml
-0,65 ml
50 µl
5 µl
Trenngel
7,5%
4,86 ml
2,5 ml
2,5 ml
50 µl
10 µl
III.1.4.5 GST-Pulldown
Tabelle 11: GST-Pulldown
Puffer
Zusammensetzung
MBP Column Buffer
20 mM Tris-HCl pH 7,5
200 mM NaCl
1 mM EDTA
10 mM β-Mercaptoethanol
1x protease inhibitors (cOmplete)
20 mM Tris-HCl pH 7,5
500 mM NaCl
0.5 % NP40
10 mM Tris-HCl pH 7.5
150 mM NaCl
0.1% NP40
PD-Bindepuffer
PD-Waschpuffer
30
10%
4,18 ml
-2,5 ml
3,34 ml
50 µl
10 µl
12,5%
3,2 ml
2,5 ml
4,16 ml
50 µl
10 µl
III Material
III.1.4.6 Microscale Thermophorese
Tabelle 12: MST-Puffer
Puffer
Zusammensetzung
Labeling-Puffer
50 mM Hepes
150 mM NaCl
pH 7,5
50 mM Hepes
150 mM NaCl
0,05 % Tween20
0,5 mg/ml BSA
2 mM DTT
pH 7,5
MST-Reaktionspuffer
III.1.4.7 Caspase-1 Assay
Tabelle 13: Caspase Assay
Puffer
Zusammensetzung
Caspase-1 Assay Puffer
50 mM Hepes
100 mM NaCl
0,1 % Chaps
1 mM EDTA
10% (v/v) Glycerol
10 mM DTT
pH 7,4
III.1.5 Protein und DNA-Leitern
A
B
Abbildung 8: Protein und DNA-Leitern.
A: PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific, Rockford, USA). B: GeneRuler 1 kb DNA Ladder
(Thermo Scientific, Rockford, USA).
31
III Material
III.1.6 Bakterienstämme
III.1.6.1 Escherichia coli
Tabelle 14: E. coli-Stämme
Stamm
Genotyp
Referenz
DH5α
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR
nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169,
hsdR17(rK- mK+), λ–
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZΔM15ΔlacX74 nupG recA1
araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15
galK16 rpsL(StrR) endA1 λF– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ
(Taylor et al. 1993)
TOP10
BL21-AI™
BL21CodonPlus®RIL
B F–ompT hsdS(rB–mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3)
endA Hte [argU ileY leuW Camr
(Grant et al. 1990)
(Moffatt & Studier
1987)
(Dunn 1988)
III.1.6.2 Yersinia
Tabelle 15: Yersinia-Stämme
Stamm
Charakteristik
Referenz
Y. enterocolitica WA-314
Serotyp O:8; klinisches Isolat, Träger
des Virulenzplasmids pYV-WA-314
Serotyp 0:8; Biotyp 1B, klinisches
Isolat, Träger des Virulenzplasmids
pYV8081
Serotyp III; klinisches Isolat
(Heesemann & Laufs
1983)
(Thomson et al. 2006)
Y. enterocolitica 8081
Y. pseudotuberculosis
YpIII
(Bolin et al. 1982;
Gemski et al. 1980)
III.1.7 Plasmide
III.1.7.1 Prokaryotische Proteinexpression
Tabelle 16: Plasmide zur prokaryotischen Proteinexpression
Vektor/ Konstrukt
Characteristik
Referenz
pGEX-4T2
Vektor zur prokaryotischen
Expression eines GSTFusionsproteins; MCS downstream
GST-Tag
GE Healthcare,
München (G)
32
III Material
pET302
pET303
pQE30-TEV
Vektor zur prokaryotischen
Expression eines 6xHisFusionsproteins; MCS downstream
His-Tag
Vektor zur prokaryotischen
Expression eines GSTFusionsproteins; MCS upstream
His-Tag
Vektor zur prokaryotischen
Expression eines GSTFusionsproteins; MCS upstream
His; einklonierte TEV-ProteaseSchnittstelle
Thermo Fisher Scientific,
Waltham (USA)
Thermo Fisher Scientific,
Waltham (USA)
Qiagen, Hilden (G);
verändert, Rumm
III.1.7.2 Eukaryotische Proteinexpression
Tabelle 17: Plasmide zur eukaryotischen Proteinexpression
Vektor/ construct
pEGFP-N1
Charakteristik
Vektor zur eukaryotischen Expression
eines GFP-Fusionsproteins; MCS
upstream His-Tag
Referenz
Clontech,
Heidelberg (G)
III.1.7.3 Expressionskonstrukte
Tabelle 18: Expressionskonstrukte
Konstrukt
YopM (Y.e. WA-314)
6x NT-His-TEV-YopM_Full
6x NT-His-TEVYopM_Core
6x CT-His-YopM_Full
(Annotation)
6x CT-His-YopM_Full
6x CT-His-YopM_noC
6x CT-His-YopM_Core
Vektor; insert
Referenz
pET302; YopM-Volllänge
(AS 1 – 506), TEV-ProteaseErkennungssequenz
pET302; YopM-Kerndomäne
(AS 34 – 481), TEV-ProteaseErkennungssequenz
pET303; YopM-Volllänge, laut
Annotation
(AS -21 – 506)
pET303; YopM-Volllänge
(AS 1 – 506)
pET303; YopM ohne C-Terminus
(AS 1 – 481)
pET303; YopM-Kerndomäne
(AS 34 – 481)
Diese Arbeit
33
Diese Arbeit
Wolters, unveröffentlicht
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
III Material
6x CT-His-YopM_LRR
CT-GFP-YopM_Full
NT-GST-YopM_Full
NT-FLAG-GPI_YopM_Full
pET303; YopM LRR (AS-74-481)
pEGFP-N1; YopM-Volllänge
(AS 1-506)
pGEX-4T2; YopM-Volllänge
(AS 1-506), Thrombin-ProteaseErkennungssequenz
pCMVSPORT6; YopM-Volllänge
(AS 1-506), GPI-Membrananker
Diese Arbeit
Diese Arbeit
pET302; YopM-Volllänge
(AS 1 – 368), TEV-ProteaseErkennungssequenz
pET302; YopM-Kerndomäne
(AS 34 – 343), TEV-ProteaseErkennungssequenz
Diese Arbeit
pET302; YopM-Volllänge
(AS 1 – 409), TEV-ProteaseErkennungssequenz
pET302; YopM-Kerndomäne
(AS 34 – 385), TEV-ProteaseErkennungssequenz
Diese Arbeit
pGEX-4T2; DDX3-Volllänge
(AS 1-662), Thrombin-ProteaseErkennungssequenz
pGEX-4T2; DDX3-ATPaseDomäne (AS 1-406), ThrombinProtease-Erkennungssequenz
pGEX-4T2; DDX3-HelicaseDomäne (AS 411-662), ThrombinProtease-Erkennungssequenz
pGEX-4T2; kristallisierte Domäne
von DDX3 (AS 168-580),
Thrombin-ProteaseErkennungssequenz
pET303; DDX3-Volllänge
(AS1-662)
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
YopM (Y.e. 8081)
6x NT-His-TEV-YopM_Full
6x NT-His-TEVYopM_Core
Diese Arbeit
YopM (Y.p. YpIII)
6x NT-His-TEV-YopM_Full
6x NT-His-TEVYopM_Core
Diese Arbeit
DDX3
NT-GST-DDX3
NT-GST-DDX3-ATPase
NT-GST-DDX3-Helicase
NT-GST-DDX3-Crystal
6x CT-His-DDX3
34
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
III Material
6x CT-His-DDX3_Crystal
6x CT-His-DDX3_1-418
6x CT-His-DDX3_51-418
6x CT-His-DDX3_101-418
6x CT-His-DDX3_168-418
6x CT-His-DDX3_201-418
pET303; kristallisierte Domäne von
DDX3 (AS 168-580)
pET303; DDX3 (AS 1-418)
pET303; DDX3 (AS 51-418)
pET303; DDX3 (AS 101-418)
pET303; DDX3 (AS 168-418)
pET303; DDX3 (AS 201-418)
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
Diese Arbeit
III.1.8 Oligonukleotide
Tabelle 19: Oligonukleotide
Name
Sequenz (5´3´)
YopM (pET303)
YopMpet303for
AAATCTAGAATGTATGGTTTTGTTTG
C
YopMshortNpet303for AAATCTAGAATGTTTATAAATCCAAG
A
YopMpet303rev
GTGCTCGAGCTCAAAAACATCATCT
TC
YopMpetnoC303rev
GTGCTCGAGGTCCATCCGAAGATCT
TC
YopMLRR6pet303rev GTGCTCGAGTAAGAAGATTAAACTC
TG
YopMpET303_KSK
AAATCTAGAATGAAATCTAAGACTGA
ATA
pET303_YopMLRR
GAGGTCTAGAATGCATGAGCTAGAA
_for
CTAAAT
Länge
Besonderheit
27
XbaI
27
XbaI
27
XhoI
27
XhoI
27
XhoI
29
XbaI
31
XbaI
52
EcoRI; TEV
58
EcoRI; TEV
34
BamHI
34
BamHI
YopM (pET302)
302TevYopMfor
302TevKSKYopMfor
302TevYopMrev
302TevYopMcorrev
CGTGAATTCGGAGAATCTTTATTTTC
AGGGCTTTATAAATCCAAGAAATGTA
CGTGAATTCGGAGAATCTTTATTTTC
AGGGCAAATCTAAGACTGAATATTAT
AATGCA
ATTCGGATCCCTACTCAAAAACATCA
TCTTCAAG
ATTCGGATCCTTAGTCCATCCGAAG
ATCTTCCAC
YopM (pGEX-4T2)
35
III Material
pGEX_6P2_YopM_f
CTGGGATCCTTTATAAATCCAAGA
24
BamHI
pGEX_6P2_YopM_r
GCCGAATTCCTACTCAAAAACATCAT
C
27
EcoRI
DDX3 (pET303)
DDX3_for
DDX3_51_for
DDX3_101_for
DDX3_151_for
DDX3_168_for
DDX3_201_for
DDX3_248_for
DDX3_303_for
DDX3_356_for
DDX3_411_for
DDX3_419_for
DDX3_167_rev
DDX3_406_rev
DDX3_418_rev
DDX3_580_rev
DDX3_rev
GAGGTCTAGAATGAGTCATGTGGCA
GTGG
GAGGTCTAGAATGGGTTTCTACGAT
AAAGAC
GAGGTCTAGAATGCGGAGTGATTAC
GATGGC
AGGTCTAGAATGTTTTCTGGAGGCA
ACACT
GAGGTCTAGAATGGTTGAGGCAACA
GGCAAC
GAGGTCTAGAATGACTCGCCCAACT
CCAGTG
GAGGTCTAGAATGGGCGAGGCTTT
GAGGGCC
GAGGTCTAGAATGGCCGATATTGGT
CAGCAG
GAGGTCTAGAATGGGGTTTGAGCCT
CAGATT
GAGGTCTAGAATGACCTCTGAAAAC
ATCACA
GAGGTCTAGAATGGTAGTTTGGGTG
GAAGAA
TACCCTCGAGTGGAATGTCATCGTA
TTT
TACCCTCGAGTCCTACAGCCAAGAA
GAT
TACCCTCGAGTTTCTGTGTGATGTTT
TC
TACCCTCGAGGTAGTGGTGTTCATA
AGC
TACCCTCGAGGTTACCCCACCAGTC
XbaI
29
XbaI
31
XbaI
31
XbaI
30
31
XbaI
31
XbaI
31
XbaI
31
XbaI
31
XbaI
31
XbaI
31
XbaI
XhoI
28
XhoI
28
XhoI
28
28
XhoI
25
XhoI
25
27
EcoRI
EcoRI
DDX3 (pET302)
pET302_DDX3_for
pET302_DDX3_51_for
GTGAATTCGAGTCATGTGGCAGTGG
GTGAATTCGGGTTTCTACGATAAAG
AC
36
III Material
pET302_DDX3_101_f
or
pET302_DDX3_151_f
or
pET302_DDX3_for
pET302_DDX3_167_r
ev
pET302_DDX3_406_r
ev
pET302_DDX3_418_r
ev
pET302_DDX3_rev
GTGAATTCGCGGAGTGATTACGATG
GC
GTGAATTCGTTTTCTGGAGGCAACA
CT
GTGAATTCGAGTCATGTGGCAGTGG
GCCGGATCCGATTATGGAATGTCAT
CGTATTT
GCCGGATCCGATTATCCTACAGCCA
AGAAGAT
GCCGGATCCGATTATTTCTGTGTGA
TGTTTTC
GCCGGATCCGATTAGTTACCCCACC
AGTC
27
EcoRI
27
EcoRI
25
32
EcoRI
BamHI
32
BamHI
32
BamHI
CTGGGATCCCCAGGAATTCCCATGA
GTCATGTGGCAGTG
CTGGGATCCCCAGGAATTCCCGTTG
AGGCAACAGGCAACAAC
CTGGGATCCCCAGGAATTCCCACCT
CTGAAAACATCACACAG
GGCCGCTCGAGTTCAGTTACCCCAC
CAGTCAAC
GGCCGCTCGAGTTTATCCTACAGCC
AAGAAGATATA
GGCCGCTCGAGTTTAGTAGTGGTGT
TCATAAGCCAT
39
BamHI; EcoRI
42
BamHI; EcoRI
42
BamHI; EcoRI
33
XhoI
36
XhoI
36
XhoI
29
DDX3
(pGEX_4T2/6P2)
DDX3_for
DDX3_168_for
DDX3_411_for
DDX3_rev
DDX3_406_rev
DDX3_580_rev
37
III Material
III.1.9 Elektronische Datenverarbeitung
Tabelle 20: Software
Software
Adobe Photoshop CS3
ATSAS Suite Biosaxs software
CCP4
CLC-Main Workbench
COOT
GraphPad Prism 5
ImageJ
iMOSFLM
NTAnalysis
Office software
pymol
UCSF Chymera
Hersteller
Adobe Systems GmbH, Munich (G)
EMBL, Hamburg (G)
(Winn et al. 2011)
CLC bio, Aarhus (DK)
(Emsley et al. 2010)
La Jolla (USA)
Bethesda (USA)
(Battye et al. 2011; Leslie 2006)
Nanotemper GmbH, München (G)
Microsoft, Redmond, (USA)
Schrödinger, Portland (USA)
Resource for Biocomputing, Visualization,
and Informatics at the University of
California, San Francisco, (USA)
38
III Methoden
III.2 Methoden
Alle mikrobiologischen Arbeiten wurden in Laboren der gentechnischen Sicherheitsstufe 2
(S2) durchgeführt.
III.2.1 Mikrobiologische Methoden
III.2.1.1 Anzuchtbedingungen
Zur Anzucht in Flüssigmedium wurden Y. enterocolitica oder Y. pseudotuberculosis-Stämme
aus Glycerinkultur oder von LB-Agarplatte in LB-Medium überführt und bei 27°C schüttelnd
inkubiert. Zum Wachstum auf Festmedium wurden die Yersinia-Stämme mit einer sterilen
Impföse aus Flüssig- bzw. Glycerinkultur auf Agarplatten ausgestrichen. Alternativ wurden
100 μl einer Flüssigkultur mit einem Drigalski-Spatel ausplattiert. Die Inkubation erfolgte bei
27°C.
Zur Anzucht von E. coli wurden 5 ml LB-Medium mit einer einzelnen Kolonie von Platte
beimpft und bei 37°C unter Schütteln über Nacht inkubiert.
III.2.1.2 Yop Release-Assay
Bei Temperaturen von 37°C und unter Ca2+-Mangel können Y. enterocolitica Stämme dazu
gebracht werden ihre Yops in den Kulturüberstand abzugeben ohne dass hierfür ein
Zellkontakt nötig ist. (Heesemann et al. 1986) Anschließend können die sich im
Kulturüberstand befindlichen Proteine isoliert und mittels Trichloressigsäure (TCA) gefällt
werden.
Eine 27°C Übernachtkultur des entsprechenden Stammes wurde 1:20 in frischem LBMedium verdünnt und bei 37°C für 1,5 h inkubiert. Die Stimulation der Yop-Sekretion erfolgte
durch Zugabe von 5 mM EGTA, 0,2 % Glukose und 15 mM MgCl2. EGTA ist ein
Chelatbildner für zweiwertige Kationen und sorgt damit für den erforderlichen Ca 2+-Mangel
im Kulturmedium. Nach Inkubation für weitere 3 h bei 37°C wurden die Bakterien in 50 ml
Zentrifugenröhrchen bei 10000 rpm und 4°C (Sigma 3-18K) pelletiert und der Überstand
wurde in ein neues 50 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Proteine wurden für eine Stunde auf
Eis durch Zugabe von 10 % (v/v) TCA gefällt. Nach erneuter Zentrifugation für 30 min bei
10000 rpm und 4°C wurden die Proteine zweimal in eiskaltem Aceton gewaschen. Ein dritter
Waschschritt erfolgte mit ddH2O. Das Pellet wurde anschließend in reduzierendem SDSPAGE Ladepuffer (Tabelle 9) aufgekocht und in einer SDS-PAGE aufgetrennt.
III.2.1.3 Stammkonservierung
Zur dauerhaften Konservierung der E. coli-Stämme wurden Glycerinkulturen angelegt.
Hierzu wurden 0,8 ml LB-Medium mit 40 % (w/v) Glycerol in Cryoröhrchen (Nunc) vorgelegt
und jeweils 0,8 ml einer exponentiell wachsenden Flüssigkultur (OD600 = 0,5-0,8) zugegeben.
Diese Mischung wurde gevortext, sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
gelagert.
III.2.1.4 Transformation von E. coli
Die Möglichkeit E. coli zu transformieren (Sambrook & Russell 2001) stellt die Grundlage für
weiterführende Klonierungen dar. Vektorkonstrukte werden in geeigneten E. coli-Stämmen
amplifiziert und zur weiteren Analyse in hoher Kopiezahl isoliert. Im Folgenden wurde eine
39
III Methoden
abgewandelte Methode zur Transformation von E. coli durch Behandlung mit CaCl2
(Hanahan & Harbor 1983) verwendet.
III.2.1.4.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien
300 ml LB-Medium (in einem 1 l Erlenmeyer-Kolben) wurden mit einem gewünschten
E. coli-Stamm beimpft und bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD600)
schüttelnd inkubiert. Die Kultur wurde anschließend auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation für
10 min bei 4°C und 3000 rpm (Sigma 3-18K) wurde das erhaltene Zellpellet in 20 ml kaltem
TFB 1 Puffer (Tabelle 6) resuspendiert und für 90 min auf Eis gelagert.
Der Ansatz wurde wie oben beschrieben erneut abzentrifugiert und das Pellet wurde in 1,5
ml eiskaltem TFB 2 Puffer (Tabelle 6) resuspendiert.
Die Zellsuspensionen wurden zu 100 µl Portionen aliquotiert, in flüssigem N2 schockgefroren
und bei -80°C gelagert.
III.2.1.4.2 Transformation von E. coli
Zur Transformation der kompetenten E. coli-Stämme wurde ein 100 µl Aliquot auf Eis
langsam aufgetaut, mit 1-100 ng DNA gemischt und für weitere 10 min auf Eis gestellt.
Danach folgte ein Hitzeschock (90 sec, 42°C) zur Aufnahme der DNA in die Zellen. Die
Zellen wurden anschließend auf Eis überführt und zu 900 µl sterilem LB-Medium in einem
Glasröhrchen pipettiert. Die phänotypische Expression der Resistenz erfolgte durch
schüttelnde Inkubation der Kultur für 90 min bei 37°C.
Nach der phänotypischen Expression wurden 100 µl der Suspension bzw. geeigneter
Verdünnungen auf Selektivagar-Platten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
III.2.2 Molekularbiologische Methoden
III.2.2.1 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung und zum Sichtbarmachen von DNA-Fragmenten wurde die AgaroseGelelektrophorese verwendet. Die aufgrund der Phosphat-Gruppen negativ geladene DNA
bewegt sich hierbei in einem Spannungsfeld von der Kathode zur Anode. Dabei werden
DNA-Fragmente aufgrund ihres unterschiedlichen Laufverhaltens je nach Größe sowie
Konformation im elektrischen Feld
innerhalb einer Agarose-Matrix aufgetrennt. Die
Wanderungsgeschwindigkeit ist weiterhin abhängig von der angelegten Spannung (8 V/cm)
sowie der Konzentration der eingesetzten Agarose (0,8-2 %). Bei höherer Spannung sowie
geringerer Agarosekonzentration bewegen sich Teilchen im Feld schneller.
Zur Durchführung wurde die gewünschte Menge Agarose in adäquater Menge 1x TAE-Puffer
gelöst und in der Mikrowelle bei 800 W erhitzt bis das Pulver vollständig gelöst war. Danach
wurde die mit RedSAFE (HISS Diagnostics, Freiburg, G) Agarose in einen Gelschlitten
gegossen, in den ein Kamm eingesetzt war, welcher nach Abkühlung des Gels die Taschen
für die spätere Probenapplikation lieferte. Nach Aushärtung des Gels wurde der Schlitten in
eine Elektrophorese-Kammer eingesetzt und das Gel mit 1x TAE-Laufpuffer vollständig
überschichtet. DNA Proben wurden mit adäquater Menge 6x DNA-Probenpuffer versetzt und
in die vorgesehenen Taschen pipettiert. Als Größenstandards diente ein 1 kb DNA-Ladder
(GeneRulerTM 1 kb-DNA Ladder, Thermo Fisher, Waltham, USA). Die Elektrophorese wurde
bei einer Spannung von 8 V/cm durchgeführt. Zur Sichtbarmachung der DNA wurde das Gel
anschließend auf einem Transilluminator (ChemiDoc XRS, BioRad, München, G) gelegt.
40
III Methoden
Hierbei macht man sich die Fluoreszenz-Eigenschaften (309nm/419nm) des an die DNA
bindenden REDSafe-Farbstoffs zunutze.
Die verwendeten Puffer sind Tabelle 9 zu entnehmen.
III.2.2.1 Konzentrationsbestimmung von DNA
Die Konzentrationsbestimmung von DNA basiert auf dem Absorptionsmaximum der Nucleinsäuren bei 260 nm. Für die Absorption sind dabei die aromatischen Ringe der Basen verantwortlich. Die Absorption eines 1 µl Tropfens wurde hierbei im NanoDrop (ND-1000 peqlab,
Erlangen, G) photometrisch gemessen. Eine Lösung die 50 ng doppelsträngige DNA
beinhaltet erhält hierbei den Absorptionswert 1. Die Konzentration eventuell noch
vorhandener Proteine oder Phenol wird bei 280 nm Wellenlänge gemessen. Der Quotient
der Absorption OD260/OD280 bestimmt hierbei die Reinheit der Lösung und sollte für DNA
idealerweise zwischen 1,8 und 2 liegen.
III.2.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA
Plasmid DNA wurde mithilfe des ZR Plasmid Miniprep-Classic Kits (Zymo Research, Irvine,
USA) laut Anleitung aufgereinigt.
III.2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine einfache Methode zur Amplifikation von kurzen DNAFragmenten (Saiki et al. 1988). Eine thermostabile DNA-Polymerase amplifiziert hierbei
einen Teil einer DNA-Sequenz, der durch zwei Oligonukleotide (Primer) begrenzt wird.
Eine PCR besteht typischerweise aus drei Schritten. Zunächst wird die doppelsträngige DNA
durch hohe Temperaturen (95-98°C) aufgeschmolzen (Schritt 1: Denaturierung), bevor sich
in einem zweiten Schritt durch Herabsetzen der Temperatur Primer an die komplementären
Stellen der DNA anlagern können (Schritt 2: Annealing). Die sogenannte AnnealingTemperatur der Oligonukleotid-Primer ist dabei abhängig von GC-Gehalt sowie Länge der
Primer. Anschließend erfolgt eine 5´  3´ gerichtete Verlängerung der Oligonukleotide
komplementär zu der als Matrize dienenden Template-DNA (Schritt 3: Elongation). Die
Elongationstemperatur richtet sich nach dem thermodynamischen Wirkungsoptimum des
verwendeten Enzyms und liegt bei den üblichen aus Thermus aquaticus isolierten
Polymerasen bei 72°C. Durch 30-35 fache Wiederholung dieser Schritte erhält man somit
eine hohe Anzahl an Kopien des ursprünglichen Templates. Die Länge des PCR-Produkts
wird durch die Primer bestimmt, die an den gegenläufigen Enden der DNA lokalisiert sind.
Die Auswahl der verwendeten Primerpaare folgte den von Newton und Graham (1994)
aufgestellten Regeln, welche GC-Gehalt, Länge sowie Basenverteilung beinhalten. Die
Schmelztemperatur der beiden Primer eines Paares sollte annähernd gleich sein.
Für die in dieser Arbeit durchgeführten Reaktionen wurden je nach Zweck zwei verschiedene
DNA-Polymerasen verwendet.
Für rein analytische Ansätze, bei denen lediglich das Vorhandensein eines bestimmten DNABereichs nachgewiesen werden sollte, wurde die GoTaq® DNA-Polymerase (Promega,
Fitchburg, USA) verwendet. Diese Polymerase besitzt keine Korrekturlesefunktion
(3´  5´ Exonuklease), wodurch es zu einer Fehlerhäufigkeit (statistische Fehlpaarung von
Basen) von 8 x 10-6 kommt. Ein Standardansatz für diese Polymerase lautet wie folgt:
41
III Methoden
Tabelle 21: PCR-Ansatz GoTaq®
Komponente
Konzentration
Volumen
DNA-Template oder Kolonie
®
GoTaq -Reaktionspuffer
forward primer
reverse primer
dNTPs
Taq-Polymerase
ddH2O
100 ng/µl
5x
10 pmol/µl
10 pmol/µl
10 mM
5 units/µl
1 µl
10 µl
1 µl
1 µl
2 µl
0,25 µl
ad 50 µl
Tabelle 22: PCR-Programm GoTaq®
Schritt
Temperatur
Dauer
Zyklen
1. Initiale Denaturierung
(colony PCR)
95 °C
3 min
(5 min)
1
2.
3.
4.
5.
95 °C
Tm -5°C
72 °C
72 °C
30 s
30 s
1 kb DNA/min
5 min
4 °C
∞
Denaturierung
Annealing
Elongation
Finale Elongation
6. Pause
30-35
1
1
Bei der Herstellung von PCR-Produkten für Klonierungen bzw. für gezielte
Mutagenese war
33-37
eine möglichst niedrige Fehlerrate erforderlich. Aus diesem Grund wurde für präparative
Zwecke die Phusion High-fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, Waltham, USA)
verwendet, welche eine Korrekturlesefunktion besitzt. Mit ihr ist eine etwa 50-fach höhere
Genauigkeit (4,4* 10-7) beim Nukleotid Einbau zu erreichen. Zusätzlich hat sie eine höhere
Amplifikationsrate pro Zeit und kann längere Produkte liefern. Sie bildet im Gegensatz zur
Taq-Polymerase Blunt Ends. Ein Standardansatz für diese Polymerase lautet wie folgt:
Tabelle 23: PCR-Ansatz Phusion-Polymerase
Komponente
Konzentration
Volumen
DNA-Template
Phusion HF Reaktionspuffer
forward primer
reverse primer
dNTPs
Phusion-Polymerase
ddH2O
100 ng/µl
5x
10 pmol/µl
10 pmol/µl
10 mM
5 units/µl
1 µl
10 µl
1 µl
1 µl
2 µl
0,25 µl
ad 50 µl
42
III Methoden
Tabelle 24: PCR-Programm Phusion
Schritt
Temperatur
Dauer
Zyklen
1. Initiale Denaturierung
98 °C
2 min
1
2.
3.
4.
5.
98 °C
Tm +3°C
72 °C
72 °C
10 s
20 s
1 kb DNA/15 s
5 min
4 °C
∞
Denaturierung
Annealing
Elongation
Finale Elongation
6. Pause
30-35
1
1
III.2.2.4 Aufreinigung von DNA
33-37
Die Aufreinigung von DNA, insbesondere von PCR-Produkten oder Plasmiden, ist wichtig um
diese von restlichen Puffern, Lösungen oder Proteinverunreinigungen, die weitere
Experimente behindern könnten, zu befreien. Zur direkten Aufreinigung von PCR-Produkten
wurde das „Nucleo Spin Extract II“ Kit (Macherey-Nagel, Düren, G) nach Herstellerangaben
verwendet. Zur Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarosegelen wurden Gele mit
ausreichend großen Taschen hergestellt, die einen Gesamtansatz von 50-100 µl fassen. Auf
das Agarosegel wurde eine geeignete DNA-Leiter und der gesamte Reaktionsansatz
aufgetragen, wobei 1 µl von diesem in eine benachbarte Tasche pipettiert wurde. Die
Elektrophorese erfolgte bei geringer Voltzahl um eine gute Auftrennung der DNA-Banden zu
gewährleisten. Um die DNA der zu eluierenden Probe nicht durch UV-Einwirkung zu
beschädigen wurde diese abgeschnitten. Nach Färbung des restlichen Gel-Fragmentes mit
DNA-Leiter und Probenspur im RED Safe-Bad wurde unter UV-Licht der Bereich der
gewünschten Bande mit dem Skalpell markiert. Nach Zusammenlegen der Teile wurde die
entsprechende Laufhöhe aus der Probenspur ausgeschnitten und mit dem „Nucleo Spin
Extract II“ Kit (Macherey-Nagel, Düren, G) gemäß Anleitung aufgereinigt.
III.2.2.5 Restriktionsverdau von DNA
Zur Subklonierung von PCR-Produkten in Expressionsvektoren wurden zunächst mittels
PCR spezifische Schnittstellen in die zu klonierenden DNA-Fragmente eingeführt. Die
korrespondierenden Schnittstellen fanden sich ebenso in dem gewählten Zielvektor. Die
Restriktion erfolgte mittels FastDigest® Restriktionsendonukleasen (Thermo Fisher, Waltham,
USA) nach Herstellerangaben in einem Wasserbad (GFL Typ 1013, GFL, Burgwedel, G)oder
im Thermocycler (Primus-96, MWG-Biotech, Ebersberg, G). Die erhaltenen Produkte wurden
mittels Agarosegelelektrophorese (2.2.1) aufgetrennt und aufgereinigt (2.2.4).
III.2.2.6 Ligation
Zur Ligation von DNA-Fragmenten wurde die T4-DNA-Ligase (1U/µl; Roche, Mannheim G)
verwendet. Diese verknüpft freie 3´-OH Gruppen mit 5´-Phosphatgruppen unter Bildung einer
Phosphodiesterbindung. Die verwendeten mit BamHI, EcoRI, XhoI, XbaI und HindI
geschnittenen DNA-Fragmente und Vektoren verfügten über kohäsive Enden und wurden
daher meist in äquimolaren Mengen eingesetzt (je ca. 0,09 pmol). Es wurde jeweils 1 µl der
Ligase in dem mitgelieferten Puffer eingesetzt und bei 16-20°C über Nacht ligiert. Die bei der
Ligation eingesetzten DNA-Mengen wurden mit nachfolgender Formel bestimmt:
ng (Vector) x kb (Insert)
ng (Insert) =
kb (Vector) x molar ratio (Vector/Insert)
43
III Methoden
III.2.2.7 Hersellung der in dieser Arbeit verwendeten Konstrukte
Zur heterologen Expression von Y. enterocolitica WA-314 GST-YopM in E.coli BL21 RIL
wurde das Zielgen aus dem aufgereinigten Virulenzplasmid pyV-WA314 (Accession number:
FR687019) mittels PCR amplifiziert und über die Schnittstellen für BamHI und EcoRI in den
Zielvektor pGEX-4T2 ligiert. YopM Konstrukte, die einen abspaltbaren 6x His-Tag tragen,
wurden kreiiert, in dem das jeweilige Zielgen mittels PCR aus den Virulenzplasmiden pyVWA314 (Accession number: FR687019), pYPIII (nicht vollständig sequenziert) bzw.
pYVe8081 (Accession number: NC_008791) amplifiziert wurde. Die verwendeten Primer
trugen die für die Klonierung benötigten Schnittstellen EcoRI und BamHI. Zusätzlich wurde in
den Vorwärts-Primer eine Sequenz „in frame“ eingebaut, die für die TEV-ProteaseErkennungssite ENLYFQG codiert. Das jeweilige PCR-Produkt wurde dann wie unter 2.2.42.2.6 beschrieben in den Zielvektor pET302 eingebracht. Zur Klonierung von YopM
Konstrukten in pET303 wurden die Schnittstellen XhoI und XbaI mittels PCR aus pyVWA314 eingebracht und wie unter 2.2.4-2.2.6 beschrieben weitergeführt.
DDX3-Konstrukte wurden durch Amplifikation aus humaner cDNA (Accession number:
NM_001356) generiert. Die Klonierung in die Zielvektoren erfolgte äquivalent zu den
beschriebenen YopM-Konstrukten. Eine vollständige Liste aller verwendeteten Konstrukte
und der benutzten Oligonukleotide findet sich in Tabelle 18 und Tabelle 19.
III.2.2.8 DNA-Sequenzierung
DNA Sequenzierungen wurden von der Firma Seqlab (Göttingen, G) laut deren
Standardprotokollen durchgeführt. Die Sequenzen wurden mit dem Programm CLC
Workbench (CLC bio, Aarhus, DK) analysiert.
III.2.3 Biochemische Methoden
III.2.3.1 Heterologe Genexpression in E. coli
Seit den Entdeckungen von Herbert Boyer und Stanley N. Cohen zur Klonierung und
Expression fremder Gene in E. coli 1974 (Cohen et al. 1972; Cohen et al. 1973) und der
erstmaligen Produktion eines humanen Proteins (Somatostatin) durch die Firma Genetech
1974 ist die heterologe Genexpression eine Standardprozedur zur Untersuchung der
Funktion und biochemischen Eigenschaften eines Proteins. Sie stellen eine der Grundlagen
moderner biochemischer Arbeiten dar.
Für die Expression der in dieser Arbeit untersuchten Proteine wurden im Wesentlichen die
Stämme E. coli BL21 AI und BL21 RIL benutzt (siehe Tabelle 14). Der grundlegende Ablauf
wird im Folgenden beschrieben.
Zunächst wurde eine Übernachtkultur des entsprechenden Stammes angesetzt. Hierzu
wurden 25 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml) entweder aus einem Glycerolstock oder
von einer Agarplatte mit einer Kolonie beimpft. Die Vorkultur wurde bei 200 rpm und 37°C
über Nacht (ca. 16 h) inkubiert. Für die Expressionskultur wurde 1 l LB-Medium mit Ampicillin
(100µg/ml) 1:40 aus der Übernachtkultur beimpft und schüttelnd (200 rpm 37°C) bis zu einer
optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,5-0,8 inkubiert. Nach Induktion der
Proteinexpression mit 0,5-1 mM IPTG (BL21 AI; BL21 RIL) und 0,2 % (w/v) L-Arabinose
(BL21 AI) wurde entweder für weitere 4 h bei 37°C inkubiert oder die Kultur wurde auf 16°C
heruntergekühlt und über Nacht weiterinkubiert. Der Temperaturshift sollte der Verhinderung
der Bildung von “Inclusion Bodies” dienen und damit die Löslichkeit des Zielproteins
44
III Methoden
erhöhen. Zur Zellernte wurde die Bakteriensuspension für 10 min bei 6000 rpm und 4°C
(Sorvall RC 5B, Rotor GS-3) pelletiert und bis zur Proteinaufreinigung bei -20°C gelagert.
III.2.3.2 Zellaufschluss von E.coli
Ultraschall mit hoher Energie (hoher Amplitude) erzeugt in Flüssigkeiten kleine Blasen, die
zunächst größer werden und dann implodieren. Diese rasch wechselnden Druckänderungen
bewirken ein Zerreißen der Membranen und Zellwände beschallter Zellen. Mit Ultraschall
kann also ohne Zusatz von Detergenzien oder Enzymen innerhalb von Sekunden ein
schneller Zellaufschluss erreicht werden. Da bei diesem Verfahren viel Wärme freigesetzt
wird, erfolgte die Ultraschallbehandlung auf Eis.
Zum Aufschluss der Zellen wurde das aus 2.2.1 erhaltene Bakterienpellet in
entsprechendem Volumen PBS (bei GST-Fusionsproteinen) oder His-Lysepuffer (Bei 6 xHisFusionsproteinen) (siehe Tabelle 7) resuspendiert und zu 5 ml Portionen in 50 ml
Zentrifugenröhrchen aliquotiert. Die Suspension wurde 5-10x bei einer Amplitude von 2040 % in einem Branson Sonifier (Digital Sonifier 250-D, Branson, Danbury, USA) beschallt,
bis die Zellsuspension klar wurde (sie wirkt opaleszierend). Im Zweifelsfall erfolgte eine
mikroskopische Kontrolle der Lyse. Um das Lysat von Zellbestandteilen zu trennen wurde
die Suspension für 30 min bei 20.000 g bei 4°C zentrifugiert (Sigma centrifuge 3-18K, Sigma,
Osterode, G).
III.2.3.3 Proteinaufreinigung
III.2.3.3.1 Imobilisierte Metallaffinitätschromatographie
Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) wurde das erste mal 1975 von Porath
und Kollegen (Porath et al. 1975) zur Auftrennung von Proteinen beschrieben und seitdem
für die Aufreinigung einer großen Anzahl von Proteinen verwendet (Sulkowski 1985).
Kernpunkt der Technik ist die Bindung des Imidazolrings der Aminosäure Histidin an
zweiwertige Kationen wie Co2+, Ni2+, Cu2+ oder Zn2+.
Zur Aufreinigung von 6x His-getagten Proteinen wurde Ni-NTA Agarose (Qiagen, Hilden, G)
und Einweg-Polypropylensäulen (1 bzw 5 ml, Qiagen, Hilden, G) verwendet. Zunächst wurde
die Ni-NTA-Agarose mit fünf Säulenvolumen (column volume, cv) His-Lysepuffer äquilibriert.
Die Menge verwendeter Matrix richtete sich nach der erwarteten Proteinmenge (5-10 mg
Protein/ 1 ml Ni-NTA-Matrix). Nach Bindung des im Rohextrakt aus 2.3.2 enthaltenen
Proteins durch einfachen Schwerkrafts-Durchfluss, wurde die Matrix zweimal mit fünf cv
Waschpuffer gespült. Die geringe Imidazolkonzentration im His-Waschpuffer diente hierbei
der Verdrängung von unspezifisch gebundenen Proteinen. Final erfolgte die Elution des
Zielproteins mit 2-3 cv Elutionspuffer, welcher 250 mM freies Imidazol beinhaltete. Alle
Aufreinigungsschritte wurden bei 4°C bzw. auf Eis durchgeführt. Die verwendeten Puffer und
Lösungen sind Tabelle 7 zu entnehmen.
III.2.3.3.2 GST-Aufreinigung
Das Prinzip der Aufreinigung von Proteinen die einen GST-Tag besitzen beruht auf der
hohen Affinität der mit dem Zielgen fusionierten Glutathion-S-Transferase (GST) aus
Schistosoma japonicum zu Glutathion (Smith & Johnson 1988).
Alle Aufreinigungsschritte wurden bei 4°C bzw. auf Eis durchgeführt. Zur Aufreinigung von
GST-getaggten Proteinen wurde eine Glutathion-Sepharose 4B Matrix (GE Healthcare, St
Gilles, UK) und Einweg-Polypropylensäulen (1 bzw 5 ml, Qiagen, Hilden, G) verwendet.
45
III Methoden
Zunächst wurde die Glutathion-Sepharose mit fünf Säulenvolumen (column volume, cv) PBS
äquilibriert. Die Menge verwendeter Matrix richtete sich nach der erwarteten Proteinmenge
(ca. 5 mg Protein/ 1 ml Ni-NTA-Matrix). Nach Bindung des im Rohextrakt aus 2.3.2
enthaltenen Proteins durch schwenkende Inkubation für 1 h bei 4°C, wurde die Matrix
zweimal mit fünf cv PBS gespült. Final erfolgte die Elution des Zielproteins mit 2-3 cv GSTElutionspuffer, welcher 30 mM reduziertes Glutathion beinhaltete. Die verwendeten Puffer
und Lösungen sind Tabelle 7 zu entnehmen.
III.2.3.3.3 Anionenaustauschchromatographie
Die Ionenaustauschchromatographie (Ion exchange chromatography, IEX) ist seit den
1960er Jahren eine etablierte Methode zur Trennung von Biomolekülen. Das Prinzip beruht
auf der Trennung von Partikeln aufgrund ihrer Netto-Oberflächen-Ladung. Jedes Protein hat
aufgrund seines unterschiedlichen Anteils an ionisierbarer Aminosäuren ein anderes pHLadungsverhältnis. Aufgrund dieser Eigenschaft und der daraus resultierenden
unterschiedlich starken Interaktion der Moleküle mit einer geladenen Matrix bei definiertem
pH, lassen sich Proteine mit dieser Methode sehr gut aufreinigen.
Für die Aufreinigung von YopM wurde das aus der Ni-NTA Aufreinigung (2.3.3.1) erhaltene
Protein gegen ein adäquates Volumen Anionenaustauschpuffer A über Nacht bei 4°C
dialysiert. Verwendet wurde eine UnoQ6-Säule der Firma Biorad (Berkeley, USA) mit einem
ÄKTA FPLC-System (GE Healthcare, St Gilles, UK). Bei dem Säulenmaterial handelt es sich
um einen starken Anionenaustauscher (-N+(CH3)3).
Zunächst wurde die Säule abwechselnd mit je fünf Säulenvolumen Puffer A und Puffer B
gespült, bevor mit fünf cv Puffer A äquilibriert wurde. Die Flussrate wurde über den
gesamten Lauf konstant auf 2 ml/min gehalten. Nach Applikation der Probe wurde mit fünf cv
Puffer A gespült um unspezifisch gebundene Proteine von der Säule abzuwaschen. Die
Elution erfolgte in zwei linearen Gradienten mit Anionenaustauschpuffer B, der 1 M NaCl
enthielt. Der erste Gradient (0-50 % Puffer B) lief über 15 Säulenvolumen, gefolgt von dem
zweiten Gradienten (50-100 % Puffer B) über sechs Säulenvolumen. Die Sammlung des
Eluats erfolgte in 2 ml Fraktionen während des ersten Gradienten. Anschließend wurde die
Säule mit fünf cv Puffer B gespült, bevor sie entweder erneut in Puffer A äquilibriert oder mit
je fünf cv ddH2O und 20 % Ethanol zur Lagerung bei 4°C gewaschen wurde.
III.2.3.3.4 Größenausschlusschromatographie
Bei der Größenausschlusschromatographie oder auch Gelfiltration genannten Methode
werden Moleküle nach ihrer Größe bzw. ihrem hydrodynamischen Volumen aufgetrennt,
während sie durch ein poröses Medium wandern, welches in einem definierten Volumen in
eine Säule gepackt ist. Der Trennungseffekt beruht hierbei auf den unterschiedlichen
Diffussionsvolumina verschieden großer Partikel. Die poröse Matrix erlaubt es kleineren
Partikeln einzudringen, was ihre Retentionszeit im Vergleich zu größeren Spezies verlängert.
Für analytische Gelfiltrationen wurde eine Superdex 200 10/300 GL, für präparative
Aufreinigung eine HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (beide GE Healthcare, St Giles UK)
verwendet. Zunächst wurde die entsprechende Säule mit zwei cv ddH2O gespült, bevor sie
mit weiteren zwei cv des Reinigungspuffers äquilibriert wurde. Welcher Puffer verwendet
wurde, richtete sich nach dem aufzureinigenden Protein. Dies ist Tabelle 7 zu entnehmen.
Vor der Aufreinigung eines gewünschten Proteins erfolgte ein Lauf mit einem geeigneten
Größenstandard (siehe Tabelle 3) und das Ausschlussvolumen der Säule wurde mittels
46
III Methoden
Blue-Dextran, welches eine molekulare Masse von 2000 kDa besitzt bestimmt. Zur
Größenbestimmung einer unbekannten Probe wurde das Verhältnis des Elutionsvolumens
der Probe (Ve) zum Ausschlussvolumen (Vo) der Säule mit den bekannten Markerproteinen
verglichen. Das applizierte Probenvolumen entsprach maximal 2 % des Säulenvolumens.
Die Flussraten lagen bei 0,4 ml/min (Superdex 200 10/300 GL) bzw. 1 ml/min (HiLoad
16/600 Superdex 200 pg)
Molekulargewicht [Da]
10 6
Thyroglobulin
-globulin
10 5
Ovalbumin
Myoglobin
10 4
Vitamin B 12
3
10
1.0
1.5
2.0
2.5
Ve /Vo
Abbildung 9: Kalibrierungsgerade Superdex 200 10/300 GL.
Die Abbildung zeigt die Eichgerade der Säule Superdex 200 10/300 GL, die sich aus Proteinen bekannten
-4,967x
Molekulargewichts ergibt. Mit der daraus resultierenden Formel: y = 3E+08e
lässt sich das Molekulargewicht
einer unbekannten Probe errechnen.
III.2.3.3.5 Aufreinigung der Tobacco Etch Virus-Protease
6x His-TEV-Protease (Tropea et al. 2009) wurde wie beschrieben überexprimiert (2.3.1), die
Zellen wurden sonifiziert (2.3.2) und das Protein wurde wie unter 2.3.3.1 und 2.3.3.4
beschrieben mittels Ni-NTA Aufreinigung und Gelfiltration aufgereinigt. Anschließend wurde
die Protease mit einem Vivaspin®- Zentrifugenfilter (GE-Healthcare Europe, München, G),
auf 2-5 mg/ml ankonzentriert und mittels flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung
des Enzyms erfolgte bei -80°C.
III.2.3.3.6 Proteinverdau mittels TEV
TEV-Protease wurde benutzt, um den His-Tag eines Proteins zu entfernen. Hierzu wurde
zwischen His-Tag und Protein die Erkennungssequenz ENLYFQG eingebracht. Die Protease
schneidet am Glutamin und hinterläßt ein nicht natives Glycin am Zielprotein. Das zu
schneidende Protein wurde gegen TEV-Reaktionspuffer (sieheTabelle 7) dialysiert und TEVProtease wurde in einem molaren Verhältnis von 1:100 hinzugefügt. Die Reaktion erfolgte
typischerweise bei 4°C über Nacht. Am nächsten Tag wurde das Proteingemisch mit einer
geeigneten Menge Ni-NTA-Sepharose für 30 min inkubiert, um ungeschnittenes Protein
sowie die Protease abzutrennen.
III.2.3.4 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen basiert auf dem Absorptionsmaximum der
aromatischen Aminosäuren (Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin) bei 280 nm. Der hierfür
benötigte spezifische Absorptionskoeffizient sowie das theoretische Molekulargewicht des
Zielproteins wurde mittels ProtParam (Gasteiger et al. 2005) bestimmt. Hierbei wurde die
47
III Methoden
Aminosäuresequenz des Zielproteins benötigt. Die Absorption der Proteinlösung wurde an
einem Nanodrop 1000 (Peqlab, Deutschland) bestimmt. Zur Messung wurden jeweils 2 µl
Probe eingesetzt. Zusammen mit dem Molaren Extinktionskoeffizienten (M-1cm-1) und dem
Molekulargewicht des Proteins kann auf der Grundlage des Lambert-Beer´schen-Gesetzes
die Konzentration der Proteinlösung bestimmt werden.
E = ελ*c*d
E: gemessene Extinktion
ελ: molarer Extinktionskoeffizient
c: Konzentration der Protein Lösung
d: Schichtdicke des durchstrahlten Körpers
III.2.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die SDS-PAGE ist eine schnelle, hochauflösende Methode zur Auftrennung von
Proteingemischen nach ihren Molekulargewichten (Laemmli 1970). Die meisten Proteine
binden das anionische Tensid SDS zu negativ geladenen SDS-Protein-Komplexen mit
konstantem Ladungs- zu Masse-Verhältnis (1,4 g SDS/g Protein in 1% SDS-Lösung). SDS
denaturiert dabei die Proteine – besonders nach Reduktion mit Mercaptoethanol und
unterbindet Protein-Protein Wechselwirkungen. Das Gel wirkt als Molekularsieb, welches die
Proteine aufgrund unterschiedlicher Größe unterschiedlich schnell passieren können. So
kommt es zu einer Auftrennung. Die Porengröße kann durch unterschiedliche Mengen an
Acrylamid und Bisacrylamid variiert werden.
In der SDS-Gelelektrophorese werden zwei Arten von Gelen kombiniert. Das Sammelgel mit
einem Tris-HCl Puffer System (pH 6,8) ist weitporig (4 %) und dient der Konzentration
der Probe. Glycinat-Ionen, die als Zwitterionen vorliegen (Gly+/-) dienen als Folge-Ionen,
Chlorid-Ionen dienen als Leit-Ionen, da sie schneller als die Glycinat-Ionen zum positiven Pol
wandern. Zwischen diesen beiden Ionenarten bewegen sich die Proteine und gelangen
gemeinsam an das Trenngel. Das Trenngel (Tris-HCl Puffer System pH 8,8) ist engporig
(7,5 % - 16 %) und trennt die Proteine auf. Beim pH-Sprung von Sammel- auf Trenngel
entstehen Glycinat-Anionen, die sich zu den Chlorid-Ionen orientieren und ebenfalls schnell
zur Anode laufen. Die Proteine können sich so nach ihrer Größe auftrennen. Die
Zusammensetzung der Gele ist Tabelle 10 zu entnehmen.
Zur Analyse von Proteinproben wurden diese mit SDS-PAGE Ladepuffer (Tabelle 9) versetzt
und bei 96°C für 10 min denaturiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden. Die
angelegte Spannung betrug 80 V während der Einlaufphase in das Sammelgel und 120150 V während der Trennungsphase.
III.2.3.6 Coomassie-Färbung von SDS-Gelen
Für die Sichtbarmachung und zur Fixierung der Proteine wurde das Sammelgel entfernt und
das Trenngel für 1 h in Coomassie Färbelösung schüttelnd inkubiert. Anschließend wurde
das Gel über Nacht, mindestens aber für 2 h in Coomassie Entfärbelösung entfärbt, bis der
Hintergrund klar und die Proteinbanden deutlich blau zu erkennen waren. Zur Dokumentation
wurde das Gel gescannt und mithilfe des Gel dryer 543 (BioRad, München, G) getrocknet.
Die Puffer sind Tabelle 9 zu entnehmen.
48
III Methoden
III.2.3.7 Western Blot
Beim Western Blot werden die Proteine eines nativen oder eines SDS-Gels elektrophoretisch
auf eine adsorbierende Membran aus Polyvinylidendifluorid (PVDF, Immobilon, Millipore,
Darmstadt, G) übertragen. Benutzt wurde die Halbtrockenzelle OWL HEP-1 (Thermo
Scientific, Rockford, USA).
Zunächst wurden drei Filterpapiere (190 g/m2, Hartenstein, Würzburg, G) in Transferpuffer
(Tabelle 9) getränkt und auf der Kathode platziert. Das SDS-Gel wurde mit ddH2O
abgewaschen und auf die Filterpapiere gelegt. Die PVDF-Membran wurde kurz in Methanol
geschwenkt und luftblasenfrei auf das Gel gebettet. Abgedeckt wurde dieses „Sandwich“
wiederum mit drei in Transferpuffer geschwenkten Filterpapieren. Die Kammer wurde
verschlossen und der Transfer der Proteine erfolgte mit 1.2 mA/cm2 for 1-1.5 h je nach
Größe der gewünschten Proteinbande. Vor der weiteren Reaktion des Blots mit HisProbe™HRP (Thermo Scientific, Rockford, USA) wurden die restlichen freien Proteinbindungsstellen
der Membran mit 25 mg BSA/ml in TBST für mindestens 1 h geblockt. Zur Bindung des
HisProbe™-HRP wurde eine 4 mg/ml Stammlösung 1:2500 in TBST verdünnt und der Blot
wurde damit für 1 h bei 4°C schüttelnd inkubiert. Nach vier-maligem Waschen mit jeweils
15 ml TBST wurde die Membran je nach Proteinmenge mit SuperSignal West Femto/ Pico
nach Herstellerangaben inkubiert. Die Detektion des emmitierten Lichts erfolgte mittels
Röntgenfilmen (Super RX, Fuji medical X-ray film, Fujifilm, Tokyo J), die in einem Curix 60,
(Agfa, Mortsel, B) entwickelt wurden.
III.2.3.8 Caspase-1 Assay
Die Cystein Protease Caspase-1 (Interleukin-1β converting enzyme, ICE) spaltet
proteolytisch Proenzyme, wie pro-Interleukin-1β, an der Erkennungssequenz YVAD
(Thornberry & Molineaux 1995). Zur Untersuchung eines postulierten inhibitorischen Effektes
von YopM auf Caspase-1 wurde ein colorimetrischer Assay durchgeführt. Hierzu wurde das
kommerzielle Peptid Ac-YVAD-pNA (Enzo Life Science, Farmingdale, USA) eingesetzt. Der
nach der Prozessierung eintretende Farbumschlag wurde photometrisch in einem Microplate
Reader (Infinite M200, TECAN, Männedorf, CH) bei 405 nm gemessen. Zu 10 bzw. 50 U
Caspase-1 (Enzo Life Science, Farmingdale, USA) in Caspase 1 Puffer (Tabelle 13) wurden
200 µM des Substrats gegeben und die Reaktion wurde für 60 min bei 37°C aufgezeichnet.
Zur Analyse der Inhibition von Caspase-1 wurden je 5 bzw. 50 µM YopM aus
Y. enterocolitica WA-314, Y. enterocolitica 8081 und Y. pseudotuberculosis YpIII
hinzugefügt. Als Kontrolle diente der kommerzielle Inhibitor Z-Val-Ala-DL-Aspfluoromethylketone (BACHEM, Bubendorf, CH).
III.2.3.8 GST-Pulldown
Zur Analyse der Interaktion von YopM und DDX3 diente der sogenannte GST-PulldownAssay. Hiezu wurde zunächt wie unter III.2.3.3.2 beschrieben GST-YopM sowie GST
aufgereinigt und über Nacht in PBS dialysiert. DDX3-Proteine, die einen 6x His-Tag
beinhalteten, wurden wie unter III.2.3.1 beschrieben exprimiert. Die aus 5 ml
Expressionskultur erhaltenen Bakterienpellets wurden in 1 ml MBP Column Buffer
resuspendiert und die Zellen wurden wie unter III.2.3.2 beschrieben aufgeschlossen. Die
Lysate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western Blot analysiert (III.2.3.5;
III.2.3.7). Mit Hilfe des HisProbe™-HRP (Thermo Scientific, Rockford, USA) Antikörpers
49
III Methoden
wurde die Qualität der Proteine überprüft und die einzusetzende Menge für den Versuch
bestimmt.
Bevor die GST-Fusionsproteine an die Glutathion-Matrix (Glutathione Sepharose 4B, GE
Healthcare, Uppsala, S) binden konnten, musste diese äquilibriert werden. Hierzu wurden je
75 µl Beads in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße überführt und 4x mit je 1 ml PBS
gewaschen. Zwischen den Waschschritten erfolgte jeweils ein Zentrifugationsschritt bei 4°C
und 500 x g für 3 min (5810R, Eppendorf, Hamburg, G) Anschließend wurden jeweils 40 µg
GST-YopM oder GST bei 4°C unter ständigem invertieren für 2 h an die Beads gebunden.
Nach vier weiteren Waschschritten mit PD-Bindepuffer, wie oben beschrieben, wurden die
Beads mit den vorher analysierten His-Lysaten über Nacht bei 4°C inkubiert.
Am nächsten morgen wurden die Beads viermal mit je 1 ml PD-Waschpuffer gewaschen und
in jeweils 40 µl SDS-PAGE Ladepuffer für 5 min aufgekocht. Die Proben wurden dann wie
unter III.2.3.5 und III.2.3.7 beschrieben analysiert. Die Zusammensetzung der eingesetzten
Puffer ist Tabelle 11 zu entnehmen.
III.2.3.9 Kd Bestimmung mittels Thermophorese (MST)
Das Prinzip der „Microscale Thermophoresis“ (MST) basiert auf der direkten Bewegung von
Biomolekülen entlang eines Temperaturgradienten, der Thermophorese genannt wird
(Wienken et al. 2010). Eine lokale Temperaturveränderung ΔT führt zu einer lokalen
Änderung der Konzentration (Erhöhung oder Erniedrigung) eines Biomoleküls welche durch
den Soret-Koeffizienten quantifiziert wird.
(
)
Die thermophoretischen Eigenschaften eines Moleküls beruhen hierbei auf dessen Größe,
Ladung sowie der Hydrathülle. Kleinste Änderungen eines dieser Parameter durch
Interaktionen mit anderen Biomolekülen können hierbei detektiert werden. Folgende Formel
beschreibt diesen Umstand:
ST =
ST :
A:

A
 2 eff
  Shyd T  
* DH 
kT 
4 0T

Soret-Koeffizient
Moleküloberfläche
 2 eff : effektive Ladung
Shyd : Hydrationsentropie der Molekül/Lösungsmitteloberfläche
DH : Debye Hueckel Länge
:
Dielektrische Konstante
Temperaturableitung
:
Die Messung der Thermophorese wurde in einem Monolith NT.115 der Firma Nanotemper
(München, G) in Standardkapillaren durchgeführt. Zunächst wurde das gewünschte Protein
mit einem Fluoreszenz-Tag markiert (Monolith™ NT.115 Protein Labeling Kit RED-NHS),
welcher die Detektion der Moleküle durch das Gerät erlaubte. Während der Messung wurde
mit Hilfe eines Lasers ein Hitze-Impuls von 30 sec appliziert und das
50
III Methoden
Thermophoreseverhalten der Probe wurde aufgezeichnet. Ein potentieller Bindungspartner
wurde in 16 Verdünnungen zum gelabelten Protein titriert und Änderungen des
Thermophoreseverhaltens wurden untersucht. Hierbei detektiert das MST-Signal eine
Bindung durch die Quantifizierung der Änderung der normalisierten Fluoreszenz (Amplitude
des MST Signals) Bezeichnet
den Anteil gelabelter Moleküle, die in einer Bindung
vorliegen, berechnet sich die Änderung der Fluoreszenz in Abhängigkeit der Konzentration
des Zielmoleküls wie folgt (Jerabek-Willemsen et al. 2011):
(
)
(
)
(
)
(
) der normalisierten Fluoreszenz ungebundener
Hierbei entspricht
(
) beschreibt die normalisierte Fluoreszenz der
gelabelter Moleküle,
Komplexe (gelabelte Moleküle gebunden an ihre Bindungspartner in Sättigung).
Unterschiede in diesen beiden Werten erlauben die Bestimmung der gebundenen Fraktion
und damit der Dissoziationskonstanten. In den Ergebnissen dieser Arbeit ist entweder
direkt geblottet oder nach Subtraktion der Basisfluoreszenz (
).
III.2.4 Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen
III.2.4.1 Dynamische Lichtstreuung (DLS)
Bei der dynamischen Lichtstreuung handelt es sich um eine Methode mit welcher der
hydrodynamische Radius eines Proteins und damit dessen Größe ermittelt werden kann.
Bei der DLS betrachtet man die Intensitätsänderung des von einer kolloidalen Lösung
emittierten Lichts als eine Funktion der Zeit. Hieraus lässt sich die Größenverteilung von
Proteinen bestimmen. Die Messungen wurden an einem SpectroSIZE 300 (Nabitec,
Deutschland) durchgeführt. Hiezu wurden ca. 15-20 µl Probe in eine Quarzküvette pipettiert
und die Pufferbedingungen wurden in der Gerätesoftware spezifiziert. Das Messintervall
betrug 20 x 20 Sekunden.
III.2.4.2 Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS)
Die Röntgenkleinwinkelstreuung (engl. small angle x-ray scattering, SAXS) ist wie die
Diffraktion an Kristallen eine Methode zur Strukturuntersuchung mit Hilfe von
Röntgenstrahlung. Im Gegensatz zur Kristallographie werden mit SAXS ungeordnete
Strukturen kolloidaler Größe untersucht, wie Proteine in flüssiger Lösung. Diesen Systemen
fehlt eine, für hochauflösende Strukturaufklärung notwendige, höhere Ordnung. Desweiteren
liegen die Partikel in Lösung unorientiert vor. Mit SAXS erhält man Informationen über
Größe, Gestalt und Dispersivität der untersuchten Materialien.
Zur SAXS-Messung wurde eine Probe standardmäßig in fünf verschiedenen
Konzentrationen zwischen 0,5 und 10 mg/ml in 15-60 µl Volumen eingesetzt. Die Proteine
wurden wie zuvor unter 2.3.3 beschrieben aufgereinigt und die Monodispersität der Probe
wurde mittels Gelfiltration und DLS (2.3.3.4 und 2.3.8) überprüft. Nur Proben, die zu mehr als
90 % monodispers waren, wurden untersucht. Vor der Messung wurde der Probe 2 mM DTT
zur Vermeidung von Strahlenschäden zugesetzt. Die Messungen wurden an Beamline P12
(EMBL, HASYLAB/DESY, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Der Abstand der Probe zum
Detektor [2D photon counting Pilatus 2M pixel X-ray detector (Dectris)] betrug 3,1 m. Die
Strahlung besaß eine Wellenlänge von 0,1-0,3 nm. Der Bereich der Impulsübertragung
51
III Methoden
0,01<s<0,6 Å-1 wurde abgedeckt (s = 4π sinθ/λ, wobei 2θ der Streuungswinkel war) Vor und
nach jeder Probe wurde der Probenpuffer gemessen und zur Skalierung der Probe anhand
ihrer Proteinkonzentration eingesetzt. Die initiale Datenprozessierung wurde mit dem
Programm Primus (Konarev et al. 2003) durchgeführt. Mit Hilfe der Guinier Annäherung
wurde I(0) und der Trägheitsradius Rg ermittelt. Dies ist möglich unter der Annahme, dass bei
sehr kleinen Winkeln (s<1,3/Rg) die Intensität I(s) = I(0) exp(-(sRg)2/3) beträgt. Für die
Bestimmung von Rg und DMAX aus den Streukurven sowie der paarweisen Verteilung p(r)
wurde die Software Gnom (Semenyuk & Svergun 1991) verwendet. Die Erstellung von ab
initio-Modellen erfolgte mittels der Programme Dammif (Franke & Svergun 2009) und
GASBOR (Svergun et al. 2001). Zur Analyse der Flexibilität von Proteinstrukturen wurde
EOM (Bernadó et al. 2007) verwendet.
Für den Vergleich der SAXS-Daten mit hochauflösenden Strukturen und Modellen wurde
CRYSOL (Svergun et al. 1995) und SASREF (Petoukhov & Svergun 2005) verwendet.
III.2.4.3 Kristallisation von Proteinen
Die Kristallisation von Proteinen ist ein Vorgang, bei dem Moleküle aus einer übersättigten
Lösung in einen festen Phasenzustand gebracht werden. Die Übersättigung einer
Proteinlösung wird in der Regel durch Hinzufügen eines Präzipitanten erreicht. Die
Konzentration des Präzipitanten wird hierbei möglichst langsam erhöht, entweder durch
Diffusion von Wasser aus der Lösung oder durch Diffusion von Präzipitans in die
Proteinlösung. Typischerweise werden als Präzipitanten Salze wie Ammoniumsulfat oder
Natriumcitrat, und organische Verbindungen wie Polyethylenglykole oder Alkohole
verwendet. Desweiteren können Faktoren wie Temperatur, pH-Wert sowie der Zusatz von
weiteren Salzen oder Detergenzien eine Rolle bei der Kristallisation spielen. Die am
häufigsten angewandte Methode zur langsamen Erhöhung der Konzentration von Protein
und Präzipitans stellt die sogenannte Dampfdiffusion dar. Hierbei wird noch einmal zwischen
der Methode des „hanging drop“, und der des „sitting drop“ unterschieden. Beim „hanging
drop“ wird die Proteinlösung auf ein Deckglas pipettiert, welches umgekehrt über eine mit
Reservoirlösung (konzentriertes Puffer/Präzipitans-Gemisch) gefüllte Vertiefung gelegt wird.
Beim sitting drop sitzt der Tropfen in einer Vertiefung über der Reservoirlösung. In beiden
Fällen wird der Tropfen zusammen mit der Reservoirlösung luftdicht verschlossen, sodass
eine Verdampfung der Proteinlösung aufgrund des Konzentrationsgefälles zur
Reservoirlösung stattfinden kann.
III.2.4.3.1 Probenvorbereitung und initiale Kristallisationsbedingungen
Die zur Kristallisation verwendeten Proteine wurden zunächst wie unter 2.3.3 beschrieben
aufgereinigt, der Affinitätstag wurde proteoytisch abgespalten (2.3.3.6) und mittels DLS
(2.4.1) und SDS-PAGE (2.3.5) auf ihre Reinheit und Dispersität hin überprüft. Zusätzlich
wurde evtl. vorhandenes Salz im Proteinpuffer mittels Dialyse entfernt. Die initialen
Kristallisations-Screens wurden im „sitting drop“-Verfahren durchgeführt. Hierzu wurden je
500 nl Proteinlösung (c: 10-15 mg/ml) unter Zuhilfenahme
eines Pipettierroboters
(Honeybee 961 Genomic solutions, UK) in spezielle 96-well-Platten (NeXtal QIA1 μplates 96
Well, Qiagen, Deutschland) pipettiert und 1:1 mit Präzipitantenlösung gemischt. In das
Reservoir der Platte wurden 55 µl pure Präzipitantenlösung pipettiert. Die Platten wurden
luftdicht verschlossen und bei 20°C oder 4°C gelagert. Verwendet wurden die kommerziellen
Kristallisationsscreens PACT premier™, Stura Footprint™, Morpheus (Molecular
52
III Methoden
Dimensions, UK) und Classic, Cryos, ComPAS, JCSG+ Suite, AmSO4 (Quiagen,
Deutschland). Ein mögliches Kristallwachstum wurde alle drei Tage mikroskopisch
untersucht.
III.2.4.3.2 Optimierung der Kristallisationsbedingungen
Wenn eine initiale Kristallisationsbedingung aus den in 2.4.3.1 beschriebenen Versuchen
gefunden wurde, wurde diese optimiert, indem die Präzipitanten oder die Salzkonzentration
variiert wurde. PEG Konzentrationen wurden hierbei meist in 1 % Schritten,
Salzkonzentrationen in 50 mM Schritten erhöht oder erniedrigt. Zusätzlich wurde in einigen
Fällen Glycerol zugesetzt um, die Kristalle vor Frostschäden durch flüssigen Stickstoff zu
schützen. Optimierungsansätze wurden zunächst ohne Veränderung der initial eingesetzten
Volumina in QIA1 μplates 96 Well (Qiagen, G) unter Zuhilfenahme des Pipettierroboters
(Honeybee 961 Genomic solutions, UK) pipettiert. Hierzu wurde dann zunächst ein 96-well
Masterblock angesetzt. Ließen sich die Bedingungen im 96-well Format reproduzieren,
wurde in MRC Maxi 48-Well Crystallization Plate (Molecular Dimensions, UK) oder in Linbro
24-well XRL Plate weiter optimiert. Hierbei wurden Proteintropfen mit bis zu 4 µl gleichem
Volumen an Präziptantenlösung vermischt und über einem Reservoir von 50 oder 500 µl
luftdicht verschlossen. Die Platten wurden anschließend bei 20°C oder 4°C inkubiert.
III.2.4.3.3 Überprüfung von Proteinkristallen
Um zwischen Protein- und Salzkristallen zu unterscheiden, wurden diese mikroskopisch
unter UV- Licht mit Hilfe des Systems XtaLight-100 UV-light source (Nabitec GmbH, G),
welches an ein CCD Mikroskop (Diversified Scientific Inc., Birmingham, USA) angeschlossen
war, untersucht. Hierbei zeigten Proteinkristalle aufgrund ihres Anteils an aromatischen
Aminosäuren Fluoreszenz bei Licht der Wellenlänge 300 nm.
III.2.4.3.4 Datensammlung unter Verwendung von Synchrotronstrahlung
Die Diffraktionsdaten wurden bei 100 K und einer Wellenlänge von 0,979570 unter
Verwendung eines PILATUS 6M Dektors an der MX2 Beamline (P14 EMBL Beamline
Macromolecular Crystallography II) des PETRA III Speicherrings (DESY, Hamburg, G)
gesammelt. Kristalle wurden mittels Nylon Loops unter Stickstoffdampf montiert, um
Strahlungsschäden gering zu halten. Kryoprotektion wurde erreicht, indem der montierte
Kristall in die entsprechende Reservoirlösung mit 20 % Glycerol getaucht wurde.
III.2.4.3.5 Datenprozessierung und Modellbau
Die gesammelten Daten wurden mit iMOSFLM (Battye et al. 2011) oder XDS (Kabsch 2010)
prozessiert. Die Skalierung der Daten fand mit SCALA (Evans 2006) statt. Für weitere
Datenanalysen und das Refinement wurde ccp4 (Winn et al. 2011) verwendet. Die finale
Modell-Bildung wurde mit Coot (Emsley et al. 2010) durchgeführt.
53
IV Ergebnisse
IV Ergebnisse
IV.1 Strukturaufklärung von YopM
IV.1.1
Klonierung,
Expression
und
Aufreinigung
von
YopM
aus
Y. enterocolitica WA-314
Der annotierte „open reading frame“ (ORF) von YopM wurde, wie unter III.2.2.3 beschrieben,
aus dem Virulenzplasmid pYV-WA314 (Accession number: FR687019) amplifiziert und in
den Vektor pET303 kloniert. Anschließend wurde 6x CT-His-YopM in E. coli BL21-AI
überexprimiert (III.2.3.1) und mittels Immobilisierter Metallaffinitätschromatographie
aufgereinigt (III.2.3.3.1).
Abbildung 10: Ni-NTA Aufreinigung von 6x CT-His YopM.
SDS-PAGE der Aufreinigung von YopM. Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt. M: Größenstandard,
Molekulargewicht in kDa; 1-6 Protein eluiert mit His-Elutionspuffer, Fraktion 1-6.
Das kalkulierte Molekulargewicht von YopM betrug 60 kDa. 6x CT-His-YopM konnte mit
einer Ausbeute von ca. 10 mg pro Liter E.coli BL21-AI Kultur exprimiert und mittels Ni-NTA
Agarose aufgereinigt werden. Wie Abbildung 10 zeigt, war die Reinheit des erhaltenen
Proteins jedoch nicht ausreichend für weitere Analysen, weswegen eine
Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wurde.
Zunächst wurde hierfür das aus der Ni-NTA Aufreinigung erhaltene Eluat gegen ein
tausendfaches Volumen Anionenaustauscher Puffer A (Tabelle 7) dialysiert. Die Analyse
mittels ProtParam (Gasteiger et al. 2005) ergab für YopM einen isoelektrischen Punkt (pI)
von 4,43. Aufgrund dieser Vorhersage wurde eine Anionenaustauschchromatographie bei
einem pH-Wert von 6,0 durchgeführt. YopM sollte also mit einer negativen Nettoladung
vorliegen und an die UnoQ1-Säule binden, während der Großteil der Kontaminanten mit
neutralem oder basischem pI sich im Durchfluss wiederfinden sollte. Die Aufreinigung wurde
wie unter III.2.3.3.3 durchgeführt und das Ergebnis wurde mittels SDS-PAGE untersucht.
54
IV Ergebnisse
A
B
300
80
60
200
40
100
% Puffer B
Absorption 280 nm [mAu]
100
20
0
123456
0
10
20
0
30
40
Zeit [min]
Abbildung 11: Ionenaustauschchromatographie von YopM.
A: Chromatogramm der Ionenaustauschchromatographie von 6x CT-His-YopM mittels UnoQ1 Säule (Biorad,
Berkeley, USA. B: SDS-PAGE der Elutionsfraktionen 1-6 aus A; M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa.
Abbildung 11 zeigt das Ergebnis der Anionenaustauschchromatographie von YopM. YopM
beginnt bei einer Konzentration von 35 % Anionenaustauscher Puffer B zu eluieren. Ein
deutlicher Peak ist im Chromatogramm zu erkennen. Abbildung 4 B zeigt die Analyse der
Peakfraktionen 1-6 mittels SDS-PAGE. Durch die Chromatographie konnte ein deutlicher
Reinigungserfolg im Vergleich zur Ni-NTA Aufreinigung (Abbildung 10) erzielt werden. Es
zeigte sich, dass weiterhin eine Proteinbande bei ca. 25 kDa als Kontamination verblieb,
weswegen als finaler
Aufreinigungsschritt eine Größenausschlusschromatographie
durchgeführt wurde. Hierzu wurde eine Superdex 200 10/30 Säule verwendet, da diese über
das benötigte Auflösungsvermögen verfügen sollte.
A
B
Absorption 280nm [mAu]
20
15
10
5
1 2 3 4
0
0
5
10
15
Elutionsvolumen Ve [ml]
20
Abbildung 12: Größenausschlusschromatographie von YopM.
A: Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie von YopM mittels Superdex 200. SDS-PAGE der
Elutionsfraktionen 1-4 aus A; M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa.
Abbildung 12 zeigt das Resultat der Größenausschlusschromatographie von YopM. Die
Reinheit des Proteins konnte noch einmal erhöht werden, indem die Kontaminante bei 25
kDa nahezu vollständig abgetrennt wurde. YopM lag nun prinzipiell in ausreichender Reinheit
für röntgenkristallographische Untersuchungen vor. Die SDS-PAGE-Analysen aus
Abbildungen 3-5 zeigten jedoch, dass YopM als Doppelbande im Gel lief. Das
Vorhandensein verschiedener Spezies eines Proteins ist für Kristallisationsexperimente
55
IV Ergebnisse
äußerst nachteilig. Dieser Umstand führte dazu, dass der annotierte Translationsstart von
YopM aus Y. enterocolitica WA-314 eingehender untersucht wurde.
IV.1.2 Überprüfung des Translationsstarts von YopM aus Y. enterocolitica
WA-314
Da YopM in verschiedenen Yersinia-Stämmen in unterschiedlicher Form vorkommt, wurden
zunächst die Aminosäuresequenzen ausgewählter Proteine aus der Datenbank „uniprot“
(www.uniprot.org) verglichen. Anschließend erfolgte eine detailliertere Analyse der N-Termini
von YopM aus Y.enterocolitica WA-314 und dem nahe verwandten Stamm Y. enterocolitica
W22703 (Fuchs et al. 2011).
A
B
C
Abbildung 13: Sequenzvergleich ausgewählter YopM-Proteine.
Ausgewählte YopM Sequenzen wurden mit Hilfe der Software „CLC Workbench“ (CLC Bio, Qiagen, Venlo, NL)
alignt. A: Aminosäurevergleich der ersten 40 Aminosäuren unterschiedlicher YopM-Isoformen aus „uniprot“. B:
Vergleich der ersten 40 Aminosäuren von YopM aus Y. enterocolitica WA-314 und Y. enterocolitica W22703 laut
Annotation (Accession number pYV-WA-314: FR687019; pYVe227: AF102990) C: Vergleich des annotierten NTerminus von YopM (WA-314) mit dem um 21 Aminosäuren upstream verlängerten N-Terminus von YopM
(W22703).
Der Sequenzvergleich verschiedener YopM-Isoformen zeigt, dass die N-Termini hoch
konserviert sind. Abbildung 6 A zeigt, dass einige Proteine einen um 21 Aminosäuren
verlängerten N-Terminus besitzen. Abbildung 6 B zeigt, dass YopM aus Y. enterocolitica
WA-314 diesen verlängerten N-Terminus aufweist. Der direkte Vergleich mit YopM aus
Stamm 22703 verdeutlicht dies. Ein Blick upstream des annotierten Translationsstart von
YopM_22703 offenbarte ein weiteres ATG, 21 Codons entfernt. Verlegte man nun den
Translationsstart um diese 21 Codons upstream, führte dies zu einer nahezu identischen
Sequenz wie der von YopM_WA-314. Aufgrund dieser Ungereimtheiten in den Annotationen
verschiedener YopM-Isoformen wurde beschlossen den tatsächlichen N-Terminus von YopM
aus Y. enterocolitica WA-314 experimentell zu untersuchen.
56
IV Ergebnisse
Hierzu wurde ein Yop Release-Assay wie unter III.2.1.2 durchgeführt. Die erhaltenen Yops
wurden mit Trichloressigsäure präzipitiert und mittels Western Blot auf eine PVDF-Membran
übertragen (Abbildung 14). Die YopM-Bande wurde mittels Immunserum gegen YopM
identifiziert, ausgeschnitten und mittels Edman-Abbaus analysiert. Das Ergebnis dieser Nterminalen Sequenzierung zeigte für die ersten fünf Aminosäuren: Met-Phe-Ile-Asn-Pro. Aus
dieser Erkenntnis heraus wurde YopM ab dem zweiten Startcodon neu amplifiziert und wie
beschrieben kloniert.
A
B
M 1
2
M
1
2
130 –
70 –
55 –
40 –
35 –
25 –
100 –
70 –
55 –
40 –
15 –
Abbildung 14: Experimentelle Analyse des Translationsstarts von YopM.
A: Ergebnis des Yop Release-Assays. M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa; 1: Analyse der freigesetzten
Yops mittels SDS PAGE; 2: Western Blot-Analyse mittels YopM Antiserum. B: Heterologe Expression von YopM
in BL21 dargestellt mittels SDS-PAGE. M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa. 1: 6x CT-His-YopM mit
annotiertem Startcodon; 2: 6x CT-His-YopM mit ermitteltem zweitem Startcodon.
Die Testexpression des neu klonierten yopM-Gens mit dem ermittelten zweiten Startcodon
zeigte, dass YopM in der SDS-PAGE nicht mehr als Doppelbande vorlag (Abbildung 14 B).
Hieraus ergibt sich die in Abbildung 15 dargestellte korrekte Sequenz von YopM.
Abbildung 15: Annotierte Aminosäuresequenz von YopM
Aminosäuresequenz von YopM aus Y. enterocolitica WA-314. N-Alpha: N-terminale alpha-Helices; LRR1-20:
„Leucine Rich Repeats“; C-Cap: C-terminales Abschlussmotiv der LRRs; C-Terminus: unstrukturierter CTerminus
Zur weiteren Untersuchung von YopM wurden im Wesentlichen drei Konstrukte verwendet:
YopM_Full, welches das Volllängenprotein von Aminosäure 1-506 enthielt, YopM_ΔC,
57
IV Ergebnisse
Aminosäure 1-481 und YopM_Core, Aminosäure 34-481. Eine komplette Übersicht aller
Konstrukte findet sich in Tabelle 18.
IV.1.3 Analytische Größenbestimmung und Dispersitätskontrolle von YopM
Nach der Aufreinigung der Proteine wie unter IV.1.1 beschrieben wurde zunächst eine
analytische Größenausschlusschromatographie durchgeführt. Diese erlaubt die Bestimmung
der Dispersität der Lösung sowie der Größe der vorhandenen Protein-Spezies. Die
Größenausschlusschromatographie wurde wie unter III.2.3.3.4 beschrieben durchgeführt.
Verwendet wurde die Säule Superdex 200 10/300 GL.
Abbildung 16: Analytische Größenausschlusschromatographie von YopM.
A: Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie dreier verschiedener YopM-Konstrukte. YopM_1-506
eluiert bei einem Volumen von 12,93 ml, YopM_1-481 bei 13,12 ml und YopM_34-481 bei 13,44 ml. Die graue
Linie zeigt den Lauf des „Biorad Gel Filtration Standards“. B: SDS-PAGE der jeweiligen Elutionsfraktionen 1-5
aus A; oberes Gel: YopM_1-506, mittleres Gel YopM_1-481, unteres Gel: YopM_34-481. M: Größenstandard,
Molekulargewicht in kDa. C: Blot der normalisierten Elutionsvolumina Ve/Vo gegen das Molekulargewicht in
Dalton. Die Eichgerade entstand aus dem Fit der Elutionsvolumina der Größenmarker Thyroglobulin (670 kDa),
γ-globulin (158 kDa), Ovalbumin (44 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B 12 (1,35 kDa).
Abbildung 16 zeigt das Ergebnis der analytischen Gelfiltration von drei verschiedenen YopMKonstrukten. Alle getesteten Konstrukte eluieren in einem Einzelpeak, d.h. es liegt jeweils
nur eine Spezies des Proteins vor. Die Lösung ist monodispers. Desweiteren eluieren die
Proteine ihrer Größe nach, in der Reihenfolge ihrer vorhergesagten Molekulargewichte
(Abbildung 16 A). Laut ProtParam (Gasteiger et al. 2005) lauten diese für YopM_1-506
(YopM_Full): 57,8 kDa, für YopM_1-481: 54,9 kDa und für YopM_34-481 (YopM_Core): 50,3
kDa. In der denaturierenden SDS-PAGE in Abbildung 16 B sind die Elutionsfraktionen
aufgetragen. Hier bestätigten sich die vorhergesagten Molekulargewichte der Konstrukte. Die
Auswertung der tatsächlichen Größe der Proteine, unter Zuhilfenahme der aus der
Eichgeraden in Abbildung 16 C erhaltenen Gleichung, ergibt jedoch ein anderes Bild. Die,
anhand der Elutionsvolumina errechneten Molekulargewichte der Proteine lauten: YopM_158
IV Ergebnisse
506: 119,1 kDa, YopM_1-481: 106,4 kDa, YopM_34-481: 88,1 kDa. Die errechneten Größen
deuten darauf hin, dass alle Konstrukte als Dimere vorlagen.
Als weitere Qualitätskontrolle wurden YopM_Full sowie YopM_Core mittels dynamischer
Lichtstreuung (DLS) wie unter III.2.4.1 beschrieben untersucht.
A
B
Abbildung 17: Dynamische Lichtstreuung von YopM.
Heatmap der Größenverteilung der hydrodynamischen Radii von A: YopM_Full und B: YopM_Core über einen
Zeitraum von 80 Sekunden.
Aus den in Abbildung 17 dargestellten Messungen der dynamischen Lichtstreuung geht
hervor, dass sowohl YopM_Full als auch YopM_Core monodispers vorlagen. Der ermittelte
hydrodynamische Radius für YopM_Full lag bei 4,4 ± 0,17 nm und für YopM_Core bei 4,2 ±
0,29 nm. Die daraus resultierenden Molekulargewichte ergeben 98,69 kDa für YopM_Full
und 88,89 kDa für YopM_Core. Ein weiterer Hinweis für das ausschließliche Vorhandensein
von Dimeren.
IV.1.4 Strukturanalyse von YopM
IV.1.4.1 Kristallisation von YopM
6x CT-His-YopM_Full (Tabelle 18) wurde wie zuvor beschrieben aufgereinigt, mittels
Vivaspin® Zentrifugenfilter (GE Healthcare Europe, München, G) mit einem MWCOs von
10 000 kDa auf 10,5 mg/ml ankonzentriert und gegen ein tausendfaches Volumen 50 mM
Hepes-Puffer mit einem pH von 7,5 dialysiert. Für die Suche nach initialen
Kristallisationsbedingungen wurden die kommerziellen Screens PACT premier™, Stura
Footprint™, Morpheus (Molecular Dimensions, UK) und Classic, ComPAS, JCSG+ Suite,
AmSO4 (Quiagen, Deutschland) verwendet. 500 nl der Proteinlösung wurden wie in
III.2.4.3.1 beschrieben unter Zuhilfenahme eines Pipettierroboters (Honeybee 961 Genomic
solutions, UK) in spezielle 96-Well Platten (NeXtal QIA1 μplates 96 Well, Qiagen,
Deutschland) pipettiert und 1:1 mit Präzipitantenlösung gemischt. Die Platten wurden bei
Raumtemperatur inkubiert und alle drei Tage mikroskopisch untersucht. Nach drei Wochen
Inkubation zeigten sich lediglich bei einer Bedingung Kristalle (PACT B12: 0,1 M MES, 0,01
M ZnCl2, 20% w/v PEG 6000 pH6). Diese Kristalle waren lange, dünne Nadeln und konnten
nicht in einem größeren Maßstab reproduziert werden.
59
IV Ergebnisse
Abbildung 18: Kristalle von YopM_Full.
Kristalle des Volllängenproteins YopM mit 6x C-terminalem His-Tag. Gewachsen nach drei Wochen bei einer
Tropfengröße von 500 nl Proteinlösung (c: 10,5 mg/ml) gemischt mit 500 nl Präzipitantenlösung (0,1 M MES,
0,01 M ZnCl2, 20% w/v PEG 6000 pH 6) im „sitting drop“-Verfahren über einem Reservoir aus 50 µl purer
Präzipitantenlösung.
Da der Versuch YopM in Volllänge zu kristallisieren wenig Erfolg brachte wurde YopM_Core
für weitere Kristallisationsansätze verwendet. Bei YopM_Core handelt es sich um eine
trunkierte Version von YopM der 33 Aminosäuren N-terminal und 23 Aminosäuren C-terminal
fehlen. Diese Aminosäuren zeigten in der Kristallstruktur von YopM aus Y. pestis 195/P
(Evdokimov et al. 2001) keine Elektronendichte, was ein klarer Hinweis dafür ist, dass diese
ungeordnet sind und somit die Kristallisation an sich stören könnten.
6xNT-His-TEV-YopM_Core (Tabelle 18) wurde analog zum Volllängenkonstrukt wie unter
IV.1.1 beschrieben kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Anschließend wurde der His-Tag wie
unter III.2.3.3.6 entfernt. Die Konzentration der Proteinlösung wurde mittels Vivaspin®
Zentrifugenfilter (GE Healthcare Europe, München, G) mit einem MWCOs von 10000 kDa
auf 10,5 mg/ml eingestellt und mittels Dialyse gegen ein tausendfaches Volumen 50 mM
Hepes-Puffer mit einem pH von 7,5 entsalzt.
Für die Suche nach initialen Kristallisationsbedingungen wurden die kommerziellen Screens
PACT premier™, Stura Footprint™, Morpheus (Molecular Dimensions, UK) und Classic,
ComPAS, JCSG+ Suite (Quiagen, Deutschland) verwendet. 500 nl der Proteinlösung wurden
wie in III.2.4.3.1 beschrieben unter Zuhilfenahme eines Pipettierroboters (Honeybee 961
Genomic solutions, UK) in spezielle 96-Well Platten (NeXtal QIA1 μplates 96 Well, Qiagen,
Deutschland) pipettiert und 1:1 mit Präzipitantenlösung gemischt. Bereits nach drei Tagen
Inkubation bei Raumtemperatur fanden sich unter verschiedenen Bedingungen Kristalle.
60
IV Ergebnisse
Abbildung 19: Initiale Kristallisationsscreens von YopM_Core.
Kristalle des trunkierten YopM_Core ohne His-Tag. Gewachsen nach drei Tagen, bei einer Tropfengröße von
500 nl Proteinlösung (c: 10,5 mg/ml) gemischt mit 500 nl Präzipitantenlösung. A: PACT premier™ B7 (0,1 M
MES, pH 6,0, 0,2 M Natriumchlorid, 20 % w/v PEG 6000). B: PACT premier™ C4 (0,1 M PCTP Puffer pH 7,0,
25 % w/v PEG 1500. C: PACT premier™ F11 (0,1 M Bis Tris Propan pH 6,5, 0,2 M Natriumcitrat, 20 % w/v
PEG 3350). D: PACT premier™ F12 (0,1 M Bis Tris Propan pH 6,5, 0,2 M Natriummalonat, 20 % w/v PEG 3350)
E: Morpheus A8 (0,1 M Natrium-Hepes/MOPS pH 7,5, 0,06 M MgCl2/CaCl2, MPD_P1K_PEG 3350 37,5% w/v)
F: ComPas B1(0,1 M MES pH 6,5, 0,2 M Ammoniumsulfat, 22 % w/v PEG 8000).
Die initialen Kristallisationsbedingungen, wie in Abbildung 19 dargestellt, wurden reproduziert
und optimiert, indem zunächst die Puffer-Art und Konzentration beibehalten, die Salz- und
die Präzipitantenkonzentration jedoch variiert wurde (siehe III.2.4.3.2). Diese ersten Ansätze
wurden zunächst in QIA1 µplates 96 well (Qiagen, G) ohne Veränderung der ursprünglichen
Volumina durchgeführt. Die erfolgreichsten Bedingungen wurden dann im 48- bzw. 24-wellFormat weiter optimiert. Hierbei wurden die Volumina der Proteintropfen auf 2 µl erhöht um
das Wachstum ausreichend großer Protein-Einkristalle zu fördern. Da für die
Datensammlung mittels Synchrotron-Strahlung eine spätere Behandlung mit flüssigem
Stickstoff notwendig war, wurde einigen Optimierungsansätzen zum Schutz vor möglichen
Frostschäden Glycerol zugesetzt. Durch die auf diese Weise durchgeführte Optimierung der
Bedingung PACT premier™ F11 (Abbildung 19 C) konnten Protein-Einkristalle mit einer
Größe von bis zu 1 x 0,4 x 0,02 mm Größe (Abbildung 20 B) hergestellt werden, welche für
die Röntgenstrukturanalyse geeignet waren.
61
IV Ergebnisse
Abbildung 20: Optimierungsansätze für YopM_Core.
Kristalle aus den Optimierungsscreens für YopM_Core. A: 50 mM BisTrisPropane pH 6,5, 0,2 M Na-Citrat, 24 %
PEG3350; 1+1 µl Tropfen (Proteinlösung/Präzipitans), 50 µl Reservoir (Maxi Plate, 48-well) B: 50 mM
BisTrisPropane pH 6,5, 0,2 M Na-Citrat,
24 % PEG3350, 15 % Glycerol; 2+2 µl Tropfen
(Proteinlösung/Präzipitans) 500 µl Reservoir (Linbro Plate, 24-well)
IV.1.4.2 Röntgenbeugung, Datensammlung und Analyse
Vor der Exposition der aus IV.1.4.1 erhaltenen Proteinkristalle mit Röntgenstrahlung wurden
diese in eine Kryoschutz-Lösung (Präzipitantenlösung mit 20 % v/v Glycerol) überführt und in
flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die in 15 % Glycerol gewachsenen Kristalle konnten
direkt schockgefroren werden. Diffraktionsdaten wurden bis zu einer Auflösung von 3,2 Å am
Messplatz P14 (EMBL Beamline Macromolecular Crystallography II) des PETRA III
Speicherrings (DESY, Hamburg, G) gesammelt. Die Statistiken der Datensammlung und des
Refinements sind in Tabelle 25 zusammengefasst.
Tabelle 25: YopM_Core: Datensammlung und Refinement
Datensammlung
Beamline
Wellenlänge [Å]
Temperatur [K]
Raumgruppe
Einheitszellparameter: a, b, c [Å]
Einheitszellparameter: α, β, γ [°]
Auflösungsbereich [Å]
Symmetrieunabhängige Reflektionen
Rsymm
Vollständigkeit der Daten [%]
Multiplizität der Daten
< I / σ(I) >
B-Faktor (Wilson Plot) [Å2]
Matthews Koeffizient (VM) [Å3/Da]
Lösungsmittelanteil
Verfeinerung
Auflösungsbereich
Rwork / Rfree [%]
P14 Beamline Macromolecular Crystallography II
EMBL /PETRA III
0.979570
100
C2
210.9, 126.3, 139.9
90, 118.3, 90
40 – 3.2
64045
9.1 (50.5)
99.6 (99.3)
6.6 (5.9)
11.9 (3.3)
95.3
4.0
69.8
40 – 3.2 (3.283 – 3.2)
19.8 / 21.5 (32.6/32.7)
62
IV Ergebnisse
Inhalt der asymmetrischen Einheit:
Gesamtzahl an Atomen
Wassermoleküle
RMS Bindungslängen-Abweichung [Å]
RMS Bindungswinkel-Abweichung [°]
Ramachandran-Plot- Analyse
Favorisierte Regionen [%]
Erlaubte Regionen [%]
Großzügig erlaubte Regionen [%]
14226
59
0.006
1.206
74.4
25.6
0
a
Werte in Klammern gelten für die höchste Auflösungsschale
Auf Grundlage der bekannten Struktur von YopM aus Y. pestis 195/P (Evdokimov et al.
2001) mit der pdb-Nummer 1jl5 konnte ein Modell erstellt werden, mit dessen Hilfe es
möglich war, die Struktur von YopM_WA-314 durch molekularen Ersatz zu lösen. Der
Modellbau und die Verfeinerung erfolgten mit Coot (Emsley et al. 2010) und Refmac5 (Winn
et al. 2011) bis zu einem finalen R-Faktor von 19,8 % und einem freien R-Faktor von 21,5 %.
Das finale Modell wurde mit der Nummer 4OW2 in der pdb-Datenbank hinterlegt. Die
geometrische Analyse der Phi- und Psi- Winkel ist in Abbildung 21 dargestellt.
Die 3,2 Å Struktur von YopM_WA-314 zeigt vier Moleküle, die in der asymmetrischen Einheit
ein Tetramer mit einer Gesamtfläche von 77.112 Å2 [Kalkuliert mit AREAIMOL (Krissinel
2012)] bilden (Abbildung 22).
Abbildung 21: Ramachandran-Plot für YopM.
Darstellung der Psi- und Phi-Winkel-Verteilung aller Aminosäuren der Struktur von YopM_WA-314 (PDB Nr.:
4OW2). Reste in favorisierten Regionen: 1158 (74,4 %); Reste in erlaubten Regionen: 398 (25,6 %); Anzahl an
Aminosäuren außer Glycin und Prolin: 1556; Anzahl an Glycinen: 24; Anzahl an Prolinen 204; Gesamtzahl an
Aminosäuren: 1792. Erstellt mit Procheck (Laskowski et al. 1993).
63
IV Ergebnisse
Abbildung 22: YopM-Moleküle in der Einheitszelle.
Tetramere Struktur von YopM_WA-314 in der asymmetrischen Einheit in Ribbon-Darstellung. Das Tetramer
besteht aus vier identischen Monomeren (Ketten A-D), angezeigt in unterschiedlichen Farben. Dargestellt mit
USCF Chimera (Pettersen et al. 2004).
In der asymmetrischen Einheit interagiert jedes YopM-Monomer über verschiedene
Wechselwirkungen mit drei anderen Molekülen. Die Analyse der Kontaktfläche der vier
Ketten mittels PDBsum (Laskowski et al. 1997) ist in Tabelle 26 dargestellt. Die wichtigsten
Interaktionsflächen liegen hierbei zwischen den Ketten A-B bzw. den Ketten A-C und B-D.
Tabelle 26: Intermolekulare Wechselwirkungen des YopM-Tetramers
Ketten
Beteiligte Reste
A–B
A–C
B–D
A–D
B–C
C–D
19 : 17
20 : 20
20 : 21
2:3
3:3
2:2
Interaktionsfläche
[Å2]
1124
1016
1022
122
126
152
H-Brücken
4
13
10
1
-
Nichtkovalente
Bindungen
69
104
80
6
16
5
Das YopM-Monomer besteht aus zwei N-terminalen Helices gefolgt von einer repetitiven
Struktur aus β-Faltblättern, die über elongierte Loops miteinander verknüpft sind. Diese
bilden insgesamt 20 Leucin-reiche Wiederholungen (Leucine Rich Repeats, LRR).
Abgeschlossen wird die Struktur durch eine weitere Faltblattstruktur, die das sogenannte Cterminale „Capping“ Motiv bildet.
64
IV Ergebnisse
A
B
Abbildung 23: Struktur und Topologie des YopM-Monomers.
A: Aufbau des YopM-Monomers aus zwei Alpha Helices (orange) gefolgt von 21 β-Faltblättern (lila), die die LRRRegion bilden und abschließen. Stabilisierende H-Brücken sind in hellblau gezeigt. Dargestellt mit USCF Chimera
(Pettersen et al. 2004) B: Topologische Darstellung des YopM-Monomers. Rote Zylinder stellen α-Helices dar,
Pfeile zeigen β-Faltblatt-Strukturen. Zahlen indizieren erste und letzte Aminosäure des Motivs.
IV.1.4.3 Struktur von YopM in Lösung
Da die aus IV.1.3 erhaltenen Ergebnisse daraufhin deuteten, dass YopM in Lösung als
Dimer vorliegt und in der Kristallstruktur (Abschnitt IV.1.4.2) ein Tetramer in der
asymmetrischen Einheit gefunden wurde, sollte nun mittels Röntgenkleinwinkelstreuung die
Struktur von YopM in Lösung untersucht werden.
Hierzu wurde YopM wie zuvor beschrieben aufgereinigt. Die Probe wurde bei 20.000 g und
4°C für eine Stunde zentrifugiert (5810R, Eppendorf, G) und mit Hilfe eines 100 nm
Zentrifugenfilters (Ultrafree-MC, Millipore, USA) von größeren Partikeln befreit.
Anschließend wurden fünf verschiedene Konzentrationen (0,7; 1,4; 2,6; 5,5 und 10,5 mg/ml)
eingestellt, die mittels DLS auf Monodispersität überprüft wurden.
Die Proben wurden anschließend an Beamline P12 (EMBL, HASYLAB/DESY, Hamburg, G)
vermessen. Die erhaltenen Daten wurden auf Strahlenschäden kontrolliert und mit dem
Programm Primus (Konarev et al. 2003) der Proteinkonzentrationen entsprechend skaliert.
Die Messkurven der Proben wurden durch Subtraktion der Streukurven der reinen
Pufferlösungen normalisiert. Das Programm GNOM (Semenyuk & Svergun 1991) lieferte den
Trägheitsradius Rg, sowie den maximalen Durchmesser Dmax, welche Aufschluss auf die
Größe der Moleküle gaben. Die Ergebnisse der Größenbestimmungen sind in Tabelle 27
zusammengefasst.
65
IV Ergebnisse
Tabelle 27: Ergebnisse der SAXS Messung von YopM_Core
Konzentration
[mg/ml]
0,7
1,4
2,6
5,5
10,4
Rg
[nm]
3,8 ± 0,3
3,9 ± 0,2
3,9 ± 0,2
3,8 ± 0,1
3,7 ± 0,1
Dmax
[nm]
12
13
12
11
10
VPorod
[nm3]
177
170
154
147
144
MW I(0)
[kDa]
79
78
79
80
76
MWPorod
[kDa]
110
106
96
92
90
Die errechneten Molekulargewichte aus der „Vorwärtsstreuung“ (~78 kDa) und dem Porod
Volumen (~99 kDa) legen, bei einem theoretischen Molekulargewicht von 50,3 kDa nahe,
dass es sich bei YopM_Core in Lösung um ein Dimer handelt. Diese Annahme wird durch
die bereits unter IV.1.3 gewonnenen Ergebnisse bekräftigt.
Mit Hilfe der Programme DAMMIF (Franke & Svergun 2009) und SASREF (Petoukhov &
Svergun 2005) wurden „ab initio“-beziehungsweise „rigid body“-Modelle anhand der SAXSDaten erstellt. Das Programm CRYSOL (Svergun et al. 1995) diente dem Vergleich der
Messdaten mit der theoretischen Streukurve der hochauflösenden Kristallstruktur.
Abbildung 24: SASREF-Modell von YopM_Core.
A: Strukturüberlagerung des mit Hilfe von SASREF erhaltenen Modells von YopM_Core (blau) mit dem aus den
Ketten A und C der 3,2 Å Kristallstruktur resultierenden Dimer (rot). Dargestellt in Ribbon-Repräsentation mit dem
Programm PyMol (Schrödinger LLC, USA) B: Vergleich der theoretischen Streukurven des SASREF-Modells
(blau) sowie des Dimers aus der Kristallstruktur (rot) mit der tatsächlichen Messkurve (grün). Dargestellt mit
SASPLOT (Petoukhov et al. 2012).
Das mit Hilfe von SASREF erstellte Dimer-Modell ähnelt sehr deutlich dem tatsächlich in der
asymmetrischen Einheit der Kristallstruktur vorkommenden Dimer, gebildet aus den Ketten A
und C beziehungsweise B und D (RMSD der Cα-Atome: 0,95 Å). Die mittels Superpose
(Winn et al. 2011) kalkulierte RMSD der Cα-Atome des SASREF-Modells und der Ketten A_C
der Kristallstruktur beträgt 3,1 Å. Das Modell wirkt weniger gedrängt, was eventuell ein Indiz
für einen Effekt der Packung der Moleküle in der Kristallstruktur sein könnte.
66
IV Ergebnisse
Abbildung 25: Fit des YopM-Monomers mit den SAXS-Messdaten.
Theoretische Streukurve des YopM-Monomers (rot) geplottet gegen die tatsächlichen Messwerte (grün).
Dargestelt mit SASPLOT (Petoukhov et al. 2012).
Um auszuschließen, dass es sich bei YopM_Core in Lösung um ein Monomer handeln
könnte, wurde auch dieses mit CRYSOL untersucht. Der Vergleich mit den Messdaten
(Abbildung 25) zeigt, dass die theoretische Streukurve von den tatsächlichen Werten
signifikant abweicht. Es ist also eindeutig auszuschließen, dass es sich bei YopM_Core in
Lösung um ein Monomer handelt.
Abbildung 26: Überlagerung des Kristalldimers mit dem ab initio-Modell.
Volumenrepräsentation des mittels DAMMIF erhaltenen ab initio-Modells überlagert mit dem aus den Ketten A
und C der 3,2 Å Kristallstruktur resultierenden Dimer in Ribbon-Darstellung. Gerendert mit PyMol (Schrödinger
LLC, USA)
Die Überlagerung des „Kristalldimers“ von YopM_Core mit der aus dem ab initio-Modell
erhaltenen, niedrig aufgelösten Hüllstruktur zeigt ebenso eine gute Übereinstimmung. Es ist
also davon auszugehen, dass in der Kristallstruktur von YopM (Abbildung 22) zwei
physiologische Dimere (dargestellt durch die Ketten A und C sowie B und D) ein nicht
67
IV Ergebnisse
biologisch aktives Tetramer bilden. Bei diesem Homodimer interagieren zwei YopM-Moleküle
über eine C-terminale Region, welche die letzten 11 LRRs umspannt. Im Folgenden wurde
nun noch einmal die Interface Region zwischen den Ketten AC bzw. BD im Detail untersucht.
Abbildung 27: Übersicht der Kontakte zwischen den Ketten A und C bzw. B und D der tetrameren
Kristallstruktur.
A: Interaktionen der Ketten A und C bzw. B und D der tetrameren Kristallstruktur analysiert mittels PDBsum
(Laskowski et al. 1997). Aminosäuren sind als Ovale dargestellt. Hierbei sind positiv geladene Aminosäuren blau
hinterlegt, negativ geladene Aminosäuren rot, ungeladene grün, aliphatische grau und aromatische Aminosäuren
lila. Blaue Linien zeigen Wasserstoffbrückenbindungen, gelbe Linien nichtkovalente Wechselwirkungen. Die
breite der Linien indiziert die Stärke der Bindungen. B: Hervorhebung der an den wichtigsten Bindungen
beteiligten Aminosäuren in gelb.
Abbildung 27 zeigt eine Übersicht über die molekularen Wechselwirkungen innerhalb des
physiologischen Dimers, wie es sich in der Kristallstruktur in den Ketten A und C bzw. B und
D wiederfindet. Die Interaktionsfläche der Ketten A und C beträgt demnach 1016 Å2 und
umfasst
20
Aminosäuren.
Das
Interface
wird
durch
insgesamt
13
Wasserstoffbrückenbindungen gebildet und über 104 nichtkovalente Wechselwirkungen
stabilisiert. Im Mittelpunkt stehen hierbei Arg 479, welches jeweils zwei H-Brücken zu Ser
401 der gegenüberliegenden Kette ausbildet, und Glu 461, welches ebenfalls in der Lage ist
zwei H-Brücken zu Arg 361 zu bilden. Die wichtigsten Interaktionen sind in Abbildung 28
graphisch dargestellt. Eine Übersicht über alle Wasserstoffbrückenbindungen ist in Tabelle
28 gezeigt.
68
IV Ergebnisse
Kette A
Glu 461 C
Asp 481 C
Arg 402 A
Arg 342 A
Arg 361 A
Lys 362 C
Arg 361 C
Asp 399 C
Asp 481 A
Ser 401 C
Arg 479 A
Glu 461 A
Asp 422 C
Kette C
His 462 A
Abbildung 28: Interfaceregion zwischen dem YopM-Dimer.
Extraktion der Ketten A und C aus der tetrameren Kristallstruktur von YopM_Core in Ribbon-Repräsentation.
Gerendert mit PyMol (Schrödinger LLC, USA). Die an den wichtigsten H-Brückenbindungen beteiligten
Aminosäuren sind herangezoomt und als Sticks dargestellt.
Tabelle 28: Wasserstoffbrückenbindungen des YopM-Dimers
Atom
Aminosäure
Kette
Atom
Aminosäure
Kette
Abstand
[Å]
NH1
Arg 342
A
O
Met 480
C
2,73
NH2
Arg 361
A
OE2
Glu 461
C
2,54
OD1
Asp 399
A
NH2
Arg 479
C
3,03
OG
Ser 401
A
NH1
Arg 479
C
2,99
OG
Ser 401
A
NH2
Arg 479
C
2,76
NH2
Arg 402
A
OD1
Asp 481
C
3,27
OD2
Asp 419
A
NH2
Arg 479
C
3,3
OE2
Glu 461
A
NH2
Arg 361
C
2,52
NE2
His 462
A
OD2
Asp 422
C
3,19
NH1
Arg 479
A
OG
Ser 401
C
3,05
NH2
Arg 479
A
OD1
Asp 399
C
3,15
NH2
Arg 479
A
OG
Ser 401
C
2,53
OD2
Asp 481
A
NZ
Lys 362
C
3,14
69
IV Ergebnisse
IV.2
Überprüfung
des
inhibitorischen
Effekts
von
YopM
auf
Caspase-1
Zur Analyse eines postulierten inhibitorischen Effektes von YopM auf Caspase-1 (LaRock &
Cookson 2012) wurde yopM aus drei verschiedenen Yersinia-Stämmen wie beschrieben
mittels PCR amplifiziert, in den Expressionsvektor pET302 kloniert und in E. coli BL21-AI
überexprimiert. Die erhaltenen YopM-Proteine wurden mittels Ni-NTA-Agarose wie unter
III.2.3.3.1 beschrieben aufgereinigt und gegen ein tausendfaches Volumen Hepes-Puffer (50
mM Hepes pH 7,5, 100 mM NaCl) dialysiert. Untersucht wurde YopM aus Y. enterocolitica
WA-314 (20 LRRs, 58 kDa), YopM aus Y. enterocolitica 8081 (13 LRRS, 42 kDa) und YopM
aus Y. pseudotuberculosis YpIII (15 LRRs, 46 kDa). Der inibitorische Effekt von YopM auf
das proinflammatorische Enzym Caspase-1 beruht angeblich auf dem Motiv YLTD welches
an einer exponierten Stelle auf LRR10 (Y. pseudotuberculosis CO95) liegt.
Abbildung 29: Aufreinigung von YopM aus Y. enterocolitica WA-314, 8081 und Y. pseudotuberculosis
YpIII
A: Sequenzvergleich von Leucine Rich Repeat 10 aus YopM_C092 mit den korrespondierenden Sequenzen aus
YopM_YpII, YopM_8081 und YopM_WA-314. B: SDS-PAGE der Elutionsfraktionen nach Aufreinigung über NiNTA-Beads. M: Größenstandard in kDa, 1: YopM_WA-314, 2: YopM_8081, 3: YopM_YpIII.
Abbildung 29 A zeigt den Sequenzvergleich dreier verschiedener YopM-Proteine mit der
Referenz YopM_CO95. Aus diesem Vergleich geht hervor, dass YopM_WA-314 einen
kritischen Aminosäureaustausch von Aspartat zu Alanin im für den inhibitorischen Effekt
verantwortlich gemachten Motiv YLTD trägt. YopM_YpIII ist über den gesamten
Sequenzbereich von LRR10 identisch mit YopM_CO95; YopM_8081 besitzt das
unveränderte Motiv. Zur Untersuchung des inhibitorischen Effekts auf die Proteaseaktivität
von Caspase-1 wurde der unter III.2.3.8 beschriebene in vitro Caspase-1-Assay
durchgeführt. Als Kontrolle wurde der kommerzielle Inhibitor Z-Val-Ala-DL-AspFluormethylketon (Z-VAD-FMK, BACHEM, Bubendorf, CH) eingesetzt. Das Ergebnis dieses
Assays ist in Abbildung 30 dargestellt.
70
IV Ergebnisse
A
B
Caspase-1 Assay 50 µM
Caspase-1 Assay 5 µM
0,15
OD405 (YVAD-pNA)
OD405 (YVAD-pNA)
0,15
0,1
Blank
Caspase_1
Caspase_1/YopM WA-314
Caspase_1/YopM 8081
Caspase_1/YopM YpIII
Casase_1/Z-VAD-FMK
0,1
0,05
0,05
0
20
40
60
0
20
40
60
Zeit [min]
Zeit [min]
Abbildung 30: Caspase-1 Assay
Kolorimetrischer Assay zum Umsatz des p-Nitroanilin Substrates YVAD-pNA durch 10 U Caspase-1 über einen
Zeitraum von 60 min. A: 200 µM YVAD-pNA ohne Caspase-1 (Blank) bzw. inkubiert mit Caspase-1 sowie
Caspase-1 mit 5 µM YopM_WA-314, 5 µM YopM_8081, 5 µM YopM_YpIII und 40 µM Z-VAD-FMK. B: 200 µM
YVAD-pNA ohne Caspase-1 (Blank) bzw. inkubiert mit Caspase-1 sowie Caspase-1 mit 50 µM YopM_WA-314,
50 µM YopM_8081, 50 µM YopM_YpIII und 40 µM Z-VAD-FMK.
Der Umsatz des Substrats YVAD-pNA durch das Enzym Caspase-1 wurde anhand des
freien p-Nitroanilin gemessen. Die Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von λ = 405 nm
über einen Zeitraum von 60 min. Der Anstieg der Kurve bei Inkubation mit Caspase-1 im
Gegensatz zur Leerkontrolle (Blank), bei der nur Puffer zugefügt wurde, zeigt die Reaktion.
Die gleichzeitige Inkubation mit 40 µM des kommerziellen Inhibitors Z-VAD-FMK hemmt den
Umsatz des Substrats. Dieser Effekt ließ sich mit keinem der aufgereinigten YopM-Proteine
nachstellen.
71
IV Ergebnisse
IV.3 Interaktion von YopM mit der DEAD-Box-Helikase DDX3
In Experimenten, die vor dieser Arbeit erfolgten, wurde DDX3 als neuer Bindungspartner von
YopM in J774-Zellen entdeckt. Darüber hinaus wurde in Co-Immunopräzipitationen
festgestellt, dass YopM spezifisch mit der ATPase-Domäne von DDX3 interagiert. Hierauf
aufbauend sollte nun eine direkte Interaktion nachgewiesen und diese biochemisch sowie
strukturell charakterisiert werden. Zunächst wurde hierzu mittels GST-PulldownExperimenten die Bindestelle von DDX3 an YopM weiter eingegrenzt.
Abbildung 31: Kristallstruktur der konservierten Domänen 1 und 2 von DDX3.
2,2 Å Struktur der DEAD-Box Helikase DDX3 (pdb Nummer: 2I4I) mit den konservierten Domänen 1, an der die
Bindung von ATP stattfindet (ATPase), und Domäne 2, die hauptsächlich an der RNA-Bindung beteiligt ist
(Helikase). Die beiden Domänen sind durch eine unstrukturierte Linker-Region verknüpft (Högbom et al. 2007).
IV.3.1 GST-Pulldown
Die DEAD-Box-Helikase DDX3 besteht aus zwei strukturierten Domänen, der ATPaseDomäne und der Helikase-Domäne, die durch einen Loop miteinander verbunden sind.
N- und C-terminal befinden sich 168 bzw. 82 Aminosäuren lange Bereiche, die ungeordnet
sind. Zur Analyse des Bindungsepitops von DDX3 wurden zunächst fünf verschiedene
Konstrukte designt, die die ATPase-Domäne beinhalten. Die Bereiche der cDNA, die die
Aminosäuren 1-418, 51-418, 101-418, 168-418 und 201-418 einschlossen, wurden wie
beschrieben mittels PCR amplifiziert, in den Vektor pET-303 kloniert und in E. coli BL21-AI
exprimiert. GST-YopM wurde wie unter III.2.3.3.2 dargestellt aufgereinigt. Anschließend
wurde der GST-Pulldown wie unter III.2.3.8 erläutert durchgeführt. Das Ergebnis ist in
Abbildung 32 dargestellt.
72
IV Ergebnisse
A
ATPase
N
100
200
Helikase
300
400
500
C
600
His-DDX3_201-418
His-DDX3_1-418
His-DDX3_51-418
His-DDX3_101-418
His-DDX3_168-418
M
His-DDX3_1-418
His-DDX3_51-418
His-DDX3_101-418
His-DDX3_168-418
His-DDX3_201-418
B
55 –
43 –
34 –
26 –
GST- Pulldown
55 –
43 –
34 –
26 –
Input
WB α His
88 –
GST- YopM
GST
26 –
Coomassie
Abbildung 32: Pulldown von His-DDX3 mittels GST-YopM.
A: Schematische Darstellung von DDX3. B: Pulldown der Konstrukte 6x His-DDX3_1-418, 6x His-DDX3_51-418,
6x His-DDX3_101-418, 6x His-DDX3_168-418 und 6x His-DDX3_201-418 mit GST-YopM bzw. GST. GSTPulldown bzw. Input dargestellt im Western Blot, inkubiert mit HisProbe™-HRP (Thermo Scientific, USA). GSTYopM bzw. GST gefärbt mit Coomassie. M: Molekulargewicht in kDa.
Abbildung 32 zeigt, dass die als unstrukturiert vorhergesagte Region von DDX3 (1-168) für
die Bindung an YopM notwendig ist. So binden die Konstrukte 6x His-DDX3_1-418, 6x HisDDX3_51-418 und 6x His-DDX3_101-418 an GST-YopM, die weiter trunkierten Konstrukte
6x His-DDX3_168-418 und 6x His-DDX3_201-418 jedoch nicht. Die Kontrolle zeigt, dass
keines der Konstrukte an GST alleine bindet. Leider war es nicht möglich den
unstrukturierten Bereich von DDX3 1-168 bzw. den minimalen Bereich 101-168 in diesem
Experiment zu untersuchen, da keine stabilen His-Fusionsproteine im heterologen E. coli
Expressionssystem gebildet wurden. Für eingehendere Untersuchungen zur Interaktion von
DDX3 und YopM, wurden die drei His-DDX3 Konstrukte (6x His-DDX3_1-418, 6x HisDDX3_51-418 und 6x His-DDX3_101-418) im größeren Maßstab exprimiert und aufgereinigt.
IV.3.2 Heterologe Expression und Aufreinigung von DDX3
Nach der Aufreinigung der Proteine mittels Ni-NTA-Agarosse (Abschnitt III.2.3.3.1) wurde
eine analytische Größenausschlusschromatographie durchgeführt. Diese erlaubt die
Bestimmung der Dispersität der Lösung, sowie der Größe der vorhandenen Protein-Spezies.
Die Größenausschlusschromatographie wurde wie unter III.2.3.3.4 beschrieben
durchgeführt. Verwendet wurde die Säule HILoad 16/600 Superdex 200.
73
IV Ergebnisse
Abbildung 33: Analytische Größenausschlusschromatographie von DDX3.
A: Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie dreier verschiedener DDX3-Konstrukte.
DDX3_1-418 eluiert bei einem Volumen von 80,65 ml, DDX3_51-418 bei 84,13 ml und DDX3_101-418 bei 86,21
ml. Die graue Linie zeigt den Lauf des „Biorad Gel Filtration Standards“. B: SDS-PAGE der jeweiligen
Elutionsfraktionen aus A; oberes Gel: DDX3_1-418, mittleres Gel DDX3_51-418, unteres Gel: DDX3_101-418. M:
Größenstandard, Molekulargewicht in kDa. C: Blot der normalisierten Elutionsvolumina Ve/Vo gegen das
Molekulargewicht in Dalton. Die Eichgerade entstand aus dem Fit der Elutionsvolumina der Größenmarker
Thyroglobulin (670 kDa), γ-globulin (158 kDa), Ovalbumin (44 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B 12 (1,35
kDa).
Abbildung 33 zeigt das Ergebnis der analytischen Gelfiltration von drei verschiedenen DDX3
Konstrukten. Alle getesteten Konstrukte eluieren in einem Einzelpeak, d.h. es liegt jeweils
nur eine Spezies des Proteins vor. Die Lösung ist monodispers. Desweiteren eluieren die
Proteine ihrer Größe nach, in der Reihenfolge ihrer vorhergesagten Molekulargewichte
(Abbildung 33 A). Laut ProtParam (Gasteiger et al. 2005) lauten diese für DDX3_1-418: 47
kDa, für DDX3_51-418: 41 kDa und für DDX3_101-418: 36 kDa. In der denaturierenden
SDS-PAGE in Abbildung 33 B sind die Elutionsfraktionen aufgetragen. Die
Molekulargewichte der Konstrukte anhand ihres Laufverhaltens im SDS-Gel decken sich mit
den Vorhersagen. Die Auswertung der tatsächlichen Größe der Proteine unter Zuhilfenahme
der aus der Eichgerade in Abbildung 33 C erhaltenen Gleichung bestätigt die Werte
ebenfalls. Die anhand der Elutionsvolumina errechneten Molekulargewichte der Proteine
lauten: DDX3_1-418: 52 kDa, DDX3_51-418: 38 kDa DDX3_101-418: 31 kDa. Die
errechneten Größen deuten wiederum darauf hin, dass alle Konstrukte als Monomere in
nativer Lösung vorliegen. Das einzige Konstrukt welches sich auch nach mehreren Tagen
als stabil herausstellte, war DDX3_51-418. DDX3_1-418 begann bereits nach kurzer Zeit
sehr stark zu degradieren und DDX3_101-418 neigte zu Oligomerisierung.
Als weitere Qualitätskontrolle wurden DDX3_51-418 sowie DDX3_101-418 im DLS wie unter
III.2.4.1 beschrieben untersucht.
74
IV Ergebnisse
A
B
Abbildung 34: Dynamische Lichtstreuung von DDX3.
Heatmap der Größenverteilung der hydrodynamischen Radii von A: DDX3_51-418 und B: DDX3_101-418 über
einen Zeitraum von 80 Sekunden.
Aus den in Abbildung 34 dargestellten Messungen der dynamischen Lichtstreuung geht
hervor, dass DDX3_51-418 sowie DDX3_101-418 einigermaßen monodispers vorlagen. Die
ermittelten hydrodynamische Radii lagen bei 2,82 ± 0,38 nm für DDX3_51-418 und 2,91 ±
0,28 für DDX3_101-418. Die daraus resultierenden Molekulargewichte betragen 35,42 kDa
bzw 38,04 kDa.
IV.3.3 Struktur von DDX3_51-418 in Lösung
Als Basis für spätere Untersuchungen zur Struktur des Komplexes aus YopM und DDX3 in
Lösung und um Aufschluss über den für die Bindung notwendigen, jedoch als unstrukturiert
vorhergesagten Bereich von DDX3 zu bekommen, wurde DDX3_51-418 mittels
Röntgenkleinwinkelstreuung untersucht.
Hierzu wurde DDX3_51-418 wie zuvor beschrieben aufgereinigt. Die Probe wurde bei
20 000 x g und 4°C für eine Stunde zentrifugiert (5810R, Eppendorf, G) und mit Hilfe eines
100 nm Zentrifugenfilters (Ultrafree-MC, Millipore, USA) von größeren Partikeln befreit.
Anschließend wurden fünf verschiedene Konzentrationen (0,7; 1,0; 1,5; 1,8 und 2,0 mg/ml)
eingestellt, die mittels DLS auf Monodispersität überprüft wurden. Da das Protein oberhalb
der Grenze von 2,5 mg/ml präzipitierte, konnten keine Lösungen mit höheren
Konzentrationen hergestellt werden.
Die Proben wurden anschließend an Beamline P12 (EMBL, HASYLAB/DESY, Hamburg, G)
vermessen. Die erhaltenen Daten wurden auf Strahlenschäden kontrolliert und mit dem
Programm Primus (Konarev et al. 2003) der Proteinkonzentrationen entsprechend skaliert.
Die Messkurven der Proben wurden durch Subtraktion der Streukurven der reinen
Pufferlösungen normalisiert. Das Programm GNOM (Semenyuk & Svergun 1991) lieferte den
Trägheitsradius Rg, sowie den maximalen Durchmesser Dmax, welche Aufschluss auf die
Größe der Moleküle gaben. Die Ergebnisse der Größenbestimmungen sind in Tabelle 29
zusammengefasst.
75
IV Ergebnisse
Tabelle 29: Ergebnisse der SAXS-Messung von DDX3_51-418
Konzentration
[mg/ml]
0,7
1,0
1,5
1,8
2,0
Rg
[nm]
2,7 ± 0,3
2,7 ± 0,4
2,8 ± 0,2
2,9 ± 0,2
2,8 ± 0,2
Dmax
[nm]
9
9
10
10
10
VPorod
[nm3]
74
64
79
78
74
MW I(0)
[kDa]
23
24
24
31
21
MWPorod
[kDa]
46
40
50
48
46
Das anhand des Porod Volumens errechnete Molekulargewicht von ~46 kDa kommt dem
theoretischen Molekulargewicht von 41 kDa für ein Monomer ziemlich nahe. Das
Molekulargewicht aus der Vorwärtsstreuung liegt etwas unter dem erwarteten Wert.
Mit Hilfe von GASBOR (Svergun et al. 2001) konnte ein ab initio-Modell erstellt werden.
Das Programm nimmt hierzu eine definierte Anzahl an Sphären, die in ihrem Volumen dem
Mittel aller Aminosäuren entsprechen und konstruiert eine Reihe von Modellen, deren
theoretisches Streuprofil mit den tatsächlichen Messwerten abgeglichen wird. Ein weiterer
Ansatz bestand darin, den flexiblen Teil (51-167) mit Hilfe von CORAL (Petoukhov et al.
2012) an die vorhandene Struktur von DDX3_168-418 zu modellieren. Letztere wurde aus
der Struktur 2I4I (Högbom et al. 2007) extrahiert. In einem letzten kombinierten Ansatz
wurde ein Modell von DDX3_51-167, welches mit Hilfe der HomologieModellierungssoftware ITASSER (Roy et al. 2010) entstand, manuell in vier Teile
geschnitten um Flexibilität zu simulieren. Diese Fragmente wurden zusammen mit der vorher
beschriebenen Struktur von DDX3 167-418 unter Zuhilfenahme des Programmes SASREF
(Petoukhov & Svergun 2005) zu einem weiteren möglichen Modell verknüpft.
Die drei Modelle besitzen eine gewisse Variabilität, gehen jedoch eindeutig auf eine
gemeinsame Grundform zurück. Desweiteren zeigen alle Modelle sehr gute Fits im Vergleich
der theoretischen Streukurven mit den Messwerten (Abbildung 35), was jedoch zum Teil auf
verstärktes Hintergrundrauschen der Messwerte zurückzuführen ist.
76
IV Ergebnisse
Abbildung 35: Modelle von DDX3_51-418.
Drei auf Grundlage der SAXS Daten entwickelte Modelle von DDX3 mit den korrespondierenden CRYSOL
(Svergun et al. 1995)-Fits. A: ab initio-Modell entwickelt mit der Software GASBOR (Svergun et al. 2001). χ =
0,81 B: Modellierung des unbekannten N-terminus mittels CORAL (Petoukhov et al. 2012) χ = 0,86 C:
Kombinierter Ansatz aus ITASSER (Roy et al. 2010) und SASREF (Petoukhov & Svergun 2005) χ = 0,86.
IV.3.4 Bestimmung der Bindungsaffinität von YopM und DDX3
Zur weiteren Charakterisierung der Interaktion zwischen YopM und DDX3 wurden
Untersuchungen zur Bindungsaffinität mittels MST in einem Monolith NT.115 (NanoTemper
Technologies, G) durchgeführt (III.2.3.9). Hierzu wurden die Fragmente DDX3_1-418 und
DDX3_51-418 exprimiert und mittels IMAC und Größenausschlusschromatographie
aufgereinigt. Die so gereinigten Proteine wurden mit Hilfe des Monolith™ NT.115 Protein
Labeling Kits RED-NHS (NanoTemper Technologies, G) laut Protokoll mit dem
Fluoreszensfarbstoff NT-647 versehen. Das Labeling der Proben wurde mit Hilfe des
NanoDrop® ND-1000 (Peqlab, G) spektroskopisch überprüft. Die für das Bindungsexperiment
einzusetzende Menge wurde in einer dreifach Messung bei 50 % LED-Power in
Standardkapillaren ermittelt. Ebenso wurden verschiedene Pufferzusammensetzungen und
Kapillaren getestet, um eine stabile Thermophorese zu gewährleisten. Zur finalen Messung
wurden 50 nM gelabeltes Protein in MST-Reaktionspuffer (Tabelle 12) eingesetzt. Das
Experiment wurde in hydrophilen Kapillaren durchgeführt. YopM_Full und YopM_Core
wurden wie zuvor beschrieben exprimiert und aufgereinigt. In einem Experiment wurden 16
unterschiedliche Konzentrationen von YopM_Full bzw. YopM_Core in einer 1:1
Verdünnungsreihe zu dem gelabelten DDX3-Konstrukt titriert und die Änderung in der
Thermophorese wurde gemessen. Der Titrationsbereich für YopM_Full betrug 6,85- 224 000
nM, für YopM_Core 8,48- 278 000 nM.
77
IV Ergebnisse
A
Kd: 11,6  1,3 µM
50
Kd: 18,1  5,3 µM
60
40
20
0
0
10 0
DDX3_1-418/YopM_Core
80
Fnorm [1/1000]
100
Fnorm [1/1000]
B
DDX3_1-418/YopM_Full
10 1
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
10 0
Konzentration [nM]
10 1
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
Fluoreszenz
Fluoreszenz
Konzentration [nM]
Zeit [s]
Zeit [s]
Abbildung 36: Ergebnis der MST von DDX3_1-418 mit YopM_Full bzw. YopM_Core.
Dargestellt sind die Ergebnisse der MST-Messungen mit gelabeltem DDX3_1-418. Geblottet ist die Amplitude der
normierten Fluoreszenz gegen die Konzentration des ungelabelten YopM_Full bzw. YopM_Core. Darunter
dargestellt sind die korrespondierenden Thermophoresekurven des jeweiligen Experiments im Zeitverlauf
A: Kd Bestimmung von DDX3_1-418 und YopM_Full. B: Kd Bestimmung von DDX3_1-418 und YopM_Core.
Abbildung 36 zeigt das Ergebnis der MST-Experimente von DDX3_1-418 mit YopM_Full
bzw. YopM_Core bei einer Laser-Power von 60 %. Es ist eine deutliche Änderung des
Thermophoreseverhaltens von DDX3_1-418 in Abhängigkeit der Konzentration von
YopM_Full bzw. YopM_Core zu erkennen. Diese äußern sich in einer Amplitude von
maximal 110 (YopM_Full) bzw. 70 (YopM_Core) relativen Fluoreszenzeinheiten. Die Analyse
der Konzentrationsabhängigkeiten dieser Fluoreszenzänderungen ergibt eine Kd von ca. 12
µM für die Interaktion von YopM_Full mit DDX3_1-418 und eine Kd von ca. 18 µM für die
Interaktion mit YopM_Core. Zum Vergleich wurden weitere Experimente mit DDX3_51-418
durchgeführt.
78
IV Ergebnisse
A
DDX3_51-418/YopM_Core
80
Kd: 9,2  0,8 µM
Fnorm [1/1000]
100
Fnorm [1/1000]
B
DDX3_51-418/YopM_Full
50
40
20
0
0
10 0
Kd: 21,1  5,1 µM
60
10 1
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
10 0
10 1
Konzentration [nM]
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
Fluoreszenz
Fluoreszenz
Konzentration [nM]
Zeit [s]
Zeit [s]
Abbildung 37: Ergebnis der MST von DDX3_51-418 mit YopM_Full bzw. YopM_Core.
Dargestellt sind die Ergebnisse der MST-Messungen mit gelabeltem DDX3_51-418. Geblottet ist die Amplitude
der normierten Fluoreszenz gegen die Konzentration des ungelabelten YopM_Full bzw. YopM_Core. Darunter
dargestellt sind die korrespondierenden Thermophoresekurven des jeweiligen Experiments im Zeitverlauf A: Kd
Bestimmung von DDX3_51-418 und YopM_Full. B: Kd Bestimmung von DDX3_51-418 und YopM_Core.
Abbildung 37 zeigt das Ergebnis der MST-Experimente von DDX3_51-418 mit YopM_Full
bzw.
YopM_Core
bei
einer
Laser-Power
von
60 %.
Die
Analyse
der
Konzentrationsabhängigkeiten der Fluoreszenzänderungen ergibt ein ähnliches Bild wie
zuvor. Die Kd für die Interaktion von YopM_Full mit DDX3_1-418 liegt bei ca. 9 µM und eine
für die Interaktion mit YopM_Core bei ca. 21 µM.
A
0.5
YopM_Full
Kd: 11,9  3,4 µM
YopM_Core
Kd: 18,1  5,3 µM
0.0
10 0
YopM_Full/DDX3
1.0
Gebundener Anteil
1.0
Gebundener Anteil
B
DDX3_1-418/YopM
0.5
DDX3_1-418
Kd 11,93  3,4 µM
DDX3_51-418
Kd: 9,2  0,8 µM
0.0
10 1
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
10 0
Konzentration [nM]
10 1
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
Konzentration [nM]
Abbildung 38: Vergleich der Bindungsaffinitäten.
Dargestellt ist der Vergleich der Bindungskurven anhand der gebundenen Fraktionen in Abhängigkeit der
Konzentration des Bindungspartners. A: Vergleich der Bindungen von YopM_Full und YopM_Core mit DDX3_1418. B: Vergleich der Bindungen von DDX3_1-418 und DDX3_51-418 mit YopM_Full.
Der in Abbildung 38 dargestellte Vergleich der Bindungsexperimente zeigt, dass es keinen
Unterschied in den Bindungsaffinitäten von DDX3_1-418 und DDX3_51-418 mit YopM_Full
gibt (Abbildung 38 B). YopM_Core bindet marginal schlechter als das Volllängenkonstrukt.
Dieser Unterschied ist jedoch vor allem in Anbetracht des statistischen Fehlers zu
vernachlässigen (Abbildung 38 A).
79
IV Ergebnisse
IV.3.5
Darstellung
des
Komplexes
aus
YopM
und
DDX3
mittels
Größenausschlusschromatographie
Um die Komplexbildung zwischen YopM und DDX3 zu überprüfen wurden mit verschiedenen
Fragmenten der beiden Proteine analytische Gelfiltrationen durchgeführt. Hierzu erfolgte
zunächst die Aufreinigung der beiden Bindungspartner wie beschrieben und die
Elutionsprofile der einzelnen Proteine wurden aufgezeichnet. Zur Etablierung des Komplexes
wurden dann beide Bindungspartner in äquimolaren Mengen zusammengebracht und 30 min
auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Probe auf eine Superdex 200 10/300 GL appliziert
und der Lauf wurde wie unter III.2.3.3.4 beschrieben durchgeführt. Alle Gelfiltrationsläufe
fanden in 50 mM Hepes-Puffer pH 7,5 mit 150 mM NaCl und 2 mM DTT statt. Das Ergebnis
der analytischen Größenausschlusschromatographie von YopM_Full und DDX3 1-418, sowie
des Komplexes aus beiden Proteinen ist in Abbildung 39 dargestellt.
200
YopM/DDX3
YopM_1-506
DDX3_1-418
150
100
50
0
1 2 3 4 5 6 7
0
5
B
M
20
C
1 2 3 4 5 6 7
10 6
70 –
55 –
10
15
Elutionsvolumen Ve [ml]
YopM
DDX3
40 –
55 –
YopM
1-506
55 –
DDX3
1-418
Molekulargewicht [Da]
Absorption 280nm [mAu]
A
y
10 5
= 3E+08e-4,967x
R² = 0,9812
YopM/DDX3
YopM_1-506
DDX3_1-418
10
4
10 3
1.0
1.5
2.0
2.5
Ve /Vo
Abbildung 39: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus YopM_Full und
DDX3_1-418.
A: Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. YopM 1-506 eluiert bei einem Volumen von 13,15
ml, DDX3_1-418 bei 14,74 ml und der Komplex bei 12,74 ml. B: SDS-PAGE der jeweiligen Elutionsfraktionen 1-7
aus A; M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa. C: Blot der normalisierten Elutionsvolumina Ve/Vo gegen
das Molekulargewicht in Dalton. Die Eichgerade entstand aus dem Fit der Elutionsvolumina der Größenmarker
Thyroglobulin (670 kDa), γ-globulin (158 kDa), Ovalbumin (44 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B 12 (1,35
kDa).
Das Chromatogramm der analytischen Gelfiltration in Abbildung 39 A zeigt die Einzelläufe
von YopM_Full in grün, DDX3 in blau und dem Komplex aus beiden Proteinen in rot. In allen
drei Läufen sind Einzelpeaks zu erkennen, was bedeutet, dass jeweils nur eine
Größenspezies in den Lösungen vorlag. Im Vergleich mit YopM_Full zeigt die Komplexkurve
eine deutliche Verschiebung nach links, d.h. eine Volumenzunahme. Desweiteren war eine
deutlich spätere Elution von DDX3_1-418 festzustellen. Die Analyse der Peakfraktionen
mittels denaturierender SDS-PAGE in Abbildung 39 B zeigt, dass sowohl YopM_Full als
80
IV Ergebnisse
auch DDX3_1-418 in dem Elutionspeak der Komplexkurve zu finden sind. Aufgrund der
Bandenintensität bei ähnlichem Molekulargewicht ist ebenso zu erkennen, dass eine größere
Menge YopM als DDX3 im Komplex vorzuliegen scheint. Die Peakfraktionen der beiden
Einzelläufe enthalten, wie erwartet, die Proteine YopM_Full bzw. DDX3_1-418. Die
Errechnung der Molekulargewichte mittels der Geradengleichung aus Abbildung 39 C
spiegelt das zuvor gewonnene Bild wider. Für YopM_Full ergibt sich ein Molekulargewicht
von 105 kDa, DDX3_1-418 liegt bei 41 kDa. Die theoretischen Molekulargewichte der
Monomere, welche sich auch in der SDS-PAGE darstellen, liegen für YopM_Full bei 58 kDa
und für DDX3_1-418 bei ca. 47 kDa. Das errechnete Molekulargewicht des Komplexes liegt
bei 135 kDa.
Anschließend wurde das Fragment DDX3_51-418 auf seine Bindung zu YopM_Full hin
untersucht.
300
YopM/DDX3
YopM_1-506
DDX3_51-418
200
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8
0
5
10
15
Elutionsvolumen Ve [ml]
B
M
55 –
40 –
55 –
40 –
55 –
40 –
20
C
1 2 3 4 5 6 7 8
10 6
YopM/
DDX3
YopM
1-506
DDX3
51-418
Molekulargewicht [Da]
Absorption 280nm [mAu]
A
y
10 5
= 3E+08e-4,967x
R² = 0,9812
YopM/DDX3
YopM_1-506
DDX3_51-418
10 4
10 3
1.0
1.5
2.0
2.5
Ve /Vo
Abbildung 40: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus YopM_Full und
DDX3_51-418.
A: Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. YopM 1-506 eluiert bei einem Volumen von 13,27
ml, DDX3_51-418 bei 15,36 ml und der Komplex bei 12,9 ml. B: SDS-PAGE der jeweiligen Elutionsfraktionen 1-8
aus A; M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa. C: Blot der normalisierten Elutionsvolumina Ve/Vo gegen
das Molekulargewicht in Dalton. Die Eichgerade entstand aus dem Fit der Elutionsvolumina der Größenmarker
Thyroglobulin (670 kDa), γ-globulin (158 kDa), Ovalbumin (44 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B 12 (1,35
kDa).
Die Untersuchung der Fragmente YopM_Full und DDX3_51-418 zeigt, dass sich auch hier
ein Komplex darstellen ließ, der in der Gelfiltration stabil war. Der Peak des Komplexes ist
mit 12,9 ml deutlich vor den Einzelpeaks angesiedelt. Das errechnete Molekulargewicht
beträgt für den Komplex: 121 kDa, für YopM_Full: 97 kDa und für DDX3_51-418: 28 kDa.
Alle drei Elutionen schienen leicht verzögert, jedoch ergab sich ein ähnliches Bild wie bei
YopM_Full/DDX3_1-418.
81
IV Ergebnisse
100
YopM/DDX3
YopM_1-506
DDX3_101-418
Absorption 280nm [mAu]
50
0
1 2 3 4 5 6
0
5
B
M
55 –
40 –
55 –
40 –
55 –
40 –
10
15
Elutionsvolumen Ve [ml]
20
C
1
2 3
4 5 6
10 6
YopM
DDX3
YopM
1-506
DDX3
101-418
Molekulargewicht [Da]
A
y
10 5
= 3E+08e-4,967x
R² = 0,9812
YopM/DDX3
YopM_1-506
DDX3_101-418
10 4
10 3
1.0
1.5
2.0
2.5
Ve /Vo
Abbildung 41: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus YopM_Full und
DDX3_101-418.
A: Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. YopM 1-506 eluiert bei einem Volumen von 12,93
ml, DDX3_101-418 bei 15,33 ml und der Komplex bei 12,73 ml. B: SDS-PAGE der jeweiligen Elutionsfraktionen
1-6 aus A; M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa. C: Blot der normalisierten Elutionsvolumina Ve/Vo gegen
das Molekulargewicht in Dalton. Die Eichgerade entstand aus dem Fit der Elutionsvolumina der Größenmarker
Thyroglobulin (670 kDa), γ-globulin (158 kDa), Ovalbumin (44 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B12 (1,35
kDa).
Die Analyse der Komplexbildung aus YopM_Full und DDX3_101-418 zeigt einige
Unterschiede zu den vorherigen Experimenten. Zwar lässt sich der Komplex darstellen,
jedoch ist eine Tendenz zur Oligomerisierung von DDX3_101-418 zu erkennen. Der
Hauptpeak bei 15,33 ml ergibt ein Molekulargewicht von 28 kDa, was etwas geringer ist als
die erwartete Masse von 36 kDa. Diese Abweichung ist jedoch vernachlässigbar. Zudem ist
ein zweiter, deutlich früherer Elutionspeak bei 13,74 ml zu beobachten, der auf ein
Molekulargewicht von ca. 74 kDa hindeutet. Die Auftragung in der SDS PAGE zeigte jedoch
lediglich die DDX3-Bande, was ein eindeutiges Indiz für die vermutete Multimerisierung ist.
Hinzu kommt, dass im Gegensatz zu den anderen untersuchten Fragmenten, nicht das
gesamte Protein im Komplex gebunden war, sondern ein großer Anteil in Fraktion 5 und 6
verblieb.
Zuletzt wurde die Komplexbildung des kristallisierten Fragmentes YopM_Core (AS 34-481)
Mit dem Fragment DDX3_1-418 untersucht.
82
IV Ergebnisse
A
Absorption 280nm [mAu]
200
YopM/DDX3
YopM_34-481
DDX3_1-418
150
100
50
0
1 2 3 4 5 6 7
0
5
10
15
Elutionsvolumen Ve [ml]
B
55 –
40 –
55 –
40 –
55 –
40 –
C
1
2
10 6
3 4 5 6 7
YopM
DDX3
YopM
34-481
DDX3
1-418
Molekulargewicht [Da]
M
20
y
10 5
= 3E+08e-4,967x
R² = 0,9812
YopM/DDX3
YopM_34-481
DDX31-418
10 4
10 3
1.0
1.5
2.0
2.5
Ve /Vo
Abbildung 42: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus YopM_Core und
DDX3_1-418.
A: Chromatogramm der Größenausschlusschromatographie. YopM 34-481 eluiert bei einem Volumen von 13,85
ml, DDX3_1-418 bei 14,74 ml und der Komplex bei 12,82 ml. B: SDS-PAGE der jeweiligen Elutionsfraktionen 1-6
aus A; M: Größenstandard, Molekulargewicht in kDa. C: Blot der normalisierten Elutionsvolumina Ve/Vo gegen
das Molekulargewicht in Dalton. Die Eichgerade entstand aus dem Fit der Elutionsvolumina der Größenmarker
Thyroglobulin (670 kDa), γ-globulin (158 kDa), Ovalbumin (44 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B 12 (1,35
kDa).
Abbildung 42 zeigt, dass sich auch mit dem YopM_Core Fragment ein stabiler Komplex mit
DDX3_1-418 darstellen ließ. Die errechneten Molekulargewichte liegen bei 85 kDa für
YopM_Core, 41 kDa für DDX3_1-418 und 127 kDa für den Komplex.
Die gesammelten Resultate deuteten daraufhin, dass ein stabiler Komplex mit allen
getesteten Kombinationen möglich war. Dieser Komplex hatte zudem in jedem Fall ein
höheres Molekulargewicht als ein Heterodimer aus YopM und DDX3 erwarten ließ.
83
IV Ergebnisse
IV.4 Strukturanalyse des Komplexes aus YopM und DDX3
Aufgrund der zuvor gesammelten Ergebnisse wurde die Kombination aus YopM_Core und
DDX3_51-418 für weitergehende Untersuchungen zur Komplexstruktur herangezogen.
YopM_Core ließ sich zum einen mit einer höheren Ausbeute als das Volllängenprotein in
E. coli exprimieren, zum anderen konnte bereits gezeigt werden, dass sich YopM_Core sehr
gut kristallisieren ließ. Desweiteren sollte die YopM_Core Kristallstruktur eine gute Basis für
Untersuchungen des Komplexes in Lösung darstellen. DDX3_51-418 stellte das am besten
geeignete DDX3_Konstrukt dar. DDX3_1-418 war nicht sehr stabil und degradierte teilweise
bereits Stunden nach der Aufreinigung aus E. coli. DDX3_101-418 zeigte wie bereits
erwähnt Oligomerisierung bzw. eine weniger stabile Bindung zu YopM.
YopM_Full und DDX3_51-418 wurden wie beschrieben aufgereinigt und der Komplex wurde
mittels Größenausschlusschromatographie überprüft. Vor den Kristallisationsansätzen bzw.
vor Experimenten mittels Röntgenkleinwinkelstreuung wurde die Probe ebenfalls mittels DLS
überprüft.
Abbildung 43: DLS von YopM_Core und YopM_Core/DDX3_51-418.
Heatmap der Größenverteilung der hydrodynamischen Radii von A: YopM_Core und B: Komplex aus
YopM_Core und DDX3_51-418 über einen Zeitraum von 80 Sekunden.
Der Komplex aus YopM_Full und DDX3_51-418 war monodispers in Lösung (Abbildung 43
B) Im Vergleich zu YopM_Core (4,2 nm) zeigt dieser einen erhöhten hydrodynamischen
Radius von 4,91 nm.
IV.4.1 Kristallisation von YopM/DDX3
Für die Kristallisation wurde eine Lösung des Komplexes mit eine Konzentration von 10,5
mg/ml hergestellt und gegen ein tausendfaches Volumen 50 mM Hepes pH 7,5 über Nacht
bei 4°C dialysiert.
Für die Suche nach initialen Kristallisationsbedingungen wurden die kommerziellen Screens
PACT premier™, Stura Footprint™, Morpheus (Molecular Dimensions, UK) und Classic,
ComPAS, JCSG+, Protein Complex Suite (Quiagen, Deutschland) verwendet. 500 nl der
Proteinlösung wurden wie in III.2.4.3.1 beschrieben unter Zuhilfenahme
eines
Pipettierroboters (Honeybee 961 Genomic solutions, UK) in spezielle 96-Well Platten (NeXtal
QIA1 μplates 96 Well, Qiagen, Deutschland) pipettiert und 1:1 mit Präzipitantenlösung
gemischt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur inkubiert und wöchentlich mikroskopisch
84
IV Ergebnisse
untersucht. Insgesamt wurden somit 672 Bedingungen getestet. Nach vier Wochen zeigten
sich bei der Bedingung JCSG+ D2 (0,1 M Hepes pH 7,5; 0,2 M MgCl2; 30 % PEG400)
Kristalle.
Abbildung 44: Kristalle des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418.
Kristalle des Komplexes aus YopM_Full und DDX3_51-418. Gewachsen nach vier Wochen bei einer
Tropfengröße von 500 nl Proteinlösung (c: 10,5 mg/ml) gemischt mit 500 nl Präzipitantenlösung (0,1 M Hepes pH
7,5; 0,2 M MgCl2; 30% PEG400) im sitting drop-Verfahren über einem Reservoir aus 50 µl purer
Präzipitantenlösung.
Um zu überprüfen ob die sehr kleinen Kristalle die gewünschten Proteine enthielten, wurden
sie durch mehrfache Überführung in Präzipitantenlösung gewaschen, in SDS-Probenpuffer
aufgekocht und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
M
α DDX3
B
α YopM
A
130 –
70 –
55 –
40 –
35 –
25 –
15 –
Abbildung 45: Analyse der Komplexkristalle.
A: Kristalle gewaschen in Präzipitantenlösung (0,1 M Hepes pH 7,5; 0,2 M MgCl2; 30 % PEG400) B: Analyse der
Kristalle mittels Western Blot und Antikörpern gegen YopM bzw. DDX3. Die Kristalle wurden in SDS-Probenpuffer
aufgekocht, die darin enthaltenen Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran
geblottet. Die Membran wurde dann zuerst mit YopM-Antikörper analysiert und nach Trocknung der Membran am
darauffolgenden Tag mit DDX3-Antikörper inkubiert.
85
IV Ergebnisse
Abbildung 45 zeigt, dass die produzierten Kristalle tatsächlich sowohl YopM als auch DDX3
enthielten. Da die Kristalle jedoch für eine umfassende Strukturanalyse zu klein und
verwachsen waren, wurden Optimierungsansätze mit der identischen Ausgangslösung
durchgeführt. Leider konnte die Bedingung nicht erfolgreich reproduziert werden. Eine
nähere Untersuchung der Ausgangslösung mittels DLS und SDS-PAGE zeigte, dass die
darin enthaltenen Proteine degradiert und aggregiert waren.
Abbildung 46: Überprüfung der Proteinlösung.
A: Heatmap der Größenverteilung des hydrodynamischen Radius von YopM_Core/DDX3_51-418 zum Zeitpunkt
des initialen Kristallisationsscreens und
B: zum Zeitpunkt der Optimierungsansätze. C: Analyse des
Proteingemisches mittels SDS-PAGE.
IV.4.2 Struktur des Komplexes aus YopM und DDX3 in Lösung
Um trotz der Schwierigkeiten bei der Kristallisation aufgrund der deutlich begrenzten
Haltbarkeit des Komplexes aus YopM und DDX3 einen Eindruck über dessen Struktur zu
gewinnen, wurden SAXS-Experimente an Beamline P12 (EMBL, HASYLAB/DESY,
Hamburg, G) durchgeführt. Obwohl DDX3_51-418 ab einer Grenze von 2,5 mg/ml zu
präzipitieren begann war es möglich höhere Konzentrationen des Proteins im Komplex mit
YopM_Core zu erreichen. Hierzu wurden zunächst YopM_Core und DDX3_51-418 wie zuvor
beschrieben aufgereinigt. Danach wurden die einzelnen Proteine zusammenpipettiert und
der Komplex wurde mittels Gelfiltration wie unter IV.3.5 beschrieben aufgereinigt. Die Probe
wurde bei 20.000 g und 4°C für 10 min zentrifugiert (5810R, Eppendorf, G) und mit Hilfe
eines 100 nm Zentrifugenfilters (Ultrafree-MC, Millipore, USA) von größeren Partikeln befreit.
Anschließend wurden fünf verschiedene Konzentrationen (0,66; 1,32; 2,65; 5,3 und 10,6
mg/ml) eingestellt, die mittels DLS auf Monodispersität überprüft wurden.
Die Proben wurden anschließend vermessen. Die erhaltenen Daten wurden auf
Strahlenschäden kontrolliert und mit dem Programm Primus (Konarev et al. 2003) der
Proteinkonzentrationen entsprechend skaliert. Die Messkurven der Proben wurden durch
Subtraktion der Streukurven der reinen Pufferlösungen normalisiert. Das Programm GNOM
(Semenyuk & Svergun 1991) lieferte den Trägheitsradius Rg, sowie den maximalen
Durchmesser Dmax, welche beide Aufschluss über die Größe der Moleküle gaben. Die
Ergebnisse der Größenbestimmungen sind in Tabelle 30 zusammengefasst.
86
IV Ergebnisse
Tabelle 30: Ergebnisse der SAXS-Messung des Komplexes YopM_Core/DDX3_51-418
Konzentration
[mg/ml]
0,66
1,32
2,65
5,3
10,6
Rg
[nm]
3,9 ± 0,3
4,0 ± 0,2
4,1 ± 0,1
4,1 ± 0,1
4,5 ± 0,1
Dmax
[nm]
14
14
14
12
16
VPorod
[nm3]
176
182
191
192
210
MW I(0)
[kDa]
116
123
131
136
147
MWPorod
[kDa]
104
107
112
113
123
Die errechneten Molekulargewichte aus der „Vorwärtsstreuung“ ~130 kDa und dem PorodVolumen 112 kDa stellen eine signifikante Erhöhung im Vergleich zu YopM dar. Die Daten
bei sehr kleinen Winkeln wurden zu einer theoretischen Konzentration von 0 mg/ml
extrapoliert und mit den Daten der höheren Konzentrationen zur finalen Kurve
zusammengeführt. Der Vergleich der Streukurve mit der YopM_Core-Kurve zeigte einen
signifikanten Unterschied bei ähnlicher Grundstruktur.
Abbildung 47: Streukurven von YopM_Core und YopM_Core/DDX3_51-418.
Um nun ein Bild des Komplexes in Lösung zu gewinnen, wurde mit Hilfe des Programmes
SASREF (Petoukhov & Svergun 2005) unter Verwendung der YopM_Core Kristallstruktur
und der unter IV.3.3 beschriebenen DDX3_51-418-Modelle nach einer Kombination
gesucht, welche zu den Messwerten passte. Hierzu wurden in verschiedenen Ansätzen
entweder die Komplexkurve alleine oder die Komplexkurve zusammen mit den Einzelkurven
verwendet.
87
IV Ergebnisse
A
B
Abbildung 48: Modell des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418 GASBOR.
Darstellung des Komplexes aus YopM_Core (rot) und DDX3_51-418 (grün) unter Zuhilfenahme des ab initioModells. A: Darstellung der Struktur in kombinierter Ribbon-Repräsentation und Sphärenmodell in drei
unterschiedlichen Perspektiven. Erstellt mit PyMol (Schrödinger LLC, USA). B: Fit des Modells (rote Kurve) zu
den Messwerten (grüne Punkte). Erstellt mittels CRYSOL (Svergun et al. 1995) χ = 1,6.
Abbildung 48 zeigt das Modell des YopM_Core Dimers in Komplex mit dem in IV.3.3
entwickelten DDX3_51-418 ab initio-Modell. Verschiedene Modellierungs-Läufe mit einer
oder drei Kurven brachten das gleiche Ergebnis, welches einen guten Fit von χ = 1,6 zeigt.
Demnach bindet DDX3_51-418 an der Dimer-Kontaktfläche von YopM_Core und der
elongierte Bereich, der wahrscheinlich dem N-Terminus entspricht, interagiert mit der
konkaven Seite von YopM. Ein weiterer Ansatz bestand in der Modellierung des Komplexes
aus dem YopM_Core-Dimer und dem DDX3_51-418 SASREF-Modell aus IV.3.3. Hierzu
wurden ebenfalls mehrere Läufe mit unterschiedlicher Kombination der Messkurven
verglichen.
88
IV Ergebnisse
A
B
Abbildung 49: Modell des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418 SASREF.
Darstellung des Komplexes aus YopM_Core (rot) und DDX3_51-418 (grün und gelb) unter Zuhilfenahme des
SASREF-Modells. A: Darstellung der Struktur in Ribbon-Repräsentation in drei unterschiedlichen Perspektiven.
Erstellt mit PyMol (Schrödinger LLC, USA). B: Fit des Modells (rote Kurve) zu den Messwerten (grüne Punkte).
Erstellt mittels CRYSOL (Svergun et al. 1995) χ = 1,36.
Der Ansatz mit dem SASREF-Modell von DDX3_51-418 zeigt ein sehr ähnliches Bild wie
zuvor bei der Simulation mit dem ab initio Modell. Hierbei ist deutlich zu erkennen, dass der
neu modellierte elongierte N-Terminus an der Dimer-Kontaktfläche bindet und sich in die
konkave Seite von YopM einfügt. Der Fit dieses Modells fiel mit χ = 1,36 sogar noch besser
aus als der des „ab initio-Modells“. Eine Modellierung eines 1:1 Komplexes aus YopM_Core
und DDX3_1-418 mit einem annehmbaren Fit war hingegen nicht erfolgreich.
89
IV Ergebnisse
Abbildung 50: Modell des Komplexes aus YopM_Core Monomer und DDX3_51-418.
Darstellung eines potentiellen Komplexes aus YopM_Core Monomer (rot) und DDX3_51-418 (grün und gelb)
Erstellt mit PyMol (Schrödinger LLC, USA). A: Darstellung des Ansatzes mit dem DDX3_51-418 SASREFModells und korrespondierender Fit χ = 9,6. B: Darstellung des Ansatzes mit dem DDX3_51-418 GASBOR
Modells und korrespondierender Fit χ = 8,3.
Abbildung 50 zeigt den Versuch einen Komplex aus dem monomeren YopM_Core und
DDX3_51-418 darzustellen. Die Simulation konnte kein zusammenhängendes Modell liefern,
das den Messwerten entsprach. Ebenso konnte kein 2:2 oder 1:2 (YopM_Core: DDX4_51418) Modell erstellt werden. Dies bekräftigt die Wahrscheinlichkeit des 2:1 Komplexes.
90
V Diskussion
V Diskussion
Innerhalb der Gattung Yersinia gibt es lediglich drei humanpathogene Arten Y. pestis,
Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica. Alle drei besitzen ein 70 kb großes
Virulenzplasmid pYV genannt, welches für das sogenannte Yop-Virulon codiert (Cornelis et
al. 1998). Dieses System erlaubt den Bakterien im Wesentlichen die Anheftung an die
Wirtszelle mittels Adhäsinen und die Einschleusung von Virulenzfaktoren, den sogenannten
Yops, über ein Typ III Sekretionssystem. Während YopE, YopH, YopO, Yop P und YopT
hochkonserviert in allen drei Spezies sind (bis zu 96 % Sequenzidentität), findet man in
YopM eine deutliche Heterogenität (Boland et al. 1998). Die Unterschiede bei YopM sind in
seiner Architektur begründet. Neben einem hochkonservierten N-Terminus mit zwei AlphaHelices und einem ungeordneten aber konservierten C-Terminus, besitzt YopM einen
repetetiven Bereich mit einer variablen Anzahl an Leucin-reichen Wiederholungen (LRR). Die
Anzahl dieser Repeats reicht von 13 in Y. enterocolitica 8081 (Thomson et al. 2006) bis 21 in
Y. pseudotuberculosis IP32953 (Vieux & Barrick 2011).
YopM ist einer der wichtigsten Virulenzfaktoren in Yersinia spp., obwohl seine tatsächliche
Rolle in der Infektion immer noch unklar ist. Es wurde mit einer Reihe von
Interaktionspartnern in Verbindung gebracht. So bindet es die beiden Kinasen RSK1-4 und
PKN1-3 in einem ternären Komplex und beeinflusst dadurch deren Phosphorylierungsgrad
(McDonald et al. 2003; Hentschke et al. 2010). In einer Vorarbeit wurde bei der
Rekonstruktion des Experiments, das zur Entdeckung von RSK1 und PKN2 als
Bindungspartner für YopM führte, die DEAD-Box Helikase DDX3 als neuer
Interaktionspartner identifiziert. In diesem Experiment wurde ein TAP-getaggtes Konstrukt
von YopM aus Y. enterocolitica WA-314 benutzt, welches 20 LRRs besitzt. YopM ist
scheinbar in der Lage eine Vielzahl an Proteinen zu binden und diese in höher geordnete
Komplexe zu zwingen. Deshalb war es ein Ziel dieser Arbeit durch biochemische und
strukturbiologische Ansätze Hinweise über die Art der Interaktion von YopM mit seinen
Bindungspartnern zu erlangen.
V.1 Struktur von YopM aus Y. enterocolitica WA-314
V.1.1 Aufreinigung von YopM und Translationsstart
In dieser Arbeit sollte die Architektur von YopM_WA-314, welches 20 LRRs besitzt,
analysiert und mit der bekannten Struktur aus Y. pestis 195/P (YopM_195/P) verglichen
werden. Hierzu wurde zunächst wie unter IV.1.1 beschrieben der annotierte ORF aus pYVWA-314 amplifiziert und in den Vektor pET_303 kloniert. Das daraus resultierende 6x Hisgetaggte YopM wurde anschließend in E. coli BL21-AI exprimiert und mittels verschiedener
chromatographischer Methoden gereinigt. Abbildung 10 bis Abbildung 12 zeigen den Verlauf
dieser Aufreinigungen. Während die Ni-NTA-Aufreinigung noch eine sehr große Anzahl an
Unreinheiten
aufzeigte,
konnte
nach
dem
letzten
Reinigungsschritt
mittels
Größenausschlusschromatographie sauberes Protein gewonnen werden. Es zeigte sich
jedoch, dass YopM nach allen Schritten als Doppelbande verblieb. Dies führte dazu, dass
der Translationsstart näher untersucht wurde. Wie in Abbildung 13 dargestellt herrscht auch
bei anderen in den Datenbanken hinterlegten YopM-Proteinen Uneinigkeit um den
Translationsstart. Bereits bei der ersten Beschreibung des yopM-Gens aus Y. pestis KIM5
91
V Diskussion
(Leung & Straley 1989) fiel auf, dass es drei mögliche Startcodons für YopM gibt. Die
Analyse des transkriptionellen Startpunkts ergab ein Protein mit 367 Aminosäuren, das mit
MFINP beginnt. 1996 standen Anne Boland und Kollegen vor dem selben Problem als sie
yopM aus Y. enterocolitica W22703 amplifizierten und sequenzierten (Boland et al. 1996).
Mittels EDMAN-Sequenzierung des in einem Yop-Release-Assay von den Bakterien in den
Überstand sezernierten YopMs konnte gezeigt werden, dass das zweite Startcodon, welches
zu den Aminosäuren MFINP führte der korrekte Translationsstart war. Mit der gleichen
Methode konnte bewiesen werden, dass der tatsächliche Translationsstart von YopM_WA314 dem zweiten Startcodon entspricht. Die Uneinigkeit in den Datenbanken ist vermutlich
auf die fortschreitende Automatisierung der Hochdurchsatzsequenzierung von Bakterien
zurückzuführen, bei der einzelne Gene natürlich nicht in dem Maße detailliert untersucht
werden, wie es in dieser und anderen Arbeiten von Nöten war. Die Umklonierung des yopM
Gens mit dem korrekten Translationsstart führte zur Expression einer einzigen
Proteinspezies, welche sich in einer einzelnen Bande im denaturierenden SDS-Gel zeigte
(Abbildung 14 B).
V.1.2 Kristallisation von YopM
Zu Beginn der Arbeit wurde versucht YopM_WA-314 in Volllänge mit einem 6x C-terminalen
His-Tag zu kristallisieren. Die Untersuchung von 672 Bedingungen in einem initialen Screen
führte lediglich bei einer Bedingung (PACT B12: 0,1 M MES, 0,01 M ZnCl2, 20% w/v
PEG6000, pH 6) zu Kristallen. Es handelte sich um lange dünne Nadeln, die sehr langsam
wuchsen. Auch die Reproduktion dieser Bedingung führte nicht zu Kristallen, die für eine
umfassende röntgenkristallographische Untersuchung geeignet waren.
Als Konsequenz aus diesen Versuchen wurde ein neues N-terminal, und C-terminal
trunkiertes Konstrukt hergestellt, welches lediglich den als strukturiert bekannten Bereich von
Aminosäure 34-481 enthielt (Abbildung 15). Dieses Konstrukt wurde ebenfalls als 6x CT-HisFusionsprotein exprimiert, gereinigt und kristallisiert. Die Suche nach initialen
Kristallisationsbedingungen zeigte schnell wachsende Kristalle bei zahlreichen Bedingungen,
von denen der Großteil Polyethylenglycol als Präzipitanten verwendete. Viele dieser
Bedingungen konnten erfolgreich reproduziert und optimiert werden. Die Untersuchung der
Kristalle mittels Röntgenstrahlung ergab jedoch eine maximale Beugung bis 6 Å. Der
Versuch die physikalische Auflösung durch Reduktion des Lösemittelanteils (Crystal
Dehydration and Salvage Kit, Jena Bioscience, G), die Kristallisation mit Additiven (JBScreen
Plus – Additives, Jena Bioscience, G) oder durch Seeding zu erhöhen blieben erfolglos. Erst
die Verwendung des Konstruktes, welches einen proteolytisch entfernbaren 6x NT-His-Tag
besaß, resultierte in einer Verbesserung der Auflösung bis 3,2 Å. Eine weitere Erhöhung war
nicht möglich. Dies könnte zum einen am hohen Lösemittelgehalt von fast 70 % zum
anderen an der Flexibilität des stark elongierten Moleküls liegen. Die beschriebene
Auflösung reichte jedoch aus, um die Struktur mittels molekularem Ersatz, durch ein
modifiziertes Modell der Kristallstruktur von YopM_195/P [1jl5,(Evdokimov et al. 2001)] zu
lösen.
92
V Diskussion
V.1.3 Struktur von YopM_WA-314 im Kristall und in Lösung
Wie bereits 2001 von Evdokimov et al. beschrieben, stellt YopM eine Besonderheit in der
Superfamilie der LRR-Proteine dar. Es besitzt mit nur 20 bzw. 22 Aminosäuren die kürzeste
Wiederholungseinheit aller Mitglieder der Familie. Diese Besonderheit setzt sich auch in der
Architektur der einzelnen Repeats fort. Während die konkave Seite dieser hufeisenförmigen
Proteine aus β-Faltblattstrukturen besteht, wird die konvexe Seite bei nahezu allen Vertretern
der Spezies durch α-Helices gebildet (Kobe & Deisenhofer 1995). Hier bildet YopM eine
Ausnahme. Ein elongierter Loop, der durch eine Polyprolin II Konformation gebildet wird, tritt
an die Stelle der alpha-helikalen Struktur (Abbildung 51 A und C oben).
Abbildung 51: LRR-Strukturvergleich.
Vergleich der LRR-Architektur von A: YopM_WA-314 und B: Internalin B (Marino et al. 1999). C: Von oben nach
unten: LRR3 aus YopM_WA-314 (20 As), LRR4_YopM_WA-314 (22 As), LRR2 aus InlB. α-Helices (orange), βFaltblätter lila, Loop-Regionen grau. Dargestellt mit USCF Chimera (Pettersen et al. 2004).
Der Unterschied zwischen den einzelnen YopM-Spezies liegt in der Anzahl und
Zusammensetzung dieser Repeats. Im Gegensatz dazu sind die beiden N-terminalen AlphaHelices und ein ungeordneter C-terminaler Bereich identisch. Wie bereits erwähnt, variiert
die Anzahl der Repeats in den bisher bekannten YopMs von 13 in Y. enterocolitica 8081 bis
21 in Y. pseudotuberculosis IP32953 (Vieux & Barrick 2011). Ein Vergleich der einzelnen
Repeats ist in Abbildung 52 dargestellt.
93
V Diskussion
A
B
Y. e.
8081
LRR1
LRR2
LRR3
LRR4
LRR5
LRR6
LRR7
LRR8
LRR9
LRR10
LRR11
LRR12
LRR13
HELELNNLGLSSLPELPPH--L
ESLVASCNSLTELPELPQS--L
KSLQVDNNNLKALSDLPPS--L
EFLAAGNNQLEELPELQNSSFL
KIIDVDNNSLKKLPDLPPS--L
EFLAAGNNQLEELSELQNLPFL
TEIHADNNSLKTLPDLPPS--L
KTLNVRENYLTDLPELPQS--L
TFLDVSDNIFSGLSELPPN--L
YYLDASSNGIRSLCDLPPS--L
VELDVRDNQLIELPALPPH--L
ERLIASLNHLAEVPELPQN--L
KQLHVEHNALREFPDIPES--V
:
: . :
:
20
20
20
22
20
22
20
20
20
20
20
20
20
Y.p.
195/P
Y.e.
WA314
1
2
3
4
5
6,8
7,9
10
11
12
13
14
15
1
2
3
4
5
6
7
8,11,14,17
9,12,15,18
10,13,14,19
20
C
Abbildung 52: Vergleich der LRRs in drei Yersinia-Arten.
A: Alignment der Leucine Rich Repeats in YopM aus Y. enterocolitica 8081 nummeriert von 1-13. Konservierte
Aminosäuren sind hervorgehoben. Nummern der korrespondierenden Repeats in Y. pestis 195/P in rot, Nummern
der korrespondierenden Repeats in Y. enterocolitica WA-314 in grün dargestellt. B: Aufbau und
Zusammensetzung der Repeatstruktur in Y. pestis 195/P C: Aufbau und Zusammensetzung der Repeatstruktur in
Y. enterocolitica WA-314. Ähnliche Repeats durch Nummern bzw. Farben gekennzeichnet.
Beim Vergleich der Repeatstruktur der drei YopMs (YopM_8081; YopM_195/P; YopM_WA314) fällt auf, dass es trotz einer gewissen Degeneration der Aminosäuresequenzen
wahrscheinlich einen evolutionären Vorfahren aller drei Proteine gibt. YopM_195/P kann
durch Replikation der Repeats 6 und 7 aus YopM_8081 hervorgegangen sein. YopM_WA314 zeigt im Vergleich eine Deletion der Repeats 5 und 6 und eine dreifache Replikation der
Repeats 10, 11 und 12. Der jeweils letzte Repeat und der C-Terminus sind wiederum in allen
drei Spezies identisch. Bei näherer Betrachtung von YopM_8081 fällt auf, dass hier ebenso
Repeat-Wiederholungen zu finden sind. Es ist also durchaus möglich, dass es einen
gemeinsamen Vorfahren mit einer noch geringeren Anzahl an LRRs gibt (Vieux & Barrick
2011). Eine Variabilität in Anzahl und Komposition der LRRs wie bei YopM ist keine
Besonderheit. So stellen z.B. Variable Lymphozyt Rezeptoren, als Teil des Immunsystems
einiger kieferlosen Vertebraten, LRR-Proteine mit einer sehr großen Diversität her (Sutoh &
Kasahara 2014; Pancer et al. 2004). Die Variabilität der Zusammensetzung der
Repeatbereiche vermittelt hierbei die Möglichkeit verschiedene Antigene zu binden. Zwar ist
kein unterschiedliches Bindeverhalten verschiedener YopMs zu den bisher entdeckten
Interaktionspartnern bekannt, jedoch ist dies auch nicht ausreichend untersucht.
Neben diesen möglichen, funktionalen Unterschieden gibt es jedoch weitere offensichtliche
strukturelle Abweichungen in der Geometrie der beiden YopM-Orthologe. So ist das
Monomer aus Y. enterocolitica WA-314 deutlich stärker gewunden als das Pendant aus
Y. pestis 195/P. Dies führt zu einer Dislokation des C-alpha Rückgrats um bis zu 16 Å.
94
V Diskussion
Abbildung 53: Vergleich von YopM_Wa-314 mit YopM_195/P.
A: YopM_WA_314 rot, YopM195/P grün. Dargestellt in Ribbon-Repräsentation mit dem Programm PyMol
α
(Schrödinger LLC, USA). B: Abweichung des C -Rückgrats im direkten Aminosäurevergleich.
Ein weiterer interessanter Fakt ist, dass in allen Kristallstrukturen der beiden Orthologe,
Tetramere gefunden wurden. YopM_195/P bildet in der Struktur 1jl5 eine nahezu perfekte
Helix in der zwei Monomere mit ihren C-Termini zusammenhängen und jeweils einen Strang
einer Doppelhelix bilden. Diese Struktur wird durch Ca2+-Ionen stabilisiert, die in hoher
Konzentration im Kristallisationsansatz vorhanden waren. Nichtsdestotrotz wird durch diese
Architektur ein Großteil der hydrophoben Oberfläche des Monomers gebunden. Das
Vorhandensein des Tetramers in Lösung konnte jedoch nicht bewiesen werden (Evdokimov
et al. 2001). Evdokimov und Kollegen mutmaßten anhand eines um fünf Repeats
verlängerten Modells (YopMe20), dass diese Art der Teramerisierung bei YopM_WA-314
aufgrund seiner Architektur und Monomerlänge nicht möglich sei, außer es änderte sich
grundlegend etwas an seiner Geometrie. Interessanterweise ist es tatsächlich möglich, diese
Art der Helix durch Überlagerung der C-Termini der vier Ketten des YopM_195/P-Tetramers
mit vier Monomeren von YopM_WA-314 darzustellen. Dabei entsteht eine weitere Windung
in der Doppelhelix, bei ansonsten gleichbleibender Geometrie (Abbildung 54). Diese
Tatsache ist wohl im grundlegenden Aufbau der LRR-Architektur zu suchen. (Enkhbayar et
al. 2004). Im Gegensatz zu Evdokimovs Resultaten ist diese kunstvolle helikale Struktur
nicht in den Kristallen von YopM_WA-314 aufgetreten. Ob es nun ein Kristallisationsartefakt
aufgrund der hohen Calcium-Konzentration darstellt oder dieses Tetramer tatsächlich in vivo
existiert, kann zu diesem Zeitpunkt nicht nachgewiesen werden. Es findet sich jedoch eine
andere Form von Tetramer in der asymmetrischen Einheit der Kristallstruktur von
YopM_WA-314, bei dem zwei Moleküle über C-terminale Regionen miteinander verknüpft
sind. Die Art dieser Interaktion wurde unter IV.1.4.3 beschrieben und wird weiter unten
diskutiert.
95
V Diskussion
Abbildung 54: Vergleich der Tetramerstrukturen der beiden kristallisierten YopM-Orthologe.
2+
A: YopM_195/P-Tetramer mit stabilisierenden Ca -Ionen. Zwei „End an End“-Dimere umeinander gewunden zu
einer Doppelhelix. Die Helix bildet einen Tunnel mit einem Durchmesser von 35 Å. B: Theoretisches „HelixTetramer“ von YopM_WA-314. C: Tetramer aus YopM_WA-314. Zwei Monomere überlappen an ihren C-Termini
und bilden mit einem weiteren identischen Paar ein Tetramer.
Dargestellt in Ribbon-Repräsentation mit dem Programm PyMol (Schrödinger LLC, USA).
Die Ergebnisse der analytischen Größenausschlusschromatographie sowie der
Untersuchungen mittels dynamischer Lichtstreuung (IV.1.3) legten bereits die Vermutung
nahe, dass es sich bei YopM_Full, YopM_ΔC sowie bei YopM_Core in Lösung nicht um
Monomere handeln konnte: Die ermittelten Molekulargewichte lagen deutlich höher als für
die einzelnen Moleküle erwartet. Die Experimente mittels Röntgenkleinwinkelstreuung
bestätigten dieses Bild. Mit Hilfe der gemessenen Streukurve von YopM_Core und des
Programms SASREF (Petoukhov & Svergun 2005) konnte ein Dimer-Modell erstellt werden,
welches im Wesentlichen der Struktur entspricht, die durch die Ketten A und C bzw. B und D
der Kristallstruktur gebildet wird. In dieser Anordnung interagieren zwei YopM-Monomere auf
eine Fläche von insgesamt 1016 Å2 über 13 Wasserstoffbrückenbindungen und 104
hydrophobe Wechselwirkungen miteinander (Abbildung 27, Abbildung 28, Tabelle 28). Diese
Art der Homodimerisierung ist auch bei Vertretern der kleinen Leucin-reichen Proteoglycane,
einer Untergruppe des Superfamilie der LRR-Proteine bekannt (Scott et al. 2004; Scott et al.
2006). Bei Decorin und Biglycan nimmt die interagierende Region nahezu die gesamte
Fläche der konkaven Seite des LRRs (ca. 2300 Å2) ein, was zu einer sehr starken Bindung
führt. Die Bindung im YopM-Dimer dürfte aufgrund seiner Interaktionsfläche und der Größe
96
V Diskussion
des Proteins nicht ganz so stark sein, jedoch ist es in unterschiedlichsten Puffern auch bei
hohen Salzkonzentrationen stabil. Dies verdeutlicht die Stärke der Bindung.
Abbildung 55: Oberflächendarstellung des YopM-Dimers im Vergleich mit Decorin.
A: Struktur des Decorin-Dimers pdb Code: 1XKU im Vergleich mit B: YopM_Core. Dargestellt in Ribbon- und
Surface Repräsentation mit dem Programm PyMol (Schrödinger LLC, USA).
Die hauptsächlich an der Dimerisierung beteiligten Aminosäuren erstrecken sich von LRR920. Dieser Bereich ist, wie in Abbildung 52 A dargestellt, durch Triplikation der LRRs 10,11
und 12 ausgehend von YopM_8081 entstanden. Aufgrund dessen liegt eine gewisse
Abweichung in der Aminosäuresequenz im Vergleich zu YopM_195/P in diesem strukturellen
Bereich vor (Abbildung 56, Abbildung 57). Dies trifft vor allem auch wichtige, an der Bildung
von stabilisierenden hydrophoben Wechselwirkungen beteiligte Reste.
YopM_WA_314
YopM195/P
VYLDVRDNQLIELPALPSG--LERLIASFNHLAELPELPPNLYYLDASRNEISSLCDLPEYLGVSNNQLEKLPELQNSSFLKIIDVDNNSLKKLPDLPPSLEFIAAGNNQLEELPELQN
**.* :*** :** * .. *: : .. * * :**:***.* :: *..*::..* :*
YopM_WA_314
YopM195/P
-PSLVDLNVRKNQLIELPALPPDLERLIASFNHLAELPELP--PNLSYLDASRNEISSLC
LPFLTAIYADNNSLKKLPDLPLSLESIVAGNNILEELPELQNLPFLTTIYADNNLLKTLP
* *. : . :*.* :** ** .** ::*. * * *****
* *: : *..* :.:*
YopM_WA_314
YopM195/P
DLPPSLVDLNVRKNQLIELPALPPDLERLIASFNHLAELPELPPNLSYLDASRNEISSLC
DLPPSLEALNVRDNYLTDLPELPQSLTFLDVSENIFSGLSELPPNLYYLNASSNEIRSLC
****** ****.* * :** ** .* * .* * :: *.****** **:** *** ***
YopM_WA_314
YopM195/P
DLPPSLVELDVRDNQLIELPALPPHLERLIASLNHLAEVPELPQNLKQLHVEHNALREFP
DLPPSLEELNVSNNKLIELPALPPRLERLIASFNHLAEVPELPQNLKQLHVEYNPLREFP
****** **:* :*:*********:*******:*******************:*.*****
YopM_WA_314
YopM195/P
DIPESVEDLRMD
DIPESVEDLRMN
***********:
Abbildung 56: Alignment der letzten 11 LRRs von YopM_WA-314 und YopM_195/P.
Sequenzvergleich der Interaktionsfläche des YopM_WA-314-Dimers mit der korrespondierenden Region in
YopM_195/P. Die für die Bindung hauptsächlich verantwortlichen Aminosäuren sind in gelb hervorgehoben.
Aminosäureänderungen an diesen Stellen in YopM_195/P sind rot markiert.
Durch Überlagerung des YopM_WA-314-Tetramers mit den C-Termini von vier YopM_195/P
Monomeren lässt sich ein analoges Tetramer von YopM_195P erstellen. Die Analyse der
Kontaktfläche dieses Modells mit PDBsum (Laskowski et al. 1997) ergibt eine deutlich
97
V Diskussion
schwächere Interaktion als bei YopM_WA-314. So werden zwischen den Ketten A und C
statt 13 nur noch eine Wasserstoffbrückenbindung gebildet und statt 104 nichtkovalenten
Bindungen nur noch 50. Natürlich ist dieses Modell sehr theoretisch. Zusammen mit dem
Sequenzvergleich der an der Interaktion in YopM_WA-314 beteiligten Aminosäuren
untermauert es jedoch die These, dass es sich bei der hier vorliegenden Dimerisierung um
eine Besonderheit von YopM_WA-314 handeln könnte. Dies wird zusätzlich durch die
Tatsache unterstützt, dass in der Literatur keinen Hinweis auf Dimerisierung dieses
Orthologs zu finden ist.
Abbildung 57: Kontaktfläche des YopM_WA-314-Dimers.
A: Darstellung der an der Bildung des Dimers beteiligten Aminosäuren in YopM_WA-314 und B: der
korrespondierenden Aminosäuren in einem theoretischen Modell aus Monomeren von YopM_195/P. Dargestellt
in Ribbon- und Stick Repräsentation mit dem Programm PyMol (Schrödinger LLC, USA).
V.2 YopM und Caspase-1
In der Literatur sind mittlerweile eine Reihe putativer Interaktionen von YopM und daraus
möglicherweise resultierende Wirkungen auf die Zielzelle beschrieben. Ein mit sehr großer
Aufmerksamkeit verfolgtes Beispiel dieser Arbeiten ist der von LaRock und Cookson
beschriebene inhibitorische Einfluss von YopM auf Caspase-1 (LaRock & Cookson 2012).
Durch direkte Interaktion des vier Aminosäuren großen Restes YLTD auf Repeat 10
(YopM_195/P) soll Caspase-1 gehemmt werden und der ihr nachgeschaltete Prozess der
Pyroptose unterbunden werden. LaRock und Cookson zeigten ebenso, dass eine Mutation
des involvierten Aspartats zu Alanin den Effekt unterband.
In dieser Arbeit wurden nun drei Proteine auf diesen inhibitorischen Effekt in einem in vitroAssay untersucht, der im Detail in der Publikation beschrieben war. Ein Sequenzvergleich
der das besagte YLTD-Motiv tragenden Repeats ist in Abbildung 29 gezeigt. Demnach trägt
YopM_WA-314 natürlicherweise den als inaktiv beschriebenen Aminosäureaustausch von
Aspartat zu Alanin (YLTA), während die beiden Proteine YopM_8081 und YopM_YPIII den
gewünschten Effekt erzielen sollten. Abbildung 30 zeigt jedoch, dass selbst mit 50 fach
höherer (50 µM) als der minimal beschriebenen Konzentration von 100 nM, keines der
getesteten YopM-Orthologe im Stande war die Caspase zu hemmen, während dies mit dem
kommerziellen Inhibitor gelang. Da die Proteine identisch behandelt wurden wie in der Arbeit
von LaRock und Cookson und auch der Assay 1:1 angesetzt wurde, lässt sich dieses
98
V Diskussion
Ergebnis nur schwer erklären. Es kann aus dieser Arbeit also keine Bestätigung für einen in
vitro-Effekt von YopM_8081, YopM_YPIII und YopM_WA-314 auf Caspase-1 erfolgen.
V.3 YopM und DDX3
DDX3 gehört zur Familie der sogenannten DEAD-Box RNA-Helikasen, die in nahezu allen
Bereichen des RNA-Metabolismus, von Transkription und Translation bis zum Abbau von
RNA, involviert sind (Linder & Jankowsky 2011). Die Mitglieder dieser Familie besitzen alle
eine hochkonservierte Helikase-Kernstruktur die aus zwei Domänen besteht, welche die
Bindestellen für ATP und RNA beinhalten (Caruthers & McKay 2002; Singleton et al. 2007;
Fairman-Williams et al. 2010). Dieser Kern ist umgeben von variablen Strukturen, die die
Spezifität der einzelnen Proteine definieren. Neben den offensichtlichen Funktionen des
RNA-Stoffwechsels wird DDX3 unter anderem eine Rolle bei der antiviralen Immunantwort
zugeschrieben. Interessanterweise ist die Helikase aber ebenso Ziel mannigfaltiger viraler
Manipulation durch z.B. HIV, HCV und Pockenviren (Yedavalli et al. 2004; Ariumi et al. 2007;
Schröder et al. 2008). In Experimenten, die vor dieser Arbeit getätigt wurden, konnte das
Protein YopM aus Y.enterocolitica WA-314 als erster bakterieller Interaktionspartner von
DDX3 identifiziert werden.
V.3.1 Einengung des Bindungsepitops von DDX3
In vorangegangenen Co-Immunopräzipitations-Experimenten konnte gezeigt werden, dass
die Aminosäuren 1-418 (ATPase-Domäne) YopM binden, das Konstrukt 419-660 (HelikaseDomäne) jedoch nicht. Um die Bindungsstelle einzuengen und stabile Expressionskonstrukte
für Röntgenstrukturuntersuchungen zu finden, wurden GST-Pulldowns mit fünf
verschiedenen 6x CT-His getaggten DDX3-Konstrukten und GST-YopM_Full durchgeführt.
Als Negativ-Kontrolle diente in diesem Versuch reines GST, welches aus dem Leervektor
pGEX_4T2 gewonnen wurde. Die in Abbildung 32 dargestellten Ergebnisse zeigen eindeutig,
dass zumindest ein Teil des unstrukturierten Bereiches, der sich N-terminal an die ATPase
Kerndomäne anschließt, notwendig ist um mit YopM zu interagieren. So bindet das Konstrukt
101-418 an YopM, die weitere Trunkierung bis Aminosäure 168 verhindert jedoch die
Interaktion. Dieses Ergebnis ist nicht überraschend, stellen doch die die Kerndomäne
umgebenden N- und C- terminalen Bereiche der DEAD Box Helikasen die variablen und
damit die Spezifität-determinierenden Bereiche dar. So bindet ebenso das K7-Protein,
welches in verschiedenen Pockenviren hochkonserviert ist in einem N-terminalen Bereich
von DDX3, dem Aminosäure Bereich 61-90 (Kalverda et al. 2009). Um zukünftig ein
minimales Bindungsepitop weiter einzugrenzen müssen weitere C-terminale Trunkierungen
von DDX3 getestet werden. Leider konnte ein 6x His getaggtes Konstrukt der Aminosäuren
101-168 nicht in E.coli überexprimiert werden. Die selben Aminosäuren als N-terminales
GST-Fusionsprotein zeigten eine sehr gute Expression, jedoch keine Bindung an YopM.
Dies ist konform mit früheren Beobachtungen, dass ein Tag am N-terminalen Teil von DDX3
die Interaktion mit YopM stört. Dies könnte in einer allgemeinen Änderung der Faltung oder
durch sterische Einflüsse des sehr großen GST-Tags bedingt sein. Folglich könnte zukünftig
die Verwendung anderer Affinitäts-Tags oder neuer Konstrukte, die Teile des ATPase-Kerns
beinhalten weiteren Aufschluss über das Bindungsepitop liefern.
Die Methode des GST-Pulldowns mit E.coli-Lysaten erlaubte die Untersuchung der an der
Interaktion beteiligten Aminossäuren, lässt jedoch keine Schlüsse zu, ob es sich zwischen
YopM und DDX3 tatsächlich um eine direkte Bindung handelt, da im Lysat neben den
99
V Diskussion
überexprimierten Konstrukten zahlreiche weitere E. coli-Kontaminanten vorhanden sind. Um
die direkte Interaktion darzustellen und einen Einblick in die Struktur des N-Terminus zu
gewinnen, mussten stabile Expressionskonstrukte gereinigt und analysiert werden.
V.3.2 Aufreinigung von DDX3 und Struktur in Lösung
Die in IV.3.2. dargestellten Ergebnisse zeigen, dass sich die drei Konstrukte DDX3_1-418,
DDX3_51-418 und DDX3_101-418, die im GST-Pulldown an YopM banden, aus dem E.coliLysat mittels immobilisierter Metall-Affinitätschromatographie reinigen ließen. Darüber hinaus
erwies sich die Proteinlösung in der analytischen Größenausschlusschromatographie und im
DLS als monodisperse Lösung aus monomeren Proteinen. Die dargestellte Analyse durch
SDS-PAGE ergab jedoch auch, dass alle Proteine eine beginnende Degradation aufwiesen.
Für nähere röntgenkristallographische Untersuchungen wurde das Konstrukt DDX3_51-418
gewählt, da es sich stabiler als DDX3_1-418 und DDX3_101-418 zeigte. DDX3_1-418 war
bereits nach wenigen Stunden zum größten Teil abgebaut und DDX3_101-418 begann nach
kurzer Zeit zu oligomerisieren bzw. zu aggregieren.
Die Analyse der Aminosäuren 1-168 von DDX3 in silico lässt vermuten, dass es sich hierbei
um einen hochgradig unstrukturierten Bereich handelt.
Abbildung 58: Analyse des DDX3 N-Terminus.
A: CD-Spektrum eines His-Thrombin getaggten Konstruktes der Aminosäuren 5-167 (Oda et al. 2009). Anteil an
Sekundärstruktur: 10 % α-Helix, 30 % β-Faltblatt, 30 % Random Coil. B: Vorhersage der ungeordneten Bereiche
nach Aminosäureposition mittels psipred (Buchan et al. 2013) C: Strukturvorhersage anhand der
Aminosäuresequenz mittel XtalPred (Slabinski et al. 2007). Schwarze Buchstaben zeigen Loop-Strukturen, rot
Helix-Strukturen. Ungeordnete Bereiche sind unterstrichen.
Auf Grundlage der Daten der Röntgenkleinwinkelstreuung konnten, auf unterschiedliche
Weise, Modelle des DDX3_51-418 Fragments erzeugt werden, die alle eine sehr ähnliche
räumliche Struktur besitzen (Abbildung 35). Der modellierte N-Terminus zeigt sich in einem
elongierten Fragment, welches sich an den globulären ATPase-Kern anschließt. Mit Hilfe des
ITASSER Servers konnte ein sequenzbasiertes Homologiemodell des N-Terminus erstellt
werden. Dieses Modell wurde in vier, ca. 30 Reste umfassende Teile zerlegt, um der
100
V Diskussion
vorhergesagten Flexibilität zu entsprechen und mit Hilfe von SASREF an die Streukurve
angepasst. Das Modell weist eine kurze Helixstruktur auf, die sich an die globuläre Domäne
anschließt und dann über einen elongierten Loop aus dem globulären Teil herausragt.
Dieses Modell ist in guter Übereinstimmung mit der aus dem ab initio-Ansatz entstandenen
Hüllstruktur (Abbildung 59) und den in Abbildung 58 dargestellten Vorhersagen. Es muss
jedoch angemerkt werden, dass aufgrund des hohen Anteils an Random-Loop-Strukturen
eine exakte Darstellung des N-Terminus mittels SAXS nicht möglich ist. Lediglich Lage und
Volumen lassen sich mit hoher Wahrscheinlichkeit abbilden.
Abbildung 59: Vergleich der DDX3_51-418 Modelle.
Überlagerung der aus dem ab initio-Modell entstandenen Oberfläche mit dem aus einem kombinierten ITASSERund SASREF-Ansatz entstandenen DDX3_51-418 Modell. Dargestellt mit USCF Chimera (Pettersen et al. 2004)
in Mesh- und Ribbon Repräsentation. Aminosäuren 51-80 in orange, 81-110 in rot, 111-140 in gelb, 141-167 in
grün und 168-418 in blau.
V.3.3 Direkte Interaktion von YopM und DDX3
Mit reinen Lösungen der aufgereinigten DDX3- und YopM-Konstrukte ließ sich nun die
Interaktion weiter biochemisch charakterisieren. Mittels Thermophorese-Experimenten
(IV.3.4) konnte für die Interaktion von YopM_Full mit DDX3_1-418 eine Kd von 11,9 ± 3,4 µM
und für die Interaktion mit DDX3_51-418 eine Kd von 9,2 ± 0,8 µM ermittelt werden. Dies legt
die Vermutung nahe, dass die ersten 50 Aminosäuren keine Rolle bei der Bindung spielen.
Leider konnten für das Fragment DDX3_101-418 keine stabilen Messwerte erhalten werden,
jedoch zeigte sich in der Tendenz eine geringere Affinität. Dies stellte sich auch in einer
weitaus geringeren Amplitude der Fluoreszenzänderungen dar. Diese Beobachtungen sind
konform mit den Schwierigkeiten bei der analytischen Größenausschlusschromatographie
mit dem Konstrukt. Der Vergleich der Bindungsstärke von YopM_Full und YopM_Core zu
DDX3_1-418 zeigt eine minimale Verschlechterung (11,9:18,1 µM) der Bindungsaffinität des
N- und C-terminal trunkierten YopM_Core Konstruktes. Diese Änderung ist jedoch nicht sehr
aussagekräftig, da es bei den Messungen Schwankungen von bis zu 5 µM gab. Auf eine
Beteiligung der fehlenden Bereiche an der Interaktion kann also nicht geschlossen werden.
Zusammenfassend handelt es sich um eine relativ schwache Bindung, die jedoch nicht
beispiellos in der Familie der LRR-Proteine ist. Zwar kann es hier zu sehr starken Bindungen
im femtomolaren Bereich kommen, wie bei der Hemmung von Ribonuclease A und
Angiotensin durch den plazentalen Ribonuclease Inhibitor RNI (Lee et al. 1989). Die
Bindungsaffinität des zu YopM strukturell sehr homologen Proteins Internalin A aus Listeria
101
V Diskussion
monocytogenes mit E-Cadherin liegt jedoch bei 8 µM (Schubert et al. 2002) und damit sehr
nah an der Bindung von YopM und DDX3.
Mittels Größenausschlusschromatographie (IV.3.5) konnte ein weiterer Nachweis der
direkten Interaktion der beiden Bindungspartner erbracht werden. Zudem diente diese dazu,
monodisperse Komplexe der beiden Proteine herzustellen, welche unabdingbar für
weiterführende Strukturanalysen waren.
V.3.4 Kristallisation des Komplexes
Der initiale Kristallisations-Screen des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418, bei
dem 672 Konditionen im 96 well-Format getestet wurden führte bei einer Bedingung [JCSG+
D2 (0,1 M Hepes pH 7,5; 0,2 M MgCl2; 30 % PEG400)] zu Kristallen. Die Analyse dieser mit
SDS-PAGE und Western Blot zeigte, dass beide Proteine enthalten waren (Abbildung 45).
Die gewachsenen Kristalle waren allerdings sehr klein und keine Einkristalle, was sie für die
Untersuchung mittels Röntgenstrahlung unbrauchbar machte. Die Reproduktion und
Optimierung der Bedingungen mit der Ausgangslösung scheiterte daran, dass der Komplex
über den verhältnismäßig langen Zeitraum den die Kristalle zum Wachsen benötigten in der
Ursprungslösung nicht stabil zu sein schien. Die Proteine degradierten und aggregierten.
Dieser Ansatz sollte jedoch in späteren Experimenten aufgegriffen werden. Vorherige
Versuche mit anderen Konstrukten scheiterten ebenso. Die Kombination aus YopM_Core
und DDX3_1-418 bzw. DDX3_101-418 zeigte eine Reihe von Bedingungen bei denen relativ
schnell, große Kristalle wuchsen. Diese Bedingungen waren denen von YopM_Core sehr
ähnlich und so ergab die Analyse der Kristalle, dass diese nur noch YopM enthielten und das
DDX3-Konstrukt anscheinend in Lösung blieb und degradierte. Hier schien der Komplex also
nicht stabil gewesen zu sein. In weiterführenden Experimenten sollte zukünftig die
Stabilisierung des Komplexes, beispielsweise durch Quervernetzung der Proteine, im Fokus
stehen. Zudem sollte nochmals nach stabileren Expressionskonstrukten von DDX3 gesucht
werden. Ein weiterer erfolgversprechender Ansatz könnte die Ko-Expression beider Proteine
in E. coli sein, da DDX3 im Komplex deutlich stabiler zu sein scheint. Dies hätte gleichzeitig
den Vorteil, dass die zeitintensive Aufreinigung der einzelnen Bindungspartner entfiele und
somit schneller frische Ausgangslösungen für Optimierungsansätze erzeugt werden könnte.
V.3.5 Struktur des Komplexes in Lösung
Im Gegensatz zu den bisher erfolglosen Kristallisationsversuchen des Komplexes konnte ein
sehr glaubhaftes Modell dessen Struktur mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung gewonnen
werden. Der Vorteil dieser Methode liegt auf der Hand: Da die Messung in Lösung stattfindet,
ist es möglich den Komplex unmittelbar vor dem Experiment herzustellen und diesen zu
analysieren, bevor es zu Dissoziationserscheinungen oder Degradationen kommen kann.
Somit sind theoretisch auch Untersuchungen transienter oder eben nicht sehr stabiler
Wechselwirkungen möglich. Die aus den SAXS-Messungen gewonnenen Daten zu Volumen
und Molekulargewicht zeigen eine konstante Erhöhung im Vergleich zu YopM_Core (Tabelle
30; Tabelle 27). Diese Erhöhung ist in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der
Größenausschlusschromatographie und der dynamischen Lichtstreuung (IV.3.5). Hier zeigte
sich durch die Größenanalyse ebenso, dass YopM als Dimer vorlag, DDX3 als Monomer und
der Komplex-Peak ziemlich exakt der Addition dieser Werte entsprach. Dies wurde sowohl
für YopM_Full, als auch für YopM_Core gezeigt. Es deutete darauf hin, dass es sich bei dem
Komplex aus YopM und DDX3 um einen 2:1 Komplex handelte. So ähnelt auch die in
102
V Diskussion
Abbildung 47 dargestellte Streukurve des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418
sehr stark der Kurve von YopM_Core, bei gleichzeitiger Erhöhung von I(0) und damit des
Trägheitsradius. Die Erhöhung ist am extrapolierten Schnittpunkt der Kurve mit der
Y-Achse zu erkennen.
In Kombination mit dem zuvor erhaltenen Modell von DDX3_51-418 war es nun möglich den
Komplex auf Basis des YopM_Core Dimers darzustellen (Abbildung 49). In diesem Modell
bindet DDX3_51-418 mit einem kleinen Teil der globulären Kerndomäne an die durch
Dimerisierung von YopM entstandene, neue Kontaktfläche. Der modellierte elongierte NTerminus ragt in dieser Struktur in die konkave Seite eines der YopM-Proteine. Dieses
Modell zeigt einen sehr guten Fit mit einem Chi-Wert von 1,36 bei sehr guten Messwerten
die wenig Hintergrundrauschen der Kurve zeigten (Abbildung 49 B). Während das Modell
mehrfach mit den Messdaten des Komplexes oder des Komplexes in Kombination mit den
Kurven der einzelnen Proteine reproduziert werden konnte, ließ sich kein Modell mit einem
YopM-Monomer darstellen (Abbildung 50). Dies bekräftigt das 2:1 Modell zusätzlich. Zudem
konnte ein 2:2 Komplex und ein 1:2 Komplex ausgeschlossen werden. Eine detailliertere
Analyse des Interface des N-Terminus von DDX3_51-418 mit YopM auf Ebene einzelner
Aminosäuren ist anhand des Modells jedoch nicht möglich, da aufgrund des hohen Anteils
an Random Coil-Struktur eine gewisse Variabilität in diesem Bereich vorliegt. Versuche den
Bereich mit einem flexiblen Teil des N-Terminus zu modellieren, brachten kein einheitliches
Ergebnis. Um hier weitere Einblicke in die exakte Kontaktfläche zu erhalten ist eine
hochauflösende Kristallstruktur erforderlich. Nichtsdestotrotz ist der Nachweis, dass YopM
DDX3 als Dimer bindet, hochinteressant: Zwar deuteten die Ergebnisse des
Sequenzvergleichs der Bindungsfläche von YopM_WA-314 mit YopM195/P an, dass es sich
bei der beschriebenen Art der Dimerisierung um eine Besonderheit von YopM_WA-314
handelt, es ist jedoch nicht auszuschließen, dass auch die anderen YopM_Orthologe zur
Homo-Dimerisierung fähig sind. Dies ist zukünftig ebenso zu untersuchen, wie die Fähigkeit
anderer YopM-Spezies DDX3 zu binden. So könnte die durch Triplikation der LRRs 10-12
entstandene neue Kontaktfläche in YopM_WA-314 ebenso die exklusive Bindung zu DDX3
vermitteln.
Wie bereits zu Beginn erwähnt, sind für YopM mittlerweile eine Reihe unterschiedlicher
Interaktionspartner in der Literatur beschrieben (Hines et al. 2001; Reisner & Straley 1992;
LaRock & Cookson 2012). Im Falle der Interaktion mit den beiden Kinasen RSK1 und PKN2
(McDonald et al. 2003) ist zudem gezeigt, dass YopM diese durch gleichzeitige Bindung in
einen neuen, ternären Komplex bringt, in dem eine gegenseitige Phosphorylierung
stattfindet. In unveröffentlichten Experimenten, die parallel zur vorliegenden Arbeit gemacht
wurden, konnte dies mit Y. enterocolitica WA-314 bestätigt werden. Darüber hinaus wurde
zudem nachgewiesen, dass YopM in diesem System in der Lage war gleichzeitig RSK1 und
DDX3 zu binden (Schnapp, unveröffentlicht). Die Fähigkeit von YopM ein Dimer zu bilden
und als solches mehrere Proteine in einen Komplex zu zwingen, könnte hierfür eine gute
Erklärung liefern. Dies untermauert eindrucksvoll den Status von YopM als Gerüstprotein.
Die Zusammenführung unterschiedlichster Zielproteine in vorher unbekannte Komplexe
bestimmt die Relevanz von YopM in der Infektion von Yersinia spp. Die Aufklärung der
daraus resultierenden Effekte auf die Wirtszelle kann schließlich zu einem besseren
Verständnis der Pathogen-Wirts-Interaktion führen.
103
VI Zusammenfassung
VI Zusammenfassung
Enteropathogene Bakterien der Gattung Yersinia haben die Fähigkeit entwickelt in
lymphatischem Gewebe zu persistieren. Um der Abwehr des Wirts zu entgehen, haben diese
Erreger ein sogenanntes Typ-III-Sekretionssystem entwickelt, mit dessen Hilfe sie eine
Reihe von Immunmodulatoren, wie das in dieser Arbeit untersuchte YopM, direkt in
Zielzellen wie Makrophagen injizieren. YopM-defiziente Yersinia-Mutanten haben kaum
Überlebenschancen im Mausmodell (Kerschen et al. 2004). YopM wird mit einer Reihe
immunmodulierender Effekte, wie der Stimulation oder der Hemmung der Ausschüttung von
Interleukinen (Kerschen et al. 2004), oder der Aktivierung von Kinasen (McDonald et al.
2003) in Verbindung gebracht. Mehrere Interaktionspartner von YopM, extrazelluläre wie
auch intrazelluläre, wurden beschrieben (Reisner & Straley 1992; Heusipp et al. 2006;
McDonald et al. 2003; LaRock & Cookson 2012). Einer dieser Interaktionspartner ist die
DEAD-Box-Helikase DDX3 (Hentschke et al. unveröffentlicht). YopM zeigt selbst in
unterschiedlichen Serotypen ein- und derselben Art eine beträchtliche Variabilität v.a. in der
Anzahl seiner „Leucine Rich Repeats“ (LRRs), die bei den bisher bekannten Formen von 13
bis 21 reichen kann. YopM aus Y. pestis 195/P (YopM_195/P) besteht aus 15 LRRs und das
in dieser Arbeit untersuchte YopM aus Y. enterocolitica WA-314 (YopM_WA-314) besitzt 20
LRRs.
Ziel dieser Arbeit war es I) YopM_WA-314 in Lösung allein und nach seiner Interaktion mit
DDX3 durch „small angle X-ray scattering“ (SAXS) zu untersuchen; II) YopM_WA-314 zu
kristallisieren, um es in die niedrig aufgelösten SAXS-Strukturen modellieren zu können; III)
die Proteinbereiche sowohl in YopM als auch in DDX3 zu identifizieren, die für die Interaktion
dieser beiden Proteine essentiell sind.
Die Kristallstruktur von YopM_WA-314, die in der vorliegenden Arbeit gelöst wurde, zeigte,
wie die Kristallstruktur von YopM_195/P, ein Tetramer. Dieses unterscheidet sich jedoch
grundlegend von der YopM_195/P-Doppelhelixstruktur. Die Strukturanalyse des YopM_WA314 ergab, dass das Kristall-Tetramer aus zwei physiologischen Dimeren besteht. Über eine
Kontaktfläche von ca. 1000 Å2 interagieren hierbei zwei Monomere C-terminal über ihre
konkave Seite. Die Bindung wird durch 13 Wasserstoffbrückenbindungen und 104
hydrophobe Wechselwirkungen vermittelt. Auf Grundlage dieser Daten konnte die Interaktion
von YopM mit DDX3 näher charakterisiert werden. Hierbei handelt es sich um eine direkte,
mäßig affine Bindung mit einer Kd von ~12 μM. Durch GST-Pulldown-Experimente konnte
ermittelt werden, dass der flexible, unstrukturierte N-terminus der ATPase-Domäne von
DDX3 unabdingbar für die Komplexbildung mit YopM ist. Die Analyse der Interaktion mittels
analytischer Größenausschlusschromatographie und Röntgenkleinwinkelstreuung zeigte,
dass der Komplex aus dem zuvor beschriebenen YopM-Dimer besteht, welches an der Cterminalen Dimerisierungsfläche ein Monomer von DDX3 bindet. Hierbei ragt der N-Terminus
von DDX3 in die konkave Seite eines der YopM-Monomere und stabilisiert die Bindung.
Diese Arbeit konnte somit die neue Kristallstruktur von YopM aus Y. enterocolitica WA-314
liefern und zum ersten Mal eine YopM-Struktur in Lösung präsentieren. Ebenso konnte mit
Hilfe von SAXS ein sehr glaubhaftes Modell des Komplexes aus YopM und DDX3 erstellt
werden. Die Art der hier dargelegten 2:1 Interaktion könnte eine Erklärung dafür liefern, wie
YopM in der Lage ist, mehrere Proteine gleichzeitig zu binden und sie, wie für die auch
interagierenden Kinasen RSK1 und PKN2 nachgewiesen, in einen ternären Komplex zu
104
VI Zusammenfassung
zwingen. Die Analyse der Auswirkung dieser Verbindungen auf die Wirtszelle könnte dabei
helfen weiter Licht in die rätselhafte Rolle YopMs in der Yersinien-Infektion zu bringen.
VIa Summary
Enteropathogenic bacteria of the genus Yersinia are able to persist in lymphatic tissues. To
evade killing by the host immune system, the bacteria have developed a so called type III
secretion system (TTSS). This system enables the bacteria to inject immune modulators like
YopM into target cells like macrophages.
YopM plays a major role in virulence in the mouse model and is said to reduce cytokine
expression (Kerschen et al. 2004) but its mode of action remains enigmatic. Besides the so
far unknown function, many extracellular and intracellular interaction partners for the protein
could be described (Reisner & Straley 1992; Heusipp et al. 2006; McDonald et al. 2003;
LaRock & Cookson 2012). One of these interaction partners is the DEAD box helicase DDX3
(Hentschke et al. unpublished).
While most of the other Yops are highly conserved among species and serotypes, YopM
displays certain variations in size and sequence. These differences are due to its variable
number of Leucine Rich Repeats (LRRs) which differs from 13 to 21 in known species. YopM
from Y. pestis 195/P (YopM_195/P) has 15 LRRs while YopM from Y. enterocolitica WA-314
(YopM_WA-314) which has been examined in this work consists of 20 LRRs.
The aim of this study was to I) characterize YopM_WA-314 alone and together with DDX3 in
solution via small angle X-ray scattering (SAXS); II) to crystallize YopM_WA-314 as a basis
for modelling the complex into the low resolution structure; III) to identify the regions in both
proteins that are essential for the interaction.
The crystal structure of YopM_WA-314 that was solved in this work shows a tetramer in the
asymmetric unit. This tetramer dramatically differs from the one found in Y. pestis. SAXS
revealed that this tetramer is built by two physiological dimers. In these dimers two
monomers overlap in a C-terminal region of ~1000 Å2. The dimer is stabilized by 13
hydrogen bonds and 104 non bonded interactions. Upon the basis of this structure the
interaction of YopM and DDX3 could be further characterized. YopM binds DDX3 directly
with moderate affinity with a Kd of ~12 µM. Via GST pulldown experiments it could be
demonstrated that the N-Terminus of the Helicase is necessary for establishing the complex.
The analysis of the complex with size exclusion chromatography and SAXS revealed that the
YopM dimer binds a monomer of DDX3. In this model the globular domain-1 of DDX3 binds
to the C-Terminal dimerization site of YopM and the N-terminus of DDX3 extends into the
concave site of one YopM and stabilizes the complex. Thus this work presents the novel
structure of YopM from Y. enterocolitica WA-314 and for the first time a structure of YopM in
solution. Furthermore it is the first time that a reasonable model of the complex of the protein
and a binding partner (DDX3) could be established. This 2:1 binding mode of YopM could
deliver an explanation for how it deals with the parallel binding of two interaction partners that
leads to the formation of a ternary complex, as described in the case of RSK1 and PRK2.
The analysis of the influences those interactions might have on the host cells should help to
shed light on the enigmatic role of YopM in Yersinia infection.
105
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125
VIII Tabellenverzeichnis
VIII Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Geräte.................................................................................................................................. 23
Tabelle 2: Verbrauchsmittel ............................................................................................................... 24
Tabelle 3: Kits, Enzyme und Reagenzien .......................................................................................... 25
Tabelle 4: Wachstumsmedien ............................................................................................................ 26
Tabelle 5: Antibiotika, Zusätze ........................................................................................................... 27
Tabelle 6: Chemisch-kompetente E.coli ........................................................................................... 27
Tabelle 7: Proteinaufreinigung........................................................................................................... 27
Tabelle 8: Chemikalien und Zusätze.................................................................................................. 29
Tabelle 9: Elektrophorese und Western Blot .................................................................................... 29
Tabelle 10: SDS-Polyacrylamidgele................................................................................................... 30
Tabelle 11: GST-Pulldown .................................................................................................................. 30
Tabelle 12: MST-Puffer ........................................................................................................................ 31
Tabelle 13: Caspase Assay ................................................................................................................ 31
Tabelle 14: E. coli-Stämme ................................................................................................................. 32
Tabelle 15: Yersinia-Stämme.............................................................................................................. 32
Tabelle 16: Plasmide zur prokaryotischen Proteinexpression ....................................................... 32
Tabelle 17: Plasmide zur eukaryotischen Proteinexpression ........................................................ 33
Tabelle 18: Expressionskonstrukte ................................................................................................... 33
Tabelle 19: Oligonukleotide ................................................................................................................ 35
Tabelle 20: Software ............................................................................................................................ 38
®
Tabelle 21: PCR-Ansatz GoTaq ........................................................................................................ 42
®
Tabelle 22: PCR-Programm GoTaq .................................................................................................. 42
Tabelle 23: PCR-Ansatz Phusion-Polymerase ................................................................................. 42
Tabelle 24: PCR-Programm Phusion ................................................................................................. 43
Tabelle 25: YopM_Core: Datensammlung und Refinement ............................................................ 62
Tabelle 26: Intermolekulare Wechselwirkungen des YopM-Tetramers ......................................... 64
Tabelle 27: Ergebnisse der SAXS Messung von YopM_Core ......................................................... 66
Tabelle 28: Wasserstoffbrückenbindungen des YopM-Dimers ...................................................... 69
Tabelle 29: Ergebnisse der SAXS-Messung von DDX3_51-418 ...................................................... 76
Tabelle 30: Ergebnisse der SAXS-Messung des Komplexes YopM_Core/DDX3_51-418 ............ 87
126
IX Abbildungsverzeichnis
IX Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Genomvergleich von Y. enterocolitica WA-314 und 8081 (Garzetti et al. 2012). ......... 8
Abbildung 2: Karte des Y. enterocolitica WA-314 Virulenzplasmids (Oberhettinger et al. 2011). ... 10
Abbildung 3: Aufbau des Typ III-Sekretionssystems. ..................................................................... 11
Abbildung 4: Vergleichende Sekundärstruktur von LRR-Proteinen. ............................................. 17
Abbildung 5: YopM_195/P Monomerstruktur. .................................................................................. 18
Abbildung 6: YopM_195/P Kristall-Tetramer. ................................................................................... 19
Abbildung 7: Strukturelle Komposition der DEAD-Box-Helikase DDX3 (Högbom et al. 2007). ...... 20
Abbildung 8: Protein und DNA-Leitern. ............................................................................................ 31
Abbildung 9: Kalibrierungsgerade Superdex 200 10/300 GL. ......................................................... 47
Abbildung 10: Ni-NTA Aufreinigung von 6x CT-His YopM. ............................................................. 54
Abbildung 11: Ionenaustauschchromatographie von YopM. ......................................................... 55
Abbildung 12: Größenausschlusschromatographie von YopM. .................................................... 55
Abbildung 13: Sequenzvergleich ausgewählter YopM-Proteine. ................................................... 56
Abbildung 14: Experimentelle Analyse des Translationsstarts von YopM. .................................. 57
Abbildung 15: Annotierte Aminosäuresequenz von YopM ............................................................. 57
Abbildung 16: Analytische Größenausschlusschromatographie von YopM. ............................... 58
Abbildung 17: Dynamische Lichtstreuung von YopM. .................................................................... 59
Abbildung 18: Kristalle von YopM_Full............................................................................................. 60
Abbildung 19: Initiale Kristallisationsscreens von YopM_Core. .................................................... 61
Abbildung 20: Optimierungsansätze für YopM_Core. ..................................................................... 62
Abbildung 21: Ramachandran-Plot für YopM. .................................................................................. 63
Abbildung 22: YopM-Moleküle in der Einheitszelle. ........................................................................ 64
Abbildung 23: Struktur und Topologie des YopM-Monomers. ....................................................... 65
Abbildung 24: SASREF-Modell von YopM_Core. ............................................................................. 66
Abbildung 25: Fit des YopM-Monomers mit den SAXS-Messdaten. .............................................. 67
Abbildung 26: Überlagerung des Kristalldimers mit dem ab initio-Modell. .................................. 67
Abbildung 27: Übersicht der Kontakte zwischen den Ketten A und C bzw. B und D der
tetrameren Kristallstruktur. ........................................................................................................ 68
Abbildung 28: Interfaceregion zwischen dem YopM-Dimer. .......................................................... 69
Abbildung 29: Aufreinigung von YopM aus Y. enterocolitica WA-314, 8081 und Y.
pseudotuberculosis YpIII ............................................................................................................ 70
Abbildung 30: Caspase-1 Assay ........................................................................................................ 71
Abbildung 31: Kristallstruktur der konservierten Domänen 1 und 2 von DDX3. .......................... 72
Abbildung 32: Pulldown von His-DDX3 mittels GST-YopM. ........................................................... 73
Abbildung 33: Analytische Größenausschlusschromatographie von DDX3. ............................... 74
Abbildung 34: Dynamische Lichtstreuung von DDX3. .................................................................... 75
Abbildung 35: Modelle von DDX3_51-418. ........................................................................................ 77
Abbildung 36: Ergebnis der MST von DDX3_1-418 mit YopM_Full bzw. YopM_Core. ................. 78
127
IX Abbildungsverzeichnis
Abbildung 37: Ergebnis der MST von DDX3_51-418 mit YopM_Full bzw. YopM_Core. ............... 79
Abbildung 38: Vergleich der Bindungsaffinitäten. ........................................................................... 79
Abbildung 39: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus YopM_Full
und DDX3_1-418. ......................................................................................................................... 80
Abbildung 40: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus YopM_Full
und DDX3_51-418. ....................................................................................................................... 81
Abbildung 41: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus YopM_Full
und DDX3_101-418. ..................................................................................................................... 82
Abbildung 42: Analytische Größenausschlusschromatographie des Komplexes aus
YopM_Core und DDX3_1-418. .................................................................................................... 83
Abbildung 43: DLS von YopM_Core und YopM_Core/DDX3_51-418. ............................................ 84
Abbildung 44: Kristalle des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418. ............................... 85
Abbildung 45: Analyse der Komplexkristalle. .................................................................................. 85
Abbildung 46: Überprüfung der Proteinlösung. ............................................................................... 86
Abbildung 47: Streukurven von YopM_Core und YopM_Core/DDX3_51-418. .............................. 87
Abbildung 48: Modell des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418 GASBOR. ................. 88
Abbildung 49: Modell des Komplexes aus YopM_Core und DDX3_51-418 SASREF. .................. 89
Abbildung 50: Modell des Komplexes aus YopM_Core Monomer und DDX3_51-418. ................ 90
Abbildung 51: LRR-Strukturvergleich. .............................................................................................. 93
Abbildung 52: Vergleich der LRRs in drei Yersinia-Arten. ............................................................. 94
Abbildung 53: Vergleich von YopM_Wa-314 mit YopM_195/P. ...................................................... 95
Abbildung 54: Vergleich der Tetramerstrukturen der beiden kristallisierten YopM-Orthologe. . 96
Abbildung 55: Oberflächendarstellung des YopM-Dimers im Vergleich mit Decorin. ................. 97
Abbildung 56: Alignment der letzten 11 LRRs von YopM_WA-314 und YopM_195/P. ................. 97
Abbildung 57: Kontaktfläche des YopM_WA-314-Dimers. .............................................................. 98
Abbildung 58: Analyse des DDX3 N-Terminus. .............................................................................. 100
Abbildung 59: Vergleich der DDX3_51-418 Modelle. ..................................................................... 101
128
X Abkürzungsverzeichnis
X Abkürzungsverzeichnis
<
>
°C
µg
µl
µm
µM
A
Abb
Amp
APS
As
ATP
bp
BSA
C
CaCl2
ca.
CC
CD
cDNA
Cm
cm
d
Da
dd
dH2O
d.h.
DLS
Dmax
DMSO
DNA
dNTP
DTT
E. coli
EDTA
EGTA
et al.
FD
G
g
g
GDP
GFP
GST
GTP
h
HA
kleiner als
größer als
Grad celsius
Mikrogramm
Mikroliter
Mikrometer
mikromolar
Adenin
Abbildung
Ampicillin
Ammoniumpersulfat
Aminosäure
Adenosintriphosphat
Basenpaar (basepair)
Bovine Serum Albumin
Cytosin
Calciumchlorid
circa
Coiled-coil
Zirkularer Dichroismus (Circular Dichroism)
copy DNA
Chloramphenicol
Zentimeter (centimeter)
Tag (day)
Dalton
doppelt destilliert (double distilled)
destilliertes Wasser (distilled water)
das heißt
Dynamische Lichtstreuung (dynamic light scattering)
maximaler Durchmesser
Dimethylsulfoxid
Deoxyribonucleic acid
Deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Dithiothreitol
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure (ethylenediamine tetra-acetic acid)
(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N‘, N‘-tetraacetic acid
und andere (lat.: „et alteri“)
fast digest
Guanin
Gramm
relative Zentrifugalkraft (relative centrifugal force)
Guanosindiphosphat
Green fluorescent protein
Glutathion-S-transferase
Guanosintriphosphat
Stunde (hour)
Hemagglutinin, Peptidsequenz YPYDVPDYA
129
X Abkürzungsverzeichnis
H-Brücken
HRP
I(0)
IFN-β
IL
IP
IPTG
Kan
kbp
Kd
kDa
l
LB
Wasserstoffbrücken
Horseradish peroxidase
Vorwärtsstreuung
Interferon-beta
Interleukin
Immunoprezipitation
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid
Kanamycin
Kilo-Basenpaare (kilo base pairs)
Dissoziationskonstante
Kilodalton
Liter
Luria broth (Luria-Bertani)
LPS
M
MALDI
MBP
mA
MCS
mg
MES
min
ml
mM
mRNA
MS
MW
ms
ng
nM
NO
OD
ON
ORF
PAGE
PBS
PBST
PCR
pI
pM
pmol
PMSF
PP
Rac
Rg
Rh
RhoA
RNA
rpm
RT
RT-PCR
s
Lipopolysaccharid
molar
matrix assisted laser desorption/ionisation
Maltose binding protein
Milliamper
Multiple Cloning Site
Milligram
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
Minute
Milliliter
millimolar
messenger-RNA
Massenspektroskopie
Molekulargewicht (molecular weight)
Millisekunde
Nanogramm
nanomolar
Stickoxid (nitric oxide)
Optische Dichte
über nacht (over night)
offener Leserahmen (open reading frame)
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
phosphate buffered saline
PBS mit Tween-20
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
isoelektrischer Punkt
pikomolar
Pikomol
Phenylmethylsulfonylfluorid
Polyprolin
Ras-related C3 botulinum toxin substrate
Trägheitsradius (radius of gyration)
hydrodynamischer Radius
Ras homolog gene family, member A
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)
Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
Raumtemperatur
Reverse Transkriptase PCR
Sekunde
130
X Abkürzungsverzeichnis
SAXS
SD
SDS
T
TAE
Taq
TBS
TBST
TEMED
Tet
TFA
TfB
TLR
Tris
TTSS
U
UV
V
Y
Yop
Röntgenkleinwinkelstreuung (small angle X-ray Scattering)
Standardabweichung (standard deviation)
Natriumlaurylsulfat (sodium dodecylsulfat)
Thymin
Tris-Acetat-EDTA
Thermus aquaticus
Tris buffered saline
TBS mit Tween-20
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
Tetracyclin
Trifluoressigsäure
Transformationspuffer (transfrmation buffer)
toll like receptor
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane
Typ drei Sekretionssystem (type three secretion system)
Uracil
Ultraviolett
Volt
Yersinia
Yersinia outer (membrane) protein
131
XI Danksagung
XI Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. Martin Aepfelbacher für die Vergabe des
interessanten Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes, die produktiven Diskussionen
und sein ständiges Interesse am Fortschreiten dieser Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Streit danke ich für die freundliche Bereitschaft zur Begutachtung
dieser Arbeit am Fachbereich Biologie.
Mein Dank gilt auch Prof. Dr. Dr. Christian Betzel für die Ermöglichung der Arbeiten zur
Strukturaufklärung YopMs am Laboratorium für Strukturbiologie von Infektion und
Entzündung, sowie für die Bereitschaft zur Begutachtung der Disputation.
Prof. Dr. Julia Kehr danke ich für die Übernahme des Vorsitzes meiner Disputation.
Ganz besonderer Dank geht an PD Dr. Markus Perbandt für seine ständige Hilfe und
Unterstützung meiner Arbeit, aufbauende Worte, konstruktive Diskussionen (auch mal über
Fußball) und nicht zuletzt die tolle Organisation von SDI.
Prof. Dr. Hartmut Schlüter und Dr. Marta Kotasinska danke ich für die zahlreichen Tipps bei
der Proteinaufreinigung und die freundliche Bereitstellung der „Äkta-Facility“.
PhD Alexey Kikhney danke ich für die riesige Geduld bei der Auswertung auch mal nicht so
perfekter SAXS-Daten.
PD Dr. Moritz Hentschke danke ich für die guten Ideen und Vorarbeiten, besonders zu
Beginn meiner Arbeit.
Danken möchte ich auch allen SDI-Kommilitonen für die schöne Zeit und die spannenden
Diskussionen unter „Leidensgenossen“.
Ein riesiger Dank geht auch an das gesamte Institut für Medizinische Mikrobiologie, alle
aktuellen und ehemaligen Mitarbeiter, für die super Arbeitsatmosphäre, die freundliche
Stimmung, zahlreiche unterhaltsame Kaffeepausen, Feierabendbiere, Festivalbesuche,
Konzerte und Wochenendveranstaltungen. Einfach für alles innerhalb und außerhalb des
Labors, was diese Arbeit so angenehm gemacht hat. Besonders danke ich hierbei natürlich
auch den aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der AG Ae: Kirsten Hennings (Wirbelwind),
Liane Rauch (Labor-Oberaufseher), Manuel Wolters (Dr. Evil), Stefan Veltel (PreußenMünster), Kerstin Lardong (Kristoffffer), Claudia Trasak (CT-Only), Franzi Krawack (Pfeffi),
Laura Berneking (Dr. Laura), Anja Röder (Modern Talking), Marie Schnapp (Amerikaner) und
allen anderen für ein inspirierendes Arbeitsumfeld und einen entspannten Laboralltag.
Bernd Zobiak danke ich für ein herzliches Willkommen in Hamburg, die vielen gemeinsamen
Unternehmungen seit wir uns kennengelernt haben und das ständige Aufmuntern auch in
schwierigen Phasen der Doktorarbeit.
132
XI Danksagung
Besonders möchte ich natürlich meiner Familie, insbesondere meinen Eltern danken, die
meinen gesamten Lebensweg erst ermöglichten und mich immer unterstützt haben.
Yvonne möchte ich einfach für alles danken, die ständige Unterstützung, riesige Geduld und
für unser tolles gemeinsames Leben. Ohne Dich hätte ich es nicht geschafft.
133
XII Vorveröffentlichungen
XII Vorveröffentlichungen
Poster mit Teilen des Inhalts dieser Arbeit wurden präsentiert bei:
SDI Summer School, Hamburg (01.07.-03.07.11)
3rd National Yersinia Meeting, Tübingen (13.-14.7.2012)
64. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM),
Hamburg (30.09.-03.10.2012)
134
XIII Eidesstattliche Versicherung
XIII Eidesstattliche Versicherung
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift selbst verfasst
und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Hamburg, 30.05.2014
____________________________
Andreas Rumm
135