biochemie der kohlenhydrate - Ruhr

75
BIOCHEMIE DER KOHLENHYDRATE
Gegenstand dieses Praktikumstages ist die Biochemie der Kohlenhydrate. Dazu werden
zwei Experimente durchgeführt:

Enzymatische Hydrolyse von Disacchariden
In diesem Versuch werden unterschiedliche Disaccharide mit Hilfe verschiedener Enzyme in
die entsprechenden monomeren Zucker gespalten. Anschließend wird mit Hilfe einer
Fehling-Reaktion untersucht, welche der entstandenen monomeren Zucker eine AldehydGruppe enthalten, die zu einer Carboxyl-Gruppe oxidiert werden kann.

Experiment mit dem Enzym Glykogen-Phosphorylase:
In diesem Experiment reagiert Glykogen in Gegenwart der Glykogen-Phosphorylase mit
Glucose-1-phosphat. Dabei wird die Phosphat-Gruppe vom Glucose-1-phosphat abgespalten und die Glucose wird in das Glykogen-Molekül eingebaut. (Die Reaktion läuft unter
physiologischen Bedingungen in der umgekehrten Richtung ab: Das Experiment zeigt, dass
eine biochemische Reaktion unter geeigneten Bedingungen ihre Richtung ändern kann.)
Das begleitende Seminar soll nicht nur der Diskussion der experimentellen Ergebnisse
dienen, sondern auch eine Gelegenheit bieten, einige elementare Grundlagen der Zuckerchemie in Erinnerung zu rufen.
Mitzubringen sind Kittel und Taschenrechner
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
Alle Zucker bestehen aus einem Kohlenstoffgrundgerüst, Hydroxyl- und Carbonylgruppen.
Die Position der Carbonylgruppen entscheidet darüber, ob es sich bei dem Zucker um eine
Aldose (Carbonylgruppe endständig) oder eine Ketose (Carbonylgruppe am zweiten
Kohlenstoffatom) handelt.
D-Fructose
(eine Ketose)
D-Glucose
(eine Aldose)
L-Glucose
(eine Aldose)
76
Die Einordnung, ob es sich um eine D- oder L-Konfiguration handelt, geschieht anhand der
Fischer-Projektion. Dabei wird das Molekül von oben nach unten notiert, wobei das am
höchsten oxidierte C-Atom oben steht. Mit der Angabe D und L wird die Konfiguration des
am höchsten priorisierten Rests des untersten Stereozentrums angegeben (hier die OHGruppe > H, am C-Atom Nr. 5). Dabei steht D für „dexter“ (rechts) und L für „laevus“ (links):
←
Das unterste Stereozentrum ist
in diesem Fall das C-Atom 5.
Die OH-Gruppe zeigt nach rechts,
somit ist D-Konfiguration gegeben.
Physiologisch haben meist nur Zucker in der D-Konfiguration Bedeutung (z.B. D-Glucose, DFructose, D-Galactose). Eine Ausnahme bildet die L-Fructose, die in den Blutgruppenantigenen des AB0- Systems enthalten ist.
Bildung eines Halbacetals: In wässriger Lösung liegt die offenkettige Form der Zucker nur
zu einem geringen Prozentsatz vor. Der größte Teil liegt dagegen in Ringform vor. Der Ringschluss erfolgt im Fall der D-Glucose durch Angriff des Sauerstoffatoms der Hydroxylgruppe
von C-Atom 5 an dem partiell positiv geladenen C-Atom der Carbonylgruppe an Position 1.
Dadurch entsteht ein Halbacetal. Das C-Atom 1 wird als anomeres C-Atom bezeichnet:
Die Bildung der Halbacetal-Form und der Ringschluß sind reversibel. Gelöst in Wasser liegt
Glucose im chemischen Gleichgewicht zu etwa 0,25% in der offenkettigen Aldol-Form vor.
Disaccharide entstehen durch Bildung einer glykosidischen Bindung zwischen Monosacchariden. Dabei entsteht eine Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoffatom eines
Zuckers mit einem weiteren Zuckermolekül. Die Stellung des Sauerstoffatoms am anomeren
Kohlenstoffatom wird durch den griechischen Buchstaben  bzw.  angegeben.
77
Reduzierende Zucker zeichnen sich dadurch aus, dass sie über eine freie Aldehydgruppe
verfügen bzw. in der Lage sind, durch Ringöffnung eine freie Aldehydgruppe zu bilden. Die
Aldehydgruppe kann leicht zu einer Carboxylgruppe oxidiert werden. Der Zucker hat dabei
reduzierende Eigenschaften, denn er reduziert das Oxidationsmittel.
Beispiele für Zucker mit reduzierenden Eigenschaften sind die Monosaccharide Glucose,
Fructose und Galactose (Gleichgewicht in wässriger Lösung mit der offenkettigen Form, bei
Fructose gefolgt von einer Keto-Enol-Tautomerie), aber auch die Disaccharide Lactose und
Maltose. Bei diesen Disacchariden handelt es sich um Halbacetale, die in wässriger Lösung
ebenfalls im Gleichgewicht mit einer offenkettigen Form vorliegen. Die Öffnung der
Halbacetalbindung und die damit verbundene Bildung der Aldehydgruppe ist hier für die
Maltose gezeigt:
Ringöffnung von Maltose
Ein nicht-reduzierender Zucker ist nicht in der Lage, eine freie Aldehydgruppe zu bilden. Ein
Beispiel dafür ist das Disaccharid Saccharose. Dieser Zucker ist chemisch gesehen ein
Vollacetal, welches im basischen bzw. neutralen Milieu stabil vorliegt.
Saccharose
In der Saccharose sind -D-Glucose und -D-Fructose über eine -1,2-glykosidische
Bindung aneinander gekoppelt. Anders als bei der Maltose ist eine Ringöffnung nicht
möglich, es kann sich keine Aldehydgruppe bilden (→ Keine reduzierenden Eigenschaften).
78
FEHLING-PROBE
Anhand der Fehling-Probe können reduzierende Zucker nachgewiesen werden. Die FehlingProbe wurde von dem Chemiker Hermann Christian Fehling im Jahr 1848 entwickelt. In der
Nachweis-Lösung liegen Cu(II)-Ionen durch Tartrat komplexiert vor. (Tartrat ist das Anion
der Weinsäure, einer Dicarbonsäure.) Die Komplexierung hält die Cu(II)-Ionen stabil in
Lösung. Wird ein reduzierender Zucker hinzugefügt, erfolgt bei Erwärmung eine Redoxreaktion, die mehrere Schritte umfasst. Dabei wird die Aldehydgruppe der jeweiligen
Zucker zur Carboxylgruppe oxidiert. Die bei der Oxidation anfallenden Elektronen werden
letztlich von den Kupferionen aufgenommen:
1. Oxidation: Die Aldehydgruppe des Zuckers wird durch OH‐‐Ionen zur Carbonsäure oxidiert. 2. Reduktion: Die Cu(II)‐Ionen werden zu Cu(I) reduziert. Das entstehende Kupfer(I)-oxid ist unlöslich und bildet einen rotbraunen Niederschlag. Das
Kupfer(I)-oxid entsteht nur bei einer Reaktion mit reduzierenden Zuckern, also mit Zuckern
wie Glucose oder Maltose. Mit Saccharose kann die Reaktion nicht ablaufen.
Die Reaktion wurde zeitweise zur quantitativen Bestimmung von Glucose verwendet und zur
Diagnose von Diabetes mellitus eingesetzt.
GLYKOGEN UND DIE GLYKOGEN-PHOSPHORYLASE
Glykogen ist in den Zellen eine leicht mobilisierbare Speicherform der Glucose. Ähnlich wie
in der Maltose sind im Glykogen die Glucose-Einheiten über -1→4-glykosidische Bindungen miteinander verbunden. Die Verzweigungsstellen des Glykogens enthalten -1→6glykosidische Bindungen. Große Mengen an Glykogen sind insbesondere in der Leber und in
der Skelettmuskulatur gespeichert.
Am Abbau des Glykogens sind mehrere Enzyme beteiligt, am wichtigsten ist dabei die
Aktivität der Glykogen-Phosphorylase. Das Enzym katalysiert keine Hydrolyse (!) der 1→4-glykosidische Bindungen, sondern eine Reaktion mit freien Phosphationen. Es liegt
also keine Hydrolyse vor, sondern eine Phosphorolyse. Aus diesem Grund wird das Enzym
auch als Glykogen-Phosphorylase bezeichnet. Als Abbauprodukt entsteht dabei Glucose-1phosphat. Zu beachten ist dabei: An der Reaktion der Glykogen-Phosphorylase ist kein ATP
beteiligt! Das für die Reaktion benötigte anorganische Phosphat stammt nicht aus ATP
sondern aus dem Gemisch der verschiedenen Salzionen in der Zelle.
79
Die Glykogen-Phosphorylase katalysiert somit die folgende Reaktion:
(Glykogen)n + Pa
(Glykogen)n-1 + Glucose-1-phosphat
Die Reaktion kann grundsätzlich in beide Richtungen ablaufen, sie ist reversibel. In vitro
(also "im Reagenzglas") liegt das Gleichgewicht der Reaktion sogar auf der Seite des
Glykogens. Es bildet sich also leichter das Glykogen als das Glucose-1-phosphat. In den
Zellen, in vivo, wird das entstehende Glucose-1-phosphat aber sehr schnell in den Stoffwechsel einbezogen. (Es wird zu Glucose-6-phosphat isomerisiert.) Die Konzentration an
Glucose-1-phosphat ist in den Zellen deshalb stets sehr gering, und aus diesem Grund wird
in den Zellen von der Glykogen-Phosphorylase primär der Abbau des Glykogens katalysiert.
Die Glykogen-Phosphorylase ist ein dimeres Enzym, das aus zwei identischen Monomeren
aufgebaut ist. Jede Untereinheit enthält 841 Aminosäuren. Die Aktivität des Enzyms wird
durch reversible Phosphorylierung gesteuert, also durch Interkonversion. Die Phosphorylierung wird von dem Enzym Phosphorylase-Kinase katalysiert. Es phosphoryliert das
Serin in Position 14 der Aminosäuresequenz der beiden Untereinheiten. Durch diese Phosphorylierung wird die inaktive Phosphorylase b in die aktive Phosphorylase a überführt:
Die Inaktivierung, d.h. die Überführung der Phosphorylase a in die Phosphorylase b, wird
durch die Phosphorylase-Phosphatase katalysiert, wobei der Phosphatrest hydrolytisch
abgespalten wird.
Neben dieser kovalenten Modifikation gibt es weitere Möglichkeiten, die Enzymaktivität zu
beeinflussen. So kann AMP (Adenosin-5'-monophosphat) an das Enzym binden und es
dadurch aktivieren. In diesem Fall liegt keine Interkonversion vor, sondern eine allosterische Aktivierung. Bindung des AMP führt im Enzym zu Konformationsänderungen, die
mit einer gesteigerten Umsatzgeschwindigkeit in den aktiven Zentren des Enzyms verbunden sind.
Die Glykogen-Phosphorylase liegt gewebespezifisch in drei unterschiedlichen Isoformen vor.
Im Praktikum wird eine Isoform verwendet, die aus Skelettmuskel (des Kaninchens) isoliert
wurde. Alle Isoformen enthalten Pyridoxalphosphat (PALP). Dieses ist im Reaktionszyklus
der Glykogen-Phosphorylase lediglich an der Übertragung eines H+ beteiligt. Anders als in
vielen anderen Enzymen, hat es in diesem Fall keinen Bezug zum Aminosäurestoffwechsel.
80
ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
1. Enzymatische Spaltung der Disaccharide Lactose, Maltose und Saccharose
Zum biochemischen Hintergrund: Neben Polysacchariden enthält die Nahrung auch
Monosaccharide und Disaccharide. Wichtige Beispiele für solche Disaccharide sind Lactose
(Milchzucker), Maltose (Abbauprodukt der Stärke) und Saccharose (Haushaltszucker). Um
vom Körper aufgenommen zu werden, müssen Disaccharide zunächst extrazellulär zu
Monosacchariden hydrolysiert werden. Diese Aufgabe übernehmen Enzyme aus der Gruppe
der Glycosidasen, welche in den Mikrovilli der Dünndarmschleimhaut verankert sind.
Beispiele für solche Enzyme sind die Saccharase-Isomaltase (aus der Gruppe der
Invertasen, sie spalten Saccharose) und die β-Galactosidase (Lactase, spaltet Lactose). In
diesem Versuch wird zudem eine α-Amylase zur Spaltung von Maltose verwendet. αAmylasen werden in den menschlichen Speicheldrüsen und in der Bauchspeicheldrüse
gebildet.
1. TEIL: ENZYMREAKTION
Dieser Versuchsteil besteht aus drei parallel durchgeführten Enzymreaktionen. Diese werden
in 1,5ml-Plastikgefäßen („Eppis“) nach folgendem Pipettierschema angesetzt. Anschließend
erfolgt die enzymatische Reaktion für 20 Minuten bei der unter dem jeweiligen Pipettierschema angegebenen Temperatur.
Ansatz A
Ansatz B
Maltose (100 mg/ml)
800 µl
Lactose (50 mg/ml)
800 µl
0,1M Phosphatpuffer
200 µl
0,1M Phosphatpuffer
200 µl
33 mM NaCl
33 mM NaCl
pH=6,9
pH=7,3
Amylase
25 µl
20 min, Raumtemperatur
800 µl
mg/ml)
0,1M NaAcetatpuffer
200 µl
pH=4,5
Invertase
20 min, 55°C (Heizblock)
25 µl
20 min, 37°C (Wasserbad)
Ansatz C
Saccharose (100
β-Galactosidase
25 µl
81
2. TEIL: FEHLING-NACHWEIS DER ZUCKER MIT REDUZIERENDEN EIGENSCHAFTEN
Dieser Versuchsteil wird nach folgendem Pipettierschema in Glas-Reagenzgläsern angesetzt.
1
2
3
4
5
6
7
Wasser
1 ml
-
-
-
-
-
-
Maltose
-
1 ml
-
-
-
-
-
Lactose
-
-
1 ml
-
-
-
-
Saccharose
-
-
-
1 ml
-
-
-
Ansatz A
-
-
-
-
1 ml
-
-
Ansatz B
-
-
-
-
-
1 ml
-
Ansatz C
-
-
-
-
-
-
1 ml
Fehling-
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
Reagenz
Die Reagenzgläser werden anschließend für 5 Minuten bei 95°C im Heizblock inkubiert.
Die Müllentsorgung erfolgt im Schwermetallabfall! (Das Fehling-Reagenz enthält u.a.
Kupferionen.)
QUALITATIVE AUSWERTUNG
Farbe
1
2
3
4
der
Wasser Maltose Lactose Saccharose
Probe
5
6
7
Ansatz
A
Ansatz
B
Ansatz
C
Maltose
Lactose
Saccharose
blau
rot
Eine rote Farbe verweist auf eine Bildung von Kupfer(I)-oxid und damit auf eine Reduktion
der Cu2+-Ionen des Fehling-Reagenz zu Cu1+. Die Kupferionen haben in diesen Fällen die
Elektronen aufgenommen, die bei der Oxidation der Aldehydgruppen der jeweiligen Zucker
zu Carboxylgruppen angefallen sind.
82
2. Vergleich der enzymatischen Aktivität der Formen an und b der GlykogenPhosphorylase
In diesem Experiment wird Glykogen in Gegenwart der Glykogen-Phosphorylase mit
Glucose-1-phosphat inkubiert. Da Glucose-1-phosphat unter den gewählten experimentellen
Bedingungen in einer vergleichsweise hohen Konzentration eingesetzt wird, läuft die
enzymkatalysierte Reaktion in Richtung der Glykogensynthese ab. (Unter physiologischen
Bedingungen katalysiert das Enzym den Glykogenabbau!)
Bei der Reaktion wird das Glucose-1-phosphat gespalten: Die Glucose wird in das
Glykogenmolekül eingebaut, das Phosphat wird freigesetzt. Das Phosphat wird dann
mit Hilfe einer einfachen Reaktion nachgewiesen (Bildung von Molybdänblau).
Das Experiment zeigt, dass die Aktivität der Glykogen-Phosphorylase von zwei Faktoren
abhängig ist:
▪ Interkonvertierung: Die Phosphorylase a (die phosphorylierte Form des Enzyms) ist aktiver
als die Phosphorylase b (die dephosphorylierte Form des Enzyms).
▪ Allosterische Aktivierung: Die Aktivität der Phosphorylase b kann durch AMP gesteigert
werden. (Die Aktivität der ohnehin aktiven Phosphorylase a wird durch AMP kaum
beeinflusst.)
Pipettierschema: Die Proben für die Enzymreaktion werden in 4 Eppi-Gefäße (1.5 mlGefäße) pipettiert:
Phosphorylase a
Phosphorylase b
-AMP
1
+AMP
2
-AMP
3
+AMP
4
−
100
−
100
Wasser (µl)
200
100
200
100
Glykogen (µl)
100
100
100
100
Beschriftung
AMP (µl)
100
100
100
100
Phosphorylase (µl)
Die Ansätze werden 5 Min. bei 30°C im Wasserbad inkubiert.
Glucose1100
100
100
100
Phosphat (µl)
Die Ansätze werden genau (!) 10 Min. bei 30°C im Wasserbad inkubiert.
TCA (µl)
500
500
500
500
Sicherheitshinweis: TCA (= Trichloressigsäure) kann die Haut verätzen. Bei Benetzung der
Haut oder der Augen ist die TCA sofort mit Wasser abzuspülen.
83
Um eine eventuelle Phosphatverunreinigung in den Ansätzen berücksichtigen zu können,
werden während der Inkubationszeit die zwei Leerwerte (LW A und LW B, ebenfalls im
Reaktionsgefäß) hergestellt. Wichtig ist in diesem Fall, dass Substrate und Effektoren erst
nach der Trichloressigsäure (TCA)-Zugabe zu dem Enzym pipettiert werden, so dass keine
enzymatische Reaktion ablaufen kann. Die Leerwerte brauchen nicht inkubiert werden.
Wichtig: Die Reihenfolge des Pipettierschemas ist genau einzuhalten!
Beschriftung
Phosphorylase a bzw. b (µl)
TCA (µl)
AMP (µl)
Wasser (µl)
Glykogen (µl)
Glucose-1-phosphat (µl)
LW A
100
500
100
100
100
100
LW B
100
500
100
100
100
100
Die 4 Reaktionsansätze und die beiden Leerwerte werden zusammen für 10 min bei 2000
rpm zentrifugiert, um das durch TCA denaturierte und präzipitierte Protein abzutrennen.
ACHTUNG: Der Zentrifugenrotor ist auf beiden Seiten mit der gleichen Anzahl an
Reaktionsgefäßen zu bestücken (3 links und 3 rechts)!
Während der Zentrifugation 6 Reagenzgläser beschriften und für die Phosphatbestimmung
vorbereiten:
Wasser
NH4+-Molybdat
Reduktionslösung ANSA
1,8 ml
2,0 ml
0,2 ml
Nach der Zentrifugation werden jeweils 0,5 ml des Überstandes in die Reagenzgläser
pipettiert und vorsichtig durch Schwenken gemischt.
10 min. bei Raumtemperatur inkubieren, anschließend wird zu jeder Probe 1ml 2,9 M NaAcetat-Lösung gegeben. Aus allen Reagenzgläsern werden ca. 3 ml der Ansätze in Küvetten
gefüllt (vorsichtig schütten, Küvettenvolumen beträgt 4 ml) und die Extinktion bei 720 nm
bestimmt.
Zuerst Photometer mit dem Leerwert A eichen, dann die restlichen Proben für Phosphorylase a messen.
Anschließend analog das Photometer mit dem Leerwert B eichen und die Phosphorylase bProben messen.
84
AUSWERTUNG
-1
-1
Berechnen Sie die Phosphorylase a und b Aktivitäten (µmol · min · ml ) anhand der
Eichkurve und anschließend stellen Sie Ihre Ergebnisse auf Millimeterpapier in Säulendiagrammen dar.
Nehmen Sie die Aktivität der Phosphorylase b (Reagenzglas 4) in Gegenwart von AMP und
die der Phosphorylase a (Reagenzglas 1) ohne AMP als 100% und geben Sie die beiden
anderen Aktivitäten als relative Aktivitäten (in %) an.
In Kenntnis der Proteinkonzentration der beiden Phosphorylasen (vom Kursassistenten
erfragen) berechnen Sie die entsprechenden spezifischen Aktivitäten.
Berechnung der Enzymaktivität:
Bei der Aktivitätsmessung wird 100 µl Enzym eingesetzt, die Aktivität
wird auf 1 ml Enzymlösung bezogen, deswegen
x 10
Für die Phosphatbestimmung wird nur die Hälfte des Ansatzes genommen
Die Inkubation dauert 10 min, aber die Aktivität wird pro Minute berechnet
Die Aktivität wird auf µmol berechnet
x2
x 1/10
x 1/1000
d.h.:
nmol Phosphat x 10 x 2 x 1/10 x 1/1000 = nmol Phosphat x 0,002
→ Enzymaktivität in µmol x min1 x ml-1
Spezifische Aktivität:
Volumenaktivität in µmol x min-1 x ml-1 dividiert durch die Proteinkonzentration in mg x ml-1
→ Spezifische Aktivität der Phosphorylase in µmol x min-1 x mg-1
85
Phosphat-Eichkurve
0,8
0,7
Extiktionsdifferenz bei 720 nm
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
100
200
300
400
500
600
nm ol Phosphat/Ansatz
700
800
900
1000