Dissertation kuenzle Vers2 1 - ETH E-Collection
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Diss. ETH Nr.18031 Verunreinigungsprofil und Stabilität von Aminosäuren diverser Herkunft ABHANDLUNG Zur Erlangung des Titels DOKTOR DER WISSENSCHAFTEN der ETH ZÜRICH vorgelegt von URS KÜNZLE eidg. dipl. Apotheker geboren am 26. September 1970 Bürger von Waldkirch SG Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. P. A. Schubiger, Referent Prof. Dr. H. Altorfer, Korreferent Prof. Dr. R. Schibli, Korreferent Dr. I. Werner, Korreferent 2008 Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassungen ........................................................................................ 1 1.1. Abstract in English ....................................................................................... 1 1.2. Zusammenfassung in Deutsch.................................................................... 2 2. Problemstellung ................................................................................................. 4 3. Aminosäuren in der Pharmakopöe ................................................................... 6 3.1. Allgemeiner Teil ............................................................................................ 6 3.1.1. Aminosäuren.......................................................................................... 6 3.1.2. Struktur und Klassifikation der Aminosäuren ......................................... 7 3.1.3. Aminosäuren - Geschichtlicher Hintergrund .......................................... 8 3.1.4. Aminosäuren – pharmazeutische Bedeutung ...................................... 10 3.1.5. Industrielle Herstellung von Aminosäuren ........................................... 11 3.1.6. Fermentation........................................................................................ 12 3.1.7. Direkte Fermentation ........................................................................... 13 3.1.7.1. Fermentationsprozess .................................................................. 13 3.1.7.2. Grobisolierung .............................................................................. 13 3.1.7.3. Reinigung ..................................................................................... 13 3.1.8. Fermentation mit Vorstufen ................................................................. 14 3.2. Aminosäuremonographien in der Pharmakopöe..................................... 14 3.2.1. Überarbeitung der Monographien ........................................................ 16 3.2.2. Verunreinigungsprofil von Aminosäuren .............................................. 16 3.2.3. Stoffklassen ......................................................................................... 18 3.3. Aminosäuren und Derivate ........................................................................ 19 3.3.1. HPLC Methode mit Vorsäulenderivatisierung ...................................... 19 3.3.2. Derivatisierung mit Dabsyl-Cl............................................................... 20 3.3.3. Derivatisierung mittels UPLC und ACCQ-Tag ..................................... 21 3.3.4. Derivatisierung mit FMOC-Cl ............................................................... 22 3.3.4.1. Geräte und Materialien ................................................................. 22 3.3.4.2. Methodenentwicklung ................................................................... 23 3.3.4.2.1 Derivatisierung ........................................................................... 23 3.3.4.2.2 Extraktion mit n-Pentan ............................................................. 26 3.3.4.2.3 Trennung und Detektion der derivatisierten Aminossäuren ....... 27 3.3.4.2.4 Bestimmung der Messabweichung der Methode ....................... 29 3.3.4.3. Probenvorbereitung und Methode ................................................ 30 3.3.4.4. Resultat der Untersuchungen auf Aminosäuren und Derivate ...... 30 3.3.4.4.1 Untersuchung von 19 Aminosäuren........................................... 30 3.3.4.4.2 Untersuchung von 19 Chargen Isoleucin ................................... 50 3.3.4.4.3 Untersuchung von 15 Chargen Phenylalanin ............................ 53 3.3.4.4.4 Untersuchung von 11 Chargen Serin......................................... 56 3.4. Flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittel-rückstände ................. 60 3.4.1. Headspace GC-MS von Aminosäuren ................................................. 61 3.4.1.1. Geräte und Materialien ................................................................. 61 3.4.1.2. Methodenentwicklung ................................................................... 61 3.4.1.3. Probenvorbereitung und Methode ................................................ 65 3.4.1.4. Resultat der Untersuchungen auf flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände ................................................................................ 65 3.4.1.4.1 Unbehandelte Aminosäuren ...................................................... 70 3.4.1.4.2 Wärmebehandelte Aminosäuren ............................................... 70 3.4.1.4.3 e-- und γ-behandelte Aminosäuren ............................................ 70 3.5. Kohlenhydrate ............................................................................................ 72 3.5.1. Dünnschichtchromatographie .............................................................. 72 3.5.1.1. Geräte und Materialien ................................................................. 72 3.5.1.2. Methodenentwicklung ................................................................... 73 3.5.1.2.1 Löslichkeitsversuche.................................................................. 73 3.5.1.2.2 Wahl des optimalen Sprühreagenz ............................................ 73 3.5.1.2.3 Fliessmitteloptimierung .............................................................. 73 3.5.1.2.4 Beladungsgrenze ....................................................................... 76 3.5.1.2.5 Nachweisgrenze ........................................................................ 77 3.5.1.2.6 Detektionsgrenze ....................................................................... 77 3.5.1.3. Probenvorbereitung und Methode ................................................ 77 3.5.1.4. Resultat der Untersuchungen auf Kohlenhydrate ......................... 78 3.5.2. HPLC mit Brechzahldetektor................................................................ 78 3.5.3. HPLC mit UV-Detektion bei 210 nm .................................................... 78 3.5.4. Schnelltest auf Glucose in Aminosäuren ............................................. 79 3.6. Antibiotika ................................................................................................... 81 3.6.1. Dünnschichtchromatographie .............................................................. 81 3.6.1.1. Geräte und Materialien ................................................................. 81 3.6.1.2. Methodenentwicklung ................................................................... 82 3.6.1.2.1 Wahl des optimalen Sprühreagenz und Detektionsgrenze ....... 82 3.6.1.3. Probenvorbereitung und Methode ................................................ 83 3.6.1.4. Resultat der Untersuchungen auf Kanamycin, Neomycin und Streptomycin .................................................................................................. 83 3.6.2. HPLC mit Festphasenextraktion .......................................................... 84 3.6.2.1. Geräte und Materialien ................................................................. 84 3.6.2.2. Methodenentwicklung ................................................................... 85 3.6.2.2.1 Detektionswellenlänge ............................................................... 85 3.6.2.2.2 Trennsäule ................................................................................. 86 3.6.2.2.3 Optimierung der Trennung ......................................................... 86 3.6.2.2.4 Detektionsgrenze ....................................................................... 88 3.6.2.2.5 Festphasenextraktion ................................................................ 88 3.6.2.3. Probenvorbereitung und Methode ................................................ 89 3.6.2.4. Resultat der Untersuchungen auf Chloramphenicol, Penicillin und Tetracyclin .................................................................................... 89 3.7. Metalle ......................................................................................................... 91 3.7.1. ICP-MS ................................................................................................ 92 3.7.1.1. Geräte und Materialien ................................................................. 92 3.7.1.2. Methodenentwicklung ................................................................... 93 3.7.1.2.1 Probenaufschluss und Verdünnung ........................................... 93 3.7.1.2.2 Übersichtsmessung ................................................................... 93 3.7.1.2.3 Optimierung der Konzentrationsbestimmung mittels externer Kalibration .................................................................................. 94 3.7.1.3. Messung ....................................................................................... 94 3.7.1.4. Resultat der Untersuchungen auf Metalle..................................... 94 3.8. Diskussion der Aminosäuren in der Pharmakopöe................................. 96 3.8.1. Vorschlag einer neuen Prüfung auf verwandte Substanzen .............. 100 4. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation .... 102 4.1. Antimikrobielle Behandlung und Sterilität ............................................. 102 4.1.1. Antimikrobielle Behandlung mit trockener Hitze................................. 102 4.1.2. Bestrahlung........................................................................................ 103 4.1.2.1. Bestrahlung von Aminosäuren.................................................... 104 4.2. Antimikrobielle Behandlung von 20 Aminosäuren ................................ 107 4.2.1. Aminosäuren und Sterilisationsmethoden ......................................... 107 4.2.1.1. Trockensterilisation ..................................................................... 107 4.2.1.2. Strahlensterilisation .................................................................... 108 4.2.2. Visuelle und organoleptische Beurteilung .......................................... 108 4.2.3. Oberflächenfluoreszenz ..................................................................... 109 4.2.3.1. Geräte und Materialien ............................................................... 109 4.2.3.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 109 4.2.3.3. Resultat der Oberfächenfluoreszenz .......................................... 109 4.2.4. Optische Drehung .............................................................................. 111 4.2.4.1. Geräte und Materialien ............................................................... 111 4.2.4.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 111 4.2.4.3. Resultat der optischen Drehung ................................................. 111 4.2.5. Dünnschichtchromatographie ............................................................ 114 4.2.5.1. Geräte und Materialien ............................................................... 114 4.2.5.2. Methodenentwicklung ................................................................. 114 4.2.5.3. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 114 4.2.5.4. Resultat der Dünnschichtchromatographie ................................. 115 4.2.6. HPLC mit FMOC Vorsäulenderivatisierung........................................ 115 4.2.7. Headspace GC/MS ............................................................................ 115 4.3. e- -Bestrahlung von Aminosäuren mit 30 kGy und 100 kGy ................. 116 4.3.1. Aminosäuren und Packmittel ............................................................. 116 4.3.1.1. Probenvorbereitung und Bestrahlung ......................................... 116 4.3.2. Visuelle Beurteilung ........................................................................... 117 4.3.3. Auflichtspektroskopie und Schmelzpunkt-Mikroskopie ...................... 117 4.3.3.1. Geräte und Materialien ............................................................... 118 4.3.3.2. Resultat der Auflichtspektroskopie und Schmelzpunkt-Mikroskopie . ................................................................................................... 118 4.3.4. UV/Vis Untersuchungen .................................................................... 120 4.3.4.1. Geräte und Materialien ............................................................... 120 4.3.4.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 120 4.3.4.3. Resultat der UV/Vis Untersuchungen ......................................... 120 4.3.5. Oberflächenfluoreszenz ..................................................................... 122 4.3.5.1. Geräte und Materialien ............................................................... 122 4.3.5.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 122 4.3.5.3. Resultat der Oberflächenfluoreszenz ......................................... 122 4.3.6. Gehaltsbestimmung mittels Titration.................................................. 124 4.3.6.1. Geräte und Materialien ............................................................... 124 4.3.6.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 125 4.3.6.3. Resultat der Gehaltsbestimmung mittels Titration ...................... 125 4.3.7. Optische Drehung .............................................................................. 126 4.3.7.1. Geräte und Materialien ............................................................... 126 4.3.7.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 126 4.3.7.3. Resultat der optischen Drehung ................................................. 127 4.3.8. Peroxidgehalt ..................................................................................... 128 4.3.8.1. Geräte und Materialien ............................................................... 128 4.3.8.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 128 4.3.8.3. Resultat des Peroxidgehalts ....................................................... 128 4.3.9. Headspace GC-MS Untersuchungen ................................................ 129 4.3.9.1. Geräte und Materialien ............................................................... 129 4.3.9.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 130 4.3.9.3. Resultat der Headspace GC-MS Untersuchungen ..................... 130 4.3.10. HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung ................................... 132 4.3.10.1. Geräte und Materialien ............................................................... 132 4.3.10.2. Probenvorbereitung und Methode .............................................. 132 4.3.10.3. Resultat der HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung........ 133 4.4. Diskussion der Stabilitätsuntersuchungen von Aminosäuren nach Sterilisationsbehandlung ......................................................................... 136 5. Abschliessende Diskussion und Schlussfolgerung ................................... 139 6. Referenzen...................................................................................................... 141 7. Anhang............................................................................................................ 146 Abkürzungsverzeichnis ACN AS CE DC em. ex. FL GABA gr. HILIC lat. MS RFU rsd RT ld-PE PP PE PTV ppm ppb ppt SPE uvw w/w Acetonitril Aminosäure Kapillarelektrophorese Dünnschichtchromatographie Emission Excitation Fluoreszenz Gammaaminobuttersäure griechisch Hydrophile Interaktionschromatographie Lateinisch Massenspektrometerie relative fluorescence units relative Standardabweichung (%) Raumtemperatur lowdensity Polyethylen Polypropylen Polyethylen Programmed Temperature Vaporizer parts per million parts per billion parts per trillion solid phase extraction und viele weitere weight/weight Zusammenfassungen 1. Zusammenfassungen 1.1. Abstract in English Today amino acids are produced in large amounts (2 million tons/year commonly used in food- or pharmaceutical industry) by diverse manufacturing processes, i.e. fermentation, extraction, chemical synthesis, whereas until 1980 mainly chemical synthesis was common. Although the impurity profiles of the amino acids changed by these new manufacturing processes, the purity tests of the Ph. Eur. were only partially adjusted until now. The pharmacopoeial authorities want to replace the TLC method and furthermore to limit the impurities to 0.1 percent. As a consequence of the growing market of amino acids, the demand for a fast and easy sterilization method such as radiation sterilization is increasing. Since radiation of high doses is known to affect amino acids and to cause by-products a closer look is of interest. The goal of this study was to establish a suitable impurity profile for 18 pharmacopoeial amino acids and propose new purity tests. After screening the chosen amino acids with the proposed tests, they were exposed to e--, γ- (28 kGy) and heat (160 °C, 2 h) treatment. A following comparison of the original amino acids with the under sterilization condition treated amino acids should answer questions of stability and degradation. As a result a new impurity profile for amino acids was proposed including substances with primary or secondary amines, volatile substances, carbohydrates, antibiotics and metals. To analyze impurities with primary or secondary amines a HPLC method with precolumn derivatization with the reagent FMOC-Cl was suggested. Impurities could be found in 17 of 19 analyzed amino acids. Additionally differences between sterilization treated and untreated amino acids could be shown. As a consequence a new purity test for Ph. Eur. was proposed. A headspace GC-MS method was developed for volatile impurities. With the exception of Leu untreated amino acids showed no impurities whereas in 8 heat treated, 10 e-- and 10 γ-irradiated amino acids decomposition products were detected. 15 of these products were identified. For the detection of carbohydrates a TLC method with thymol reagent was proposed. The limit of detection for glucose, saccharose and fructose was 0.05 % (m/m). All tested amino acids did not show evidence for carbohydrates as impurities. Other methods like HPLC with RI- or far UV-detection failed in the carbohydrate analysis because of a higher limit of detection. As possible impurities from fermentation process several antibiotics were analyzed by TLC and anisaldehyde-sulfuric acid reagent and by solid phase extraction and HPLC. No evidence for antibiotics as residues in the samples could be found. The concentration of 28 metals was examined in 4 amino acids (L-Asp, Gly, L-Ile and L-Ser) by ICP-MS. Results indicated that the 10 ppm limit for heavy metals (set by the Ph. Eur.) was not exceeded. To evaluate radiation as possible sterilization process for amino acids, 20 biogenous amino acids were treated by e-- and γ-irradiation (30 kGy) and other 5 amino acids by e--irradiation with a higher dose (100 kGy). It could be shown that amino acids undergo significant changes by this process. In addition, several degradation products could be found and identified. At this point, radiation seems not qualified as sterilization method for amino acids. 1 2 Zusammenfassungen 1.2. Zusammenfassung in Deutsch Aminosäuren werden heute in grossen Mengen (2 Millionen Tonnen/Jahr) produziert und finden vor allem Verwendung in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie. Ihre Herstellung erfolgt mengenmässig vor allem durch Fermentation gefolgt von Extraktion und chemischer Synthese, wobei bis 1980 chemische Synthese massgebend war. Obwohl sich das Verunreinigungsprofil der Aminosäuren durch die neuen Herstellungsmethoden veränderte, wurde der Reinheitstest der Ph. Eur. nur teilweise an die neue Situation angepasst. Die zuständige Behörde der Ph. Eur. möchte die auf DC beruhende Reinheitsprüfung durch eine neue ersetzen, welche Verunreinigungen auf 0.1 Prozent limitiert. Durch den schnell wachsenden Markt für Aminosäuren, wurde die Nachfrage nach einer einfachen und schnellen Sterilisationsmethode, wie sie die Bestrahlung darstellt, geweckt. Da aber bekannt ist, dass Bestrahlung von Aminosäuren mit hohen Dosen zu Zersetzung und Abbauprodukten führt, sind genauere Untersuchungen notwendig. Das Ziel dieser Arbeit lag in der Erstellung eines Verunreinigungsprofils für 18 in der Ph. Eur. vorkommende Aminosäuren und dazu geeignete Reinheitsprüfungen vorzuschlagen. Nach Analyse der ausgewählten Aminosäuren mit den vorgeschlagenen Tests, wurden dieselben mit e-- und γ-Strahlen (30 kGy) behandelt, sowie trockener Wärme (2 h, 160 °C) ausgesetzt. Ein anschliessender Vergleich mit den unbehandelten Aminosäuren, sollte Fragen über Zersetzung und Stabilität liefern. Als Resultat wurde ein neues Verunreinigungsprofil entwickelt, welches Verunreinigungen mit primären oder sekundären Aminen, flüchtige Verunreinigungen, Kohlenhydrate, Antibiotika und Metalle beinhaltete. Eine Methode mit HPLC und FMOC Vorsäulenderivatisierung wurde für die Reinheitsprüfung auf Verunreinigungen mit primären oder sekundären Aminen vorgeschlagen. Dabei konnte in 17 von 19 untersuchten Aminosäuren Verunreinigungen gefunden werden. Zusätzlich konnten Unterschiede zwischen unbehandelten und unter Sterilisationsbedingungen behandelten Aminosäuren aufgezeigt werden. Als Resultat wurde eine neue Reinheitsprüfung für Aminosäuren in der Ph. Eur vorgeschlagen. Für die flüchtigen Verunreinigungen wurde eine GC-MS Methode erstellt. Bei den unbehandelten Aminosäuren konnten ausser bei Leu keine Verunreinigungen gefunden werden. Es konnten jedoch bei 8 wärme-, 10 e-- und 10 γ- behandelten Aminosäuren Zersetzungsprodukte gefunden werden. 15 dieser Produkte konnten identifiziert werden. Zur Detektion der Kohlenhydrate wurde eine DC Methode mit Thymolreagenz entwickelt. Die Nachweisgrenze lag dabei für Glucose, Saccharose und Fructose bei 0.05 % (m/m). Alle untersuchten Aminosäuren zeigten jedoch keine Hinweise auf Verunreinigungen dieser Stoffklasse. Andere Methoden wie HPLC mit RI- oder UVDetektion scheiterten an der höheren Nachweisgrenze. Als mögliche Verunreinigungen aus dem Fermentationsprozess wurden Aminosäuren auf Anwesenheit von Antibiotika überprüft. Die Untersuchungen wurden mittels DC und Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz, sowie mittels Festphasenextraktion und HPLC durchgeführt. Es konnten in den untersuchten Proben jedoch keine Hinweise auf Antibiotika gefunden werden. Die Konzentrationen von 28 Metallen wurden in 4 Aminosäuren (L-Asp, Gly, L-Ile und L-Ser) mittels ICP-MS bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass das Limit von 10 ppm (Ph. Eur.) für Schwermetalle nicht überschritten wurde. Um die Eignung von Bestrahlung als Sterilisationsmethode für Aminosäuren zu bewerten, wurden 20 biogene Aminosäuren mit e-- und γ-Strahlung (30 kGy) und Zusammenfassungen weitere 5 Aminosäuren mit einer höheren Dosis (100 kGy) e--Strahlung behandelt. Es konnte gezeigt werden das Aminosäuren signifikante Veränderungen durch diesen Prozess erfahren. Zusätzlich konnten einige Zersetzungsprodukte detektiert und identifiziert werden. Zu diesem Zeitpunkt, scheint Bestrahlung als ungeeignete Methode zur Sterilisation von Aminosäuren. 3 4 Problemstellung 2. Problemstellung Aminosäuren werden heute weltweit in riesigen Mengen hergestellt. Aktuelle Schätzungen gehen von mehr als 2 Millionen Tonnen pro Jahr mit einem Wert im Milliardenbereich aus. Sie werden hauptsächlich als Geschmacksverstärker, Lebensmittelzusätze, Futterzusatzstoffe und zu pharmazeutischen Zwecken verwendet. Ebenso sind sie ein wichtiger Ausgangsstoff für die chemische Industrie. Bei ihrer Herstellung hat die Fermentation immer mehr an Bedeutung zugenommen und gilt heute als mengenmässig wichtigstes Verfahren zur Gewinnung von Aminosäuren. Daneben können sie aber auch durch chemische Synthese oder durch Extraktion eines Proteinhydrolysates gewonnen werden[1]. Die Anforderungen, welchen Aminosäuren zur medizinischen Verwendung erfüllen müssen, werden in Europa durch die Europäische Pharmakopöe (Ph. Eur.) definiert und sind verbindlich. Als Reinheitsprüfung für Aminosäuren wird für alle Aminosäuren ein Dünnschichtchromatographie Test für Ninhydrin positive Substanzen vorgeschrieben. Nur bei Tryptophan wurde eine zusätzliche Reinheitsprüfung mittels HPLC eingeführt. Ein Auslöser dafür war eine neue Krankheit, die zwischen 1989 und 1990 epidemisch in Amerika auftrat und als Eosinophilie-myalgie Syndrome (EMS) bezeichnet wurde[2]. Der Grund für die Krankheit konnte bei einer japanischen Firma (Showa Denko) gefunden werden, welche zur Herstellung von Tryptophan an ihrem üblichen Fermentations- und Reinigungsprozess eine Modifikation vorgenommen hatte[3]. Dies hatte die weit reichende Folge, dass toxische Verunreinigungen im Endprodukt auftraten, welche mit der bis dahin vorhandenen Reinheitsprüfung nicht erkannt wurden und zum EMS führten. Nach Aufklärung dieses Vorfalls wurde die Monographie von Tryptophan überarbeitet und eine HPLC-Methode zur Reinheitsprüfung hinzugefügt, welche sensitiver auf die neuen Verunreinigungen ist. Als Leitsubstanz für diese Prüfung wurde 1,1`ethylidenbis(tryptophan) gewählt und auf 10 ppm limitiert. Bei allen anderen Aminosäuren wird noch immer Dünnschichtchromatographie als einzige Reinheitsprüfung auf verwandte Substanzen verwendet. Dieser Test erscheint aber, bedingt durch seinen Reaktionsmechanismus (nur Verunreinigungen mit primären oder sekundären Aminogruppen reagieren), unzureichend um alle potentiellen Verunreinigungen in Aminosäuren zu detektieren. Gerade durch die Erfahrung mit dem Tryptophanzwischenfall und dem neuen Verunreinigungsprofil, welches sich durch das fermentative Herstellungsverfahren von Aminosäuren ergab, scheint es ratsam die Monographien hinsichtlich Reinheitsprüfung zu überarbeiten. Eine Notwenigkeit wurde ebenfalls durch Arbeiten und Publikationen von Holzgrabe, U. et al. belegt[4]. Diese Gruppe entwickelte schon erfolgreich eine Reinheitsprüfung mittels Kapillarelektrophorese, welche der DC-Methode der Ph. Eur. überlegen war[5]. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin ein Verunreinigungsprofil für Aminosäuren zu erstellen, wie es bei der fermentativen Herstellung zu erwarten wäre. Daraus sollten für die relevanten potentiellen Verunreinigungen analytische Grenzprüfungsmethoden entwickelt werden und diese an kommerziellen Aminosäuren mit Ph. Eur. Qualität getestet werden. Ein zweites Ziel lag in Stabilitätsuntersuchungen von Aminosäuren nach e-- und γBestrahlung. Die Auswirkungen einer Strahlenexposition unter Sterillisationbedingungen (30kGy) sollte mittels der zuvor entwickelten Prüfmethoden untersucht werden. Dies sollte einerseits die Fähigkeiten der entwickelten Methoden belegen Abbauprodukte zu detektieren und andererseits aber auch neue Erkenntnisse über Zersetzungsprodukte von Aminosäuren nach Strahlenbehandlung liefern. Durch die Problemstellung Resultate der Untersuchungen sollte zudem die Möglichkeit einer Strahlensterilisation von pulverförmigen Aminosäuren erörtert werden. 5 6 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3. Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.1. Allgemeiner Teil 3.1.1. Aminosäuren Aminosäuren dürften schon während der chemischen Evolution vor 4 Milliarden Jahren entstanden sein. Das berühmte Experiment (1963) von Miller und Urey, welches die präbiotische Entstehung organischer Verbindungen simulierte, lieferte als Resultat unter anderem die Aminosäuren Gly, Ala, Asp, Glu, und Derivate davon. Ähnliche Experimente, bei denen die Reaktionsbedingungen verändert wurden, konnten dieses Experiment bestätigen. Zudem liessen sich in kohlenstoffhaltigen Meteoriten die gleichen Aminosäuren nachweisen[6]. Damit liegt nahe, dass Aminosäuren wahrscheinlich mit zu den ältesten organischen Verbindungen auf der Erde gehören. Durch Analyse einer sehr grossen Zahl von Proteinen unterschiedlichster Herkunft konnte nachgewiesen werden, dass sich alle aus 20 Aminosäuren zusammensetzen. Als Gemeinsamkeit tragen diese Aminosäuren (ausser Prolin) alle am α-Kohlenstoffatom eine primäre Aminogruppe[6]. Die pKWerte für die Carboxygruppen liegen zwischen 1.9 und 2.95 und die pK-Werte der Aminogruppen liegen zwischen 8.84 und 10.78. Daraus ergibt sich, dass eine Aminosäure sowohl als Base wie auch als Säure reagieren kann. Diese Eigenschaft wird als amphoterisch bezeichnet. In Wasser bei neutralem pH und in fester Form liegen Aminosäuren deshalb vorwiegend als Zwitterionen vor. Sie haben einen kristallinen Aufbau mit hohen Schmelztemperaturen (siehe Tabelle 20) und weisen salzartigen Charakter auf. Weitere Temperaturerhöhung würde zu Zersetzung führen. Mehr als die Hälfte der zwanzig biogenen Aminosäuren kann der Körper entweder direkt synthetisieren oder aus anderen durch Austausch oder Umwandlung der Seitenkette gewinnen. Acht dieser zwanzig Aminosäuren kann der menschliche Organismus nicht selber herstellen. Diese werden deswegen als essentielle Aminosäuren (Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin) bezeichnet und müssen über die Nahrung aufgenommen werden. Fehlt eine dieser essentiellen Aminosäuren über längere Zeit gerät die Proteinsynthese ins Stocken und es stellen sich Mangelerscheinungen ein. Bei Kindern gelten zusätzlich Cystein und Tyrosin als essentiell, da deren Eigenproduktion noch nicht vollständig ausgebildet ist. Arginin und Histidin werden als semiessentiell bezeichnet und müssen nur unter bestimmten Bedingungen mit der Nahrung aufgenommen werden. Solche Situationen können beispielsweise nach einer schweren Verletzung oder während einer Wachstumsphase auftreten, wenn der Körper nicht mehr in der Lage ist, ausreichende Mengen selber herzustellen. Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.1.2. Struktur und Klassifikation der Aminosäuren Eine Klassifikation dieser 20 Standard-Aminosäuren erfolgt üblicherweise gemäss der Polarität ihrer Seitenketten. Daraus ergeben sich die 3 Haupttypen mit geladenen, ungeladenen polaren und unpolaren Seitenketten. Tabelle 1 zeigt eine Übersicht der 20 biogenen Aminosäuren. Tabelle 1 Struktur und pKa-Werte der Aminosäuren[7] Struktur Name pKa pKa α-COOH α-NH3 Code pKa + Seitenkette O O C geladene polare Seitenketten OH OH Asparaginsäure Asp 1.99 9.9 3.9 OH Glutaminsäure Glu 2.1 9.47 4.07 OH Arginin Arg 1.82 8.99 12.48 OH Histidin His 1.8 9.33 6.04 OH Lysin Lys 2.16 9.18 10.79 OH Asparagin Asn 2.1 8.84 - OH Cystein Cys 1.92 10.78 8.33 OH Glutamin Gln 2.17 9.13 - OH Serin Ser 2.19 9.21 - OH Threonin Thr 2.09 9.10 - Tyrosin Tyr 2.20 9.11 10.13 NH2 O O HO C NH2 NH H2N O N H C NH2 O N C NH2 N H O H2N C NH2 O O C NH2 NH2 Ungeladene polare Seitenketten O HS C NH2 O O H2N C NH2 O HO C NH2 OH H 3C O C NH2 O C HO NH2 OH 7 Aminosäuren in der Pharmakopöe Struktur Name pKa pKa α-COOH α-NH3 Code pKa + Seitenkette O H3C C OH Alanin Ala 2.35 9.87 - OH Glycin Gly 2.35 9.87 - OH Isoleucin Ile 2.32 9.76 - OH Leucin Leu 2.33 9.74 - OH Methionin Met 2.13 9.28 - OH Phenylalanin Phe 2.16 9.18 - OH Prolin Pro 2.95 10.65 - OH Tryptophan Trp 2.43 9.44 - OH Valin Val 2.29 9.74 - NH2 O H C NH2 CH3 H3C O C NH2 O unpolare Seitenketten 8 H3C C CH3 NH2 O H 3C S C NH2 O C NH2 O C NH O C NH2 N H CH3 H3C O C NH2 3.1.3. Aminosäuren - Geschichtlicher Hintergrund Asparagin war die erste Aminosäure, die 1806 von Vauquelin und Robiquet aus dem Saft der Spargel (Asparagus officinalis L.) isoliert wurde[8]. Cystin, das oxidierte Dimer des Cysteins, wurde bereits 1810 von Wollaston entdeckt, aber erst 1899 als Bestandteil von Proteinen erkannt[9]. Der Begriff Protein (gr. protos: erstrangig) wurde 1836 von Berzelius eingeführt und unterstrich die Bedeutung dieser Makromoleküle in Lebewesen[10]. 1819 gelang Braconnot die teilweise Isolation von Leucin aus Käse und 1820 in kristalliner Form aus Wolle und Muskelgewebe. Der Name Leucin bezieht sich dabei auf das griechische Wort „leukos“ für weiss, als Beschreibung der weissen Plättchen, welche aus der Isolation erhalten wurden. Ebenso konnte er Glycin (gr. glycis: süss) 1820 durch Hydrolyse tierischer Abfälle, wie sie zur Leimproduktion verwendet wurden, gewinnen[11]. 1846 wurde Tyrosin von Liebig aus Käse (gr. tyros: Käse) isoliert. Alanin bildete eine Ausnahme durch den Umstand, dass seine Synthese (1850, Strecker[12]) schon vor seiner Isolation (1888, Weyl[13]) stattfand. Aminosäuren in der Pharmakopöe 1857 gelang es Pasteur zu zeigen, dass die Gärung eine Reaktion von überaus winzigen Zellen als Resultat ihres Lebensprozesses ist. Damit bereite er mit seiner Forschung und seinen Erkenntnissen die Grundlage für die moderne Biotechnologie, zu welcher letztlich auch die Produktion von Aminosäuren mittels Fermentation gehört[14, 15]. Bei der Fermentation von Nahrungsmitteln dürfte es sich zu dem um die wahrscheinlich älteste Biotechnolgie[16] handeln. Belegen liess sich dies durch ein 4400 Jahre altes ägyptisches Wandrelief, welches ein Rezept zur Bierherstellung mittels dieser Technik aufwies[17]. Damit dürfte die Herstellung von trinkbarem Alkohol durch Fermentation wohl die erste, wenn auch unbewusste Verwendung von Mikroorganismen zur Herstellung eines Genussmittels gewesen sein. 1865 wurde Serin in Sericin (Seidenleim) von Cramer entdeckt[18]. Glutamin und Glutaminsäure wurden 1866 von Ritthausen aus Gluten isoliert. 2 Jahre später folgte Asparaginsäure aus Leguminosen. 1875 gelang Schützenberger der Nachweis, dass die Hydrolysen von Proteinen ausschliesslich Aminosäuren einer bestimmten Bauart lieferten. Phenylalanin konnte von Schulze 1881 aus Keimlingen der Lupine gewonnen werden und 1886 entdeckten Schulze und Steiger Arginin in derselben Pflanze, welche sie in Anlehnung an ihr Silbersalz (lat. argentum:Silber) benannten. Weyl erhielt durch Behandlung von Fibroin mit kochender verdünnter Schwefelsäure Alanin neben dem bereits bekannten Tyrosin und Glycin[13]. Lysin (gr. lysis: Lösung) konnte von Drechsel 1889 aus Casein gewonnen werden[19]. Es folgte Histidin, welches parallel 1896 von Kossel[20] aus Sturin und von Hedin[21] als Hydrolysat verschiedener Proteine (Ovalbumin und Casein) isoliert wurde. Ebenfalls aus Ovalbumin und Casein gelang es Fischer 1901 Prolin zu gewinnen[19]. Tryptophan wurde aus Milch 1902 von Hopkins isoliert[22]. Isoleucin wurde erst über 80 Jahre nach der Entdeckung von Leucin von Ehrlich (1904) aus Fibrin erhalten[23]. Der Schritt zur ökonomischen Bedeutung von Aminosäuren geschah 1908 mit Glutaminsäure, welches als Gewürz vermarktet wurde. Glutamat war die erste Aminosäure, welche als Gewürz 1908 wirtschaftliche Bedeutung erlangte und bis zum Zeitpunkt der mikrobiellen Produktion vorwiegend aus Sojabohnen, Weizen uns anderen Pflanzenproteinen gewonnen wurde. Glutamat hat seitdem mengenmässig immer noch die grösste Bedeutung in der Herstellung von Aminosäuren (siehe Tabelle 2). 1922 wurde Methionin, die zweite schwefelhaltige Aminosäure, von Müller aus Casein isoliert[19]. Die letzte der 20 biogenen Aminosäure Threonin wurde von Rose 1935 entdeckt[24]. Die Anfänge für Prozesse bei denen Mikroorganismen in der chemischen und pharmazeutischen Industrie eingesetzt wurden, liegen im Anfang des 20-sten Jahrhunderts. 1937 stellten Mamoli und Vercellone Testosteron aus Androstendion mit einem Corynebacterium und Hefe her[17]. 1941 wurde in den USA erstmals Penicillin nach dem Oberflächenverfahren und 1943 nach dem Submersverfahren hergestellt. Die Produktion von Aminosäuren erfolgte erst 15 Jahre später in Japan. 1957 isolierten Kinoshita und Mitarbeiter ein Gram-positives Bakterium, welches in der Lage war grosse Mengen Glutamat ins Nährmedium auszuscheiden[25]. Die Möglichkeit diese Aminosäure neu mittels Fermentation einer Mutante von Corynebacterium glutamicum herzustellen, führte zur systematischen Erforschung der Biosynthesenwege von Aminosäuren in Mikroorganismen. Es stellte sich dabei schnell heraus, dass die neue Herstellungsmethode, der alten Gewinnung von Aminosäuren durch Hydrolyse natürlicher Proteine oder durch chemische Synthese, wirtschaftlich überlegen war. Die neue Methode benötigte nur noch einen Mikroorganismus als Produzenten, ein einfaches Mineralsalzmedium und Glukose 9 10 Aminosäuren in der Pharmakopöe als Kohlenstoff- und Energiequelle. Ein weiterer Vorteil lag darin, dass bei dieser Technik die gewünschte L-Form produziert wird. Heute werden fast alle Aminosäuren mittels Fermentation hergestellt. Glycin, die einzige Aminosäure ohne chiralem Zentrum, wird industriel mittels Strecker Synthese produziert[26]. 3.1.4. Aminosäuren – pharmazeutische Bedeutung Neben der Tatsache, dass Aminosäuren als Bausteine der Proteine eine wichtige Rolle im Primärstoffwechsel des Menschen spielen, kann bei einigen von ihnen eine spezifische pharmazeutische Bedeutung zugemessen werden. Arginin, Asparagin und Glutaminsäure werden zur Restitution der körperlichen und geistigen Leistungsfähigkeit bei Erschöpfungs- und Schwächezuständen empfohlen (Dynamisan® forte, Tonoglutal® uvw.). Glutamat bildet daneben auch eine Vorstufe von GABA und ist selbst ein exzitatorischer Neurotransmitter. Das China-RestaurantSyndrom wird verursacht durch Mononatriumglutamat und beschreibt eine reversible Intoxikation durch den exzessiven Gebrauch dieser Aminosäure als Gewürz. Cystein kann als Radikalfänger (SH-Gruppe) bei Metallvergiftungen und Prophylaxe bei Strahlenintoxikation verwendet werden. Acetylcystein wird als gebräuchliches Mukolytikum verwendet (ACC eco®, Dynamucil®, Ecomucil®, Fluimucil®, Solmucol® uvw.) Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im Rückenmark und Hirnstamm[27]. Histidin kann zur Diagnose von Folsäuremangel benutzt werden. Dabei wird die Ausscheidung von N-Formidglutamat nach Verabreichung einer hohen Dosis Histidin im Urin gemessen. Die Exkretion einer hohen Konzentration N-Formidglutamat weist dabei auf Folsäuremangel hin[28]. Bei der Ahornsirupkrankheit handelt es sich um eine autsomal-rezessive Stoffwechselstörung, bei der Abbau der verzweigtkettigen Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin drastisch verringert ist[29]. Methionin wird eingesetzt gegen Harnwegsinfekte (Acimethin®). Daneben findet es sich auch zusammen mit Cystein in Produkten gegen Alopezie und Nagelwachstumstörungen (Revalid®, Pil-Food Revalid®) Bei der autosomal-rezessiv erblichen Stoffwechselstörung Phenylketonurie kann durch Mangel der Phenylalaninhydroxylase Phenylalanin nicht mehr zu Tyrosin umgebaut werden. Als Massnahme muss eine Phenylalanindiät eingehalten werden. Tryptophan fand bis 1989 Anwendung als Schlafmittel und Antidepressivum. Wurde dann aber durch das Auftreten des Eosinophilie-Myalgie-Syndroms vom Markt genommen. Neuerdings scheint es wieder in der Behandlung von Schlafstörungen Einzug zu halten (L-Tryptophan-ratiopharm®, Kalma ®). Daneben ist Tryptophan eine Vorstufe des Neurotransmitters Serotonin und des neurosekretorischen Hormons Melatonin. Die totale parenterale Ernährung, welche eine Nahrungszufuhr bei einem Patienten unter Umgehung des Gastrointestinaltraktes erlaubt, benötigt zwingenderweise die 8 essentiellen Aminosäuren (siehe 3.2. Aminosäuren). Diese werden oft als vorgefertigte Lösungen in Kombination mit Glucose und Spurenelementen verwendet. Aminomix®, Aminoven®, Glamin®, Nutriflex® und StructoKabiven® sind einige Beispiele, welche auf dem Markt erhältlich sind. Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.1.5. Industrielle Herstellung von Aminosäuren Aminosäuren werden industriell durch vier Verfahren produziert. Es handelt sich dabei um Fermentation, chemische Synthese, enzymatische Methoden oder Extraktionen eines pflanzlichen oder tierischen Proteinhydrolysats. Welches Verfahren dabei im Einzelnen angewendet wird, hängt von der zu produzierenden Aminosäure ab. Tabelle 2 gibt eine Übersicht über Aminosäuren und ihre jeweiligen gängige Produktionsverfahren. Der Verbrauch an Aminosäuren wird weltweit auf über 2 Millionen Tonnen pro Jahr geschätzt. Ungefähr die Hälfte wird als Geschmacksverstärker oder Futterzusatz verwendet. Vor allem in asiatischen Ländern findet Glutamat als Gewürz und Geschmacksverstärker einen grossen Absatz. Dieser Markt wächst um 6 % pro Jahr[30]. Der für pharmazeutische Produkte benötigte Anteil Aminosäuren beträgt lediglich 15`000 Tonnen pro Jahr[31]. Die meisten Aminosäuren zeigen jedoch ein Marktwachstum von 10 % oder höher[30]. Die grosse Nachfrage meisten Aminosäuren, welche in grossen Mengen auf den Markt kommen, werden heute durch Fermentation oder enzymatische Prozesse gewonnen. Als Ausnahme gelten Ala, Gly und Met, die auch durch chemische Synthese im grossen Stil produziert werden. Zusätzlich werden Cys, Leu, Pro, Ser, Trp und Tyr aus Extraktionen gewonnen[32]. Für Met konnte bisher keine lohnende fermentative Erzeugung entwickelt werden und die Produktion basiert hauptsächlich auf chemischer Synthese. Die steigenden Preise der benötigten Vorstufen weckten aber in neuster Zeit wieder das Interesse einer fermentativen Produktion[33]. Tabelle 2 Aminosäuren und ihre Herstellungsmethoden [32, 34, 35] Aminosäure Methode des Produktionsverfahren DL-Alanin L-Alanin L-Arginin L-Asparagin L-Asparaginsäure L-Cystein L-Glutamin L-Glutaminsäure Glycin L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin DL-Methionin L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L, DL-Threonin L, DL-Tryptophan chemisch Fermentation, chemisch enzymatisch, chemisch enzymatisch enzymatisch enzymatisch, Extraktion Fermentation Fermentation chemisch Fermentation Fermentation Extraktion Fermentation, enzymatisch chemisch chemisch, enzymatisch Fermentation, chemisch Fermentation, Extraktion Fermentation, Extraktion Fermentation, chemisch Fermentation, chemisch, enzymatisch, Extraktion Extraktion Fermentation, chemisch L-Tyrosin L-Valin 1989 Produktion t/Jahr 1500 150 1000 30 4000 1000 850 340000 6000 350 200 200 70000 250000 150 3000 150 60 200 250 1996 Produktion t/Jahr 1500 500 1200 2006 Produktion t/Jahr 7000 1500 1300 1000000 22000 400 400 500 250000 350000 14000 4500 500 40000 1200 60 200 120 500 1000 8000 350 200 1500 2000 1200000 16000 500 1200 600000 550000 13000 11 12 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.1.6. Fermentation Als mengenmässig wichtigste Methode wird hier kurz auf ihre Technik eingegangen und ein Augenmerk auf den Reinigungsprozess gelegt. Wie in Tabelle 2 aufgeführt, können die meisten Aminosäuren aus fermentativen Prozessen gewonnen werden. Dabei kann als Vorteil gewertet werden, dass natürlicherweise L-Aminosäuren in grosser Menge geerntet werden können. Tabelle 3 listet die Aminosäuren nochmals mit ihren typischen Produktionsmikroorganismen und deren benötigte C-Quellen auf. 1.5 Millionen Tonnen Aminosäuren werden jährlich alleine von Coryneform bacteria hergestellt[30]. Der Prozess der Aminosäuren-Fermentation kann weiter in eine direkte Fermentation und in eine Fermentation mit Vorstufen unterteilt werden. Bei der direkten Fermentation stellen die verwendeten Mikroorganismen die gewünschte Aminosäure aus billigen C-Quellen ohne weitere Zusätze in grossem Überschuss her[32]. Verständlicherweise wird in der Industrie diese ökonomischere Methode, jener der precursor Zugabe vorgezogen. Tabelle 3 Mikroorganismen zur Herstellung von Aminosäuren mit C-Quellen[34, 36, 37] Aminosäure DL-Alanin L-Arginin L-Glutamin L-Glutaminsäure Glycin L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin Mikroorganismus Corynebacterium gelatinosum Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Corynebacterium sp. (C. glutamicum, C. hydrocarbolastus, C. alkanolyticum) Brevibacterium sp (B. flavum, B. thiogenitalis) Microbacterium ammoniaphilum Bacillus megaterium Arthrobacter paraffineus Chemische Synthese Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum Arthrobacter paraffineus Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium glycinophilum Arthrobacter paraffineus Escherichia coli Brevibacterium flavum Arthrobacter paraffineus Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum Arthrobacter paraffineus Brevibacterium sp. (B. flavum, B. lactofermentum) Corynebacterium acetoacedophilum C-Quelle Glucose Glucose, Essigsäure Glucose, Essigsäure, Ethanol Glucose, Essigsäure, Ethanol, Propylenglycol, n-Paraffin, Benzoesäure Glucose, Essigsäure, Ethanol Glucose, Essigsäure Glucose Glucose, Essigsäure, Ethanol, n-Paraffine Glucose Glucose, n-Paraffine, Ethanol Glucose, Essigsäure, Ethanol n-Paraffine Glucose, Essigsäure, Ethanol, n-Paraffine Glucose Glucose, n-Paraffine Glucose, Essigsäure, Ethanol Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.1.7. Direkte Fermentation Arg, Glu, Gln, Iso, Leu, Lys, Phe, Pro, Thr, Tyr und Val lassen sich durch direkte Fermentation gewinnen[32]. Eine typische Fermentation kann in folgende 3 Prozesse gegliedert werden: den Fermentationsprozess, die Grobisolierung und die Reinigung des Produktes bis zur gewünschten Qualität[31]. 3.1.7.1. Fermentationsprozess Zur Anwendung kommen die batch, fed-batch oder kontinuierliche Fermentation. Nach der Inokulation werden im batch-Verfahren die Zellen ohne Zugabe von zusätzlichem Substrat kultiviert. Die Produktivität der Mikroorganismen wird dabei durch den Substratverbrauch oder die Bildung von toxischen Nebenprodukten nach und nach reduziert. Die fed-batch-Technik kann dieses Problem verringern, indem der Fermentationsbrühe schrittweise Medium und essenzielle Nährstoffe zugefügt werden. Beim kontinuierlichen Fermentationsverfahren werden toxische oder wachstumsinhibierende Produkte (Laktat oder Ammoniak) entfernt und gleichzeitig frisches Medium hinzugefügt. Damit wird eine Substratlimitierung vermieden[38]. Die auf diese Weise von Mikroorganismen spezifisch produzierten Aminosäuren müssen danach aus der Fermentationsbrühe isoliert werden. 3.1.7.2. Grobisolierung Bei der Grobisolierung werden zuerst die Mikroorganismen aus der Fermentationsbrühe entfernt. Dies geschieht entweder durch Zentrifugation und/oder Membranfiltration. Bei einem typischen kommerziellen Verfahren wird danach die zellfreihe Brühe angesäuert und durch ein Anionen- oder Kationentauscherharz fliessen gelassen. Dabei ersetzen die geladenen Aminosäuren die korrespondierenden Ionen und bleiben auf der Kolonne zurück. Die Mutterlauge enthält danach noch 0.1 % (w/w) Aminosäuren. Mit wässriger Ammoniaklösung lassen sich die gebundenen Aminosäuren vom Tauscherharz abeluieren. Der überschüssige Ammoniak wird verdampft und das Eluat wieder angesäuert (z.B. HCl). Die so gewonnen Aminosäuren werden kristallisiert und getrocknet. Auf diese Weise lässt sich feed-grade Qualität mit einer Reinheiten von < 98.5 % erreichen. Für food- oder pharmaceutical-grade Qualität müssen weitere Reinigungsschritte vorgenommen werden. Dazu können Aktivkohlebehandlung, Umkristallisation oder weitere chromatographische Trennmethoden gehören[39, 40]. Das Ziel der Grobfiltration liegt darin, die meisten Verunreinigungen zu entfernen und die produzierte Aminosäure in kristalliner Form in angemessener Reinheit zu gewinnen. 3.1.7.3. Reinigung Die anschliessende Reinigung richtet sich vor allem nach dem Verwendungszweck der produzierten Aminosäure. Dabei stellt eine Anwendung im pharmazeutischen Bereich die höchsten Ansprüche. Eventuell müssen Rohkristalle mit Aktivkohle entfärbt und weiter gereinigt werden. In diesem Zusammenhang spielt die Umkristallisation eine wichtige Rolle. Da viele Aminosäuren polymorphe Eigenschaften haben, ist es möglich durch umkristallisieren in die verschiedenen Kristallformen hohe Reinheitsgrade zu erreichen. Zum Beispiel lässt sich Glu sowohl in eine α als auch in eine β Kristallform überführen[31]. Dadurch lassen sich sehr hohe Reinheitsgrade erzielen. Wo dies nicht möglich ist (Gln), müssen die weiteren Reinigungsschritte mit chromatographischen Methoden ergänzt werden[31]. Für pharmazeutische Verwendung auf dem europäischen Markt müssen die Aminosäuren letztendlich den Anforderungen der Ph. Eur. entsprechen. Sollen sie in 13 14 Aminosäuren in der Pharmakopöe Infusionszubereitungen verwendet werden, verlangt die Phr. Eur. eine Prüfung auf Pyrogene. Das bedeutet das solche Aminosäuren während der Reinigung entpyrogenisiert werden müssen. Den Abschluss findet die Reinigung von Aminosäuren in einem Trocknungsprozess. 3.1.8. Fermentation mit Vorstufen Nicht alle Aminosäuren können mit genügend hoher Ausbeute auf dem einfachen Weg der Direktfermentation gewonnen werden. Beispiele dafür sind L-Ser oder auch L-Trp. Die Industrie verwendet C. glycinophilum mit Zugabe von Gly als Vorstufe um L-Ser zu produzieren[41]. L-Trp kann mit einer Mutanten von E. Coli, welche das Enzym Tryptophan Synthase überproduziert, mit Indol und L-Ser als Vorstufe fermentativ hergestellt werden[35]. 3.2. Aminosäuremonographien in der Pharmakopöe Die erste Monographie betraf das L-Glu und wurde in der Schweiz mit Ph. Helv. VI eingeführt (siehe Tabelle 4). L-His HCl war die zweite und erhielt in derselben Pharmakopöe eine Monographie. Die Reinheitsprüfung auf verwandte Substanzen wurde für beide Aminosäuren mittels Papierchromatographie und Ninhydrinreagenz durchgeführt. Eine Prüfung auf Schwermetalle, Chlorid, Sulfat, Verbrennungsrückstand und ein Limit der optischen Drehung wurden ebenfalls schon gefordert[42]. Die grosse Aufnahme der Aminosäure in die Pharmakopöe fand in der Ph. Eur. 2 statt, bei welcher 16 der 20 biogenen Aminosäuren eigene Monographien erhielten[43]. Diese europäischen Monographien hatten auch Gültigkeit für die Schweiz und wurden in der Ph. Helv. VII integriert[44]. Als Reinheitsprüfung auf verwandte Substanzen wurde eine DC-Methode auf Ninydrin nachweisbare Substanzen gefordert. Genauso verhielt es sich bei L-Tyr, welches eine eigene Monographie in der Ph. Eur. 3 erhielt. L-Trp bildete eine Ausnahme und erhielt neben der Reinheitsprüfung mittels DC und Ninhydrinreagenz eine HPLC-Methode mit UVDetektion bei 220 nm. Dies war eine direkte Folge des unter der Problemstellung beschriebenen Tryptophanzwischenfalls in den neunziger Jahren. Neben den Monographien, welche sich direkt an die einzelnen Aminosäuren wandten, kamen allgemeine Monographien hinzu. Diese stellten zusätzliche Anforderungen an die Aminosäuren und definierten die Verantwortlichkeit an den Hersteller oder Anwender. Ein Beispiel, welches die fermentativ hergestellten Aminosäuren betrifft, ist der Artikel zur Kontrolle bei Verfahrensänderungen in der allgemeine Monographie Fermentationsprodukte (Ph. Eur. 6.2, 01/2008:1468). „If the production process is altered in a way that causes a significant change in the impurity profile of the product, the critical steps associated with this change in impurity profile are revalidated.“ Darin wird erstens ersichtlich, dass immer der Hersteller die Verantwortung über die Verunreinigungen seines Produktes bei neuen Verfahren trägt und zweitens die Ph. Eur. keine expliziten Methoden angibt, wie eine solche Änderung im Verunreinigungsprofil festgestellt werden soll. Eine Reinheitsprüfung mittels DC auf Ninydrin nachweisbare Substanzen in der entsprechenden Aminosäuremonographie würde dafür sicher nicht genügen. Eine weitere allgemeine Monographie, welche die Aminosäuren betrifft, ist die Kontrolle von Verunreinigungen in Substanzen zur pharmazeutischen Verwendung (Ph. Eur. 6.2, 01/2008:51000). Darin wird unter anderem die Art der Verunreinigung, welche auftreten kann, definiert. Es wird unterschieden zwischen „Spezifizierten Verunreinigungen“ und „Anderen bestimmbaren Verunreinigungen“. Zu ersteren Aminosäuren in der Pharmakopöe gehören jene, welche zum Zeitpunkt der Erstellung der Monographie bereits bekannt und in Bulkwaren der Substanz nachweisbar waren. Diese werden in der Monographie einzeln aufgelistet und enthalten ein zusätzliches Akzeptanzkriterium. Wann immer möglich sollte die Struktur der Verunreinigung aufgeklärt sein. Sollte dies nicht möglich sein, sollten vom Hersteller oder dem zuständigen Labor die unternommenen misslungenen Schritte zur Strukturaufklärung in einer Studie belegt werden[45]. In der Monographie zu Tryptophan (Ph. Eur. 6.2 01/2008:1272) wurden unter dem Reinheitstest auf „1,1′-ethylidene(bistryptophan), andere verwandte Substanzen“ bereits spezifizierte Verunreinigungen implementiert. Zu den anderen bestimmbaren Verunreinigungen werden jene gezählt, welche aufgrund ihrer Synthese oder durch Lagerung auftreten könnten. Diese wurden aber zum Zeitpunkt der Erstellung der Monographie nicht gefunden oder sie wurden von den vorgeschriebenen Prüfungen erfasst und kontrolliert, lagen jedoch in einer Konzentration unter 0.1 %[46]. Eine Tabelle mit Grenzwerten für die Identifizierung und Qualifizierung von Verunreinigungen befindet sich in der allgemeinen Monographie Substanzen zur pharmazeutischen Verwendung (Ph. Eur. 6.2 01/2008:2034). Tabelle 4 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Alanin L-Arginin L-Arginin HCl 1993 Ph. Eur. 2 1994 Ph. Eur. 2 1994 Ph. Eur. 2 In Kraft bei Beginn Dissertation Reinheitsprüfung Ph. Eur. 4 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin L-Asparagin Monohydrat 2005 Ph. Eur. 5 - DC mit Ninhydrin 0.5 L-Asparaginsäure 1994 Ph. Eur. 2 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin 0.5 L-Cystein HCl Monohydrat 1995 Ph. Eur. 2 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin 0.5 - - - DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin 0.5 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin 0.5 0.5 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin 0.5 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 10 ppm 1,1′ethylidenebi stryptophan 0.5 0.5 Aminosäure L-Glutamin 1. Monographie In Kraft bei Ende Dissertation Reinheitsprüfung Ph. Eur. 6.2 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin HCl L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin 1971 Ph. Helv VI 1993 Ph. Eur. 2 1991 Ph. Eur. 2 1995 Ph. Eur. 2 1976 Ph. Helv. VI 1995 Ph. Eur. 2 1993 Ph. Eur. 2 1993 Ph. Eur. 2 1995 Ph. Eur. 2 1996 Ph. Eur. 2 1993 Ph. Eur. 2 1993 Ph. Eur. 2 1993 Ph. Eur. 2 1996 Ph. Eur. 2 L-Tryptophan 2000 Ph. Eur. 4 DC mit Ninhydrin HPLC mit UVDetektion (220 nm) DC mit Ninhydrin HPLC mit UVDetektion (220 nm) L-Tyrosin L-Valin 1997 Ph. Eur. 3 1993 Ph. Eur. 2 DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin DC mit Ninhydrin L-Glutaminsäure Glycin L-Histidin L-Histidin HCl Detektions Limit (%) 0.5 0.5 0.5 15 16 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.2.1. Überarbeitung der Monographien Da die Aminosäuremonographien vor den beschriebenen allgemeinen Monographien in die Ph. Eur. aufgenommen wurden, sollte vor allem die Reinheitsprüfung an die neuen Anforderungen angepasst werden. Ein diesbezüglicher Bedarf wurde schon in einigen Untersuchungen von Holzgrabe, U. et al. festgestellt und es liegen zahlreiche Arbeiten und Vorschläge vor[5, 47, 48]. Eine 2005 erschienene Publikation dieser Gruppe mit dem Titel „Impurity Profile of Amino Acids?“ konkretisiert die Notwendigkeit einer Überarbeitung der Reinheitsprüfung für Aminosäuren in der Ph. Eur. und listet mögliche Verunreinigungen auf, wie sie in Aminosäuren auftreten könnten[4]. 3.2.2. Verunreinigungsprofil von Aminosäuren Da der Anteil der Aminosäure, welcher über die Technik der Fermentation produziert wurde in den letzten Jahren immer mehr zugenommen hat und damit zukunftsweisend ist, sollten die Prüfmethoden der Ph. Eur. diesem Umstand ebenfalls Rechnung tragen. Mit der Monographie Fermentationsprodukte wird zwar die Kontrolle bei Verfahrensänderungen geregelt, jedoch obliegt die Verpflichtung dem Hersteller, die dafür geeigneten Prüfmethoden zu wählen. Der Anwender, dem in den meisten Fällen keine genauen Informationen über Herstellungsprozess und verwendete Edukte und Hilfsstoffe vorliegen, muss sich auf die Reinheitsprüfung der Ph. Eur. verlassen (siehe 3.2. Aminosäuremonographien in der Pharmakopöe). Tabelle 5 stellt potentielle Verunreinigungen dar, wie sie bei der Fermentation auftreten könnten. Da es jedoch auszuschliessen ist, dass eine einzige Reinheitsprüfung in der Lage ist, sämtlichen Anforderungen bei allen Aminosäuren zu genügen, wurden diese potentiellen Verunreinigungen als Stoffgruppen erfasst (siehe 3.2.3. Stoffklassen) und entsprechende Prüfmethoden für die jeweiligen Gruppen erarbeitet. Aus Tabelle 5 wird ebenfalls klar, dass bedingt durch den Herstellungsprozess mit einer Vielzahl von Verunreinigungen unterschiedlichster Herkunft gerechnet werden muss. Eine vernünftige Wahl der geeigneten Methoden und der zu detektierenden potentiellen Verunreinigungen kann nur in Zusammenarbeit mit den Herstellern der entsprechenden Aminosäure und den zuständigen Behörden gemeinsam getroffen werden. Der Vorteil einer Überarbeitung der Reinheitsprüfung bei Aminosäuren liegt sicher eher beim Verwender als beim Hersteller. Der Hersteller befindet sich sowieso in der Pflicht die Reinheit seines Produktes zu garantieren. Da er seine Ausgangsprodukte kennt und die kritischen Schritte in seinem Produktionsprozess definiert hat, werden seine eigenen Reinheitsprüfungen weitergehend und angepasster sein, als die bisherigen Anforderungen der Ph. Eur. Eine Anpassung der Reinheitsprüfung hätte für den Konsumenten den Vorteil, dass vor der Anwendung oder Weiterverarbeitung der Aminosäure eine Eingangskontrolle erfolgen könnte, welche sich mit dem realen Verunreinigungsprofil des Produzenten vergleichen liesse. Des Weiteren würde es dem Produzenten und Kunden ein validiertes Prüfinstrumentarium liefern. Die Monographie von L-Trp (Ph. Eur. 6.2 01/2008:2072) oder aber auch die neue Monographie für Melphalan[49] sind Beispiele in welche Richtung zukünftige Reinheitsprüfungen gehen könnten. Aminosäuren in der Pharmakopöe Tabelle 5 potentielle Verunreinigungen in Aminosäuren, wie sie bei fermentativer Herstellung auftreten könnten. Bakterienbestandteile/ Bakterienstoffwechsel Zellwand Nukleinsäure Kohlenhydrate Glucosamine Proteine Oligopeptide Dipeptide Aminosäuren Biogene Amine Organische Säuren und weitere Salze Nährmedium Hilfsstoffe Aufarbeitung Vitamine Melasse andere AS Weitere Tenside Antischaummittel Antibiotika Lokalanästhetika Ölsäure Lösungsmittel N-Acetyl-D-muraminsäure N-Acetyl-D-glucosamin Ala, Met, Ile, Thr, Val, Leu Cadaverin Acetate, Lactat, Pyruvat NaCl, Citrat, CaCl2, MgSO4, EDTA, FeSO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, MnSO4, Na2B4O7, FeCl3, ZnSO4, CuCl2, (NH4)6Mo7O24 Thiamin, Biotin, Pantothensäure Glucose, Saccharode Thr, Met, Leu, Urea Tween, Dodecylammoniumacetat Penicillin, Kanamycin, Teracyclin 17 18 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.2.3. Stoffklassen Aus Tabelle 5 wurden folgende Stoffgruppen als potentielle Quellen für Verunreinigungen definiert: Flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittelrück-stände, Aminosäuren und Derivate, Kohlenhydraten, Antibiotika, Metalle und andere Verunreinigungen. Diese Einteilung wurde vorallem auch von den Detektionsmethoden beeinflusst. In einem ersten Schritt wurden Analysemethoden für diese Stoffklassen erstellt um dann die Reinheit von 20 kommerziellen Aminosäuren mit Ph. Eur. Qualität zu untersuchen. Die Fähigkeit der entwickelten Methoden Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukte zu detektieren, sollte durch Vergleich mit gestressten Proben (Wärme und Bestrahlung) erbracht werden. In dieser Arbeit wurden Aminosäuren vor allem im Zusammenhang mit Fremdaminosäuren und Derivaten, Flüchtigen Verunreinigungen, Lösungsmittelrückständen, Kohlenhydraten, Antibiotika und Metallen untersucht. Die Stoffgruppe der anderen Verunreinigungen stellte all jene dar, welche hier nicht berücksichtigt wurden. Dazu gehören beispielsweise Anforderungen, wie sie an Parenteralia (Ph. Eur. 01/2008:0520) gestellt werden (Sterilität, Endotoxine/Pyrogene), Hilfsstoffe (Tenside, Antischaummittel), Proteine, Nuklein- und organische Säuren. Tabelle 6 Stoffklassen, welche bei Erstellung des Verunreinigungsprofils für Aminosäuren überprüft wurden Flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände Antibiotika Aminosäuren und Derivate Metalle Kohlenhydrate Andere Verunreinigungen Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3. Aminosäuren und Derivate Wie unter 3.2. (Aminosäuremonographien in der Pharmakopöe) ausgeführt, verlangt die Ph. Eur. in ihren Monographien für die meisten Aminosäuren unter der Prüfung auf Reinheit eine DC-Methode auf Ninhydrin nachweisbare Substanzen. Bei dieser Methode reagiert Ninhydrin quantitativ mit primären oder sekundären Aminen bei einer Temperatur von 100 – 120 °C zum Ruhemans Violett. Die Nachweisgrenze liegt sehr tief (ca. 50 pmol)[50]. Dieser Test stellt für sich alleine keine zeitgemässe Lösung mehr dar (siehe 3.2.). In einer Dissertation von N. Novatchev wurde eine neue Methode mittels Vorsäulenderivatisierung (FMOC), Kapillarelektrophorese (CE) und UV-Detektion (254 nm) vorgestellt[47]. Darin wurden ebenfalls alle gängigen Derivatisierungsreagenzien für Aminosäuren ausführlich abgehandelt und FMOC als geeignet ausgewählt. Es konnte auch gezeigt werden, dass die neue Methode der Ph. Eur. Methode hinsichtlich der Nachweisgrenze und der Quantifizierbarkeit von potentiellen Verunreinigungen überlegen war[5]. Diese neue Methode stellt deswegen rein von ihrer Leistung her gesehen eine gute Lösung dieses Problems dar und wurde ausführlich behandelt. In dieser Arbeit wurde eine Alternativmethode auf Basis von HPLC erstellt. Der Grund ist vor allem darin zu sehen, dass HPLC in der in der industriellen pharmazeutischen Praxis verbreiteter ist als CE (siehe 3.8.). 3.3.1. HPLC Methode mit Vorsäulenderivatisierung Die Möglichkeiten Aminosäuren ohne Derivatisierung direkt nachzuweisen sind begrenzt. Dies liegt daran, dass die meisten Aminosäuren keine chromophore Gruppe besitzen (Ausnahme His, Phe, Trp und Tyr). Dadurch kämen UV-Detektion im tiefen Wellenlängenbereich, Detektion mittels Brechungsindex, ampèrometrische Detektion und Massenspektroskopie in Frage. Für die Spurenanalyse von Fremdaminosäuren wäre wohl die zu hohe Nachweisgrenze der UV-Detektion und der Detektion mittels Brechungsindex limitierend. Die Verwendung von Ionenchromatographie mit ampèrometrischer Detektion wäre sicher vielversprechender. Dabei könnten neben Fremdaminosäuren, auch Kohlenhydrate, Alkohole und anorganische Ionen gleichzeitig detektiert werden. Es existieren auch schon fertige Applikationen, welche sich mit der Bestimmung von Aminosäuren in einer Fermentationsbrühe befassen[51, 52]. Dabei geht es aber eher um Fragestellungen der Zusammensetzung und Quantifizierbarkeit. Grundsätzlich käme diese Methode aber sicher in Frage und hätte gute Erfolgsaussichten. Dasselbe gilt auch für LC-MS. Da die Trennung der polaren Aminosäuren mit herkömmlichen RPSäulen schwierig wäre, könnte die Kombination von HILIC und MS-Detektion eine weitere Möglichkeit darstellen[53]. Wie schon unter 3.3. (Aminosäuren und Derivate) begründet, fiel die Wahl aber auf HPLC mit Vorsäulenderivatisierung. Die Pharmakopöe enthält in der Zwischenzeit unter den allgemeinen Methoden (Ph. Eur. 6.2 01/2008:20256) ein eigenes Kapitel „Amino acid analysis“. Dieses stellt eine Methodik zur Bestimmung der Aminosäurenzusammensetzung in Proteinen, Peptiden und anderen pharmazeutischen Zubereitungen und deren Quantifizierung dar. Darüber hinaus werden darin alle üblichen Derivatisierungsreagenzien, wie sie in der Chromatographie von Aminosäuren verwendet werden, vorgestellt. Die Detektion von Fremdaminosäuren als Verunreinigung in Aminosäuren stellt allerdings einige Anforderungen an das potentielle Derivatisierunsreagenz. So muss das verwendete Reagenz natürlich möglichst rein sein, um selbst nicht Verunreinigungen in die Probe einzubringen. Die Reaktion sollte quantitativ, vollständig und entstehende 19 20 Aminosäuren in der Pharmakopöe Nebenprodukte möglichst limitiert und klar abtrennbar sein. Das Derivat sollte die Detektion einer potentiellen Verunreinigung in einer Aminosäure bis zu einer Nachweisgrenze von 0.05 % (Mol/Mol) ermöglichen. Dazu sollte es bei Raumtemperatur möglichst stabil sein um längere Analysezeiten zu ermöglichen. Schliesslich wäre es noch wünschenswert, wenn das Derivatisierungsreagenz nicht zu teuer und bereits gut erprobt wäre. Aus diesem Grund fiel die Wahl auf das bereits gut untersuchte FMOC, welches diese Anforderungen erfüllte[47]. Daneben wurde aber auch die Derivatisierung mittels Dabsyl-Cl (4-Dimetylaminoazobenzol-4sulfonylchlorid) und AccQ-Tag (Kit der Firma Waters zur Aminosäurenanalyse mittels 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate) in Betracht gezogen. Tabelle 7 zeigt einen Vergleich der 3 Derivatisierungsreagenzien. Tabelle 7 Vergleich von 3 Derivatisierungsreagenzien Derivatisierungsreagenz FMOC-Cl Dabsyl-Cl[54, 55] AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit 250 Analyses [56, 57] Preis (05/08) Stabilität 44.50 Fr. 1g Fluka 126.50 Fr. 1g Fluka 690.- Fr. 250 Analysen Waters stabil Nachweisgrenze Bereich fmol stabil pmol stabil fmol Reaktion Detektion pH 8.5, 1 min, RT pH 9, 15 min, 70°C pH 8.5, 10 min, 55 °C UV 254 FL ex. 260 nm em. 313 nm UV 436 nm UV 250 nm FL ex. 250 em. 395/520 nm 3.3.2. Derivatisierung mit Dabsyl-Cl Es wurde dabei eine automatisierte Methode zur Derivatisierung von Aminosäuren mit Dabsyl-Cl angestrebt. Das verwendete Equipment bestand aus einem Interface (DX-LAN Dionex), einer Gradient Pump (GP50 Dionex), einem UV-VIS-Detektor (AD25 Dionex), PeakNet Software und einem programmierbaren Autosampler mit Heizblock (AS3500 Dionex). Die Derivatisierung wurde unter den Bedingungen wie in Tabelle 7 erwähnt durchgeführt. Es zeigte sich aber schnell, dass die Derivatisierung zu vielen störenden Nebenpeaks führte. Zudem gelang es nicht den Peak (DabsylOH), des im Überschuss zugegebenen Derivatisierungsreagenzes genügend von den gesuchten Aminosäuren abzutrennen. Die gewünschte Nachweisgrenze von 0.05 % (Mol/Mol) konnte ebenfalls nicht gewährleistet werden. Deswegen wurde diese Methode nicht mehr weiter verfolgt. Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.3. Derivatisierung mittels UPLC und ACCQ-Tag Hierbei handelte es sich nur um einen einmaligen Kurzversuch, welcher bei der Firma Waters (Baden-Dättwil) durchgeführt wurde. Es sollte abgeklärt werden, ob mit einer bereits entwickelten Applikation zur Aminosäurenanalyse vergleichbare Resultate wie mit der FMOC-Cl Methode (3.3.4.) erzielt werden konnten. Dazu wurde L-Asp mit 0.05 % (Mol/Mol) L-Ala, Gly, L-Met und L-Tyr verunreinigt. Es sollte dadurch gezeigt werden, ob diese Verunreinigungen mit der Firmenmethode gefunden werden konnten. Die verwendete Gerätekonfiguration bestand aus einem Acquity Ultraperformance LC (Binary Solvent Pump, Sample Manager, Column Manager, PDA Detector), AccQ Tag Ultra Säule (2.1 x 100 mm, 1.7 µm, 0134161861CC) und Empower software zur Auswertung. Die Derivatisierung wurde mit einem AccQ-Tag Ultra Derivatisierungskit (Lot.No. 060482, Cat.No. 186003836) nach Anleitung durchgeführt und die Proben analysiert. Leider konnten jedoch keine verwertbaren Resultate erzielt werden und der Nachweis der Verunreinigungen in L-Asp gelang zu diesem Zeitpunkt nicht. Für weiterführende Untersuchungen stand die Firma leider nicht mehr zur Verfügung. Aus analytischer Sicht wurde das Potential der Methode aber noch lange nicht ausgeschöpft. 21 22 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.4. Derivatisierung mit FMOC-Cl 3.3.4.1. Geräte und Materialien Gerät Interface Gradient Pump Autosampler UV-VIS-Detektor FL-Detektor Software D-7000 (Merck HITACHI) L-7100 (Merck HITACHI) L-7200 (Merck HITACHI) L-7400 (Merck HITACHI) L-7480 (Merck HITACHI) D-7000 HMS Säulen Vorsäule Spherisorb® ODS2 5µm 4x4mm (Waters) Trennsäule Spherisorb® ODS2 5µm 250x4mm (Waters) Detektion Fluoreszenz (ex. 260 nm, em. 313 nm) Injektionsvolumen 10 µl (entspricht 125 pmol eingespritze Aminosäure) Fliessgeschwindigkeit 1 ml/min Mobile Phase A: Puffer: 10 mM NaH2PO4 pH 8 – Acetonitril (90:10) B: Acetonitril Trennprogramm Zeit (min) A (%) 0 98 8 91 10 90 21 89 25 82 35 81 36 65 42 65 45 15 50 15 55 98 60 98 Substanz FMOC-Cl Acetonitril NaH2PO4 Dihydrat NaOH in rotulis Borsäure n-Pentan B (%) 2 9 10 11 18 19 35 35 85 85 2 2 Qualität BioChemika, ≥99.0% (HPLC), for fluorescence gradient grade HPLC Ph. Eur. puriss p. a. puriss p. a. ACS reagent SupraSolv® Hersteller Fluka Merck Hänseler Fluka Fluka Merck Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.4.2. Methodenentwicklung 3.3.4.2.1 Derivatisierung Die Derivatisierung von Aminosäuren mit FMOC-Cl und Fluoreszenzdetektion ist in der Chromatographie eine bereits etablierte Methode und wurde in der Literatur zahlreich beschrieben[58]. FMOC-Cl reagiert schon bei RT mit primären und sekundären Aminosäuren zu fluoreszierenden Verbindungen, welche sehr sensitiv detektiert werden können. Zur Untersuchung von Trp mittels Fluoreszenzdetektion ist das Derivatisierungsreagenz aufgrund von intramolekularem Quenching nicht geeignet. Da die Ph. Eur. die Reinheitsprüfung von Trp bereits mit einer HPLCMethode ergänzt hat, wurde diese hier nicht mehr berücksichtigt. Die optimalen Reaktions- und Detektionsbedingungen von FMOC-Cl mit Aminosäuren wurden bereits gut untersucht (siehe Tabelle 8). Die Abbildung S. 150 im Anhang zeigt die Probenvorbereitung mit Derivatisierung, wie sie für die Hauptversuche durchgeführt wurden. Tabelle 8 Literatur zur Derivatisierung von Aminosäuren mit FMOC-Cl Literatur Einarsson et al.[59, 60] Haynes et al.[61, 62] Chan et al.[63] Ou et al.[64] Novatchev et al.[47] Ph. Eur. 5.08 (2.2.56.) pH 7.7 8.5 9.3 8.8 9.3 - Temperatur RT 21 °C RT RT RT RT Reaktionszeit 30 - 120 s 90 s 60 s 90 s 120 s 30 s Stabilität Bis 13 Tage, ausser His Sicher bis 24 h stabil stabil Stabil, ausser His Bei einer Reinheitsprüfung sollte die zu prüfende Substanz so wenig wie möglich vor der Messung verändert werden und selbst Lösungsvorgänge bergen schon das Risiko einer Kontamination der Probe. Dasselbe gilt entsprechend für die Derivatisierung. Da es sich bei der Derivatisierung um Zugabe eines reaktiven Fremdstoffes in die zu untersuchende Probe handelt, sollte dieses deshalb in möglichst kleiner Menge zugeführt werden. Trotzdem muss die Menge ausreichen für reproduzierbare Ergebnisse. Um ein optimales Verhältnis zwischen dem eingesetzten Derivatisierungsreagenz und den zu untersuchenden Aminosäuren zu finden, wurde L-Ser mit verschiedenen Überschüssen FMOC-Cl (2 – 20 in 7 Schritten) derivatisiert. Daneben wurde L-Ser mit 0.05 % (mol/mol) L-Asp, L-Leu und und L-Val verunreinigt um das Verhalten von kleinen Mengen Aminosäuren als potentielle Verunreinigungen in L-Ser bei unterschiedlichen Verhältnissen FMOC-Cl zu verfolgen (siehe Abbildung 1). Es zeigte sich, dass die Signalfläche von L-Ser bei allen untersuchten Verhältnissen FMOC-Cl annähernd gleich blieb (siehe Abbildung 2). Ähnlich verhielt es sich, wenn die zu detektierenden Aminosäuren als 0.05 %-ige (Mol/Mol) Verunreinigung der Hauptsubstanz zugesetzt waren (siehe Abbildung 3). Auch hier schien schon 2facher Reagenzienüberschuss zu einem vernünftigen Signal zu führen. Um sicher genügend Kapazität zu erreichen, wurde 6-facher Derivatisierungsüberschuss gewählt. Auf Stabilitätsuntersuchungen der derivatisierten Aminosäuren wurde verzichtet, da diese in der Literatur als stabil bei Raumtemperatur während 1 Woche beschrieben worden waren (siehe Tabelle 7). Es ergaben sich während den Untersuchungen auch keine Anhaltspunkte für eine Problematik mit der Stabilität (ausser bei L-His 23 24 Aminosäuren in der Pharmakopöe siehe Tabelle 7). Die Proben wurden bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert und innerhalb 8 Stunden zum ersten Mal gemessen. Eine Messserie dauerte nie länger als 48 h. Ser FMOC OH — L-Ser gespiked mit 0.05 % (mol/mol) L-Asp, L-Leu und L-Val — L-Ser — blank Asp Leu Val Abbildung 1 HPLC mit FMOC Vorsäulenderivatisierung und Fluoreszenzdetektion von L-Ser Aminosäuren in der Pharmakopöe Ermittlung der optimalen Menge FMOC-Cl zur Derivatisierung 14000000 12000000 Fläche (mVs) 10000000 8000000 L-Ser (nach nPentan Extraktion) 6000000 L-Ser 4000000 2000000 0 2 4 6 8 10 15 20 Verhältnis FMOC-Cl / L-Ser (mol/mol) Abbildung 2 Derivatisierung von L-Ser mit FMOC-Cl Überschuss (2-20-fach) Ermittlung des optimalen Verhältnis FMOC-C-/Aminosäure 600000 Signalfläche (mVs) 500000 400000 L-Asp 300000 L-Val L-Leu 200000 100000 0 1 2 4 6 10 15 20 Ueberschuss FMOC-Cl/Aminosäure (mol/mol) Abbildung 3 FMOC-Derivatisierung von L-Ser mit 0.05 % L-Asp, L-Leu und L-Val (FMOC-Cl Überschuss 2-20-fach) 25 26 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.4.2.2 Extraktion mit n-Pentan Die Literatur beschrieb die Möglichkeit der Reduktion von überschüssigem Derivatisierungsreagenz und seinem Hydrolyseprodukt aus der derivatisierten Probe mit einer n-Pentan Extraktion[47]. Bei eigenen Versuchen mit Einspritzungen von FMOC-Cl Derivatisierungen ohne Aminosäuren konnten mit solchen Extraktion 4 von 5 auftretenden Nebenpeaks des Reagenzes entfernt werden. Daher schien es sinnvoll diese Extraktion beizubehalten. Allerdings barg die Extraktion das grosse Risiko, dass potentielle Verunreinigungen so der der Detektion entgehen könnten. Dies wurde bei den Untersuchungen der 19 Aminosäuren (siehe 3.3.4.4.1) berücksichtigt und deswegen bei diesen Aminosäuren jeweils die n-Pentanphase zusätzlich gemessen. Das heisst, der n-Pentanüberstand nach der ersten Extraktion (siehe Anhang S.150) wurde nicht verworfen, sondern 200 µl davon in ein HPLC Glässchen überführt und mit Stickstoff eingedampft. Danach wurde der Rückstand in 1 ml Eluent gelöst und gleich wie die Aminosäureproben vermessen. Es zeigte sich, dass keine zusätzlichen Peaks gefunden wurden, welche nicht auch in den derivatisierten Aminosäureproben vorkamen. Die Extraktion entzog aber, wenn auch nie vollständig, den Proben derivatisierte Aminosäuren. In Abbildung 2 ist ersichtlich, dass die Signalfläche von L-Ser nach einer n-Pentantextraktion um 14.7 % abnahm. Für die Untersuchungen der verschiedenen Chargen L-Ile, L-Phe und L-Ser wurde dann auf Messung der n-Pentanphase verzichtet, da die Untersuchung an den 19 Aminosäuren keinen zusätzlichen Informationsgewinn gebracht hatte. Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.4.2.3 Trennung und Detektion der derivatisierten Aminossäuren Die angestrebte Trennmethode sollte der Reinheitsprüfung von Aminosäuren dienen und deswegen in der Lage sein ein möglichst breites Feld an aminhaltigen Verbindungen aufzutrennen. Die 19 zu untersuchenden Aminossäuren bildeten genau so einen Pool und gehörten sowieso zu den erwarteten potentiellen Verunreinigungen. Es schien daher Vernünftig eine Methode zu entwickeln, welche in der Lage war diese Aminosäuren voneinander zu trennen. Damit konnten alle Untersuchungen mit derselben Trennmethode durchgeführt werden und ein Vergleich untereinander wäre auch möglich. Zudem sollte die Reinheitsprüfung eine Detektion von Fremdaminosäuren bis zu einem Limit von 0.05 % (Mol/Mol) gegenüber der zu untersuchenden Aminosäure gewährleisten. Für die Detektion standen 2 Möglichkeiten offen. FMOC derivatisierte Verbindungen lassen sich entweder im UV-Bereich bei 256 nm oder mittels Fluoreszenz (ex. 260 nm/em. 313 nm) detektieren. Da sich Fluoreszenzdetektion durch sehr hohe Empfindlichkeit auszeichnet und dies für Analysen im Spurenbereich gefordert ist, wurde diese der UV-Vis-Detektion vorgezogen. Die höhere Spezifität der Fluoreszenzdetektion wurde hier nicht als Nachteil gewertet, da bei diesen Untersuchungen das Interesse nur im Nachweis der derivatisierten Verbindungen lag. Als Trennsäule wurde eine endcapped RP18 Säule (Waters Spherisorb® 5µm ODS2 4.0x250mm) verwendet. Ausgehend aus Vorversuchen, bei welchen verschiedene in der Literatur[65, 66] beschriebene Eluenten ausprobiert wurden, schien die Entwicklung eines Gradientenprogramms mit Acetonitril und Natriumdihydrogenphosphat (10 mM) als Puffer am aussichtsreichsten. Bei Trennversuchen der 19 Aminosäuren mit unterschiedlichem pH des Puffers (4-8) zeigte sich, dass bei pH 8 die beste Trennung erreicht werden konnte. Eine Erhöhung der Säulentemperatur verschlechterte die Trennleistung, so dass diese bei 25 °C mit einem Säulenofen konstant gehalten wurde. Nach weiterer Optimierung des Gradientenprogramms wurde eine Trennung wie unter Abbildung 4 erreicht. 27 28 Aminosäuren in der Pharmakopöe 12 345 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Abbildung 4 Trennung eines Aminosäuren-Testgemisches Aminosäuren Testgemisches mit der entwickelten Methode (1 L-Asp, 2 L-Glu, 3 L--Asn, 4 L-Gln, 5 L-Ser, 6 Gly, 7 L-Thr Thr und L-His, L 8 L-Ala, 9 L-Pro, 10 L-Tyr, 11 L-Val, Val, 12 L-Met, L 13 L-Ile, 14 L-Leu, 15 L-Arg, 16 L-Phe, Phe, 17 L-Lys, L 18 L-Cys und 19 FMOC-OH) Abbildung 5 Response von 19 Aminosäuren nach FMOC-Cl FMOC Cl Derivatisierung Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.4.2.4 Bestimmung der Messabweichung der Methode Mit der entwickelten HPLC-Methode sollte die Reinheit einer Aminosäure überprüft werden. Zusätzlich sollte auch eine Aussage über den Gehalt dieser Aminosäure vor und nach einer Stressbehandlung unter Sterilisationsbedigungen (Hitze und Bestrahlung) ermöglicht werden. Wie im Schema S. 150 ersichtlich beinhaltete die Probevorbereitung neben der Derivatisierung zahlreiche Verdünnungsschritte, welche alle mit einer Unsicherheit behaftet waren. Da die Probenvorbereitung bei allen untersuchten Aminossäuren identisch war, wurde die Messabweichung von LAsp exemplarisch für alle anderen untersucht. Zur Bestimmung wurden 6 L-Asp Lösungen hergestellt und jede mit der entwickelten Methode dreimal vermessen (siehe Tabelle 9). Die dreifach Messungen der gleichen Probe zeigten sehr kleine relative Standardabweichungen < 0.7 %. Dies war zu erwarten, da es sich ja dabei lediglich um den Injektionsfehler des Gerätes handelte. Die relativen Standardabweichungen zwischen den 6 Lösungen lagen < 2.6 % und beschrieben den Fehler, wie er sich durch Einwaage, Derivatisierung und Verdünnungsschritte erklärte. Um eine Abschätzung der zu erwartenden Messabweichung zu bekommen, wurde diese nach DIN 1319 bestimmt. Dabei wurden die Signalflächen der Messung 2 verwendet, welche die grösste relative Standardabweichung zeigte. Es wurde eine Messabweichung von 2.71 % für die 6 Werte berechnet. Als weitere Sicherheit wurde dieser Wert mit dem Faktor 2 multipliziert. Einen Unterschied im Gehalt zwischen 2 Proben wurde somit nur dann deklariert, wenn er grösser als 5.5 % war. Lösung L-Asp 1 L-Asp 2 L-Asp 3 L-Asp 4 L-Asp 5 L-Asp 6 Mittelwert (mVs) Rsd (%) Messung 1 (mVs) 4360553 4418140 4322672 4281114 4360557 4547630 Messung 2 (mVs) 4323948 4411401 4315836 4275303 4329125 4585114 Messung 3 (mVs) 4335412 4399088 4357275 4305442 4372142 4604845 4381778 2.13 4373455 2.58 4395701 2.44 Mittelwert (mVs) 4339971 4409543 4331927 4287286 4353941 4579196 Rsd (%) 0.43 0.22 0.51 0.37 0.51 0.63 Tabelle 9 relative Standardabweichung nach HPLC-Messung von 6 L-Asp-Lösungen (Signalflächen entsprechen 2.5 fmol L-Asp) mit FMOC-Vorsäulenderivatisation Standardabweichung des Mittelwertes = Messabweichung (%) = Vertauensniveau P Student t-Faktor für n=6 Messabweichung Mittelwert Messung 2 Messabweichung in % Std ඥAnzahl Messungen (t-Faktor × Standardabweichung des Mittelwertes) × 100 Mittelwert 95% 2.57 118340 4373455 2.71 29 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.4.3. Probenvorbereitung vorbereitung und Methode Die zu untersuchende Aminosäure wurde nach dem Schema S. 150 hergestellt und derivatisiert. 3.3.4.4. Resultat der Untersuchungen auf Aminosäuren und Derivate 3.3.4.4.1 Untersuchung von 19 Aminosäuren Mit der entwickelten Methode wurden die Aminosäuren L-Ala, L L-Arg, L-Asp, Asp, L-Asn, L LAsp, L-Cys HCL, L-Gln, Gln, Gly, L-Glu, L L-His, L-Ile, L-Leu, L-Lys HCl, L-Phe, Phe, L-Pro, L LSer, L-Thr, L-Tyr und L-Val Val untersucht. Die Aminosäuren wurden bei einem kommerziellen mmerziellen Anbieter eingekauft und wiesen bis auf L-Asn L und L-Gln Gln Ph. Eur. Qualität auf (Tabelle 21, S. 107 7). Ausser bei L-Ala und L-Pro Pro konnten bei allen untersuchten Aminosäuren zusätzliche Peaks gefunden werden, welche auf Verunreinigungen hindeuten. Abbildung 6 zeigt eine qualitative Zusammenfassung der Resultate. Im Folgenden wurden w die Resultate der untersuchten Aminosäuren einzeln aufgelistet. Beim Gehaltsvergleich wurde die Signalfläche der unbehandelten Aminosäure jeweils auf 100 % gesetzt und die e unter Sterilisationsbedingungen behandelten prozentual dazu angegeben. Ein Wert musste über 5.5 % von den 100% abweichen um als signifikant zu gelten (siehe auch 3.3.4.2.4). Anzahl gefundener Peaks 30 HPLC Messungen mit FMOC Vorsäulenderivatisierung 25 20 15 10 5 0 γ behandelt e- behandelt wärmebehandelt unbehandelt Abbildung 6 Übersicht der HPLC Messungen mit FMOC-Vorsäulenderivatisierung FMOC Vorsäulenderivatisierung Aminosäuren in der Pharmakopöe 31 L-Alanin Es konnten keine Verunreinigungen und kein signifikanter Unterschied im Gehalt zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Ala gefunden werden. - L-Ala L-Ala TS L-Ala e L-Ala γ Gehalt 100.0 % 103.8 % 100.2 % 102.1 % Verun. - - - - L-Arginin Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Arg. Für L-Arg konnten 5 Verunreinigungspeaks gefunden werden und die Gesamtverunreinigung lag um 1 %. Bei e-- und γ- bestrahltem L-Arg konnten zusätzlich 2 kleine peaks detektiert werden. Auf die Gesamtverunreinigung hatte dies aber keinen Einfluss. FMOC — γ -behandelt L-Arg — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 3. 4. 2. 1. 5. - 6. 7. L-Arg L-Arg TS L-Arg e L-Arg γ Gehalt 100.0 % 94.9 % 99.5 % 105.0 % Gesamtver. 1.07 % 1.00 % 1.01 % 0.83 % Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 11.49 29.71 39.25 40.23 42.87 47.97 1806912 189271 1716238 1598246 13.5 14.5 1.3 1.7 1702346 204810 1627265 1508450 8.5 51.7 1.0 0.6 65510 70217 1654941 327034 1550112 1439911 11.6 27.1 11.3 53.7 5.3 2.2 63773 6.7 104459 15.9 1679801 6.0 139255 12.5 1507195 1.3 1354944 2.2 7. 50.04 1217359 21.1 772342 54.8 1074425 19.1 503063 40.4 32 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Asparagin Nach einer Behandlung von L-Asn unter Trockensterilisationsbedingungen nahm der Gehalt um 9 % ab. Das Verunreinigungsprofil (6 zusätzliche gefundene Peaks) zeigte aber keine zusätzlichen oder grösseren Peaks gegenüber dem unbehandelten LAsn. Mögliche Zersetzungsprodukte, welche mit der Gehaltserniedrigung auftraten, konnten mit dieser Methode nicht erfasst werden. — γ behandelt L-Asn 1. 2. 5. FMOC — e- behandelt 3. 4. 6. - — wärmebehandelt — unbehandelt — blank L-Asn L-Asn TS L-Asn e L-Asn γ Gehalt 100.0 % 90.9 % 97.8 % 96.4 % Gesamtver. 1.51 % 1.62 % 1.39 % 1.39 % Nr. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Rt (min) 4.96 5.83 23.92 26.27 40.95 43.61 Signalfläche (mVs) 1216122 56128 3567101 439171 3326481 968565 rsd (%) 4.0 15.5 4.7 32.0 2.9 15.3 Signalfläche (mVs) 1236662 49529 3584445 123210 3247089 1101967 rsd (%) 2.6 3.7 14.6 24.3 0.5 16.7 Signalfläche (mVs) rsd (%) 1235704 2.2 37801 29.7 2826724 7.4 159697 65.4 3304900 1.1 1046078 19.6 Signalfläche (mVs) rsd (%) 1206779 1.8 39457 24.3 2990326 3.2 99709 26.1 3260580 1.6 912007 20.0 Aminosäuren in der Pharmakopöe 33 L-Asparaginsäure Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Asp. Das strahlenbehandelte L-Asp zeigte einen zusätzlichen Peak gegenüber dem unbehandelten und temperaturbehandelten L-Asp. Die Gesamtverunreinigung war mit 0.06 % sehr klein. FMOC — γ -behandelt L-Asp 1. 2. — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 3. 4. - L-Asp L-Asp TS L-Asp e L-Asp γ Gehalt 100.0 % 95.3 % 98.5 % 98.7 % Gesamtver. 0.06 % 0.06 % 0.05 % 0.05 % Nr. 1. 2. 3. 4. Rt (min) 2.23 10.35 14.60 20.21 Signalfläche (mVs) 191699 69479 96176 - rsd (%) 3.4 5.2 6.3 - Signalfläche (mVs) 208931 42418 93652 - rsd (%) 11.8 12.2 10.6 - Signalfläche (mVs) rsd (%) 167093 2.2 12867 23.8 75152 5.6 33797 9.7 Signalfläche (mVs) rsd (%) 152513 7.0 23508 23.8 82572 3.8 36779 3.4 34 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Cystein HCl Die Peaks von L-Cys und FMOC lagen sehr dicht beieinander und konnten bei der Reinheitsprüfung nicht vollständig getrennt werden. Deswegen wurde für den Gehaltsvergleich ein Alternativgradient verwendet, welcher die vollständige Auftrennung ermöglichte. Wie schon visuell beobachtbar, hatte sich das wärmebehandelte L-Cys vollständig zersetzt. Dies zeigte sich auch in den zahlreichen Peaks, wie sie zusätzlich gegenüber der unbehandelten Aminosäure detektiert werden konnten. Bei einem Gehaltsvergleich konnte zudem eine starke Signalzunahme von e- behandeltem Cys beobachtet werden. Die Ursache konnte nicht aufgeklärt werden. Als Möglichkeit könnte ein stark fluoreszierendes Zersetzungsprodukt, welches sich unter dem Hauptpeak verbirgt in Frage kommen. Es wäre auch denkbar, dass die eBestrahlung die Fluoreszenz von Cys HCl begünstigt. Dieses Phänomen konnte auch bei L-His beobachtet werden. Die Strahlenbehandlung stellte auf jeden Fall die stressärmere Behandlung der Aminosäure dar und viele der nach Wärmebehandlung auftretenden Nebenpeaks traten nicht auf. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank L-Cys HCl 10. FMOC 19. – 24. 1. – 8. Gehalt Gesamtver. Nr. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Rt (min) 5.22 6.99 7.75 8.68 8.97 9.31 10.19 11.42 11. – 17. 9. 18. - L-Cys HCl L- Cys HCl TS L- Cys HCl e 100.00% 8 % (zersetzt) 106.50% 98.30% 4.57% - 3.45% 4.53% Signalfläche (mVs) 231168 - rsd (%) 74.4 - Signalfläche (mVs) 136733 410216 60216 257680 397029 505541 928368 205833 rsd (%) 94.2 8.5 3.7 2.2 3.1 3.7 6.9 11.0 Signalfläche (mVs) rsd (%) 333281 80.0 - L- Cys HCl γ Signalfläche (mVs) rsd (%) 304851 68.6 - Aminosäuren in der Pharmakopöe 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 17.58 19.49 26.45 27.32 27.76 28.77 29.61 30.39 31.84 35.57 37.53 39 39.12 39.39 40.63 42.21 961524 83118 447282 444365 30427 503376 - 33.4 12.7 2.4 5.9 24.1 29.3 - 306932 62177120 492597 473844 1086043 1577898 1553625 524013 163272 1266476 10553278 5008405 9393616 141262 587280 1798573 22.8 1.7 42.5 36.0 13.4 7.4 3.9 12.4 10.5 6.1 1.2 75.9 25.2 7.3 42.4 34.5 158716 737436 78883 469065 459610 976899 171229 111014 3.5 35.6 5.4 3.0 11.0 14.5 83.2 66.0 164488 1.4 1072951 33.3 65001 9.8 419113 2.9 391279 5.0 750885 16.5 61387 120 73525 9.7 35 36 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Glutamin L-Gln zersetzte sich nach der Wärmebehandlung vollständig, was auch im Chromatogramm erkennbar war. Die Strahlenbehandlung zeigte keinen signifikanten Unterschied im Gehalt gegenüber der unbehandelten Aminosäure. Bei Peak 1 könnte es sich nach Vergleich der Relativenretention um Glu handeln. L-Gln FMOC 6. 3. 1. 4. 2. 7. 5. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 9. 8. - L-Gln L-Gln TS L-Gln e L-Gln γ Gehalt 100.0 % zersetzt 98.6 % 96.1 % Gesamtver. 1.16 % - 1.23 % 1.42 % Nr. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Rt (min) 5.71 14.89 21.37 23.92 39.09 40.73 41.51 45.95 48.12 Signalfläche (mVs) 43335 103291 54475 7231273 - rsd (%) 6.1 5.9 19.4 0.7 - Signalfläche (mVs) 442754 46521 417606 355619 207469 1133641 62283333 2276733 rsd (%) 4.0 24.3 53.0 9.3 5.9 0.3 19.7 6.2 Signalfläche (mVs) rsd (%) 40675 9.0 78349 19.6 101111 42.4 53210 25.6 7481023 2.5 - Signalfläche (mVs) 44511 102848 141905 109808 8230319 100587 - rsd (%) 4.5 27.8 23.7 17.7 0.4 13.4 - Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Glutaminsäure Die Wärmebehandlung führte bei L-Glu zu einer signifikanten Gehaltsabnahme gegenüber der unbehandelten Aminosäure. Diese Abnahme spiegelte sich im Verunreinigungsprofil nicht wieder, welches dasselbe Muster wie die unbehandelte Aminosäure aufwies. Peak 3 wies auf eine Verunreinigung von Gln hin. L-Glu FMOC — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 3. 1. 2. 4. L-Glu L-Glu TS L-Glu e - L-Glu γ Gehalt 100.0 % 79.7 % 102.2 % 99.2 % Gesamtver. 0.50 % 0.60 % 0.49 % 0.50 % Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 2.39 5.12 15.91 19.57 28.00 Signalfläche (mVs) 394883 99080 2282903 48679 47113 rsd (%) 3.0 3.8 1.6 7.3 7.6 Signalfläche (mVs) 480487 86451 2063712 54937 44252 rsd (%) 2.1 5.2 0.5 3.4 5.6 Signalfläche (mVs) rsd (%) 379191 101976 2284244 58359 54035 2.5 3.0 3.9 5.9 4.1 Signalfläche (mVs) 365333 100695 2258216 61785 55056 rsd (%) 1.6 2.8 1.7 7.0 0.5 37 38 Aminosäuren in der Pharmakopöe Glycin Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem Gly. Der unbekannte Peak 3 war verantwortlich, dass die Gesamtverunreinigung über 1 % stieg. Gly FMOC 3. 1. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 2. - Gly Gly TS Gly e Gly γ Gehalt 100.0 % 97.4 % 98.2 % 102.3 % Gesamtver. 1.32 % 1.27 % 1.28 % 1.38 % Nr. 1. 2. 3. Rt (min) 3.47 15.82 42.11 Signalfläche (mVs) 97372 37191 8180548 rsd (%) 4.1 3.0 0.8 Signalfläche (mVs) 88195 7726135 rsd (%) 7.8 0.6 Signalfläche (mVs) rsd (%) 95853 7869945 1.4 2.5 Signalfläche (mVs) rsd (%) 110287 5.4 45631 19.9 8748843 1.9 Aminosäuren in der Pharmakopöe 39 L-Histidin Für His war die Messabweichung für die Gehaltsbestimmung wie sie beim Asp berechnet wurde nicht repräsentativ. Es zeigte sich nämlich, dass Schwankungen zwischen den Messungen der gleichen Probe (im schlechtesten Fall lag die rsd bei 7 %) auftraten. Der Gehalt wurde zwar bestimmt, aber es konnte damit keine vergleichende Aussage gemacht werden. Trotzdem zeigte sich ein Verunreinigungsmuster, welches von den verschiedenen Behandlungsmethoden unbeeinflusst blieb und auf 8 mögliche Verunreinigungen hinwies. L-His 1. 2. FMOC 4.5. 6. 3. - — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 7. 8. L-His L-His TS L-His e L-His γ Gehalt 100.0 % 100.0 % 106.7 % 106.7 % Gesamtver. 1.17 % 1.11 % 1.03 % 0.95 % Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 2. 3. 4. 7.39 15.83 26.57 40.48 66131 64090 54094 87336 6.2 35.4 16.1 3.0 29672 109256 69559 87903 10.4 20.9 25.5 0.8 5. 41.36 187668 5.9 163766 9.1 6. 41.91 1666312 33.9 1705034 7. 47.27 428372 37.1 8. 50.28 1155501 6.1 Signalfläche (mVs) rsd (%) 42568 8.5 77646 16.2 71219 22.3 92225 16.8 159241 Signalfläche (mVs) rsd (%) 27071 15.3 60111 44.0 96830 7.2 72040 11.4 8.3 138901 21.7 32.6 1750255 32.0 1390101 46.9 479537 28.9 517672 22.6 237533 20.6 893224 12.7 796979 2.4 1042001 9.0 40 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Isoleucin Bei L-Ile konnte kein signifikanter Gehaltsunterschied durch die Sterilisationsbehandlung beobachtet werden. Bei dem strahlenbehandelten L-Ile trat ein kleiner Peak (Nr.2) mehr auf als bei der unbehandelten Aminosäure, welche 4 zusätzliche Peaks enthielt. Nach Vergleich der relativen Retentionszeit, könnte es sich bei Peak 1, 3 und 4 um Pro, Tyr und Val handeln. L-Ile FMOC — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 5. 1. 3.4. 2. - L-Ile L-Ile TS L-Ile e L-Ile γ Gehalt 100.0 % 103.8 % 100.2 % 102.1 % Gesamtver. 0.55 % 0.69 % 0.74 % 0.63 % Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 23.05 27.47 28.13 29.01 39.35 Signalfläche (mVs) 417521 740786 648961 1415820 rsd (%) 11.6 2.7 6.1 33.4 Signalfläche (mVs) 549362 891310 767066 1992782 rsd (%) 2.8 1.8 5.9 13.4 Signalfläche (mVs) rsd (%) 435925 90260 955221 895686 1974671 7.0 7.2 7.9 6.5 7.2 Signalfläche (mVs) rsd (%) 452224 4.9 82285 15.6 824348 1.4 779477 1.8 1674639 18.3 Aminosäuren in der Pharmakopöe 41 L-Leucin Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Leu. Beim unbehandelten L-Leu konnten zusätzlich 6 Peaks detektiert werden. Nach Strahlenbehandlung traten 4 zusätzliche Peaks auf, welche zu einer Erhöhung der Gesamtverunreinigung führten. 9. L-Leu 4. 2. 3. 5.6.-7. 8. FMOC — γ -behandelt 10. 11. — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 1. - L-Leu L-Leu TS L-Leu e L-Leu γ Gehalt 100.0 % 97.1 % 98.2 % 93.0 % Gesamtver. 0.87 % 0.86 % 1.11 % 1.07 % Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 20.33 23.51 26.46 28.19 28.83 30.43 29581 38727 - 11.1 11.4 - 18056 19354 74407 - 4.4 3.0 1.1 - 27721 9.7 116435 5.7 722498 1.9 72339 21.1 47677 14.3 38261 20.0 114217 6.4 745847 0.7 112024 21.3 40434 19.2 7. 30.95 - - - - 109015 115710 8. 33.53 97899 2.9 93393 6.8 9. 34.80 4211898 0.3 4113521 0.2 4397742 1.0 3987988 10. 39.04 1100988 30.7 972382 1.4 1344524 6.2 1036506 15.3 11. 39.63 95812 0.7 54911 5.6 53500 2.6 5.9 98591 21.7 6.3 107453 21.8 48708 0.4 4.6 42 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Lysin HCl Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Lys. Die Gesamtverunreinigung war mit 1.72 % eher hoch. Dies lag auch daran, dass Lys einen viel kleineren Response als die meisten anderen Aminosäuren zeigte (siehe Abbildung 5) und somit die gefundenen 10 Nebenpeaks eine stärkere Gewichtung erfuhren. L-Lys HCl — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank FMOC 4. 1. 2. 3. 5.-10. 11. 12. - L-Lys HCl L-Lys HCL TS L-Lys HCl e L-Lys HCl γ Gehalt 100.0 % 100.5 % 100.5 % 100.9 % Gesamtver. 1.72 % 1.72 % 2.44 % 2.33 % Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 19.17 22.20 24.86 26.22 28.44 28.73 30284 31190 172228 716454 126636 221261 8.7 4.0 2.4 1.7 3.5 3.6 30248 27686 110733 685140 100412 179584 5.2 7.4 5.5 3.2 7.0 5.4 37169 32218 128717 687774 96447 210846 4.4 4.3 3.9 2.2 8.0 5.4 28730 25194 136511 662128 79432 194527 3.9 1.7 3.9 0.7 7.7 2.4 7. 29.19 814096 2.0 818440 2.7 855106 2.9 786478 2.5 8. 30.08 - - - - 72835 10.3 75370 7.7 9. 30.39 - - - - 114954 7.8 101729 5.2 10. 30.80 60385 1.8 60442 4.6 1049795 2.7 1028406 1.4 11. 32.83 613853 65.9 775762 57.2 12. 41.67 449874 1.4 464012 3.2 837896 55.8 826695 42.8 478886 468046 3.1 2.4 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Methionin Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Met. Beim unbehandelten, wärmeund e- -behandelten L-Met blieb das Verunreinigungsmuster mehr oder weniger gleich, hingegen schien die γ-Bestrahlung zu mehr Zersetzung zu führen. Insbesondere verdoppelte sich die Fläche von Peak 3 nach einer solchen Behandlung. L-Met FMOC 3. 4.5. 1. 2. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 7. 6. L-Met L-Met TS L-Met e - L-Met γ Gehalt 100.0 % 95.2 % 101.3 % 98.1 % Gesamtver. 0.55 % 0.54 % 0.51 % 0.87 % Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 4.02 5.37 14.61 15.41 16.26 33.09 1045211 645865 459402 - 26.5 55.2 69.2 - 1331322 406525 298164 - 35.3 58.2 37.1 - 7. 40.08 210427 6.5 205467 6.8 Signalfläche (mVs) rsd (%) 1237464 25.8 439392 7.1 254504 53.2 103631 10.0 213817 7.4 Signalfläche (mVs) rsd (%) 39485 9.7 107787 8.6 2645701 29.0 505031 13.0 186459 19.4 217026 1.0 43 44 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Phenylalanin Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Phe. Gesamthaft konnten neben dem Hauptpeak 8 zusätzliche Peaks detektiert werden, welche auf Verunreinigungen hinweisen. L-Phe FMOC 6. 1. 3. 2. 4. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 7. 8. 5. - L-Phe L-Phe TS L-Phe e L-Phe γ Gehalt 100.0 % 101.9 % 98.5 % 100.0 % Gesamtver. 0.37 % 0.34 % 0.29 % 0.27 % Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 35621 10.2 57207 4.3 31613 19.4 60858 6.0 48895 2.4 1418945 10.0 Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 18.00 20.55 27.49 30.45 33.64 39.08 73962 86748 226907 57291 45669 1549823 3.1 7.5 4.8 5.2 1.8 24.8 28597 28900 219288 53060 40941 1562446 9.0 4.9 6.1 2.8 7.1 4.0 13449 11.2 18463 4.0 62581 6.6 54143 7.9 41531 6.5 1376253 13.1 7. 40.08 80515 11.1 155445 2.2 32678 9.8 30235 4.0 8. 41.55 130653 6.4 39047 5.1 52001 7.0 31069 4.9 Aminosäuren in der Pharmakopöe 45 L-Prolin Ein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Pro konnte nicht festgestellt werden, wobei wärmebehandeltes L-Pro eine Tendenz zur Gehaltsabnahme aufwies. Beim unbehandelten L-Pro konnten keine Hinweise auf Verunreinigungen gefunden werden. Die Wärmebehandlung dieser Aminosäure führte zu einem zusätzlichen Peak und die Strahlenbehandlung zu 2 kleinen Peaks. L-Pro FMOC 1.2. Gehalt Gesamtver. Nr. 1. 2. 3. Rt (min) 12.67 18.29 41.88 — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 3. - L-Pro L-Pro TS L-Pro e L-Pro γ 100.0 % 94.6 % 98.9 % 101.1 % - 0.02 % 0.01 % 0.01 % Signalfläche (mVs) - rsd (%) Signalfläche (mVs) - 122514 rsd (%) 10.2 Signalfläche (mVs) rsd (%) 38957 42405 - 6.1 6.1 - Signalfläche (mVs) rsd (%) 39926 10.8 37524 2.4 - 46 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Serin Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Ser. Bei unbehandeltem und wärmebehandelten L-Ser konnte ein zusätzlicher Peak gefunden werden, welcher auf Verunreinigung hinwies. Derselbe Peak wurde auch nach Strahlenbehandlung gefunden, wobei sich dabei seine Fläche verdoppelte. Deswegen könnte dies auf ein Zersetzungsprodukt von L-Ser hindeuten. L-Ser — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank FMOC 1. L-Ser L-Ser TS L-Ser e - L-Ser γ Gehalt 100.0 % 98.8 % 100.6 % 99.1 % Gesamtver. 0.02 % 0.02 % 0.04 % 0.05 % Nr. 1. Rt (min) 19.94 Signalfläche (mVs) 148822 rsd (%) 2.1 Signalfläche (mVs) 165247 rsd (%) 3.6 Signalfläche (mVs) rsd (%) 271217 2.4 Signalfläche (mVs) 325749 rsd (%) 7.8 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Threonin Bei γ-bestrahltem L-Thr zeigte sich eine signifikante Gehaltsabnahme und auch wärmebehandeltes L-Thr zeigte eine Tendenz zu Gehaltsabnahme. Insgesamt konnten bei dieser Aminosäure 5 Peaks detektiert werden, welche auf Verunreinigungen hinwiesen. Die Fläche von Peak 3 nahm nach einer Strahlenbehandlung drastisch zu und wies damit auf ein Zersetzungsprodukt von LThr hin. L-Thr 3. 2. 1. 4. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank FMOC 5. L-Thr L-Thr TS L-Thr e - L-Thr γ Gehalt 100.0 % 95.3 % 103.1 % 90.3 % Gesamtver. 0.21 % 0.20 % 0.34 % 0.45 % Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 5.59 16.35 17.47 21.86 28.8 Signalfläche (mVs) 193702 504646 18232 304768 118722 rsd (%) 5.6 1.7 6.5 7.9 5.0 Signalfläche (mVs) 103449 484206 27714 350490 95820 rsd (%) 7.3 6.2 9.0 1.5 10.8 Signalfläche (mVs) rsd (%) 113899 515591 798428 362033 156453 2.0 2.6 2.5 4.6 7.0 Signalfläche (mVs) rsd (%) 119314 13.6 523474 4.6 1126620 1.0 350718 3.3 106267 18.0 47 48 Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Tyrosin Es zeigte sich kein signifikanter Gehaltsunterschied zwischen unbehandeltem und unter Sterilisationsbedingungen behandeltem L-Tyr. Vorallem Peak 3 war verantwortlich, dass die die berechnete Gesamtverunreinigung über 3 % lag. Dies lag aber nicht daran, dass L-Tyr schlechter Qualität war, sondern dass diese Aminosäure mit der verwendeten Methode einen kleinen Response aufwies. Derselbe Effekt konnte auch bei L-Lys beobachtet werden. FMOC L-Tyr 3. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 4. 2. 1. L-Tyr L-Tyr TS L-Tyr e - L-Tyr γ Gehalt 100.0 % 104.2 % 98.4 % 98.4 % Gesamtver. 3.56 % 3.15 % 3.68 % 3.41 % Nr. 1. 2. 3. 4. Rt (min) 36.72 39.08 40.96 47.99 Signalfläche (mVs) 63452 471403 1619857 569836 rsd (%) 5.7 7.1 1.1 7.1 Signalfläche (mVs) 64770 433752 1642571 372854 rsd (%) 2.9 1.7 2.4 14.8 Signalfläche (mVs) rsd (%) 64557 479616 1648079 579763 5.7 7.1 1.1 7.1 Signalfläche (mVs) 81848 458201 1723903 305035 rsd (%) 7.6 5.3 1.2 7.2 Aminosäuren in der Pharmakopöe 49 L-Valin Die bestrahlten Proben von L-Val zeigten eine Tendenz zur Gehaltsabnahme. Zudem wurden nach der Bestrahlung zwischen 3 und 4 zusätzliche Peaks gefunden, welche auf Zersetzung hindeuten. Bei unbehandeltem Val konnten 5 zusätzliche Peaks detektiert werden, welche auf Verunreinigungen hinwiesen. Bei Peak 3 könnte es sich aufgrund der relativen Retention um Ala handeln. L-Val 1. 2. 3. FMOC 6. 4.5. 7. 8. — γ behandelt — e behandelt — wärmebehandelt — unbehandelt — blank 9. L-Val L-Val TS L-Val e - L-Val γ Gehalt 100.0 % 99.6 % 93.0 % 95.8 % Gesamtver. 0.29 % 0.28 % 0.34 % 0.38 % Nr. Rt (min) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 16.25 18.54 20.81 24.74 26.28 32.36 7. Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 720218 2.4 713149 0.9 418993 8.1 452909 0.5 33.88 66749 4.6 8. 39.04 215441 14.6 193200 9. 42.21 366071 5.8 356559 Signalfläche (mVs) rsd (%) 43289 12.8 723956 2.1 85823 13.8 64465 1.6 449663 2.6 Signalfläche (mVs) rsd (%) 113380 6.2 61945 2.6 734190 1.6 91828 15.8 91689 4.5 456273 0.4 66034 1.2 72162 8.0 14.0 176257 1.3 250437 14.2 4.7 364413 3.0 375138 5.1 50 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.3.4.4.2 Untersuchung von 19 Chargen Isoleucin Mit der unter 4.2.1.3 entwickelten HPLC Methode wurden mehrere Chargen Ile von 2 verschiedenen Herstellern (im Folgenden als Hersteller A und Hersteller B bezeichnet) untersucht. Von Hersteller A wurden 13 Chargen und von Hersteller B 6 Chargen auf Verunreinigungen geprüft. Bei Hersteller A konnten bei den untersuchten Chargen Ile jeweils 4 bis 5 Verunreinigungen detektiert werden. Peak 3 wurde durch Aufstockung als Valin identifiziert und bei Peak 1 handelt es sich wahrscheinlich um Ala. Die Gesamtverunreinigung bei Hersteller A lag zwischen 0.32 und 0.47 %. Hersteller B wies 2 bis 3 Verunreinigungen auf. Dadurch lag die Gesamtverunreinigung (0.1 bis 0.17 %) tiefer als bei Hersteller A. Es konnte durch Aufstockung gezeigt werden, dass Valin als Verunreinigung auch bei diesem Hersteller vorkam. Ein Gehaltsvergleich zwischen den beiden Herstellern (siehe Abbildung 7) ergab, dass sich ihre Chargen in den gleichen Grössenordnungen bewegten. Isoleucin Hersteller A Ile — Ile Hersteller A Charge 1 gespiked — Ile Hersteller A Charge 1 — blank L-Val L-Asp L-Ser Charge 1 Gesamtver. Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 19.87 25.03 28.43 29.2 39.39 L-Phe L-Ala 1. Hersteller A FMOC 2. Charge 2 0.43 3. 4. Charge 3 0.47 Signalfläch e (mVs) rsd (%) Signalfläch e (mVs) 108262 551865 1025692 313255 796483 5.85 0.34 1.99 8.38 7.87 81007 646735 824646 322540 1056548 5. rsd (%) 2.08 3.54 0.93 4.89 17.88 Charge 4 0.45 Signalfläch e (mVs) 80635 640256 786004 268565 980138 rsd (%) 12.73 2.68 1.36 3.84 6.62 0.43 Signalfläche (mVs) 79794 524795 937748 316771 796954 rsd (%) 8.55 4.53 1.71 2.17 7.10 Aminosäuren in der Pharmakopöe Hersteller A Charge 5 Charge 6 Gesamtver. Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 19.87 25.03 28.43 29.2 39.39 Hersteller A 0.36 Signalfläch e (mVs) rsd (%) 69598 385589 938821 110936 836374 - 7.01 5.99 1.07 7.26 Charge 9 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 19.87 25.03 28.43 29.2 39.39 Signalfläch e (mVs) rsd (%) 50501 373141 855391 455317 680247 7.15 1.70 1.17 5.37 5.24 Charge 13 Gesamtver. 0.32 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 19.87 25.03 28.43 29.2 39.39 Signalfläch e (mVs) Signalfläch e (mVs) 244853 329566 879938 193963 429027 rsd (%) 57525 10.03 472535 3.09 1062824 1.09 110535 11.79 1831980 - 0.37 Hersteller A Nr. 0.57 Charge 10 Gesamtver. Nr. Charge 7 rsd (%) 4.93 5.15 1.16 5.30 1.46 0.23 Signalfläch e (mVs) 44243 497655 774709 159167 - 64110 363433 1022041 138367 752775 rsd (%) 13.77 4.49 2.45 8.37 - Charge 11 0.38 Signalfläch e (mVs) Charge 8 rsd (%) 11.59 6.07 0.76 4.37 16.06 0.30 Signalfläche (mVs) 100935 586324 1047912 149419 - 49548 342047 954657 114075 760522 rsd (%) 17.52 0.64 0.59 9.16 3.32 4.60 1.92 0.98 7.02 - Charge 12 0.36 Signalfläch e (mVs) rsd (%) 0.36 Signalfläche (mVs) 53269 375988 748912 228209 820392 rsd (%) 5.45 7.51 1.73 11.31 5.69 51 52 Aminosäuren in der Pharmakopöe Isoleucin Hersteller B — Ile Hersteller B Charge 1 gespiked — Ile Hersteller B Charge 1 — blank L-Asp L-Ser Ile FMOC L-Val L-Ala 1. L-Phe 2. 3. Hersteller B Charge 1 Charge 2 Charge 3 Charge 4 Gesamtver. 0.100 0.100 0.114 0.110 Nr. 1. 2. Rt (min) 24.93 28.51 Signalfläch e (mVs) 93650 516368 rsd (%) 1.60 3.05 Signalfläch e (mVs) 106077 505947 Hersteller B Charge 5 Charge 6 Gesamtver. 0.166 0.161 Nr. 1. 2. 3. Rt (min) 24.93 28.51 39.32 Signalfläch e (mVs) 53594 520601 453787 rsd (%) 10.32 2.89 11.33 Signalfläch e (mVs) 98267 487501 397795 rsd (%) 3.96 6.49 rsd (%) 7.44 2.50 20.00 Signalfläch e (mVs) 127365 569992 rsd (%) 11.32 2.17 Signalfläche (mVs) 120909 554312 rsd (%) 8.66 1.67 Aminosäuren in der Pharmakopöe Gehaltsvergleich verschiedener Chargen Ile 8000000 Signalfläche (mVs) 7000000 Hersteller A Hersteller B 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 Abbildung 7 Gehaltsvergleich verschiedener Chargen Ile nach FMOC Derivatisierung 3.3.4.4.3 Untersuchung von 15 Chargen Phenylalanin Es wurden mit der unter 4.2.1.3 entwickelten HPLC Methode mehrere Chargen Ile von 2 verschiedenen Herstellern (im Folgenden als Hersteller A und Hersteller B bezeichnet) untersucht. Von Hersteller A wurden 12 Chargen und von Hersteller B 3 Chargen auf Verunreinigungen geprüft. Alle untersuchten Chargen Phe des Herstellers A wiesen ein Verunreinigungsmuster von 3 Peaks auf (Peak Nr. 3, 4, 5). Daneben wiesen die Chargen 4, 5, 6 und 7 eine zusätzliche Verunreinigung auf. Der Versuch einer Identifizierung mittels Aufstockung lieferte keine klaren Ergebnisse, sondern lediglich Hinweise. Dies lag daran, dass die gefundenen Peaks zu klein für eine klare Zuordnung waren. Peak 1 könnte aufgrund der Retentionszeit ein Hinweis auf Tyr sein. Bei Peak 2 könnte es sich um Val handeln und bei Peak 3 um Ile. Peak 4 und 5 liessen sich nicht zuordnen. Bei Phe von Hersteller B konnten ebenfalls 3 Peaks detektiert werden. Wahrscheinlich sind die Peaks 2 und 3 identisch mit Peak 4 von Hersteller A, welcher manchmal eine kleine Schulter aufwies. Die Gesamtverunreinigung fiel bei Hersteller B (0.14-21 %) trotz weniger Verunreinigungspeaks höher aus als bei Hersteller A (0.08-0.12 %). Dies lag sicherlich auch daran, dass Peak 1 und 3 bei Hersteller B besser von Phe abgetrennt werden konnte als bei Hersteller A (Peak 4). Der Gehalt von Phe lag bei beiden Herstellern in der gleichen Grössenordnungen (siehe Abbildung 8). 53 54 Aminosäuren in der Pharmakopöe Phenylalanin Hersteller A — Phe Hersteller A Charge 5 — Phe Hersteller A Charge 4 — blank Phe FMOC 4. 5. 1. 3. 2. Hersteller A Charge 1 Charge 2 Charge 3 Charge 4 Gesamtver. 0.11 0.10 0.11 0.12 Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) Signalfläch e (mVs) 27.19 rsd (%) - 30.33 33.49 39.17 40.31 4.49 1.69 19.17 39164 564206 142623 Signalfläch e (mVs) 38432 622093 24431 rsd (%) 5.99 16.07 Signalfläch e (mVs) 44474 640435 26824 rsd (%) 10.17 19.56 Signalfläche (mVs) 44530 28179 709777 32383 Hersteller A Charge 5 Charge 6 Charge 7 Charge 8 Gesamtver. 0.10 0.08 0.11 0.08 Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 27.19 30.33 33.00 39.20 40.36 Signalfläch e (mVs) rsd (%) Signalfläch e (mVs) 22866 - 18.53 - 27619 - 32690 556897 37258 17.21 4.41 3.12 33647 430131 38588 rsd (%) Signalfläch e (mVs) 5.56 63035 4.30 43743 5.38 583024 3.96 43643 rsd (%) - Signalfläche (mVs) 4.21 4.61 32478 5.76 474039 8.49 58858 rsd (%) 2.53 24.48 11.93 18.75 rsd (%) 1.99 7.03 4.02 Aminosäuren in der Pharmakopöe Hersteller A Charge 9 Charge 10 Charge 11 Charge 12 Gesamtver. 0.09 0.09 0.09 0.09 Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) Signalfläch e (mVs) 27.19 30.33 33.34 32478 39.23 474039 40.44 58858 rsd (%) 1.99 7.03 4.02 Signalfläch e (mVs) 38624 465700 53447 rsd (%) 7.31 14.16 5.12 Signalfläch e (mVs) - rsd (%) - 32088 461371 50616 4.98 7.13 5.85 Signalfläche (mVs) - rsd (%) - 35224 512721 6.16 5.89 48761 9.05 Phenylalanin Hersteller B — Phe Hersteller B Charge 2 — blank Phe FMOC 2. 1. 3. Hersteller B Charge 1 Charge 2 Charge 3 Gesamtver. 0.14 0.16 0.21 Nr. 1. 2. 3. Rt (min) 39.23 39.59 40.53 Signalfläch e (mVs) 494252 369714 40898 rsd (%) 0.22 2.99 5.72 Signalfläch e (mVs) 335826 612060 70662 rsd (%) 2.05 0.71 5.00 Signalfläch e (mVs) 543058 755086 62265 rsd (%) 10.81 7.97 6.55 55 Aminosäuren in der Pharmakopöe Gehaltsvergleich verschiedener Chargen Phe 8000000 Hersteller A Hersteller B 7000000 Signalfläche (mVs) 56 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 Abbildung 8 Gehaltsvergleich verschiedener Chargen Phe nach FMOC Derivatisierung 3.3.4.4.4 Untersuchung von 11 Chargen Serin Es wurden mit der unter 4.2.1.3 entwickelten HPLC Methode mehrere Chargen Ser von 3 verschiedenen Herstellern (im Folgenden als Hersteller A, Hersteller B und Hersteller C bezeichnet) untersucht. Von Hersteller A wurden 4 Chargen, von Hersteller B 5 Chargen und von Hersteller C 2 Chargen auf Verunreinigungen geprüft. Alle untersuchten Chargen wiesen zusätzliche Peaks bei einer Retentionszeit von 20.13, 28.51 und 42.83 min auf. Die Identifizierung dieser gefundenen Verunreinigungen mittels Aufstockung konnte lediglich Hinweise aufgrund der Retention liefern, da die Peaks zu klein oder zu nahe am Hauptpeak lagen. Bei dem Peak bei 20.13 min dürfte es sich aufgrund der Retentionszeit um Alanin handeln. Die anderen beiden konnten nicht zugeordnet werden. Die berechnete Gesamtverunreinigung, welche bei allen Herstellern und Chargen (0.95 – 1.86%) sehr hoch ausfiel, konnte direkt auf den Peak bei 42.83 min zurückgeführt werden. Dieser Peak ist problematisch, da er nicht identifiziert werden konnte. Es wurde ausserdem beobachtet, dass ein ähnlicher Peak mit derselben Konsequenz bei LGln, Gly und L-Tyr (siehe 3.3.4.4.1) gefunden wurde. Deswegen wäre es denkbar, dass es sich dabei um eine unbekannte Problematik mit der Derivatisierung handeln könnte. Die untersuchten Chargen von Hersteller A enthielten nur diese 3 Verunreinigungen. Bei Hersteller B wiesen die Chargen 2, 3, 4, 5 einen zusätzlichen Peak (Nr.1) auf, bei welchem es sich wahrscheinlich um Thr handelte. Bei Peak 4 in Charge 3 dürfte es sich um Leu handeln. Hersteller C wies auf Spuren von Ile hin (Nr 3). Aminosäuren in der Pharmakopöe Serin Hersteller A — Ser Hersteller A Charge 1 Ser — Ser Hersteller A Charge 2 — blank FMOC 3. 1. 2. Hersteller A Charge 1 Charge 2 Charge 3 Charge 4 Gesamtver. 1.17 1.06 1.06 1.03 Nr. 1. 2. 3. Rt (min) 20.13 28.51 42.83 Signalfläch e (mVs) 482849 154880 7439101 rsd (%) 4.61 7.31 0.55 Signalfläch e (mVs) 323900 186080 6561285 rsd (%) 3.70 3.03 1.19 Signalfläch e (mVs) 330231 174859 6272267 rsd (%) 4.65 5.10 0.58 Signalfläche (mVs) 334225 281167 6411237 rsd (%) 9.43 9.54 3.72 57 58 Aminosäuren in der Pharmakopöe Serin Hersteller B 5. — Ser Hersteller B Charge 2 Ser — Ser Hersteller B Charge 3 — blank 1. 2. 3. 4. Hersteller B Charge 1 Charge 2 Charge 3 Charge 4 Gesamtver. 1.86 0.95 1.04 0.99 Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) Signalfläch e (mVs) 19.72 20.65 28.67 655080 37.80 41.96 12451502 HerstellerB Charge 5 Gesamtver. 0.96 Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Rt (min) 19.16 19.92 28.80 41.80 Signalfläch e (mVs) 213842 162476 216441 5690669 rsd (%) - Signalfläch e (mVs) rsd (%) 200326 - 3.34 - 0.61 - 254616 - 3.05 - 0.90 5916569 0.57 rsd (%) 7.58 5.41 15.60 0.87 Signalfläch e (mVs) 228754 191673 346218 42308 5058315 FMOC rsd (%) 14.25 6.42 2.95 8.07 0.08 Signalfläche (mVs) 238437 105899 246349 5598918 rsd (%) 7.10 12.31 3.62 1.01 Aminosäuren in der Pharmakopöe Serin Hersteller C Ser — Ser Hersteller C Charge 1 — Ser Hersteller C Charge 2 — blank FMOC 4. 1. Hersteller C Charge 1 Charge 2 Gesamtver. 1.24 1.05 Nr. 1. 2. 3. 4. Rt (min) Signalfläch e (mVs) 19.81 28.6 32.92 42.52 250348 247074 33559 7760992 rsd (%) 5.65 1.97 8.35 1.10 Signalfläch e (mVs) 180587 273196 21427 6149191 2. 3. rsd (%) 4.76 28.15 12.30 1.26 Gehaltsvergleich verschiedener Chargen Ser 8000000 Hersteller A Hersteller B Hersteller C Signalfläche (mVs) 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 Abbildung 9 Gehaltsvergleich verschiedener Chargen Ser nach FMOC Derivatisierung 59 60 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.4. Flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände Zur Detektion von flüchtigen Verunreinigungen oder Lösungsmittelrückständen in Aminosäuren bietet sich die Gaschromatographie mit einem Massenspektrometer an. Massenspektrometrie gekoppelt mit GC ist eine sensitive Methode, bei der die quantitative Detektion von Atommassen, Molekülmassen oder Molekülbruchstückmassen möglich ist[67]. Das Signal stellt ein Fragmentierungsmuster von Massen-Ladungsverhältnissen einer ionisierten Substanz dar, welches je nach dem auch Rückschlüsse auf die Struktur erlaubt. Durch Vergleich mit einer Bibliothek kann dieses Signal einer bestimmten Substanz zugeordnet werden. Somit können Substanzen nicht nur detektiert werden, sondern gleichzeitig auch identifiziert werden. Da Aminosäuren einen hohen Schmelzpunkt (siehe Tabelle 20) haben und sie sich bei weiterer Erwärmung zersetzen, ist eine direkte Einspritzung nicht zu empfehlen. Eine Injektion würde zur Verstopfung des Inserts und der Trennsäule führen. Eine Möglichkeit dieses Problem zu umgehen, wäre, die Aminosäuren zu derivatisiern, um so flüchtige Verbindungen zu erhalten. Dies ist eine bewährte Methode und wird oft zur Aminosäurenanalyse verwendet[68-70]. Zur Detektion von flüchtigen Verunreinigungen und Lösungsmittelrückständen in Aminosäuren wird auf diese Methode aber verzichtet. Da für eine Derivatisierung die notwendigen Reagenzien der Probe zugegeben werden müssen, können sich Probleme mit der Unterscheidung zwischen echter Verunreinigung und eingebrachter ergeben. Deswegen wurde die Technik des headspace GC-MS verwendet. Dabei werden die Proben nicht wie üblich direkt eingespritzt, sondern in spezielle Glasgefässe (headspace vials 20 ml) gefüllt und diese Luftdicht verschlossen. Die Gefässe werden im headspace sampler auf eine gewählte Temperatur erhitzt und nach Erreichung eines Gleichgewichtszustandes entnimmt eine Nadel automatisch eine Probe aus der Gasphase. Somit wird die Trennsäule nicht mit Aminosäuren verunreinigt und flüchtige Komponenten können trotzdem von der nichtflüchtigen Matrix (hier Aminosäuren) getrennt werden. Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.4.1. Headspace GC-MS von Aminosäuren 3.4.1.1. Geräte und Materialien Headspace-Sampler GC MS Software Varian Genesis head space Varian Star CX 3400 Varian Saturn GC/MS/MS 4D Varian Saturn Ver. 5.2 NIST92 Mass Spectral Search Program Ver. 1.1a Säule Restek RTX-624. 60 m, ID 0.32 mm, DF: 1.8, Cat.-Nr. 10972, Serial-Nr. 196266 Rtx-624 (fused silica), Crossbond 6% cyanopropylphenyl 94%dimethylpolysiloxan Temperaturbereich: -20 - 240 °C Headspace-Sampler GC Plate temperature Plate equil. Sample equil. Vial size Mixer Mix power Stabilize Press Injektor Temp. Transferline Carrier gas Transfer line back pressure flow 85 °C 1 min 60 min 22 ml Off 1 min 1.5 min up to 8 psi Press equil. 0.2 min Loopfill 1.5 min Loopfill equil. 0.2 min Inject time 1.5 min Loop temperature 220 °C Line temperature 220 °C Injection per vial 1 Loop volume 1 ml GC cycle time 80 min Method optimization off mode 3.4.1.2. 220 °C 220 °C Helium 5.0 55-70 kPa 1.4 ml/min Heizprogramm Initial temperature Initial hold time 1 Program rate 1 Final temprature 1 Final hold time 2 40 ° C 20 min 10 °C/min 220 °C 20 min Methodenentwicklung Für die Untersuchungen wurde eine Restek RTX-624 Säule (60 m, ID 0.32 mm, DF: 1.8 µm, fused silica, Crossbond 6% cyanopropylphenyl 94%dimethylpolysiloxan, Cat.# 10973) verwendet, welche dieselben Anforderungen erfüllt, wie sie die Ph. Eur. 5 unter Test auf Lösungsmittelrückstände[71] fordert und welche von vielen Laboratorien zur Untersuchung von flüchtigen organischen Substanzen verwendet wird. Das Temperaturprogramm gestaltete sich wie folgt: Nach der Injektion wurde die Säulentemperatur 20 min bei 40 °C gehalten und stieg dann mit einem Gradient von 10 °C/ min auf 220 °C an, wo sie noch mal 20 min gehalten wurde. Die Trenndauer betrug damit 58 min und entsprach im Wesentlichen ebenfalls der Ph. Eur. 5 Methode. Als Lösungsmittel für die Aminosäureproben wurde destilliertes Wasser gewählt. Vorversuche hatten keinen Vorteil von pulverförmigen Proben gezeigt und das Auflösen der Aminosäuren sollte helfen flüchtige Verunreinigungen 61 62 Aminosäuren in der Pharmakopöe leichter freizusetzen. Die Temperatur für die Probeninkubation wurde auf 85 °C gewählt, da dort noch keine Zersetzung der Aminosäuren zu erwarten ist. Dieser Schluss wurde ebenfalls aus Voruntersuchungen gezogen, bei denen sich für pulverförmige Aminosäuren selbst bei 100 °C noch keine Probleme mit Zersetzung zeigten. Zur Ermittlung einer optimalen Zeit bis zur Gleichgewichtseinstellung vor der Injektion wurde ein Testgemisch aus Acetaldehyd, Acetonitril, Allylacetat, Benzol, Benzaldehyd, Butyrlaldehyd, 2-Propanol und Pyrrol bei 20, 40 und 60 min je viermal vermessen. Die eingesetzten Mengen entsprachen dabei einer theoretischen Verunreinigung von 0.01 % (V/m) bezogen auf 100 mg Aminosäureprobe. Das Resultat zeigte, dass alle Referenzsubstanzen zu allen Equilibrationszeiten detektiert werden konnten (siehe Abbildung 10). Die relativen Standardabweichungen lagen zwischen 0.5 und 8.1 Prozent und hatten für die meisten der untersuchten Substanzen bei 40 min die kleinste Streuung (siehe Tabelle 10). Es zeigte sich jedoch wie erwartet, dass längere Equlibrierungszeiten zu höheren Signalen führten. Besonders ausgeprägt war dies bei Benzol ersichtlich. Eine Erhöhung der Equilibrierungszeit von 20 auf 60 min führt zu einem über 25% stärkeren Signal. Da Sensitivität bei der zu entwickelnden Methode höher gewichtet wurde als die Streuung, wurde 60 min als Equilibrierungszeit gewählt. Auf über 60 min wurde verzichtet, da sonst unvernünftig lange Messzeiten entstanden wären und die Proben zu lange einer erhöhten Temperatur ausgesetzt worden wären. Aminosäuren in der Pharmakopöe Benzol Pyrrol Benzaldehyd Allylacetat Butanal Acetonitril 2-Propanol Acetaldehyd Abbildung 10 Chromatogramm der Referenzlösung nach einer Equilibrierungszeit von 60 min. Die erhaltenen Signale entsprechen einer Verunreinigung von 0.01 % bezogen auf 100 µl Reinsubstanz (für Benzol 0.0025 % auf 100 mg Reinsubstanz) Tabelle 10 Effekt von verschiedenen Equilibrierungszeiten auf die Signale der Referenzsubstanzen Equlibration Zeit Acetaldehyd rsd 2-Propanol rsd Acetonitril rsd Butyraldehyd rsd Benzol rsd Allylacetat rsd Pyrrol rsd Benzaldehyd rsd 20 min 40 min 60 min 334688 1.2 333936 3.2 262884 3.1 2278834 0.5 5162712 1.4 2553883 2.3 314733 4.4 848312 6.7 344426 3.1 371473 2.0 279327 1.0 2508227 0.6 5964068 2.0 2873128 2.4 378525 3.5 993395 8.7 367398 2.2 375102 7.0 287574 6.2 2697677 3.5 7034036 2.7 2778619 8.1 373068 7.3 959274 7.8 Retentionszeit (min) 5.37 10.17 11.1 17.4 23.27 26.51 31.43 37.09 63 64 Aminosäuren in der Pharmakopöe Eine gefundene Substanz wurde nur dann als identifiziert erklärt, wenn sie mit einer Referenzsubstanz hinsichtlich Retentionszeit und Fragmentierungsmuster übereinstimmte (siehe Tabelle 11). Auf Substanzen, welche nur über die verwendete Bibliothek (NIST92 Mass Spectral Search Programm Vers. 1.1a) und das Fragmentierungsmuster zugeordnet werden konnten, wurde immer explizit hingewiesen. Die Suche in der Bibliothek wurde mit der Funktion reverse fit durchgeführt. Wobei fit den Grad in Prozent (0-100 %) beschreibt, mit welcher eine Probe mit einer Substanz in der Datenbank übereinstimmt. Tabelle 11 Referenzsubstanzen, die zur Identifikation verwendet wurden. Die eingesetzten Mengen entsprechen dabei einer Verunreinigung von 0.01 und 0.01% (V/m oder m/m) Substanz Acetaldehyd 2-Methyl-1-butene Furan Dimethylsulfid Aceton Carbon Disulfid 2,5-Dihydrofuran Benzol Thiophene 2-Nitropropan Dimethyldisulfid Toluol 2-Methylthiophene 3-Methylthiophene Ethylbenzene 2,5-Dimethylthiophene Styrene Dimethyltrisulfid Benzaldehyd Verunreinigung von 0.01 % (V/m oder m/m) Rt Fläche Ø rsd 5.46 106937 3.6 7.45 12273150 3.9 8.40 17042996 5.6 9.49 9722408 3.0 9.56 1189436 1.2 10.08 15852 4.5 19.10 1687670 2.3 23.43 21582598 9.1 24.34 23624803 5.3 28.50 659463 12.4 29.15 21412454 2.3 29.53 22901759 9 30.12 29670346 13.4 30.37 27331380 14.7 33.23 34143194 58.2 Verunreinigung von 0.001 % (V/m oder m/m) Rt Fläche Ø rsd 4.46 15549 4.1 7.43 743958 6.6 8.39 1708876 3.0 9.51 701713 2.5 10.19 56173 13.0 23.47 1553916 11.8 24.34 1546012 4.6 29.01 25192 7.9 29.17 1698833 2.5 29.55 1709230 12 30.12 1956737 4.3 30.36 1990677 4.7 33.22 2518663 8.7 33.41 48419285 48.4 33.40 2277507 7.5 34.32 37.06 37.30 38212636 801736 636652 47.0 4.1 12.2 34.32 - 1719534 - 7.3 - Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.4.1.3. Probenvorbereitung und Methode 20 Aminosäuren (Tabelle 21, S.107) wurden auf Lösungsmittelrückstände und flüchtige Verunreinigungen untersucht und mit trockener Hitze- (160 °C, 2h), e-- (25 kGy) und γ– (25 kGy) sterilisierten Aminosäuren verglichen. Je 100 mg Aminosäurenprobe wurde mit 10 ml Wasser in einem headspace vial gelöst, mit Stickstoff geflutet und luftdicht verschlossen. Bei Asp, Glu, His und Tyr war jedoch eine vollständige Lösung der Proben nicht möglich. Alle Messungen wurden dreimal wiederholt. 3.4.1.4. Resultat der Untersuchungen auf flüchtige unreinigungen und Lösungsmittelrückstände Ver- Von den unbehandelten Aminosäuren wurde nur für Leu ein zusätzlicher Peak erhalten (siehe Bild 11 und 12). Die Trockensterilisation hingegen führte bei den 8 Aminosäuren Cys HCl, Glu, Iso, Leu, Lys HCl, Met, Ser und Val zu zusätzlichen Zersetzungsprodukten. e-- und γ–Sterilisation lieferte in beiden Fällen für die 10 Aminosäuren Ala, Asp, CysHCl, Iso, Leu, Met, Phe, Ser, Thr und Val zusätzliche Peaks. In Tabelle 12 wurden die Resultate ausführlich wieder gegeben. Generell konnte gesagt werden, dass die Strahlenbehandlung zu wesentlich mehr detektierbaren Abbauprodukten führte als die Trockensterilisation. Auf den Spezialfall von Cys HCl wurde unter 3.4.1.4.2 eingegangen. Vor allem Ile, Leu, Met, Phe und Val lieferten zahlreiche Produkte. Bei den Aminosäuren Arg, Asp, Gln, Gly, His, Pro, Trp, Tyr konnten mit dieser Methode weder flüchtige Verunreinigungen noch Zersetzungsprodukte gefunden werden. Eine Aussage über die Stabilität der Stoffe nur an hand dieser Methode liess sich aber keinesfalls machen. Als Beispiel ist Gln zu erwähnen, welches sich nach einer Trockensterilisation caramelartig zersetzte. Bei Gln wurden aber keine Zersetzungsprodukte detektiert. Aussagen über die Stabilität konnten deswegen erst im Vergleich mit anderen Methoden gemacht werden. 65 Aminosäuren in der Pharmakopöe GC MS Untersuchungen von sterilisierten Aminosäuren Anzahl gefundener peaks 25 20 15 10 5 L-Isoleucin L-Histidin Gamma sterilisiert (100 mg) e- sterilisiert (100 mg) trockensterilisiert (100 mg) unbehandelt (100 mg) Glycin L-Glutamin L-Glutamat L-Cystein L-Aspartat L-Asparagin L-Arginin L-Alanin 0 Abbildung 11 GC/MS Untersuchungen auf flüchtige Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukte der Aminosäuren Ala, Arg, Asp, Cys HCl, Glu, Gln, Gly, His, Ile GC MS Untersuchungen von sterilisierten Aminosäuren 16 14 Anzahl gefundener peaks 12 10 8 6 4 2 Gamma sterilisiert (100 mg) e- sterilisiert (100 mg) trockensterilisiert (100 mg) unbehandelt (100 mg) L-Valin L-Tyrosin L-Tryptophan L-Threonin L-Serin L-Prolin L-Phenylalanin L-Methionin L-Lysin HCL 0 L-Leucin 66 Abbildung 12 GC/MS Untersuchungen auf flüchtige Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukte der Aminosäuren Leu, Lys HCl, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val Legende für Tabelle 10 Identifikation Kursiv Schrift: Vermutung aufgrund Fragmentierungsmuster und Bibliothekvergleich Normal Schrift: Identifiziert mit Referenzsubstanz Rot: Verunreinigung über 0.01 %(V/m; m/m) Orange: Verunreinigung zwischen 0.01 und 0.001 %(V/m; m/m) Gelb: Verunreinigung unter 0.001 %(V/m; m/m) Aminosäuren in der Pharmakopöe 67 Tabelle 12 Zusammenfassung der Resultate der headspace GCMS Methode auf flüchtige Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukte Aminosäure L-Alanin L-Arginin L-Asparagin L-Aspartat L-Cystein HCl L-Glutamat L-Glutamin Glycin L-Histidin unbehandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd - wärmebehandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd 4.18 315285 7.3 5.35 464800 38.4 5.55 24757 27.1 9.35 2428250 9.3 9.52 280149 11.3 14.34 29664 12.9 24.19 3038910 12.7 30.00 4038982 14.1 30.26 566190 12.3 33.32 251882 13.8 33.50 485007 13.9 34.15 164721 13.2 36.17 372295 9.6 37.41 3843486 8.7 37.49 451359 13.0 39.54 177816 10.2 42.28 11648046 5.0 44.13 270930 8.9 44.40 743476 14.4 46.28 183907 12.8 46.57 482900 0.9 5.44 94628 6.8 - - e behandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd 5.38 626667 16.3 5.44 430743 0.4 4.20 352073 9.3 5.58 9996 23.9 9.56 63473 21.7 29.07 39281 6.3 - γ behandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd 5.37 699133 9.8 5.44 438909 8.0 28.36 17081 4.0 4.20 379790 7.4 5.58 15177 56.4 9.56 49755 25.9 29.08 171354 72.2 - Identifikation Acetaldehyd Acetaldehyd ? Carbonylsulfid Acetaldehyd Methanthiol ? Kohlenstoffdisulfid ? Thiophene dimethyl-Disulfid 2-methyl-Thiophene 3-methyl-Thiophene ? 2,5-dimethyl-Thiophene dimethyl-Thiophene ? ? ? ? thieno-Thiophene Derivat ? ? ? ? Acetaldehyd - 68 Aminosäuren in der Pharmakopöe Aminosäure L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin HCl unbehandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd 6.21 19272 27.1 - wärmebehandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert 19.44 337015 19.7 24.33 745580 29.1 25.12 151164 26.9 6.26 13953 12.8 8.50 28235 40.3 24.33 461010 17.2 24.34 319456 61.1 - e behandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd 5.09 9382068 3.5 5.23 673372 4.2 5.41 783416 5.1 6.42 706168 4.3 7.39 3497234 3.5 8.04 56524 10.0 8.27 24774 2.8 8.41 62991 7.5 9.59 49963 29.0 19.16 7050219 12.3 25.02 3844294 2.9 25.26 90721 15.3 30.02 269110 26.3 4.18 2879079 5.7 4.47 18058188 4.2 5.07 3278556 4.4 5.20 174935 7.8 5.39 58694 5.4 6.23 514492 4.1 6.44 459064 4.7 7.40 12742 21.8 8.41 26241 6.7 9.46 1401317 3.4 12.13 101205 4.3 13.50 658795 8.1 23.37 26217 8.2 24.31 23738822 1.3 26.06 28540 6.9 26.32 15600 38.7 - γ behandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert 5.09 12970419 4.7 5.24 736205 5.2 5.41 1015725 5.7 6.42 757123 5.0 7.39 5141938 5.0 8.03 54459 6.0 8.27 33807 7.6 8.40 81558 11.8 9.55 53394 13.3 19.14 10811858 5.1 25.01 3844294 2.9 25.24 90721 15.3 30.02 269110 26.3 4.18 3713915 2.8 4.46 22233908 2.1 5.07 2808141 3.2 5.20 127826 19.2 5.39 64494 6.6 6.23 323879 0.4 6.42 574008 4.3 7.40 11677 4.2 8.39 18694 21.0 9.44 1987901 1.8 12.11 110394 7.0 13.47 887188 4.1 23.35 53026 9.3 24.29 23887504 2.7 26.04 24193 9.6 26.31 13799 19.2 - Identifikation ? 2-methyl-1-Propen ? ? 2-methyl-1-Buten ? ? ? ? Butanal ? ? ? ? ? Isobutan 2-methyl-1-Propen ? ? ? ? 2-methyl-1-Buten ? ? 2-methyl-2-Propanol ? ? ? ? ? ? Aminosäuren in der Pharmakopöe Aminosäure L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin unbehandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd - wärmebehandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert 5.42 37834 0.2 6.02 43430 27.5 9.49 27426 13.1 10.05 9121 23.7 24.35 216937 40.2 29.13 9601845 6.9 37.05 197355 23.7 5.43 45378 9.3 9.51 861885 22.6 13.56 648836 29.8 - - e behandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert rsd 6.01 33216 6.8 9.47 62377 37.4 29.11 8323619 10.2 37.04 82888 15.0 23.43 241957 8.5 29.51 974455 9.5 33.28 240786 14.5 34.31 1669655 13.9 37.21 788908 12.6 5.43 1509159 4.9 8.40 36364 6.5 5.43 140652 1.0 9.25 568280 7.2 9.50 1209252 4.4 4.20 995438 8.2 4.49 420739 19.9 5.09 8250844 6.2 5.26 235610 8.8 5.45 156278 7.1 9.47 6740734 4.0 13.52 6060738 5.7 15.20 150468 6.0 18.52 415075 3.9 23.44 46583 17.3 69 γ behandelt (100 mg) RT (min) Mittelwert 6.01 56042 11.9 9.46 31761 5.3 10.01 11655 38.2 29.10 34381257 6.0 36.59 1681064 18.6 23.46 123706 16.0 29.52 1085051 17.4 33.31 207326 20.7 34.31 2527331 11.1 37.21 769009 5.8 5.42 1910077 6.2 8.39 36585 1.1 5.44 128665 6.3 9.26 405674 7.3 9.51 1087656 3.7 4.20 955465 7.0 4.50 328550 4.0 5.09 9942935 6.4 5.27 225635 6.3 5.44 146241 5.8 9.48 6840679 6.9 13.54 5801746 5.2 15.19 160253 12.0 18.54 418857 9.3 23.44 50851 20.6 Identifikation Acetaldehyd ? Dimethylsulfid Kohlenstoffdisulfid ? Dimethyldisulfid Dimethyltrisulfid Benzol Toluol Ethylbenzene Styrene Benzaldehyd Acetaldehyd Furan Acetaldehyd ? ? ? ? ? 2-methyl-1-Propen ? ? ? 2-Butenal ? ? 70 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.4.1.4.1 Unbehandelte Aminosäuren Bei den unbehandelten Aminosäuren konnte bei Leu 1 zusätzlicher Peak detektiert werden. Wahrscheinlich handelt es sich dabei um ein Zersetzungsprodukt von Leu, da die Peakfläche nach e-- und γ-Behandlung um das 15-fache zunahm (siehe Tabelle 12). 3.4.1.4.2 Wärmebehandelte Aminosäuren Von den 20 untersuchten Proben enthielten die 8 Aminosäuren Cys HCl, Glu, Iso, Leu, Lys HCl, Met, Ser und Val zusätzliche Peaks. Das Cys HCl dabei die meisten Peaks zeigte, war nicht weiter verwunderlich, da sich diese Aminosäure bei einer Trockensterilisation von 160 °C während 2 h völlig zersetzte. Dabei entstanden stark schweflige, unangenehm riechende Verbindungen. Die Untersuchung wurde trotzdem durchgeführt um die anfallenden Zersetzungsprodukte mit denjenigen der e- und γ–Sterilisation zu vergleichen. Für Cys HCl konnten 21 zusätzliche Peaks detektiert werden. Dabei wurden Acetaldehyd und Kohlenstoffdisulfid als Verunreinigung identifiziert mit einem Anteil von mehr als 0.01 %. Methanthiol und Thiophen wurden als Verunreinigung zwischen 0.01 und 0.001% gefunden. Dimethyldisulfid, 2-methyl-Thiophen, 3-methyl-Thiophen und 2,5-dimethyl-Thiophen wurden ebenfalls gefunden und identifiziert, lagen aber 0.001 %. An Hand des Fragmentierungsmusters und Bibliothkenvergleichs wurden 3 Peaks Carbonylsulfid, dimethyl-Thiophen und thieno-Thiophen zugeordnet. Trockensterilisiertes Glu hatte im Vergleich mit dem unbehandelten einen zusätzlichen Peak. Dieser konnte Acetaldehyd mit einem Anteil zwischen 0.01 und 0.001% zugeordnet werden. Ile zeigte 3 Peaks, wovon einer nur nach Trockensterilisation detektiert werden konnte. Durch Vergleich mit der Bibliothek und dem Fragmentierungsmuster wurde dem ersten Peak Butanal zugeordnet. Für Leu wurden 3 unbekannte Peaks erhalten. Bei einem davon handelte es sich um denselben wie unter 4.1.2.4. erwähnt. Met enthielt 7 zusätzliche Peaks, darunter Acetaldehyd, Kohlenstoffdisulfid, Dimethyldisulfid und Dimethyltrisulfid zwischen 0.01 und 0.001 %. Dimethylsulfid wurde unter 0.001 % gefunden. Bei Ser konnte Acetaldehyd zwischen 0.01 und 0.001 % gefunden werden. Val lieferte 2 unbekannte Peaks. 3.4.1.4.3 e-- und γ-behandelte Aminosäuren Nach e-- und γ–Bestrahlung wurden jeweils bei den 10 Aminosäuren Ala, Asp, CysHCl, Iso, Leu, Met, Phe, Ser, Thr und Val Zersetzungsprodukte gefunden. Lediglich das γ–sterilisierte Asp und Met enthielten einen Peak mehr als die e-sterilisierten. Für Ala wurde Acetaldehyd in beiden Fällen über 0.01% gefunden. Ebenfalls in Asp konnte Acetaldehyd gefunden werden. Die Menge lag aber unter 0.001 %. Dazu trat bei der γ–Behandlung ein zusätzlicher unbekannter Peak auf. Cys HCl zeigte Kohlenstoffdisulfid über 0.01%. Daneben wurde Methanethiol und Dimethyldisulfid unter 0.001% gefunden. Carbonylsulfid wurde nach Bibliothekenund Fragmentmustervergleich einem Peak zugeordnet. Bei Ile wurden 13 zusätzliche Peaks gefunden. 2-methyl-1-Buten konnte identifiziert werden und lag zwischen 0.01 und 0.001%, wobei das Signal nach γ-Behandlung grösser war als nach e-Behandlung. 2-methyl-1-Propen und Butanal wurden auf Grund eines Bibliothekenund Fragmentmustervergleichs zugeordnet. 2 der gefundenen Peaks waren identisch mit denjenigen, die bei einer Trockensterilisation auftreten, hatten aber ein um ein Vielfaches stärkere Signal. Leu hatte 16 zusätzliche Peaks, darunter 2-methyl-1- Aminosäuren in der Pharmakopöe Buten unter 0.01%. Isobutan, 2-methyl-1-Propen und 2-methyl-2-Propanol werden nach Bibliotheken- und Fragmentmustervergleich vermutet. Ein unbekannter Peak konnte sowohl bei unbehandelten, als auch sterilisierten Proben gefunden werden. Nach einer e-- und γ–Behandlung wurden aber um das zwanzigfache grössere Flächen erhalten. 2 weitere Peaks konnten auch nach einer Trockensterilisation gefunden werden. Met enthielt nach γ–Behandlung Dimethyltrisulfid und Dimethyldisulfid über 0.01% und nach e-- Behandlung zwischen 0.01 und 0.001%. Kohlenstoffdisulfid wurde nur nach γ– Behandlung zwischen 0.01 und 0.001% gefunden. Dimethylsulfid konnte bei beiden Behandlungsarten unter 0.001% nachgewiesen werden. Dagegen konnte Actaldehyd und ein zweiter Peak, welche sich nach der Trockensterilisation zeigten, nicht detektiert werden. Bei Phe lag Benzaldehyd in beiden Fällen über 0.01 % vor, Styrene nach γ–Behandlung zwischen 0.01 und 0.001 % und bei e-- Behandlung unter 0.01 %. Benzol, Toluol und Ethylbenzen konnten unter 0.001% detektiert werden. Ser enthielt neben Acetaldehyd, welches über 0.01% lag, noch Furan unter 0.001%. Furan konnte nach der Trockensterilisation nicht nachgewiesen werden. Für Thr wurden 3 Zersetzungsprodukte gefunden, wobei es sich bei dem ersten um Acetaldehyd über 0.01% handelte. Val zeigte 10 zusätzliche Peaks, wobei 2 davon durch Vergleich mit der Bibliothek und den Fragmentierungsmustern 2-methyl-Propen und 2-Butenal zugeordnet wurden. Es konnte damit gezeigt werden, dass die Bestrahlung zu signifikanten Veränderungen bei der Hälfte der untersuchten Aminosäuren führte. Dabei konnte kein wesentlicher Unterschied zwischen e-- oder γ-Bestrahlung gefunden werden. 71 72 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.5. Kohlenhydrate Kohlenhydrate werden in grossen Mengen der Fermentationsbrühe zugegeben und dienen den Mikroorganismen als C-Quellen für Zellwachstum und Produktion der Aminosäuren (siehe Tabelle 3). Die Monographien der Aminosäuren der Ph. Eur. sehen keine Überprüfung dieser Stoffklasse vor. Da es sich aber zumindest bei den fermentativ hergestellten Aminosäuren um potentielle Verunreinigungen handelt, wurden 20 biogene Aminosäuren (Tabelle 21, S. 107) auf Kohlenhydrate überprüft. Die zu entwickelnde Methode sollte die Monosaccharide Fructose und Glucose und das Disaccharid Saccharose bis zu einer Konzentration von 0.05 % (Aminosäure/Kohlenhydrat w/w) detektieren. Als endogene Substanz, welche am Bakterienstoffwechsel beteiligt ist, wurde das Zuckerderivat N-Acetyl-D-glucosamin als Verunreinigung ebenfalls in Betracht gezogen. 3.5.1. Dünnschichtchromatographie Kohlenhydrate lassen sich auf einfache Weise mittels Dünnschichtchromatographie und Sprühreagenzbehandlung nachweisen[72]. Das Ziel dieser DC-Untersuchungen lag in der Überprüfung von 20 Aminosäuren auf potentielle Zuckerverunreinigungen. Dazu musste zuerst eine Methode entwickelt werden, welche in der Lage war Zucker oder deren Derivate als Verunreinigungen in Aminosäuren noch in einer möglichst tiefen Konzentration nachzuweisen. 3.5.1.1. Geräte und Materialien Auftragegerät: Glaswanne: UV-Gerät: Linomat IV (CAMAC) Flachbodenkammer (CAMAG) 20 x 20 cm Typ N mit Deckel UV-Cabinet II (CAMAG) Kieselgelplatte (60 F254 20 x 20 cm (MERCK)) Substanz . Glucose H2O Fructose Saccharose N-Acetyl-D-glucosamin Ninhydrin Aceton Thymol Ethanol 99.8% Schwefelsäure 95% 1- Propanol Methanol Essigsäure 99% Dichlorethan Ammoniaklösung 32% Qualität Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. ≥ 99% ≥98.0% (UV) Purum Purum, ≥ 99% Rein purum Puriss p.a Analytic grade Ph. Eur. Purisse p.a. reinst Hersteller Hänseler Hänseler Hänseler SIGMA Fluka Hänseler Fluka Merck Hänseler FLUKA Scharlau Hänseler FLUKA Merck Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.5.1.2. Methodenentwicklung Zu den bekannten Zuckern, wie sie in den Nährmedien bei der Fermentation vorkommen, gehören unteranderem Glucose, Fructose und Saccharose. Deswegen wurden diese 3 Kohlenhydrate exemplarisch für die Methodenentwicklung ausgewählt. Daneben wurde noch N-Acetyl-D-glucosamin, als Bestandteil des Bakterienstoffwechsels und als Beispiel für ein Zuckerderivat mit geprüft. Die Methodenentwicklung wurde im Rahmen einer Semesterarbeit (Scilla Stocker) erarbeitet und weiter optimiert. Dies beinhaltete Löslichkeitsversuche, Fliessmitteloptimierung, Wahl des optimalen Sprühreagenz, Beladungsgrenze und Detektionsgrenze. 3.5.1.2.1 Löslichkeitsversuche Zur Auftragung der Proben werden in der DC gerne organische Lösungsmittel wie Methanol verwendet und weniger wässerige Lösungsmittel. Erstere haben den Vorteil bei optimaler Auftragungsgeschwindigkeit schnell am Auftragungspunkt zu verdampfen und so zu einem konzentrierten Startfleck zu führen. Aminosäuren sind hingegen in organischen Lösungsmitteln schlecht löslich. Da aber bei den Untersuchungen an der Beladungsgrenze gearbeitet werden sollte, war es notwendig die relativ grossen Mengen Probe in vernünftigen Volumen zu lösen und auf die Platte aufzubringen. Nach Untersuchung der Löslichkeit von L-Ala, L-Glu, Gly, L-Lys, L-Met, L-Phe und L-Thr in unterschiedlichen Lösungsmitteln, fiel die Wahl auf eine Mischung aus Methanol, Wasser und 32%-igem Ammoniak im Verhältnis 500:300:15. Damit war es möglich 10 mg der getesteten Amiosäuren in 1 ml zu lösen, was den Anforderungen genügte. Die gleichen Mischungen mit den Verhältnissen 500:200:50 und 500:200:25 und Essigsäure 99% an Stelle von Ammoniak lieferten deutlich schlechtere Ergebnisse. Es zeigte sich, dass das ermittelte Lösungsmittel bis auf L-Tyr für alle zu testenden Aminosäuren geeignet war. Für L-Tyr wurde verdünnte Ammoniak-Lösung R2 (Ph. Eur. 5.04) verwendet, wie sie zum Test von Ninhydrinpositiven Substanzen verwendet wird. 3.5.1.2.2 Wahl des optimalen Sprühreagenz Zur Detektion wurde das Ninhydrin-Sprühreagenz für Aminosäuren und das ThymolSchwefelsäure-Reagenz für die Zucker und Zuckerderivate gewählt (siehe Abbildung 13). Daneben wurde zum Nachweis der Kohlenhydrate noch Fehlingsche Lösung und Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz ausprobiert. Beide lieferten aber schlechtere Nachweis-grenzen. Nähere Angaben zu den Sprühreagenzien befinden sich im Anhang (S.146). 3.5.1.2.3 Fliessmitteloptimierung Aus Literatur und Ph. Eur., welche sich mit ähnlichen Problemstellungen befasste, waren zahlreiche Fliessmittel zur Auftrennung von Aminosäuren und Zuckern beschrieben worden. 6 Fliessmittel (siehe Tabelle 13) wurden an den Aminosäuren L-Ala, L-Glu, Gly, L-Lys, L-Met, L-Phe, L-Thr und den Zuckern Fructose, Glucose und Saccharose auf optimale Trennung getestet. Daraus wurde das vielversprechendste ausgewählt und an allen 20 Aminosäuren erprobt. Es stellte sich heraus, dass das Fliessmittel 6, welches die Ph. Eur. 4 zur Identitätsprüfung von Fructose, Glucose und Saccharose verwendete, auch geeignet war Aminosäuren aufzutrennen. Abbildung 13 zeigt die Auftrennung von 7 Aminosäuren und 4 Zuckern. Dabei bewegten sich die Zucker eher im untern Bereich der Platte (RF-Werte 0.21 – 0.24) und die Aminosäuren lagen tendenziell höher. Eine Trennung aller 20 Aminosäuren 73 74 Aminosäuren in der Pharmakopöe (siehe Abbildung 14) zeigte jedoch, dass dieses Fliessmittel für L-Cys HCl und L-Tyr ungeeignet war. Für die Untersuchung dieser Aminossäuren wurde Fliessmittel 3, wie es die Ph. Eur verwendet, eingesetzt. Tabelle 13 verschiedene Fliessmittel zur Tennung von Aminosäuren mittels DC Fliessmittel 1 2 3 4 5 6 Zusammensetzung H2O:1-Propanol (30:70) H2O:AcCOOH:Butanol (20:20:60) NH3 32 %:1-Propanol (30:70) H2O:AcCOOH:1-Propanol (20:20:60) NH3:EtOH:Ethylacetat (20:40:40) H2O:MeOH:AcCOOH:Dichloreth an (10:15:25:50) Herkunft Laskar et al., 2001 Ph. Eur. 5.04 Identitätsprüfung von Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Thr, Asp, Glu, His Ph. Eur. 5.04 Identitätsprüfung von Cys, Tyr, Lys, Arg Variante von Fliessmittel 2 Neues Fliessmittel (ohne Vorlage) Ph. Eur. 5.04 Identitätsprüfung von Glucose Aminosäuren in der Pharmakopöe blank Gly L-Ala L-Met L-Phe L-Thr L-Glu L-Lys Glc Aminosäuren Foto1 Fruc Sacc NAG Zucker Foto2 Abbildung 13 DC mit Fliessmittel 6 zur Trennung von Aminosäuren und Zuckern. Die Platte wurde erst zur Detektion der AS mit Ninhydrin-Reagenz behandelt und dann mit Thymol-Reagenz zur Detektion der Zucker. Es handelt sich also um einen Zusammenschnitt von 2 Fotos, aber der gleichen Platte. Auftragungsmenge: 25µg Lösungsmittel: MeOH: H2O: NH3 500:300:15 Fliessmittel H2O:MeOH:AcCOOH:Dichlorethan 10:15:25:50 Substanz Gly L-Ala L-Met L-Phe L-Thr L-Glu RF -Wert 0.20 0.24 0.39 0.46 0.23 0.20 Substanz L-Lys Glc Fruc Sacc NAG RF -Wert 0.10 0.21 0.22 0.16 0.24 75 76 Aminosäuren in der Pharmakopöe 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15 16. 17. 18. 19 20. Abbildung 14 DC mit Fliessmittel 6 zur Trennung von 20 Aminosäuren mit Ninhydrin Anfärbung Sprühreagenz Ninhydrin-Reagenz Auftragungsmenge: 15µg Lösungsmittel: MeOH: H2O: NH3 500:300:15 Fliessmittel H2O:MeOH:AcCOOH:Dichlorethan 10:15:25:50 3.5.1.2.4 Nr. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Substanz Gly L-Ala L-Val L-Leu L-Ile L-Cys L-Met L-Phe L-Tyr L-Trp RF-Wert 0.17 0.21 0.31 0.37 0.36 0.34 0.40 0.39 Nr. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Substanz L-Pro L-Ser L-Thr L-Asn L-Gln L-Asp L-Glu L-His L-Lys L-Arg RF-Wert 0.24 0.16 0.21 0.16 0.17 0.13 0.18 0.10 0.08 0.11 Beladungsgrenze Da die Zucker noch in möglichst tiefer Konzentration in den Aminosäuren detektiert werden sollten, war es notwendig an der Beladungsgrenze der Aminosäuren zu arbeiten. Es zeigte sich, dass eine Auftragung von 120 µg Aminosäure auf einer 5 mm Bande noch möglich war ohne zu einer Überladung der DC-Platte zu führen. Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.5.1.2.5 Nachweisgrenze Von Fructose, Glucose, Saccharose und N-Acetyl-D-glucosamin wurden Verdünnungsreihen (Verdünnungsbereich: 20 µg – 10 ng aufgetragene Substanz in 15 Schritten) auf den DC-Platten erstellt, diese mit Laufmittel 6 (siehe Tabelle 13) aufgetrennt und danach mit Thymol-Schwefelsäure-Reagenz behandelt. Tabelle 14 gibt die Resultate wieder. Für N-Acetyl-D-glucosamin lag die Nachweisgrenze bei 300 ng. Dies hatte zur Folge, dass die entwickelte Methode für diese Substanz 10fach weniger empfindlich im Vergleich zu den 3 anderen Zuckern war. Tabelle 14 Nachweisgrenze von 4 Kohlehydraten mittels DC Substanz Fructose Glucose Saccherose N-Acetyl-D-glucosamin 3.5.1.2.6 RF-Wert 0.16 0.15 0.12 0.26 Nachweisgrenze 20 ng 20 ng 30 ng 300 ng Detektionsgrenze Getestet wurden dabei die Nachweisgrenzen der vier Substanzen Fructose, Glucose, Saccharose und N-Acetyl-D-glucosamin als Verunreinigung in L-Phe. In Verdünnungsreihen (100 µg Aminosäure gespiked mit 10 µg – 10ng Zucker in 10 Verdünnungsschritten) konnte gezeigt werden, dass die Zucker ausser NAG bis zu einer Grenze von 0.05 % (m/m) nachgewiesen werden konnten. Tabelle 15 gibt eine Übersicht. Tabelle 15 Nachweisgrenze von gespikten Kohlenhydraten mittels DC Substanz Verunreinigung L-Phe Fructose Glucose Saccherose N-Acetyl-D-glucosamin 3.5.1.3. RF-Wert Aminosäure Zucker 0.40 0.16 0.40 0.15 0.40 0.12 0.40 0.26 Nachweisgrenze Menge % (m/m) 30 ng 0.03 50 ng 0.05 50 ng 0.05 800 ng 0.8 Probenvorbereitung und Methode Von den 20 Aminosäuren (Tabelle 21, S.107) wurden mit dem jeweiligen Lösungsmittel (siehe 3.5.1.2.3) 1 % Lösungen (m/V) hergestellt. Von jeder Aminosäure wurden eine blank-Auftragung (LM), 3 Probenauftragungen (120 µg AS), 1 Auftragung mit der jeweiligen Aminosäure gespiked mit Glucose (0.05 % (m/m)) und 1 Auftragung Glucose entwickelt. 77 78 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.5.1.4. Resultat der Untersuchungen auf Kohlenhydrate Es konnte bei keiner der 20 untersuchten Aminossäuren Glucose, Fructose oder Saccherose detektiert werden. Die untersuchten Proben enthielten damit keine dieser potentiellen Verunreinigungen in einer Konzentration von über 0.05 % (m/m). Ebenfalls konnten keine Hinweise auf N-Acetyl-Glucosamin gefunden werden, bei welchem die Detektionsgrenze bei 0.8 % (m/m) lag. Die untersuchten Proben erschienen im Rahmen der entwickelten Methode als rein und zeigten keine zusätzlichen Flecken, welche auf Verunreinigungen schliessen lassen würden. 3.5.2. HPLC mit Brechzahldetektor Um Kohlenhydrate als mögliche Verunreinigungen von Aminosäuren zu isolieren und zu detektieren, wurde die Eignung einer HPLC-Methode mit Brechzahldetektor in Betracht gezogen. Brechzahldetektoren eignen sich zur unselektiven Detektion zahlreicher Substanzen. Dabei wird eine Änderung der Brechzahl eines Gemisches aus Elutionsmittel und Probe gegenüber der Brechzahl des reinen Elutionsmittel gemessen. Dem Vorteil der unselektiven Detektion stehen aber einige Nachteile gegenüber. Brechzahldetektoren sind weniger empfindlich als UV/Vis Detektoren und anfälliger auf äussere Einflüsse wie Temperatur- oder Druckschwankungen. Der Umstand, dass zu jedem Zeitpunkt gegen eine Referenz gemessen werden muss, hat zur Folge, dass nur unter isokratischen Bedingungen getrennt werden kann[73]. Dies schränkt die Möglichkeiten einer Trennung sehr ein. Eigene Versuchen mit einem HPLC-System (Merck Hitachi D-6000), LiChrospher 100 NH2 (5µm, 250x4 mm) Säule und einem Brechzahldetektor (Merck RI-71) scheiterten schon an der Nachweisgrenze von Glucose (50 µg/ml H2O/ACN 25:75). Der Response von Fructose und N-Acetyl-D-glucosamin war mit Glucose vergleichbar und es wären dementsprechend Nachweisgrenzen in ähnlicher Grössenordnung zu erwarten gewesen. Auf eine Optimierung der Methode wurde verzichtet, da eine Verbesserung die Nachweisgrenze bestenfalls um den Faktor 10 erniedrigt hätte. Dies hätte bei weitem nicht ausgereicht Glucose als 0.05 %-ige (m/m) Verunreinigung in Aminosäuren zu detektieren. Aus diesem Grund und der Einschränkung bedingt durch die isokratische Trennung wurde die entwickelte DC-Methode 3.5.1. als geeigneter zur Prüfung von Zuckern eingestuft. Es ist zu erwähnen, das neuere Modelle von Brechzahldetektoren (Bsp. RefractoFlow 60 SunChrom) schon werkseitig eine Empfindlichkeit für Glucose von 0.05 µg/ml garantieren. Unter diesen Umständen könnte eine solche Methode wieder aktuell werden. 3.5.3. HPLC mit UV-Detektion bei 210 nm Im tiefen UV-Wellenlängenbereich zeigen fast alle Substanzen eine Absorption. Diese Eigenschaft könnte deshalb auch zur unselektiven Detektion von Aminosäuren und Kohlenhydraten genutzt werden. Der Versuch Fructose und Glucose mit dem gleichen HPLC-System wie unter 3.5.2. beschrieben und mit einem UV/Vis-Detektor (Merck Hitachi L-4250) bei einer Wellenlänge von 210 nm zu detektieren gelang nicht. Das Zuckerderivat NAG liess sich jedoch bis zu einer Konzentration von 0.5 µg/ml nachweisen. Damit wäre eine solche Methode zum Nachweis von NAG in Aminosäuren geeigneter als die entwickelte DC-Methode. Da aber die einfachen Zucker nicht zu detektieren waren, wurde der DC der Vortritt gelassen Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.5.4. Schnelltest auf Glucose in Aminosäuren Eine bekannte Reaktion zwischen Aminosäuren und Zuckern ist die MaillardReaktion (nichtenzymatische Bräunung). Dabei reagieren Aminosäuren mit reduzierenden Zuckern unter Einwirkung von Wärme zu einer Vielzahl neuer Verbindungen, die oft braun sind und die typischerweise bei Koch- und Bratvorgängen entstehen[74]. Dieser Umstand sollte für einen einfachen Test von Glucose in Aminosäuren genutzt werden. Es wurde anhand der Aminosäure Asp getestet, inwieweit eine potentielle Verunreinigung mit Glucose nach Hitzeeinwirkung noch zu einer optisch sichtbaren Verfärbung führte. Materialien Substanz Glucose . H2O L-Asparaginsäure Qualität Ph. Eur. Ph. Eur. Hersteller Hänseler Fluka Proben- und Probenvorbereitung Es wurden 4 Proben zur Untersuchung hergestellt. Probe 1 bestand aus Asp und diente als Referenz, Probe 2 enthielt Asp mit 10 % (m/m) Glucose, Probe 3 enthielt Asp mit 0.1 % (m/m) Glucose und Probe 4 enthielt Asp mit 0.01 % (m/m) Glucose. Die Proben 2-3 wurden durch Verreibung im Mörser hergestellt. Probe 1 wurde ebenfalls im Mörser verrieben, aber ohne Glucose zu zusetzen. Abbildung 15 zeigte die Proben zu 100 mg in 3 ml Gewindeflaschen vor der Hitzebehandlung. Es konnten dabei optisch keine Unterschiede zwischen den Proben festgestellt werden. Probe 1 Probe 4 Probe 3 Abbildung 15 Proben 1- 4 (je 100 mg) vor der Hitzebehandlung Probe 2 79 80 Aminosäuren in der Pharmakopöe Hitzebehandlung der Proben Die Plastikdeckel der Probengefässe wurden entfernt und die Öffnungen mit Aluminiumfolie verschlossen. Anschliessend wurden die Proben für 2 Stunden bei 160 °C in einem Thermocenter (Salvis) inkubiert. Nach dem Abkühlen wurden die Proben optisch bewertet. Resultat von einfachem Test auf Glucose in Aminosäuren Wie Abbildung 16 zeigt, verfärbten sich einige Proben. Nach Befragung von 6 Personen (es wurde im Voraus kein Hinweis über den Versuch gegeben), welche gebeten wurden, die Proben anhand der Stärke der Verfärbung anzuordnen, waren sich alle einig, dass sich die Proben 2 und 3 am stärksten verfärbt hatten. 3 Personen sagten aus, dass Probe 4 ein wenig dunkler war als Probe 1. Die anderen 3 Befragten konnten zwischen Probe 1 und 4 keinen deutlichen Unterschied erkennen. Dies liefert einen klaren Hinweis, dass eine potentielle Glucoseverunreinigung in Asp durch erhitzen bei 160 °C für 2 Stunden bis zu einer Konzentration von 0.1 % (m/m) gegen eine Referenz optisch erkannt wird. Es handelte sich also um den denkbar einfachsten Test um Glucose in Aspartat nachzuweisen und es wäre zu erwarten, dass der Test auch für weitere Aminosäuren und reduzierende Zucker funktioniert. Probe 1 Probe 4 Probe 3 Probe 2 Abbildung 16 Proben 1- 4 (je 100 mg) nach 2 h Inkubation bei 160 °C, deutliche Verfärbungen traten auf Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.6. Antibiotika 20 Aminosäuren wurden auf potentielle Verunreinigungen von Chloramphenicol, Penicillin V, Tetracyclin, Kanamycin, Neomycin und Streptomycin untersucht. Die Zielsetzung lag bei einem Nachweis von 0.05 % (w/w) Antibiotikum in den zu untersuchenden Aminosäuren. Als Methode kam RP HPLC mit UV-Detektion zum Einsatz, wobei die Proben vorher mittels Festphasenextraktion aufkonzentriert und von überschüssiger Matrix befreit wurden. Aus Vorversuchen war bekannt, dass die Gruppe der Aminoglykosidantibiotika nur sehr schwache Absorption im UV-Bereich zeigte. Deswegen genügte die entwickelte HPLC Methode nicht. Als Konsequenz wurden auf Kanamycin, Neomycin und Streptomycin mittels Dünnschichtchromatographie geprüft. 3.6.1. Dünnschichtchromatographie 20 Aminosäuren (Tabelle 21, S. 107) wurden mittels Dünnschichtchromatographie und Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz auf Kanamycin, Neomycin und Streptomycin überprüft. 3.6.1.1. Geräte und Materialien Auftragegerät: Glaswanne: UV-Gerät: Linomat IV (CAMAC) Flachbodenkammer (CAMAG) 20 x 20 cm Typ N mit Deckel UV-Cabinet II (CAMAG) Kieselgelplatte (60 F254 20 x 20 cm (MERCK)) Substanz Kanamycin Sulfat Neomycin Trisulfat Streptomycin Sulfat Anisaldehyd 4-(Dimethyloamin) –zimtaldehyd Ninhydrin Ammoniak 32% Eisessig 100% Essigsäure 99% Salzsäure 36% Schwefelsäure 95% 1-Butanol 1,2-Dichlorethan Ethanol Qualität cell culture tested cell culture tested 752 I.U./mg purum purum BioChemika puriss p.a. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. purum reagent grade puriss p.a. gradient grade Hersteller Sigma Sigma Sigma Fluka Fluka Fluka Merck Merck Hänseler Hänseler Hänseler Scharlau Fluka Merck 81 82 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.6.1.2. Methodenentwicklung Die Methode entsprach im Wesentlichen derjenigen zur Untersuchung von Kohlehydraten (siehe 3.5.1.) und wurde für die Detektion von Aminoglykosidantibiotika in Aminosäuren erweitert. Die 3 zu untersuchenden Antibiotika wanderten mit dem verwendeten Laufmittel nur sehr wenig und blieben nahe der Startlinie. Dies war nicht optimal, aber dadurch waren sie deutlich von den Aminosäuren getrennt. Die Weiterentwicklung der Methode beinhaltete Wahl des optimalen Sprühreagenz und Bestimmung der Detektionsgrenze. Dazu wurden je 6 Verreibungen von L-Glu mit den entsprechenden Antibiotika hergestellt. Die Konzentrationen betrugen 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 % (w/w) Antibiotikum in L-Glu. 3.6.1.2.1 Wahl des optimalen Sprühreagenz und Detektionsgrenze Zur Detektion von Kanamycin, Neomycin und Streptomycin in L-Glu wurde das Anisaldehyd-Schwefelsäure-, Ninhydrin- und 4-(Dimethylamino)-zimtaldehydSalzsäure-Reagenz getestet (Anhang S. 146). Es zeigte sich, dass das AnisaldehydSchwefelsäure-Reagenz die besten Resultate lieferte (siehe Tabelle 16) und im Falle von L-Glu konnten die 3 Antibiotika bis zu einem Limit von 0.05 % (w/w) detektiert werden. Allerdings liessen sich mit diesem Reagenz die Aminosäuren in der Regel nicht anfärben (siehe Abbildung 17). Die Ausnahmen bildeten L-Arg, L-Asn, L-Gln, L-Phe L-Ser, L-Thr, L-Trp und L-Tyr. Da das Interesse bei den Antibiotika lag und es sich um eine gut untersuchte DC-Methode handelte, bei der die Positionen der zu untersuchenden Aminosäuren bekannt waren, stellte dies kein Hinderungsgrund dar. Tabelle 16 Antibiotikanachweis mittesl DC und verschiedenen Sprühreagenzien Antibiotikum RF-Wert Kanamycin Sulfat Neomycin Trisulfat Streptomycin Sulfat 0.02 0.02 0.04 AnisaldehydSchwefelsäureReagenz 0.05 0.05 0.05 4-(Dimethylamino)zimtaldehydSalzsäure-Reagenz 0.1 0.5 10 NinhydrinReagenz 0.05 0.05 0.5 Aminosäuren in der Pharmakopöe Streptomycin 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Abbildung 17 DC mit Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz von L-Glu und Streptomycin in verschiedenen Konzentrationen (Das Reagenz reagiert nicht mit LGlu) Sprühreagenz: Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz Auftragungsmenge: 120 µg L-Glu (Nr. 2-7,9) 120 µg Streptomycin (Nr. 8) Lösungsmittel: MeOH: H2O: NH3 500:300:15 Fliessmittel H2O:MeOH:AcCOOH:Dichlorethan 10:15:25:50 3.6.1.3. Nr. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Substanz Blank (LSM) L-Glu/ Streptomycin 10% L-Glu/ Streptomycin 1% L-Glu/ Streptomycin 0.5 % L-Glu/ Streptomycin 0.1 % L-Glu/ Streptomycin 0.05 % L-Glu/ Streptomycin 0.01 % Streptomycin L-Glu Blank (LSM) Streptomycin 12 µg 1.2 µg 600 ng 120 ng 60 ng 12 ng 120 µg 120 µg - Probenvorbereitung und Methode Es wurden Probelösungen (1 %, m/V) aus den 20 Aminosäuren mit dem jeweiligen Lösungsmittel (siehe 3.5.1.2.1) hergestellt. Von jeder Aminosäure wurde ein Blank (LSM) und 2 Proben (120 µg AS) entwickelt. 3.6.1.4. Resultat der Untersuchungen auf Kanamycin, Neomycin und Streptomycin Es konnten keine Hinweise auf das Vorhandensein von Kanamycin, Neomycin oder Streptomycin bis zu einem Limit von 0.05 % (m/m) in den 20 untersuchten Aminosäuren gefunden werden. Das nachträgliche bedampfen mit Iod lieferte auch keine weiteren Erkenntnisse. Die untersuchten Aminosäuren erschienen als rein. 83 84 Aminosäuren in der Pharmakopöe Das verwendete Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz reagiert nicht nur mit Aminoglykosidantibiotika, sondern auch mit Tetracyclin, Makrolidantibiotika und den Stoffklassen der Antioxidantien, Steroiden, Prostaglandinen, Kohlenhydraten, Phenolen, Glycosiden, Sapogeninen und Mykotoxinen[75]. Es konnten aber auch sonst keine zusätzlichen Flecken detektiert werden, welche auf Verunreinigungen schliessen lassen könnten. Potentielle Verunreinigungen der Aminosäuren mit Chloramphenicol oder Penicillin lassen sich mit diesem Reagenz nicht nachweisen. 3.6.2. HPLC mit Festphasenextraktion 20 Aminosäuren (Tabelle 21, S.107) wurden auf potentielle Verunreinigungen durch Chloramphenicol, Penicillin V und Tetracyclin untersucht. Die Experimente wurden im Rahmen einer Masterarbeit von Herr M. Tomic durchgeführt. 3.6.2.1. Geräte und Materialien Festphasenextraktion Gerät SPE Säule SPE-10 (Baker) Oasis® HLB 1cc (30 mg) (Waters) Gerät Gradient Pump Autosampler UV-VIS-Detektor Software GP 50 (Dionex) AS 3500 (Dionex)) AD25 (Dionex) PeakNet (Version 6.30 SP3 Build 594) Säulen Vorsäule LiChroCart® RP-18 250x4 (Merck) Trennsäule LiChrosper® RP select B 250x4 (Merck) Detektion 210 nm Injektionsvolumen 20 µl Fliessgeschwindigkeit 1 ml/min Mobile Phase A: Puffer: 10 mM Phosphatpuffer pH 2.1 B: Acetonitril Trennprogramm Zeit (min) A (%) 0 75 2 75 19 50 23 80 27 80 32 75 35 75 B (%) 25 25 50 20 20 25 25 Aminosäuren in der Pharmakopöe Substanz Chloramphenicol Penicillin V (Kaliumsalz) Tetracyclin HCl Acetonitril Methanol o-Phosphorsäure 85% NaH2PO4 Dihydrat 3.6.2.2. Qualität Ph. Eur. 1510 Units ≥96.0% (HPLC) gradient grade HPLC gradient grade HPLC puriss p.a. ACS≥85% Ph. Eur. Hersteller Hänseler Sigma Fluka Merck Merck Fluka Hänseler Methodenentwicklung Das Ziel der Methode lag im Nachweis von Chloramphenicol, Penicillin V und Tetracyclin in Aminosäuren bis zu einer Limite von 0.05 %. Die Methodenentwicklung umfasste die Ermittlung der optimalen Detektionswellenlänge, die Wahl der Trennsäule, die Optimierung der Trennung, Detektionsgrenze und die Festphasenextraktion. Die Methodenentwicklung wurde anhand von L-Glu und dessen Verreibungen mit den entsprechenden Antibiotika durchgeführt. Die Konzentrationen der Verreibungen betrugen 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 % (w/w) Antibiotikum in L-Glu. Die Literatur, welche sich mit ähnlichen Problemstellungen befasst hatte, bildete die Ausgangslage[76]. Untersuchte Substanz Chloramphenicol[77] Chloramphenicol[78] Penicillin[79] Tetracyclin[77] Detektion Säule Mobile Phase 278 nm DAD DAD/ 225 nm 254 nm RP 18 RP 18 RP 8 RP 18 Tetracyclin[80] 355 nm RP 18 0.005 M (NH4)2PO4 : ACN (76:24) 0.01 M NaCH3COO (710 ml): ACN (290 ml) Gradient mit 20 mM Na2HPO4, MeOh und ACN H2O (760 ml), ACN (240 ml), N,N-dimethylformamide (60 ml), Ethanolamine (5 ml), NaHPO4 (2.5 g) 0.02 M Oxalsäure : MeOH : ACN (60 : 20 : 20) 3.6.2.2.1 Detektionswellenlänge Zur Ermittlung der optimalen Detektionswellenlänge wurden Wellenlängenscans zwischen 200 und 800 nm von allen 3 Antibiotika und L-Glu durchgeführt (Gerät siehe 4.3.4.1). Als Lösungsmittel wurde Phosphatpuffer (10mM, pH 6.2) verwendet. Aus dem Vergleich der Spektren wurde 210 nm als Detektionswellenlänge bestimmt. Ein weiterer Grund für diese Wahl war, dass der tiefe Wellenlängenbereich zudem eine unspezifische Detektion erlaubte und so die Möglichkeit bestand in den zu untersuchenden Aminosäuren neben den Antibiotika auch andere Verunreinigungen zu detektieren. 85 86 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.6.2.2.2 Trennsäule Die Trennbarkeit einer Mischung aus Chloramphenicol, Penicillin V und Tetracyclin (0.08 mg/ml 10 mM Phosphatpuffer pH 3.15) wurde an 4 verschiedenen Säulen erprobt. Es handelte sich dabei um 2 LiChrospher® RP select B unterschiedlicher Länge (250x4 bzw. 125x4 mm), einer LiChrospher® RP8 250x4 mm und einer LiChrospher® 100 RP18 endcapped (Merck). Es wurden für die Trennung folgende Bedingungen verwendet: Eluent 10 mM Phosphatpuffer pH 3.15 (A)/Acetonitril (B); Injektionsvolumen 20 µl; Fluss 1 ml/min; Detektion UV 220 nm. Dazu wurde ein einfaches Gradientenprogramm verwendet (0 min 95% A, 20 min 60% A, 30 min 15% A, 35 min 15% A) Es zeigte sich, dass unter diesen Bedingungen die LiChrosper® RP select B 250x4 mm die beste Trennung ermöglichte. 3.6.2.2.3 Optimierung der Trennung Eine Mischung aus Chloramphenicol, Penicillin V und Tetracyclin wurde bei unterschiedlichem pH getrennt (pH 2.1, 2.5, 3.15 und 6.2). Dabei wurden folgende Bedingungen verwendet: Eluent 10 mM Phosphatpuffer mit entsprechendem pH (A)/Acetonitril (B); Injektionsvolumen 20 µl; Fluss 1 ml/min; Detektion UV 210 nm; Gradientenprogramm 0 min 75% A, 2 min 75% A, 19 min 60% A, 30 min 15% A, 35 min 15% A. Wie erwartet hatte die Veränderung des pH`s einen massgeblichen Einfluss auf die Trennung der 3 Komponenten. Bei tieferem pH wurde Tetracyclin vor Penicillin eluiert im Gegensatz zu einer Trennung mit pH 6.2 (siehe Abbildungen 18 und 19). Die Möglichkeit einer sauberen Trennung zwischen Tetracyclin und Penicillin schien eher im sauren Bereich zu liegen. Dies führte aber zu Stabilitätsproblemen mit Penicillin, so dass eine solche Trennung nur mit dem säurestabilen Penicillin V möglich war. Das säurelabile Penicillin G würde sich unter diesen Bedingungen in kürzester Zeit zersetzen. Wäre das Ziel der Methode nur die Detektion von Tetracyclin, so müsste der pH des Puffers noch tiefer gewählt werden um einen symmetrischen schmalen Peak zu erhalten. Dies wäre mit Verwendung einer säurestabilen Säule sicher zu erreichen. In diesem Fall wurde mit pH 2.1 ein Kompromiss zwischen Auflösung und Stabilität gewählt. Die weitere Anpassung des Gradientenprogramms führte zu einer Trennung, wie sie für den Hauptversuch erwünscht war (siehe Abbildung 20). Alle untersuchten Aminosäuren wurden mit diesem Gradient unter 3 min eluiert und liessen sich deswegen gut von Tetracyclin trennen. Ein Austausch von Acetonitril mit Methanol brachte keine Verbesserung der Trennung. Aminosäuren in der Pharmakopöe Abbildung 18 Antibiotika getrennt bei pH 2.1 Mischung Abbildung 19 Antibiotika getrennt bei pH 6.2 Mischung Abbildung 20 Trennung einer Mischung von L-Glu und Antibiotika mit der entwickelten Methode, wie sie auch für die Hauptmessungen verwendet wurde. 87 88 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.6.2.2.4 Detektionsgrenze Aus Verreibungen von Chloramphenicol, Penicillin V, Tetracyclin HCl mit L-Glu in den Konzentrationen 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 % (w/w) wurde die Detektionsgrenze der entwickelten Methode bestimmt. Dazu wurden Probelösungen (2.5 mg Probe/ml) jeder Verreibung und reinem L-Glu in 10 mM Phosphatpuffer (pH 2.1) hergestellt und wie unter (3.6.2.1.)Geräte und Materialien beschrieben analysiert. Die Detektionsgrenze für Chloramphenicol und Penicillin in L-Glu lag bei 0.05 %. Tetracyclin HCl liess sich mit dieser Methode nur bis zu 0.5 % nachweisen (siehe Tabelle 17). Dies lag daran, dass Tetracyclin HCl in kleinen Konzentrationen mit dem verwendeten Trennprogramm eine starke Peakverbreiterung mit tailing aufwies. Um das gesteckte Nachweisziel von 0.05 % trotzdem zu erreichen, wurde eine Anreicherung der Probenlösung mittels der Technik der Festphasenextraktion durchgeführt. Dadurch konnte eine Erniedrigung der Detektionsgrenze bei allen Antibiotika erreicht werden (siehe Tabelle 17). Tetracyclin HCl konnte nun bis 0.05 % in L-Glu nachgewiesen werden. Zusätzlich waren die relativen Standardabweichungen an der Detektionsgrenze deutlich tiefer als zuvor. Tabelle 17 Detektionsgrenze von Chloramphenicol, Penicillin V und Tetracyclin HCl in L-Glu mit und ohne Festphasenextraktion Antibiotikum Chloramphenicol Ohne SPE Mit SPE Detektionsgrenze in L-Glu (w/w) Signalfläche (µAUmin) rsd % 2 Linearität (R ) 3.6.2.2.5 Penicillin V Ohne SPE Mit SPE Tetracyclin HCl Ohne SPE Mit SPE 0.05 % 0.01 % 0.05 % 0.01 % 0.5 % 0.05 % 478 835 260 420 1982 553 12.7 0.9994 1.81 0.9991 27.8 0.9981 2.8 0.9996 36.8 0.9988 4.36 0.9904 Festphasenextraktion Die Festphasenextraktion zur Probenvorbereitung wurde aufgrund der Problematik der zu hohen Nachweisgrenze von Tetracyclin HCl in L-Glu (siehe 3.6.2.2.4) eingeführt. Dabei sollten Chloramphenicol, Penicillin V und Tetracyclin HCl aus der Probelösung an der festen Phase angereichert werden, während die zu untersuchenden Aminosäuren nur wenig Wechselwirkung mit der Säule zeigen sollten. Die Wahl fiel aufgrund bereits vorhandener Anwendungen mit ähnlichen Problemstellungen auf die Oasis® HLB (Waters) SPE Säulen. Das Protokoll zum Vorgehen befindet sich im Anhang S. 151. Bei einer erneuten Ermittlung der Detektionsgrenze konnte gezeigt werden, dass die Festphasenextraktion erfolgreich war (siehe Tabelle 17). Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.6.2.3. Probenvorbereitung und Methode Die 20 zu untersuchenden Aminosäuren (Tabelle 21, S.107) wurden in 10 mM Phosphatpuffer pH 2.1 gelöst (25 mg AS in 10 ml Puffer). Aufgrund von Löslichkeitsproblemen wurden L-Asp 50 µl und L-Tyr 100 µl HCl (36%) zugegeben. Diese Lösungen wurden zuerst ohne Festphasenextraktion wie unter 3.6.2.1. beschrieben analysiert. Zusätzlich wurden jeweils 5 ml der Probelösungen einer Festphasenextraktion unterzogen (Protokoll siehe Anhang S. 151) und nochmals auf dieselbe Weise analysiert. 3.6.2.4. Resultat der Untersuchungen auf Chloramphenicol, Penicillin und Tetracyclin In 20 untersuchten Aminosäuren liessen sich keine Hinweise auf Chloramphenicol, Penicillin V und Tetracyclin HCl bis zu einem Limit von 0.05% (w/w) finden. Dafür wurde bei L-Asp und L-Val je eine zusätzliche unbekannte Verunreinigung detektiert. Nach Festphasenextraktion und erneuter Analyse zeigten beide Verunreinigungen eine Zunahme der Signalfläche (siehe Abbildungen 21 und 22). Bei L-Lys wurden 2 zusätzliche Peaks gefunden, wobei diese nach Festphasenextraktion nicht mehr zu detektieren waren (siehe Abbildung 23). Die Signalflächen beider Peaks nahmen über die Zeit zu. L-Tyr zeigte ebenfalls einen zusätzlichen Peak, welcher nach Festphasenextraktion nicht mehr vorhanden war (siehe Abbildung 24). Wie schon bei L-Lys nahm seine Signalfläche über die Zeit zu. Dies könnte auch auf ein Zersetzungsprodukt hinweisen, welches bedingt durch das saure Lösungsmittel langsam entsteht. Da bei diesen Aminosäuren keine Zersetzung unter diesen Bedingungen zu erwarten wäre, könnte es sich auch um ein Zersetzungsprodukt einer Verunreinigung handeln. vor SPE L-Asp L-Asp 1. nach SPE 1. Abbildung 21 L-Asp Chromatogramm (210 nm) vor und nach SPE L-Asp Probenvorbereitung vor SPE nach SPE Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 2.60 1288 12.6 6778 2.2 Signalfläche nach SPE 5.3-fach grösser 89 90 Aminosäuren in der Pharmakopöe vor SPE L-Val nach SPE L-Val 1. 1. Abbildung 22 L-Val Chromatogramm (210 nm) vor und nach SPE L-Val Probenvorbereitung vor SPE nach SPE Nr. Rt (min) Signalfläche (mVs) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 4.97 730 34 1679 1.8 L-Lys vor SPE Signalfläche nach SPE 2.3-fach grösser nach SPE L-Lys 1.2. Abbildung 23 L-Lys Chromatogramm (210 nm) vor und nach SPE L-Lys Probenvorbereitung vor SPE Signalfläche (mVs) nach SPE Nr. Rt (min) rsd (%) Signalfläche (mVs) rsd (%) 1. 1.73 250 27.6 - - Signalfläche nahm mit t zu 2. 1.84 67 7.6 - - Signalfläche nahm mit t zu Aminosäuren in der Pharmakopöe L-Tyr vor SPE L-Val nach SPE 1. Abbildung 24 L-Tyr Chromatogramm (210 nm) vor und nach SPE L-Asp Probenvorbereitung Nr. Rt (min) 1. 1.84 vor SPE Signalfläche (mVs) 11958 nach SPE rsd (%) 64.7 Signalfläche (mVs) rsd (%) - - Signalfläche nahm mit t zu 3.7. Metalle Metalle gehören bedingt durch den Herstellungsprozess zu den potentiellen Verunreinigungen in Aminosäuren. Deswegen sind die Prüfungen auf Schwermetalle und Eisen, wie sie die Ph. Eur. in den Monographien fordert, verständlich. Diese liefern jedoch keine exakten Werte für einzelne Metalle, sondern stellen eine optische Grenzprüfung (10 ppm) gegenüber einer Standardlösung dar[71]. Um ein präziseres Bild zu erhalten, wurden 4 ausgewählte Aminosäuren (Ph. Eur. Qualität) mittels ICP-MS untersucht. Bei der Auswahl wurde darauf geachtet, dass verschiedene Herstellungsprozesse verwendet wurden. Dies sollte die Frage beantworten, ob je nach Herstellungsart ein Muster in der Metallverteilung zu erkennen wäre. Aus den Bestrahlungsversuchen (Tabelle 22) war bekannt, dass viele Aminosäuren nach Strahlenexposition Verfärbungen aufwiesen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die beobachteten Verfärbungen im Zusammenhang mit Metallkontaminationen stehen könnten. Diese Metalle könnten katalytisch zu Abbaureaktionen führen, welche die Verfärbungen der Aminosäuren erklärten. Die Untersuchungen auf Metallkontaminationen in L-Asp, Gly, L-Ile und L-Ser wurden mit grosser Unterstützung von Prof. D. Günther und im Rahmen einer Semesterarbeit von Herrn S. Staub am Laboratorium für analytische anorganische Chemie (ETHZ) durchgeführt. 91 92 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.7.1. ICP-MS ICP-MS (ionductively-coupled-plasma mass spectrometry) stellt eine der leistungsfähigsten Methoden in der Elementaranalytik dar. Die Nachweisgrenzen liegt typischerweise im ppb-Bereich. 3.7.1.1. Geräte und Materialien ICP-Sektorfeld-MS: Element2 (ThermoFinnigan, Bremen) -high-resolution sector-field MS -dynamic range: 9 units (LOD:ppt) -meinhard-nebulizer (double pass spraycamber) Geräteparameter Torch-Position (mm) x-pos. y-pos. z.pos. 4.8 2.8 -5 Gas Flows (l/min) cool gas auxilliary gas Sample gas 16.8 1.1 1 Power (W) 1290 mass window (%) integration window (%) mittlere Auflösung (m/∆m) 80 50 4000 Lenses (V) extraction focus x-deflaction shape y-deflaction -2000 -788 2.2 160 5.1 High resolution lenses (V) Rotation Quad1 Quad2 focus Quad1 -9.7 6.4 sample time (s) Samples per peak 0.01 30 6.8 Probenaufschluss: ultraCLAVE II (MLS GmbH) Temperaturprogramm Zeit (min) 0 20 30 60 Temperatur (°C) 20 135 180 180 Leistung (W) 900 Druck (bar) 90 Pipetten: Eppendorf Reference (0.1, 0.2, 0.5, 1 und 2 ml) Waagen: Mettler AE 240, Mettler AT 400 Substanz HNO3 65% H202 30% Wasser Qualität suprapur suprapur Milli-Q Hersteller Merck AG Merck AG Aminosäuren in der Pharmakopöe Substanz Herstellung L-Asparaginsäure Glycin L-Isoleucin L-Serin 3.7.1.2. Enzymatische Synthese synthetisch Fermentation Fermentation Verfärbung nach Bestrahlung keine Qualität Ph. Eur. Prüfung auf Schwermetalle ja stark gelb keine bräunlich Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. ja ja Ja Prüfung auf Eisen ja nein ja ja Methodenentwicklung Die Methodenentwicklung umfasste den Probenaufschluss, eine Übersichtsmessung und Optimierung der Konzentrationsbestimmung der Metalle mittels externer Kalibration. 3.7.1.2.1 Probenaufschluss und Verdünnung Da die zu untersuchenden Aminosäuren in HCl und HNO3 löslich waren, stellte der Probenaufschluss keine grossen Probleme dar. Für die Hauptmessung wurden jeweils 100 mg Aminosäure in 2 ml HNO3 und 0.2 ml H202 mit einem ultraCLAVE aufgeschlossen. Die Proben wurden vor der Messung mit HNO3 (5%) um den Faktor 100 verdünnt, wobei im letzten Verdünnungsschritt Indium (10 ppb, CPI International, PeakPerformance) als interner Standard zugegeben wurde. 3.7.1.2.2 Übersichtsmessung Die Übersichtsmessungen der 4 Aminosäuren, bei welchen das gesamte Massenspektrum (m/z 5-255) gescannt wurde, ergaben, dass folgende Elemente weiter untersucht werden sollten: Na, Mg, Al, P, K, Ca, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Rb, Sr, Y, Mo, Pd, Cd, Sb, Ba, Hf, W, Pt, Hg, Tl, Pb, Th, U Für die Übersichtsmessung wurden jeweils 1 ml Probe (0.01 mg Aminosäure /ml 1 M HCl), 2 ml HNO3 und 0.2 ml H202 mit einem ultraCLAVE aufgeschlossen. Als blank diente 1 ml Milli-Q-Wasser. Daraus wurden 2 Serien mit 100 ppm bzw. 1000 ppm Matrixbelastung vermessen. Indium (10 ppb, CPI International, PeakPerformance) diente als interner Standard. Der Massenanteil der Elemente wurde durch Vergleich der erhaltenen Intensitäten mit dem internen Standard abgeschätzt und daraus die weiter zu untersuchenden Elemente und die Probenverdünnung bestimmt. 93 94 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.7.1.2.3 Optimierung der Konzentrationsbestimmung mittels externer Kalibration Der Aufschluss und die Verdünnung der Proben erfolgten wie unter Probenaufschluss beschrieben. Für die externe Kalibration wurden Lösungen mit 1, 5, 10 und 20 ppb Elementkonzentrationen hergestellt. Dazu wurden 1000 ppm Standards (Merck-IV-Standard) dementsprechend mit HNO3 (5%) verdünnt. Um Einflüsse der Matrix auf den internen Standard zu überprüfen, wurden zusätzlich zwei HNO3 (5%) Lösungen mit 10 ppb Indium hergestellt. Als erstes wurden die Kalibrationslösungen gemessen um die Linearität der Kalibrationsgerade zu überprüfen (R2 > 0.998, Ausnahme Na und Ca). Danach wurden die Aminosäureproben und zum Schluss die Indium Blanklösungen vermessen. Es zeigte sich, dass mit sehr tiefen Metallkonzentrationen in den Aminosäurelösungen zu rechnen war. Daher war es notwendig, den Kalibrationsbereich auf den ppt-Bereich zu erweitern. Natrium und Calcium waren in diesen Konzentrationsbereichen schwer zu bestimmen. Dies liess sich damit erklären, dass beide Elemente ubiquitär auftreten. Zudem zeigt Ca40 Interferenzen mit Ar40. Deswegen wurde auf weitere Messungen von Ca verzichtet. Einen Einfluss der Matrix auf die Indium Blanklösung konnte nicht festgestellt werden. 3.7.1.3. Messung Die Messlösungen von L-Asp, Gly, L-Ile und L-Ser wurden wie unter Probenaufschluss und Verdünnung beschrieben hergestellt. Die Lösungen für den externen Standard wurden durch Verdünnen von Standardlösungen (Merck-IVStandard) der jeweiligen Elemente in HNO3 (5%) in den Konzentrationen von 50, 100, 500, 1000 ppt und 5, 10, 20 ppb hergestellt. Die Messungen wurden an einem Element2 ICP-SF-MS mit den beschriebenen Geräteparametern und einem autosampler durchgeführt. Die Standardlösungen wurden zur Kontrolle der Kalibrationsgeraden vor den Aminosäuremesslösungen gemessen (R2 Werte siehe Tabelle 18). Zwischen den Messungen wurde das Gerät 1 min mit HNO3 (1%) gespült. 3.7.1.4. Resultat der Untersuchungen auf Metalle Kein gemessenes Schwermetall überschritt die 10 ppm Grenze (siehe Abbildung 25). Die Elemente Rb, Y, Mo, Cd, Hf, W, Pt, Hg, Tl, Pb, Th und U lagen in den untersuchten Aminosäuren unter ihrer Nachweisgrenze. Na überschritt bei L-Asp und L-Ile die 10 ppm Grenze. Für Na muss jedoch bedacht werden, dass dieses Metall ubiquitär vorkommt und in diesem Messbereich schwer quantifizierbar war. Fe, welches katalytisch aktiv sein könnte, lag bei Gly um 3 ppm. Bei Gly verlangte die Ph. Eur. 6 aber auch keinen Grenztest auf Eisen (10 ppm) wie bei den anderen 3 Aminosäuren. Aminosäuren in der Pharmakopöe ICP-MS Untersuchungen auf Metallkontaminationen 16 14 12 L-Asp ppm 10 Gly 8 L-Ile 6 L-Ser 4 2 0 Al Ba Cr Cu Fe K Mg Mn Na Ni P Sb Sr W Zn Abbildung 25 Resultat der ICP-MS Untersuchungen von L-Asp, Gly, L-Ile und L-Ser Tabelle 18 Auflistung der gefundenen quantifizierten Elemente mittels ICP-MS und externer Kalibration Element Al Ba Cr Cu Fe K Mg Mn Na Ni P Sb Sr W Zn LOD (ppb) 1.1 0.1 0.03 0.8 0.6 26.8 26.9 0.01 0.8 0.2 13.2 0.1 0.04 0.1 2.3 R 2 0.9938 0.9986 0.9997 0.9932 0.9973 0.6481 0.9914 0.9996 0.5372 0.9963 0.9992 0.9998 0.9989 0.9977 0.9977 L-Asp (ppm) 0.8 0.02 0.05 1.1 0.6 4.5 3.2 0.04 14.0 2.8 0.03 0.1 0.07 0.3 rsd (%) 25.0 10.0 20.0 9.1 16.7 8.9 18.8 10.0 8.6 10.7 33.3 10.0 2.9 13.3 Gly (ppm) 0.6 0.04 0.09 0.3 3.2 3.3 0.5 1.2 0.03 0.08 0.1 0.2 rsd (%) 33.3 10.0 11.1 16.7 9.4 21.2 10.0 8.3 0.0 12.5 10.0 15.0 L-Ile (ppm) 0.04 rsd (%) 10.0 0.2 0.3 1.0 0.005 12.2 0.02 - 15.0 13.3 50.0 20.0 9.0 10.0 - 0.03 0.01 0.1 16.7 10.0 20.0 L-Ser (ppm) 0.02 0.02 0.1 0.4 1.0 0.01 1.3 0.2 0.008 0.04 0.2 rsd (%) 10.0 15.0 20.0 12.5 40.0 9.0 7.7 10.0 50.0 12.5 15.0 95 96 Aminosäuren in der Pharmakopöe 3.8. Diskussion der Aminosäuren in der Pharmakopöe Aminosäuren und Derivate Wie unter 3.3.4. beschrieben konnte mit Hilfe von Vorsäulenderivatisierung, HPLC und Fluoreszenzdetektion eine Reinheitsprüfung für Aminosäuren erstellt werden, welche es ermöglichte fremde Aminosäuren und Aminderivate bis zu einer Grenze von 0.05 % (Mol/Mol) zu detektieren. Tabelle 19 stellt einen Vergleich zwischen der Ph. Eur. Prüfung, der Methode mittels Kapillarelektrophorese nach Novatchev [47] und der entwickelten Methode dar. Tabelle 19 Methodenvergleich der Reinheitsprüfungen auf Fremdaminosäuren und Derivate Methode Ph. Eur. Methode Technik Derivatisierungsreagenz DC Ninhydrin Sichtbare Flecken auf DC-Platte Detektion Nachweisgrenze auf Fremdaminosäuren 0.5 % Kapillarelektrophorese CE FMOC UV (254 nm) 0.05 % HPLC HPLC FMOC Fluoreszenz (ex. 260 nm/ em. 313 nm) 0.05 % Es konnte gezeigt werden, dass die Nachweisgrenze der entwickelten HPLCMethode 10-mal tiefer als diejenige der DC-Methode der Ph. Eur. lag und sich damit auf gleicher Höhe wie diejenige der CE-Methode bewegte. Der Vorteil von HPLC gegenüber der CE liegt im Verbreitungsgrad dieser Technik in der pharmazeutischen Industrie. Dies zeigt sich auch bei einem Vergleich der Anzahl Monographien, welche HPLC verwenden, gegenüber denjenigen, welche CE verwenden. Das Verhältnis liegt etwa bei 100:1. Da die Einführung einer neuen Reinheitsprüfung gesetzlichen Charakter hat, sollte bei ihrer Wahl neben den rein analytischen und ökonomischen Aspekten auf jeden Fall auch die in der Industrie gebräuchlichen und bewährten Methoden berücksichtigt werden. Unter 3.8.1. wurde deshalb für Aminosäuren eine neue Prüfung auf verwandte Substanzen mittels HPLC vorgeschlagen. FMOC in 6-fachem Überschuss mit einer Reaktionszeit von 2 min bei RT konnte als geeignetes Derivatisierungsreagenz für Aminosäuren bestätigt werden. Es wurde zudem eine n-Pentan Extraktion nach Derivatisierung zur Entfernung von überschüssigem Derivatisierungsreagenz angewendet (siehe 3.3.4.2.2). Dabei war man sich des Risikos bewusst, dass potentielle lipophile Verunreinigungen durch diese Extraktion der Analyse entzogen werden könnten. Die zusätzlichen Untersuchungen an 19 Aminosäuren mit und ohne n-Pentan Extraktion ergaben jedoch keine Anhaltspunkte auf eine grössere diesbezügliche Problematik, so dass der Vorteil der Extraktion zur Entfernung von überschüssigem Reagenz klar überwog. Es ist aber festzuhalten, dass sehr lipophile Verunreinigungen durch die nPentan Extraktion der anschliessenden Analyse entzogen werden könnten. Das Trennprogramm wurde zur Auftrennung von 19 Aminosäuren optimiert (siehe 3.3.4.2.3). Damit konnte bei allen 19 zu untersuchenden Aminosäuren das gleiche Trennprogramm verwendet werden, was somit einen Quervergleich der erhaltenen Chromatogramme erlaubte. Eine Basislinien Trennung konnte dabei nicht bei allen Aminosäuren erreicht werden (zwischen L-Gln und L-Ser, sowie Gly und L-Thr). LHis konnte mit dieser Methode nicht verlässlich erfasst werden. Zum einen fiel die Retentionszeit von L-His mit derjenigen von L-Thr zusammen und zum andern Aminosäuren in der Pharmakopöe zeigten sich Stabilitätsprobleme, wie sie die Ph. Eur. unter 2.2.56 erwähnt. Es muss damit darauf hingewiesen werden, dass die Methode zum Nachweis von L-His nicht zuverlässig ist. Die anderen untersuchten Aminosäuren zeigten diese Problematik nicht. Ein weiteres Phänomen, welches oft bei einer Trennung auftrat, war eine Retentionszeitverschiebung (z. B. siehe L-Asn Peak S. 32). Diese konnte manchmal auch 1 min betragen. Es wurde vermutet, dass diese Problematik mit dem verwendeten flachen Gradientenprogramm zusammenhängt, welches vom HPLCGerät nicht immer problemlos umgesetzt werden konnte (siehe 3.3.4.1.). Die relative Retention blieb davon aber ausgenommen und so wurde diese zum Vergleich verschiedener Chromatogramme verwendet. Der verwendete Puffer (NaH2PO4, 10 mM, pH 8) war basisch und lag damit an der Grenze der Anwendungsmöglichkeit der verwendeten Säule (Waters Spherisorb® 5µm ODS2 pH 2-8) (siehe 3.3.4.2.3). Dadurch musste eine Säule jeweils nach ca. 300 Analysen ersetzt werden. Durch Verwendung einer basestabileren Säule könnte die Wirtschaftlichkeit der Methode ohne analytische Einbussen noch zusätzlich verbessert werden. Die Messabweichung der Methode zum Gehaltvergleich verschiedener Chargen der gleichen Aminosäuren war mit 5.5 % eher gross (siehe 3.3.4.2.4). Dies lag vor allem an den vielen kleinen Verdünnungsschritten, welche bei der Derivatisierung notwendig waren (siehe Anhang S. 150). Sollte sich das Interesse nur auf einen Gehaltsvergleich oder eine Gehaltsbestimmung einer Aminosäure beschränken, so liesse sich durch Optimierung der Verdünnungsschritte die Messabweichung leicht senken. Untersuchung von 19 Aminosäuren Im Vergleich mit dem Test auf Ninhydrin nachweisbare Substanzen der Ph. Eur. konnte mit der HPLC Methode mit FMOC Vorsäulenderivatisierung wesentlich mehr Information über die Reinheit der Aminosäuren gewonnen werden (siehe 3.3.4.). Mit der Ph. Eur. Methode wurden zuvor bei den untersuchten Aminosäuren keine zusätzlichen Verunreinigungen detektiert und die Proben galten nach Ph. Eur. Kriterien als rein (siehe 4.2.5.4.). Die Analysen derselben Proben mit der entwickelten HPLC-Methode ergaben ein differenzierteres Bild (siehe 3.3.4.4.1). Mit Ausnahme von L-Ala und L-Pro konnten bei allen untersuchten Aminosäuren zusätzliche Peaks gefunden werden. Die Verwendung einer sensitiveren Methode zur Detektion von potentiellen Verunreinigungen erwies sich somit als erfolgreich und es konnte gezeigt werden, dass unter der 0.5 % Limite sehr viele detektierbare Verunreinigungen auftraten. Insgesamt wiesen aber alle untersuchten Aminosäuren sehr hohe Reinheit auf und die Gesamtverunreinigung wurde in allen Fällen als unkritisch beurteilt. Untersuchung von 19 Chargen Isoleucin Die untersuchten Chargen beider Hersteller A und B wiesen nach Untersuchung (wie deklariert) hohe Reinheit auf (siehe 3.3.4.4.2). Trotzdem konnten Verunreinigungen mit der entwickelten HPLC-Methode detektiert werden. Bei beiden Herstellern konnte Valin als Verunreinigung identifiziert werden. Insgesamt war die Reinheit bei Hersteller B (Gesamtverunreinigung 0.17 %) höher als bei Hersteller A (Gesamtverunreinigung 0.47 %). 97 98 Aminosäuren in der Pharmakopöe Untersuchung von 15 Chargen Phenylalanin Es wurden insgesamt 15 Chargen Phe von 2 Herstellern untersucht (siehe 3.3.4.4.3). Es konnten dabei nur sehr kleine Unterschiede zwischen den beiden Herstellern gefunden werden. Typischerweise enthielt Phe des Herstellers A einen kleinen Peak bei einer Retentionszeit von 33.49 min, welcher bei Hersteller B nicht vorkam. Allerdings standen bei Hersteller A auch mehr Chargen zur Untersuchung zur Verfügung als bei Hersteller B. Bei beiden Herstellern zeigten die Aminosäuren mit der verwendeten Methode hohe Reinheit. Untersuchung von 11 Chargen Serin Alle 3 Hersteller zeigten ein ähnliches Verunreinigungsprofil, welches aus mindestens 3 Verunreinigungen bestand (siehe 3.3.4.4.4). Die Gesamtverunreinigung fiel durch das Vorhandensein eines Peaks (siehe Peak 3 Hersteller A, S. 57) sehr hoch aus (> 1%). Es bestehen aber berechtigte Zweifel, dass es sich dabei um eine echte Verunreinigung handelt. Viel wahrscheinlicher erscheint es, dass es sich dabei um ein Nebenprodukt der Derivatisierung handelt, da dieses Phänomen auch noch bei anderen Aminosäuren beobachtet wurde (3.3.4.4.1 Gln, Gly und Tyr). Zudem wäre eine so grosse Verunreinigung der zuvor angewendeten Ph. Eur. Prüfung kaum entgangen. Ohne diese Verunreinigung lag die Gesamtverunreinigung bei allen 3 Herstellern unter 0.14 %, was einer sehr hohen Reinheit entsprach. Flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände Bei den unbehandelten Aminosäuren konnten bis auf eine Ausnahme (Leu) keine flüchtigen Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukte detektiert werden (siehe 3.4.1.4.1). Da sich damit ausser für Leucin keine Hinweise auf eine Problematik mit dieser Gruppe von Verunreinigungen ergaben, wurde der Schluss gezogen, dass bei der Produktion anfallende flüchtige Verunreinigungen effektiv bei der Reinigung entfernt werden konnten. Dass die Methode aber geeignet war um flüchtige Zersetzungsprodukte von Aminosäuren sehr sensitiv zu detektieren, zeigte sich einerseits in der Methodenentwicklung (siehe 3.4.1.2.) und andererseits im Vergleich zu den antimikrobiell behandelten Aminosäuren (siehe 3.4.1.4.2 und 3.4.1.4.3), bei welchen viele Zersetzungsprodukte auftraten und wovon viele identifiziert werden konnten. Bei Leu wurde ein Peak bei einer Retentionszeit von 6.21 min gefunden und der auch bei allen folgenden antimikrobiell behandelten Proben auftrat. Nach e-- und γ– Behandlung zeigte sich zudem eine drastische Zunahme dieses Peaks (siehe Tabelle 12). Deswegen wurde vermutet, dass es sich dabei um ein Zersetzungsprodukt handelte und nicht um eine flüchtige Verunreinigung aus dem Herstellungsprozess. Kohlenhydrate Obwohl 12 der 20 untersuchten Aminosäuren mittels Fermentation hergestellt wurden und damit während der Produktion massivem Zusatz von Kohlehydraten als Nährstoffquelle ausgesetzt waren, konnte bei keiner Aminosäure ein Hinweis auf Kohlenhydrate über 0.05 % mit der entwickelten DC-Methode gefunden werden (siehe 3.5.1.4.). Die Hypothese, wonach bei fermentativ hergestellten Aminosäuren Kohlenhydrate als Verunreinigungen auftreten könnten, wurde bei den untersuchten Aminosäuren in der Pharmakopöe Aminosäuren nicht bestätigt. Sollte es sich in der Zukunft oder durch andere Untersuchungen als notwendig erweisen, eine Grenzprüfung auf Kohlenhydrate bei Aminosäuren einzuführen, so könnte auf die entwickelte Methode zurückgegriffen werden. Eine Ph. Eur. Grenzprüfung auf Saccharose für Phe könnte wie folgt aussehen: Mit Thymol-Schwefelsäure-Reagenz nachweisbare Substanzen: Die Prüfung erfolgt mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (2.2.27) unter Verwendung einer Schicht eines geeigneten Kieselgels. Untersuchungslösung a: 0.10 g Substanz werden in einer Mischung aus Methanol R, Wasser R und konzentrierter Ammoniak-Lösung R 1 (500:300:15 Volumenteile) zu 10 ml gelöst. Referenzlösung a: 10.0 mg Saccharose R werden in einer Mischung aus Methanol R, Wasser R und konzentrierter Ammoniak-Lösung R 1 (500:300:15 Volumenteile) zu 10 ml gelöst. 500 µl dieser Lösung werden mit derselben Mischung zu 100 ml gelöst. Referenzlösung b: 10.0 g Saccharose R werden in einer Mischung aus Methanol R, Wasser R und konzentrierter Ammoniak-Lösung R 1 (500:300:15 Volumenteile) zu 10 ml gelöst. 9 ml dieser Lösung werden mit 1 ml Untersuchungslösung a gemischt. Auf die Platte werden getrennt 12 µl (5 mm Banden) jeder Lösung aufgetragen. Die Platte wird an der Luft trocknen gelassen. Die Chromatographie erfolgt mit einer Mischung von 10 Volumenteilen Wasser R, 15 Volumenteilen Methanol R, 25 Volumenteilen wasserfreier Essigsäure R und 50 Volumenteilen Dichlorethan R über eine Laufstrecke von 10 cm. Die Platte wird im Warmluftstrom getrocknet, mit einer Lösung aus 0.5 g Thymol R in 5 ml Schwefelsäure R und 95 ml Ethanol 96% R besprüht und für 10 min oder bis die Flecken erscheinen bei 115 °C erhitzt. Kein im Chromatogramm der Untersuchungslösung a auftretender Nebenfleck darf grösser oder stärker gefärbt sein als der Fleck im Chromatogramm der Referenzlösung a (0.05 Prozent). Die Prüfung darf nur ausgewertet werden, wenn das Chromatogramm der Referenzlösung b 2 deutlich getrennte Flecken aufweist. Eine noch einfachere Lösung könnte der Schnelltest auf Glucose liefern (siehe 3.5.4.). Antibiotika Weder mittels DC (siehe 3.6.1.4.) noch mittels HPLC und SPE (siehe 3.6.2.4.) liessen sich in den 20 untersuchten Aminosäuren Hinweise auf Antibiotika finden. Es konnte in dieser Arbeit somit keine Notwendigkeit für eine Prüfung auf Antibiotika in Aminosäuren festgestellt werden. Es wäre jedoch zu überlegen, ob zukünftige Vorschriften nicht die Offenlegung von Antibiotika generell fordern sollten, welche bei Herstellung von fermentativen Produkten verwendet werden. Nur so wäre eine gezielte Prüfung möglich. Die DC-Methode, welche zum Nachweis von Aminoglycosidantibiotika verwendet wurde und im Wesentlichen derjenigen für Kohlenhydrate entsprach, war in der Lage Aminosäuren von Antibiotika zu trennen. Allerdings blieben die Antibiotika sehr nahe am Auftragungspunkt und liessen sich nicht untereinander trennen (siehe 3.6.1.2.). Eine Optimierung der Trennung durch Wahl eines neuen Laufmittels oder einer anderen Platte wäre angebracht. Mittels HPLC und SPE konnten die 3 Antibiotika Chloramphenicol, Penicillin und Tetracyclin von den untersuchten Aminosäuren getrennt werden. Insbesondere die Technik der SPE eignete sich hervorragend zum Anreichern der gesuchten Antibiotika in der Probe (siehe Tabelle 17). Damit liess sich die Nachweisgrenze um den Faktor 5 senken. Vor allem Tetracyclin stellte eine hohe Anforderung an die anschliessende Trennung. Nur durch Verwendung eines sehr sauren pH`s (2.1) war eine Analyse möglich. 99 100 Aminosäuren in der Pharmakopöe Dadurch entstanden aber Stabilitätsprobleme mit Penicillin, welches sehr schnell (innert Stunden) Zersetzung zeigte. Zukünftige Fragestellungen über die Anwesenheit von Penicillin oder Tetracyclin in Aminosäuren sollten besser mit separaten und auf das jeweilige Antibiotikum zugeschnittenen Methoden beantwortet werden. Metalle Die Erwartung, dass fermentativ hergestellte AS mehr Metalle enthalten könnten als durch chemische Synthese hergestellte, konnte bei den getesteten Aminosäuren nicht bestätigt werden (siehe 3.7.1.4.). Im Gegenteil wurden bei L-Asp und Gly (Ausnahme Na) grössere Mengen der Metalle Mg, Al, K, Fe und Cu gefunden. Die Annahme, dass die nach Bestrahlung auftretenden Verfärbungen bei Gly und LSer auf katalytisch aktive Metalle zurückgeführt werden könnten, bestätigte sich ebenfalls nicht. Die gefundenen Metallkonzentrationen waren zu klein um dafür als Erklärung zu dienen. Die Prüfungen auf Schwermetalle und Eisen, wie sie die Ph. Eur. in den Monographien für Aminosäuren fordert, scheinen als ausreichend. 3.8.1. Vorschlag einer neuen Prüfung auf verwandte Substanzen Der Fall von Tryptophan hatte in der Vergangenheit bewiesen, dass Nebenprodukte fermentativ hergestellter Aminosäuren schon in kleinsten Mengen die Gesundheit gefährden können (im Falle von Trp limitiert die Ph. Eur. Methode die mit der Problematik assoziierte Substanz 1,1`-ethylidenbis(tryptophan) auf 10ppm). Die in dieser Arbeit entwickelte Methode basierend auf HPLC stellt einen Lösungsansatz dieser Problematik dar. Mit ihrem Potential Fremdaminosäuren und Derivate als Verunreinigungen bis 0.05 % zu detektieren, ergibt sich dadurch eine bessere Kontrolle der Reinheit und damit auch der pharmazeutischen Sicherheit. Letztlich dürfte auch die Akzeptanz in der Industrie durch Verwendung einer verbreiteten Analysetechnik gesichert sein. Im Folgenden wurde ein Vorschlag erarbeitet, wie eine neue Prüfung auf verwandte Substanzen im Falle von Serin aussehen könnte. Es muss aber betont werden, dass es sich dabei um einen Vorschlag handelt. Eine vollständige Methodenvalidierung müsste durchgeführt werden und auch das Gradientenprogramm, welches zur Trennung von 19 Aminosäuren optimiert wurde, müsste letztlich auf jede einzelne Aminosäure angepasst werden. Prüfung auf verwandte Substanzen Die Prüfung erfolgt mit Hilfe der Flüssigchromatographie (Ph. Eur. 6.2/ 2.2.29). Alle Lösungen müssen frisch hergestellt sein. FMOC-Cl-Lösung (6 nmol/µl): 15.6 mg FMOC-Cl R werden in 10.0 ml Acetonitril R gelöst. Borsäurepuffer (200 mM Borsäure R, pH 8.5): 3.10 g Borsäure R werden in 200 ml Wasser R gelöst und mit 2 M Kaliumhydroxid R auf pH 8.5 eingestellt. Anschliessend wird mit Wasser R auf 250.0 ml ergänzt. Untersuchungslösung a: 24.0 mg Substanz werden in 20.0 ml Borsäurepuffer gelöst. 1.0 ml dieser Lösung wird mit Borsäurepuffer zu 10 ml verdünnt. Stammreferenzlösung: 24.0 mg Serin CRS werden in 20.0 ml Borsäurepuffer gelöst. Aminosäuren in der Pharmakopöe Referenzlösung a: 1.0 ml Stammreferenzlösung wird mit Borsäurepuffer zu 10.0 ml verdünnt. Referenzlösung b: 26.0 mg Asparaginsäure CRS und 23.0 mg Valin CRS werden in 20.0 ml Borsäurepuffer gelöst. 0.50 ml dieser Lösung wird mit Borsäurepuffer zu 10.0 ml verdünnt. 0.20 ml dieser Lösung wird mit Borsäurepuffer zu 20.0 ml verdünnt. 1.0 ml dieser Lösung und 1.0 ml Stammreferenzlösung werden mit Borsäurepuffer zu 10.0 ml verdünnt. Referenzlösung c: 10 ml Borsäurepuffer. Derivatisierung: Es werden die Untersuchungslösung, die Referenzlösung a, Referenzlösung b und Referenzlösung c mit FMOC-Cl derivatisiert. Es werden je 0.20 ml der jeweiligen Lösung mit 0.20 ml FMOC-CL-Lösung bei Raumtemperatur für 2 min intensiv gemischt. Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit 0.40 ml Pentan R extrahiert und der organische Überstand verworfen. Die Chromatographie kann durchgeführt werden mit - einer Säule von 0.25 m Länge und 4 mm innerem Durchmesser, gepackt mit octadecylsilyliertem Kieselgel zur Chromatographie R (µm) - Einsatz einer linearen Gradientenelution zweier mobiler Phasen A und B mit einer Durchflussrate von 1 ml/min -1 mobile Phase A: 90 Volumenteile einer Lösung Kaliumdihydrogenphosphat R (1.36 g · l ), die mit verdünnter Kaliumhydroxid-Lösung R auf einen pH-Wert von 8.0 eingestellt wurde, werden mit 10 Volumenteile Acetonitril R gemischt. mobile Phase B: Acetonitril R Zeit (min) mobile Phase A (% V/V) mobile Phase B (%V/V) 0 98 2 8 91 9 10 90 10 21 89 11 25 82 18 35 81 19 36 65 35 42 65 35 45 15 85 50 15 85 55 98 2 60 98 2 - einem Fluoreszenzdetektor bei einer Exzitation von 260 nm und einer Emission von 313 nm Die Temperatur der Säule wird bei 25 °C gehalten. Je 10 µl Referenzlösung a, b und c werden getrennt eingespritzt. Werden die Chromatogramme unter den Vorgegebenen Bedingungen aufgenommen, so betragen die Retentionszeiten für Serin etwa 15 min, für Asparaginsäure etwa 5 min, für Valin etwa 31 min und für FMOC-OH etwa 45 min. Das System darf nur verwendet werden, wenn die Referenzlösung c bis zum Erscheinen des FMOC-OH keine störenden Peaks aufweist und in Referenzlösung b die Peaks für Asparaginsäure und Valin klar gegen über der Referenzlösung c detektiert werden können. 10 µl Untersuchungslösung a wird eingespritzt. Das Chromatogramm der Untersuchungslösung a wird mit demjenigen der Referenzlösung a verglichen. Kein erhaltener Peak darf grösser sein als die zweifache Fläche von Valin in Referenzlösung b (0.1 %). Die Gesamtverunreinigung darf nicht grösser sein als die 10fache Fläche von Valin in Referenzlösung b (0.5 %). Peaks deren Fläche kleiner ist als das 0.5fache der Fläche von Valin in Referenzlösung b (0.025%), werden nicht berücksichtigt. 101 102 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.1. Antimikrobielle Behandlung und Sterilität Die Ph. Eur. versteht unter den Begriff Sterilität die Abwesenheit von lebensfähigen Mikroorganismen. Die Methode, welche gewählt werden muss um dieses Ziel zu erreichen, hängt vom Produkt selbst ab. Arzneimittel oder Gegenstände dürfen gemäss Ph. Eur. nur dann als steril bezeichnet werden, wenn sie den Forderungen unter „Prüfung auf Sterilität“ entsprechen und in einer kontaminationssicheren Verpackung an den Verbraucher abgeben werden. Da die Wirksamkeit eines Sterilisationsverfahrens durch nachträgliche Untersuchung und Prüfung nicht vollständig nachgewiesen werden kann, müssen diese Verfahren validiert und deren Leistungsfähigkeit überwacht werden[81]. Grundsätzlich stehen zum Erreichen des SAL 10-6 (Sterility assurance level) direktes Erhitzen, Erhitzen in heisser Luft, Behandlung mit strömendem Dampf, Behandeln mit gespanntem Wasserdampf, keimtötende Stoffe und Bestrahlung zur Auswahl[82, 83]. Für Aminosäuren in Lösung sind die Behandlung in gespanntem Wasserdampf (121 °C, 15 min) und die Sterilfiltration die Methoden der Wahl. Eine kostengünstige antimikrobielle Behandlung von Bulkwaren ist damit aber nicht zu erreichen. Für Aminosäuren als Trockensubstanz käme nur Trockensterilisation oder Bestrahlung in Frage. Gassterilisation (Ethylenoxid) eignet sich bestenfalls für Gegenstände und darf nur eingesetzt werden, wenn keine Alternative zur Verfügung steht (Ph. Eur. 01/2008:50101). 4.1.1. Antimikrobielle Behandlung mit trockener Hitze Die Standardbedingungen für die Antimikrobielle Behandlung mit trockener Hitze im Endbehältnis liegen bei einer Inkubation von 2h bei 160 °C (Ph. Eur 01/2008:50101). Damit diese Methode verwendet werden könnte, müssten die Aminosäuren eine solche Prozedur ohne Zersetzungserscheinungen überstehen. Da der Schmelzpunkt bei allen untersuchten Aminosäuren (Ausnahme L-Gln, Lys HCl und L-Cys HCl, siehe Tabelle 20) über 200 °C lag, sollte eine solche Methode grundsätzlich anwendbar sein. Dagegen spricht jedoch der Fakt, dass der Schmelzvorgang bei Aminosäuren mit Zersetzung endet. Dies zeigt, dass Aminosäuren nur bis zu einem gewissen Grad tolerant gegenüber Temperatur sind. Bei einer Einwirkung von 160 °C über 2 h wäre deswegen durchaus mit Zersetzungsprodukten zu rechnen. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Tabelle 20 Schmelzpunkte von Aminosäuren nach verschiedenen Quellen Aminosäure Smp (°C) [84] L-Alanin L-Arginin L-Asparagin L-Asparaginsäure L-Cystein HCl L-Glutamin L-Glutaminsäure Glycin L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin HCl L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin 4.1.2. 297 244 235 270 185 224 290 287 284 293 281 283 221 228 256 289 343 314 Smp (°C) [85] 297 238 236 269 - 271 184 - 185 247 - 249 233 277 285 - 286 293 - 296 270 283 - 284 220 - 222 223 - 228 253 289 342 - 344 315 Smp (°C) [86] 295 - 297 238 220 - 235 269 - 271 175 - 178 185 - 187 247 - 249 233 287 285 - 286 293 - 295 193 280 - 281 283 - 284 220 - 222 228 251 - 257 290 - 295 342 - 344 315 Bestrahlung Die ersten Untersuchungen zur Verwendung von radioaktiver Strahlung zur antimikrobiellen Behandlung von Medikamenten und Medizinalprodukten fanden in den 40-er Jahren des letzten Jahrhunderts statt. Schon 10 Jahre später wurde diese Methode industriell genutzt[87]. Zu den Gründen, die zum Erfolg dieser Methode führten, gehörte sicherlich, dass auch thermolabile Stoffe sterilisiert werden konnten. Zudem liessen sich Stoffe mit dieser Technik direkt im verschlossenen Endbehältnis behandeln. Die Möglichkeit, dass grosse Mengen an Substanz mit hohem Durchsatz direkt als Bulk sterilisiert werden konnten, machte diese Methode auch ökonomisch interessant. Ab 1980 wurde nach den positiven Erfahrungen aus dem Medizinalbereich die Verwendung einer Dosis bis 10 kGy im Lebensmittelsektor durch die WHO erlaubt und als sicher eingestuft[88, 89]. In Bezug auf die eingesetzte Bestrahlungsenergie können zwischen tiefen Dosen (< 1 kGy), mittleren Dosen (1-10 kGy) und hohen Dosen (> 10 kGy) unterschieden werden. Tiefe Dosen werden vor allem im Lebensmittelbereich eingesetzt und reichen zur Bekämpfung von Insektenbefall und Verlangsamung des Reifungs- und Sprossungsprozesses bei Gemüse und Früchten aus. Mittlere Dosen werden eingesetzt zur Reduktion von pathogenen oder Verderbnisbakterien und Parasiten[90]. Um Sterilität zu gewährleisten müssen hohe Dosen angewendet und die mikrobiologische Grundlast im zu behandelnden Produkt so tief wie möglich gehalten werden. Eine Sterilitätssicherheit von 106 kann unter diesen Umständen mit der meist verwendeten Dosis von 25 kGy erreicht werden[91]. Gammastrahlenanlagen verwenden fast ausschliesslich das Radionukleid 60Co. Im Bezug auf Strahlensterilisation zeichnet sich die Gammastrahlung vor allem durch 103 104 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation das tiefere Eindringvermögen in das zu sterilisierende Gut gegenüber der Betastrahlung aus. Dies kann durch den Linearen Energie Transfer (LET) ausgedrückt werden, welcher bei der Gammastrahlung tiefer ist als bei der Betastrahlung[92]. Als Konsequenz müssen diese Anlagen mit einer dicken, dichten Ummantelung abgeschirmt werden. Bei dem Studer IR-168 Gamma Irradiator, in welchem die Proben der vorliegenden Arbeit behandelt wurden, liegt die Halbwertsschicht für Wasser bei 12 cm. Bei Betastrahlen ist die Eindringtiefe viel geringer und kann nur bedingt durch Erhöhung der Energie kompensiert werden. Eine Energie von 6 MeV sollten jedoch bei der antimikrobiellen Behandlung nicht überschritten werden, da sonst die Gefahr von Radioaktivität im Sterilisiergut entstehen könnte[93]. Darum eignet sich Gammasterilisation eher für voluminöse Bulkware, bei der die Eindringtiefe entscheidend ist. Demgegenüber ist die Bestrahlungsintensität bei Betastrahlung (1-200 kGy/s) viel höher als bei der Gammastrahlung (1-10 kGy/h)[94]. Daraus ergibt sich, dass die Aufenthaltszeit des Sterilisierguts im Falle der Gammastrahlung mehrere Stunden dauern kann. Hingegen können Elektronenstrahlbeschleuniger augenblicklich die gewünschte Dosis aufbringen und zeichnen sich deswegen durch eine hohe Durchsatzrate geeigneter dünner Produkte aus. In dieser Arbeit wurden Aminosäuren sowohl mit e-- als auch mit Gammastrahlen behandelt und analysiert. Das Ziel lag darin Unterschiede zwischen e--, γ- und unbehandelten Aminosäuren aufzuzeigen und diese in einem zweiten Schritt hinsichtlich einer prinzipiellen Eignung für Strahlensterilisation zu beurteilen. Unabhängig der gewonnen Resultate muss dabei noch ein weiterer wichtiger Aspekt angefügt werden. Trotz dem Nutzen der Strahlensterilisation und den mittlerweile jahrzehntelangen guten Erfahrungen leidet diese Methode noch immer unter Akzeptanzschwierigkeiten in der breiten Bevölkerung[89, 95]. Dies liegt daran, dass bei allem was mit Radioaktivität zu tun hat, ausserhalb des Fachbereichs eher mit Skepsis begegnet wird. Dem gegenüber stehen die Leistung und die Sicherheit, die die Strahlenbehandlung sowohl bei medizinischen Produkten als auch bei Lebensmitteln erbracht hat. Diese Methode würde mehr positive Beachtung verdienen und hat im Bereich public relation Nachholbedarf. Für Wissenschaftler, welche sich in diesem Feld der Forschung bewegen, ist es wichtig sich des belasteten Verhältnisses der Öffentlichkeit mit dem Thema Radioaktivität bewusst zu sein. Als Konsequenz sollte mit Forschungsergebnissen dementsprechend vorsichtig und verantwortungsvoll umgegangen werden. 4.1.2.1. Bestrahlung von Aminosäuren Die Wirkung ionisierender Strahlung auf Aminosäuren wurde seit Mitte des letzten Jahrhunderts in zahlreichen Studien untersucht. Für Glu konnte nach γ-Bestrahlung (25, 50 kGy) und Behandlung mit trockener Hitze (3h, 160 °C) lediglich eine Verfärbung festgestellt werden. DC, UV-Spektrum, Schmelzpunkt und pH-Wert zeigten keine Veränderung gegenüber der unbehandelten Aminosäure[96]. Festes DL-Met zeigte ausser einer Wasserstoffabspaltung bis zu einer Dosis von 25 kGy keine nennenswerte Zersetzung. Bei höheren Dosen kam es zu –S-CH3- Abspaltung. Nach γ-Bestrahlung (5, 25 und 100 kGy) von Met in wässriger Lösung zeigte sich eine starke Zersetzung. Mittels DC wurden mindestens 3 Zersetzungsprodukte gefunden[97]. Die starke Zersetzung wurde auf die Reaktion von Met mit den Radiolyseprodukten des Wassers zurückgeführt. Die Radiolyse von Wasser wurde gut untersucht und ihre Radikale spielen oft eine wesentliche Rolle bei der Zersetzung von Stoffen in wässeriger Lösung[94]. Bei der Strahlensterilisation wird Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation dies ersichtlich durch den Umstand, dass gefrorene Lebensmittel höhere Dosen erfordern als dieselben bei Raumtemperatur. Dabei behindert die Eisstruktur die Migration der Wasserradikale, welche in einem zweiten Schritt mit den abzutötenden Mikroorganismen reagieren[98]. Diese Arbeit beschränkte sich jedoch auf die Bestrahlung fester Aminosäuren. Die meisten Bestrahlungsexperimente von Aminosäuren dienten zur Klärung der Entstehung von Radikalen, sowie der Bildung neuer Produkte und deren Reaktionsmechanismen. Viele Untersuchungen wurden damals wie heute mit ESR (electron spin resonance) durchgeführt[99, 100]. Diese Methode eignet sich ebenfalls zum Nachweis von Strahlenbehandlung bei Lebensmitteln oder Arzneimitteln[101103]. Der 2004 erschienene Review „The Solid-State Radiation Chemistry of Simple Amino Acids, Revisited“ von Sagstuen et al. bildet eine Zusammenfassung der Bestrahlungsversuche von festen Aminosäuren[104]. Es wurde aufgezeigt, dass Aminosäuren bei Bestrahlung ein sehr komplexes chemisches Verhalten zeigen. Auf Grund der Untersuchungen von Ala und Gly wurde ein allgemeingültiges Reaktionsschema für Aminosäuren vorgeschlagen (siehe Abbildung 26). In diesem Schema wurde vor allem der Fokus auf die gut untersuchte Amino- und Carboxylgruppe gelegt. Die Seitenkette ist natürlich ebenfalls betroffen und mögliche Reaktionen hängen von der jeweiligen Aminosäure ab. Abbildung 27 zeigt die Grundstruktur einer Aminosäure und die möglichen Angriffspunkte und Reaktionen, welche durch Bestrahlung auftreten könnten. 105 106 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Aminosäure + hν Anion +H + Kation -H + Protoniertes Anion Deprotoniertes Kation - NH3 - CO2 Desaminiertes Produkt Decarboxyliertes Produkt -H + Deprotonierung am Cα Abbildung 26 generalisiertes Reaktionschema für bestrahlte Aminosäuren nach Sagstuen et al.[104] Abbildung 27 Grundstruktur einer Aminosäure mit möglichen Angriffspunkten der einwirkenden Noxen Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.2. Antimikrobielle Behandlung von 20 Aminosäuren 20 Aminosäuren wurden vor und nach antimikrobieller Behandlung analysiert. Als Methoden kamen Trockensterilisation (2h, 160 °C) und Strahlensterilisation (Dosis 28 kGy, e- und γ) zum Einsatz. Es handelte sich dabei um Standardbedingungen, wie sie üblicherweise zur Keimabtötung verwendet werden. 4.2.1. Aminosäuren und Sterilisationsmethoden Die verwendeten Aminosäuren wurden bei einem kommerziellen Anbieter eingekauft. Tabelle 21 listet die untersuchten Aminosäuren, deren Qualität und Herkunft auf. Tabelle 21 verwendete Aminosäuren zur Stabilitätsuntersuchung nach antimikrobieller Behandlung Aminosäure L-Alanin L-Arginin L-Asparagin L-Asparaginsäure L-Cystein HCl Monohydrat L-Glutamin L-Glutaminsäure Glycin L-Histidin L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin HCl L-Methionin L-Phenylalanin L-Prolin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin 4.2.1.1. Qualität Ph. Eur. Ph. Eur. TLC 98% Ph. Eur. Ph. Eur. >=99% Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Herkunft synthetisch Fermentation synthetisch Fermentation synthetisch Fermentation synthetisch synthetisch Fermentation Fermentation Extraktion (soybean) Fermentation synthetisch Fermentation Fermentation Fermentation Fermentation Fermentation Extraktion (soybean) Fermentation Trockensterilisation 2 g jeder Aminosäure wurden in ein headspace Glasvial (20 ml) gefüllt und die Öffnung mit Alufolie verschlossen. Die Proben wurden bei 160 °C für 2 h in einem Thermocenter (salvis) inkubiert. Die Proben wurden in 2 ml Glasvials umgefüllt und bis zum Gebrauch luftdichtverschlossen bei -20 °C im Tiefkühler aufbewahrt. 107 108 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.2.1.2. Strahlensterilisation 5 g jeder Aminosäure wurden in ld-PE Beuteln (qualiFILM Flachschlauch (Mat.Nr. 2436) (Semadeni)) verschweisst und von der Firma Studer AG (Däniken) mit e- (27.1 - 29.9 kGy) und γ-Strahlen (27.2 - 27.4 kGy) behandelt. Die Proben wurden in 2 ml Glasvials umgefüllt und bis zum Gebrauch luftdichtverschlossen bei -20 °C im Tiefkühler aufbewahrt. 4.2.2. Visuelle und organoleptische Beurteilung Von den strahlenbehandelten Aminosäuren zeigten die meisten eine Veränderung der Farbe (siehe Tabelle 22). Lediglich L-Arg, L-Leu und L-Tyr lagen nach der Strahlenbehandlung noch als weisses Pulver vor. Die Trockensterilisation bewirkte bei L-Glu, L-Met, L-Ser und L-Trp eine Farbveränderung. L-Cys HCl und L-Gln wurden durch diese Behandlung sogar vollkommen zersetzt. Bei 14 Aminosäuren trat nach der Sterilisationsbehandlung eine stärkere Geruchsemmision auf (siehe Tabelle 22). Diese Beobachtung bildete den Auslöser zur Entwicklung einer headspace GC-MS Methode, welche Aufschluss über die flüchtigen Bestandteile der Proben geben sollte. Tabelle 22 optische und organoleptischen Aminosäuren nach antimikrobieller Behandlung Aminosäure Veränderungen L-Ala L-Arg L-Asn L-Asp L-Cys HCl Optische Veränderung (e und γ-Bestrahlung) Gelb Keine Hellgelb Hellgelb Hellgelb Optische Veränderung (160 °C 2 h) keine keine keine keine zersetzt, hell L-Gln Hellgelb zersetzt, dunkel L-Glu Gly L-His L-Ile L-Leu L-Lys HCl L-Met L-Phe L-Pro L-Ser L-Thr L-Trp L-Tyr L-Val Hellgelb Gelb Hellbraun Stich von gelb Keine Hellgelb Stich von gelb Hellgelb Stich von gelb hellbraun gelb hellbraun keine Stich von gelb keine keine keine keine keine keine gelb keine keine gelb keine gelb keine keine der untersuchten Geruch nach Behandlung Leicht würzig Kein Unterschied zu vorher schwacher Geruch Leicht nach Fleisch Stechend nach Trockensterilisation Leicht fleischig nach Strahlenbehandlung Stechend nach Trockensterilisation Kein Unterschied zu vorher nach Strahlenbehandlung schwacher Geruch Kein Unterschied zu vorher Leicht fleischig schwacher Geruch Stark nach Fleisch Stark nach Fleisch Stärkerer Geruch Starker Geruch Starker Geruch schwacher Geruch Kein Unterschied zu vorher Kein Unterschied zu vorher Kein Unterschied zu vorher Kein Unterschied zu vorher Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.2.3. Oberflächenfluoreszenz Die sterilisierten und unbehandelten Aminosäuren wurden auf einer 96-er multiwell Platte mit einem Fluoreszenzdetektor untersucht. Dabei wurden erst die pulverförmigen Proben vermessen und danach dieselben als Lösung. 4.2.3.1. Geräte und Materialien Multiwell reader mit Fluoreszenzdetektor: TECAN GENios Pro Software: XFLUOR4GENIOSPRO Version: V 4.53 96-er multiwell Platte für Fluoreszenz: greiner Microlon F Geräteeinstellung: Measurement mode: Excitation wavelength: Emission wavelength: Gain (Optimal): Number of flashes: Lag time: Integration time: Mirror selection: Plate definition file: Fluorescence 485 nm 535, 590, 612, 620 nm 30 - 41 (Pulver), 27 - 47 (Lösung) 10 0 µs 40 µs Dichroic 3 (e.g. Fl) 96-well Salzsäure 36 % (Hänseler AG, Ph. Eur.) 4.2.3.2. Probenvorbereitung und Methode Es wurden pro Vertiefung 5 mg Aminosäure in eine 96-er multiwell Platte eingewogen. 8 Vertiefungen enthielten keine Probe und dienten als blank. Nach Messung der Fluoreszenz der pulverförmigen Proben bei einer Anregung von 485 nm und der Detektion bei 535, 590, 612 und 620 nm wurden die Proben in 200 µl 1 M HCl gelöst. 8 Vertiefungen mit 200 µl 1 M HCl dienten als blank. Die Platte wurde anschliessend noch einmal bei denselben Wellenlängen vermessen. 4.2.3.3. Resultat der Oberfächenfluoreszenz Es zeigte sich, dass nach einer Wärmebehandlung 15 Aminosäuren zu Fluoreszenz neigten. Dies konnte auch bei 9 Strahlenbehandelten Aminosäuren beobachtet werden, wobei die Intensitäten weniger ausgeprägt schienen (siehe Abbildung 28). Die stärksten Signale wurden bei einer Anregung von 485 nm und einer Absorption von 535 nm erhalten. Nach Lösung der Aminosäuren in 1 M HCl zeigte sich Fluoreszenz nur noch bei L-Cys HCl, L-Gln, L-Met und L-Ser (siehe Abbildung 29). Weitere Untersuchungen mit verschiedener Bestrahlungsdosis wurden unter 4.5.3.5. durchgeführt. 109 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Fluoreszenzmessung (485nm/535nm) von pulverförmigen Aminosäuren 20000 10000 5000 0 TiO2 L-Val L-Tyr γ behandelt e-- behandelt wärmebehandelt unbehandelt L-Trp L-Ala L-Arg L-Asn L-Asp L-Cys HCl L-Gln L-Glu Gly L-His L-Ile L-Leu L-Lys HCl L-Met L-Phe L-Pro L-Ser L-Thr Signalintensität (RFU) 15000 Abbildung 28 Fluoreszenzmessung von 20 pulverförmigen Aminosäuren Fluoreszenzmessung (485nm/535nm) von gelösten Aminosäuren 20000 15000 10000 5000 0 TiO2 L-Val L-Trp γ behandelt e- behandelt wärmebehandelt unbehandelt L-Tyr L-Ala L-Arg L-Asn L-Asp L-Cys HCl L-Gln L-Glu Gly L-His L-Ile L-Leu L-Lys HCl L-Met L-Phe L-Pro L-Ser L-Thr Signalintensität (RFU) 110 Abbildung 29 Fluoreszenzmessung von 20 gelösten Aminosäuren (1 M HCl) Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.2.4. Optische Drehung Um den Einfluss der 3 Sterilisationsmethoden (trockene Hitze, e--, γ-Strahlen) auf die Chiralität der Aminosäuren zu untersuchen, wurden die optischen Drehungen bestimmt. 4.2.4.1. Geräte und Materialien Polarimeter: Perkin-Elmer 241 Natriumlampe: 589 nm Quecksilberlampe: 578nm, 546nm, 436nm und 365nm Kühlsystem: RM6 LAUDA Salzsäure 36 % (Hänseler AG, Ph. Eur.) 4.2.4.2. Probenvorbereitung und Methode Die Prüflösungen wurden anhand der Monographien der Ph. Eur. 4.3 hergestellt. Da für die optische Drehung sehr viel Probesubstanz (100 – 500 mg AS/ 5 ml Lösungsmittel) aufgewendet werden musste, wurde jeweils nur eine Prüflösung pro Probe verwendet. Diese wurde dann dreimal gemessen und der Mittelwert gebildet. Nachfolgende Messungen, bei welchen 3 Lösungen der gleichen Probe vermessen wurden, zeigten nur sehr geringe Standardabweichungen (siehe Tabelle 30). Eine weitere Sicherheit stellte der Vergleich der Messung der unbehandelten Aminosäure mit dem Analysezertifikat dar. Neben der Wellenlänge 589 nm wurde die optische Drehung auch bei 365 nm gemessen. 4.2.4.3. Resultat der optischen Drehung Wie erwartet lagen die spezifischen Drehungen von allen unbehandelten Aminosäuren in den Limits, wie sie die Ph. Eur. vorgab und bestätigten somit die Messungen der Analysezertifikate (siehe Tabelle 23). Abbildung 30 zeigt eine Übersicht der optischen Drehung bei 366 nm und belegt, dass keine grossen Unterschiede zwischen unbehandelten und unter Sterilisationsbedingungen behandelten Aminosäuren vorlagen. Dies zeigte sich auch in der Tatsache, dass die spezifischen Drehungen noch den Limits der Ph. Eur. 4.3 entsprachen. Allerdings gab es auch Ausnahmen. Bei L-Cys HCl lag die spezifische Drehung nach den Strahlensterilisationen unter der von der Ph. Eur. geforderten Limite. Die antimikrobielle Behandlung mit trockener Hitze führte bei L-Glu zu einer deutlichen Erniedrigung der spezifischen Drehung. Die Messung von L-Cys HCl und L-Gln war nach einer Wärmebehandlung nicht mehr möglich, da sich diese Aminosäuren völlig zersetzt hatten. Die daraus erstellten Messlösungen absorbierten zu stark für eine Messung. Derselbe Effekt trat auch bei L-Glu und L-Ser bei einer Wellenlänge von 365 nm auf. Der Einfluss der Bestrahlung auf die optische Drehung wurde an L-Ala, L-Asp, L-Leu und L-Phe noch genauer untersucht (siehe 4.3.7.) 111 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation optische Drehung bei 366 nm 13.00 8.00 unehandelt 3.00 wärmebehandelt L-Val L-Tyr L-Trp L-Thr L-Ser L-Pro L-Phe L-Met L-Lys HCl L-Leu L-Ile L-His L-Glu L-Gln L-Asp L-Cys HCl -7.00 L-Asn -2.00 L-Arg e- behandelt L-Ala 112 γ behandelt -12.00 Abbildung 30 Vergleich der optischen Drehung von Aminosäuren vor und nach Sterilisationsbehandlung Tabelle 23 Spezifische optische Drehung der unbehandelten Aminosäuren und nach Behandlung unter Sterilisationsbedingung Aminosäure L-Ala unbehandelt wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Arg wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Asn wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Asp wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Cys HCl wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Gln wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Glu wärmebehandelt e behandelt γ behandelt Limit Ph. Eur. 4.3 (°) 13.5 – 15.5 Analysezertifikat (°) 14.8 25.5 – 28.5 27.3 nicht bestimmt 30.0 24.0 – 26.0 25.1 5.5 – 7.0 6.8 nicht bestimmt 30.5 – 32.5 6.7 30.6 Spezifische Drehung (°) 13.69 13.68 13.60 13.63 26.67 26.67 26.18 26.46 32.33 33.28 32.15 32.20 24.95 24.96 24.97 24.99 5.90 zersetzt 5.24 5.15 6.61 zersetzt 6.64 6.61 30.93 11.56 31.04 31.01 Rsd (%) 0.25 0.12 0.21 0.09 0.07 0.08 0.15 0.08 0.06 0.06 0.06 0.03 0.08 0.08 0.13 0.05 1.29 2.96 1.50 0.38 0.22 0.38 0.11 0.09 0.09 0.06 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation L-His wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Ile wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Leu wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Lys HCl wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Met wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Phe wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Pro wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Ser wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Thr wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Trp wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Tyr wärmebehandelt e behandelt γ behandelt L-Val wärmebehandelt e behandelt γ behandelt 11.8 – 12.8 12.5 40.0 – 43.0 41.0 14.5 – 16.5 15.3 21.0 – 22.5 21.2 22.5 – 24.0 23.4 -33.0 – -35.5 -34.1 -84.0 – 86.0 -85.0 14.0 -16.0 15.3 -27.6 - -29.0 -28.2 -30.0 - -33.0 -31.4 -11.0 - -12.3 -11.7 26.5 – 29.0 28.5 12.25 12.27 12.26 12.27 41.32 41.35 41.39 41.13 16.02 15.98 15.92 15.85 21.20 21.13 21.24 21.26 23.26 23.58 23.54 23.51 -33.14 -33.28 -33.06 -33.05 -84.12 -85.94 -85.16 -85.34 15.47 15.38 15.88 15.94 -27.96 -27.96 -27.88 -27.96 -31.18 -31.12 -31.17 -31.21 -11.30 -11.36 -11.34 -11.30 27.23 27.58 27.43 27.35 0.09 0.07 0.11 0.07 0.14 0.06 0.09 0.06 0.16 0.09 0.09 0.24 0.04 0.07 0.09 0.09 0.22 0.48 0.21 0.24 0.09 0.22 0.15 0.17 0.03 0.02 0.05 0.02 0.13 0.22 0.13 0.05 0.06 0.04 0.13 0.09 0.32 0.18 0.37 0.32 0.36 0.48 0.55 0.37 0.05 0.03 0.07 0.03 113 114 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.2.5. Dünnschichtchromatographie Die e-- und γ-bestrahlten Aminosäuren wurden mit der unter 3.5.1 entwickelten Methode auf Zersetzungsprodukte überprüft. Als Sprühreagenz kam die NinhydrinLösung R, welche sich zur Detektion von aminhaltigen Verbindungen eignet, und unspezifisch die Iodkammer zur Anwendung (siehe Anhang S. 146). 4.2.5.1. Geräte und Materialien Es wurden die gleichen Geräte und DC-Platten wie unter 3.5.1 beschrieben verwendet. Substanz Qualität Hersteller Ninhydrin Anisaldehyd Iod Essigsäure 99% Schwefelsäure 95% Ammoniaklösung 32% 1-Butanol 1- Propanol Methanol Dichlorethan ≥98.0% (UV) Purum, ≥99% Puriss p. a. Ph. Eur. purum reinst z. A. Puriss p.a Analytic grade Purisse p.a. Fluka Fluka Fluka Hänseler Hänseler Merck Scharlau Fluka Scharlau Fluka 4.2.5.2. Methodenentwicklung Die Methode, Lösungsmittel und Laufmittel entsprachen denjenigen von 3.5.1 Im Wesentlichen handelt es sich um eine analoge Methode wie sie die Ph. Eur. für viele Aminosäuren zur Reinheitsprüfung verwendet. 4.2.5.3. Probenvorbereitung und Methode Es wurden 0.1 % Lösungen (m/V) von den 20 Aminosäuren und den entsprechenden bestrahlten Aminosäuren hergestellt. Zur Untersuchung einer Aminosäure wurde eine DC-Platte verwendet. Das Auftragungsschema der Platte sah wie folgt aus: Nr. 1. 2. 3. 4. 5. Auftragung Aminosäure unbehandelt (120 µg) Aminosäure γ behandelt (120 µg) Aminosäure γ behandelt (120 µg) Aminosäure γ behandelt (120 µg) Blank (Lösungsmittel) Nr. 6. 7. 8. 9. 10. Auftragung Aminosäure unbehandelt (120 µg) Aminosäure e behandelt (120 µg) Aminosäure e behandelt (120 µg) Aminosäure e behandelt (120 µg) Blank (Lösungsmittel) Nach Entwicklung und Trocknung der Platte wurde diese erst unter UV-Licht (254 und 366 nm) auf Verunreinigungen und Zersetzungsprodukte überprüft. Die nächste Kontrolle erfolgte mit der Ninhydrinlösung R und abschliessend wurde die Platte noch in die Iodkammer gestellt. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.2.5.4. Resultat der Dünnschichtchromatographie Unter UV-Licht (254 und 366 nm) konnten keine Hinweise auf Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukte gefunden werden. Nach Besprühen der Platten mit Ninhydrin R konnten bei den bestrahlten Aminosäuren L-His, L-Ile, Leu, L-Lys HCl, L-Met und LSer neben der Hauptsubstanz zusätzliche Flecken detektiert werden (siehe Tabelle 24). Dabei handelte es sich jedoch ausschliesslich um sehr schwache Flecken, welche nur sichtbar waren, wenn die Platte gegen das Licht gehalten wurde. Bei L-Leu wurden Anzeichen gefunden, dass die Art der Bestrahlung zu unterschiedlichen Zersetzungsprodukten führen könnte. Allerdings konnte dieser Befund bei den nachfolgenden HPLC Untersuchungen nicht bestätigt werden (siehe 4.2.6.). Bei L-Ser wurde ein Startfleck auch bei der unbehandelten Aminosäure detektiert. Die anschliessende Behandlung der DC-Platten in der Iodkammer brachte keine weiteren Informationen. Bei den unbehandelten Aminosäuren traten im Rahmen dieser Untersuchungen keine zusätzlichen Flecken auf. Sie erschienen somit als rein und bestätigten die Analysezertifikate der Hersteller. Tabelle 24 Resultate der DC-Untersuchungen von bestrahlten Aminosäuren Aminosäure L-His L-Ile L-Leu L-Lys HCl L-Met L-Ser - e behandelt (Rf) 0.22 0.24 0.29 0.27, 0.4 0.23 Startfleck, 0.22 γ behandelt (Rf) 0.22 0.24 0.54 0.27, 0.4 0.23 Startfleck, 0.22 4.2.6. HPLC mit FMOC Vorsäulenderivatisierung Die Untersuchungen wurden unter 3.3.4. abgehandelt. 4.2.7. Headspace GC/MS Die Untersuchungen wurden unter 3.4.1. abgehandelt. Bild im Anhang S. 147 S. 147 S. 148 S. 148 S. 149 S. 149 115 116 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3. e- -Bestrahlung von Aminosäuren mit 30 kGy und 100 kGy Um den Einfluss einer e--Bestrahlung auf Aminosäuren genauer zu untersuchen, wurden L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe einer Strahlendosis von 30 kGy und 100 kGy ausgesetzt. Daneben wurde noch ein möglicher Einfluss des Packmittels auf die Aminosäuren bei der Bestrahlung untersucht. Als Packmittel dienten einerseits Polyethylen- und andererseits Polypropylenbeutel. Die 5 Aminosäuren wurden auf Grund ihrer Verfärbung, ihrer Struktur und ihrer Herstellungsart ausgewählt. L-Ala, Gly und L-Phe hatten bei einem anderen Versuch schon starke Gelbfärbung nach einer Strahlendosis von 30 kGy gezeigt (siehe Tabelle 22). L-Asp und L-Leu zeigten bei demselben Versuch nur eine schwache Verfärbung. Neben den Aminosäuren LAla und L-Leu mit aliphatischer Seitenkette wurde mit L-Asp eine Aminosäure mit saurer Seitenkette gewählt. L-Phe trägt eine Phenylgruppe und Gly enthält an Stelle der Seitenkette lediglich ein Wasserstoff. Die verwendeten Chargen wurden bei der Firma SIGMA ALDRICH bezogen und wiesen Ph. Eur. Qualität auf. Laut Certificate of origin (SIGMA ALDRICH) wurden L-Ala und Gly synthetisch hergestellt. L-Asp und L-Phe wurden fermentativ erzeugt und L-Leu wurde aus einer industriellen Sojaextraktion gewonnen. 4.3.1. Aminosäuren und Packmittel Aminosäure L-Alanin L-Asparaginsäure Glycin L-Leucin L-Phenylalanin Lieferant SIGMA ALDRICH Fluka Fluka SIGMA ALDRICH SIGMA ALDRICH Produktnr. A7469 77737 50058 L8912 P5482 Lotnr. 016K0711 1089479 1103270 116K0042 104K0251 Qualität Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Ph. Eur. Herkunft synthetisch fermentativ synthetisch Sojaextraktion fermentativ PE: Lowdensity Polyethylen (qualiFILM Flachschlauch (Mat.Nr. 2436) (Semadeni)) ohne Weichmacher, Hilfsstoff: Erucasäureamid (725 ppm) und Siliciumdioxid (625 ppm) PP: Polypropylen (Beutel 70 x 100 mm (Art.-Nr. 22223) (Egli plastic) ohne Weichmacher, Hilfsstoff: Siliconöl 4.3.1.1. Probenvorbereitung und Bestrahlung Die Aminosäuren wurden ohne vorangehende Homogenisierung direkt aus dem Originalgebinde aufgeteilt. 5 g jeder Aminosäure wurden einmal in einem Polyethylen- und einmal in einem Polypropylenbeutel verschweisst. Als Kontrolle diente je 5 g Titandioxid. Die e--Bestrahlung wurde von der Firma Studer (Dänikon) durchgeführt. Die Proben mit 30 kGy Dosis wurden in einem Durchgang erzeugt. Die Proben mit 100 kGy wurden in 4 Auftragungen zu 25 kGy erzeugt. Dadurch sollte verhindert werden, dass die Temperatur in den Proben während der Bestrahlung 80 °C überstieg und eine potentielle Zersetzung eher durch thermischen Stress als durch Bestrahlung erklärbar wäre. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.2. Visuelle Beurteilung Alle untersuchten Aminosäuren zeigten bei Dosen von 25 und 50 kGy eine Verfärbung gegenüber den unbehandelten. Dieser Effekt wurde bei Glu schon beschrieben[105]. Bei den Aminosäuren, welche einer Dosis von 30 kGy ausgesetzt waren, zeigten L-Ala, Gly und L-Phe stärkere Verfärbung als L-Asp und L-Leu. Es zeigte sich zudem, dass die Verfärbungen bei allen untersuchten Aminosäuren nach einer 100 kGy Dosis stärker waren, als nach 30 kGy. Die Stärke der Verfärbung schien mit der Dosis zu korrelieren. Abbildung 31 zeigt Gly vor und nach der Bestrahlung bei verschiedenen Dosen in 3 ml Glasvials. Die Zunahme der Verfärbung von 30 kGy nach 100 kGy Dosen wurde dabei ersichtlich. Bei Gly zeigten die beiden Packmittel Polyethylen und Polypropylen rein optisch keinen Unterschied zwischen den gleichen Bestrahlungsdosen. L-Asp, L-Ala, L-Leu und L-Phe verhielten sich gleich und es konnten keine Unterschiede zwischen den bei Verpackungsmaterialien festgestellt werden. Titandioxid zeigte vor und nach der e-Behandlung keinen optisch erkennbaren Unterschied. unbehandelt ld-PE 30 kGy PP 30 kGy ld-PE 100 kGy PP 100 kGy Abbildung 31 Glycin unbehandelt, nach 30 kGy und 100 kGy Bestrahlung 4.3.3. Auflichtspektroskopie und Schmelzpunkt-Mikroskopie Um einen detaillierteren Einblick über die farblichen Veränderungen der Aminosäuren nach der e- -Bestrahlung zu erhalten, wurden die Proben einerseits unter einem Auflichtmikroskop und andererseits in polarisiertem Licht unter einem Mikroskop betrachtet. Damit sollte die Frage geklärt werden, ob die Aminosäuren nach Strahlenbehandlung eine gleichmässige Verfärbung zeigten oder ob in den Proben punktuell stärker verfärbte Bereiche auftraten. Letzteres könnte auf ein Zusammenspiel bei der Entstehung der Verfärbung zwischen Aminosäure, Bestrahlungsenergie und einem Fremdkörper hindeuten. Desweiteren sollte überprüft werden, ob die Aminosäurenkristalle sichtbare Einschlüsse enthielten, welche einen Hinweis auf mögliche Verunreinigungen liefern könnten. Dieser Punkt sollte vor allem mittels Mikroskopie unter polarisiertem Licht geklärt werden. Die Schmelzpunkt-Mikroskopie beschrieb das Schmelzverhalten vor und nach Bestrahlung. Die Zersetzung der einzelnen Aminosäurekristalle unter Wärmezuführung wurde unter dem Mikroskop beobachtet und beschrieben. 117 118 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.3.1. Geräte und Materialien Stereomikroskop: Beleuchtung: Kamera: Software: Einstellung: Mikroskop: Kamera: Schmelzpunktgerät: Software: ZEISS SteREO Lumar.V12 KL 1500 LCD 3300 K ZEISS AxioCam color AxioVision AxioVs40 V4.5.0.0. Best Fit, AxioCam HR: Exposure 53 ms 5% Olympus BH-2 Panasonic WV-CL700 Mettler Toledo FP90 Central Processor Mettler Toledo FP82 HAT Hot stage Hauppauge WinTV USB Version 2.13 4.3.3.2. Resultat der Auflichtspektroskopie und SchmelzpunktMikroskopie Alle Chargen der 5 unbehandelten und bestrahlten Aminosäuren (L-Asp, L-Ala, Gly, L-Leu, L-Phe) wurden gegen einen blauen Hintergrund mit einem ZEISS Stereomikroskop mit 10-facher Vergrösserung untersucht. Abbildung 32 und 33 zeigt als Beispiel unbehandelt Alaninkristalle und solche nach e--Bestrahlung mit 100 kGy unter dem Stereomikroskop. Abbildung 32 Alaninkristalle handelt 10-fache Vergrösserung unbe- Abbildung 33 Alaninkristalle ld-PE 100 kGy 10-fache Vergrösserung Analog zu L-Ala zeigten auch die bestrahlten Aminosäuren von L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe eine gleichmässige Verfärbung über die ganzen Kristalle. Es wurden keine stärker verfärbten Spots innerhalb der Proben beobachtet. Ebenso konnten keine Einschlüsse unter dem Stereomikroskop gefunden werden, welche auf Fremdkörper hinwiesen. Nach dem Zerbrechen eines verfärbten Alaninkristalles zeigten auch die inneren Bruchstücke noch eine gelbliche Verfärbung (siehe Abbildung 34 und 35). Damit konnten die Verfärbungen nicht auf einen reinen Oberflächeneffekt reduziert werden. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Abbildung 34 Alaninkristall PP 100 kGy 10-fache Vergrösserung Abbildung 35 Alaninkristall PP 100 kGy 10-fache Vergrösserung nach dem Zerbrechen Die Beobachtungen unter dem Mikroskop in polarisiertem Licht bei 40- bis 100-facher Vergrösserung ergaben keine Hinweise auf Fremdeinschlüsse in den Aminosäurenkristallen. Tabelle 25 fasste die Resultate der Schmelzpunktmikroskopie zusammen. Der erste Wert stellt die Temperatur dar, bei welcher der Schmelzvorgang begann. Bei der zweiten Temperatur hatte sich die Probe vollständig zersetzt. Die Werte in Klammern stehen für Temperaturen, bei welchen mikroskopisch beobachtbar kleinste Veränderungen in den Proben stattfanden. Ein kontinuierlicher Schmelz-, bzw. Zersetzungsvorgang fand aber noch nicht statt. Bei L-Asp, Gly und L-Phe zeigte sich nach der Bestrahlung tendenziell eine Schmelzbereicherniederigung. Die zersetzten unbehandelten und bestrahlten Aminosäuren unterschieden sich aber visuell nicht voneinander. Einen Unterschied gleicher Proben bedingt durch die beiden Verpackungsmaterialien Polyethylen und Polypropylen konnte in diesen Versuchen nicht festgestellt werden. Tabelle 25 Schmelzbereich von L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe vor und nach der Bestrahlung Aminosäure L-Ala Schmelzbereich Unbehandelt nach Literatur[106] (°C) (°C) 297 226 - 248 L-Asp 269 - 271 Gly 233 L-Leu 293 - 295 L-Phe 283 PE 100 kGy Zersetzung (°C) 225 - 244 braun caramelartig, Blasenbildung (250) 265 - (240) 250 - weiss, bräunlich, 285 278 caramelartig (225) 250 - (220) 235 - schwarz, caramelartig 255 247 255 - 283 255 - 287 hellgelb, Tröpfchenbildung (198) 205 – (184) 200 - braun caramelartig 255 250 119 120 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.4. UV/Vis Untersuchungen Wie unter 4.3.2. erwähnt, zeigten die bestrahlten Aminosäuren L-Ala, L-Asp, Gly, LLeu und L-Phe gegenüber den unbestrahlten eine gelbliche Verfärbung, welche sich unter höherer Strahlendosis noch intensivierte. Ein Wellenlängenscan (200 – 800 nm) bildete eine einfache Methode um die Verfärbungen in gelöstem Zustand weiter zu verfolgen. 4.3.4.1. Geräte und Materialien Spektralfotometer: CARY 50 Scan Software: Cary WinUV Software (Version 3.00(182)) Quarzküvette: HELMA 282 QS 1.00 Salzsäure 36 % (Hänseler AG, Ph. Eur.) 4.3.4.2. Probenvorbereitung und Methode Nach Vorversuchen wurden wässerige Lösungen (1% (m/V)) der unbehandelten und strahlenbehandelten Aminosäuren vermessen. Da L-Phe starke Absorption zeigte, wurde diese Lösung auf 0.1% (m/V) verdünnt und für L-Asp wurde wegen Löslichkeitsproblemen in Wasser 0.8 %-ige Salzsäure verwendet. Die erhaltenen Spektren (200 – 800 nm, 600 nm/min) wurden anschliessend mit der Cary WinUV Software aufbereitet und ausgewertet. 4.3.4.3. Resultat der UV/Vis Untersuchungen Ausser bei Gly zeigte sich zwischen den Spektren der unbehandelten und bestrahlten Aminosäure eine Gemeinsamkeit. Die Grundabsorption der jeweiligen Aminosäure erhöhte sich nach einer Strahlendosis gegenüber der unbehandelten Aminosäure. Abbildung 36 zeigt stellvertretend für alle untersuchten Aminosäuren diesen Effekt. Es wurde ersichtlich, dass die Grundabsorption zwischen 200 – 350 nm nach 30 kGy Bestrahlung anstieg. Bei einer Bestrahlung von 100 kGy wurde die Grundabsorption noch weiter erhöht. In Tabelle 26 wurden die Absorptionen bei 250 nm von allen untersuchten Aminosäuren eingetragen. Die daraus berechneten Faktoren geben an, um wie viel die Absorptionen der bestrahlten Aminosäuren gegenüber den unbehandelten zunahmen. Bei L-Phe wurden die Faktoren aus den Absorptionen bei 275 nm berechnet. Dies lag daran, dass unbehandeltes L-Phe bei 250 nm im Gegensatz zu den anderen Aminosäuren schon eine starke Eigenabsorption aufwies, was zu einer Verfälschung der berechneten Faktoren geführt hätte. = ݎݐ݇ܽܨ Absorption der bestrahlten Aminosäure Absorbtion der unbehandelten Aminosäure Diese Faktoren lieferten ein weiteres Indiz, dass die Stärke der Verfärbung mit der Bestrahlungsdosis korrelierte. Gly bildete dabei eine Ausnahme. Obwohl eine stärkere Verfärbung mit steigender Dosis im Pulver optisch erkennbar war (siehe Abbildung 31), spiegelte sich dies nicht wieder in den UV/Vis Spektren. Ein signifikanter Unterschied in den Spektren konnte nicht gefunden werden. Dies Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation belegten auch die berechneten Faktoren bei 250 nm, welche sich um den Wert 1 bewegten (zwischen 0.7 und 1.2). Einen Einfluss auf die Spektren durch die Verwendung unterschiedlicher Verpackungsmaterialien (ld-PE und PP), konnte nicht wahrgenommen werden. Die Faktoren bei gleicher Strahlendosis bewegten sich um die gleichen Werte. Abbildung 36 Spektrum von unbehandeltem und bestrahltem Alanin 200 - 350 nm Tabelle 26 Absorption von L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu bei 250 nm und L-Phe bei 275 nm (Einwaage einberechnet) unbehandelt ld-PE 30 kGy PP 30 kGy ld-PE 100 kGy PP 100 kGy L-Alanin 250 nm 0.0053 0.0130 0.0151 0.0281 0.0303 Faktor 2.5 2.9 5.3 5.8 L-Asparaginsäure Faktor 250 nm 0.0252 2.7 0.0686 2.7 0.0688 5.6 0.1415 5.6 0.1420 L-Leucin 250 nm 0.0059 0.0394 0.0394 0.1249 0.1256 Faktor 6.7 6.7 21.1 21.3 L-Phenylalanin Faktor 275 nm 0.0069 2.2 0.0132 2.1 0.0122 5.8 0.0341 5.9 0.0346 Glycin 250 nm 0.0116 0.0078 0.0078 0.0099 0.0135 Faktor 0.7 0.7 0.8 1.2 121 122 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.5. Oberflächenfluoreszenz Aus Vorversuchen unter UV-Licht (CAMAG UV-Cabinet II) bei 366 nm war bekannt, dass L-Asp, L-Leu und L-Phe nach Strahlenbehandlung Fluoreszenz zeigten. Mit einem Fluoreszenzdetektor sollte dieser Umstand genauer untersucht werden. 4.3.5.1. Geräte und Materialien Multiwell reader mit Fluoreszenzdetektor: TECAN GENios Pro Software: XFLUOR4GENIOSPRO Version: V 4.53 96-er multiwell Platte für Fluoreszenz: greiner Microlon F Geräteeinstellung: Measurement mode: Excitation wavelength: Emission wavelength: Gain (Manual): Number of flashes: Lag time: Integration time: Mirror selection: Plate definition file: Fluorescence 485, 612 nm 535, 590, 612, 620 nm 25 (Pulver), 50 (Lösung) 10 0 µs 40 µs Dichroic 3 (e.g. Fl) 96-well Salzsäure 36 % (Hänseler AG, Ph. Eur.) 4.3.5.2. Probenvorbereitung und Methode 5 mg der zu untersuchenden Aminosäuren wurden im Doppel in eine 96-er multiwell Platte eingewogen. Die Vertiefungen ohne Proben dienten als blank. Es wurden Fluoreszenzmessungen bei Anregungswellenlängen von 485 nm (Detektionen bei 535, 590, 612 und 620 nm) und 612 nm (Detektion bei 620 nm) durchgeführt. Danach wurde derselbe Versuch in gleicher Anordnung mit gelösten Proben (0.5 % (m/V) in Wasser, 200 µl pro Vertiefung) wiederholt. Für L-Asp wurde aus Gründen der Löslichkeit 1M Salzsäure verwendet. 4.3.5.3. Resultat der Oberflächenfluoreszenz Pulverförmige Proben Die stärksten Fluoreszenzsignale wurden bei einer Anregung von 485 nm und einer Absorption von 535 nm erhalten (siehe Abbildung 37). Bei gleicher Anregungswellenlänge konnte eine kontinuierliche Abnahme der Fluoreszenzsignale mit steigenden Detektionswellenlängen beobachtet werden. Das Muster welches Abbildung 37 aufzeigte, blieb aber immer erhalten. Messungen bei einer Exitation von 612 nm und einer Absorption von 620 nm führten zu keinen verwertbaren Resultaten. L-Ala und Gly zeigten vor und nach einer Strahlenbehandlung keine Fluoreszenz bei den gemessenen Wellenlängen. L-Asp wies eine Grundfluoreszenz auf, welche nicht von der Bestrahlung beeinflusst wurde. Bei L-Phe und L-Leu führte eine Erhöhung der Strahlendosis zu einer Erhöhung der Fluoreszenz. Wobei dieser Effekt bei L-Leu erst bei 100 kGy deutlich ersichtlich wurde (siehe Tabelle 27). Stabilitätsuntersuchung bilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Auch bei diesem Versuch wurde kein Unterschied ersichtlich zwischen Proben, welche in Polyethylenbeuteln bestrahlt wurden, gegenüber denen, bei welchen welche Polypropylen als Packmaterial verwendet wurde. Oberflächenfluoreszenzmessungen von pulverförmigen Aminosäuren 3000 Fluoreszenzsignal 2500 2000 unbehandelt PE 30 kGy 1500 PP 30 kGy PE 100 kGy 1000 PP 100 kGy PP 100 kGy 500 PP 30 kGy 0 Ala Asp unbehandelt Gly Leu Phe Abbildung 37 Fluoreszenzmessug pulverförmiger Aminosäuren (Anregung 485 nm, Absorption 535 nm) Behandlung L-Ala unbehandelt 30 kGy PE 30 kGy PP 100 kGy PE 100 kGy PE - rsd (%) - L--Asp 292 315 319 386 347 rsd (%) 19 7 14 4 4 Gly - rsd (%) - L-Leu 32 32 107 77 rsd (%) 10 12 3 48 LPhe 151 1287 1190 2388 2525 rsd (%) 4 9 18 9 25 Tabelle 27 Fluoreszenzmessung pulverförmiger Aminosäuren (Anregung 485 nm, Absorption 535 nm) 123 124 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Gelöste Proben Die Lösungen der Aminosäuren zeigten kaum mehr Fluoreszenz. Mit den gleichen Geräteeinstellungen wie bei den pulverförmigen Proben (Exitation 485 nm, Detektion 535 nm, gain 25) sank die Fuorezenz von Phe 100 kGy PP um das 150-fache. Die übrigen Aminosäuren zeigten keine Fluoreszenz mehr. Nachdem der Fluoreszenzdetektor empfindlicher eingestellt wurde (gain 50), zeigten die Proben zwar wieder stärkere Signale, aber das Rauschen nahm damit auch zu. Eine Fluoreszenz konnte nur noch L-Phe zugeordnet werden und es zeigte sich das gleiche Muster wie bei Abbildung 37. 4.3.6. Gehaltsbestimmung mittels Titration Sollte die Bestrahlung von Aminosäuren zu starker Zersetzung führen, so sollte sich dies in einer Abnahme des ursprünglichen Gehaltes zeigen. Eine einfache Überprüfung bildete dabei die Gehaltsbestimmung mittels wasserfreier oder SäureBase-Titration wie sie die Monographie Ph. Eur. der jeweiligen Aminosäure verlangt. Bei L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe wurde vor und nach Strahlenbehandlung eine Gehaltsbestimmung nach Ph. Eur. durchgeführt. Die ermittelten Werte wurden einerseits untereinander und andererseits mit dem Analysezertifikat des Lieferanten verglichen. Der Trocknungsverlust wurde dem Analysezertifikat entnommen und war für alle untersuchte Aminosäuren kleiner oder gleich 0.08 %. Dieser Einfluss wurde im Weiteren als vernachlässigbar klein angesehen. Die Tirationsmethode kann für sich alleine nicht den Anspruch erheben den wahren Gehalt der Aminosäurenproben in jedem Fall zu ermitteln. Sollten beispielsweise nach der Bestrahlung potentielle Zersetzungsprodukte der Aminosäuren noch saure oder basische Gruppen tragen, so könnten diese die Messungen im schlechten Fall dahingehend beeinflussen, dass der Gehalt noch gleich wie vor Strahlenbehandlung erschiene. Deswegen wurde der Fokus der Aussagen in diesem Versuch auf Unterschiede zwischen den Proben gelegt. Mittels HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung wurde noch ein weiterer Gehaltsvergleich durchgeführt (siehe 4.3.10). Zusammen sollte sich eine verlässliche Aussage ergeben. 4.3.6.1. Geräte und Materialien Tirando-System Titrando 836 (Metrohm) Magnetrührer 801 (Metrohm) Touch Control (Metrohm) Elektrode 6.0451.100 (Pt, Metrohm), 6.0229.100 (LiCl sat. In EtOH, Metrohm) Titrisol Natronlauge 1 N (Merck, 1.09956.0001) Essigsäure 100% (Merck, K36522863636, pro analysi) Ameisensäure 100% (Fluka, Ph. Eur.) Perchlorsäure 0.1 N (Merck, 0B557153, zur Titration in nicht wässerigen Flüssigkeiten) Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.6.2. Probenvorbereitung und Methode Die Gehaltsbestimmungen der Aminosäuren wurden wie in den Monographien der Ph. Eur. 5.08 beschrieben durchgeführt. Jede Aminosäure wurde dreifach bestimmt und daraus der Gehalt als Mittelwert berechnet. Das Resultat bildete der titrierte Gehalt prozentual gegenüber der Einwaage. Tabelle 28 Liste der Ph. Eur. Monographien zu den untersuchten Aminosäuren L-Alanin L-Asparaginsäure Glycin L-Leucin L-Phenylalanin 4.3.6.3. Ph. Eur. 5.08 Monographie 01/2005:0752 Ph. Eur. 5.08 Monographie 01/2005:0797 Ph. Eur. 5.08 Monographie 04/2005:0614 Ph. Eur. 5.08 Monographie 01/2005:0771 Ph. Eur. 5.08 Monographie 01/2005:0782 Resultat der Gehaltsbestimmung mittels Titration Die titrierten Gehalte der unbehandelten Aminosäuren lagen alle in den Bereichen wie sie von der Ph. Eur. vorgegeben wurden (siehe Tabelle 29). Sie wichen zudem nicht viel von den Resultaten der Analysezertifikate ab. Die bestrahlten Aminosäuren zeigten keinen signifikanten Unterschied gegenüber den unbehandelten (siehe Abbildung 38). Eine Zersetzung der Proben durch Bestrahlung konnte mit dieser Methode nicht detektiert werden. Tabelle 29 titrierter Gehalt der unbehandelten Aminosäuren Aminosäure L-Alanin L-Asparaginsäure Glycin L-Leucin L-Phenylalanin Limit Ph. Eur. 5.08 (%) 98.5 – 101.0 98.5 – 101.5 98.5 – 101.0 98.5 – 101.0 98.5 – 101.0 Analysezertifikat (%) 100.3 99.6 101.0 100.2 100.1 Titrierter Gehalt (%) 100.28 99.98 100.87 100.60 100.24 Rsd (%) 0.41 0.24 0.20 0.39 0.09 125 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Gehaltsbestimmung mittels Titration 100 80 titrierter Gehalt (%) 126 unbehandelt 60 PE 30 kGy PP 30 kGy 40 PE 100 kGy PP 100 kGy 20 0 L-Ala L-Asp Gly L-Leu L-Phe Abbildung 38 Gehaltsbestimmung mittels Titration von unbehandelten und bestrahlten Aminosäuren 4.3.7. Optische Drehung Da es sich bei den untersuchten Aminosäuren (L-Ala, L-Asp, L-Leu, L-Phe) um chirale Verbindungen handelte, bildete die Messung der optischen Drehung eine einfache Methode um den Zustand der bestrahlten Proben zu überprüfen. Glycin wurde weggelassen, da diese Aminosäure kein chirales Zentrum besitzt. 4.3.7.1. Geräte und Materialien Polarimeter: Natriumlampe: Quecksilberlampe: Kühlsystem: Perkin-Elmer 241 589 nm 578nm, 546nm, 436nm und 365nm RM6 LAUDA Salzsäure 36 % (Hänseler AG, Ph. Eur.) 4.3.7.2. Probenvorbereitung und Methode Die Prüflösungen zur Messung der optischen Drehung wurden wie in der Monographie der Ph. Eur. 5.08 beschrieben hergestellt (siehe Tabelle 28). Die optische Drehung wurde bei 20 °C bei 589nm, 578nm, 546nm, 436nm und 365nm gemessen. Es wurden pro Probe jeweils 3 Lösungen hergestellt und jede Lösung dreifach bestimmt. Die so erhaltenen Werte wurden gemittelt. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.7.3. Resultat der optischen Drehung Die spezifischen optischen Drehungen bei 589 nm der unbehandelten Aminosäuren entsprachen wie erwartet den Limiten der Ph. Eur. (siehe Tabelle 30). Die Werte lagen auch Nahe an denjenigen des Analysezertifikates. Im Vergleich der unbehandelten gegenüber den bestrahlten Aminosäuren ergab sich ein auffälliges Muster (siehe Abbildung 39). Dieses wiederholte sich bei allen gemessenen Wellenlängen, wobei sich die grösste Empfindlichkeit bei 365 nm ergab. Die Drehwinkel der unbehandelten Aminosäuren waren immer höher als nach Bestrahlung. Allerdings konnte auch beobachtet werden, dass es zwischen einer Dosis von 30 kGy und 100 kGy keinen Unterschied hinsichtlich der Drehwinkelerniedrigung gab. Anders als bei der Verfärbung, welche mit der Dosis korrelierte, konnte hier kein solcher Zusammenhang gefunden werden. Tabelle 30 Spezifische optische Drehung von unbehandeltem L-Ala, L-Asp, L-Leu und L-Phe Aminosäure L-Alanin L-Asparaginsäure L-Leucin L-Phenylalanin Limit Ph. Eur. 5.08 (°) 13.5 - 15.5 24.0 - 26.0 14.5 - 16.5 − 33.0 - − 35.5 Analysezertifikat (°) 14.8 25.1 15.3 - 34.0 Spezifische Drehung (°) 14.768 25.528 15.152 - 33.953 Rsd (%) 0.47 0.33 0.38 0.64 optische Drehung (Hg 365 nm) 7.00 6.00 optische Drehung (°) 5.00 4.00 unbehandelt PE 30 kGy 3.00 PP 30 kGy 2.00 PE 100 kGy PP 100 kGy 1.00 0.00 L-Ala L-Asp L-Leu L-Phe -1.00 -2.00 Abbildung 39 0ptische Drehung von unbehandelten und bestrahlten Aminosäuren 127 128 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.8. Peroxidgehalt Es ist bekannt, dass sich bei der Radiolyse von Wasser neutrale Radikale wie H und OH, sowie H2O2 und H2 entstehen[107]. Diese hochreaktiven Stoffe (abgesehen von H2) könnten bei den Aminosäuren zu Zersetzung führen. Da alle untersuchten Proben Restwasser enthielten, wäre dieser Prozess bei der Bestrahlung zu erwarten. Erwartungsgemäss würden damit Aminosäuren mit hohem Restwassergehalt mehr Peroxid nach der Bestrahlung aufweisen. Es wurde ein semiquantitativer Stäbchentest verwendet um die Aminosäuren vor und nach der Bestrahlung auf Peroxid zu prüfen. 4.3.8.1. Geräte und Materialien Peroxid-Test:Merckoquant® (1.10011.0001,0.5 -25 mg /l H2O2) Salzsäure 36 % (Hänseler AG, Ph. Eur.) Tabelle 31 Trocknungsverlust von L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe nach Analysezertifikat Aminosäuren L-Ala L-Asp Gly L-Leu L-Phe 4.3.8.2. Trocknungsverlust nach Analysezertifukat (%) 0.01 0.05 0.01 0.08 0.01 Probenvorbereitung und Methode Die Prüfung der Aminosäuren auf Peroxid wurde 8 Wochen nach der Bestrahlung (Lagerung bei 8°C im Kühlschrank) durchgeführt. Dazu wurden wässerige Lösungen (0.1% (m/V)) dreifach vermessen. Für L-Asp wurde aus Gründen der Löslichkeit Salzsäure (0.1 %) verwendet. 4.3.8.3. Resultat des Peroxidgehalts Die Aminosäuren zeigten vor Strahlenbehandlung keine Anzeichen für Peroxid. Nach der Bestrahlung konnte Peroxid bei L-Ala, Gly, L-Leu und L-Phe gefunden werden (siehe Tabelle 32). L-Phe wies eine deutliche Zunahme der Peroxidkonzentration mit steigender Dosis auf. Bei L-Asp konnte mit dieser Versuchsanordnung kein Peroxid belegt werden. Tabelle 32 Peroxidgehalt von L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe Peroxidgehalt (mg/l H2O2) L-Ala L-Asp Gly L-Leu L-Phe unbehandelt PE 30 kGy PP 30 kGy PE 100 kGy PP 100 kGy - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2 0.5 0.5 0.5 2 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.9. Headspace GC-MS Untersuchungen Die 5 Aminosäuren L-Ala, L-Asp, Gly, Leu und L-Phe wurden mittels Headspace GCMS auf flüchtige Zersetzungsprodukte untersucht. Die Untersuchungen mit der gleichen Technik hatten im Vorfeld keine Hinweise auf flüchtige Verunreinigungen oder Lösungsmittelrückstände bei unbehandelten Aminosäuren geliefert (siehe 3.4.). 4.3.9.1. Geräte und Materialien Headspace-Sampler GC MS Software Bibliothek TriPlus Autosampler (Thermo Electron Corporation) Trace GC Ultra (Thermo Electron Corporation) DSQ II (Thermo Electron Corporation) XcaliburTM Home Page version 1.4 SR1 NIST MS Search 2.0 2005 Säule Restek RTX-624. 60 m, ID 0.32 mm, DF: 1.8, Cat.-Nr. 10972, Serial-Nr. 196266 Rtx-624 (fused silica), Crossbond 6% cyanopropylphenyl 94%dimethylpolysiloxan Stabil bis 280 °C TriPlus Autosampler Parameter Syringe Incubation mode Agitator temperature Incubation time Sample draw Syringe temperature Filling volume Filling counts Filling delay Post-Injection syringe flush Filling speed Injection speed Injection depth Pre-Injection delay Post-Injection delay Anticipated time Synchro type Needle speed in vial Heated syringe body 2.5 ml headspace constant 85 °C 60 min 1 ml 85 °C 1 ml 3 1s 30 s 25 ml/min 4 ml/min 20 mm 5s 5s 3 min normal 200 mm/s Trace GC Ultra Parameter Injector Carrier gas Carrier gas flow Prep Run Timeout Equilibration time PTV CT splitless 250 °C Constant septum purge Helium 5.6 1 ml/min constant flow vacuum compensation 70 min 0 min GC Trennprogramm Initial temperature Initial hold time 1 Program rate 1 Final temprature 1 Final hold time 2 40 ° C 20 min 10 °C/min 220 °C 20 min DSQ II Parameter Ion source Start time Detector gain Scan time Scan per second Scan rate Mass range 250 °C 4.5 min 1 x 105 (Multiplier voltage: 1049 V) 0.765 s 1.3245 500.0 amu/s 34 – 400 129 130 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.9.2. Probenvorbereitung und Methode Die Methode wurde aus 3.4. (Flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände) übernommen, musste aber an das neue Injektionssystem (PTV) angepasst werden (siehe 4.1). Das gleiche Testgemisch bestehend aus Acetaldehyd, 2-Propanol, Acetonitril, Butanal, Benzol, Allylacetat, Pyrrol und Benzaldehyd konnte getrennt und ebenfalls bis zu einer Konzentration von 0.01 % (V/m bezogen auf 100 mg Aminosäure) nachgewiesen werden. Allerdings zeigten sich, vermutlich bedingt durch das unterschiedliche Injektionssystem, stärkere Standardabweichungen. Es wurden je 100 mg Aminosäurenprobe in 10 ml Wasser in einem headspace vial gelöst, mit Stickstoff geflutet und luftdicht verschlossen. L-Asp konnte nicht vollständig gelöst werden. Alle Messungen wurden dreimal wiederholt. Die Identifizierung wurde mittels der NIST-Bibliothek und Vergleich des erhaltenen Fragmentierungsmuster durchgeführt. 4.3.9.3. Resultat der Headspace GC-MS Untersuchungen Die Aminosäuren lieferten wie schon bei dem Versuch auf flüchtige Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände (siehe 4.1) keinen Anhaltspunkt auf zusätzliche Abbauprodukte vor der Bestrahlung. Nach der Bestrahlung konnte bei LAla und L-Asp Acetaldehyd nachgewiesen werden (siehe Tabelle 33). Bei Erhöhung der Strahlendosis von 30 kGy auf 100 kGy wurde dabei die Signalfläche mehr als verdoppelt. Mit dieser Methode konnten für Gly keine Abbauprodukte detektiert werden. L-Leu wies 8 und L-Phe 7 zusätzliche Peaks auf. Diese konnten teilweise mit Hilfe der NIST-Bibliothek und Vergleich des Fragmentierungsmusters identifiziert werden. Abbildung 40 und 41 gibt eine Übersicht über die gefundenen Substanzen und ein Zersetzungsschema für L-Leu und L-Phe. Alle Signalflächen nahmen dabei mit der Bestrahlungsdosis zu. Eine Zusammenfassung aller Werte wird in Tabelle 33 aufgelistet. Die Resultate standen auch in Einklang mit früheren Untersuchungen (3.4.1.4.3 e-und γ-Bestrahlung von 20 Aminosäuren mit 30 kGy). Das Verpackungsmaterial zeigte auch in diesem Versuch keinen Einfluss auf die bestrahlten Aminosäuren. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 131 Tabelle 33 Übersicht der headspace GC-MS Messungen von L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe Aminosäure PE 30 kGy (100 mg) RT (min) Mittelwert L-Ala 5.39 L-Asp Gly L-Leu L-Phe PP 30 kGy (100 mg) rsd RT (min) Mittelwert 15353538 45.16 5.41 5.47 17984620 15.90 - - 4.70 PE 100 kGy (100 mg) rsd RT (min) Mittelwert 17800414 19.16 5.43 5.46 18688404 6.03 - - - 97584922 21.13 4.64 6.19 9388866 23.52 - - - 9.23 18401532 11.45 PE 100 kGy (100 mg) Identifikation rsd RT (min) Mittelwert rsd 37698657 33.71 5.41 43410008 21.82 Acetaldehyd 5.51 44154760 19.98 5.49 45812120 25.04 Acetaldehyd - - - - - - - 132340489 13.95 4.64 327585240 32.25 4.61 296657921 20.37 Isobutan 6.14 11964485 18.33 6.02 18205879 15.27 6.08 12267991 20.24 ? - - - 6.40 43392170 31.74 6.36 37192414 12.66 2-methyl-Butan 7.02 9.22 18839086 9.35 9.19 34813093 18.37 9.19 35724397 3.18 Aceton 3215091 12.90 11.48 2876251 3.97 11.45 8170410 31.14 11.45 8101738 8.21 ? 12.97 1809330 15.52 12.90 1763811 9.76 12.89 5578173 14.89 12.82 5604155 14.86 2-methyl-Propanal 23.51 485575793 3.70 23.50 477208711 16.86 23.48 2217072251 18.03 23.46 2012114646 15.72 3-methyl-Butanal - - - - - - 36.66 50297004 15.30 36.65 45304806 18.01 ? 22.56 6197731 4.68 22.61 6308962 9.96 22.56 20457899 12.36 22.54 19176642 8.72 Benzol 28.50 23556415 6.38 28.52 24682836 12.07 28.48 99477190 9.32 28.48 92226018 14.06 Toluol 31.69 7130290 5.46 31.72 7553036 14.91 31.63 67253843 7.18 31.62 60469389 17.89 Ethylbenzol 32.67 43189877 4.18 32.69 42012681 19.66 32.63 362196122 12.08 32.63 341165487 14.83 Styrol 35.48 8160957 11.73 35.54 7836232 8.14 35.28 34779132 32.80 35.24 35763591 13.32 Benzaldehyd 36.89 25247415 28.83 36.98 20937921 27.45 36.79 111686390 52.17 36.75 146621436 36.81 Phenylacetaldehyd 37.44 8268863 10.43 37.49 7930410 9.16 37.33 37142727 39.99 37.28 37251526 25.95 Acetophenone - headspace GC-MS von L-Leu 3000000000 CH3 CH Signalfläche 2500000000 CH3 Isobutan 2000000000 ? 1500000000 ? 1000000000 500000000 CH3 O O H H2 N CH C OH C CH3 CH2 0 CH2 CH2 CH CH CH3 CH3 CH CH3 CH3 CH3 CH3 L-Leucin 2-methyl-Butanal 2-methyl-Butan L-Leu L-Leu PE 30 kGy L-Leu PP 30 kGy L-Leu PE 100 kGy L-Leu PP 100 kGy Abbildung 40 Resultat der Zersetzungsschema von L-Leu O O H C C HC CH3 H 3C ? CH 3 Aceton CH3 2-methyl-Propanal headspace GC-MS Untersuchungen und Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation headspace GC-MS L-Phe 450000000 CH3 CH3 400000000 Signalfläche 132 CH2 350000000 300000000 Toluol 250000000 200000000 Benzol Ethylbenzol O 150000000 100000000 O 50000000 NH 2 CH3 CH C C CH2 Acetophenon Phenylalanin OH H CH2 C 0 H L-Phe O C L-Phe PE 30 kGy Styrol CH2 H O C L-Phe PP 30 kGy L-Phe PE 100 kGy L-Phe PP 100 kGy Phenylacetaldehyd Benzaldehyd Abbildung 41 Resultat der headspace GC-MS Untersuchungen und Zersetzungsschema von L-Phe 4.3.10. HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung Die Aminosäuren L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe wurden mit der unter 3.3.4. entwickelten HPLC-Methode auf Zersetzungsprodukte und Verunreinigungen überprüft. Als Zersetzungsprodukt wurde ein peak dann ausgewiesen, wenn eine zunehmende Strahlendosis zu einer Signalflächenvergrösserung führte. Im Gegenzug galt ein Peak, welcher trotz Strahlenbehandlung gleichbleibende Signalfläche aufwies, als Verunreinigung. 4.3.10.1. Geräte und Materialien Es wurden die gleichen Geräte und Materialien wie unter 3.3.4.1. beschrieben verwendet. 4.3.10.2. Probenvorbereitung und Methode Die Probenvorbereitung und Methode war identisch wie unter 3.3.4.3. beschrieben. Die Messabweichung beim Gehaltsvergleich wurde ebenfalls auf 5.5 % gesetzt. Die Gesamtverunreinigung wurde prozentual aus der Summe aller gefundenen Zersetzungsprodukte und Verunreinigungen gegenüber der Hauptsubstanz gebildet. Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.3.10.3. Resultat der HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung Bei L-Ala konnte mit dieser Methode ein grosser Peak gefunden werden. Die Gesamtverunreinigung fiel deswegen auch sehr hoch aus (siehe Tabelle 35). Es handelte sich dabei allerdings um dieselbe Problematik, wie schon unter 3.8. (Untersuchung von 11 Chargen Serin) beschrieben. Es wurde deswegen vermutet, dass es sich nicht um eine echte Verunreinigung handelt. L-Asp zeigte 2 Verunreinigungen und 3 Zersetzungsprodukte. Der Peak bei einer Retentionszeit von 32.08 min zeigte eine Signalflächenabnahme über die Zeit, was die grosse Standardabweichung erklärte. Gly wies 2 Zersetzungsprodukte und 1 Verunreinigung auf. Die Verunreinigung erschien bei ähnlicher Retentionszeit, wie diejenige von L-Ala und verursachte ebenfalls, dass die Gesamtverunreinigung sehr hoch ausfiel. Auch in diesem Fall wurde bezweifelt, dass es sich um eine echte Verunreinigung handelte. Die Chromatogramme von L-Leu enthielten 5 Zersetzungsprodukte und 6 Verunreinigungen. Bei L-Phe konnten 4 Zersetzungsprodukte und 5 Verunreinigungen detektiert werden. Wie schon bei den GC-MS-Messungen zeigten L-Leu und L-Phe mehr Zersetzungsprodukte als die übrigen Aminosäuren. Die erhaltenen Resultate wurden in Tabelle 34 zusammengefasst. Dabei bezeichnen die weissen Felder Verunreinigungen und die hellgrauen Zersetzungsprodukte. Das Packmittel zeigte auch bei diesem Versuch keinen Einfluss auf die bestrahlten Proben. Der Gehaltvergleich war bedingt durch die vielen Verdünnugsschritte, die zur Herstellung der Untersuchungslösungen notwendig waren, mit einer grossen Unsicherheit behaftet (siehe Abbildung 42) und deswegen nur schwer beurteilbar. Er stand aber in keinem Widerspruch mit der Gehaltsbestimmung mittels Titration (siehe 4.3.6.), die keinen Unterschied feststellen konnte. 133 rsd (%) 2.18 11.74 0.98 rsd (%) 5.17 0.66 rsd (%) 5.75 7.29 7.57 4.91 0.30 6.53 5.65 rsd (%) 5.07 16.95 9.48 19.04 6.40 3.99 Gly Mittelwert (µV*s) 75397 10679486 Leu Mittelwert (µV*s) 106058 73045 43214 130694 5234748 467374 116949 L-Phe Mittelwert (µV*s) 41643 19437 57960 46148 59883 32734 Rt (min) 4.78 7.43 42.83 Rt (min) 17.35 19.67 22.2 26.62 29.09 29.49 30.89 31.8 32.87 39.24 39.73 Rt (min) 7.54 17.93 20.56 28.49 30.95 34.49 40.49 40.91 42.09 22134 24070 23726 56742 48951 47737 50444 L-Phe PE 30 kGy Mittelwert (µV*s) Leu PE 30 kGy Mittelwert (µV*s) 35914 44718 133499 845178 55292 135186 116805 5007482 538049 115593 rsd (%) 5.47 13.19 41.72 7.30 7.82 7.58 8.10 rsd (%) 5.35 6.50 2.48 2.44 9.38 0.91 2.50 0.29 0.81 13.38 rsd (%) 5.64 1.52 15.67 24.20 L-Asp L-Asp PE 30 kGy Mittelwert (µV*s) rsd (%) (%) Mittelwert (µV*s) 233139 7.77 220410 128847 17.09 126909 43936 1.97 89547 40253 Rt (min) 3.09 18.23 20.37 26.36 32.08 Gly PE 30 kGy Mittelwert (µV*s) 80266 21751 10300957 rsd (%) 2.21 L-Ala PE 30 kGy Mittelwert (µV*s) 29304980.67 rsd (%) 3.08 L-Ala Mittelwert (µV*s) 30103303 Rt (min) 43.48 31239 30343 25174 55515 70809 46392 62495 L-Phe PP 30 kGy Mittelwert (µV*s) Leu PP 30 kGy Mittelwert (µV*s) 46733 43796 136730 829768 51263 120530 121942 4915809 521750 97875 Gly PP 30 kGy Mittelwert (µV*s) 87072 20236 11092362 L-Asp PP 30 kGy Mittelwert (µV*s) 237147 122489 72811 37790 L-Ala PP 30 kGy Mittelwert (µV*s) 29041724.67 rsd (%) 2.70 15.26 19.47 12.60 25.97 18.42 12.54 rsd (%) 10.88 5.42 3.59 1.45 4.66 5.53 2.38 0.75 3.57 2.66 rsd (%) 10.33 16.34 0.74 rsd (%) 7.20 0.75 15.97 20.48 rsd (%) 1.21 L-Phe PE 100 kGy Mittelwert (µV*s) 24662 22088 26821 54508 168073 46937 91543 53946 Leu PE 100 kGy Mittelwert (µV*s) 66979 75747 191824 1466021 100520 154097 42804 437657 4909189 679850 135344 Gly PE 100 kGy Mittelwert (µV*s) 95068 37173 10217030 L-Asp PE 100 kGy Mittelwert (µV*s) 210210 120623 34766 227266 80869 L-Ala PE 100 kGy Mittelwert (µV*s) 28981771.33 rsd (%) 38.64 2.40 21.65 7.24 7.42 8.26 1.13 13.29 rsd (%) 3.60 7.45 2.75 0.72 2.14 0.80 58.85 9.90 0.80 2.99 7.92 rsd (%) 10.97 9.31 0.82 rsd (%) 5.95 6.62 7.10 7.96 41.84 rsd (%) 2.66 L-Phe PP 100 kGy Mittelwert (µV*s) 27668 26416 30759 52627 159794 58260 94841 56702 Leu PP 100 kGy Mittelwert (µV*s) 46027 66082 178751 1396647 94232 147134 40423 448503 4878025 655245 154424 Gly PP 100 kGy Mittelwert (µV*s) 104941 33811 11092458 L-Asp PP 100 kGy Mittelwert (µV*s) 214023 119057 12237 232625 78354 L-Ala PP 100 kGy Mittelwert (µV*s) 29555865 rsd (%) 13.59 16.42 32.80 4.37 9.01 7.46 9.30 15.40 rsd (%) 4.59 10.73 3.70 0.61 4.91 3.49 20.94 10.56 0.39 3.35 48.24 rsd (%) 8.94 1.30 1.42 rsd (%) 6.34 7.39 3.96 8.74 45.03 rsd (%) 0.69 134 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Tabelle 34 gefundene Verunreinigungen und Zersetzungsprodukte nach HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation Signalfläche (µV*s) Gehaltvergleich mittels HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung 9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 unbehandelt 30 kGy PE 30 kGy PP 100 kGy PE 100 kGy PP L-Ala L-Asp Gly L-Leu L-Phe Abbildung 42 Gehaltvergleich von L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe mittels HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung Tabelle 35 Gehaltvergleich und Gesamtverunreinigung von L-Ala, L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe mittels HPLC mit FMOC-Cl Vorsäulenderivatisierung Aminosäure L-Ala L-Ala 30 kGy PE L-Ala 30 kGy PP L-Ala 100 kGy PE L-Ala 100 kGy PP L-Asp L-Asp 30 kGy PE L-Asp 30 kGy PP L-Asp 100 kGy PE L-Asp 100 kGy PP Gly Gly 30 kGy PE Gly 30 kGy PP Gly 100 kGy PE Gly 100 kGy PP L-Leu L-Leu 30 kGy PE L-Leu 30 kGy PP L-Leu 100 kGy PE L-Leu 100 kGy PP L-Phe L-Phe 30 kkGy PE L-Phe 30 kkGy PP L-Phe 100 kkGy PE L-Phe 100 kkGy PE Rt (min) Mittelwert (µV*s) rsd (%) Gesamtverunreinigung (%) 23.97 23.73 23.35 23.57 23.52 7.50 7.42 7.48 7.48 7.69 22.03 21.90 21.73 22.31 22.17 34.11 34.19 34.01 33.92 34.29 38.52 38.83 38.05 38.23 37.56 7191990 6900543 6852747 6850275 6833697 6728432 6493486 6570093 6555856 6809827 7473661 7270969 7597806 7096834 7503917 6643008 6427664 6243649 6127001 6193407 6409477 6409477 6423175 6219555 6316410 1.19 0.83 0.85 0.51 1.54 0.31 0.67 0.46 0.69 0.86 0.37 0.65 0.89 0.96 0.83 0.35 0.40 0.12 0.33 0.20 1.04 0.39 0.90 0.74 0.43 4.19 4.25 4.24 4.23 4.33 0.06 0.07 0.07 0.10 0.10 1.44 1.43 1.47 1.46 1.50 0.93 1.09 1.10 1.35 1.31 0.04 0.04 0.05 0.08 0.08 135 136 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation 4.4. Diskussion der Stabilitätsuntersuchungen von Aminosäuren nach Sterilisationsbehandlung Antimikrobielle Behandlung von 20 Aminosäuren Nach antimikrobieller Behandlung traten typische Verfärbungen auf, wie sie auch schon in der Literatur beschrieben worden waren (siehe 4.1.2.1.). Davon waren nach Bestrahlung (30 kGy) mit Ausnahme von L-Arg und L-Tyr alle Aminosäuren betroffen (siehe Tabelle 22). Durch Wärmebehandlung (2 h, 160 °C) ergaben sich deutlich weniger Verfärbungen, dafür zersetzten sich L-Cys HCl und L-Gln unter diesen Bedingungen vollständig. Neben den Verfärbungen war die Zunahme des Geruchs bei 14 Aminosäuren ein zusätzlicher Hinweis auf Zersetzungsprozesse durch die antimikrobiellen Behandlungen. Einen weiteren Hinweis auf Veränderungen lieferten die Untersuchungen der Oberflächenfluoreszenz (siehe 4.2.3.3.). Dabei zeigte sich, dass vor allem nach Wärmebehandlung bei den meisten Aminosäuren im pulverförmigen Zustand Fluoreszenz auftrat. Nach Lösung dieser Proben mit 1 M HCl zeigten nur noch 4 Aminosäuren Fluoreszenz. Es scheint, dass die Veränderungen, welche zur Fluoreszenz führten, bei den andern Aminosäuren nur an der Oberfläche der Kristalle auftraten. Es besteht natürlich auch die Möglichkeit, dass das zugefügte HCl zu Quenching führte. Bei den Aminosäuren, welche im gelösten Zustand noch Fluoreszenz zeigten, gehörte das vollständig zersetzte L-Cys und L-Gln. Daneben war auch L-Met davon betroffen, welches durch die SH-Gruppe leicht zu Zersetzung neigt. Die antimikrobiellen Behandlungen schienen bei den meisten Aminosäuren keinen grossen Einfluss auf die Chiralität zu haben (siehe 4.2.4.3.). Ein Muster konnte erst bei anschliessenden Untersuchungen gezeigt werden, wonach die Drehung nach Bestrahlung Dosis abhängig abnahm (siehe 4.3.7.3.). Der Grund, dass dieses Muster hier nicht auftrat, könnte in der Zeit zwischen der Bestrahlung und den Messungen liegen. Die Proben dieses Versuches wurden erst nach 1.5 Jahren vermessen, die neuen unmittelbar nach Bestrahlung. Bei L-Cys HCl lag die optische Drehung bei allen 3 verwendeten Sterilisationsmethoden ausserhalb der Limite. Damit war keine der verwendeten antimikrobiellen Methoden für L-Cys geeignet. Es zeigte sich auch, dass Trockensterilisation bei L-Glu zu einem starken Verlust der Chiralität führte und somit als Sterilisationsmethode ungeeignet war. Durch DC mit Ninhydrin-Detektion konnte bei 6 Aminosäuren Hinweise auf Zersetzungsprodukte gefunden werden (siehe 4.2.5.4.). Eine starke Zersetzung der Proben durch die Strahlenbehandlung konnte mit dieser Methode jedoch nicht festgestellt werden. Diese Befunde konnten mit der entwickelten HPLC-Methode (siehe 3.3.4.) bestätigt werden. Allerdings war die HPLC wesentlich sensitiver und es konnte bei der Hälfte der untersuchten Aminosäuren Hinweise auf Zersetzungsprodukte nach antimikrobieller Behandlung gefunden werden (siehe 3.3.4.4.1). Die einzige Ausnahme bildete L-Ala, welche weder Hinweise auf Verunreinigungen noch auf Zersetzungsprodukte lieferte. Insgesamt lagen die gefundenen Zersetzungsprodukte aber an der Nachweisgrenze und die detektierten Veränderungen waren eher klein. Schon anhand der Geruchsemissionen der Proben wurde vermutet, dass durch die antimikrobielle Behandlung flüchtige Zersetzungsprodukte entstehen. Dies konnte durch GC-MS erfolgreich gezeigt werden (siehe 3.4.1.). Bei Cys und Met traten wie erwartet typische sulfidhaltige Verbindungen auf. Acetaldehyd fand sich gleich bei mehreren Aminosäuren (Ala, Asp, Glu, Met und Thr). Wie man erwarten würde, Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation konnte bei Phe Verbindungen wie Benzol, Toluol und Benzaldehyd gefunden werden. Interessanterweise fanden sich gleichzeitig bei Tyr keine solchen Zersetzungsprodukte. Tyr war die einzige Aminosäure, bei der mit allen verwendeten Methoden keine Veränderungen nach antimikrobieller Behandlung detektiert werden konnte. Bei den bestrahlten Aminosäuren konnten mittels GC-MS mehr Zersetzungsprodukte detektiert werden als bei den wärmebehandelten (siehe 3.4.1.4.2 und 3.4.1.4.3). Dies konnte auch mit den HPLC Untersuchungen bestätigt werden, wobei hier der Unterschied weniger deutlich ausfiel. Dafür trat bei Bestrahlung mit 30 kGy keine Totalzersetzung auf wie im Falle von Cys und Gln nach Wärmebehandlung. Die Untersuchungen zeigten klar, dass die antimikrobielle Behandlung von Aminosäuren mittels trockener Hitze oder Bestrahlung mit Zersetzung verbunden war. Die Wärmebehandlung führte dabei tendenziell zu weniger Veränderung als die Bestrahlung. Es konnte auch kein wesentlicher Unterschied zwischen der Anwendung von e-- oder γ-Strahlen festgestellt werden. Da für Aminosäuren zur pharmazeutischen Anwendung die Reinheit höchsten Ansprüchen genügen muss, war letztlich keine der verwendeten Techniken in der Lage die Sterilfiltration zu ersetzen. e- -Bestrahlung von Aminosäuren mit 30 kGy und 100 kGy Durch Untersuchungen an 5 ausgewählten Aminosäuren (L-Ala, L-Asp, Gly, Leu und L-Phe), welche mit unterschiedlichen Strahlendosen (30 kGy und 100 kGy) behandelt wurden, sollten die Effekte der Verfärbungen und das Verhalten der Zersetzungsprodukte genauer untersucht werden (siehe 4.3.). Einen Einfluss des Packmittels auf die Verfärbungen oder die Zersetzungsprodukte liess sich durch die Verwendung von 2 Packmaterialien (ld-PE und PP) während der Bestrahlung in den anschliessenden Analysen nicht finden. Es konnten mit keiner der verwendeten Methoden Unterschiede gefunden werden. Es zeigte sich schon visuell, dass die Stärke der Verfärbung mit der Dosis zunahm (siehe Abbildung 31). Dies wurde als ersten Hinweis gewertet, dass die Verfärbungen nicht durch reine Oberflächeneffekte zu erklären waren. Bestätigt wurde dies auch durch Auflichtspektroskopie, bei welcher die Aminosäurekristalle eine gleichmässige Verfärbung aufwiesen (siehe Abbildung 33). Die Vermutung, dass die Verfärbungen aufgrund von Fremdeinschlüssen in den Kristallen auftraten und somit im Zusammenhang mit Verunreinigungen standen, konnte nicht bestätigt werden (siehe 4.3.3.3.). Die anschliessenden UV/Vis Untersuchungen stimmten mit diesen Erkenntnissen überein und zeigten eine Zunahme der Absorption mit steigender Bestrahlungsdosis (siehe 4.3.4.3.). Gly bildete dabei eine Ausnahme und eine Zunahme der Absorption konnte nicht festgestellt werden, obwohl die Zunahme der Verfärbung bei höherer Dosis visuell klar erkennbar war. Die Oberflächenfluoreszenzuntersuchungen bestätigten die Ergebnisse der zuvor durchgeführten Messungen (siehe 4.3.5.3.). Zusätzlich korrelierte die Oberflächenfluoreszenz bei pulverförmigen Phe und Leu mit der Strahlendosis. Nach Lösung der Proben in Wasser (Asp in 1 M HCl) zeigte nur noch Phe eine Zunahme der Fluoreszenz. Durch Titration konnte keine Veränderung des Gehaltes selbst nach einer Bestrahlung von 100 kGy festgestellt werden (siehe 4.3.6.3.). Daraus liess sich schliessen, dass nur wenig Zersetzung auftrat. Die Untersuchungen der optischen Drehung zeigten ein interessantes Muster (siehe 4.3.7.3.). Nach Bestrahlung waren die Drehwinkel erniedrigt, aber unabhängig von 137 138 Stabilitätsuntersuchung von Aminosäuren nach Strahlensterilisation der Strahlendosis. Hier fände sich ein mögliches Indiz, dass es sich bei dem gefundenen Muster um einen Oberflächeneffekt handelt. Die ionisierende Strahlung würde nur in der obersten Schicht der Kristalle, also an der Grenze zur Luft, zu einer Veränderung führen, welche für die Drehwinkelerniedrigung verantwortlich wäre. Naheliegend wären Prozesse wie Decarboxylierungen und Desaminierungen, die das chirale Zentrum der Aminosäure aufheben würden. Falls dieser Effekt vorwiegend an der Kristalloberfläche stattfände, wären die gefunden Ergebnisse erklärbar. Bei 30 kGy wäre der Vorgang schon abgeschlossen und eine Erhöhung der Dosis würde das Resultat nicht weiter beeinflussen. Dies könnte leicht überprüft werden, indem Aminosäure mit unterschiedlicher Kristallgrösse und damit unterschiedlicher Oberflächengrösse bestrahlt würden. Eine grössere Oberfläche müsste dann zu einer stärkeren Drehwinkelerniedrigung führen. Peroxid konnte nach einer Bestrahlung von 100 kGy in Ala, Gly, Leu und Phe nachgewiesen werden (siehe 4.3.8.3.). Dadurch wurde deutlich, dass mit Zersetzungsprozessen, wie sie in wässerigen Lösungen ablaufen, prinzipiell auch bei Bestrahlung von Aminosäurepulvern gerechnet werden muss. Ein Zusammenhang von Peroxidgehalt und Restwassergehalt in den Proben konnte nicht offenbart werden. Dies könnte auch daran liegen, dass der Versuch erst 8 Wochen nach der Bestrahlung durchgeführt wurde. Bei Ala und Asp konnte mittels GC-MS Acetaldehyd als Zersetzungsprodukt gefunden werden (siehe 4.3.9.3.). Für Leu und Phe konnte ein Zersetzungsschema erstellt werden (Abbildung 40 und 41). Typischerweise und wie erwartet nahmen die detektierten Zersetzungsprodukte mit steigender Strahlendosis zu. Bei Gly liessen sich keine Zersetzungsprodukte finden. HPLC Untersuchungen mit FMOC Vorsäulenderivatisierung lieferten keinen Hinweis auf eine starke Zersetzung der Proben durch die verwendeten Strahlendosen (siehe Abbildung 42). Ein weiteres Indiz dafür lieferte die Gesamtverunreinigung. Obwohl bei L-Asp, Gly, L-Leu und L-Phe nach einer Strahlenbehandlung einige Zersetzungsprodukte gefunden wurden, stieg die Gesamtverunreinigung nicht übermässig an (siehe Tabelle 35). L-Leu zeigte eine maximale Zunahme nach 100 kGy von 0.38 %. Alle anderen zeigten eine Zunahme unter 0.07 %. Dieses Resultat stand im Einklang mit der Gehaltsbestimmung mittels Titration (siehe 4.3.6.). Abschliessende Diskussion und Schlussfolgerung 5. Abschliessende Diskussion und Schlussfolgerung Zur Untersuchung von Aminosäuren mit Ph. Eur. Qualität wurden für die Stoffklassen der flüchtigen Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände, der Aminosäuren und Derivate, der Kohlenhydrate, der Antibiotika und der Metalle analytische Methoden erstellt. Die Zielvorgabe vordefinierte, potentielle Verunreinigungen auf 0.05 % (m/m bzw. Mol/Mol) zu limitieren konnte erreicht werden. Durch Analyse von 18 biogenen Aminosäuren, welche alle Ph. Eur. Qualität aufwiesen und Vergleich mit denselben Aminosäuren nach Sterilisationsbehandlung (e-- und γ-Bestrahlung und Wärme), konnten mit den entwickelten Methoden zahlreiche Zersetzungsprodukte gefunden werden. Dies demonstrierte, dass die entwickelten Methoden tatsächlich in der Lage waren Qualitätsunterschiede zu detektieren. Aminosäuren und Derivate Es konnte bestätigt werden, dass sich die von Novatchev et al. entwickelte FMOCDerivatisierungsmethode zur Reinheitsprüfung von Aminosäuren eignete. An Stelle von Kapillarelektrophorese und UV-Detektion wurde erfolgreich HPLC mit Fluoreszenzdetektion mit einer Nachweisgrenze von 0.05 % (Mol/Mol) auf Fremdaminosäuren erstellt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass diese Methode in der Lage war Verunreinigungen zu detektieren, welche der Ph. Eur. Reinheitsprüfung (DC) entgingen. Sie stellt dadurch eine bessere Lösung als die Ph. Eur. Methode dar und ist eine gute Alternative zur Kapillarelektrophorese. Eine neue Prüfung auf verwandte Substanzen, wie sie in Ph. Eur. für Aminosäuren wünschbar wäre, wurde vorgeschlagen. Das verwendete Trennprogramm wurde darauf ausgelegt alle zu untersuchenden Aminosäuren in einem Lauf aufzutrennen. Eine Basislinientrennung konnte jedoch bedingt durch die hohe Anzahl der zu trennenden Stoffe nicht in jedem Fall erreicht werden. Hinsichtlich einer Eignung als Reinheitsprüfung für die Ph. Eur. wäre es notwendig, das Trennprogramm individuell auf die jeweilige Aminosäure abzustimmen. Flüchtigen Verunreinigungen und Lösungsmittelrückstände Es konnte mittels headspace GC-MS gezeigt werden, dass zur Qualitätsbeurteilung von Aminosäuren den flüchtigen Verunreinigungen eine wesentliche Rolle zu gesprochen werden muss. Die untersuchten Aminosäuren neigten bei Stressbehandlung zu zahlreichen flüchtigen Zersetzungsprodukten, welche durch diese Technik wirksam detektiert werden konnten. Deswegen sollte bei Fragestellungen, welche sich mit der Stabilität von Aminosäuren beschäftigen (Bsp. Halbarkeits-, Verwendbarkeitsfristen) diese Methode eine wesentliche Rolle spielen. Kohlenhydrate Obwohl Kohlenhydrate bei den fermentativ hergestellten Aminosäuren in grossen Mengen zum Einsatz kommen, konnten im Rahmen dieser Arbeit keine Hinweise auf Verunreinigungen aus dieser Stoffklasse gefunden werden. Die untersuchten Aminosäuren erschienen hinsichtlich der Kohlenhydrate als rein. Eine mögliche Erklärung könnte hier die unterschiedliche Löslichkeit in Wasser liefern. Während viele Zucker leicht löslich in Wasser sind, gilt dies nicht generell für Aminosäuren. Durch wässerige Reinigungsprozesse, wie sie die Industrie anwendet 139 140 Abschliessende Diskussion und Schlussfolgerung (Umkristallisation und chromatographische Methoden) können Zucker sehr effektiv von Aminosäuren getrennt werden. Herstellerfirmen könnten einen solchen Test auf einfache und billige Weise als Indikator für einen erfolgreichen Reinigungsprozess nutzen. Falls Zucker detektiert würden, dürfte ein grundsätzliches Problem im Reinigungsprozess aufgetreten sein. Metalle Bei der Untersuchung von L-Asp, Gly, L-Ile und L-Ser traten keine Metallkontaminationen über 10 ppm auf. Da Aminosäuren (z.B. L-Ala, L-Asp, L-Glu, Gly und L-His) aber in Proteinen als Chelatoren katalytisch aktiver Metalle (z.B. Fe, Cu, Mn, Ni oder Zi) in Funktion treten, wäre die Untersuchung weiterer Aminosäuren vor und nach Aussetzung verschiedener Konzentrationen entsprechender Metalle von Interesse. Nur so könnte eine fundierte Aussage über das Risiko einer Metallkontamination gemacht werden. Antibiotika Für die in dieser Arbeit untersuchten Aminosäuren liessen sich keine Anzeichen von Antibiotikaverunreinigungen finden. Trotzdem stellen sie, wenn sie bei der fermentativen Herstellung von Aminosäuren verwendet werden, ein potentielle Verunreinigung dar. Da der Herstellungsprozess aber der Geheimhaltung unterliegt und das verwendete Antibiotikum der Öffentlichkeit nicht offengelegt wird, liegt die Verantwortung darüber ganz bei den Herstellern. Dabei müsste die zuständige Behörde sicherstellen, dass die notwendige Überwachung gewährleistet wurde. Antimikrobielle Behandlung von Aminosäuren Die verwendeten Sterilisationsmethoden (trockene Hitze, e-- und γ-Bestrahlung) führten bei fast allen Aminosäuren zu signifikanten Veränderungen und zu Abbauprodukten. Aus diesem Grund eignet sich Bestrahlung als Sterilisationsmethode für Aminosäuren hoher Reinheit nicht. Bei den Veränderungen fiel vor allem die Verfärbung nach Bestrahlung ins Gewicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Stärke der Verfärbung mit der Bestrahlungsdosis bei den untersuchten Aminosäuren korrelierte. Dies wurde als Hinweis gewertet, dass die Verfärbung nicht ausschliesslich von einer Verunreinigung stammte, sondern direkt mit der Aminosäure zusammenhing und mit der Bestrahlungsdosis zunahm. Durch chromatographische Methoden konnte jedoch nicht bestätigt werden, dass sich die Verfärbung auf ein einziges Abbauprodukt zurückführen liess. Daneben war auch bekannt, dass Aminosäuren in Anwesenheit von Zuckern und Hitze Verfärbung (Maillard Reaktion) zeigen. Diese Erklärung schien jedoch bei den untersuchten Aminosäuren als unwahrscheinlich, da keine Hinweise auf Kohlenhydrate gefunden wurden. Dazu zeigte die Behandlung derselben Aminosäuren mit trockener Hitze (160 °C, 2 h) oft keine Verfärbung. Die Vermutung, dass Metallverunreinigungen verantwortlich für die Verfärbungen sein könnten, konnte im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls nicht bestätigt werden. Die Verfärbung als reinen Oberflächeneffekt auf den Aminosäurekristallen zu erklären, scheint ebenfalls als unwahrscheinlich, da dies mit Auflichtspektroskopie nicht bestätigt werden konnte. Nach Verreibung der Kristalle blieb die Verfärbung zudem erhalten, was ebenfalls gegen einen reinen Oberflächeneffekt sprach. Es konnte nicht geklärt werden, was dieser Verfärbung letztlich zu Grunde lag. Es konnten lediglich einige mögliche Erklärungen ausgeschlossen werden. Bei den Untersuchungen konnte kein wesentlicher Unterschied im Verunreinigungsprofil zwischen e-- und γ-bestrahlten Aminosäuren gefunden werden. Referenzen 6. Referenzen 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Bernard R. Glick, J.J.P., Molekulare Biotechnologie. 1995, Heidelberg, Berlin, Oxford: Spektrum Akademischer Verlag GMBH. E. A. Belongia, C.W.H., G. J. Gleich,K. E. White, An investigation of the cause of the eosinophilia-myalgia syndrome associated with tryptophan use. New England Journal of medicine, 1990(325): p. 357-365. T. Simat, B.v.W., K. Eulitz, H. Steinhart, Contaminants in biotechnologically manufactured L-tryptophan. Journal of Chromatography B, 1996(685): p. 4151. Kopec, S. and U. Holzgrabe, Impurity Profile of Amino Acids? Pharmeuropa Scientific Notes, 2005(1). Novatchev, N. and U. Holzgrabe, Comparison of the Suitability of Capillary Electrophoresis and Thin-Layer Chromatography for Detection of Impurities in Amino Acids. 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Anhang Sprühreagenzien zur Detektion in der DC Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz Eine Mischung aus 85 ml Methanol und 10 ml Eisessig wurde unter Eiskühlung vorsichtig mit 8 ml konz. Schwefelsäure und 0.5 ml Anisaldehyd versetzt Die Platten wurden nach Entwicklung an der Luft trocknen gelassen, mit dem Reagenz besprüht und 15 min lang bei 125 °C erhitzt. Ninhydrin-Lösung R 0.2 g Ninhydrin wurden in 5 ml verdünnter Essigsäure R (3 g Essigsäure R in 25 ml Wasser R) und 95 ml 1-Butanol R gelöst. Die Platten wurden nach Entwicklung an der Luft trocknen gelassen, mit dem Reagenz besprüht und 15 min lang bei 105 °C erhitzt. Thymol-Sprühreagenz 0.5 mg Thymol wurden in 95 ml EtOH 94% gelöst und unter Eiskühlung 5ml Schwefelsäure 95% dazugegeben. Die Platten wurden nach Entwicklung an der Luft trocknen gelassen, mit dem Reagenz besprüht und 10 min lang bei 115 °C erhitzt. Vanilin-Schwefelsäure-Reagenz 0.5 g Vanillin wurden in 85 ml Methanol gelöst. Danach wurden 10 ml Essigsäure und vorsichtig 5 ml konzentrierte Schwefelsäure unter Eiskühlung zugegeben. Die Platten wurden nach Entwicklung an der Luft trocknen gelassen, mit dem Reagenz besprüht und 10 min lang bei 115 °C erhitzt. 4-(Dimethylamino)-zimtaldehyd-Salzsäure-Reagenz 0.5 g 4-(Dimethylamino)-zimtaldehyd wurden in 50 ml Salzsäure (5 mol/l) gelöst und mit Ethanol auf 100 ml aufgefüllt. Diese Lösung wurde anschliessend mit Ethanol 1 : 1 verdünnt. Die Platten wurden nach Entwicklung an der Luft trocknen gelassen, mit dem Reagenz besprüht und 10 min lang bei 110 °C erhitzt. Anhang Dünnschichtchromatographie von bestrahlten Aminosäuren L-Histidin Laufmittel 1 Ninhydrin R Nach e--Bestrahung trat ein zusätzlicher schwacher Fleck bei einem Rf von 0.22 auf. 1 Bahn 1 2- 4 5 6 7- 9 10 2 3 4 Substanz LSM L-His Referenz L-His γ-bestrahlt Blank L-His Referenz L-His e--bestrahlt Blank A A A A A A 5 6 Konzentration (mg/ml) 10 10 10 10 7 8 Volumen (µl) 12 12 12 12 12 12 9 RF-Wert 10 0.15 0.15 Menge (µg) 120 120 0.15 0.15 120 120 γ-bestrahltes L-His enthielt einen Fleck an derselben Stelle, aber dieser war noch schwächer. L-Isoleucin Laufmittel 1 Ninhydrin R Nach e-- und γBestrahung trat ein zusätzlicher schwacher Fleck bei einem Rf von 0.24 auf. 1 Bahn 1 2- 4 5 6 7- 9 10 2 3 Substanz L-Ile Referenz L-Ile γ-bestrahlt Blank L-Ile Referenz L-Ile e--bestrahlt Blank 4 LSM A A A A A A 5 6 Konzentration (mg/ml) 10 10 10 10 7 8 Volumen (µl) 12 12 12 12 12 12 9 RF-Wert 10 0.37 0.37 Menge (µg) 120 120 0.37 0.37 120 120 147 148 Anhang L-Leucin Laufmittel 1 Ninhydrin R Nach γ-Bestrahung trat ein zusätzlicher schwacher Fleck bei einem Rf-wert von 0.54 auf. 1 Bahn 1 2- 4 5 6 7- 9 10 2 3 4 Substanz LSM L-Leu Referenz L-Leu γ-bestrahlt Blank L-Leu Referenz L-Leu e--bestrahlt Blank A A A A A A 5 6 Konzentration (mg/ml) 10 10 10 10 7 8 Volumen (µl) 12 12 12 12 12 12 9 RF-Wert 10 0.42 0.42 Menge (µg) 120 120 0.42 0.42 120 120 Nach e--Bestrahung trat ein zusätzlicher schwacher Fleck bei einem Rf-Wert von 0.29 auf L-Lysin HCl Laufmittel 1 Ninhydrin R Nach e-- und γBestrahung traten 2 Flecken bei einem Rfwert von 0.27 und 0.4 auf. 1 Bahn 1 2- 4 5 6 7- 9 10 2 3 4 Substanz LSM L-Lys Referenz L-Lys γ-bestrahlt Blank L-Lys Referenz L-Lys e--bestrahlt Blank A A A A A A 5 6 Konzentration (mg/ml) 10 10 10 10 7 Volumen (µl) 12 12 12 12 12 12 8 9 RF-Wert Der Fleck bei Rf 0.4 war intensiver. 10 0.15 0.15 Menge (µg) 120 120 0.15 0.15 120 120 Anhang L-Methionin Laufmittel 1 Ninhydrin R Nach e-- und γBestrahung trat 1 Fleck bei einem Rfwert von 0.23 auf. 1 2 Bahn 1 2- 4 5 6 7- 9 10 3 4 Substanz LSM L-Met Referenz L-Met γ-bestrahlt Blank L-Met Referenz L-Met e--bestrahlt Blank A A A A A A 5 6 Konzentration (mg/ml) 10 10 10 10 7 8 Volumen (µl) 12 12 12 12 12 12 9 RF-Wert 10 0.35 0.35 Menge (µg) 120 120 0.35 0.35 120 120 L-Serin Laufmittel 1 Ninhydrin R Sowohl die unbehandelten als auch die bestrahlten Aminosäuren wiesen einen Starfleck auf. 1 Bahn 1 2- 4 5 6 7- 9 10 2 3 4 Substanz LSM L-Ser Referenz L-Ser γ-bestrahlt Blank L-Ser Referenz L-Ser e--bestrahlt Blank A A A A A A 5 6 Konzentration (mg/ml) 10 10 10 10 7 8 Volumen (µl) 12 12 12 12 12 12 9 RF-Wert 10 0.15 0.15 Menge (µg) 120 120 0.15 0.15 120 120 Zusätzlich zeigten die bestrahlten Aminosäuren einen Flecken bei einem Rf von 0.22. 149 150 Anhang FMOC Derivatisierungsschema von Aminosäuren Aminosäurestammlösung (10 nmol/µl) gelöst in Borpuffer (pH 8.5, 200 mM) FMOC-Cl Lösung (6 nmol/µl) 15.55 mg FMOC-Cl wurden in 10 ml ACN im Ultraschallbad (2 min) gelöst und gut gemischt. 1 : 10 Verdünnung mit Borpuffer (pH 8.5, 200 mM) Aminosäurelösung (1 nmol/µl) 200 µl 200 µl Derivatisierung: 200 µl der Aminosäurelösung wurden mit 200 µl FMOC-CLLösung mit dem Vortexmischer 2 min bei Raumtemperatur in einem HPLC-Glässchen gemischt (0.5 nmol/µl). Das Reaktionsgemisch wurde 2-mal mit 400 µl n-Pentan extrahiert. Der nPentanüberstand wurde verworfen. 25 µl Derivatisierte Aminosäurelösung (25 fmol/µl) Diese Lösung wurde für die Reinheitsprüfung verwendet Diese Lösungen verwendet wurden für die Reinheitsprüfung 100 µl Derivatisierte Aminosäurelösung (2.5 fmol/µl) 100 µl Derivatisierte Aminosäurelösung (0.25 fmol/µl) Diese Lösung wurde für den Gehaltsvergleich verwendet Diese Lösungen verwendet wurden für den Gehaltsvergleich Anhang Protokoll SPE 1. Konditionierung Die Säule (HLB Oasis®, 30 mg, Porengrösse 80 Å) wurde mit 3ml Acetonitril und 3 ml Phosphatpuffer pH 2.1 (10mM) gespült. 2. Extraktion 5 ml Probe (gelöst in Phosphatpuffer pH 2.1) wurden über die Extraktionssäule gegeben. Die so angereicherte Probe wurde anschliesend 1 ml Acetonitril in ein Eppendorf Röhrchen eluiert und dann in ein HPLC-Vial überführt. Die erhaltene Probelösung wurde danach mit der entwickelten HPLC-Methode (4.4.2.) analysiert. 151 152 Anhang Danksagung Ich möchte mich bei Herrn Prof. Altorfer für die Aufnahme in seine Forschungsgruppe bedanken und dafür, dass ich unter seiner Leitung eine Dissertation mit analytischem Thema absolvieren durfte. Die grosse Selbständigkeit, welche mir bei Planung und Durchführung der Experimente gewährt wurde, habe ich sehr geschätzt. Diese Arbeit wäre ohne die Unterstützung und Übernahme des Referats von Herrn Prof. Schubiger nicht zu Stande gekommen. Ich möchte mich für die Hilfestellungen und das Interesse an dieser Arbeit bedanken. Bei Herrn Prof. Schibli möchte ich mich für die Übernahme des Korreferats und die Begutachtung meiner Arbeit bedanken. Ein spezieller Dank gilt Frau Dr. Werner, welche ein Korreferat für diese Arbeit übernommen hat und mir stets mit Rat und Tat zur Seite stand. Bei Herrn Prof. Dr. D. Günther und S. Staub möchte ich mich für die Hilfe bei den ICP-MS Messungen bedanken. Bedanken möchte ich mich auch bei S. Stocker, M. Bürzle und M. Tomic, die mir durch ihre Diplom- und Semesterarbeit eine grosse Unterstützung in diesem Projekt waren. Bei meinen Arbeitskollegen möchte ich mich für die gute Arbeitsatmosphäre und die schönen Zeiten bedanken, welche wir während dieser Zeit erleben durften. Ein spezieller Dank gebührt Francine Gilardi, die immer ein offenes Ohr für mich hatte und mir bei vielen analytischen Problemen weitergeholfen hat. Eva Caronni betreute schon meine Semesterarbeit als Student und viele der verwendeten Analysemethoden habe ich durch sie erst kennengelernt. Dafür möchte ich mich bedanken. Claudia Schatzmann war meine Arbeitsplatznachbarin und konnte ihre Doktorarbeit leider nicht mehr vollenden. Ich möchte mich trotzdem bei ihr für ihre stete Hilfsbereitschaft und Freundschaft bedanken. Bei R. Alder, D. Lüthi, T. Baumann und M. Chatfield möchte ich mich für die Hilfe an Geräten und die Hilfe bei den unterschiedlichsten Messungen bedanken. Ich möchte mich an dieser Stelle auch bei meinen Eltern und meiner Freundin bedanken, welche mich immer vorbehaltslos unterstützt haben. Anhang Lebenslauf Name: Künzle Urs Geburtsdatum: 26.09.1970 Bürgerort: Waldkirch SG Zivilstand: ledig Ausbildung 04.2004 – 09.2008 Doktorand und Assistent Institut für Pharmazeutische Analytik ETHZ 10.1998 - 10.2003 Pharmazie, Apotheker ETH ZH 10.1995 - 10.1997 Biologie 1.Vordiplom Universität ZH 03.1992 - 03.1995 eidg. Matura, 2.Weg AKAD SG 04.1987 - 03.1991 Berufslehre Mechaniker und Berufsmittelschule Spühl AG SG 153
