Kohlehydrate - Ruhr-Universität Bochum
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81 BIO OCHEMIE E DER KO OHLENH HYDRATE E Gege enstand die eses Praktiikumstagess ist die Biochemie der Kohlenhhydrate. Da azu werden n zwei Experimen nte durchgefführt: E Enzymatisc che Hydroly yse von Di saccharide en In die esem Versu uch werden n unterschie edliche Disa accharide mit m Hilfe versschiedener Enzyme in n die entspreche enden monomeren Zu ucker gesp palten. Ans schließend wird mit Hilfe einerr Zucker eine Aldehyd-Fehliing-Reaktio on untersuc cht, welche der entsta andenen mo onomeren Z Grup ppe enthalte en, die zu einer Carboxxyl-Gruppe oxidiert werden kann. E Experimentt mit dem Enzym E Glyk kogen-Pho osphorylase: In diiesem Expe eriment rea agiert Glyko ogen in Gegenwart der d Glykogeen-Phospho orylase mitt Gluccose-1-phossphat. Dabei wird die e Phospha at-Gruppe vom v Glucoose-1-phosp phat abge-spaltten und die e Glucose wird w in das Glykogen-M Molekül eingebaut. (Diie Reaktion n läuft unterr physsiologischen n Bedingung gen in der u umgekehrte en Richtung g ab: Das E Experiment zeigt, dasss eine biochemiscche Reaktio on unter gee eigneten Be edingungen ihre Richtuung ändern kann.) D der experim e Das begleitende Seminar soll nicht nur der Diskussion mentellen Ergebnisse diene en, sondern n auch eine e Gelegenh heit bieten, einige elem mentare Grrundlagen der d Zucker-chem mie in Erinnerung zu ru ufen. Mitzub bringen siind Kittel und Tasch henrechneer BIOC CHEMISCHE GRUNDLAGE EN Alle Zucker besstehen aus einem Koh hlenstoffgru undgerüst, Hydroxyl- uund Carbon nylgruppen.. Die P Position der Carbonylg gruppen en tscheidet darüber, ob es sich beii dem Zuck ker um eine e Aldo ose (Carbo onylgruppe endständig g) oder eiine Ketose e (Carbonyylgruppe am a zweiten n Kohle enstoffatom m) handelt. Fructose D-F D-Gluc cose L-Glucosee (ein ne Ketose) (eine Aldose) A (eine Aldoose) 82 Die Einordnung, ob ess sich um eine e D- ode r L-Konfigu uration han ndelt, geschhieht anhan nd der Fischer-Prrojektion. Dabei D wird das d Molekü ül von obe en nach unten notiert,, wobei das am höchsten o oxidierte C--Atom oben n steht. Mit der Angab be D und L wird die K Konfiguration n des am höchstten priorisie erten Rests s des unte rsten Stere eozentrums angegebeen (hier die e OHGruppe > H H, am C-Ato om Nr. 5). Dabei D steht D für „dexter“ (rechts) und L für „llaevus“ (link ks): ← Das unte erste Stereozzentrum ist in diesem m Fall das C C-Atom 5. Die OH-Gruppe zeiggt nach rechts s, somit istt D-Konfiguraation gegebe en. Physiologissch haben meist nur Zucker Z in de er D-Konfigu uration Bedeutung (z.B B. D-Glucos se, DD-Galactosse). Eine Au Fructose, D usnahme biildet die L-F Fucose, die e in den Bluutgruppenantigenen des AB B0- System ms enthalten n ist. Bildung eines Halba acetals: In wässriger w L Lösung liegt die offenk kettige Form m der Zucke er nur zu einem g geringen Prrozentsatz vor. v Der grö ößte Teil liegt dagegen n in Ringform m vor. Der Ringschluss erffolgt im Fall der D-Glucose durch h Angriff des s Sauerstofffatoms derr Hydroxylgrruppe von C-Atom m 5 an dem m partiell po ositiv gelad denen C-Ato om der Carrbonylgrupppe an Positiion 1. Dadurch entsteht ein Halbacetal.. Das C-Ato om 1 wird alls anomeres s C-Atom bbezeichnet: acetal-Form m und der R Ringschluß sind revers sibel. Gelöstt in Wasserr liegt Die Bildung der Halba m chemischen Gleichge ewicht zu e twa 0,25% in der offen nkettigen Alddol-Form vo or. Glucose im Disaccharride entste ehen durch h Bildung e einer glyko osidischen Bindung zzwischen MonoM saccharide en. Dabei entsteht e eine Bindung zwischen dem d anome eren Kohlennstoffatom eines Zuckers m mit einem we eiteren Zuckermolekül.. Die Stellun ng des Sau uerstoffatom ms am anom meren Kohlenstofffatom wird durch den griechische g en Buchstab ben bzw. angegebeen. 83 3 uzierende Zucker Z zeic chnen sich dadurch au us, dass sie e über eine freie Aldeh hydgruppe e Redu verfü ügen bzw. in der Lage sind, durc h Ringöffnu ung eine fre eie Aldehyddgruppe zu bilden. Die e Aldehydgruppe kann leichtt zu einer C Carboxylgru uppe oxidie ert werden. Der Zucker hat dabeii reduzzierende Eiigenschafte en, denn er reduziert da as Oxidationsmittel. Beisp piele für Zu ucker mit reduzierend r den Eigenschaften sin nd die Monnosaccharide Glucose,, Fructtose und Galactose G (G Gleichgewiccht in wässrriger Lösung mit der ooffenkettigen n Form, beii Fructtose gefolgt von einerr Keto-Enol--Tautomerie e), aber auch die Disaaccharide Lactose und d Malto ose. Bei die esen Disacc chariden ha andelt es sich um Halb bacetale, diee in wässrig ger Lösung g eben nfalls im Gleichgewic G cht mit ein ner offenke ettigen Forrm vorliegeen. Die Öffnung derr Halbacetalbindu ung und die e damit ve erbundene Bildung der Aldehydggruppe ist hier h für die e Malto ose gezeigtt: Rin ngöffnung vo on Maltose nicht-reduzierender Zucker ist niccht in der La age, eine fre eie Aldehyddgruppe zu bilden. Ein n Ein n Beisp piel dafür ist i das Dis saccharid S Saccharose. Dieser Zu ucker ist chhemisch ge esehen ein n Volla acetal, welches im basiischen bzw . neutralen Milieu stabil vorliegt. Saccharoose In de er Saccharrose sind -D-Glucos se und -D D-Fructose über eine -1,2-gly ykosidische e Bindung aneina ander geko oppelt. And ders als be ei der Maltose ist ei ne Ringöfffnung nichtt mögllich, es kann sich keine e Aldehydg ruppe bilde en (→ Keine e reduzierennden Eigens schaften). 84 Fehling-Prrobe Anhand de er Fehling-P Probe könne en reduzierrende Zucke er nachgew wiesen werdden. Die FehlingProbe wurrde von dem m Chemikerr Hermann Christian Fehling F im Jahr J 1848 eentwickelt. In der Nachweis--Lösung lieg gen Cu(II)-Ionen durcch Tartrat komplexiert k vor. (Tartra rat ist das Anion A der Weinssäure, eine er Dicarbonsäure.) Die e Komplexierung hältt die Cu(II))-Ionen sta abil in Lösung. W Wird ein red duzierender Zucker h hinzugefügt,, erfolgt be ei Erwärmu ng eine Re edoxreaktion, d die mehrere e Schritte umfasst. D Dabei wird die Aldeh hydgruppe der jeweiiligen Zucker zu ur Carboxyllgruppe ox xidiert. Die bei der Oxidation anfa allenden Eleektronen we erden letztlich vo on den Kupfferionen auffgenommen n: 1. Oxidation: Die Aldehydgrupp A pe des Zuckkers wird durc ch OH--Ionen n zur Carbonnsäure oxidie ert. 2. Red duktion: Die Cu(II)-Ionen werden zu C Cu(I) reduzie ert. Das entste ehende Kup pfer(I)-oxid ist unlöslich h und bilde et einen rotb braunen Nieederschlag. Das Kupfer(I)-o oxid entsteh ht nur bei einer e Reaktiion mit redu uzierenden Zuckern, aalso mit Zuckern wie Glucosse oder Malltose. Mit Sa accharose kann die Re eaktion nich ht ablaufen.. Die Reaktion wurde zeitweise z zu ur quantitativven Bestim mmung von Glucose G veerwendet un nd zur Diagnose vvon Diabete es mellitus eingesetzt. e Glykogen und die Glykogen-Ph hosphoryla ase Z eine leicht mobiilisierbare Speicherform S m der Glucoose. Ähnlic ch wie Glykogen ist in den Zellen in der Maltose sind im Glykoge en die Gluccose-Einheiten über -1→4-glyk kosidische Bindungen m miteinander verbunden.. Die Verzw weigungsste ellen des Glykogens e nthalten -1→6glykosidiscche Bindung gen. Große Mengen an n Glykogen sind insbes sondere in dder Leber und u in der Skeletttmuskulaturr gespeiche ert. Am Abbau u des Glykkogens sind d mehrere Enzyme beteiligt, b am m wichtigsteen ist dabe ei die Aktivität de er Glykoge en-Phosphorylase. D Das Enzym katalysiert keine Hydrrolyse (!) der d 1→4-glyko osidische Bindungen, sondern s ein ne Reaktion n mit freien Phosphaationen. Es s liegt also keine Hydrolyse vor, sonderrn eine Pho osphorolys se. Aus dies sem Grund wird das Enzym auch als G Glykogen-Ph hosphorylas se bezeichn net. Als Abb bauprodukt entsteht daabei Gluco ose-1phosphat.. Zu beachtten ist dabei: An der Re eaktion der Glykogen-Phosphoryllase ist kein n ATP beteiligt! D Das für die e Reaktion benötigte anorganisc che Phosph hat stammtt nicht aus ATP sondern au us dem Gem misch der verschieden v nen Salzione en in der Ze elle. Die Glykog gen-Phosph horylase kattalysiert som mit die folge ende Reaktion: (Glyykogen)n + Pa (Glykogen)n-1 + Gluco ose-1-phospphat 85 Die Reaktion kann grundsätzlich in beide Richtungen ablaufen, sie ist reversibel. In vitro (also "im Reagenzglas") liegt das Gleichgewicht der Reaktion sogar auf der Seite des Glykogens. Es bildet sich also leichter das Glykogen als das Glucose-1-phosphat. In den Zellen, in vivo, wird das entstehende Glucose-1-phosphat aber sehr schnell in den Stoffwechsel einbezogen. (Es wird zu Glucose-6-phosphat isomerisiert.) Die Konzentration an Glucose-1-phosphat ist in den Zellen deshalb stets sehr gering, und aus diesem Grund wird in den Zellen von der Glykogen-Phosphorylase primär der Abbau des Glykogens katalysiert. Die Glykogen-Phosphorylase ist ein dimeres Enzym, das aus zwei identischen Monomeren aufgebaut ist. Jede Untereinheit enthält 841 Aminosäuren. Die Aktivität des Enzyms wird durch reversible Phosphorylierung gesteuert, also durch Interkonversion. Die Phosphorylierung wird von dem Enzym Phosphorylase-Kinase katalysiert. Es phosphoryliert das Serin in Position 14 der Aminosäuresequenz der beiden Untereinheiten. Durch diese Phosphorylierung wird die inaktive Phosphorylase b in die aktive Phosphorylase a überführt: Die Inaktivierung, d.h. die Überführung der Phosphorylase a in die Phosphorylase b, wird durch die Phosphorylase-Phosphatase katalysiert, wobei der Phosphatrest hydrolytisch abgespalten wird. Neben dieser kovalenten Modifikation gibt es weitere Möglichkeiten, die Enzymaktivität zu beeinflussen. So kann AMP (Adenosin-5'-monophosphat) an das Enzym binden und es dadurch aktivieren. In diesem Fall liegt keine Interkonversion vor, sondern eine allosterische Aktivierung. Bindung des AMP führt im Enzym zu Konformationsänderungen, die mit einer gesteigerten Umsatzgeschwindigkeit in den aktiven Zentren des Enzyms verbunden sind. Die Glykogen-Phosphorylase liegt gewebespezifisch in drei unterschiedlichen Isoformen vor. Im Praktikum wird eine Isoform verwendet, die aus Skelettmuskel (des Kaninchens) isoliert wurde. Alle Isoformen enthalten Pyridoxalphosphat (PALP). Dieses ist im Reaktionszyklus der Glykogen-Phosphorylase lediglich an der Übertragung eines H+ beteiligt. Anders als in vielen anderen Enzymen, hat es in diesem Fall keinen Bezug zum Aminosäurestoffwechsel. 86 DIE EXPERIMENTE 1. Enzymatische Spaltung der Disaccharide Lactose, Maltose und Saccharose Zum biochemischen Hintergrund: Neben Polysacchariden enthält die Nahrung auch Monosaccharide und Disaccharide. Wichtige Beispiele für solche Disaccharide sind Lactose (Milchzucker), Maltose (Abbauprodukt der Stärke) und Saccharose (Haushaltszucker). Um vom Körper aufgenommen zu werden, müssen Disaccharide zunächst extrazellulär zu Monosacchariden hydrolysiert werden. Diese Aufgabe übernehmen Enzyme aus der Gruppe der Glycosidasen, welche in den Mikrovilli der Dünndarmschleimhaut verankert sind. Beispiele für solche Enzyme sind die Saccharase-Isomaltase (aus der Gruppe der Invertasen, sie spalten Saccharose) und die β-Galactosidase (Lactase, spaltet Lactose). In diesem Versuch wird zudem eine α-Amylase zur Spaltung von Maltose verwendet. αAmylasen werden in den menschlichen Speicheldrüsen und in der Bauchspeicheldrüse gebildet. 1. Teil: Enzymreaktion Dieser Versuchsteil besteht aus drei parallel durchgeführten Enzymreaktionen. Diese werden in 1,5ml-Plastikgefäßen („Eppis“) nach folgendem Pipettierschema angesetzt. Anschließend erfolgt die enzymatische Reaktion für 20 Minuten bei der unter dem jeweiligen Pipettierschema angegebenen Temperatur. Ansatz A Ansatz B Maltose (100 mg/ml) 800 µl Lactose (50 mg/ml) 800 µl 0,1M Phosphatpuffer 200 µl 0,1M Phosphatpuffer 200 µl 33 mM NaCl 33 mM NaCl pH=6,9 pH=7,3 Amylase 25 µl 20 min, Raumtemperatur 20 min, 37°C (Wasserbad) Ansatz C Saccharose (100 mg/ml) 800 µl 0,1M NaAcetatpuffer 200 µl pH=4,5 Invertase 20 min, 55°C (Heizblock) β-Galactosidase 25 µl 25 µl 87 2. Teil: Fehling-Nachweis der Zucker mit reduzierenden Eigenschaften Dieser Versuchsteil wird nach folgendem Pipettierschema in Plastikreagenzgläsern angesetzt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Wasser 1 ml - - - - - - Maltose - 1 ml - - - - - Lactose - - 1 ml - - - - Saccharose - - - 1 ml - - - D-Fructose - - - - 1ml - - - Glycogen - - - - - 0.1ml - - Ansatz A - - - - - - Ansatz B - - - - - 1 ml - Ansatz C - - - - - - 1 ml Fehling- 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml (100mg/ml) 1ml 4ml 4 ml 4ml reagenz Die Reagenzgläser werden anschließend für 15 Minuten bei 60°C im Heizblock inkubiert. Die Müllentsorgung erfolgt im Schwermetallabfall! (Das Fehling-Reagenz enthält u.a. Kupferionen.) Qualitative Auswertung Farbe der 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Wasser Maltose Lactose Saccharose D-Fructose Glykogen Ansatz Ansatz Ansatz C A Maltose B Lactose Saccharose Probe blau rot Eine rote Farbe verweist auf eine Bildung von Kupfer(I)-oxid und damit auf eine Reduktion der Cu2+-Ionen des Fehling-Reagenz zu Cu1+. Die Kupferionen haben in diesen Fällen die Elektronen aufgenommen, die bei der Oxidation der Aldehydgruppen der jeweiligen Zucker zu Carboxylgruppen angefallen sind. 88 2. Vergleich der enzymatischen Aktivität der Formen an und b der GlykogenPhosphorylase In diesem Experiment wird Glykogen in Gegenwart der Glykogen-Phosphorylase mit Glucose-1-phosphat inkubiert. Da Glucose-1-phosphat unter den gewählten experimentellen Bedingungen in einer vergleichsweise hohen Konzentration eingesetzt wird, läuft die enzymkatalysierte Reaktion in Richtung der Glykogensynthese ab. (Unter physiologischen Bedingungen katalysiert das Enzym den Glykogenabbau!) Bei der Reaktion wird das Glucose-1-phosphat gespalten: Die Glucose wird in das Glykogenmolekül eingebaut, das Phosphat wird freigesetzt. Das Phosphat wird dann mit Hilfe einer einfachen Reaktion nachgewiesen (Bildung von Molybdänblau). Das Experiment zeigt, dass die Aktivität der Glykogen-Phosphorylase von zwei Faktoren abhängig ist: Interkonvertierung: Die Phosphorylase a (die phosphorylierte Form des Enzyms) ist aktiver als die Phosphorylase b (die dephosphorylierte Form des Enzyms). Allosterische Aktivierung: Die Aktivität der Phosphorylase b kann durch AMP gesteigert werden. (Die Aktivität der ohnehin aktiven Phosphorylase a wird durch AMP kaum beeinflusst.) Pipettierschema: Die Proben für die Enzymreaktion werden in 4 Eppi-Gefäße (1.5 ml-Gefäße) pipettiert: Phosphorylase a Phosphorylase b -AMP +AMP -AMP +AMP Beschriftung 1 2 3 4 AMP (µl) − 100 − 100 Wasser (µl) 200 100 200 100 Glykogen (µl) 100 100 100 100 Phosphorylase (µl) 100 100 100 100 Die Ansätze werden 5 Min. bei 30°C im Wasserbad inkubiert. Glucose1-Phosphat (µl) 100 100 100 100 Die Ansätze werden genau (!) 10 Min. bei 30°C im Wasserbad inkubiert. TCA (µl) 500 500 500 500 89 Sicherheitshinweis: TCA (= Trichloressigsäure) kann die Haut verätzen. Bei Benetzung der Haut oder der Augen ist die TCA sofort mit Wasser abzuspülen. Um eine eventuelle Phosphatverunreinigung in den Ansätzen berücksichtigen zu können, werden während der Inkubationszeit die zwei Leerwerte (LW A und LW B, ebenfalls im Reaktionsgefäß) hergestellt. Wichtig ist in diesem Fall, dass Substrate und Effektoren erst nach der Trichloressigsäure (TCA)-Zugabe zu dem Enzym pipettiert werden, so dass keine enzymatische Reaktion ablaufen kann. Die Leerwerte brauchen nicht inkubiert werden. Wichtig: Die Reihenfolge des Pipettierschemas ist genau einzuhalten! Beschriftung LW A LW B Phosphorylase a bzw. b (µl) 100 100 TCA (µl) 500 500 AMP (µl) 100 100 Wasser (µl) 100 100 Glykogen (µl) 100 100 Glucose-1-phosphat (µl) 100 100 Die 4 Reaktionsansätze und die beiden Leerwerte werden zusammen für 10 min bei 2000 rpm zentrifugiert, um das durch TCA denaturierte und präzipitierte Protein abzutrennen. ACHTUNG: Der Zentrifugenrotor ist auf beiden Seiten mit der gleichen Anzahl an Reaktionsgefäßen zu bestücken (3 links und 3 rechts)! Während der Zentrifugation 6 Reagenzgläser beschriften und für die Phosphatbestimmung vorbereiten: Wasser 1,8 ml NH4+-Molybdat 2,0 ml Reduktionslösung ANSA 0,2 ml Nach der Zentrifugation werden jeweils 0,5 ml des Überstandes in die Reagenzgläser pipettiert und vorsichtig durch Schwenken gemischt. 10 min. bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend wird zu jeder Probe 1ml 2,9 M NaAcetat-Lösung gegeben. Aus allen Reagenzgläsern werden ca. 3 ml der Ansätze in Küvetten gefüllt (vorsichtig schütten, Küvettenvolumen beträgt 4 ml) und die Extinktion bei 720 nm bestimmt. 90 Zuerst Photometer mit dem Leerwert A eichen, dann die restlichen Proben für Phosphorylase a messen. Anschließend analog das Photometer mit dem Leerwert B eichen und die Phosphorylase bProben messen. Übersichtstabelle der zu berechnenden Daten: Probe Gemessene nMol Enzymaktivität Relative Spezifische Extinktion Phosphat Volumenaktivität Aktivität Aktivität nMol Phosphat x 0.002 % µmol x min-1 x mg-1 720nm pro Ansatz (Phosphat- µmol x min1 x ml-1 Eichkurve) Phosphorylase A - AMP Phosphorylase A + AMP Phosphorylase B - AMP Phosphorylase B + AMP AUSWERTUNG -1 -1 Berechnen Sie die Phosphorylase a und b Aktivitäten (µmol · min · ml ) anhand der Eichkurve und anschließend stellen Sie Ihre Ergebnisse auf Millimeterpapier in Säulendiagrammen dar. Nehmen Sie die Aktivität der Phosphorylase b (Reagenzglas 4) in Gegenwart von AMP und die der Phosphorylase a (Reagenzglas 1) ohne AMP als 100% und geben Sie die beiden anderen Aktivitäten als relative Aktivitäten (in %) an. In Kenntnis der Proteinkonzentration der beiden Phosphorylasen (ausgehängte Legende und Skript) berechnen Sie die entsprechenden spezifischen Aktivitäten. Proteinkonzentration: Phosphorylase A 35µg/ml Phosphorylase B 25µg/ml 91 Berechnung der Enzymaktivität: Bei der Aktivitätsmessung wird 100 µl Enzym eingesetzt, die Aktivität wird auf 1 ml Enzymlösung bezogen, deswegen Für die Phosphatbestimmung wird nur die Hälfte des Ansatzes genommen Die Inkubation dauert 10 min, aber die Aktivität wird pro Minute berechnet Die Aktivität wird auf µmol berechnet d.h.: nmol Phosphat x 10 x 2 x 1/10 x 1/1000 = nmol Phosphat x 0,002 → Enzymaktivität in µmol x min1 x ml-1 x 10 x2 x 1/10 x 1/1000 92 Spezifische Aktivität: Volumenaktivität in µmol x min-1 x ml-1 dividiert durch die Proteinkonzentration in mg x ml-1 → Spezifische Aktivität der Phosphorylase in µmol x min-1 x mg-1 Phosphat-Eichkurve 0,8 0,7 Extiktionsdifferenz bei 720 nm 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 100 200 300 400 500 600 nm ol Phosphat/Ansatz 700 800 900 1000
