Dictyostelium discoideum als Modellsystem und Funktionsanalyse des

Dictyostelium als Wirtsmodell und Funktionsanalyse
des Virulenzfaktors Mip aus Legionella pneumophila
Dissertation
zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Carina Wagner
(geb. Skriwan)
aus Würzburg
Würzburg, 2004
Eingereicht am:
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender:
Gutachter:
Gutachter:
Tag des Promotionskolloquiums:
Doktorurkunde ausgehändigt am
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation
Dictyostelium als Wirtsmodell und Funktionsanalyse des
Virulenzfaktors Mip aus Legionella pneumophila
selbständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und
Hilfsmittel benutzt habe.
Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation weder in gleicher oder anderer Form bereits in
einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.
Ich habe früher ausser den mit dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten Graden keine
weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.
Würzburg, den 15.12.04
––––––––––––––––––––
(Carina Wagner)
Die Experimente zu der vorliegenden Dissertation wurden in der Zeit von November 2000 bis
September 2004 am Lehrstuhl für Molekulare Infektionsbiologie der Universität Würzburg
durchgeführt.
HERRN PROF. DR. JÖRG HACKER danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes am
Institut für Molekulare Infektionsbiologie.
Bei DR. MICHAEL STEINERT bedanke ich mich herzlich für die interessante Themenstellung,
das stetige Interesse am Fortgang meiner Arbeit und die gute Betreuung während der vielen
Jahre.
Zudem möchte ich mich bei DR. SALAM KHAN bedanken, der mich durch seine Erfahrung auf
dem Gebiet der Proteine und durch seine Ideen im Mip-Projekt unterstützt hat.
Allen Mitarbeitern des Institutes und vor allem den Kollegen im Legionellenlabor danke ich
für die angenehme Arbeitsatmosphäre und für den Spass an der Arbeit. Zudem möchte ich
mich bei allen für die bereitwillige Unterstützung in allen fachlichen und weniger fachlichen
Fragen bedanken. Vor allem danke ich SILKE KILLINGER und allen anderen, die mir das
Arbeiten mit giftigen Stoffen zeitweise abgenommen haben.
FRAU PROF. ANGELIKA NOEGEL, DR. LUDWIG EICHINGER und DR. PATRICK FARBROTHER
danke ich für die gute Zusammenarbeit, die Möglichkeit eines kurzen Aufenthaltes in ihrer
Arbeitsgruppe und die Einführung in die Welt der DNA-Chips.
Bei PROF. DR. SALVATORE BOZZARO bedanke ich mich für die Bereitstellung der
Dictyostelium Mutante und die Durchführung der Northern-Blots.
PROF. DR. GUNTHER FISCHER und DR. THILO KAMPHAUSEN danke ich für das Interesse am
Fortschreiten meiner Arbeit und für das Überlassen großer Mengen an Mip und anderen
Proteinen.
Vor allem möchte ich meinen Eltern, Großeltern und dem Rest der Familie danken, die mich
während meines Studiums und darüber hinaus motiviert und nicht nur finanziell unterstützt
haben.
Bartosz danke ich für die Unterstützung und für sein Verständnis wenn es im Labor mal
wieder länger dauert.
für Cassandra
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1
ZUSAMMENFASSUNG UND SUMMARY_____________________________5
1.1
ZUSAMMENFASSUNG
5
1.2
SUMMARY
6
2
EINLEITUNG_____________________________________________________ 9
2.1
LEGIONELLA PNEUMOPHILA
9
2.2
BIOLOGIE DER LEGIONELLEN
9
2.3
VORKOMMEN VON LEGIONELLEN IN DER UMWELT
11
2.4
ÜBERTRAGUNG AUF DEN MENSCHEN
11
2.5
PATHOGENITÄTSFAKTOREN
13
2.5.1
2.5.2
2.5.3
OBERFLÄCHENSTRUKTUREN
SEKRETIONSSYSTEME UND IHRE FAKTOREN
EISENAUFNAHMESYSTEME UND WEITERE VIRULENZFAKTOREN
13
14
16
2.6
AUFNAHME VON LEGIONELLEN IN DIE WIRTSZELLE
16
2.7
MODELLSYSTEME
20
2.7.1
2.7.2
2.7.3
MODELLSYSTEME ZUR UNTERSUCHUNG VON WIRT-PATHOGEN-INTERAKTIONEN 20
PHYLOGENETISCHE EINTEILUNG UND BIOLOGIE VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM 20
DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM ALS MODELLSYSTEM
23
2.8
DAS MIP-PROTEIN VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA
26
2.8.1
2.8.2
2.8.3
STRUKTUR UND LOKALISIERUNG VON MIP
EINTEILUNG UND FUNKTION VON PPIASEN
INFEKTIONSSTUDIEN
26
27
28
2.9
ZIELSETZUNG DER ARBEIT
30
3
MATERIAL UND METHODEN_____________________________________31
3.1
GERÄTE
31
3.2
VERWENDETE BAKTERIENSTÄMME
32
3.3
WIRTSZELLEN
33
3.4
ANTIKÖRPER
34
3.5
CHEMIKALIEN
34
3.6
ANTIBIOTIKA
34
3.7
16S- UND 18S-RRNA-SONDEN ZUR IN SITU HYBRIDISIERUNG
35
3.8
ANZUCHT DER BAKTERIENSTÄMME
35
3.8.1
ANZUCHT VON ESCHERICHIA COLI, KLEBSIELLA AEROGENES UND
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
ANZUCHT VON LEGIONELLA UND LLAP K62
35
36
3.8.2
Inhaltsverzeichnis
II
3.9
ANZUCHT VON MYKOBAKTERIEN
36
3.10
KULTIVIERUNG VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
37
3.11
KULTIVIERUNG VON ENDOZYTOBIONTENHALTIGEN ACANTHAMOEBA SP.
38
3.12
INFEKTION VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
39
3.12.1
3.12.2
3.12.3
3.12.4
3.12.5
VORBEREITUNG VON DICTYOSTELIEN FÜR DIE INFEKTION
INFEKTION VON DICTYOSTELIEN MIT LEGIONELLEN
INFEKTION VON DICTYOSTELIEN MIT PSEUDOMONADEN
INFEKTION VON DICTYOSTELIEN MIT MYKOBAKTERIEN
INFEKTION VON DICTYOSTELIEN MIT ENDOZYTOBIONTEN
39
39
39
40
40
3.13
FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG VON ENDOZYTOBIONTEN UND
DICTYOSTELIEN
41
3.13.1
3.13.2
FIXIERUNG VON ZELLEN FÜR DIE IN SITU HYBRIDISIERUNG
FÄRBUNG VON ZELLEN MITTELS 16S-RRNA BZW. 18S-RRNA
IN SITU HYBRIDISIERUNG
42
QUANTIFIZIERUNG DER PHAGOZYTOSERATE VON DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS-ANALYSE)
42
QUANTIFIZIERUNG DER PHAGOZYTOSERATE VON DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM MITTELS GENTAMICIN-ASSAY
43
3.16
FIXIERUNG VON ZELLEN FÜR DIE ELEKTRONENMIKROSKOPIE
43
3.17
ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
44
3.17.1
3.17.2
3.17.3
3.17.4
RNA-ISOLIERUNG NACH QIAGEN-PROTOKOLL
RNA-ISOLIERUNG MIT TRIZOL
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON RNA
RNA-GELELEKTROPHORESE
44
44
44
45
3.18
KULTIVIERUNG DER HUMANEN LUNGENEPITHELZELLLINIEN
NCI-H292, A549 UND CALU3
46
3.19
INFEKTION VON NCI-H292 MIT LEGIONELLEN
46
3.20
BIOTINYLIERUNG VON LEGIONELLEN UND BINDUNGSASSAY
47
3.21
GEWINNUNG EXTRAZELLULÄRER MATRIX AUS NCI-H292
48
3.22
BINDESTUDIEN VON MIP AN NCI-H292, DIE EXTRAZELLULÄRE MATRIX VON
NCI-H292 UND AN EXTRAZELLULÄRE MATRIXPROTEINE
49
3.22.1
3.22.2
3.22.3
3.22.4
3.22.5
3.22.5.1
3.22.5.2
FITC-MARKIERUNG VON PROTEINEN
HRP-MARKIERUNG VON PROTEINEN
BINDESTUDIEN MIT MIP-FITC
BINDESTUDIEN MIT MIP-HRP
KOHLENHYDRATABSPALTUNG VON GLYKOPROTEINEN
Abspaltung der Kohlenhydrate mit Periodat
Abspaltung der Kohlenhydrate mit Endoglykosidase H
49
49
49
50
50
50
50
3.23
TRANSWELL-EXPERIMENTE
51
3.24
TRANSWELL-EXPERIMENT MIT MATRIGEL
52
3.25
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE
52
3.26
RADIOAKTIVMARKIERUNG EXTRAZELLULÄRER MATRIX
52
3.14
3.15
41
Inhaltsverzeichnis
III
3.27
PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN
53
3.27.1
3.27.2
3.27.3
3.27.4
AUFTRENNUNG VON PROTEINEN MITTELS
SDS-PAGE (POLYACRYLAMID-GELEKTROPHORESE)
COOMASSIE-FÄRBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN
PROTEIN-TRANSFER AUF NITROZELLULOSEMEMBRAN (WESTERNBLOT)
STRIPPEN VON WESTERNBLOTS
53
55
55
57
4
ERGEBNISSE____________________________________________________ 59
4.1
DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM ALS MODELLSYSTEM
59
4.1.1
4.1.2
4.1.3
INFEKTION VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM MIT PSEUDOMONAS AERUGINOSA
INFEKTION VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM MIT ENDOZYTOBIONTEN
ZUSAMMENFASSUNG
59
60
62
4.2
EXPRESSIONSMUSTER VON INFIZIERTEN UND UNINFIZIERTEN DICTYOSTELIEN 62
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.8
AUFBAU DES DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM CDNA-MICROARRAYS
KATEGORISIERUNG DER DIFFERENTIELL EXPRIMIERTEN GENE
VERMEHRUNG VERSCHIEDENER LEGIONELLEN IN DICTYOSTELIEN
DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE GENE VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM 24 H NACH
INFEKTION MIT LEGIONELLA PNEUMOPHILA
Induzierte Gene
Reprimierte Gene
VERGLEICH DER GENEXPRESSION NACH INFEKTION MIT
LEGIONELLA PNEUMOPHILA UND LEGIONELLA HACKELIAE
VERGLEICH DER GENEXPRESSION NACH INFEKTION MIT
LEGIONELLA PNEUMOPHILA UND LEGIONELLA PNEUMOPHILA ∆DOTA
ZEITREIHE DER GENEXPRESSION VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM MIT
LEGIONELLA PNEUMOPHILA
ZUSAMMENFASSUNG
4.3
UNTERSUCHUNG VON NRAMP AUS DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
4.3.1
4.3.3
4.3.4
AUFNAHMERATE VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA IN DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
WT UND NRAMP-MUTANTE
VERMEHRUNG VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA UND MYCOBAKTERIUM AVIUM IN
DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM WT UND NRAMP-MUTANTE HSB60
EXPRESSION VON NRAMP WÄHREND DER INFEKTION
ZUSAMMENFASSUNG
4.4
FUNKTIONSANALYSE DES LEGIONELLA PNEUMOPHILA MIP-PROTEINS
81
4.4.1
INTRAZELLULÄRE VERMEHRUNG VON LEGIONELLA PNEUMOPHILA
MIP-MUTANTEN IN NCI-H292
BINDESTUDIEN
Bindung von Mip an Lungenepithelzellen NCI-H292
Bindung von Mip an extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen
Bindung von Mip an Proteine der extrazellulären Matrix
KOMPETITIONSASSAY
Entfernung der Zuckerreste von Collagen IV
TRANSWELL-EXPERIMENTE
Transwell-Versuche mit Legionella pneumophila Mip-Varianten
Zugabe von rekombinantem Mip
Hemmung der PPIase-Aktivität
81
82
83
85
86
91
92
93
94
96
97
4.2.4.1
4.2.4.2
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.3.2
4.4.2
4.4.2.1
4.4.2.2
4.4.2.3
4.4.3
4.4.3.1
4.4.4
4.4.4.1
4.4.4.2
4.4.4.3
62
64
65
66
66
68
69
72
74
76
76
76
78
80
81
Inhaltsverzeichnis
IV
4.4.4.4
4.4.4.5
4.4.5
4.4.6
4.4.7
Transwell-Versuche mit Escherichia coli
Hemmung der Proteaseaktivität
TRANSWELL-VERSUCHE MIT A549- UND CALU3-ZELLEN
DEGRADATIONSASSAY
ZUSAMMENFASSUNG
5
DISKUSSION___________________________________________________ 108
5.1
DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM ALS MODELLSYSTEM
5.1.1
5.1.2.3
5.1.3
5.1.3.1
5.1.3.2
DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM ALS MODELLSYSTEM ZUR UNTERSUCHUNG VON
WIRT-PATHOGEN-INTERAKTIONEN
GENEXPRESSION VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM NACH
INFEKTION MIT LEGIONELLA
Genexpression 24 h nach Infektion mit Legionella pneumophila
Infektion mit Legionella hackeliae und einer dotA-Mutante von
Legionella pneumophila
Genexpresssion während einer Infektion über 48 h
NRAMP VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
Infektion von Dictyostelium discoideum WT und einer nramp-Mutante
Expression von nramp in Dictyostelium discoideum während einer Infektion
113
115
116
117
118
5.2
FUNKTIONELLE ANALYSE DES LEGIONELLA PNEUMOPHILA MIP-PROTEINS
119
5.2.1.1
5.2.1.2
5.2.1.3
5.2.1.4
5.2.1.5
Invasionsassays von Legionellen in Lungenepithelzellen
Bindestudien von Mip
Transwell-Versuche mit Legionella Mip-Varianten und Escherichia coli
Inhibierung der Proteaseaktivitäten
Degradation der extrazellulären Matrix
120
121
122
125
125
5.3
AUSBLICK
128
6
LITERATUR____________________________________________________ 130
7
ANHANG_______________________________________________________ 139
7.1
ABKÜRZUNGEN
139
7.2
PUBLIKATIONEN
141
7.3
ÜBERSICHTSARTIKEL UND TAGUNGSBEITRÄGE
141
7.4
LEBENSLAUF
142
5.1.2
5.1.2.1
5.1.2.2
99
101
104
105
107
108
108
110
110
Zusammenfassung und Summary
5
1 Zusammenfassung und Summary
1.1
Zusammenfassung
Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 beschrieben, nachdem der Erreger aus dem
Lungengewebe eines Patienten isoliert wurde, der an einer schweren atypischen Pneumonie
erkrankt war. Das Bakterium zeichnet sich durch ein duales Wirtssystem aus und kann sich
sowohl in Protozoen als auch in humanen Zellen vermehren.
Ein Ziel dieser Arbeit war es, wichtige Faktoren einer Legionelleninfektion seitens der
Wirtszelle zu betrachten. Als Wirtsmodell diente die soziale Amöbe Dictyostelium
discoideum. Mit Hilfe eines von Patrick Farbrother (Universität Köln) etablierten
Dictyostelium DNA-Microarrays mit 5906 genspezifischen Sonden, wurde die Genexpression
von D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion durch L. pneumophila untersucht. Zur
Kontrolle dienten uninfizierte Zellen, und Zellen, die mit L. hackeliae bzw. einer dotAMutante von L. pneumophila koinkubiert wurden. Diese beiden Stämme weisen eine
verminderte Pathogenität bzw. ein deletiertes Pathogenitätsgen auf. Für den Zeitpunkt 24 h
nach Infektionsbeginn wurden 140 Gene gefunden, die in D. discoideum in Reaktion auf eine
Infektion mit L. pneumophila differentiell exprimiert werden. Einige Gene codieren bereits
bekannte Proteine von D. discoideum. Dazu gehören das RtoA (ratioA, Fusion von Vesikeln),
Discoidin I, CotB (spore coat Protein SP70) und die lysosomale α-Mannosidase. Mit Hilfe
von Homologie-Suchen konnte weiteren unbekannten Proteinen eine Funktion zugeteilt
werden. Hierzu zählen die Chaperone ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP (coat
protein) und drei calciumbindende Proteine. Nach Einteilung in funktionelle Kategorien,
konnte gezeigt werden, dass viele Gene reguliert werden, deren Produkte am AminosäureMetabolismus beteiligt sind oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt.
Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Nramp-Protein von D. discoideum näher untersucht.
Nramp transportiert zweiwertige Kationen über die phagosomale Membran. Es konnte
festgestellt werden, dass die Aufnahme von L. pneumophila und M. avium in eine nrampMutante deutlich reduziert ist. Allerdings ist eine vermehrte Replikation von Legionellen und
Mykobakterien in der Wirtsmutante zu beobachten. In Zusammenarbeit mit Salvatore
Bozzaro (Turin, Italien) konnte gezeigt werden, dass während einer Infektion mit
L. pneumophila die nramp-Expression sinkt und bereits nach 48 h annähernd keine nrampRNA im Northern-Blot nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu bleibt die nramp-Expression
während einer Infektion mit M. avium relativ konstant.
Zusammenfassung und Summary
6
In Infektionsstudien konnte nachgewiesen werden, dass sich die Endozytobionten TUME1,
UWE25 und UWC6 in D. discoideum vermehren können. Mit Hilfe von spezifischen Cy3markierten 16S-rRNA Sonden wurde die intrazelluläre Zunahme der Bakterien über 48 h
beobachtet. Zum Zeitpunkt 48 h nach Inokulation konnte eine erhöhte Anzahl der drei
Endozytobionten in D. discoideum festgestellt werden. Anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Stämme TUME1 und UWE25 im
Zytoplasma des Wirtes von membranösen Strukturen eng umschlossen sind. UWC6 konnte
sowohl in Vakuolen als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Lokalisierung der
Endozytobionten entspricht ihrer Lokalisierung in ihren natürlichen Wirten.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Funktionsanalyse des Mip-Proteins aus
L. pneumophila. Das Mip-Protein von Legionella gehört in die Klasse der FK506Bindeproteine. Es besitzt Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität und bildet Homodimere.
Mip kann an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen binden, speziell an das
Collagen IV. Mit Hilfe von Transwell-Versuchen konnte festgestellt werden, dass Mip für die
Penetration von Legionella durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen verantwortlich ist.
Die Penetrationsfähigkeit konnte nach Hemmung der PPIase-Aktivität durch FK506 bzw.
Rapamycin
gehemmt
werden.
Ebenso
waren
Legionellen
nach
Hemmung
der
Serinproteaseaktivitäten im Transwell-System nicht mehr in der Lage die Barriere aus
Epithelzellen mit extrazellulärer Matrix zu durchwandern. Mit Hilfe von Degradationsassays
mit S35-markierter extrazellulärer Matrix konnte gezeigt werden, dass mip-positive
Legionellen extrazelluläre Matrix degradieren können. Nach Hemmung der PPIase-Aktivität
bzw. Serinproteaseaktivität konnten mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix nicht
mehr degradieren.
1.2
Summary
The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila is the etiological agent of
Legionnaire’s disease. It was first described in the year 1977 after isolation of the lung of a
patient who had a severe atypical pneumonia. The bacterium possesses a dual host system and
can replicate within protozoa and human cells.
The main focus of this work was to identify host cell factors which are important during
Legionella infection. As a host model system we used the social amoeba Dictyostelium
discoideum. In cooperation with Patrick Farbrother (University of Cologne) who established a
Dictyostelium DNA-microarray we have been able to investigate the gene expression of
Zusammenfassung und Summary
7
Dictyostelium during Legionella infection. The microarray consists of 5906 gene-specific
probes representing about half the genome of D. discoideum. As controls we isolated RNA
from uninfected cells and cells after coincubation with L. hackeliae as well as a dotA-mutant
of L. pneumophila. Both are Legionella strains with reduced pathogenicity and a deleted
pathogenicity gene respectively. Approximately 24 h after infection we identified 140
differentially expressed D. discoideum genes. Some of these genes encode well characterised
D. discoideum proteins like RtoA (ratioA, vesicle fusion protein), Discoidin I, CotB (spore
coat protein SP70) and the lysosomal α-Mannosidase. By homology searches the functions of
others could be assigned, like the chaperones ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP
(coat protein) and three calcium-binding proteins. When characterising the probes by cellular
processes the alteration of gene expression was analysed on functional level. A lot of genes
were regulated whose products are involved in nucleotid metabolism or that are ribosomal
proteins.
Furthermore we investigated the role of the Nramp-protein of D. discoideum. L. pneumophila
as well as M. avium were more efficiently phagocytosized from wildtype Dictyostelium than
from nramp-mutants. In contrast to phagocytosis, the replication rate of both bacteria was
much higher in the mutant than in the wildtype. In cooperation with Salvatore Bozzaro (Turin,
Italy) we have been able to show a decrease of nramp-expression during infection with
Legionella. Approximately 48 h after infection virtually no nramp-RNA was detectable by
northern blots. In contrast to these results, the nramp-expression was nearly constant during
an infection by Mycobacteria.
By infection studies it was shown that the endocytobionts TUME1 UWE25 and UWC6 were
able to replicate within D. discoideum. The intracellular increase of the bacteria within 48 h
was detected by fluorescent in situ hybridisation with specific Cy3-labeled 16S-rRNA probes.
By means of electron micrographs we were able to show that the strains TUME1 and UWE25
resided within the host cytoplasm closely surrounded by membranous structures. UWC6 was
found in vacuoles as well as in the cytoplasm. Localisation of the endocytobionts corresponds
to their localisation in their natural hosts.
A further aim of this work was to investigate the function of the L. pneumophila Mip-protein.
The Mip-protein of Legionella belongs to the FK506 binding proteins. Mip exhibits peptidylprolyl cis/trans isomerase activity and creates homodimers. We showed that mip binds to the
extracellular matrix of lung epithelial cells especially to collagen IV. By using the transwellsystem we demonstrated that Mip is responsible for Legionella penetrating a barrier of lung
epithelial cells and their extracellular matrix. After blocking the PPIase-activity by FK506 or
Zusammenfassung und Summary
8
Rapamycin, the ability of Legionella-penetration was dramatically reduced. Also after
inhibition of serinprotease-activities in the transwell-system, Legionella was not able to
penetrate through the barrier. Degradation-assays with S35-labeled extracellular matrix
indicated that mip-positive Legionella are able to degrade extracellular matrix. After
inhibiting the PPIase-activity or serinprotease-activities mip-positive Legionella were no
longer able to degrade extracellular matrix.
Einleitung
9
2 Einleitung
2.1
Legionella pneumophila
Im Juli 1976 fand ein Treffen amerikanischer Legionäre in Philadelphia, Pennsylvania, statt.
Von ca. 4400 Teilnehmern erkrankten 221 an einer atypischen Lungenentzündung, wobei
34 Menschen starben. Die Ursache dieser Epidemie blieb unbekannt, bis Forscher des Centers
of Disease Control (CDC) in Atlanta im darauffolgenden Winter das Bakterium Legionella
pneumophila isolieren konnten, das für den Ausbruch der Lungenentzündung verantwortlich
war. Als Quelle der Verbreitung der Legionellen konnte die Klimaanlage des Hotels
identifiziert werden, in dem das Zusammentreffen der Legionäre stattfand. Zweifelsohne war
dieses Bakterium die Ursache vieler ungeklärter Lungenentzündungen, nur konnte es in
früheren Zeiten aufgrund seiner hohen Nährmedienanforderungen nie kultiviert werden.
2.2
Biologie der Legionellen
Legionellen sind aerobe, Gram-negative Stäbchen und werden in die γ-Untergruppe der
Proteobakterien eingeteilt. Mittlerweile ist bekannt, dass die Familie der Legionellaceae
48 Spezies und 70 Serogruppen umfasst (Alli et al., 2003). Zusätzlich gehören zur Gattung
Legionella noch mindestens 12 Legionella Like Amoebal Pathogens (LLAP), die sich schwer
auf künstlichem Medium anziehen lassen, jedoch physiologisch starke Ähnlichkeiten zu
Legionellen aufweisen (Adeleke et al., 1996). Legionellen haben einen Durchmesser von etwa
0,3 bis 0,9 µm und eine Länge von 2 bis 20 µm. Die Bakterien sind durch eine, zwei oder
mehrere polare oder laterale Flagellen beweglich. Sie sind chemoorganotroph und nutzen
Aminosäuren als Kohlenstoffquelle. Kohlenhydrate werden weder fermentiert noch oxidiert.
Als Charakteristikum kommen in der Zellwand hauptsächlich verzweigte Fettsäuren vor. Das
Chromosom von Legionella hat eine Grösse von etwa 3,9 Mb und einen G+C Gehalt von
39 bis 43% (Fliermans, 1996; Bender et al., 1990). Legionellen benötigen für ihr Wachstum
spezielle Nährmedien, die mit L-Cystein und löslichen Eisensalzen angereichert sind. Auf
BCYE-Agar (charcoal yeast-extract agar) bilden sie runde, gräulich-weisse Kolonien.
Einleitung
Abb. 1 Stammbaum von Legionella erstellt aufgrund der Sequenz von Mip (nach Adeleke et al., 2001)
10
Einleitung
2.3
11
Vorkommen von Legionellen in der Umwelt
Man findet Legionellen in natürlichen aquatischen Habitaten. Da sich Legionellen nicht
extrazellulär vermehren können (Surman et al., 2001), findet man sie in der Umwelt in
Assoziation mit verschiedenen Amöben und Protozoen, aber auch in Biofilmen und in
Vergesellschaftung mit blau-grünen Algen (Tison et al., 1980). Ihr Wirtsspektrum ist recht
groß; bis heute kennt man 13 Arten Amöben und zwei zilientragende Protozoen, in denen sich
Legionellen vermehren können. Hierbei findet man L. pneumophila am häufigsten in den
Amöben Hartmanella vermiformis und Acanthamoeba castellanii (Fields, 1996). Das
Vorkommen in Amöben dient Legionellen nicht nur als Nahrungsgrundlage, sondern auch
zum Schutz vor widrigen Umweltbedingungen wie hohen Temperaturschwankungen und pHÄnderungen (Wadowski et al., 1982). Fliermans et al. isolierte Legionellen aus Flüssen, Seen
und heissen Quellen in den USA aus einem Temperaturbereich zwischen 5,7 und 63°C. Er
konnte zwar nicht zeigen, dass sich Legionellen bei extrem hohen oder niedrigen
Temperaturen vermehren, jedoch konnte er durch Infektion von Meerschweinchen mit diesen
Legionellen beweisen, dass diese überlebensfähig und infektiös sind (Fliermans et al., 1981).
Die Bakterien befanden sich im sog. VBNC-Stadium (viable but non culturable).
2.4
Übertragung auf den Menschen
In ihren natürlichen Habitaten kommen Legionellen in zu geringen Mengen vor um für den
Menschen eine Gefahr darzustellen. Man findet Legionellen auch in von Menschen
geschaffenen künstlichen Warmwassersystemen wie Klimaanlagen, Whirlpools, Luftbefeuchtern oder Duschen. Sie vermehren sich in Amöben, die in Assoziation mit Biofilmen
und einer Temperatur von 30 bis 40°C hervorragende Bedingungen für Legionellen bieten.
Zudem sind die Bakterien in den Amöbentrophozoiten und -zysten sowohl vor pH- und
Temperaturschwankungen als auch vor Desinfektion durch Chlor geschützt (Fliermans,
1995). Legionellen in Amöbenzysten überleben sogar die Anwesenheit von 50 mg/l freiem
Chlor. Der Zusatz von subletalen Dosen freien Chlors erhöht die Enzystierung der Amöben
und
macht
Legionellen
noch
unzugänglicher
(Kilvington
&
Price,
1990).
Die
Dekontamination von Legionellen in Trinkwasserleitungen kann durch Erhöhung der
Wassertemperatur in den Rohrleitungen auf über 60–70°C erreicht werden. Dies ist jedoch
nur für kurze Zeit wirksam, da Legionellen nach einigen Monaten wieder nachzuweisen sind
(Zacheus & Martikainen, 1996; Steinert et al., 1998). Einer Studie zufolge hätten 90% der
Fälle von Legionellose, die durch Trinkwasser verursacht wurden, verhindert werden können,
Einleitung
12
wenn Monochloramin an Stelle von freiem Chlor zur Desinfektion von Trinkwasser benutzt
worden wäre (Atlas, 1999; Kool et al., 1999).
Die Übertragung auf den Menschen geschieht über legionellenhaltige Aerosole, die beim
Duschen, in Klimaanlagen und Whirlpools entstehen. Durch Einatmen dieser Aerosole
gelangen die Bakterien in die Lunge. Neuere Untersuchungen zeigen, dass mit Legionellen
kontaminiertes Trinkwasser auch ein erhebliches Risiko darstellt an Legionellose zu
erkranken. Bei gesunden Menschen werden die Bakterien, die fälschlicherweise über den
Mund in den Respirationstrakt gelangt sind, durch die Zilien der Zellen im Respirationstrakt
wieder in Richtung Mund befördert. Bei starken Rauchern und kranken Menschen ist dieser
Mechanismus gestört. Somit können die Legionellen durch Aspiration in die Lunge gelangen
(Kool et al., 1999). Die darauf folgende Legionella-Infektion kann in zwei unterschiedlichen
Formen verlaufen. Die Legionärskrankheit ist eine Lungenentzündung mit einer
Inkubationszeit von etwa zwei bis zehn Tagen. Die Krankheit beginnt mit Husten, leichtem
Fieber sowie Muskel- und Kopfschmerzen. Spätere Symptome sind hohes Fieber,
Kurzatmigkeit und Auswurf von Sputum. Nach Schätzungen des Robert Koch Institutes treten
in Deutschland jährlich 8000-12000 und in den USA ca. 25000 durch Legionellen verursachte
Pneumonien auf (Lück & Helbig 1997; Abu Kwaik, 2000). Bei Nichtbehandlung verläuft die
Legionärskrankheit in Abhängigkeit des Immunstatus in 10 bis 25% der Fälle letal. Die
zweite durch Legionellen ausgelöste Krankheit ist das selbstlimitierende Pontiac-Fieber.
Diese Erkrankung verläuft mit grippeähnlichen Symptomen und heilt meist nach zwei bis drei
Tagen wieder ab. Der erste Fall von Pontiac-Fieber wurde 1968 beschrieben. Als Erreger
konnte Legionella pneumophila Serogruppe 1 aus der Klimaanlage des Gesundheitsamtes in
Pontiac, Michigan, USA isoliert werden. Es ist noch nicht bekannt, warum ein und dasselbe
Bakterium zwei unterschiedliche Erkrankungen hervorrufen kann (Fliermans, 1995). In ca.
80% der Fälle von Legionärskrankheit ist L. pneumophila der Erreger; und darunter wiederum
zu 95% Vertreter der Serogruppe 1 (Abu Kwaik et al., 1998). Weitere Arten, die mit einem
Ausbruch der Legionärskrankheit verknüpft sind, sind L. micdadei, L. bozemanii und
L. longbeachae (Atlas et al., 1999). Zur Behandlung der Legionellose stehen hoch effektive
Antibiotika zur Auswahl. Zum einen die Makrolidantibiotika wie Azithromycin und zum
anderen
die
Quinolone
(www.legionella.org).
wie
Ciprofloxacin,
Levofloxacin
und
Moxifloxacin
Einleitung
2.5
13
Pathogenitätsfaktoren
2.5.1
Oberflächenstrukturen
Es sind zahlreiche Pathogenitätsfaktoren bekannt, die bei der Aufnahme der Legionellen in
ihre Wirtszellen, sowie bei der Modulation der Wirtszelle während der Infektion eine Rolle
spielen. Auch Oberflächenstrukturen sind an der Pathogenität von L. pneumophila beteiligt.
Die Oberfläche von L. pneumophila ist von Lipopolysaccharid (LPS) bedeckt. Im Gegensatz
zu anderen Gram-negativen Bakterien, ist das LPS der Legionellen anders zusammengesetzt.
Das Lipid A besteht aus langkettigen, verzweigten Fettsäuren. Daran sind Zuckermoleküle,
sog. Legionaminsäuren gebunden, die frei von Hydroxylgruppen sind (Lüneberg et al., 2001).
Die dadurch gewonnene Hydrophobizität könnte bei der Übertragung durch Aerosole oder bei
der Bildung von Biofilmen eine Rolle spielen (Helbig et al., 1995). Die Phasenvariation des
LPS führt zum Verlust der Serumresistenz. Die Fähigkeit zur Phasenvariation des LPS ist von
der Anwesenheit eines 30 kB großen genetischen Elementes abhängig, das ursprünglich von
einem Bakteriophagen stammt. Virulentes LPS wird exprimiert, solange sich dieses
genetische Element im Chromosom befindet. Nach der Exzision wird dieser Bereich als HighCopy-Plasmid repliziert, wobei avirulentes LPS auf der Bakterienoberfläche erscheint
(Lüneberg et al., 2001).
Eine weitere Oberflächenstruktur bilden RTX Proteine. RtxA zeigt Homologien zu RTXProteinen (repeats in structural toxin genes) anderer Bakterien. Die RTX-Proteine vermitteln
die Adhärenz von Legionella an Komplementrezeptoren, die β2-Integrine der Wirtszelle.
Neben der Funktion der Adhärenz konnte gezeigt werden, dass das rtxA-Genprodukt Poren in
seiner Wirtszelle ausbildet und somit eine zytotoxische Aktivität besitzt. Im Vergleich zu
wildtypischen Legionellen besitzen Mutanten im rtxA-Gen eine verminderte Adhärenz,
Zytotoxizität, Porenbildung, intrazelluläre Vermehrung und Virulenz in Mäusen (Cirillo et al.,
2001).
Des Weiteren spielt die Flagelle von L. pneumophila eine Rolle für die Virulenz. Die Flagelle
wird nach Erreichen der stationären Phase auf der Oberfläche der Legionellen exprimiert. Ihre
Expression wird durch den alternativen σ28 Faktor reguliert (Heuner et al., 2002). Die
monopolare Flagelle besteht aus der Untereinheit Flagellin, das durch das flaA-Gen codiert
wird. Es konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme unflagellierter flaA-Mutanten sowohl in
HL-60 Zellen als auch in A. castellanii reduziert ist, wobei die Flagelle für die Adhäsion und
während der intrazellulären Vermehrung keine Rolle spielt (Dietrich et al., 2001).
Einleitung
14
Typ-IV-Pili sind ca. 0,1 bis 1,5 µm lang und bestehen aus 17 kDa Typ-IV-Pilin
Untereinheiten. Diese Pili sind bei der komplementunabhängigen Aufnahme der Legionellen
in Makrophagen und Lungenepithelzellen beteiligt. Mutanten ohne Pili (pilE) zeigen eine
deutlich verminderte Adhärenz an Makrophagen, Amöben und Epithelzellen, sind jedoch
während ihrer intrazellulären Replikation nicht beeinträchtigt (Stone & Abu Kwaik, 1998).
Weitere Oberflächenstrukturen von L. pneumophila sind das 28 kDa große OMP (outer
membrane porin) und das 16 kDa große POM (pneumophila-specific outer membrane
protein). Durch die Opsonisierung von OMP mit spezifischen Legionella-Antikörpern ist die
Aufnahme der Bakterien über den Fc-Rezeptor möglich. (Bellinger-Kawahara & Horwitz,
1990; Husmann, 1992). POM wirkt als Adhäsin und ist bei der initialen Aufnahme der
Bakterien beteiligt (Steudel, 2001).
Das 25 kDa große Oberflächenprotein Mip (macrophage invectivity potentiator) ist ein
Homodimer, das während der Infektion in die phagosomale Membran inseriert wird (Helbig
et al., 2001). Es gehört zur Enzymfamilie der FK506-Bindeproteine, wobei seine exakte in
vivo Funktion noch nicht aufgeklärt werden konnte. Mip spielt während der Infektion eine
Rolle, da sich mip-negative Mutanten sowohl in Acanthamoeba castellanii, in humanen
mononukleären Makrophagen, als auch in Hartmanella vermiformis und Lungenepithelzellen
schlechter vermehren können.
2.5.2
Sekretionssysteme und ihre Faktoren
Legionellen besitzen eine Reihe von Pathogenitätsfaktoren, die ihnen das Überleben und die
Replikation in ihrer Wirtszelle ermöglichen. Das dot/icm System (defective for organelle
trafficking and intracellular replication) ist ein Typ-IV-Sekretionssystem. Dieses
Sekretionssystem führt zum Transport von Virulenzfaktoren in die Wirtszelle. Man nimmt an,
dass über das dot/icm System von L. pneumophila zwei Klassen von Effektormolekülen in die
Wirtszelle gebracht werden. Zur ersten Klasse gehören Moleküle, die den endozytischen
Reifungsprozess des Phagosoms und die Fusion mit Lysosomen verhindern. Die zweite
Klasse ist für den Transport des legionellenhaltigen Phagosoms zum Endoplasmatischen
Retikulum (ER) verantwortlich (Nagai & Roy, 2003). Mehr als 90% der Phagosomen, in
denen sich tote Legionellen bzw. lebende dot/icm-Mutanten befinden, fusionieren mit
Lysosomen und bilden das sog. Phagolysosom, worin die Bakterien verdaut werden (Hilbi et
al., 2001). Das DotA-Protein wird über das dot/icm kodierte System transportiert und in die
Wirtszellmembran inseriert, wo es einen ringförmigen Kanal bildet, durch den zusätzlich
Einleitung
15
Substrate transportiert werden. Neben DotA sind noch DotB, DotH, DotO, IcmQ, IcmR,
IcmS, IcmW und IcmX an der Bildung bzw. an der Funktion des Sekretionsapparates beteiligt
(Cianciotto, 2001). Der ADP-Ribosylierungsfaktor (ARF) gehört zu den GTP-Bindeproteinen.
Es konnte gezeigt werden, dass ARF benötigt wird, um das legionellen-haltige Phagosom
zum ER zu transportieren. ARF1 wird durch das von L. pneumophila sekretierten RalF zum
Phagosom rekrutiert. RalF wird auch über das dot/icm-System sekretiert und kommt in allen
Serogruppen von L. pneumophila vor. Allerdings hat eine Deletion im ralF-Gen keine
Auswirkung auf die Vermehrung der Legionellen in ihrer Wirtszelle (Conover et al., 2003).
Zusammenfassend kann man sagen, dass das dot/icm-System in der frühen Phase der
Infektion eine Rolle spielt. Für die intrazelluläre Vermehrung ist es nicht mehr notwendig, da
gezeigt werden konnte, dass sich eine dotA-Mutante im gleichen Phagosom mit
L. pneumophila WT ungehindert vermehren kann.
Ein zweites Typ-IV-ähnliches Sekretionssystem von L. pneumophila ist das lvh-System
(Legionella vir homologues). Das lvh-System ist für den konjugativen DNA Transfer
zuständig, ist jedoch nicht essentiell für die Vermehrung von L. pneumophila in Makrophagen
und Protozoen (Segal et al., 1999).
Des Weiteren ist bei Legionella ein zweites Sekretionssystem beschrieben. Über das Typ-IISekretionssystem werden viele degradative Enzyme transportiert. Die Typ-II-Sekretion wird
durch PilD beeinflusst. PilD ist eine Peptidase, die bei der Typ-IV-Pilusbiogenese beteiligt ist
(Cianciotto, 2001). Das Typ-II-Sekretionssystem wird durch die lsp-Gene (Legionella
secretion pathway) kodiert. Der genetische Bereich lspFGHIJK codiert für Pseudopiline,
während lspD ein Sekretin in der äusseren Membran und lspE eine ATPase in diesem System
ist (Rossier & Cianciotto, 2001). Zu den über das Typ-II-Sekretionssystem sekretierten
Enzymen gehören die Zink-Metalloprotease, Proteasen, saure Phosphatasen, die p-NPPC
Hydrolase, die Lipase, Phospholipase A und die Lysophospholipase A. Mutanten in den lspGenloci zeigen eine veränderte Morphologie beim Wachstum auf Agarplatten. Die Kolonien
sind flacher und dunkler als die Kolonien des Wildtyps. Ebenso ist die intrazelluläre
Vermehrung der lsp-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp in makrophagenähnlichen U937
Zellen und in den Amöben Hartmanella vermiformis und Acanthamoeba castellanii deutlich
vermindert, wobei der Effekt in Amöben größer ist als in Makrophagenzelllinien.
Infektionsversuche in Meerschweinchen konnten zeigen, dass sich der Verlust von PilD
dramatischer auf die Virulenz auswirkt als Mutationen im Typ-II-Sekretionssystem. Daher
geht man davon aus, dass PilD nicht nur an der Biogenese von Typ-IV-Pili und der
Generation des Typ-II-Sekretionssystems beteiligt ist. Es muss vielmehr noch einen neuen
Einleitung
16
PilD-abhängigen Sekretionsweg geben, der die Pathogenese beeinflusst (Rossier &
Cianciotto, 2001).
2.5.3
Eisenaufnahmesysteme und weitere Virulenzfaktoren
Die Eisenaufnahme ist für Legionellen für die intra- und extrazelluläre Replikation wichtig.
Legionellen sekretieren verschiedene Siderophoren, um Eisen zu binden. Dazu gehören das
legionellenspezifische Legiobactin, das Pneumobactin und ein Pyoverdin-ähnliches
Siderophor. Ebenso wie die Eisenaufnahme, wird auch die intrazelluläre Vermehrung von
L. pneumophila durch
Eisentransporter
(iraB)
eine
und
einzigartige
ein
Methyltransferase
CytochromC
(iraA),
Biogenesesystem
einen
putativen
(ccmC)
gefördert
(Viswanathan & Cianciotto, 2001). Legionellen benutzen zur Eisenversorgung allerdings
keine wirtseigenen Fe3+-Binder wie Lactoferrin oder Transferrin. Sämtliche Eisenaufnahmegene von L. pneumophila werden durch Fur kontrolliert, einen Transkriptionsregulator, der
die Verfügbarkeit von Eisen messen kann (Cianciotto, 2001).
Des Weiteren konnte man Genloci identifizieren, die für das Überleben und die Vermehrung
von L. pneumophila sowohl in Makrophagen als auch in Protozoen nötig sind. Diese Gene
bezeichnet man als pmi (protozoa and macrophage infectivity). Das Vorhandensein von
diesen Genen lässt darauf schliessen, dass viele Mechanismen während der Infektion von
Protozoen und Makrophagen ähnlich sind (Gao et al., 1998). Auf der anderen Seite konnten
aber auch mil-Gene (macrophage-specific infectifity loci) gefunden werden, bei denen bislang
nur eine Relevanz während einer Infektion in Makrophagen gezeigt werden konnte. Die milLoci werden evtl. dazu benötigt, damit sich die Legionellen an veränderte Nährstoff- und
biochemische Anforderungen im Menschen als neuen Wirt adaptieren (Abu Kwaik, 1998).
2.6
Aufnahme von Legionellen in die Wirtszelle
Der Lebenszyklus von Legionellen ist zweiphasig. Sind genug Nährstoffe vorhanden, so
befinden sich die Bakterien in der replikativen Phase. Faktoren, die die Transmission der
Legionellen fördern, werden in dieser Zeit reprimiert. Wird das Nährstoffangebot jedoch
knapp, so treten die Bakterien in die Transmissionsphase ein. Die Koordination dieser
Phänotypen wird über die Menge an (p)ppGpp (Guanosin-3`,5`-bis-diphosphat) koordiniert
(Molofsky and Swanson, 2004). Während der Transmissionsphase sind Legionellen kurz,
breit, beweglich und besitzen eine dicke Zellwand. Es kommt zur Expression anderer Gene
Einleitung
17
und zur Bildung anderer Proteine, Membranfettsäuren und Lipopolysacchariden als während
der replikativen Phase. Legionellen, die sich in Wirtszellen vermehrt haben, sind deutlich
resistenter gegen Biozide und Antibiotika. Durch den zweiphasigen Lebenszyklus hat es
L. pneumophila geschafft, sich an extrazelluläre und intrazelluläre Umweltbedingungen
anzupassen (Swanson & Fernandez-Moreira, 2002).
L. pneumophila besitzt ein duales Wirtssystem. Es vermehrt sich sowohl in freilebenden
Protozoen als auch in Säugetierzellen. Die Aufnahme von L. pneumophila und L. micdadei in
Hartmanella vermiformis geschieht über ein 170 kDa großes Lektin, das durch Galaktose/NAcetylgalactosamin (Gal/GalNAc) inhibierbar ist. Es zeigt Homologien zu einem 170 kDa
großen Protein von Echinamoeba histolyticum und die extrazellulären Domänen sind den
CR1- und β-Integrinen von Säugetieren ähnlich. Einige Minuten nach Kontakt mit
Legionellen wird das 170 kDa große Lektin, sowie verschiedene zytoskelett-assoziierte
Proteine dephosphoryliert. Die Dephosphorylierung bei Anheftung und Invasion ist spezifisch
für Legionella und kann durch Tyrosin-Phosphatase-Inhibitoren blockiert werden
(Venkataraman et al., 1997). Die Aufnahme in H. vermiformis ist unabhängig vom Mikrofilamentsystem der Zelle und kann somit nicht durch Cytochalasin D gehemmt werden.
Allerdings kann die hier vorliegende Form der rezeptorvermittelten Endozytose durch
Methylamin verhindert werden (King et al., 1991). Die Aufnahmemechanismen in die
verschiedenen Protozoen sind sehr verschieden. Nach Hemmung der Wirtszellproteinsynthese
durch Cycloheximid wird die Aufnahme in A. castellanii zu 50% gehemmt. Die Aufnahme in
A. polyphaga wird jedoch durch Cycloheximid nicht beeinflusst. Aufgrund diverser
Untersuchungen mit Inhibitoren geht man davon aus, dass es verschiedene Aufnahmemechanismen in Protozoen gibt (Köhler, 2000). Die Aufnahme von L. pneumophila in
Protozoen und Makrophagen geschieht über konventionelle oder die sog. „coiling“
Phagozytose, bei der das Bakterium durch eine vielschichtige ringförmige Struktur
umschlossen wird (Abu Kwaik et al., 1998). Es konnte gezeigt werden, dass Legionellen
bevorzugt über die „coiling“ Phagozytose aufgenommen werden, wenn sie sich vorher in
Amöben repliziert haben (Harb & Abu Kwaik, 2000). Die Aufnahme von L. pneumophila in
Makrophagen geschieht über die Bindung von Komplementfaktoren C3 und C3bi an das
Major Outer Membrane Protein (MOMP) auf der Oberfläche der Bakterien. Bei virulenten
Legionellen kommt es allerdings nicht zur komplementvermittelten Lyse der Bakterien. Die
Bakterien binden an die Komplementrezeptoren CR1 und CR3 auf den Makrophagen. Durch
diesen Aufnahmeweg wird der „oxidative burst“ der Wirtszelle unterbunden, wobei
Legionellen zu dieser Zeit auch sehr resistent gegen Wasserstoffperoxid, Superoxidanionen
Einleitung
18
und gegen Sauerstoffradikale sind (Cianciotto, 2001; Steinert et al., 2002). Ein weiterer
Aufnahmeweg ist die Fc-Rezeptor vermittelte Phagozytose von Legionellen, an die
spezifische Antikörper gebunden sind. Diese Aufnahme ist allerdings weniger erfolgreich, da
nur etwa die Hälfte der aufgenommenen Bakterien überleben und sich intrazellulär vermehren
können. Des Weiteren gibt es komplementunabhängige Aufnahmemechanismen. Diese
spielen eine Rolle während in vitro Infektionsversuchen in Anwesenheit von Komplementkomponenten (Steinert et al., 2002). Allen unterschiedlichen Aufnahmewegen in die humane
Säugerzelle ist die Abhängigkeit vom Mikrofilamentsystem gemeinsam. Die Aufnahme der
Bakterien kann durch Cytochalasin D, einem Inhibitor der Aktinpolymerisation, gehemmt
werden (King et al., 1991).
Nach Aufnahme in ihre Wirtszelle befinden sich die Legionellen in einem membrangebundenen Phagosom, das schnell von Mitochondrien und anderen wirtseigenen Vesikeln
umgeben wird. Auf diesen frühen Phagosomen sind keine lysosomalen Marker nachweisbar.
Man findet weder Klasse I und II Moleküle des Major Histikompatibilitäts Komplexes
(MHC), noch alkalische Phosphatasen oder andere Membranproteine. Ebenso findet man auf
dem Phagosom, das jünger als 3 h ist, keine späten lysosomalen Proteine wie Rab7, LAMP-1,
LAMP-2, Transferrinrezeptoren oder Cathepsin D. Innerhalb der ersten 6 h nach Phagozytose
ist das legionellenhaltige Phagosom völlig getrennt vom endosomal-lysosomalen Weg
(Swanson & Fernandez-Moreira, 2002). Danach werden die phagosomassoziierten ERVesikel durch Ribosomen ersetzt. Die Funktion und der Nutzen der Ribosomen für die
Legionellen ist noch nicht eindeutig geklärt. Es konnte jedoch gezeigt werde, dass sie nicht
als Proteinquelle für die Legionellen dienen. Die Assoziation des Phagosoms mit rauem
endoplasmatischem Retikulum (RER) ist spezifisch für die meisten L. pneumophila Stämme
wie Philadelphia und AA100. In mit L. pneumophila Koxsville oder L. micdadei infizierten
Protozoen kann man beobachten, dass das replikative Phagosom frei von RER ist. (Abu
Kwaik, 1998; Abu Kwaik et al., 1998a). Während der logarithmischen Wachstumsphase
verdoppelt sich die Anzahl der Legionellen alle 2 h. In dieser Replikationsperiode erwerben
die Phagosomen lysosomale Charakteristika. Circa 18 h nach Infektion besitzen 50 bis 70%
der Vakuolen den lysosomalen Marker LAMP-1 und Cathepsin D. Ebenso wird der neutrale
pH-Wert des Phagosoms innerhalb 20 h immer saurer. Das lysosomale Kompartiment fördert
das Wachstum von L. pneumophila eher als dass es gehemmt wird (Sturgill-Koszycki &
Swanson, 2000). Legionella pneumophila ist in der Lage seine Wirtszelle auf zwei Arten zu
töten. Gao und Abu Kwaik konnten zeigen, dass Legionellen abhängig ihrer MOI
(multiplicity of infection) schon innerhalb der ersten Stunden nach Infektion in der Lage sind,
Einleitung
19
HL-60 Makrophagen und alveolare Epithelzellen durch Apoptose zu zerstören. Apoptose ist
ein gezieltes Selbstmordprogramm der Zelle, das nicht von der intrazellulären Replikation der
Bakterien, sondern vielmehr durch die Zytopathogenität der Bakterien ausgelöst wird. Es wird
spekuliert, dass es beim Kontakt extrazellulärer Legionellen mit der Wirtszelle zu einem
Export bakterieller Faktoren kommt. Diese führen zur Aktivierung einer Kaskade von
Caspasen die eine Apoptose auslösen (Gao & Abu Kwaik, 1999).
Während sich die Legionellen im Phagosom vermehren, befinden sie sich in der
exponentiellen Wachstumsphase. Sie sind erhöht salzresistent, nicht flagelliert, bilden lange
filamentöse Stäbchen und sind wenig zytotoxisch und wenig stressresistent. Haben sich die
Bakterien dann so stark vermehrt, dass die Replikationsvakuole voll ist, erfolgt die
Umwandlung von der Replikationsform in die Transmissionsform. Bei Aminosäuremangel
und niedriger Temperatur wird RelA, eine Guanosin 3’,5’-Bispyrophosphat Synthetase,
aktiviert. Das daraufhin vermehrt gebildete 3’,5’-Bispyrophosphat (ppGpp) wirkt als „second
messenger“ und erhöht die Expression des alternativen Sigmafaktors RpoS. Anschließend
treten die Legionellen in die stationäre Wachstumsphase ein. Sie werden zu kurzen, dicken
Stäbchen, bilden Flagellen aus und werden beweglich. Zudem sind sie salzsensitiv,
zytotoxisch und stressresistent (Steinert et al., 2002). Infektionsversuche mit relA-Mutanten
konnten zeigen, dass die Pigmentproduktion von Legionellen in der stationären Phase deutlich
vermindert ist. Ebenso ist die Expression der Flagellin Untereinheit flaA deutlich reduziert,
was zu einer verminderten Flagellierung der relA-Mutante führt. Das intrazelluläre Wachstum
von relA- und rpoS-Mutanten ist in HL-60 Zellen und in Acanthamöben nur gering
beeinträchtigt. Zusman et al. gehen davon aus, dass relA und rpoS zwar einige Virulenzfaktoren regulieren, aber das für das intrazelluläre Wachstum wichtige dot/icm-System durch
andere Faktoren kontrolliert wird (Zusman et al., 2002).
Nachdem die Legionellen in der post-exponentiellen Wachstumsphase eine hohe Zelldichte in
ihrer Wirtszelle erreicht haben, werden sie wie oben beschrieben zytotoxisch. Die infizierten
Zellen werden nekrotisch und geben die Legionellen in die Umwelt ab. Die Zellen in
unmittelbarer Nachbarschaft werden durch die große Bakterienanzahl und Zytotoxizität
ebenfalls nekrotisch. Diese Phase des nekrotischen Zelltods wird wahrscheinlich durch ein
porenbildendes Toxin hervorgerufen, das L. pneumophila während der postexponentiellen
Wachstumsphase bildet (Gao & Abu Kwaik, 1999).
Einleitung
2.7
2.7.1
20
Modellsysteme
Modellsysteme zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen
Für die Untersuchung und Aufklärung einer Infektion durch L. pneumophila stehen eine
Reihe von Wirtsmodellsystemen zur Verfügung. Zum einen untersucht man die Interaktion
von Legionellen mit Protozoen. Hier sind weit verbreitete Modelle die leicht kultivierbaren
Amöben A. castellanii, A. polyphaga und H. vermiformis. Da Legionellen ein duales
Wirtssystem besitzen, eignen sich zum Studium der Interaktion auch humane Makrophagenund Epithelzellinien, wie U937, HL-60 sowie Epithelzellen des Typs I und II. Allerdings
konnte man zeigen, dass es bakterielle Faktoren (z.B. mil) gibt, die zwar für die Vermehrung
der Bakterien in Makrophagen, nicht jedoch für die Vermehrung in Protozoen benötigt
werden (Gao et al., 1998). In Zellkulturen ist die Untersuchung bakterieller Faktoren, die z. B.
eine wichtige Rolle bei der Bindung an die extrazelluläre Matrix spielen, schwierig. Hier ist
die Verwendung tierischer Modelle oft nicht zu umgehen. Köhler et al. konnte zeigen, dass
die PPIase-Aktivität des Mip-Proteins von Legionella im monozellulären System keine
Funktion hat, jedoch im Meerschweinchenmodell sehr wichtig ist (Köhler et al., 2003).
Für die Aufklärung der Interaktion zwischen Legionella und seiner Wirtszelle hat sich vor
allem die Bodenamöbe Dictyostelium discoideum als geeignet erwiesen (Hägele et al., 2000;
Solomon et al., 2000). Im folgenden Abschnitt soll auf die Charakteristika und die Vorteile
von D. discoideum als Modellsystem eingegangen werden.
2.7.2
Phylogenetische Einteilung und Biologie von Dictyostelium discoideum
Dictyostelium discoideum wurde erstmals 1935 von K. B. Raper isoliert und den
Acrasiomyceten (zelluläre Schleimpilze) zugeordnet. Während die Myxomyceten (echte
Schleimpilze) eine Masse aus mehreren Zellkernen bilden und sich sexuell fortpflanzen,
pflanzen sich die Acrasiomyceten vegetativ fort (www.science-at-home.de/lexikon).
Dictyostelien haben evolutionär noch vor der Ausbildung der Metazoa und Fungi eine eigene
Klasse gebildet (Baldauf et al., 2000). Der zelluläre Schleimpilz kann als einzellige Amöbe,
als Zellaggregat und schliesslich in Form eines vielzelligen Fruchtkörpers vorkommen. Das
natürliche Habität von Dictyostelium ist feuchter Erdboden und abgefallenes Laub, wo sich
die Amöben von Bakterien ernähren. Die Vermehrung findet alle 6 bis 8 h durch einfache
Zweiteilung statt. Bei ausreichendem Nährstoffangebot findet man D. discoideum als
Einleitung
21
Einzelamöbe. Wird das Nahrungsangebot jedoch knapp, aggregieren die Einzelamöben und
bilden einen vielzelligen Organismus mit verschiedenen spezialisierten Zelltypen (Abb. 2).
Aufgrund dieses Phänomens werden Dictyostelien auch zu den sozialen Amöben gezählt. Die
Aggregation von bis zu 105 Einzelzellen wird durch extrazelluläres cAMP ausgelöst. Das
cAMP bindet an der Oberfläche der Zelle an G-Protein assoziierte cAMP-Rezeptoren und löst
dadurch eine Signaltransduktionskaskade aus. Aufgrund unterschiedlicher Signalrezeption am
vorderen und hinteren Teil der Amöbe, werden vorne Pseudopodien ausgestülpt in die das
Zytoplasma strömt. Kurz darauf zieht sich der hintere Teil der Zelle zusammen und folgt den
vorgestülpten Pseudopodien (Kay, 2002). Innerhalb von 15 h formen die Einzelamöben ein
sog. „Slug-Stadium“ in dem die Zellen durch spezifische Adhäsion und durch die ständige
Bildung einer extrazellulären Matrix eine vielzellige Einheit bilden. Dieses schneckenförmige
Gebilde bewegt sich entlang eines Hitze- oder Lichtgradienten fort. Ebenso wird der
extrazelluläre cAMP-Spiegel gemessen. Die oberflächlichen cAMP-Rezeptoren sind über GProteine an Adenylatzyklasen gekoppelt. Aktivierte Adenylatzyklasen produzieren intrazelluläres cAMP, das wiederum eine cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) aktiviert. Diese
PKA ist der Initiator der Entwicklung und der terminalen Differenzierung. Während der
weiteren Entwicklung formen die unteren Stielzellen eine basale Scheibe, um den
Fruchtkörper zu stabilisieren. Von unten werden weitere Prästielzellen eingebaut, während die
unteren Stielzellen unbeweglich werden, vakuolisieren und sterben. Die Präsporenzellen
werden über den wachsenden Stiel nach oben transportiert und reifen schnell zu Sporenzellen
aus (Thomason et al., 1999). Die Reifung zu Stiel- und Sporenzellen wird über die
Peptidfaktoren SDF1 (spore differentiation factor) und SDF2 ausgelöst. Beide Faktoren
werden nur während der Reifung des Fruchtkörpers abgegeben. Man hat beobachtet, dass
beide Faktoren eine schnelle Reifung von Präsporenzellen in einer Monolayerkultur auslösen
und SDF1 zusätzlich Stielzellbildung stimuliert (Anjard et al., 1998).
Einleitung
22
Abb. 2 Darstellung verschiedener Strukturen während der Entwicklung von D. discoideum. Unabhängig
voneinander lebende Amöben aggregieren zu einem vielzelligen Organismus. Während der Aggregation (1 und
2) differenzieren sich die Zellen in Prästiel- und Präsporenzellen unabhängig von ihrer Position. Die
Prästielzellen wandern nach oben und bilden die spätere Spitze der Anordnung (3). Die spitzenförmige
Anordnung verlängert sich (4) und sammelt sich an (5-9). Während der letzten Phase des Wachstums (7-8)
differenzieren sich Präsporen- und Prästielzellen in entsprechende Sporen- und Stielzellen. Der entstandene
Fruchtkörper (9) ist ungefähr 4-10 mm hoch und besteht aus einem Sporenköpfchen (10) auf einem dünnen Stiel
(11).
Das Genom von Dictyostelium ist zwischen 34 und 40 Mb groß und umfasst 6 Chromosomen,
die jeweils zwischen 4 und 8 Mb groß sind. Zusätzlich sind auf dem Nukleus ungefähr
100 Kopien eines kleinen palindromischen extrachromosomalen Elements mit ungefähr
90 kb, worauf die Information für rRNA-Gene gespeichert ist. Des Weiteren findet man
repetitive Elemente, die etwa 10% des kompletten Genoms von Dictyostelium einnehmen. Im
Vergleich zu Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans und Drosphila melanogaster
ist das ausgesprochen hoch (Glöckner et al., 2001). Ebenso ist das Genom mit einem A+T
Gehalt von 78% sehr basisch und wird im Vergleich zu schon bekannten Gensequenzen nur
von dem 80% A+T reichen Genom von Plasmodium falciparum übertroffen (Gardner et al.,
2002). Das Genom ist relativ einfach aufgebaut, da die etwas A+T reicheren Introns sehr
selten und mit ca. 100 Basen relativ kurz sind (Eichinger & Noegel, 2003).
Einleitung
2.7.3
23
Dictyostelium discoideum als Modellsystem
Dictyostelium discoideum ist bereits ein etablierter Modellorganismus zur Untersuchung des
Zytoskeletts und bietet unter anderem durch sein haploides Genom zahlreiche Vorteile
gegenüber anderen Modellsystemen. Ebenso wie beim Modellorganismus Saccharomyces
cerevisiae ist das Genom von Dictyostelium leicht zu manipulieren. Es sind viele
molekulargenetische Techniken anwendbar. Hierzu gehören die Geninaktivierung durch
homologe Rekombination, „gene-replacement“, Antisense-Strategien, die REMI-Mutagenese
(restriction enzyme-mediated integration) und die Expression von GFP-Fusionsproteinen.
Ebenso konnte gezeigt werden, dass sich Gene durch interference RNA (RNAi) ausschalten
lassen (Martens et al., 2002). Ein weiterer Vorteil im Vergleich zur Hefe besteht darin, dass
D. discoideum beweglich sowie phagozytisch aktiv ist und sich als multizellulärer
Organismus differenziert und entwickelt. Die Chemotaxismechanismen gleichen denen von
Lymphozyten. Die Phagozytose und Motilität ähnelt humanen Makrophagen und die
Differenzierungsprozesse sind mit denen der Säugerzellen während ihrer Entwicklung
vergleichbar. Außerdem ist dieser Organismus für die Laborarbeit gut geeignet, da sich
Sporen sehr leicht einfrieren und wieder auftauen lassen. Durch Mutagenese des Wildtyps
NC4 sind die Stämme AX2 und AX4 entstanden, die in axenischem Flüssigmedium
kultivierbar sind (Eichinger & Noegel, 2003). Aufgrund der oben genannten Vorteile, eignet
sich D. discoideum zur Untersuchung von Wirt-Pathogen Interaktionen. Anwendungen dieses
Modells sind die Virulenzanalyse von Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila,
Mycobacterium avium, dem Umweltisolat LLAP K62 und verschiedenen Endozytobionten
(Cosson et al., 2002; Hägele et al., 2000; Skriwan et al., 2002; Solomon et al., 2000). Neben
der Aufklärung bakterieller Faktoren eignet sich D. discoideum auch zur Untersuchung wirtsspezifischer Faktoren, die während der Infektion eine Rolle spielen. Das TACO-Protein von
humanen Makrophagen ist bei der Infektion mit pathogenen Bakterien wichtig. In
Deletionsmutanten kann die Phagolysosomfusion nicht mehr inhibiert werden, so dass die
intrazelluläre Replikationsrate der Bakterien sinkt. Ein in D. discoideum homologes Protein
ist das Coronin. Infektionsversuche mit einer Coronin-minus Mutante haben allerdings
gezeigt, dass sich Legionellen sogar besser vermehren können als im Wildtyp. Ebenso können
sich Legionellen in einer myoA/B-Doppelmutante von Myosin I besser vermehren. Diese
Myosin I Isoformen spielen in D. discoideum eine wichtige Rolle bei der Fortbewegung der
Zelle und der Endozytose. Die Replikationsrate von L. pneumophila ist in Gβ-Mutanten
vermindert. Gβ ist eine Untereinheit des trimären G Proteins, das eine Rolle im Signalweg der
Zelle spielt (Solomon et al., 2000; Fajardo et al., 2004). Des Weiteren kann Dictyostelium als
Einleitung
24
Modellsystem dienen, da es genetische Sequenzen und Proteine besitzt, die man sowohl in
Prokaryoten als auch in Eukaryoten finden kann. Ein Beispiel hierfür ist das Nramp-Protein
(natural resistance associated macrophage protein), das für einen pH-abhängigen,
zweiwertigen Metallionentransport zuständig ist. In Säugern wird Nramp1 nur in Zellen der
retikuloendothelialen Organe (Leber und Milz) sowie in den von ihnen produzierten
Makrophagen exprimiert. Im Gegensatz dazu kann man Nramp2 in jeder Art Zelle finden.
Immunfluoreszenzstudien haben gezeigt, dass Nramp1 in Makrophagen gleich nach der
Phagozytose auf die Membran reifender Phagosomen rekrutiert wird. Seine Aufgabe hier ist
der Transport zweiwertiger Kationen wie Fe2+, Cu2+, Zn2+ und Mn2+. Es gibt zwei
Hypothesen für die Richtung des Kationentransports. Zum einen könnten Kationen aus dem
Phagosom heraustransportiert werden. Der Effekt auf die sich im Phagosom befindlichen
Bakterien ist, dass ihnen eine Reihe von wichtigen Nährstoffen zum Überleben und
Kofaktoren zur Synthese wichtiger Enzyme wie der Superoxiddismutase fehlen. Zum anderen
könnten die Kationen aber auch in das Phagosom hineintransportiert werden. Das würde dazu
führen, dass nach der Haber-Weiss-Reaktion Sauerstoffradikale gebildet werden. Beide
Hypothesen würden die verminderte Überlebensrate von Bakterien im Phagosom von nramppositiven Zellen erklären. In nramp-Deletionsmutanten wiederum würde eine erhöhte
intrazelluläre Vermehrungsrate pathogener Bakterien zustande kommen (Forbes & Gros,
2001). Beim Menschen konnte man durch die Identifizierung von polymorphen nramp1Genen eine erhöhte Anfälligkeit für Tuberkulose finden (Bellamy, 1999). Neben der
Untersuchung
einzelner
Gene
ist
es
heute
möglich
das
annähernd
komplette
Expressionsmuster von D. discoideum zu analysieren. Eine relativ neue Methode mehrere
Gene auf ihre Expression zu untersuchen ist die Microarrayanalyse. Hierzu werden die
gewünschten Gensequenzen von genomischer DNA oder cDNA mittels PCR amplifiziert, in
Mikrotiterplatten aufbewahrt und mittels eines automatischen Spotters auf Glasobjektträger
aufgebracht. Zum Vergleich der Genexpression wird RNA aus Experiment- und Kontrollzellen gewonnen, in cDNA umgeschrieben und mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen
markiert. Nach Hybridisierung der cDNAs mit dem Microarray, werden die Intensitäten der
an Experiment und Kontrolle gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe mit Hilfe von zwei
verschiedenen Lasern ausgelesen. Die Signale der Sonden werden quantifiziert und
anschließend ausgewertet. So kann man reprimierte und exprimierte Gene durch Bildung des
Quotienten der Lasersignale aus Experiment und Kontrolle bestimmen (Duggan et al., 1999).
Bis zu dieser Zeit wurden das Genexpressionsmuster mit Hilfe von Microarrays durch zwei
Arbeitsgruppen untersucht. Iranfar et al. benutzen einen Chip mit 690 definierten Genen und
Einleitung
25
einer Reihe von cDNAs, die während des Vielzellstadiums von Dictyostelium gewonnen
wurden. Die Studie war auf die Untersuchung der zeitlichen Expression zelltypspezifischer
Gene ausgerichtet (Iranfar et al., 2001). Der zweite Chip mit mehr als 5500 cDNAs aus dem
japanischen EST Projekt (expressed sequence tag) wurde ebenfalls zur Analyse des
Entwicklungszyklusses von D. discoideum verwendet (Van Driessche et al., 2002). In
Abbildung 3 ist das Prinzip der Microarrayanalyse dargestellt.
Test-RNA
Kontroll-RNA
Laserreize
DNA Klone
1
Reverse
Transkription und
Markierung mit
Cy3 bzw. Cy5
2
Emission
PCR Amplifikation
und Reinigung
Aufbringen der
Sonden auf den
Chip
Hybridisierung
Computeranalyse
Abb. 3 Prinzip der DNA Microarrayanalyse. Nach PCR Amplifikation der Sonden, wird die cDNA auf einen
Standardglasobjektträger aufgebracht. Die aus den Experimenten gewonnene RNA wird in cDNA
umgeschrieben und mit den Farbstoffen Cy3 bzw. Cy5 markiert. Nach Hybridisierung der cDNAs auf dem
Microarray, werden die rot, grün oder gelb leuchtenden Punkte auf dem Chip gescannt und mit Hilfe spezieller
Programme ausgewertet (modifiziert nach Duggan et al., 1999).
Des Weiteren entwickelten Farbrother et al. an der Universität Köln einen cDNA-Microchip
mit 450 veröffentlichten D. discoideum Genen und 5800 nicht-redundanten ESTs des
D. discoideum cDNA Projekts. Dies war unter anderem dadurch möglich, dass die
Sequenzierung des Genoms durch das Sequenzierkonsortium (Universität Köln, Baylor
College of Medicine in Houston, Sanger Institut in Hinxton, Universität Dundee etc.)
abgeschlossen ist und sich in der Analysephase befindet (Farbrother, 2004).
Einleitung
2.8
2.8.1
26
Das Mip-Protein von Legionella pneumophila
Struktur und Lokalisierung von Mip
Das Mip-Protein (macrophage invectivity potentiator) zählt zu den ältesten bekannten
Virulenzfaktoren von L. pneumophila. Trotz eingehender Studien ist die in vivo Funktion
dieses Proteins bisher noch nicht eindeutig aufgeklärt. Im Jahr 2001 konnte die Struktur von
Mip durch Röntgenstrukturanalyse in der Arbeitsgruppe von Prof. Hilgenfled aufgeklärt
werden. Mip ist ein 25 kDa großes Protein, das als Homodimer vorliegt. Das Monomer
besteht aus zwei Domänen, die über eine lange α-Helix miteinander verbunden sind. Die Nterminale Domäne besteht aus zwei antiparallelen α-Helices, die aus den Aminosäureresten
10-28 (α1) und 35-46 (α2) gebildet werden. Diese beiden Helices werden durch einen
6 Aminosäure langen Loop verbunden und sind wichtig für die Dimerisierung des MipMonomers. Über einen 8 Aminosäuren langen Loop ist das N-terminale Ende an eine
45 Aminosäuren lange Verbindungshelix (α3) gebunden. Mit 65 Ångström ist diese Helix die
längste freistehende Helix unter allen bekannten Proteinen. Die Stabilisierung wird durch
Salzbrücken und Wasserstoffbindungen innerhalb der beiden Stränge der Helix erreicht. Die
α3 Verbindungshelix endet in der C-terminalen Domäne, die aus den Aminosäureresten 100213 besteht und das aktive enzymatische Zentrum enthält. Die C- terminale Domäne besteht
aus 6 antiparallelen β-Faltblattstrukturen und einer α-Helix, die über kurze Loops verbunden
sind. Die Dimerisierung wird hauptsächlich erreicht durch hydrophobe Wechselwirkungen
zwischen den α1 und α2 Helices in den N-terminalen Domänen beider Monomere. Ebenso
beteiligt an der stabilen Ausbildung des Dimers sind polare Wechselwirkungen zwischen den
Monomer-Helices. Ungewöhnlich hierbei ist die Bildung eines sog. „Methionin-zippers“
durch Met 38 und Met 42 des einen Monomers mit Met 42 und Met 38 des anderen
Monomers.
Mip
gehört
zu
den
FK506-Bindeproteinen
(FKBP)
und
kann
die
Immunosuppressoren FK506 und Rapamycin binden. Die Bindung findet in dem
hydrophoben Hohlraum zwischen der α4 Helix und der inneren Wand des β-Faltblattes in der
C-terminalen Domäne statt. Die hydrophoben Reste, die die Bindung vermitteln, sind in der
Familie der FKBPs stark konserviert (Riboldi-Tunnicliffe et al., 2001).
Einleitung
27
C-terminale Domäne
N-terminale Domäne
Abb. 4 Modell der Röntgenkristallstruktur des homodimeren Mip-Proteins aus Legionella pneumophila. Jedes
Monomer besteht aus zwei Domänen, die über eine lange α-Helix miteinander verbunden sind. Die C-terminale
Domäne enthält das PPIase-aktive Zentrum. Die Dimerisierung erfolgt durch hydrophobe Wechselwirkungen
innerhalb der N-terminalen Domäne (nach Riboldi-Tunnicliffe et al., 2001).
Das nichtprozessierte Vorläuferprotein von Mip besitzt eine 20 Aminosäuren umfassende
Signalsequenz am N-Terminus, welche von der Signalpeptidase erkannt wird. Mip ist im
Zytoplasma von Legionellen zu finden (Ludwig, 1992). Ebenso haben Studien mit
goldmarkierten Antikörpern gezeigt, dass das prozessierte Protein über die ganze
Bakterienzelle verteilt in der Zellwand lokalisiert ist. Ebenso ist Mip auf der bakteriellen
Oberfläche in intrazellulären Legionellen zu sehen. In infizierten A. castellanii kann 6 h nach
Infektion mit L. pneumophila das Mip-Protein in multilamellaren Membranstrukturen der
Wirtszelle nachgewiesen werden (Helbig et al., 2001).
2.8.2
Einteilung und Funktion von PPIasen
Die C-terminale Domäne von Mip weist Homologien zu FK506-Bindeproteinen (FKPBs) auf.
Diese FKBPs gehören zu den Immunophilinen, einer Enzymklasse, die die Isomerisierung
von Peptidyl-Prolylbindungen einstellen. Die Rotationsbarriere zwischen den beiden cis und
trans Isoformen ist mit ca. 85 kJ/ml relativ hoch, wobei der thermodynamische Unterschied
zwischen beiden Isomeren mit 4 kJ/ml eher klein ist. Daher ist infolge der hohen
Aktivierungsenergie die Einstellung des Gleichgewichts zwischen cis und trans der
geschwindigkeitsbestimmende Faktor bei der Ausbildung von Strukturelementen in Proteinen
(Schmid et al., 1993). Als Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen (PPIasen) werden diejenigen
Enzyme bezeichnet, die in der Lage sind, die Einstellung dieses Gleichgewichts zu
Einleitung
28
beschleunigen. Man findet Proteine mit PPIase-Aktivität in allen Organismen. Es sind bis
zum Zeitpunkt dieser Arbeit drei Klassen von Proteinen mit PPIase-Aktivität bekannt. Die
Cyclophiline als erste Gruppe ist durch Cyclosporin A (CsA) hemmbar. Des Weiteren kennt
man Parvuline und FK506-Bindeproteine. Parvuline sind weder durch Cyclosporin A noch
durch FK506 hemmbar. FKBPs findet man sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten.
Die Aktivität kann durch nanomolare Konzentrationen an FK506, Ascomycin und Rapamycin
gehemmt werden, wobei die Affinität von Mip (L.p.FKBP25) zu Rapamycin etwa 10 mal
größer ist als zu FK506 (Ludwig et al., 1994; Galat & Metcalfe, 1995).
Cyclosporin
A,
FK506
und
Rapamycin
werden
bei
Organtransplantationen
als
Immunsuppressiva eingesetzt. Binden diese Immunsuppressiva an ihre zellulären Rezeptoren,
wird die Aktivität der Ca2+-Calmodulin abhängigen Proteinphosphatase Calcineurin inhibiert
(Liu et al., 1991). Das wiederum führt über weitere Schritte zur Inhibierung der IL-2
Ausschüttung durch die T-Helferzellen. Die T-Zell-Aktivierung wird beim FKBPRapamycin-Komplex etwas später in der Signalkaskade inhibiert als beim Cyclophilin-CsA
oder FKBP-FK506 Komplex (Schreiber, 1991).
2.8.3
Infektionsstudien
Durch Southernblot Hybridisierungen konnte man mip-homologe Gene auch außerhalb der
Legionella Spezies finden, wie in Coxiella burnetii und Rochalimaea quintana. Ebenso besitzt
Chlamydia trachomatis eine Mip-ähnliche PPIase, die während der frühen Phase der Infektion
eine Rolle spielt und für die intrazelluläre Replikation wichtig ist. Das Mip-Protein ist bei
Chlamydien aber weder auf der Oberfläche von Elementar- noch auf Retikularkörpern zu
finden. Neben den Haupt-PPIasen in E. coli, den Cyclophilinen Cyp18cy und Cyp21peri,
konnte ein Mip-ähnliches dimeres FKBP22 gefunden werden. Im Gegensatz zum
L.p.FKBP25, liegt das FKBP22 nicht auf der Bakterienoberfläche, sondern im Periplasma vor
(Rahfeld et al., 1996). Trypanosoma cruzi sekretiert eine PPIase (TcMip) auf die Oberfläche,
die die Invasion in Säuger-Wirtszellen verstärkt. Man geht davon aus, dass TcMip am
Invasionsprozess des Parasiten in die Wirtszelle beteiligt ist. Durch Blockade von TcMip
durch spezifische Antikörper ist die Aufnahme vermindert bzw. durch Zugabe von
rekombinantem Protein wird die Invasivität erhöht (Moro et al., 1995). Das monomere TcMip
kann in Invasionsassays mit T. cruzi durch das Legionella Mip effektiv ersetzt werden, was
auf eine funktionelle Ähnlichkeit schliessen lässt (Pereira et al., 2002). Mip-ähnliche Proteine
und mip-homologe Gene konnten jedoch nicht nur in pathogenen, sondern auch in
Einleitung
29
apathogenen Bakterien wie E. coli K-12 gefunden werden. Daraus kann geschlossen werden,
dass dieses Protein generell bei den meisten Prokaryoten vorkommt.
Das Mip-Protein von L. pneumophila spielt keine Rolle während der Aufnahme in Protozoen
oder Makrophagen (Cianciotto und Fields, 1992). Infektionsstudien mit L. pneumophila WT
und mip-Mutanten konnten jedoch zeigen, dass das Mip-Protein wichtig ist bei frühen
Ereignissen während einer Infektion in makrophagenähnlichen U937 Zellen, Blutmonozyten
und in A. castellanii (Cianciotto et al., 1989; Wintermeyer et al., 1995). Die Beteiligung der
PPIase-Aktivität während der Infektion wurde durch PPIase-defiziente L. pneumophila
Mutanten untersucht. Der Austausch der Aminosäuren Asp-142 zu Leu-142 und Tyr-185 zu
Ala-185 führte zu Proteinvarianten mit verminderten PPIase-Aktivitäten von 6,2 bzw. 2% im
Vergleich zum Wildtypprotein. Die Legionella Stämme mit verminderter PPIase-Aktivität des
Mip-Proteins zeigten bei Infektionsstudien in Makrophagen, Blutmonozyten und in
A. castellanii keine Unterschiede in ihrer Replikationsrate zum Wildtyp. Im monozellulären
System spielt die PPIase-Aktivität keine Rolle, bzw. reicht die geringe Restaktivität für die
volle Virulenz nicht aus (Wintermeyer et al., 1995). Im Gegensatz zum monozellulären
System ist die PPIase-Aktivität im Meerschweinchenmodell wichtig. Ebenso wie die
enzymatische Aktivität kann die Quartärstruktur des L. pneumophila Mip-Proteins für die
Virulenz wichtig sein. Sowohl in Lösung als auch auf der Bakterienoberfläche liegt Mip als
Dimer vor. Durch cis Komplementation der mip-negativen Mutante wurde eine
L. pneumophila Variante konstruiert, die nur noch monomeres Mip [Mip(77-213)] exprimiert.
Die PPIase-Aktivität ist im monomeren Protein nicht vermindert. Infektionsstudien mit der
monomeren Mip-exprimierenden Variante konnten zeigen, dass die Replikation der
Legionellen sowohl im monozellulären System, als auch im Meerschweinchenmodell
vermindert ist. Die restriktiveren Bedingungen im Tier durch das Vorhandensein
verschiedener Zelltypen, eines extrazellulären Millieus und eines effektiven Immunsystems
sind vermutlich ausschlaggebend für die verminderte Vermehrung der isomerasedefizienten
Legionella Mip-Varianten (Köhler, 2000). Warum die PPIase-Aktivität nur im Tiermodell
eine Rolle spielt ist Teil dieser Arbeit.
Einleitung
2.9
30
Zielsetzung der Arbeit
Dictyostelium konnte als Modellsystem zur Untersuchung der Interaktion mit verschiedenen
intrazellulären Pathogenen etabliert werden. In dieser Arbeit sollte gezeigt werden, ob sich
das Modell D. discoideum auch als Wirtssystem für Endozytobionten eignet. Hierfür sollten
Invasionstudien mit verschiedenen Vertretern der Endozytobionten gemacht werden.
Ausgewählt wurden der Neochlamydien-Verwandte TUME1, der Parachlamydien-Verwandte
UWE25 und das β-Proteobakterium UWC6.
Zur weiteren Untersuchung von D. discoideum als Modellsystem sollte in Zusammenarbeit
mit Patrick Farbrother (Universität Köln) das mRNA-Expressionsmuster von uninfizierten
und mit verschiedenen Legionellen infizierten Dictyostelien verglichen werden. Hierzu
sollten zu verschiedenen Zeitpunkten RNA aus Dictyostelien isoliert werden die jeweils mit
L. pneumophila WT, L. hackeliae und einer L pneumophila dotA-Mutante infiziert wurden.
Für eine Zeitreihe sollte das Expressionsmuster über 48 h beobachtet werden. Mit der
isolierten RNA sollte ein cDNA-Microarray hybridisiert werden, auf dem sich ca. 6000 Gene
von D. discoideum befinden.
Zur Untersuchung, welche Rolle das Nramp-Protein von D. discoideum während einer
Infektion mit Bakterien spielt, sollten Dictyostelien mit L. pneumophila und M. avium
infiziert und die RNA zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert werden. Mit Hilfe von Northernblots sollte die Expression von nramp-RNA nachgewiesen werden. Ebenso sollte durch
Invasionsassays in D. discoideum WT und einer nramp-Mutante die Notwendigkeit von
Nramp während einer Infektion mit L. pneumophila und M. avium untersucht werden.
Aufgrund der wichtigen Rolle der PPIase-Aktivität während einer Infektion im Tiermodell,
soll eine eventuelle extrazelluläre Funktion der PPIase von Mip untersucht werden. Hierzu
sollten Bindestudien von Mip an extrazelluläre Matrixproteine zeigen, ob es einen
extrazellulären Bindungspartner von Mip gibt. Des Weiteren soll überprüft werden, welche
Rolle Mip während der Penetration von Legionellen durch das Lungengewebe spielt und ob
Mip an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt ist.
Material und Methoden
31
3 Material und Methoden
3.1
Geräte
Die in dieser Arbeit verwendeten Geräte sind in folgender Tabelle aufgelistet.
Tabelle1 Verwendete Geräte
Analysenwaage
Chyo JL-180
Autoklav
Fedegari Autoklavi
Brutschrank
Heraeus, Memmert
Durchflusszytometer (FACScan)
Becton Dickinson
Eismaschine
Scotsman AF-20
Elektrophoresekammern
Institutswerkstatt, Pharmacia, BioRad
Elektronenmikroskop
Zeiss EM 10
ELISA-Reader
Dynatech Laboratories MRX
Thermo Elektron Corporation Multiscan Ascent
Entwicklermaschine
Agfa, Curex 60
Fluoreszenzmikroskop
Axiovert 25, Zeiss, Zeiss Filtersets 00 und 10
Kamera: Intas Lowlight CCD
Fotometer
Unicam 8625
Geldokumentationsapparatur
BioRad Gel Doc 2000
Gefrierschrank –20°C
Privileg Senator
Gefrierschrank –80°C
Revco
Gelelektrophoreseapparatur
BioRad, Pharmacia GNA-100
Grobwaage
Kern 470
Hybridisierungsofen
Bachofer
Kühlzentrifuge
Heraeus Multifuge 1 L-R
Magnetrührer
Magnetmix 2070
Mikrowelle
AEG Micromat
Netzgeräte
Consort E455, BioRad PowerPac 3000
Pipetten
Gilson, Eppendorf
pH-Meter
WTW pH525
Schüttler
Innova 4300 Incubator Shaker
Scintillationsmessgerät
Packard Scintillation Analyzer 1600 TR
Material und Methoden
32
Sicherheitswerkbank
Nunc Microflow
Thermoblock
Eppendorf Thermostat 5320
Tischzentrifuge
Eppendorf Centrifuge 5415C
Vortexer
Boscamp Mixomat
3.2
Verwendete Bakterienstämme
Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in folgender Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 2 Verwendete Bakterienstämme
Stamm
Charakteristika
Referenz
Neochlamydien-verwandter
Endozytobiont TUME1
Parachlamydien-verwandter
Endozytobiont UWE25
Endozytobiont von Acanthamoeba sp.
TUME1
Fritsche et al.,
2000
Endozytobiont von Acanthamoeba sp.
UWE25
Fritsche et al.,
2000
β-Proteobakterium
Endozytobiont UWC6
Escherichia coli HB101
Enozytobiont von Acanthamoeba sp.
UWC6
Horn et al., 2002
Escherichia coli HB101
mip auf 4,5 kb BamH I-Cla I Fragment
in pBR322, pBLL106 (Apr)
Mit pBR322Apr, Tcr
Klebsiella aerogenes
Legionella hackeliae SG 1
Legionella pneumophila
PhilI JR32
Legionella pneumophila
PhilI JR32-2
Legionella pneumophila
PhilI JR32-2.1
Legionella pneumophila
PhilI JR32-2.2
Legionella pneumophila
PhilI JR32-2.3
Legionella pneumophila
PhilI JR32-2.4
Ludwig Diss.
1992
Boyer 1969
Schleicher, LMU
München
ATCC 35250
Restriktionsdefizites Derivat von L. p.
Philadelphia I (Smr)
Marra and
Shuman, 1989
mip-negative Mutante von
L. p. PhilI JR32 (Smr, Kmr)
L. p. PhilI JR32-2 komplementiert
mit pEWMS 102 (Mip WT)
(Smr, Kmr, Cmr)
L. p. PhilI JR32-2 komplementiert
mit pEWMS 205-A (Mip Y185-A)
(Smr, Kmr, Cmr)
L. p. PhilI JR32-2 komplementiert
mit pEWMS 162-L (Mip D142-L)
(Smr, Kmr, Cmr)
L. p. PhilI JR32-2 komplementiert
mit pRK105 (Mip1-4, 77-238)
(Smr, Kmr, Cmr)
Wintermeyer
Diss. 1994
Wintermeyer
Diss. 1994
Wintermeyer
Diss. 1994
Wintermeyer
Diss. 1994
Köhler Diss.
2000
Material und Methoden
33
Legionella pneumophila
PhilI JR32 LELA 3118
dotA 3118:Tn903DLL LacZ
Ko et al., 2003
Legionella pneumophila
Corby
Virulentes Patientenisolat
Serogruppe 1
mip-negative Mutante von L. p. Corby
(Rifr, Kmr)
L. p. Corby-1 komplementiert mit
pEWM 103 (Mip WT) (Rifr, Cmr,Kmr)
Jepras et al.,
1985
Wintermeyer
Diss. 1994
L. p. Corby transformiert mit
pRK10(pBC(gfp)-Pmip) (Rifr, Cmr, Kmr)
Köhler Diss.
2000
streptomycinresistentes Derivat
von L. p. Wadsworth (Smr)
mip-negative Mutante von L. p.
Wadsworth NU 201 (Smr, Kmr)
Cianciotto and
Fields, 1992
Legionella pneumophila
Corby-1
Legionella pneumophila
Corby-1 (pEWM 103)
Legionella pneumophila
Corby (pRK10(pBC(gfp)Pmip))
Legionella pneumophila
Wadsworth NU 201
Legionella pneumophila
Wadsworth NU 203
Legionella pneumophila
Wadsworth NU 203.1
Mycobakterium avium
Pseudomonas aeruginosa
3.3
Wintermeyer
Diss. 1994
Cianciotto and
Fields, 1992
L. p. Wadsw. NU 203 komplementiert mit Wintermeyer
pEWMS 102 (Mip WT) (Smr, Kmr, Cmr) Diss. 1994
Isolat aus AIDS-Patient
Klinisches Isolat
ATCC 35713
Würzburg
Wirtszellen
Die in dieser Arbeit verwendeten Wirtszellen sind in folgender Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 3 Verwendete Wirtszellen
Organismus
Charakteristika
Referenz
Dictyostelium discoideum
Axenisiertes Umweltisolat
AX2
Dictyostelium discoideum
Knockout Mutante von Nramp1
AX2 HSB60
Schleicher, LMU
München
Acanthamoeba sp.
TUME1
trägt den Neochlamydien-verwandten
Endozytobiont TUME1
Fritsche et al., 2000
Acanthamoeba sp.
UWE25
trägt den Parachlamydien-verwandten
Endozytobiont UWE25
Acanthamoeba sp. UWC6 trägt das β-Proteobakterium UWC6
Lungenepithelzellen
Epithelzellen aus humanem mucoNCI-H292
epidermoiden Lungenkarzinom
Lungenepithelzellen A549
Lungenepithelzellen
Calu3
Bozzaro, Turin
Fritsche et al., 2000
Horn et al., 2002
ATCC: CRL-1848
ATCC: CCL-185
ATCC: HTB-55
Material und Methoden
3.4
34
Antikörper
Die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper sind in folgender Tabelle aufgeführt.
Tabelle 4 Verwendete Antikörper
Bezeichnung
Verdünnung Hersteller/Quelle
Monoklonaler Maus-Anti-Mip (2D8)
1 : 700
Bubert, Würzburg
Ziege-Anti-Maus-HRP
1 : 1500
Dako, Hamburg
Anti-Kaninchen-Cy3
1 : 200
Dianova, Hamburg
Polyklonaler Kaninchen-Anti-Collagen Typ IV 1 : 500
3.5
Biomol, Hamburg
Chemikalien
Die während dieser Arbeit benötigten Chemikalien wurden von folgenden Firmen bezogen:
Applichem, Darmstadt; BD Biosciences Clontech, Heidelberg; Carl Roth GmbH, Karlsruhe;
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot; Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg; Invitrogen GmbH,
Karlsruhe; Oxoid GmbH, Wesel; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen; VWR
International, Nürnberg.
3.6
Antibiotika
Für die Selektion auf vektortragende Bakterien und Dictyostelium Knockout-Mutanten
werden folgende Antibiotika-Zusätze in Nährmedien bzw. Agarplatten eingesetzt.
Tabelle 5 Verwendete Antibiotika
Antibiotika
Konzentration
Ampicillin (Ap)
100 µg/ml
Blasticidin S (Bsr)
10 µg/ml
Chloramphenicol (Cm) 25 µg/ml
Kanamycin (Km)
10 µg/ml
Gentamicin (Gm)
10 µg/ml
Material und Methoden
3.7
35
16S- und 18S-rRNA-Sonden zur in situ Hybridisierung
Die in dieser Arbeit verwendeten Sonden sind in Tabelle 6 aufgeführt. Die Sonden lieferte die
Firma MWG-Biotech AG bzw. wurden von Matthias Horn (Technische Universität,
München) zur Verfügung gestellt.
Tabelle 6 Verwendete Sonden
Bezeichnung Basenabfolge (5`-> 3`)
Fluoreszenzfarbstoff
AcBet42a
GCC TTC CCA CTT CGT TT
Cy3
Bn9658
TCCGTTTTCTCCGCCTAC
Cy3
C22658
TCCATTTTCTCCGTCTAC
Cy3
DICT2
GCC AGT CAC CCA TCG CTT
Fluorescein
EUB338
GCT GCC TCC CGT AGG GAG T Cy3
Tabelle 7 Für die rRNA-Hybridisierung und Immunfluoreszenz verwendete Fluoreszenzfarbstoffe
Fluoreszenz-
Absorptions-
Emissions-
Molarer Extinktions-
Farbstoff
maximum [nm]
maximum [nm]
Koeffizient ε [1 x mol-1 x cm]
FLUOS
494
518
7,5 x 104
Cy3
554
570
1,3 x 105
3.8
Anzucht der Bakterienstämme
3.8.1
Anzucht von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli, Klebsiella aerogenes und Pseudomonas aeruginosa wachsen über Nacht bei
37°C. Die Bakterien werden mit sterilem Wasser auf die gewünschte optische Dichte (OD550)
eingestellt.
•
LB-Agar für die Anzucht von E. coli und P. aeruginosa
Caseinhydrolysat
10 g
Hefeextrakt
5g
NaCl
5g
Agar
15 g
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen und autoklavieren
Material und Methoden
•
36
SM-Agar für die Anzucht von K. aerogenes
Bacto-Pepton (Difco)
10 g
Glukose
10 g
Hefeextrakt
1g
MgSO4
1g
KH2PO4
2,2 g
K2HPO4
1,3 g
Kobaltchlorid
0,3 g
Agar
15 g
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen und autoklavieren
3.8.2
Anzucht von Legionella und LLAP K62
Legionella pneumophila werden auf BCYE-Agar bei 37°C und 5% CO2 Atmosphäre für 4 bis
5 Tage bis zur stationären Phase kultiviert. LLAP K62 werden auf BCYE-Agar bei 30°C und
5% CO2 Atmosphäre für 6 bis 7 Tage kultiviert. Die Bakterien werden mit sterilem Wasser
von der Agarplatte abgeschwemmt und auf die gewünschte optische Dichte (OD600)
eingestellt.
•
BCYE-Agar für die Anzucht von L pneumophila und LLAP K62
ACES
Hefeextrakt
5g
10 g
in 1000 ml H2Odest. lösen und den pH-Wert mit 10 N KOH auf 6,9 einstellen
Aktivkohle
Agar
2g
15 g
zugeben und autoklavieren
Agar auf ungefähr 40°C abkühlen lassen
Cystein
0,4 g in 10 ml H2Odest.
Eisen(III)NO3
0,25 g in 10 ml H2Odest.
sterilfiltrieren und vor dem Gießen der Platten zugeben
3.9
Anzucht von Mykobakterien
Für die Anzucht von Mykobakterien werden 50 µl einer Glycerinkultur in 20 bis 30 ml
Middlebrook-7H9-Medium pipettiert und bei 37°C geschüttelt bis eine OD600 von 1 erreicht
Material und Methoden
37
ist. Eine OD600 = 1 entsprechen einer Zellzahl von etwa 1 x 108 Bakterien/ml. Die
Mykobakterien können direkt nach Einstellen der gewünschten OD für Infektionsversuche
eingesetzt werden.
•
Middlebrook-7H9-Medium für die Anzucht von Mykobakterien
Middlebrook Brooth 7H9
4,7 g
20% Tween 80
5 ml
auf 900 ml H2Odest. auffüllen, autoklavieren und auf 45°C abkühlen
OADC-Anreicherung
•
20 ml
Middlebrook-7H11-Agar für die Anzucht von Mykobakterien
Middlebrook-7H11-Agar
21 g
Glycerin
5 ml
auf 900 ml H2Odest. auffüllen, autoklavieren und auf 45°C abkühlen
OADC-Anreicherung
100 ml
3.10 Kultivierung von Dictyostelium discoideum
Da bei dem haploiden Organismus D. discoideum häufig Spontanmutationen auftreten,
werden die Amöben nicht kontinuierlich weiterkultiviert. Es wird ein Vorrat an Sporen in
flüssigem Stickstoff angelegt, aus dem man jede Woche eine Vorkultur auftaut und von dieser
Hauptkulturen anlegt. Um einen neuen Jahresvorrat anzulegen, werden die Sporen in 75 cm2
Zellkulturflaschen mit 10 ml HL5-Medium überführt. Bei 23°C keimen die Sporen zu
Amöben aus und bilden innerhalb von 3 bis 4 Tagen einen Zellrasen. Anschließend werden
drei 1 Liter Erlenmeyerkolben mit je 300 ml HL5-Medium befüllt und mit je 3 ml der
Vorkultur beimpft. Die Kolben werden bei 23°C und 150 rpm geschüttelt bis eine Zellzahl
von 2-4 x 106 Zellen/ml erreicht ist. Die Zellen werden geerntet indem sie bei 1000 rpm für
5 min zentrifugiert und zweimal mit Soerensenpuffer pH 6,0 gewaschen werden. Das
Zellpellet wird in wenig Soerensenpuffer aufgenommen und auf Soerensenagarplatten
ausplattiert. Die Agarplatten werden bei 23°C inkubiert, wobei nach 48 Stunden Fruchtkörper
mit gelben Sporenköpfen ausgebildet werden. Diese Fruchtkörper mit den reifen Sporen
werden mit sterilem Soerensenpuffer von der Agarplatte abgeschwemmt und in 1 ml Aliquots
in flüssigem Stickstoff eingefroren. Aus diesem Vorrat wird jede Woche ein Aliquot aufgetaut
und in 20 ml HL5-Medium in einer 75 cm2 Zellkulturflasche bei 23°C inkubiert. Wenn eine
Zellzahl von 2-5 x 106 Dictyostelien/ml erreicht ist, wird die Zellkulturflasche mit der
Material und Methoden
38
Vorkultur bis zu 10 Tage bei 4°C gelagert. Aus dieser Vorkultur wird je nach Bedarf die
Arbeitskultur angeimpft.
•
HL5-Medium
Proteose Pepton
14,3 g
Hefeextrakt
7,15 g
Glukose
15,4 g
Na2HPO4
1,28 g
KH2PO4
0,49 g
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen und den pH-Wert mit 10 N KOH auf 7,5 einstellen
•
50 x Soerensenpuffer
KH2PO4
99,9 g
Na2HPO4
17,8 g
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen
•
Soerensenagar
Agar
15 g
mit 1 x Soerensenpuffer auf 1000 ml auffüllen
•
Infektionsmedium
HL5-Medium und 1 x Soerensenpuffer im Verhältnis 1:1 mischen
3.11 Kultivierung von endozytobiontenhaltigen Acanthamoeba sp.
Da endozytobiontenhaltige Acanthamöben nicht in flüssigem Stickstoff konserviert werden
können, muss eine kontinuierliche Kultur angelegt werden. Hierzu werden in 75 cm2
Zellkulturflaschen 20 ml TSY-Medium mit 2 ml einer bestehenden Amöbenkultur angeimpft
und bei Raumtemperatur inkubiert. Sobald sich ein Zellrasen gebildet hat, werden die
Amöben durch Klopfen der Zellkulturflasche auf eine Tischkante vom Flaschenboden
abgelöst und zum Beimpfen einer neuen Kultur verwendet.
•
TSY-Medium
Trypticase Soja Bouillon
30 g
Hefeextrakt
10 g
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen und den pH-Wert mit 10 N KOH auf 7,3 einstellen
Material und Methoden
39
3.12 Infektion von Dictyostelium discoideum
3.12.1 Vorbereitung von Dictyostelien für die Infektion
Um eine Arbeitskultur von D. discoideum zu erhalten, werden in einer 75 cm2
Zellkulturflasche 20 ml HL5-Medium mit 500 µl der Dictyostelium-Vorkultur beimpft und
bei 23°C inkubiert. Wenn sich nach 2 bis 3 Tagen ein Zellrasen gebildet hat, werden die
Dictyostelien durch Klopfen der Flasche auf eine Tischkante vom Boden gelöst.
Anschließend werden die Zellen bei 1000 rpm für 5 min abzentrifugiert und mit
Soerensenpuffer
gewaschen.
Für
die
Infektion
werden
die
Dictyostelien
mit
Infektionsmedium auf die gewünschte Zellzahl eingestellt.
3.12.2 Infektion von Dictyostelien mit Legionellen
Die Infektion von Dictyostelium mit Legionella bzw. LLAP K62 findet in 25 cm2
Zellkulturflaschen statt. Hierzu werden 5 x 105 Dictyostelien/ml im Infektionsmedium mit
1 x 104 Legionellen/ml infiziert, was einer MOI von 0,02 entspricht. Bei dieser geringen
Infektionsdosis kann davon ausgegangen werden, dass alle Legionellen von den Dictyostelien
aufgenommen werden. Zur Bestimmung des 0 h-Wertes, werden sofort nach Zugabe der
Legionellen die Wirtszellen durch Klopfen der Infektionsflasche auf eine Tischkante vom
Flaschenboden gelöst. Es wird ein Aliquot von 300 µl entnommen. Durch 3 minütiges
Zentrifugieren bei 13000 rpm und starkes Vortexen werden die Wirtszellen zerstört. Durch
Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten wird die Bakterienzahl/ml
bestimmt. Die Infektionsflaschen werden über 96 h bei 24,5°C inkubiert, wobei nach 24, 48,
72 und 96 h erneut Aliquots entnommen werden, um die Zunahme oder Abnahme der
Bakterienzahl zu bestimmen.
3.12.3 Infektion von Dictyostelien mit Pseudomonaden
Für die Infektion von Dictyostelien mit Pseudomonaden, werden 5 x 105 Wirtszellen/ml in
25 cm2 Zellkulturflaschen mit 1 x 106 Pseudomonaden/ml infiziert. Nach 3 h Koinkubationszeit bei 24,5°C werden die Zellen zweimal mit Soerensenpuffer gewaschen.
Anschließend werden die extrazellulären Bakterien durch 100 µg Gentamicin/ml im
Infektionsmedium abgetötet. Nach 30 min wird das gentamicinhaltige Medium durch
zweimaliges Waschen mit Soerensenpuffer entfernt und durch Infektionsmedium mit
Material und Methoden
40
10 µg/ml Gentamicin ersetzt. Aufgrund der reduzierten Menge an Gentamicin im Medium
wird während des Infektionszeitraumes gewährleistet, dass sich die Pseudomonaden nicht
extrazellulär vermehren können. Zu diesem Zeitpunkt wird ein Aliquot von 300 µl
entnommen und zweimal mit Soerensenpuffer bei 1000 rpm für 5 min gewaschen um das
Gentamicin zu entfernen. Nach Zentrifugation bei 13000 rpm und 3 minütigem starken
Vortexen werden die Wirtszellen zerstört und die intrazellulären Bakterien freigesetzt. Durch
Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf LB-Platten wird die intrazellulär vorhandene
Bakterienanzahl bestimmt. Ebenso werden nach 24 h und 48 h geeignete Verdünnungen
ausplattiert.
3.12.4 Infektion von Dictyostelien mit Mykobakterien
In kleinen Zellkulturflaschen werden 5 x 105 Dictyostelien/ml mit 1 x 106 Mykobakterien/ml
infiziert und bei 24,5°C koinkubiert. Drei Stunden später wird das Infektionsmedium durch
amikazinhaltiges Medium (200 µg/ml Endkonzentration) ausgetauscht um extrazelluläre
Bakterien abzutöten. Nach 1 h werden die Bakterien und das Amikazin durch dreimaliges
Waschen mit Soerensenpuffer entfernt. Die weitere Inkubation findet in Infektionsmedium
mit 20 µg/ml Amikazin statt, um die extrazelluläre Vermehrung von Mykobakterien zu
verhindern. Zu diesem Zeitpunkt wird ein Aliquot von 300 µl aus der Infektionsflasche
entnommen, dreimal mit Soerensenpuffer gewaschen und auf 7H11-Agar ausplattiert. Alle
24 h werden weitere Aliquots entnommen und geeignete Verdünnungen auf 7H11-Agar
ausplattiert um die intrazelluläre Bakterienanzahl zu bestimmen.
3.12.5 Infektion von Dictyostelien mit Endozytobionten
Für die Infektion von Dictyostelien mit Endozytobionten müssen die Endozytobionten aus
ihren Originalwirten isoliert werden. Hierzu werden die endozytobiontenhaltigen Amöben in
75 cm2 Zellkulturflaschen kultiviert, bis sie einen Monolayer am Boden der Zellkulturflasche
gebildet haben. Durch Klopfen der Zellkulturflasche auf eine Tischkante, werden die Amöben
vom Boden abgelöst. Anschließend wird die Suspension bei maximaler Geschwindigkeit für
4 min zentrifugiert, um die Amöben zu zerstören. Das Pellet wird in EppendorfReaktionsgefäße überführt und zweimal mit eiskaltem, sterilen H2Odest. gewaschen. Mit Hilfe
von zwei „freeze-thaw“-Zyklen werden noch intakte Wirtszellen zerstört. Hierzu werden zum
Gefrieren die Eppendorf-Reaktionsgefässe mit den Amöben in mit 96%igem Ethanol
Material und Methoden
41
versetztes Trockeneis gelegt, bis die Suspension durchgefroren ist. Das Auftauen findet in
einem auf 37°C vorgeheizten Wärmeblock statt. Um die restlichen noch intakten Wirtszellen
zu zerstören, wird die Suspension dreimal durch eine Injektionsnadel aufgezogen und wieder
ausgeblasen. Schliesslich wird die Kanüle durch einen sterilen Filter (Minisart, Sartorius,
Porengrösse 1,2 µm) ausgetauscht und die endozytobiontenhaltige Suspension in ein steriles
Eppendorf-Reaktionsgefäss filtriert. Durch das Filtrieren werden die Amöbenreste entfernt. Ist
die Endozytobiontensuspension undurchsichtig weiß und milchig, kann mit sterilem 1 x PBS
verdünnt werden.
Für die Infektion von Dictyostelien mit Endozytobionten werden 5 ml 5 x 105
Dictyostelien/ml in einer 25 cm2 Zellkulturflasche mit 100 µl der Endozytobiontensuspension
infiziert. Da Endozytobionten nicht kultivierbar sind, wird die intrazelluläre Vermehrung
mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) beobachtet.
3.13 Fluoreszenz in situ Hybridisierung von Endozytobionten und Dictyostelien
Bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung binden spezifische, mit einem Fluoreszenzfarbstoff
markierte Oligonukleotidsonden an eine komplementäre Zielsequenz der ribosomalen RNA.
3.13.1 Fixierung von Zellen für die in situ Hybridisierung
Zur Fixierung von Zellen für die in situ Hybridisierung, werden 300 µl Zellsuspension aus der
Zellkulturflasche entnommen und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert. Hiervon
werden gleich 20 µl auf ein Feld eines 6-Feld-Objektträgers aufgetragen. Der Rest wird bei
1000 rpm für 4 min zentrifugiert. Das Pellet wird in 50 µl 1 x PBS aufgenommen und
vorsichtig resuspendiert. Hiervon werden ebenso 20 µl auf ein Feld eines 6-FeldObjektträgers aufgetragen. Zum Trocknen der Zellen, werden die Objektträger bei 37°C auf
einen vorgeheizten Heizblock gelegt. Anschließend werden auf jedes Feld 20 µl einer 4%igen PFA-Lösung aufgetropft. Die Fixierung erfolgt in einer feuchten Kammer bei
Raumtemperatur (RT). Nach einer Stunde wird das Fixans abgezogen und die Zellen mit
1 x PBS gewaschen. Die Permeabilisierung der Zellmembran erfolgt über eine aufsteigende
Ethanolreihe mit 50, 80 und 96% Ethanol für je 3 min. Der luftgetrocknete Objektträger kann
direkt zur Hybridisierung eingesetzt oder bei 4°C aufbewahrt werden.
Material und Methoden
•
42
Fixierlösung 4% Paraformaldehyd
Zur Herstellung einer 4%-igen Paraformaldehydlösung werden 99 ml H2Odest. auf
einem heizbaren Magnetrührer auf 60–65°C erwärmt. Anschließend werden 6-9 g
Paraformaldehyd zugegeben und unter Rühren gelöst. Langsam wird 1 M NaOH
zugetropft, bis die Lösung klar ist. Nach Zugabe von 49,8 ml 3 x PBS lässt man die
Lösung auf RT abkühlen. Mit konzentrierter Salzsäure wird der pH-Wert auf 7,2 bis
7,4 eingestellt. Die Fixierlösung kann in Aliquots bei –20°C eingefroren werden.
3.13.2 Färbung von Zellen mittels 16S-rRNA bzw. 18S-rRNA in situ Hybridisierung
Zur in situ Hybridisierung werden 50 ng der jeweiligen Sonde in Hybridisierungspuffer (20 µl
Endvolumen) auf die fixierte Probe aufgetropft und in einer feuchten Kammer für 1,5 h bei
46°C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wird der Hybridisierungsmix abgezogen. Um
überschüssige Sonde zu entfernen, werden die Zellen zweimal mit vorgewärmtem
Waschpuffer gewaschen und mit 20 µl Waschpuffer pro Feld in einer feuchten Kammer bei
46°C inkubiert. Nach 20 min wird der Objektträger vorsichtig mit H2Odest. gespült.
Anschließend wird der Objektträger im Dunkeln luftgetrocknet und mit Citifluor eingedeckt.
3.14 Quantifizierung der Phagozytoserate von Dictyostelium discoideum
mittels Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)
Mit
Hilfe
des
Durchflusszytometers
(FACS
für
Fluorescence
Activated
Cell
Sorting/Scanning) kann neben Größe und Granularität von Zellen auch die Expression
fluoreszierender Proteine gemessen werden. Das Green Fluorescent Protein (GFP) emittiert
nach Anregung mit Licht der Wellenlänge im Bereich von 480-501 nm grünes Licht der
Wellenlänge 507-511 nm.
Um die Phagozytoserate von D. discoideum zu ermitteln, wird 1 ml 5 x 105 Dictyostelien/ml
jeweils in eine Vertiefung einer 24-Loch-Schale pipettiert. Es werden 2,5 x 107 GFPexprimierende L. pneumophila Corby pro Napf zugegeben, was einer MOI von 50 entspricht.
Nach 3 h Koinkubation bei 24,5°C in Soerensenpuffer, werden die Zellen einmal mit
Soerensenpuffer und dreimal mit eiskaltem Soerensenpuffer gewaschen. Anschließend
werden die Zellen 5 min auf Eis gestellt, damit sie sich vom Boden der 24-Loch-Schale
ablösen. Durch vorsichtiges auf- und abpipettieren, werden die restlichen Zellen abgelöst und
Material und Methoden
43
in ein FACS-Röhrchen überführt. Am Durchflusszytometer kann nun die Anzahl der grün
leuchtenden Wirtszellen bestimmt werden.
3.15 Quantifizierung der Phagozytoserate von Dictyostelium discoideum
mittels Gentamicin-Assay
Um die Phagozytoserate von D. discoideum und nicht GFP-markierten Bakterien zu ermitteln,
wird der Gentamicin-Assay durchgeführt. Hierzu werden 5 ml von 5 x 105 Dictyostelien/ml in
einer 25 cm2 Zellkulturflasche mit 1 x 106 Legionellen/ml infiziert. Nach der gewünschten
Koinkubationszeit bei 24,5°C, wird das Infektionsmedium abgezogen und die Zellen zweimal
vorsichtig mit Soerensenpuffer gewaschen. Anschließend wird 100 µg/ml gentamicinhaltiges
Infektionsmedium
zugegeben
um
extrazelluläre
Bakterien
abzutöten.
Nach
einer
Inkubationszeit von 30 min bzw. 3 h bei 24,5°C, werden die extrazellulären Bakterien und das
Gentamicin durch dreimaliges Waschen mit Soerensenpuffer entfernt. Die Anzahl der
aufgenommenen Bakterien wird durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf BCYEAgarplatten bestimmt.
3.16 Fixierung von Zellen für die Elektronenmikroskopie
Für die Transmissionselektronenmikroskopie werden 5 x 105 Dictyostelien/ml auf runde
Deckgläschen in 24-Loch-Schalen ausgesät. Diese werden mit 100 µl Endozytobiontenfiltrat,
mit 1 x 106 LLAP K62/ml bzw. mit 1 x 106 P. aeruginosa/ml infiziert. Nach entsprechender
Inkubationszeit werden die Deckgläser mit Hilfe einer Pinzette aus den Näpfen entfernt und
für 2 h bei RT in einer 0,5 x Karnovskylösung fixiert. Anschließend werden die Deckgläschen
kurz in Wasser gewaschen und mit 25% Glutaraldehyd überschichtet. 15 min später wird das
Glutaraldehyd mit 0,2 M Cacodylatpuffer abgespült und 2% Osmiumtetroxid aufgetropft.
Nach weiteren 15 min wird das Osmiumtetroxid mit Wasser abgewaschen und die Zellen über
Nacht in 0,2 M Cacodylatpuffer bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag erfolgt die Entwässerung
der Zellen durch eine aufsteigende Alkoholreihe mit 70, 80, 90, 96 und zweimal mit 100%
Ethanol gefolgt von zweimal Propylenoxid für jeweils 5 bis 10 min. Die Zellen verbleiben für
mindestens 2 h bzw. über Nacht in einer 1:1 Mischung aus Propylenoxid und Epon, bevor sie
für weitere 2-4 h in reines Epon überführt werden. Anschließend werden Gelatinekapseln mit
Epon gefüllt und vorsichtig auf die Zellseite der Deckgläschen gepresst. Im Wärmeschrank
bei 40 bis 50°C polymerisiert das Epon innerhalb von zwei Tagen aus. Die Deckgläser
Material und Methoden
44
werden mit flüssigem Stickstoff abgesprengt. Die fertigen Präparate werden geschnitten und
kontrastiert.
3.17 Isolierung von Gesamt-RNA aus Dictyostelium discoideum
3.17.1 RNA-Isolierung nach Qiagen-Protokoll
Die RNA-Isolierung wird nach dem RNeasy Midi Protokoll zur Isolierung zytoplasmatischer
RNA durchgeführt. Die Isolierung erfolgt pro Ansatz aus 1,5 x 107 infizierten bzw. nicht
infizierten Dictyostelien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion. Für die Infektion,
werden die Bakterien mit einer MOI von 10 eingesetzt.
3.17.2 RNA-Isolierung mit Trizol
Die RNA-Isolierung erfolgt aus infizierten und nicht infizierten Dictyostelien. Für die
Infektion werden die Bakterien mit einer MOI von 10 eingesetzt.
Für die RNA-Isolierung mit Trizol, werden 5 x 107 infizierte und nicht infizierte Dictyostelien
pro Ansatz zweimal mit 0,02 M Soerensenpuffer pH 6 gewaschen. Das Pellet wird in 5 ml
Trizol resuspendiert und gevortext. Nach Zugabe von 1 ml Chloroform wird 15 s stark
gevortext und anschließend bei 3000 rpm und 4°C 45 min zentrifugiert. Die wässrige Phase
wird in ein neues Röhrchen überführt und mit 5 ml Isopropanol stark gevortext. Nach 10 min
Inkubation bei RT wird bei 3000 rpm und 4°C 45 min zentrifugiert. Das Pellet wird mit 75%
Ethanol in H2O/DEPC gewaschen (3000 rpm bei 4°C für 1 min). Anschließend wird das
Pellet in 0,4 ml H2O/DEPC resuspendiert und gevortext und bei 60°C für 10 min inkubiert.
3.17.3 Konzentrationsbestimmung von RNA
Zur Bestimmung der RNA-Konzentration, wird die Absorption der Probe bei 260 nm am
Photometer gemessen. Die zu untersuchende Probe wird 1:100 verdünnt. Unter
Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors wird die Konzentration berechnet, wobei ein
Extinktionskoeffizient von 1 einer Konzentration von 40 µg/ml RNA entspricht. Durch
Messen der Absorption bei 280 nm wird die Reinheit der Probe kontrolliert. Bei einem
Verhältnis der Absorption A260/A280 von 1,6 bis 2,1 liegt die RNA in ausreichender
Reinheit vor.
Material und Methoden
45
3.17.4 RNA-Gelelektrophorese
Die isolierte RNA wird mit Hilfe der Gelelektrophorese auf Qualität und eventuelle
Verunreinigungen mit DNA kontrolliert.
Es werden 4,2 g Agarose in 304 ml DEPC-Wasser aufgekocht und im Wasserbad abgekühlt.
Nach Abkühlen auf 60°C, werden 35 ml 10 x MOPS-Puffer und 10,5 ml 37% Formaldehyd
zugegeben und in einen vorbereiteten Gelschlitten gegossen. Das erkaltete Agarose-Gel wird
in eine mit MOPS-Puffer gefüllte Gelkammer gelegt, wo es für 30 min equilibriert. 3 µg RNA
werden mit 3 µl Ladepuffer in einem Gesamtvolumen von 20 µl gemischt und bei 55°C für
10 min inkubiert. Die Auftrennung der RNA erfolgt bei 120 V für 3 h. Um das Formaldehyd
aus dem Gel auszuwaschen, wird das Gel für 30 min gewässert und anschließend mit
Ethidiumbromid gefärbt.
•
H2O/DEPC (1% DEPC)
2,5 ml DEPC werden mit 2,5 l H2Odest. gemischt, über Nacht bei 37°C inkubiert und
anschließend für 20 min autoklaviert
•
10 x MOPS
MOPS
41,8 g
werden in 800 ml H2O/DEPC gelöst. Der pH-Wert wird auf 7 eingestellt
3 M Na-Acetat
EDTA pH 8
16,6 ml
20 ml
mit H2O/DEPC auf 1000 ml auffüllen und filtrieren. Der Puffer wird im Dunkeln bei
RT aufbewahrt
•
5 x RNA Ladepuffer
deionisiertes Formamid
3084 µl
Glycerin 86 %
2000 µl
Formaldehyd 37 %
10 x MOPS
720 µl
4000 µl
EDTA 0,5 M
80 µl
Bromphenolblau
16 µl
mischen und mit H2O/DEPC auf 10 ml auffüllen
Material und Methoden
46
3.18 Kultivierung der humanen Lungenepithelzelllinien NCI-H292, A549 und
Calu3
Die Lungenepithelzelllinie NCI-H292 wird bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Als Medium
dient RPMI-1640 mit zusätzlich 2 mM L-Glutamin und 10% FCS. Die Kultivierung erfolgt in
75 cm2 Zellkulturflaschen, wobei alle 3 Tage Medium gewechselt wird. Haben die Zellen
einen konfluenten Monolayer gebildet, werden sie in neue Flaschen gesplittet. Hierzu wird
das alte Medium abgekippt und durch 5 ml Trypsin/EDTA ersetzt. Die Inkubation erfolgt bei
37°C und 5% CO2 bis sich die ersten Zellen vom Boden der Zellkulturflasche ablösen. Das
Trypsin/EDTA wird vorsichtig abgegossen. Die lose am Boden haftenden Zellen werden
durch Klopfen der Flasche an den Handrücken gelöst. Es werden 10 ml frisches RPMIMedium zugegeben und die noch haftenden Zellen durch gutes Resuspendieren abgelöst. Um
die Zellen weiter zu kultivieren, werden 1-2 ml dieser Suspension in eine neue 75 cm2
Zellkulturflasche mit frischem RPMI-Medium gegeben und bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Für die Stammhaltung werden die Zellen von 4-5 Flaschen in 5 ml Medium und 5 ml FCS
resuspendiert und auf Eis gestellt. Hierzu werden eine Mischung aus 2 ml DMSO und 8 ml
Medium zugetropft. 1 ml Aliquots werden in Cryoröhrchen mit Innengewinde pipettiert und
für 2 h bei –20°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen über Nacht bei –80°C
eingefroren, bevor sie in flüssigem Stickstoff dauerhaft gelagert werden. Zum Ansetzen einer
frischen Kultur müssen die eingefrorenen Zellen rasch bei 37°C aufgetaut und in 20 ml
vorgewärmtes RPMI-Medium gegeben werden um die toxische Wirkung von DMSO auf die
Zellen zu verringern. Die Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Sobald die ersten
Zellen am Boden der Zellkulturflasche haften, wird das DMSO-haltige Medium abgekippt
und durch frisches Medium ersetzt.
Die Kultivierung der Lungenepithelzelllinien A549 und Calu3 erfolgt wie oben beschrieben
für NCI-H292 Zellen. A549-Zellen werden in DMEM-Medium mit wenig Glukose (PAA),
2mM L-Glutamin und 10% FCS kultiviert. Die Kultivierung von Calu3-Zellen findet in
Eagles MEM zusätzlich mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, non essential amino
acids und 10% FCS statt.
3.19 Infektion von NCI-H292 mit Legionellen
Für die Infektion von Lungenepithelzellen werden 5 x 105 NCI-H292/Vertiefung in eine 24Loch-Platte ausgesäht. Nach Zugabe von 1 x 107 Bakterien/Vertiefung und einer
Koinkubation von 3 h bei 37°C und 5% CO2, werden die extrazellulären Bakterien durch
Material und Methoden
47
dreimaliges Waschen entfernt. Durch Zugabe von 100 µg Gentamicin/ml für 30 min werden
die
restlichen
extrazellulären
Bakterien
getötet.
Anschließend
wird
dreimal
mit
vorgewärmtem RPMI-Medium gewaschen um das Gentamicin zu entfernen. Durch Kratzen
mit einer blauen Pipettenspitze werden die Zellen vom Boden gelöst. Durch Ausplattieren
geeigneter Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten wird die Bakterienzahl/ml bestimmt.
Ebenso werden nach 24, 48, und 72 h geeignete Verdünnungen ausplattiert, um die
Vermehrung der Bakterien zu bestimmen.
3.20 Biotinylierung von Legionellen und Bindungsassay
Für die Biotinylierung werden Legionellen auf BCYE-Agar 4-5 Tage kultiviert. Die Bakterien
werden mit Puffer A abgeschwemmt und mit Puffer A auf eine OD550nm von 0,7 verdünnt.
Anschließend werden gleiche Volumina Legionellen mit der Biotinlösung 2 h bei RT leicht
geschüttelt. Nach Abzentrifugation bei 3000 rpm für 5 min werden die Bakterien dreimal mit
1 x PBS pH 7,4 gewaschen, um ungebundenes Biotin zu entfernen. Die biotinylierten
Bakterien werden in 1% BSA/PBS pH 7,4 resuspendiert.
Die biotinylierten Legionellen können für drei Tage bei 8°C aufbewahrt werden.
•
Puffer A
1 x PBS
Calciumchlorid
Magnesiumchlorid
0,1 mM
1 mM
pH-Wert auf 7,6 einstellen
•
Biotinlösung
0,2 bis 0,3 mg/ml Biotin in Puffer A
Für den Bindungsassay biotinylierter Legionellen an Lungenepithelzellen NCI-H292 werden
die Wirtszellen in einer 96-Loch-Schale kultiviert, bis sie zu einem Monolayer gewachsen
sind. Über Nacht bei 4°C werden die freien Bindungsstellen mit 5% Milch blockiert.
Anschließend werden die Zellen dreimal mit 1 x PBS gewaschen. Nach Inkubation der
biotinylierten Legionellen auf den Zellen, werden ungebundene Legionellen dreimal
weggewaschen. Nach Zugabe von Neutravidinperoxidase und mehrmaligem Waschen tritt mit
Hilfe von Peroxidasesubstrat in den Näpfen in denen Biotin-Legionellen gebunden haben eine
blaue Verfärbung auf. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 2 M H2SO4
Material und Methoden
48
gestoppt. Durch die pH-Wert Änderung tritt eine Farbänderung auf und aus blau wird gelb.
Die Absorption wird bei 450 nm gemessen.
3.21 Gewinnung extrazellulärer Matrix aus NCI-H292
Um extrazelluläre Matrix aus der Lungenepithelzelllinie NCI-H292 zu gewinnen, werden die
Zellen auf eine Zellzahl von 1 x 105 Zellen/ml eingestellt und in 96- oder 24-Loch-Platten
bzw. in Chamberslides ausgesät und bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. 20 ml davon werden in
eine 75 cm2 Zellkulturflasche gegeben und bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Alle 2 Tage wird
das Medium gewechselt bis die Zellen zu einem konfluenten Monolayer gewachsen sind. 48 h
später wird das Medium entfernt und die Zellen dreimal mit 10 mM Tris/HCl pH 8
gewaschen. Durch Inkubation in 0,5% DOC (Natriumdesoxycholat) in 10 mM Tris/HCl bei
RT werden die Zellen zerstört. Die Zellreste werden nach 30 min vorsichtig abgezogen.
Anschließend wird die Matrix in 10 mM Tris/HCl mit 10 U/ml DNaseI und
Proteaseinhibitoren (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets) für 5 min
inkubiert. Nach weiterer Inkubation in 2 mM Tris/HCl pH 8 und Proteaseinhibitoren für 5 min
bei RT, wird die Matrix dreimal mit 1 x PBS gewaschen.
•
1 M Tris/HCl
Tris
121,14 g
auf 1000 ml H2Odest. auffüllen und mit HCl auf pH 8 einstellen
•
10 x PBS
NaCl
Na2HPO4 x 2 H2O
80 g
12,5 g
KCl
2g
KH2PO4
2g
auf 1000 ml H2Odest. auffüllen
Material und Methoden
49
3.22 Bindestudien von Mip an NCI-H292, die extrazelluläre Matrix von NCI-H292
und an extrazelluläre Matrixproteine
3.22.1 FITC-Markierung von Proteinen
Die Bindung von FITC an Proteine erfolgt mit dem FITC Labeling Kit von Calbiochem. Die
Durchführung erfolgt nach Protokoll. Es werden je 1 mg Protein mit 50 µg FITC markiert.
Die mit FITC gekoppelten Proteine werden aliquotiert und bei –20°C gelagert.
3.22.2 HRP-Markierung von Proteinen
Die Bindung aktivierter Peroxidase aus Meerrettich (HRP) an Proteine erfolgt mit dem
Peroxidase Markierungs-Kit von Biotrend. Die Durchführung erfolgt nach Protokoll. Es
werden 1 mg Protein mit 50 µg aktivierter Peroxidase konjugiert. Die mit HRP gekoppelten
Proteine werden aliquotiert und bei –20°C gelagert.
3.22.3 Bindestudien mit Mip-FITC
Zur Gewinnung extrazellulärer Matrix von Lungenepithelzellen, werden NCI-H292 Zellen in
Chamberslides (Falcon, Culture slide 8 Chamber Polystyrene Vessel) angezogen, und wie
unter 3.21 beschrieben, behandelt. Die extrazelluläre Matrix wird 2 h mit 5% Milch bei RT
blockiert und anschließend einmal gewaschen. 5 µg Mip-FITC werden in 0,5% Milch gelöst
und für 4 h bei RT inkubiert. Anschließend wird das ungebundene Mip-FITC gut
weggewaschen. Die Matrix wird im Dunkeln getrocknet, mit Citifluor eingedeckt und unter
dem Fluoreszenzmikroskop mikroskopiert.
Für Bindestudien an extrazelluläre Matrixproteine werden 3-5 µg Protein in 40 µl 1 x PBS
gelöst und auf je ein Feld eines 6-Feld-Objektträgers pipettiert. Dieser wird in einer feuchten
Kammer über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wird 2 h mit 5% Milch bei RT
blockiert. Anschließend wird einmal gewaschen und mit Mip-FITC für 4 h bei RT inkubiert.
Das Mip-FITC liegt dabei in einer Konzentration von 3 µg in 40 µl 0,5% Milch in PBS vor.
Die Objektträger werden in einer Küvette mit 1 x PBS gut gewaschen, um ungebundenes
Mip-FITC zu entfernen. Anschließend werden die Objektträger im Dunkeln getrocknet und
mit Citifluor eingedeckt.
Material und Methoden
50
3.22.4 Bindestudien mit Mip-HRP
Für Bindestudien von Mip-HRP an NCI-H292 Zellen und die extrazelluläre Matrix dieser
Zellen werden diese in 96-Loch-Platten angezogen. Die extrazelluläre Matrix wird wie unter
3.21 beschrieben, gewonnen. Für Bindestudien an extrazelluläre Matrixproteine, werden 3 µg
je Protein in 50 µl 0,1 M NaHCO3 pH 8,3 gelöst und in je eine Vertiefung einer 96-LochPlatte pipettiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Sowohl die Zellen, die extrazelluläre
Matrix und die Matrixproteine werden dreimal mit 1 x PBS gewaschen und 2 h mit 5% Milch
bei 37°C blockiert. Anschließend wird einmal gewaschen. In jeden Napf werden 3 µg MipHRP verdünnt in 0,5% Milch pipettiert und bei RT inkubiert. Nach 4 h wird durch
dreimaliges Waschen ungebundenes Mip-HRP entfernt. Durch Zugabe von Peroxidasesubstrat tritt in den Näpfen in denen Mip-HRP gebunden hat eine blaue Verfärbung auf. Die
enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 2 M H2SO4 gestoppt. Durch die pH-Wert
Änderung tritt eine Farbänderung auf und aus blau wird gelb. Die Absorption wird bei 450
nm gemessen.
3.22.5 Kohlenhydratabspaltung von Glykoproteinen
3.22.5.1
Abspaltung der Kohlenhydrate mit Periodat
Wie unter 3.22.4 beschrieben, werden 96-Loch-Platten mit Glykoproteinen beschichtet. Die
Oxidation der Zucker an den Glykoproteinen erfolgt durch Behandlung mit Natriumperiodat.
Hierzu werden 10 mM Natriumperiodat in 100 mM Natriumazetatpuffer pH 5,5 gelöst. Die
Inkubation der Glykoproteine mit der Natriumperiodatlösung findet für 16 h bei 4°C statt.
Nach zweimaligem Waschen mit 1 x PBS können die Bindungsstudien wie unter 3.22.4
beschrieben durchgeführt werden.
3.22.5.2
Abspaltung der Kohlenhydrate mit Endoglykosidase H
Für die Abspaltung von Kohlenhydraten mit Endoglykosidase H (Roche) werden die
Glykoproteine in 96-Loch-Platten mit 2,5 mU/ml Endoglykosidase H in 100 mM
Natriumazetatpuffer pH 5,5 inkubiert. Die Inkubation findet für 16 h bei 22°C statt. Nach
zweimaligem Waschen können die Bindungsstudien wie unter 3.22.4 beschrieben
durchgeführt werden.
Material und Methoden
51
3.23 Transwell-Experimente
Die Transwell-Versuche werden in 24-Loch-Platten und Transwell-Einsätzen mit 3 µm
großen Poren durchgeführt. In jeden Napf werden 1000 µl Medium pipettiert, bevor die
Filtereinsätze in die Näpfe eingehängt werden. Die Lungenepithelzellen NCI-H292, A549
oder Calu3 werden auf 5 x 105 Zellen/ml eingestellt. Davon werden je 200 µl in die Einsätze
pipettiert und bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach 2 Tagen werden die Filtereinsätze in eine
neue 24-Loch-Platte überführt, in der frisches Medium vorpipettiert ist. Der Überstand im
Filter wird ebenso durch frisches Medium ausgetauscht. Nach 3-4 Tagen bildet sich ein
konfluenter Monolayer. Um sicher zu gehen, dass der Monolayer dicht gewachsen ist, werden
die Zellen noch einen Tag inkubiert. Die Filter werden in eine neue 24-Loch-Platte überführt
in der frisches FCS-freies Medium vorpipettiert ist. Der Überstand in den Filtern wird
abgesaugt und ebenso durch FCS-freies Medium mit 1 x 107 Bakterien auf den Filter
pipettiert. Die Inkubation findet bei 37°C und 5% CO2 statt. Um zu untersuchen, ob die
Bakterien in der Lage sind, den Monolayer zu durchdringen, werden nach 5 h geeignete
Verdünnungen des unteren Teils des Transwell-Systems auf Agarplatten ausplattiert.
Für Komplementationsversuche mit rekombinantem wildtypischem Mip, Mip(Y185-A),
Mip(D142-L), Mip(Monomer), humanem FKBP12 und Parvulin werden aufsteigende
Konzentrationen rekombinanten Proteins zum oberen Teil des Transwell-Systems pipettiert.
Um die Rolle der PPIase-Aktivität von Mip bei der Penetration durch den Monolayer zu
untersuchen, werden 1 x 107 wildtypische Legionellen mit 100 µg Rapamycin bzw. FK506
vorinkubiert. Die Vorinkubation findet bei 37°C für 20 min statt, bevor die Legionellen auf
den Filter pipettiert werden.
Für die Versuche mit Proteaseinhibitoren (Roche) werden die Bakterien ebenfalls für 20 min
bei 37°C mit den entsprechenden Proteaseinhibitoren vorinkubiert. Das Medium des Transwell-Systems wird durch proteaseinhibitorhaltiges Medium ausgetauscht. In folgender Tabelle
sind die Konzentrationen der Proteaseinhibitoren für die Transwell-Experimente aufgelistet.
Tabelle 8 Konzentrationen und Spezifität der Proteaseinhibitoren im Transwell-Experiment
Proteaseinhibitor
Spezifität
Konzentration
Complete EDTA-free Protease
Inhibitor Cocktail Tabletten
E-64
inhibiert Serin- und
Cysteinproteasen
inhibiert Cysteinproteasen
inhibiert Serinproteasen und SerinThreonin Phosphatasen
inhibiert Serinproteasen
1 Tablette für
20 ml
10 µg/ml
Pefabloc SC
PMSF
30 µg/ml
170 µg/ml
Material und Methoden
52
3.24 Transwell-Experiment mit Matrigel
Das MatrigelTM Basement Membrane Matrix (Becton Dickinson) wird auf Eis aufgetaut und
vorsichtig mit vorgekühlten Pipetten homogenisiert. Das Matrigel wird mit eiskaltem RPMIMedium auf 1 mg/ml verdünnt und in Aliquots bei –20°C eingefroren. Für TranswellVersuche wird ein Aliquot auf Eis aufgetaut und 20 µg in 100 µl 1 x PBS verdünnt und mit
gekühlten Pipetten auf Transwell-Filterchen pipettiert, die in 24-Loch-Platten eingehängt sind.
Während einer Inkubation von 1 h bei 37°C geliert das Matrigel. Das Matrigel muss
anschließend getrocknet werden. Hierzu werden die offenen Platten über Nacht in die
Sterilwerkbank gestellt. Am nächsten Tag wird das Matrigel mit 100 µl serumfreiem RPMIMedium für 2 h bei 37°C rekonstituiert. Die Penetrationsassays werden wie unter 3.21
beschrieben durchgeführt.
3.25 Rasterelektronenmikroskopie
Für die Rasterelektronenmikroskopie werden die Transwell-Filter in 5% Paraformaldehyd und
2% Gluraraldehyd für 2 h bei RT fixiert. Nach einmaligem Waschen in 100 mM
Cacodylatpuffer werden die Filter in 100 mM Cacodylatpuffer für 1 h bei RT inkubiert.
Anschließend werden die Filter dreimal für je 5 min mit 100 mM Cacodylatpuffer gewaschen.
Zur Mikroskopie der Ober- und Unterseite der Filter wird die Membran mit den fixierten
Zellen mit Hilfe einer Rasierklinge vom Einsatz gelöst und in zwei Teile geschnitten. Die
fixierten Zellen bzw. das Matrigel auf den Membranen werden in einer aufsteigenden
Acetonreihe entwässert. Hierzu werden die Membranen für je 15 min in 10%, 30% und 50%
Aceton und für je 30 min in 70%, 90% und 100% Aceton inkubiert. Die entwässerten
Membranen werden nach Standardmethode kritisch punktgetrocknet.
3.26 Radioaktivmarkierung extrazellulärer Matrix
Für die radioaktive Markierung der extrazellulären Matrix von Lungenepithelzellen NCIH292, werden die Zellen wie unter 3.18 beschrieben in 24-Loch-Platten kultiviert bis sie zu
einem subkonfluenten Monolayer gewachsen sind. Nach dem Waschen der Zellen mit
1 x PBS, werden pro Napf 1 ml Methionin- und Cystein-freies Zellkulturmedium (C. C. Pro,
Neustadt/W.) zugegeben und für 1 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wird das
Medium abgezogen und durch 30 µCi L-[35S]-haltiges Medium (21 µCi L-[35S]Methionin und
9 µCi L-[35S]Cystein; Pro-MixTM, Amersham Biosciences, Freiburg) und 10% normales
Material und Methoden
53
RPMI-Medium ersetzt. Zum Einbau der radioaktiv-markierten Aminosäuren werden die
Zellen für 18 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Am nächsten Tag werden die Zellen zerstört
und die extrazelluläre Matrix, wie unter 3.19 beschrieben, gewonnen. Um den Abbau der
extrazellulären Matrix durch Bakterien zu untersuchen, werden pro Napf 1 x 107 Bakterien
auf die radioaktiv-markierte Matrix pipettiert und kurz gemischt. Sofort nach Zugabe der
Bakterien wird ein Aliquot von 25 µl aus dem Überstand entnommen und in ein
Scintillationsröhrchen mit 2 ml Scintillationsflüssigkeit (Optiphase Hisafe) pipettiert. Die
Radioaktivität im Scintillationsröhrchen wird an einem Scintillationsmessgerät (Packard,
Liquid Scintillation Analyzer 1600 TR) gemessen. Um den Abbau der Matrix über die Zeit zu
beobachten werden nach 0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min und 120 min Aliquots
aus dem Überstand entnommen und die freiwerdende Radioaktivität gemessen. Der Einbau
der Radioaktivität in die gesamte Matrix eines Napfes wird bestimmt, indem die Matrix vom
Boden des Napfes mit einer blauen Pipettenspitze abgekratzt wird und komplett in ein
Scintillationsröhrchen pipettiert wird. Als Positivkontrolle für den Abbau der Matrix werden
in einen Napf 2 Units Proteinase K gegeben. Als Negativkontrolle wird an Stelle der
Bakterien 1 x PBS zugegeben.
3.27 Proteinbiochemische Methoden
3.27.1 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelektrophorese)
Die Auftrennung von Proteinen nach ihrer Größe erfolgt über die SDS-PAGE
(Polyacrylamid-Gelelektrophorese). Durch Zugabe von SDS zu den Proteinen, werden diese
denaturiert. Des Weiteren bindet je ein SDS-Molekül an je zwei Aminosäurereste der
Hauptkette des Proteins. Die Nettoladung des nativen Proteins wird durch die negative
Ladung des SDS weit überlagert. Daher wandern die Proteine im Gel ausschließlich auf
Grund ihrer Größe in Richtung der Anode.
Vor Gießen des Gels werden die Glasplatten gründlich mit 100% Ethanol gereinigt und nach
Anleitung (BioRad) zusammengebaut. Die Trenngellösung wird bis ca. 2-3 cm unterhalb des
oberen Randes der Glasplatten gegossen. Damit der Trenngelrand nicht uneben
auspolymerisiert, wird ca. 1 ml Ethanol aufpipettiert. Nachdem das Trenngel auspolymerisiert
ist, wird das Ethanol mit Hilfe von Whatmanpapier abgesaugt. Das Sammelgel wird nun bis
zum Rand der Glasplatten eingefüllt und die Kämme werden luftblasenfrei eingesetzt. Nach
Auspolymerisieren des Sammelgels werden die Gele mitsamt Glasplatten in die
Elektrophoreseapparatur eingespannt. Die Apparatur wird mit 1 x SDS-Laufpuffer gefüllt.
Material und Methoden
54
Nach Entfernen der Kämme werden die Taschen mit einer Spritze mit Laufpuffer ausgespült,
um
Polyacrylamidreste
zu
entfernen.
Die
aufzutrennenden
Proteine
werden
mit
5 x Lämmlipuffer versetzt, 5 min bei 100°C aufgekocht und anschließend in die Taschen des
Gels pipettiert. Der Lauf der Proteine durch das Sammelgel erfolgt bei 80 V. Sobald die
Proteine am Rande des Trenngels angekommen sind, kann die Spannung auf 110 V erhöht
werden. Die Auftrennung der Proteine kann gestoppt werden, sobald die Bromphenolbande
aus dem Gel in den Puffer läuft. Die Gele können mit Coomassie-Blue gefärbt oder für einen
Western-Blot verwendet werden.
•
30%ige Acrylamidlösung (rotiphorese Gel A, Roth, Karlsruhe)
•
10 x SDS-Laufpuffer
0,5 M Tris/HCl
3,84 M Glycin
SDS
30 g
144,4 g
10 g
auf 1000 ml mit H2Odest. auffüllen
•
•
Trenngellösung für ein 12%iges Acrylamidtrenngel
Acrylamidlösung
3,2 ml
1,5 M Tris/HCl pH 8
2,0 ml
H2Odest.
2,8 ml
10% SDS
80 µl
10% APS
40 µl
TEMED
5 µl
Sammelgellösung für ein 5%iges Sammelgel
Acrylamidlösung
0,5 M Tris/HCl pH 8
H2Odest.
•
1,33 ml
2,0 ml
4,37 ml
10% SDS
80 µl
10% APS
40 µl
TEMED
5 µl
5 x Lämmlipuffer
1)
SDS
EDTA
1,1 g
0,41 g
Material und Methoden
55
NaH2PO4 x 2H2O
0,17 g
β-Mercaptoethanol
1,1 ml
mit NaOH auf pH 7,2 einstellen und mit H2Odest. auf 10 ml auffüllen
2)
0,2% Bromphenolblau in 50% Glycerin
1) und 2) zu gleichen Teilen mischen und geeignete Aliquots einfrieren
•
100% Ethanol
•
TEMED
•
APS 10% (w/v) in H2Odest.
3.27.2 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen
Die Proteine auf Polyacrylamidgelen werden unter leichtem Schwenken mit Coomassie-Blue
gefärbt. Die Färbung findet für 1-2 h bei RT statt. Anschließend wird Entfärbelösung
zugegeben, die mehrmals gewechselt wird. Sobald der Hintergrund genügend entfärbt ist,
können die Gele in H2O aufbewahrt werden.
•
Färbelösung
Methanol/Ethanol*
454 ml
100% Essigsäure
92 ml
Coomassie-Blue R250
2,5 g
auf 1000 ml H2Odest. auffüllen
•
Entfärbelösung
100% Essigsäure
75 ml
Methanol/Ethanol*
50 ml
auf 1000 ml H2Odest. auffüllen
*aufgrund der Toxizität von Methanol kann auch Ethanol verwendet werden
3.27.3 Protein-Transfer auf Nitrozellulosemembran (Westernblot)
Mittels elektrophoretischem Transfer im Westernblot-Verfahren können Proteine aus dem
Polyacrylamidgel auf eine Nitrozellulose- bzw. eine PVDF-Membran immobilisiert werden.
Material und Methoden
56
Die Proteine werden somit für die nachfolgende Detektion mit Antikörpern zugänglich
gemacht. Zur Vorbereitung werden zwölf Whatmanpapiere und eine Nitrozellulose- bzw.
PVDF-Membran auf die Größe des Polyacryamidgels zugeschnitten. Die Grafitplatte des
Semi-Dry-Blotters wird mit Wasser angefeuchtet. Für die unterste Lage werden sechs
Whatmanpapiere in Anodenpuffer I getränkt und der überschüssige Puffer vorsichtig
ausgedrückt. Auf die zweite Lage (drei in Anodenpuffer II getränkte Whatmanpapiere) wird
eine in Anodenpuffer II getränkte Nitrozellulosemembran luftblasenfrei aufgelegt. Im Falle
einer PVDF-Membran, wird diese für 30 s in 100% Methanol inkubiert und dann für 5 min in
Anodenpuffer II equilibriert. Die letzte Lage bilden drei in Kathodenpuffer eingelegte
Whatmanpapiere. Es ist darauf zu achten, dass die getränkten Whatmanpapiere gut von
überschüssigem Puffer befreit werden und nicht zu nass auf die Blotapparatur gelegt werden.
Zum Schluss wird die obere Grafitplatte aufgelegt und der Deckel der Apparatur
verschlossen. Die Proteine werden für 1 h stromkonstant bei 0,8 mA pro Quadratzentimeter
Gel auf die Membran übertragen.
Für spezifische Antikörperreaktionen mit den Proteinen auf der Membran müssen zuerst die
freien Bindungsstellen mit 5% Milch in TBST abgesättigt werden. Das Blockieren findet für
1 h bei RT bzw. über Nacht bei 4°C statt. Nach zweimaligem Waschen mit TBST wird der
erste Antikörper in 1% Milch in TBST zugegeben und für 2 h bei RT bzw. über Nacht bei
4°C inkubiert. Die Verdünnung des Antikörpers erfolgt je nach Herkunft bzw. nach
Herstellerangaben. Der primäre Antikörper wird abgenommen und kann eingefroren und
wieder verwendet werden. Anschließend wird die Membran dreimal für je 10 min unter
leichtem Schwenken mit TBST gewaschen. Die Inkubation mit dem HRP-gekoppelten
sekundären Antikörper erfolgt für 1 h bei RT unter leichtem Schwenken in 1% Milch in
TBST. Nach Verwerfen des sekundären Antikörpers wird die Membran dreimal je 10 min in
TBST gewaschen um ungebundenen Antikörper zu entfernen.
Mit Hilfe des ECL-Kits (enhanced chemilumineszence) wird der Blot entwickelt. Dazu
werden die zwei Lösungen zu gleichen Teilen gemischt und die Membran damit für 1 min
überschichtet. Überschüssige Flüssigkeit wird mit Whatmanpapier abgesaugt, bevor die
Membran in Frischhaltefolie eingewickelt wird. Die an den sekundären Antikörper gekoppelte
Peroxidase setzt das in Lösung 1 enthaltene Wasserstoffperoxid zu Wasser und O2 um. Der
freiwerdende Sauerstoff wiederum oxidiert das in Lösung 2 enthaltene Luminol, wobei es zur
Entstehung von blauem Licht kommt. In der Dunkelkammer wird in einer Entwicklerkassette
ein Film auf die Membran gelegt. Durch das blaue Licht wird der Film während der
Material und Methoden
57
Exposition auf die Membran geschwärzt. Mit Hilfe einer Entwicklermaschine können die
geschwärzten Bereiche sichtbar gemacht werden.
•
Anodenpuffer I
0,3 M Tris-Base
36,3 g
20% Methanol
200 ml
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen
•
Anodenpuffer II
25 mM Tris-Base
3,02 g
20% Methanol
200 ml
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen
•
Kathodenpuffer
25 mM Tris-Base
3,02 g
40 mM ε-Amino-n-Capronsäure
5,25 g
20% Methanol
200 ml
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen
•
TBST
50 mM Tris/HCl pH 7,5
6,55 g
150 mM NaCl
8,77 g
0,05% Tween 80
0,5 ml
mit H2Odest. auf 1000 ml auffüllen
•
ECL-Kit mit Lösung 1 und 2
3.27.4 Strippen von Westernblots
Durch Entfernen der gebundenen Antikörper auf einer Nitrozellulose- bzw. einer PVDFMembran, können diese für neue Antikörperreaktionen erneut verwendet werden. Hierzu
werden die Antikörper mit Strip-Puffer für 30 min bei 60°C entfernt. Anschließend wird mit
TBST gut gewaschen, bevor der Blot blockiert und mit neuen Antikörpern hybridisiert
werden kann.
•
Material und Methoden
58
Strip-Puffer
62,5 mM Tris/HCl pH 7,6
2% SDS
3,63 g
10 g
mit H2Odest. auf 500 ml auffüllen
vor Gebrauch zu 100 ml Puffer 700 µl β-Mercaptoethanol (Endkonzentration
100 mM) geben
Ergebnisse
59
4 Ergebnisse
4.1
4.1.1
Dictyostelium discoideum als Modellsystem
Infektion von Dictyostelium discoideum mit Pseudomonas aeruginosa
Dictyostelium discoideum eignet sich als Modellsystem zur Untersuchung der Virulenz von
verschiedenen intrazellulären Pathogenen wie L. pneumophila und M. avium. In dieser Arbeit
wurde untersucht, ob sich Dictyostelien auch als Modellsystem für extrazelluläre Bakterien
wie Pseudomonas aeruginosa oder verschiedene Endozytobionten eignet. Für die Invasionsassays mit Pseudomonaden wurden die Dictyostelien, wie unter 3.12.3 beschrieben, infiziert.
Nach 3 h Koinkubation der Bakterien mit den Zellen, werden die extrazellulären Bakterien
durch mehrmaliges Waschen und Gentamicinbehandlung entfernt. Von 1,2 x 106 Bakterien/ml werden nach 3 h 3,3 x 103 Bakterien/ml von den Dictyostelien aufgenommen.
Pseudomonaden können sich in den Wirtszellen nicht etablieren. 3 h nach Gentamicinbehandlung sind nur noch knapp 500 Bakterien/ml und nach 17 Stunden sind noch 40
Bakterien/ml intrazellulär nachzuweisen. 24 h nach Infektionsbeginn sind nur noch wenige
Pseudomonaden intrazellulär detektierbar (Abb. 5). Für die intrazelluläre Beobachtung
wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen wie unter 3.16 beschrieben durchgeführt. In
Abbildung 6 ist der intrazelluläre Verdau von P. aeruginosa durch D. discoideum dargestellt.
10000000
1000000
log Zellzahl/ml
100000
10000
1000
100
10
1
0,1
0
0'
3
17
24
Zeit [h]
Abb. 5 Infektion von Dictyostelium discoideum mit Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa ist nicht in der
Lage, sich in D. discoideum zu vermehren. 3 h nach Infektion werden die extrazellulären Bakterien entfernt (0`).
24 h nach Infektionsbeginn sind nur noch wenige Bakterien nachweisbar. Die Versuche wurden dreimal
unabhängig voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken
dargestellt.
Ergebnisse
60
Abb. 6 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Pseudomonas aeruginosa in Dictyostelium discoideum.
Bereits 3 h nach Aufnahme der Bakterien ist zu sehen, dass die Pseudomonaden durch ihre Wirtszelle
verdaut werden. B stellt das Bakterium dar. Der Grössenmarker entspricht 1 µm Länge.
4.1.2
Infektion von Dictyostelium discoideum mit Endozytobionten
In diesem Teil der Arbeit, wurde untersucht, ob sich das Modellsystem D. discoideum zur
Studie obligat intrazellulärer Bakterien eignet. Hierzu wurden die mit Neochlamydien
verwandten TUME1 und die mit Parachlamydien verwandten UWE25, sowie die βProteobakterien UWC6 wie unter 3.12.5 beschrieben aus ihren Originalwirtszellen isoliert
und mit Dictyostelien koinkubiert. Da Endozytobionten nicht auf Agarplatten kultivierbar
sind, wurde die Vermehrung der Bakterien mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung
beobachtet. Nach 24 und 48 h Koinkubation wurden Proben aus den Infektionsflaschen
entnommen und auf 6-Feld-Objektträger aufgetropft. Nach Fixierung der Proben wurden die
Dictyostelien mit der Sonde DICT2-Fluorescein und die Endozytobionten mit den jeweiligen
Sonden
(AcBet42a-Cy3;
Bn9658-Cy3;
C22658-Cy3)
hybridisiert.
Mit
Hilfe
des
Fluoreszenzmikroskopes konnten 48 h nach Infektion mehr intrazelluläre Bakterien
beobachtet werden als nach 24 h Infektion (Abb. 7).
Ergebnisse
61
TUME1
UWE25
UWC6
24h
24h
24h
48h
48h
48h
Abb. 7 Fluoreszenzmikroskopische Darstellung von D. discoideum infiziert mit den Endozytobioten TUME1,
UWE25 und UWC6. Die Wirtszellen wurden mit der Dictyostelien-spezifischen Sonde DICT2-FITC und die
Endozytobionten mit der jeweilig spezifischen Cy3-markierten Sonde hybridisiert. Die obere Reihe zeigt die
infizierten Dictyostelien 24 h nach Infektion. 48 h nach Infektion (zweite Reihe) sind intrazellulär mehr
Bakterien zu sehen.
Im Gegensatz zu TUME1 und UWC6 ist UWE25 in der Lage Dictyostelien zu lysieren. Dies
konnte unter dem Lichtmikroskop 48 h nach Infektion durch einen großen Teil abgelöster
Wirtszellen und das Vorhandensein vieler Zellfragmente beobachtet werden.
Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen (Abb. 8) konnte die Lokalisierung der
Endozytobionten in D. discoideum gezeigt werden. TUME1 und UWE25 befanden sich 48 h
nach Infektion nicht in Vakuolen, sondern waren eng von Membranen umschlossen. UWC6
konnte sowohl in Vakuolen als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden (Abb. C).
Ergebnisse
A
B
C
4.1.3
62
Abb. 8 Infektion von D. discoideum mit den
Endozytobionten
A: UWE25
B: TUME1
C: UWC6
Mit S ist der Endozytobiont bezeichnet. M stellt
die Mitochondrien dar und V die Vakuole. Der
Grössenmarker zeigt eine Länge von 1 µm. Die
elektronenmikroskopischen Bilder wurden 48 h
nach Infektion aufgenommen.
Zusammenfassung
Anhand von Infektionsexperimenten konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das extrazelluläre Bakterium P. aeruginosa von D. discoideum verdaut werden kann. Im Gegensatz
dazu konnte man anhand von Fluoreszenz in situ Hybridisierung und elektronenmikroskopischen Auffnahmen nachweisen, dass sich die Endozytobionten UWE25, TUME1 und
UWC6 in D. discoideum innerhalb von 48 h vermehren können.
4.2
Expressionsmuster von infizierten und uninfizierten Dictyostelien
4.2.1 Aufbau des Dictyostelium discoideum cDNA-Microarrays
In Zusammenarbeit mit Patrick Farbrother und Ludwig Eichinger am Institut für Biochemie I
der Universität zu Köln wurde die Genexpression von Dictyostelium discoideum nach
Infektion mit Legionella mittels eines cDNA-Microarrays untersucht. Der Chip wurde von
Patrick Farbrother im Rahmen seiner Dissertation hergestellt (Farbrother, 2004). Dieser
cDNA-Microarray trägt 5423 Sonden des japanischen cDNA Projektes, 450 Sonden für
Ergebnisse
63
publizierte Gene und 33 Kontrollen. Die Amplifikation der Sonden erfolgte in 96-well Platten
mittels PCR und QIAvac PCR Purification Kit. Die Sonden wurden aus den 96-Loch-Platten
in 384-Loch-Platten überführt, um mit Hilfe eines Proteineer dp Pipettier-Roboter auf
Microarrays gedruckt zu werden. Durch Kontrollen konnte sichergestellt werden, dass
während des Transfers und des Druckvorgangs keine Kontamination der Sonden
untereinander stattfindet. Auf dem cDNA-Microarray sind die Sonden jeweils zweimal
nebeneinander gedruckt. Die Positivkontrollen sind je 24 mal, die Negativkontrollen 6, 24
oder 286 mal und die SpotReport Kontrollen je 96 mal gedruckt. Das SpotReport System
besteht aus zehn DNA Sonden und den dazugehörigen RNAs von Arabidopsis thaliana
Genen. Da die verwendeten Gene von A. thaliana von allen bekannten D. discoideum Genen
verschieden sind, ist keine Hybridisierung möglich. Somit besteht das Microarray aus 14620
Punkten. Die Anordnung auf dem Microarray besteht aus drei Blöcken mit je 16 UnterMicroarrays, die aus 18 x 18 Punkten bestehen. Kontrollen haben gezeigt, dass die
Nachweisgrenze des Microarray Systems bei 5 pg DNA liegt.
Die RNA aus mit Legionella infizierten Dictyostelien und uninfizierten Dictyostelien wurde
wie unter 3.17.1 beschrieben isoliert. Anschließend wurde die reverse Transkription und die
Markierung der cDNA mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy3 und Cy5 nach Vorschrift des
Herstellers durchgeführt. Nach Hybridisierung des Microarrays mit den markierten cDNA
Sonden und nach Entfernen der ungebundenen Sonden, wurden die Microarrays nach
Anleitung mit ScanArray Express gescannt. Die Anregung während des Scans wurde so
gewählt, dass der Cy3-Kanal und der Cy5-Kanal ähnliche Signalintensitäten hatten. Dies hatte
den Vorteil, dass dadurch die Kanäle teilweise normalisiert wurden, was die erforderlichen
Anpassungen bei der Normalisierung mit dem Statistikprogramm R verringerte. Mit Hilfe von
ScanArray Express wurden die Microarray Bilder eines Scans mit starker und schwacher
Anregung nach Anleitung des Herstellers quantifiziert. Die Identifikation differentiell exprimierter Gene eines Microarray-Experimentes erfolgte durch das Programm Significance
Analysis of Microarrays (SAM) in der Version 1.21. Dieses Programm verwendet einen
modifizierten t-Test, um die signifikanten Gene und die Anzahl der falsch positiven Gene zu
ermitteln. Für den Sequenzvergleich der cDNA Sequenzen mit bekannten Proteinsequenzen
aus D. discoideum und anderen Organismen, wurde das Programm BLAST des NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) oder des EBI (http://www.ebi.ac.uk/blast2/index.html?UniProt) verwendet. Um falsche Ergebnisse auszuschließen, müssen die Arrays möglichst oft wiederholt werden. Hierzu gibt es mehrere Möglichkeiten. Zum einen kann die RNA
aus mehreren Kulturen isoliert werden, die unabhängig voneinander zu verschiedenen
Ergebnisse
64
Zeitpunkten angesetzt wurden. Dies würde die biologische Variabilität der RNA-Expression
verringern. Zum anderen kann die Farbmarkierung von Experiment- und Kontroll-cDNA
getauscht werden. Somit kann ein möglicher genspezifischer Effekt der Farbstoffe minimiert
werden. Eine weitere Art der Wiederholung erfolgt auf dem Microarray, da für jede Sonde
zwei Punkte und für die Kontrollen mehrere Punkte auf dem Microarray existieren.
4.2.2
Kategorisierung der differentiell exprimierten Gene
Die Sonden des Microarrays wurden in funktionelle Kategorien eingeteilt. Diese funktionelle
Kategorisierung basiert auf der für Saccharomyces cerevisiae des Munich Information Centre
for Protein Sequences (MIPS, http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.html). Mit aufgenommen wurden noch Kategorien für die Multizellularität von D. discoideum während des
Entwicklungszyklusses (Urushihara et al., 2004; Farbrother, 2004). In Tabelle 9 sind die
funktionellen Kategorien der 5423 cDNA Sonden des D. discoideum Microarrays aufgeführt.
Tabelle 9 Funktionelle Kategorisierung der 5423 cDNA Sonden des D. discoideum Microarrays. Es ist die
Anzahl der Sonden in den einzelnen Kategorien sowie der Anteil der Kategorie am gesamten cDNA Satz
angegeben.
Kategorie
Anzahl Anteil (%)
1. Metabolism
757
14,0
2. Energy
64
1,2
3. Transcription
107
2,0
4. Translation
90
1,7
5. Protein destination
139
2,6
6. Cellular biogenesis and organization
53
1,0
7. Transport facilitaion
96
1,8
8. Cell proliferation
63
1,2
9. Movement
67
1,2
10. Stress response and cell rescue
34
0,6
11. Signal transduction
115
2,1
12. Multicellular organization
95
1,8
13. Retrotransposon and plasmid proteins
13
0,2
14. Classification uncertain
2377
43,8
15. Unclassified proteins
1340
24,7
13
0,2
16. error
Ergebnisse
4.2.3
65
Vermehrung verschiedener Legionellen in Dictyostelien
Mit Hilfe des Microarrays sollte das RNA-Expressionsmuster uninfizierter Dictyostelien mit
dem von Dictyostelien verglichen werden, die mit verschiedenen Legionellen infiziert
wurden. Hierzu wurden der pathogene Stamm L. pneumophila PhilI JR32, der für
D. discoideum apathogene Stamm L. hackeliae und die dotA-Mutante von L. pneumophila
PhilI JR32 für die Infektionen verwendet. Zunächst wurde die Vermehrungsfähigkeit der drei
Legionellen-Stämme in D. discoideum untersucht. Die Infektionen wurden wie unter 3.12.2
beschrieben durchgeführt. In Abbildung 9 ist die Replikationsrate von L. pneumophila PhilI
JR32, L. hackeliae und der dotA-Mutante von L. pneumophila PhilI JR32 dargestellt. Über
eine Infektionszeit von 96 h ist eine stetige Abnahme der dotA-Mutante und von L. hackeliae
zu sehen, wobei sich die wildtypischen L. pneumophila PhilI JR32 über 96 h um 1,5 logStufen vermehren können.
1000000
log CFU/ml
100000
L. p. JR32
10000
L. p. dotA-Mutante
1000
L. hackeliae
100
10
0
24
48
72
96
Zeit [h]
Abb. 9 Invasionsassays von L. pneumophila PhilI JR32, dotA-Mutante von L. p. PhilI JR32 und L. hackeliae in
D. discoideum. Die Versuche wurden wie unter 3.12.2 beschrieben dreimal unabhängig voneinander
durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Ergebnisse
4.2.4
66
Differentiell exprimierte Gene von Dictyostelium discoideum 24 h nach Infektion
mit Legionella pneumophila
Im Folgenden wurde untersucht, welche Gene von D. discoideum während der Infektion mit
L. pneumophila PhilI JR32 reguliert werden. Hierzu wurde die RNA aus infizierten und
uninfizierten Dictyostelien isoliert und gegeneinander mit Hilfe von Microarrays verglichen.
Zum Vergleich wurde der 24 h Wert nach Infektion von D. discoideum mit L. pneumophila
ausgewählt. Der 24 h Wert ist dahingehend interessant, da zu diesem Zeitpunkt noch keine
intrazelluläre Vermehrung der Legionellen stattfindet und noch keine Lyse der Wirtszellen
erfolgt. Aus vier unabhängigen Experimenten wurden sieben RNA-Extrakte aus infizierten
Dictyostelien und aus uninfizierten Dictyostelien isoliert. Diese wurden unter Vertauschung
der Farbmarkierung von Experiment- und Kontroll-cDNA markiert und mit insgesamt 19
Microarrays hybridisiert.
Nach Auswertung dieser 19 Microarray-Experimente wurden durch SAM 1218 differentiell
regulierte Gene gefunden. Davon wurden 612 induziert und 606 reprimiert. Aufgrund der
hohen Zahl an differentiell regulierten Genen wurden für die Annotation nur die Sonden mit
den höchsten score-Werten, also Werte mit hoher Signifikanz, ausgewählt. Um Hinweise zu
erhalten, welche Funktion die zu den Sonden gehörigen Gene haben, wurde mit dem
Programm BLAST nach Proteinen bekannter Funktion in D. discoideum und anderen
Organismen gesucht.
4.2.4.1
Induzierte Gene
In Tabelle 10 ist das BLAST-Ergebnis für die 16 am stärksten regulierten Gene von
D. discoideum 24 h nach Infektion mit L. pneumophila aufgelistet.
Tabelle 10 Induzierte Gene von D. discoideum 24 h nach Infektion mit L. pneumophila. Angegeben sind die
Sonden des Microarrays, der Signifikanz-Wert von SAM (score), der Faktor der Induktion und das BLASTErgebnis.
Sonde
score Faktor
BLAST-Ergebnis
SSB153 15,24
5,9
-
SSL850 13,18
4,3
Ähnlich zu Discoidin I von D. discoideum
SSK605 11,64
1,6
SLD769 10,85
2,4
Ähnlich zu Phosphoribosylaminoimidazol Carboxylase von
Bifidobacterium longum
Ähnlich zu Endopeptidase ClpB von Rhodopseudomonas palustris
SSL284 10,29
1,9
rtoA
Ergebnisse
67
VSA218 10,28
2,1
SLJ833 10,13
2,1
Ähnlich zu short-chain Dehydrogenase von Schizosaccharomyces
pombe
α-Mannosidase
SSM409 10,07
1,8
-
SLD718 9,59
1,8
SSM847 9,51
2,4
-
SSJ163
8,40
3,0
SSK692 8,14
2,4
SSI119
7,15
2,6
Ähnlich zu short-chain Dehydrogenase von Rhizobium sp. (Stamm
NGR234)
Hypothetisches Protein in D. discoideum, keine ähnlichen Proteine
in anderen Organismen mit p-Wert < 0,98
Ähnlich zu Glutathion S-Transferase von Xenopus laevis
SSK512 6,59
2,4
Ähnlich zu hypothetischem Protein in Arabidopsis thaliana
SLH683 4,91
3,0
D13973 4,57
4,4
Ähnlich zu Acetyl-CoA Hydrolase von Geobacter sulfurreducens
Dp87, Sorus Matrix Protein
Zwei der induzierten Gene infizierter Dictyostelien konnten bereits charakterisiert werden.
RtoA ist ein 39,8 kDa großes Protein. Mutanten im rtoA-Gen bilden während des
Entwicklungszyklusses ungewöhnlich viele Prästielzellen. Das Gen manA, repräsentiert durch
die Sonde SLJ833, kodiert für die lysosomale α-Mannosidase. Die α-Mannosidase ist ein
140 kDa großes Präprotein, das proteolytisch in zwei lösliche Untereinheiten gespalten wird.
Dieses Enzym ist eine Exoglykosidase und ist in Eukaryoten weit verbreitet. Es spaltet α-Dmannosidische Bindungen und baut somit N-glykosidische Oligosaccharide ab (Schatzle et
al., 1992). Für weitere sieben Sonden wurden ähnliche, bereits in D. discoideum und anderen
Organismen beschriebene Proteine gefunden. Das durch die Sonde SSL850 repräsentierte Gen
zeigt eine starke Ähnlichkeit zu Discoidin I von D. discoideum. Durch Vergleiche der
Aminosäuresequenzen konnte gezeigt werden, dass von 266 Aminosäurepositionen 134
identisch sind und 167 ähnliche Aminosäuren aufweisen. Das Discoidin I ist ein
kohlenhydratbindendes Protein (Lectin) und dient zur interzellulären Adhäsion. Des Weiteren
binden an dieses Lectin auch Futterbakterien wie Klebsiella aerogenes und Escherichia coli
(Simpson et al., 1974; Breuer und Siu, 1981). Die durch die Sonden VSA218 und SSJ163
repräsentierten Gene zeigen eine zu 41% bzw. zu 43 % identische Aminosäuresequenz zu den
short-chain Dehydrogenasen von Schizosaccharomyces pombe und Rhizobium sp. Die shortchain Dehydrogenasen gehören zu den Oxidoreduktasen, Lyasen oder Isomerasen. Sie
können aliphatische Alkohole, Prostaglandine, Retinoide und Steroide umsetzen (Belyaeva et
al., 2003). Die Sonde SSK605 zeigt mit 40% Übereinstimmung eine Ähnlichkeit zu der
Phosphoribosylimidazol Carboxylase von Bifidobacterium longum. Die entsprechende
Ergebnisse
68
Aminosäuresequenz der Sonde SLD769 zeigt 60% Identität zu der Endopeptidase ClpB von
Rhodopseudomonas palustris. Eine 66%ig identische Aminosäuresequenz zeigen SLD718
und die Acetyl-CoA Hydrolase von Geobacter sulfurreducens. Die größte Ähnlichkeit der
Sonde SSI119 mit 69 identischen von 194 Aminosäuren hatte die Glutathion S-Transferase
von Xenopus laevis. Die Sonden SSK692 und SSK512 zeigten Ähnlichkeiten zu
hypothetischen Proteinen von D. discoideum oder anderen Organismen, zu denen keine
weitere Information vorliegt. Für die vier Sonden SSB153, SSM409, SSM847 und SLH683
konnte keine signifikante Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen gefunden werden. Die Sonde
D13973 repräsentiert das bereits publizierte Gen Dp87 (Ozaki et al., 1993). Dieses Gen
kodiert für ein 83 kDa großes Protein der Sporenhülle.
4.2.4.2
Reprimierte Gene
In Tabelle 11 sind die D. discoideum Gene aufgeführt, die 24 h nach Infektion mit
L. pneumophila am stärksten reprimiert wurden.
Tabelle 11 Reprimierte Gene von D. discoideum 24 h nach Infektion mit L. pneumophila. Angegeben sind die
Sonden des Microarrays, der Signifikanz-Wert von SAM (score), der Faktor der Repression und das BLASTErgebnis.
Sonde
Score Faktor
BLAST-Ergebnis
Ähnlich zu β`-COP von Bos taurus
VSE168 -11,23
2,3
SSC645 -10,96
2,6
SSC158 -10,67
2,9
Ähnlich zum T06D8.9 Protein von C. elegans
SSL828 -10,44
2,5
Ähnlich zu calcium binding protein 4a von D. discoideum
SSC374 -10,25
2,3
-
SSL818 -10,18
2,7
Ähnlich zu calcium binding protein 4b von D. discoideum
VSG118 -10,14
1,7
-
SSF803 -10,08
2,5
Hypothetisches Protein von D. discoideum
SSB431 -9,80
3,0
Ähnlich zu Stearoyl-CoA Desaturase von Mucor rouxii
SSM741 -9,71
3,2
-
SLE471 -9,25
2,9
cotB, spore coat protein SP70
SSL579 -8,11
2,5
Ähnlich zu calcium binding protein 2 von D. discoideum
SSM558 -5,93
2,8
Ähnlich zu calcium binding protein 4a von D. discoideum
-
Das durch die Sonde SLE471 codierte Gen konnte dem cotB von D. discoideum zugeordnet
werden. Dieses Gen codiert für das spore coat Protein SP70, eines von drei Proteinen, die in
Ergebnisse
69
der Sporenhülle von D. discoideum vorkommen (Fosnaugh & Loomis, 1993). Teilweise große
Ähnlichkeit zeigen die Sonden SSL818, SSL828 und SSL579 mit den kleinen
calciumbindenden Proteinen (CBP) 4a, 4b und 2 von D. discoideum. Die CBPs 4a und 4b sind
162 Aminosäuren lang und weisen eine Sequenzidentität mit den entsprechenden Sonden von
90% auf. Die Aminosäuresequenz von CBP 2 ist mit der Sequenz von SSL579 nur zu 36%
identisch bzw. mit 54% ähnlich. Alle drei calciumbindenden Proteine weisen vier
Konsensusseqzuenzen für vier EF-Hand Motive auf (Andre et al., 1996). Für die Sonde
VSE168 wurde eine Übereinstimmung von 384 Aminosäuren von 638 Aminosäuren des β`COP Proteins von Bos taurus gefunden. 73% der Aminosäuren sind ähnlich. COPs (coat
protein) sind Vesikel umhüllende Proteine, die in den intra-Golgi Transport und auch beim
Transport zwischen Golgi und dem endoplasmatischen Retikulum eine Rolle spielen (Lowe &
Kreis, 1998). Mit 49% Sequenzübereinstimmung und 66% ähnlichen Aminosäuren zeigt die
Sonde SSB431 die größte Gemeinsamkeit mit der Stearoyl-CoA Desaturase von Mucor
rouxii. Diese membrangebundenen Enzyme des endoplasmatischen Retikulums oxidieren
bevorzugt Palmitoyl- und Steraoyl-CoA. Die entstehenden Produkte sind Ausgangsstoffe für
die Synthese von Triglyzeriden, Wachsen, Cholesterinestern und Phospholipiden (Heinemann
& Ozols, 2003). Die Sonde SSC158 zeigt 36% Identität in ihrer Sequenz zu dem
Membranprotein T06D8.9 von Caenorhabditis elegans auf. SSF803 ist identisch mit dem
hypothetischen Protein Q86HF1 von D. discoideum. Ähnlichkeiten zu charakterisierten
Proteinen anderer Organismen sind nicht bekannt. Für die Sonden SSC645, SSC374,
VSG118, SSM741 und SSM558 konnten keine signifikanten Treffer in den Datenbanken des
NCBI gefunden werden.
4.2.5
Vergleich der Genexpression nach Infektion mit L. pneumophila und L. hackeliae
Legionella pneumophila kann sich in D. discoideum vermehren. Im Gegensatz dazu werden
L. hackeliae in den Phagolysosomen zu 82% verdaut. Der Vergleich der Genexpression von
D. discoideum nach Infektion mit L. pneumophila und L. hackeliae sollte die Gene liefern, die
aufgrund von Infektion statt dem Verdau differentiell exprimiert werden. Diejenigen Gene,
die mit der Aufnahme von Legionellen reguliert sind, werden in beiden Kulturen exprimiert
und sollten sich somit aufheben. In Tabelle 12 sind die nach 24 h Infektion von D. discoideum
mit L. pneumophila induzierten Gene aufgezeigt, wobei Tabelle 13 die reprimierten Gene
darstellt. Zur Kontrolle dienten nicht uninfizierte Zellen wie oben beschrieben, sondern mit
L. hackeliae infizierte Dictyostelien.
Ergebnisse
70
Tabelle 12 Induzierte Gene von D. discoideum 24 h nach Infektion mit L. pneumophila im Vergleich zu
L. hackeliae infizierten Dictyostelien. Angegeben sind die Sonden des Microarrays, der Signifikanz-Wert von
SAM (score), der Faktor der Repression und das BLAST-Ergebnis.
Sonde
score Faktor
BLAST-Ergebnis
SLI845
18,5
4,7
Ähnlich zu Endopeptidase ClpB von Rhodopseudomonas palustris
SSL850 18,4
6,1
Ähnlich zu Discoidin I von D. discoideum
SSB153 18,3
13,0
-
SSJ163
15,6
4,6
SSM847 15,3
3,7
Ähnlich zu short-chain Dehydrogenase von Rhizobium sp. (Stamm
NGR234)
Discoidin I
J01284
14,6
3,5
SLJ337
13,3
2,8
VSE614 12,9
3,5
SSE777 12,6
3,1
-
VSI715
3,2
-
11,6
Ähnlich zu PqaA von Salmonella typhi
Tabelle 13 Reprimierte Gene von D. discoideum 24 h nach Infektion mit L. pneumophila im Vergleich zu
L. hackeliae infizierten Dictyostelien. Angegeben sind die Sonden des Microarrays, der Signifikanz-Wert von
SAM (score), der Faktor der Repression und das BLAST-Ergebnis.
Sonde
score Faktor
BLAST-Ergebnis
SLE471 -20,7
6,7
CotB, spore coat protein SP70
SSM558 -18,5
8,6
SSB307 -16,2
4,3
SSC374 -15,8
3,5
-
SSF615 -14,7
3,3
-
SSC158 -13,1
4,4
Ähnlich zum T06D8.9 Protein von C. elegans
SSL818 -12,2
4,0
Ähnlich zu calcium-binding protein 4b von D. discoideum
SSH545 -11,3
2,6
Cysteinproteinase 5 Vorläufer
VSK389 -11,0
2,4
SSB431 -10,9
3,7
Ähnlich zu Ubiquitin-konjugierendem Enzym von Paramecium
tetraurelia
Ähnlich zu Stearoyl-CoA Desaturase von Mucor rouxii
Ähnlich zu Spleissfaktor 3b von Mus musculus
Für die Versuche wurden je zwei unabhängige DNA-Präparationen verwendet, die mit vier
Microarrays hybridisiert wurden. Die Analyse durch SAM ergab insgesamt 882 regulierte
Gene. Hiervon wurden während der Infektion mit L. pneumophila 428 induziert und 454
reprimiert. Anhand der Tabellen kann man sehen, dass sich hier drei induzierte und vier
reprimierte Gene befinden, die auch in entsprechender Tabelle des Vergleichs mit
Ergebnisse
71
uninfizierten Zellen auftauchen. Bei den induzierten Genen tauchten die Sonden SSL850,
SSJ163 und SLI845 (SLD769) schon in Tabelle 10 auf. Die Sonde SLI845 hat große
Ähnlichkeit mit der Endopeptidase ClpB von Rhodopseudomonas palustris. Durch
Überarbeitung der cDNA-Sequenzen des japanischen cDNA-Projektes konnte festgestellt
werden, dass es sich um dasselbe Gen handelt, das durch die Sonde SLD769 aus Tabelle 10
repräsentiert wird. Ebenfalls ist bei den in diesem Experiment induzierten Genen der Faktor
der Induktion mit den Faktoren im vorangegangenen Experiment zu vergleichen.
Aus den Vergleichen der reprimierten Gene in Tabelle 11 und 13 geht hervor, dass hier vier
Sonden übereinstimmen. Die Sonden SLE471, SSL818, SSC158 und SSB431 zeigen Gene,
die in beiden vergleichenden Experimenten bei der Infektion von D. discoideum mit
L. pneumophila reprimiert werden. Jedoch sind in diesem Vergleich die Faktoren der
Repression verschieden. Die Sequenz der Sonde SSH545 zeigt Identität mit dem cDNAFragment der Cysteinproteinase 5. Die Sonde VSK389 ist ähnlich zu einem Ubiquitinkonjugierenden Enzym von Paramecium tetraurelia, wobei die Sequenz der Sonde SSB307
ähnlich zu dem Spleissfaktor 3b von Mus musculus ist.
Wird nun der Faktor der Induktion und Repression mit einem Schwellenwert von > 1,5
angegeben, so verringert sich die Anzahl der differentiell regulierten Gene beim Vergleich
uninfiziert gegen L. pneumophila infiziert auf 269. Beim Vergleich von L. pneumophila
infizierten gegen L. hackeliae infizierte Dictyostelien ergibt sich ein Wert von 588
differentiell regulierten Genen. Die Anzahl der Gene, die bei beiden Experimenten reguliert
werden ist 197. Hiervon werden 120 induziert und 77 reprimiert. Diese sind die Gene, die
durch den Infektionsvorgang reguliert sind. Beim Kontakt und durch die Aufnahme der
Legionellen werden 72 Gene reguliert. Während des Verdaus von Legionellen werden 187
Gene induziert und 204 reprimiert. In folgender Abbildung sollen die Werte veranschaulicht
werden.
Ergebnisse
72
L. pneumophila
uninfiziert
L. pneumophila
L. hackeliae
152
117
307
281
32
40
Gene, die durch den Kontakt
und die Aufnahme von
Legionellen beeinflusst werden
120
77
187
204
Gene, die durch die Infektion
beeinflusst werden
Gene, die durch den
Verdau von Legionellen
beeinflusst werden
Abb. 10 Vergleich der Experimente von L. pneumophila-infizierten und uninfizierten Dictyostelien und mit
L. hackeliae als Kontrolle. Es sind die induzierten und reprimierten Gene dargestellt, die bei beiden
Infektionsexperimenten differentiell reguliert sind und solche, die bei einem der Experimente zu finden sind. Für
die Induktion und die Repression wurde ein Schwellenwert von > 1,5 gewählt.
4.2.6
Vergleich der Genexpression nach Infektion mit Legionella pneumophila und
Legionella pneumophila ∆dotA
Das Protein DotA ist Bestandteil des Typ-IV-Sekretionssystems von Legionella und spielt
eine Rolle während der Blockade der Phagosom-Lysosomfusion. Knockout-Mutanten im
dotA-Gen werden von Dictyostelien aufgenommen, befinden sich aber kurze Zeit später in
Phagolysosomen und werden dort abgebaut (Roy et al., 1998). Für den Vergleich der
Genexpression von D. discoideum infiziert mit L. pneumophila und L. pneumophila ∆dotA
wurden je zwei unabhängige RNA-Präparationen verwendet, die mit vier Microarrays
hybridisiert wurden. In Tabelle 14 und 15 sind die zehn induzierten bzw. reprimierten Gene
mit den höchsten scores angegeben.
Ergebnisse
73
Tabelle 14 Induzierte Gene von D. discoideum nach Infektion mit L. pneumophila und mit L. pneumophila
∆dotA als Kontrolle. Angegeben sind die Sonden des Microarrays, der Signifikanz-Wert von SAM (score), der
Faktor der Induktion und das BLAST-Ergebnis.
Sonde
score Faktor
BLAST-Ergebnis
VSH181
28,8
4,2
Ähnlich zu exprimiertem Protein von Arabidopsis thaliana
SSK833
26,7
5,3
Ähnlich zu hypothetischem Protein von D. discoideum
AF140780 25,3
3,0
Countin
Ähnlich zu Glykoprotein 130 von D. discoideum
VSE427
25,2
4,1
SSB153
22,4
9,2
-
SSE890
22,2
3,3
SLG851
22,0
8,0
Ähnlich zu vermeintlich Kinesin-verwandtem Protein von
Plasmodium falciparum
Präsporen Protein Dp87 Vorläufer
SSK761
21,3
6,2
SLB478
19,9
5,5
Ähnlich zu einem Histidyl-tRNA Synthetase Homolog von Homo
sapiens
Ähnlich zu RING Finger Protein 14 von Mus musculus
SSL437
19,9
5,0
-
Tabelle 15 Reprimierte Gene von D. discoideum nach Infektion mit L. pneumophila und mit L. pneumophila
∆dotA als Kontrolle. Angegeben sind die Sonden des Microarrays, der Signifikanz-Wert von SAM (score), der
Faktor der Induktion und das BLAST-Ergebnis.
Sonde
score Faktor
BLAST-Ergebnis
SLJ376 -21,7
3,4
Flavohämoglobin
SSL389 -20,0
2,5
SSM424 -19,0
3,6
SSL845 -18,1
4,1
VSD222 -16,8
2,0
Ähnlich zu Gen 16 Protein von Xenopus laevis
VSH732 -16,4
3,5
VSH352 -16,3
2,0
Ähnlich zu einer Oxidoreduktase der Eisen/Ascorbat Familie von
Caulobacter crescentus
Ähnlich zu ribosomalem Protein L17 von Paralichthys olivaceus
SSC158 -16,3
4,7
Ähnlich zum T06D8.9 Protein von C. elegans
VSI401 -15,4
3,7
ABC Transporter AbcG3
SLG489 -15,2
2,2
Cytochrom Oxidase Untereinheit 1 und 2
Ähnlich zu
luminescens
Xaa-Pro
Aminopeptidase
von
Photorhabdus
-
Vergleicht man die zehn am stärksten induzierten und reprimierten Gene dieses Experiments
mit uninfizierten Zellen als Kontrolle, so kann man zwei Übereinstimmungen finden, nämlich
Sonde SSB153 bei den induzierten Genen und SSC158 bei den reprimierten Genen. Ebenfalls
sind bei den induzierten Genen zwei bekannte D. discoideum Gene dabei. Countin (Sonde
AF140780) ist ein Sekretionsfaktor, der die Zellzahl der Aggregate während der Entwicklung
Ergebnisse
74
beeinflusst. Dp87 ist ein Präsporenprotein, das Ähnlichkeiten mit anderen Proteinen aus der
Sporenhülle aufweist (Ozaki et al., 1993). Reprimiert werden die Gene, die durch die Sonden
SLJ376, VSI401 und SLG489 repräsentiert werden. Diese Gene konnten als Flavohämoglobin, ABC-Transporter G3 und als Cytochrom Oxidase identifiziert werden.
Um zu untersuchen, welche Gene bei D. discoideum eine Rolle während eines Infektionsvorgangs spielen, bildet man die Schnittmenge aller Gene, die bei L. pneumophila infizierten
Zellen auftauchen, jedoch keine Rolle spielen, bei uninfizierten, L. hackeliae oder
L. pneumophila ∆dotA infizierten Zellen. Die Gene, die hier differentiell exprimiert werden,
stellen wohl den minimalen Satz an Genen dar, die in D. discoideum als Reaktion auf eine
Infektion mit L. pneumophila reguliert werden. Dieser Satz an Genen kann in funktionelle
Kategorien eingeteilt werden. Die Kategorisierung wurde von Urushihara et al. des japanischen cDNA-Projekt erstellt und teilt die Gene entsprechenden Kategorien ihrer Funktion
zu (Urushihara et al., 2004). So gehören 17 der 35 induzierten Gene während einer
L. pneumophila Infektion in die Unterkategorie 1.1 Metabolismus: Aminosäuremetabolismus.
In dieser Kategorie sind auch übermäßig viele Sonden für t-RNA-Synthetasen vorhanden. Des
Weiteren tritt keine weitere Kategorie gehäuft auf.
4.2.7
Zeitreihe der Genexpression von Dictyostelium discoideum mit Legionella
pneumophila
Um zu untersuchen wieviele Gene während einer Infektion von D. discoideum mit
L. pneumophila exprimiert werden, wurde eine Zeitreihe angesetzt. Hierzu wurden
Dictyostelien mit L. pneumophila wie unter 3.12.2 beschrieben infiziert und die RNA zu den
Zeitpunkten 1 h, 3 h, 6 h, 24 h und 48 h nach Infektion wie unter 3.17.1 beschrieben isoliert.
Für jeden Zeitpunkt wurden drei unabhängige RNA-Isolationen verwendet, die mit sechs
Microarrays hybridisiert wurden. Nach Einberechnung eines Schwellenwertes von > 1,5 für
den Regulationsfaktor, ergibt sich folgende Anzahl an differentiell regulierten Genen zu den
entsprechenden Zeitpunkten.
Tabelle 16 zeigt, dass die meisten Gene 24 h nach Infektion differentiell reguliert werden.
Eine Stunde nach Infektionsbeginn sind nur die wenigsten Gene differentiell reguliert. Teilt
man die Gene funktionellen Gruppen zu, so findet man überwiegende Induktion vorwiegend
in den Kategorien 6 Cellular biogenesis and organization und 10 Stress response and cell
rescue (siehe Tabelle 9).
Ergebnisse
75
Tabelle 16 Darstellung der differentiell exprimierten Gene zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion von
D. discoideum mit L. pneumophila. Die Anzahl der differentiell exprimierten Gene wurde mit SAM identifiziert.
Der Schwellenwert der Induktion bzw. Repression ist mit einem Faktor > 1,5 angegeben.
Zeitpunkt [h] Differentiell exprimierte Gene
1
19
3
129
6
50
24
189
48
77
Zur Veranschaulichung wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen einer Infektion von
D. discoideum mit L. pneumophila gemacht. Hierzu wurden Dictyostelien wie unter 3.12.2
beschrieben mit L. pneumophila PhilI JR32 infiziert. In Abbildung 11 sind infizierte
Dictyostelien 3 h, 24 h und 48 h nach Infektion dargestellt.
A
B
A
B
C
C
Abb. 11 Elektronenmikroskopische Aufnahmen Legionellen-infizierter Dictyostelien. Die Bilder wurden 3 h
(A), 24 h (B) und 48 h (C) nach Infektion aufgenommen.Die Pfeile zeigen die sich im Phagosom befindlichen
Legionellen. Der Grössenmarker entspricht 1 µm Länge
In Abbildung 11 sind mit L. pneumophila infizierte Dictyostelien elektronenmikroskopisch
dargestellt. Die Pfeile zeigen auf die sich im Phagosom befindlichen Legionellen 3 h (A), 24 h
Ergebnisse
76
(B) und 48 h (C) nach Infektion. Bereits 48 h nach Infektion können randvoll mit Legionellen
angefüllte Wirtszellen beobachtet werden.
4.2.8
Zusammenfassung
Mit Hilfe des D. discoideum Microarrays wurde die Genexpression von D. discoideum nach
Infektion mit L. pneumophila untersucht. Zur Kontrolle dienten uninfizierte Dictyostelien und
Dictyostelien, die mit L. hackeliae bzw. einer dotA-Mutante von L. pneumophila infiziert
wurden. Für den Zeitpunkt 24 h nach Infektionsbeginn konnten 140 Gene in D. discoideum
als differentiell exprimiert identifiziert. Zu den bisher bekannten Proteinen gehören RtoA,
Discoidin I, CotB und die lysosomale α-Mannosidase. Über Homologie-Suche konnte
weiteren Treffern eine Funktion zugewiesen werden. Hierzu zählen die molekularen
Chaperone ClpB, β`-COP und drei calciumbindende Proteine. Mit Hilfe einer Kategorisierung
der Sonden konnte gezeigt werden, dass besonders viele Gene induziert werden, die am
Aminosäuremetabolismus beteiligt sind, oder bei denen es sich um ribosomale Proteine
handelt. Anhand einer Zeitreihe über 48 h konnte gezeigt werden, dass 3 h und 24 h nach
Infektion die meisten Änderungen in der Genexpression von D. discoideum auftreten.
Zahlenmäßig überrepräsentiert sind in der Zeitreihe die Kategorien 6 Cellular biogenesis and
organization und 10 Stress response and cell rescue.
4.3
4.3.1
Untersuchung von Nramp aus Dictyostelium discoideum
Aufnahmerate von Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum WT und
nramp-Mutante
Das Nramp-Protein aus D. discoideum ist am Transport zweiwertiger Kationen über die
phagosomale Membran beteiligt. Es wurde untersucht, ob dieses Protein einen Einfluss auf
die Aufnahme und die Replikation von Bakterien in D. discoideum hat. Um die Aufnahmerate
von L. pneumophila in D. discoideum WT und der nramp-Mutante HSB60 zu vergleichen,
wurden WT und Mutante in 24-Loch-Schale für 3 h mit GFP-exprimierenden Legionellen
koinkubiert. Nach 3 h Koinkubation bei 24,5°C wurden die extrazellulären Bakterien
weggewaschen. Nach Ablösen der Zellen vom Boden der Schale wurde die Anzahl der grün
leuchtenden Wirtszellen am Durchflusszytometer bestimmt. Für die Durchführung der
Versuche wurde der Stamm L. pneumophila Corby (pRK10(pBC(gfp)-Pmip)) verwendet.
Parallel zur FACS-Analyse wurden die CFU-Werte ermittelt. Abbildung 12 zeigt die durch
Ergebnisse
77
FACS-Analyse erimittelte Aufnahmerate von L. pneumophila in AX2-Wildtyp und die
nramp-Mutante. Bild A zeigt uninfizierte wildtypische Dictyostelien und Bild B zeigt
uninfizierte nramp-Mutanten. In Bild C ist eine durch erhöhte Fluoreszenz verursachte
Rechtsverschiebung der Wirtszellen zu sehen. Im Mittel sind 19% der Dictyostelien infiziert,
wobei nur 10% Zellen der nramp-Mutante (Bild D) mit L. pneumophila Corby infiziert sind.
Dies entspricht einer 50% verminderten Aufnahmefähigkeit der nramp-Mutante im Vergleich
zum Wildtyp.
A
B
C
D
Abb. 12 FACS-Analyse von D. discoideum infiziert mit GFP-markierten L. pneumophila. Die Versuche wurden
wie unter 3.14 beschrieben durchgeführt. Bild A zeigt uninfizierte AX2 und Bild B zeigt uninfizierte nrampMutanten. Die Phagozytoserate von L. pneumophila in nramp-Mutanten (D) ist im Vergleich zur Aufnahme in
AX2 (C) vermindert.
Zur Überprüfung der Ergebnisse aus der FACS-Analyse wurden parallel noch CFUBestimmungen durchgeführt um die Phagozytoserate in wildtypischen Dictyostelien und
nramp-Mutanten zu bestimmen (Abb. 13)
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
L. pneumophila in WT
L. pneumophila in NRAMP-Mutante
Abb. 13 Bestimmung der CFU-Werte 3 h nach Infektion von D. discoideum WT und D. discoideum nrampMutante mit L. pneumophila Corby. Die Versuche wurden wie unter 3.14 beschrieben dreimal unabhängig
voneinander durchgeführt und die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Ergebnisse
78
Wie in Abb. 13 dargestellt, werden 1 x 105 L. pneumophila in 5 x 105 D. discoideum WT
aufgenommen. Geht man davon aus, dass jede Wirtszelle jeweils nur ein Bakterium
aufnimmt, so entspricht das einer Infektionsrate von 20%. Im Gegensatz zum Wildtyp nimmt
die nramp-Mutante nur etwa halb so viele (5,7 x 104) Legionellen auf. Die Aufnahmerate in
die nramp-Mutante ist also im Vergleich zum WT um 50% reduziert. Sowohl durch FACSAnalyse, als auch durch CFU-Bestimmung konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von
L. pneumophila in die nramp-Mutante von D. discoideum deutlich vermindert ist.
4.3.2
Vermehrung
von
Legionella pneumophila
und
Mycobakterium avium
in
Dictyostelium discoideum WT und nramp-Mutante HSB60
Neben der Aufnahmerate wurde die Vermehrungsrate von L. pneumophila in wildtypischen
Dictyostelien mit der Vermehrungsrate in nramp-Mutanten HSB60 über eine Zeit von 96 h
untersucht. Hierzu wurden die Dictyostelien wie unter 3.12.2 beschrieben infiziert. Nach 0 h,
24 h, 48 h, 72 h und 96 h wurden Aliquots aus den Infektionsflaschen entnommen und davon
geeignete Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten ausplattiert. Die Vermehrung der
Legionellen in D. discoideum WT und in der nramp-Mutante ist in Abb. 14 dargestellt.
log CFU/ml
1000000
100000
L. pneumophila in WT
L. pneumophila in
Nramp-Mutante
10000
1000
0
24
48
72
96
Zeit [h]
Abb. 14 Vermehrung von L. pneumophila Corby in D. discoideum Wildtyp und in der nramp-Mutante von
D. discoideum. Die Invasionsassays wurden wie in 3.12.2 beschrieben dreimal unabhängig voneinander
durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Wie in Abb. 14 zu erkennen ist, nimmt die Anzahl der Legionellen sowohl im WT als auch in
der Mutante in den ersten 24 h ab. Während die Legionellen sich in der Mutante bereits nach
48 h vermehrt haben, nehmen die Bakterien im Wildtyp weiter ab. Erst nach 72 h ist eine
Ergebnisse
79
deutliche Vermehrung um das knapp 4-fache des Inokulums zu erkennen. Die Legionellen in
der Mutante haben sich nach 72 h bereits um das 7-fache vermehrt. Nach 96 h wird der
Unterschied in der Replikationsrate noch deutlicher. Während sich L. pneumophila im WT
um das 22-fache vermehrt hat, nahm die Anzahl von L. pneumophila in der nramp-Mutante
um das 80-fache zu.
Da Mycobacterium avium ebenfalls ein intrazelluläres Pathogen ist und sich in D. discoideum
vermehren kann, wurde die Aufnahme- und Replikationsrate von M. avium in wildtypischen
Dictyostelien mit der in nramp-Mutanten verglichen. Hierzu wurden die Invasionsassays wie
unter 3.12.4 beschrieben durchgeführt. In Abb. 15 ist die Vermehrung von M. avium in
wildtypischen Dictyostelien und in der nramp-Mutante dargestellt.
10000000
log CFU/ml
1000000
M. avium in WT
100000
M. avium in NrampMutante
10000
1000
0
0'
24
48
72
96
Zeit [h]
Abb. 15 Darstellung der Vermehrungsrate von M. avium in D. discoideum WT und der nramp-Mutante über
einen Zeitraum von 96 h. Die Invasionsassays wurden wie unter 3.12.4 beschrieben durchgeführt. Nach 3 h
Koinkubationszeit wurden die extrazellulären Bakterien entfernt und die Anzahl der intrazellulären Bakterien
zum Zeitpunkt 0’ h bestimmt. Ebenso wurden bis 96 h alle 24 h Aliquots entnommen um die intrazelluläre
Vermehrungsrate zu bestimmen. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die
resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken angegeben.
Wie in Abb. 15 zu erkennen ist, wurden sowohl die wildtypischen Dictyostelien als auch die
nramp-Mutanten zum Zeitpunkt 0 h mit etwa gleich vielen Mykobakterien infiziert. Nach
Entfernen der extrazellulären Bakterien wurden zum Zeitpunkt 0’ h von der nramp-Mutante
nur etwa halb so viele Mykobakterien aufgenommen wie von wildtypischen Dictyostelien.
Die Mykobakterien vermehrten sich in D. discoideum WT von 7,6 x 103 Bakterien/ml zum
Zeitpunkt 0’ h auf 5,4 x 105 Bakterien/ml nach 96 h. Dies enspricht einer Vermehrung um
knapp 2 log-Stufen. Trotz der niedrigeren Aufnahme in die nramp-Mutante, vermehrten sich
die Mykobakterien innerhalb von 96 h von 4 x 103 Bakterien/ml auf 1,5 x 106 Bakterien/ml,
Ergebnisse
80
was einer Vermehrung um knapp 2,7 log-Stufen entspricht. Zusammenfassend lässt sich
sagen, dass sich sowohl L. pneumophila als auch M. avium in nramp-Mutanten von
Dictyostelium besser vermehren können
4.3.3
Expression von nramp während der Infektion
Im Folgenden wurde die Expression von nramp in D. discoideum während einer Infektion
untersucht. Hierzu wurden 5 x 107 Dictyostelien mit 5 x 108 Legionellen bzw. mit der
gleichen Anzahl Mykobakterien wie in 3.12.2 und 3.12.4 beschrieben infiziert. Anschließend
wurden zum Zeitpunkt 0 h, 24 h, und 48 h nach Infektion die Gesamt-RNA aus dem
Infektionsansatz mit Trizol isoliert. Als Negativkontrolle dienten uninfizierte Dictyostelien.
Im Schnitt konnten pro Ansatz etwa 400 µl RNA mit einer Konzentration von 1 mg/ml
isoliert werden. In Zusammenarbeit mit Salvatore Bozzaro wurden mit diesen RNAs
Northern-Blots mit einer spezifischen nramp-Sonde durchgeführt, um die Expression von
nramp während der Infektion mit Legionellen und Mykobakterien zu untersuchen (Abb. 16).
Abb. 16 In den oberen Northern-Blots ist die nramp1-Expression von D. discoideum nach Inkubation im
Medium und nach Koinkubation mit M. avium und L. pneumophila dargestellt. Zur Kontrolle wurden NorthernBlots mit den Sonden gegen VatB und Actin durchgeführt.
Zum Zeitpunkt 0 h exprimieren Dictyostelien, die sich alleine im Medium befinden bzw. bei
Koinkubation mit M. avium oder L. pneumophila gleich viel nramp-RNA. Zur Kontrolle
wurden Dictyostelien ohne Bakterien in Medium inkubiert. Hier ist zu beobachten, dass die
nramp-Expression innerhalb 48 h abnimmt. Ebenso ist die nramp-Expression nach Infektion
mit L. pneumophila (rechter Blot) nach 24 h reduziert. Nach 48 h ist keine nramp-RNA im
Northernblot mehr nachweisbar. Anders verhält es sich mit M. avium infizierten
Dictyostelien. Nramp-RNA ist die ganze Zeit während der 48 h Infektion nachweisbar. Zur
Kontrolle wurden aus den gleichen Experimenten Northern-Blots mit Sonden für VatB
(vacuolar H+ ATPase B) und Actin durchgeführt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass
Ergebnisse
81
nramp-RNA von Dictyostelium während einer Infektion mit M. avium über 48 h exprimiert
wird, während einer Infektion mit L. pneumophila jedoch nach 48 h nicht mehr nachweisbar
ist.
4.3.4
Zusammenfassung
Sowohl durch FACS-Analyse als auch durch CFU-Bestimmungen konnte gezeigt werden,
dass M. avium und L. pneumophila durch wildtypische Dictyostelien besser phagozytiert
werden, als durch nramp-Mutanten von D. discoideum. Invasionsstudien haben gezeigt, dass
sich beide Bakterien in der Mutante besser vermehren können als im Wildtyp. Anhand von
Northern-Blots ist zu sehen, dass die nramp-Expression von uninfizierten und mit
L. pneumophila infizierten Dictyostelien innerhalb 48 h abnimmt. Im Gegensatz dazu ist
nramp-RNA während einer Infektion mit M. avium über 48 h nachweisbar.
4.4
4.4.1
Funktionsanalyse des Legionella pneumophila Mip-Proteins
Intrazelluläre Vermehrung von Legionella pneumophila mip-Mutanten in
NCI-H292
Um den Einfluss der PPIase-Aktivität und der Dimerisierung des Mip-Proteins auf das
intrazelluläre Überleben von L. pneumophila in Lungenepithelzellen NCI-H292 zu
untersuchen, wurden wie unter 3.19 beschrieben Invasionsassays durchgeführt. Über die
Bestimmung der CFU wurde die intrazelluläre Vermehrung quantifiziert. Für die Infektion
wurden der mip-positive Wildtyp Stamm L. pneumophila PhilI JR32, die mip-negative
Mutante L. p. PhilI JR32-2, die mit mip transformierte Komplementante L. p. PhilI JR32-2.1,
die PPIase-defizienten Stämme L. p. PhilI JR32-2.2 (2% PPIase) und L. p. PhilI JR32-2.3
(6,2% PPIase) sowie der monomeres Mip exprimierende Stamm L. p. PhilI JR32-2.4
verwendet (Abb. 17)
Ergebnisse
82
100000000
log CFU/ml
10000000
JR 32
JR 32-2
1000000
JR 32-2.1
JR 32-2.2
100000
JR 32-2.3
JR 32-2.4
10000
1000
0
0'
24
48
72
Zeit [h]
Abb. 17 Invasionsassay verschiedener L. pneumophila PhilI JR32 Mip-Varianten. Quantifizierung der
intrazellulären Vermehrung des Wildtyps JR32, der mip-negativen Mutante JR32-2, der mip-positiven
Komplementante JR32-2.1, den PPIase-defizienten Stämmen JR32-2.2 (2% PPIase) und JR32-2.3 (6,2% PPIase)
sowie der monomeres Mip exprimierenden Variante JR32-2.4 in der Lungenepithelzelllinie NCI-H292. 5 x105
Zellen/ml wurden mit einer MOI von 20 für 3 h bei 37°C und 5% CO2 infiziert, bevor die extrazellulären
Bakterien durch Gentamicinbehandlung entfernt wurden. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander
durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Die Abbildung 17 zeigt die intrazelluläre Vermehrung verschiedener L. pneumophila PhilI
JR32 Mip-Varianten. Nach einer Inkubationszeit von 3 h bei 37°C und 5% CO2 wurden die
extrazellulären Bakterien durch Gentamicinbehandlung entfernt. Zu diesem Zeitpunkt (0’ h)
wurden alle Bakterienstämme gleich gut in die Lungenepithelzellen aufgenommen. Bereits
24 h später ist eine deutliche Vermehrung des Wildtyps JR32, der Komplementante JR32-2.1
und der monomeres Mip exprimierenden Variante JR32-2.4 um eine knappe log-Stufe zu
erkennen. Die mip-Mutante JR32-2 vermehrte sich innerhalb 24 h nicht und die PPIasedefizienten Varianten JR32-2.2 und JR32-2.3 konnten ihre Anzahl nur verdreifachen. Dieser
Trend ist nach 48 h und 72 h noch besser zu sehen. Der Wildtyp JR32, die Komplementante
JR32-2.1 und die monomeres Mip exprimierende Variante JR32-2.4 vermehrten sich um 2,5
log-Stufen. Die mip-Mutante konnte sich nur leicht mehr als 1 log-Stufe vermehren, die
PPIase-defizienten Varianten JR32-2.2 um 1,5 log-Stufen und JR32-2.3 um 2 log-Stufen.
4.4.2
Bindestudien
Für viele Immunophiline sind zelluläre Interaktionspartner identifiziert worden. Das humane
Cyclophilin-A (hCyp-18) z. B. interagiert mit hsp90. Das hFKBP-12 bindet an Calmodulin
und auch an weitere zelluläre Komponenten wie das RAFT1 (Rapamycin-FKBP-12 target)
(Galat & Metcalfe, 1995). Ebenso wie das hFKBP-12, zählt das Legionella Mip-Protein zu
Ergebnisse
83
den FK506-Bindeproteinen. Für Mip konnte jedoch bis heute kein natürliches Substrat
identifiziert werden. Legionellen vermehren sich in der Lunge sowohl in Lungenmakrophagen
als auch in Lungenepithelzellen. Durch histologische Untersuchungen konnten in der Lunge
von Patienten, die an Legionellose verstorben sind, viele Legionellen extrazellulär
nachgewiesen werden. In der Annahme, dass es einen extrazellulären Interaktionspartner gibt,
wurden Bindestudien von Mip an extrazelluläre Matrix und extrazelluläre Matrixproteine
durchgeführt.
4.4.2.1
Bindung von Mip an Lungenepithelzellen NCI-H292
Zur Untersuchung, ob Mip eine Rolle bei der Bindung von Legionellen an
Lungenepithelzellen spielt, wurden wildtypische L. pneumophila PhilI JR32 und mip-negative
L. pneumophila PhilI JR32-2 mit Biotin gekoppelt und mit Lungenepithelzellen inkubiert. Der
Versuch wurde wie unter 3.20 beschrieben durchgeführt. Nach entsprechender Inkubationszeit wurde Neutravidinperoxidase zugegeben, welche an Biotin bindet. Nicht gebundene
Neutravidinperoxidase wurde entfernt und nach Zugabe von Peroxidasesubstrat wurde die
Intensität des Farbumschlages am ELISA-Reader gemessen. Anhand der unterschiedlichen
Farbintensitäten ist zu erkennen, dass die mip-Mutante nur halb so gut an die
Lungenepithelzellen gebunden hat, wie der Wildtyp (Abb. 18)
Bindung (A450nm)
1,2
0,9
0,6
0,3
0
JR32
JR32-2
Abb. 18 Darstellung der Bindung biotinylierter Legionellen an Lungenepithelzellen NCI-H292. Nach 3 h
Inkubation der Legionellen auf den Lungenepithelzellen ist zu erkennen, dass wildtypische L. pneumophila PhilI
JR32 doppelt so gut an NCI-H292 Zellen binden als mip-negative L. pneumophila PhilI JR32-2. Die Versuche
wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von
Fehlerbalken dargestellt.
Ergebnisse
84
Da Mip eine Rolle bei der Bindung von Legionellen an die Lungenepithelzellen spielt,
wurden Bindestudien von gereinigtem, rekombinantem Mip an Lungenepithelzellen
durchgeführt. In Vorversuchen kam es beim Nachweis einer Bindung von Mip zu falsch
positiven Ergebnissen, die durch Kreuzreaktionen des sekundären Antikörpers verursacht
wurden. Um Kreuzreaktionen von Antikörpern zu vermeiden, wurde das rekombinante MipProtein direkt mit Meerrettichperoxidase (HRP) bzw. mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC
gekoppelt. Die Bindung von HRP an Mip bzw. von FITC an Mip wurde wie unter 3.22.1 und
3.22.2 beschrieben durchgeführt. Die Bindungsstudien von Mip an Lungenepithelzellen NCIH292 wurde wie unter 3.22.3 und 3.22.4 beschrieben durchgeführt. In folgender Grafik ist die
Bindung von Mip-HRP an Lungenepithelzellen in Abhängigkeit der Konzentration
dargestellt. Zur negativen Kontrolle wurden gleiche Versuche mit Rinderserumalbumin
(BSA) durchgeführt. Es ist zu sehen, dass Mip-HRP bei steigender Konzentration vermehrt an
Lungenepithelzellen bindet. BSA-HRP bindet trotz steigender Konzentration nicht an
Lungenepithelzellen..
2,5
Bindung (A450nm )
2
1,5
Mip-HRP
BSA-HRP
1
0,5
0
0,6
1,25
2,5
5
10
20
40
Konzentration [µg/ml]
Abb. 19 Bindung von Mip-HRP und BSA-HRP an Lungenepithelzellen. Die Versuche wurden wie unter 3.22.4
beschrieben durchgeführt. Die Bindung von Mip-HRP bzw. BSA-HRP ist durch die Farbintensität und somit
durch die Absorption wiedergegeben, die der ELISA-Reader misst. Die Bindung von Mip-HRP ist
konzentrationsabhängig, da bei zunehmender Konzentration von Mip-HRP eine zunehmende Absorption
gemessen wurde. BSA-HRP bindet trotz zunehmender Konzentration nicht an Lungenepithelzellen. Die
Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die daraus resultierende Standardabweichung
ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
4.4.2.2
Ergebnisse
85
Bindung von Mip an extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen
Um zu untersuchen, ob Mip an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen NCI-H292
bindet, wurde wie unter 3.22 beschrieben, die extrazelluläre Matrix aus diesen Zellen
gewonnen. Die quantitative Bindung von Mip-HRP an die extrazelluläre Matrix wurde wie
unter 3.22.4 beschrieben durchgeführt. Die konzentrationsabhängige Bindung ist in Abb.20
dargestellt.
3
Bindung (A450nm )
2,5
2
Mip-HRP
BSA-HRP
1,5
1
0,5
0
6
1,25
2,5
5
10
20
40
Konzentration [µg/ml]
Abb. 20 Bindung von Mip-HRP und BSA-HRP an die extrazelluläre Matrix der Lungenepithelzelllinie NCIH292. Die Versuche wurden wie unter 3.22.4 beschrieben durchgeführt. Die Absorption nimmt mit steigender
Konzentration von zugegebenem Mip-HRP zu, wobei sich die Absorption mit steigender Konzentration an
zugegebenem BSA-HRP nicht wesentlich verändert. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander
durchgeführt. Die daraus resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Wie in Abb. 20 zu erkennen, nimmt die Bindung von Mip-HRP an die extrazelluläre Matrix
von Lungenepithelzellen mit steigender Konzentration zu. Als Negativkontrolle wurden die
Versuche unter gleichen Bedingungen mit BSA-HRP durchgeführt. Trotz steigender
Konzentration konnte keine Bindung von BSA-HRP an die extrazelluläre Matrix
nachgewiesen werden.
Zur Kontrolle der Bindung von Mip an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen
wurden Mip und BSA wie unter 3.22.1 beschrieben mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC
markiert und Bindestudien durchgeführt. Je 50 µg des Farbstoffes wurden an 1 mg des
Proteins gekoppelt. Die Bindung von Mip-FITC an die extrazelluläre Matrix konnte
anschließend am Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Die gleichen Versuche wurden
zur Kontrolle mit BSA-FITC durchgeführt. Hier konnte keine Fluoreszenz detektiert werden,
was darauf schließen lässt, dass keine Bindung von BSA-FITC an die extrazelluläre Matrix
Ergebnisse
86
stattgefunden hat. In Abbildung 21 A ist die Bindung von Mip-FITC an die extrazelluläre
Matrix dargestellt. Abbildung 21 B zeigt die negative Kontrolle mit BSA-FITC.
A
B
Abb. 21 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der Bindung von Mip-FITC (A) bzw. BSA-FITC (B) an die
extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen NCI-H292. Die extrazelluläre Matrix wurde wie unter 3.22
beschrieben gewonnen. Die Bindestudien wurden wie unter 3.22.3 beschrieben durchgeführt.
4.4.2.3
Das
Bindung von Mip an Proteine der extrazellulären Matrix
Mip-Protein
von
L. pneumophila
bindet
an
die
extrazelluläre
Matrix
von
Lungenepithelzellen. Die extrazelluläre Matrix besteht hauptsächlich aus hochmolekularen
Glykoproteinen, Proteoglykanen, Laminin, Collagenen und Fibronektin. Im Folgenden wurde
untersucht an welche der Komponenten der extrazellulären Matrix das Legionella MipProtein bindet. Für Bindestudien wurde der Boden einer 96-Loch-Platte mit aufgereinigten
Matrixproteinen wie unter 3.22.4 beschrieben beschichtet. Durch die schonende Behandlung
ist gewährleistet, dass die Proteine ihre native Form behalten. Die Proteine wurden mit MipHRP bzw. für die negative Kontrolle mit BSA-HRP inkubiert. Die Bindung von HRPgekoppeltem Protein wird durch Zugabe von Peroxidasesubstrat sichtbar gemacht indem eine
Blaufärbung auftritt. Die Reaktion wird durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt, wobei
sich durch die pH-Wert Änderung die Flüssigkeit gelb färbt. Die Intensität der Farbe wird mit
Hilfe des ELISA-Readers bei 450 nm gemessen. In Abbildung 22 ist die Bindung von MipHRP an die verschiedenen Proteine der extrazellulären Matrix dargestellt.
Ergebnisse
87
Binding (A450nm)
2,5
2
1,5
Binding of Mip-HRP
1
0,5
BS
A
C
ol
Ia
ge
n
C
ol
I
la
ge
n
C
ol
II
la
ge
n
C
III
ol
la
ge
n
C
IV
ol
la
ge
n
C
pl
ol
V
as
la
g
m
e
.F
n
VI
ib
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ll.
ec
Fi
tin
br
on
ec
tin
70
La
kD
m
a
in
Fi
in
br
on
ec
t
Vi
tro in
ne
ct
in
0
Abb. 22 Dargestellt ist die Bindung von 40 µg Mip-HRP/ml an immobilisierte Proteine der extrazellulären
Matrix. Die Versuche wurden wie unter 3.21.4 beschrieben durchgeführt. Mip-HRP bindet an Collagene, wobei
die Bindung an Collagen IV am stärksten ist. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander
durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
In Abbildung 22 ist die Bindung von Mip-HRP an die verschiedenen gereinigten
extrazellulären Matrixproteine dargestellt. Zur Negativkontrolle diente BSA. Anhand der
Abbildung ist zu erkennen, dass Mip bevorzugt an die Collagene bindet. Hier ist vor allem
eine vermehrte Bindung an die Collagene I, IV, V und VI zu erkennen. Collagen II und III
wird nur schwach gebunden. Andere Matrixproteine wie zelluläres Fibronektin, plasmatisches
Fibronektin, ein 70 kDa Fragment von Fibronektin sowie Laminin und Vitronektin werden
nicht gebunden. Die Absorption liegt für die Bindung an diese Proteine unter 0,5 und somit
im Bereich der Negativkontrolle BSA. Ebenso konnte gezeigt werden, dass BSA-HRP nicht
in der Lage ist an die in diesen Versuchen verwendeten extrazellulären Matrixproteine zu
binden.
Des Weiteren wurde untersucht, ob die Bindung von Mip an die Matrixproteine
konzentrationsabhängig ist. Hierzu wurden wie oben beschrieben die Vertiefungen einer 96Loch-Platte mit den Matrixproteinen beschichtet. Anschließend wurden aufsteigende
Konzentrationen von Mip-HRP zugegeben und mit den Proteinen inkubiert. Nach Zugabe von
Peroxidasesubstrat wurde die quantitative Bindung anhand der Farbintensität am Photometer
bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. In Abbildung 23 ist die Absorption in
Abhängigkeit der Bindung von Mip-HRP an die verschiedenen extrazellulären Matrixproteine
gezeigt.
Ergebnisse
88
3,000
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
-0,500
1,25 2,5
5
10
20
40
80
Bindung (A450nm)
2,500
Collagen I
Collagen II
Collagen III
Collagen IV
Collagen V
Collagen VI
plasma. Fibronectin
zell. Fibronectin
Laminin
70 kDa Fibronectin
Vitronectin
BSA
Konzentration Mip-HRP [µg/ml]
Abb. 23 Bindung von Mip-HRP an verschiedene gereinigte extrazelluläre Matrixproteine. Die Versuche wurden
wie unter 3.22 beschrieben durchgeführt. Bei steigender Konzentration an zugegebenem Mip-HRP zu den
Collagenen I - VI nimmt die Absorption zu. Der Effekt ist am stärksten bei Collagen IV zu beobachten. An die
Collagene II und III bindet Mip-HRP erst ab einer Konzentration von über 30 µg. Die extrazellulären
Matrixproteine wie verschiedene Fibronektine, Laminin, Vitronektin, sowie die negative Kontrolle BSA werden
nicht gebunden.
In Abbildung 23 ist zu erkennen, dass mit steigender Konzentration von Mip-HRP die
Bindung an Collagen I, IV, V und IV zunimmt, wobei Collagen IV am stärksten gebunden
wird. Bei Zugabe von 80 µg/ml Mip-HRP steigt die Absorption auf 2,4 an. An die Collagene
II und III bindet Mip-HRP erst bei Konzentrationen über 30 µg/ml. Die Bindung an zelluläres
Fibronektin, plasmatisches Fibronektin, ein 70 kDa Fragment von Fibronektin, Laminin,
Vitronektin und BSA bleibt trotz steigender Konzentrationen an zugegebenem Mip-HRP
unter einer Absorption von 0,5. Die negativen Werte kommen durch das Abziehen des
Leerwertes zustande. Anhand dieses Versuches konnte gezeigt werden, dass die Bindung von
Mip-HRP an die Collagene I bis VI konzentrationsabhängig ist. Trotz zunehmender
Konzentration an zugegebenem Mip-HRP konnte jedoch keine erhöhte Bindung an
plasmatisches Fibronektin, zelluläres Fibronektin, ein 70 kDa Fragment von Fibronektin,
Laminin, Vitronektin oder an die negative Kontrolle BSA gezeigt werden.
Die Bindung von Mip an verschiedene extrazelluläre Matrixproteine wurde durch
mikroskopische Analyse bestätigt. Für diese Versuche wurde Mip und BSA wie unter 3.22.1
beschrieben mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC markiert. Der Bindungsassay wurde wie
unter 3.22.3 beschrieben durchgeführt, wobei die extrazellulären Matrixproteine durch eine
schonende Methode auf Glasobjektträger aufgebracht wurden. Nach Inkubation der Proteine
Ergebnisse
89
mit Mip-FITC bzw. BSA-FITC und Entfernen von ungebundenem Protein, konnten die
Proben mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskopes ausgewertet werden. In Abbildung 24 ist die
Bindung von Mip-FITC an verschiedene extrazelluläre Matrixproteine dargestellt.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
Abb. 24 Fluoreszenzmikroskopische Darstellung der Bindung von Mip-FITC an verschiedene Proteine der
extrazellulären Matrix. Bindung von Mip-FITC an Collagen I (A), Collagen II (B), Collagen III (C), Collagen IV
(D), Collagen V (E), Collagen VI (F). An die Proteine plasmat. Fibronektin (G), zelluläres Fibronektin (H),
Laminin (I), Vitronektin (J) und BSA (K) ist keine spezifische Bindung nachzuweisen.
Die Versuche wurden wie unter 3.22.3 beschrieben durchgeführt. An die Collagene I–VI (A–
F) ist eine Bindung von Mip-FITC zu sehen. Bei Bindungsstudien an die anderen
extrazellulären Matrixproteine ist nur eine schwache Hintergrundfluoreszenz zu erkennen.
Um die Bindedomäne von Mip an Collagen IV zu identifizieren, wurden Bindestudien mit
dem monomeren, N-terminal verkürzten Mip(77-213) durchgeführt. In Abbildung 25 ist die
Ergebnisse
90
Bindung von monomerem Mip an Collagen IV dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die
Bindefähigkeit des monomeren Mip im Vergleich zum dimeren Mip nicht eingeschränkt ist.
Dies weist darauf hin, dass die N-terminale Domäne an der Bindung von Mip an Collagen IV
nicht beteiligt ist. In Abbildung 26 kann man die Bindung von Mip-HRP nach Hemmung der
PPIase-Aktivität durch FK506 bzw. Rapamycin sehen. Beide Inhibitoren binden an das Cterminale Ende von Mip. Somit wird die C-terminale Domäne blockiert. Es ist zu erkennen,
dass die Bindung nach Blockierung der C-terminalen Domäne deutlich vermindert ist. Als
Negativkontrolle wurde BSA-HRP verwendet.
2,5
Bindung (A450nm )
2
1,5
1
0,5
0
Mip
monomeres Mip
Abb. 25 Bindung von wildtypischen Mip-HRP und monomerem Mip-HRP an Collagen IV im ELISA. Für die
Bindung wurde Collagen IV in den Vertiefungen einer 96-Loch-Platte mit 80 µg Mip/ml inkubiert. Die Versuche
wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von
Fehlerbalken dargestellt.
Bindung (A450nm)
2,5
Mip-HRP
2
Mip-HRP + FK506
1,5
Mip-HRP +
Rapamycin
BSA-HRP
1
0,5
0
0,6
1,25
2,5
5
10
20
40
Konzentration [µg/ml]
Abb. 26 Darstellung der Bindung von Mip-HRP und Mip-HRP nach Hemmung der PPIase-Aktivität durch
100 µg FK506 bzw. Rapamycin an Collagen IV im ELISA Test. Zur Negativkontrolle wurde die Bindung von
BSA-HRP an Collagen IV durchgeführt. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt.
Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Ergebnisse
4.4.3
91
Kompetitionsassay
Um zu untersuchen, ob die Bindung von Mip-HRP bzw. von Mip-FITC an Collagen IV durch
die Zugabe von unmarkiertem Mip vermindert werden kann, wurden die Bindungsassays wie
folgt durchgeführt. Für die ELISA-Versuche wurden die 96-Loch-Platten mit 3 µg Collagen
IV beschichtet. Pro Napf wurden 8 µg Mip-HRP eingesetzt. Durch Zugabe aufsteigender
Konzentrationen von gereinigtem, unmarkiertem Mip wurde die Bindungsfähigkeit von MipHRP getestet. Als Positivkontrolle wurden in einen Napf nur 8 µg Mip-HRP und zur
Negativkontrolle 8 µg unmarkiertes Mip zugegeben. Zusätzlich diente die Zugabe von Puffer
als Negativkontrolle. Die Versuche wurden wie unter 3.22 beschrieben durchgeführt. Nach
Zugabe von Peroxidasesubstrat wurde die quantitative Bindung anhand der Farbintensität am
Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die Bindung von Mip-HRP ist in
Abbildung 27 gezeigt.
Bindung (A450nm )
2
1,5
1
0,5
0
kein Mip
2µg Mip
4µg Mip
8µg Mip
kein MipHRP
Neg. Ko.
Abb. 27 Bindung von Mip-HRP an gereinigtes Collagen IV in einer 96-Loch-Platte. Die ersten vier Balken
stellen die Bindung von 8 µg Mip-HRP dar unter Zugabe der angegebenen Konzentrationen von unmarkiertem
Mip. Als Negativkontrolle wurde nur unmarkiertes Mip bzw. Puffer zugegeben. Die Versuche wurden dreimal
unabhängig voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken
dargestellt.
In Abbildung 27 ist die Bindung von Mip-HRP an Collagen IV unter Zugabe aufsteigender
Konzentrationen von unmarkiertem Mip dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Bindung von
Mip-HRP an Collagen IV nach Zugabe aufsteigender Konzentrationen an unmarkiertem Mip
abnimmt. In den Negativkontrollen ist keine Bindung nachweisbar.
Zur Kontrolle wurden Kompetitionsversuche mit Mip-FITC wie unter 3.22.3 beschrieben
durchgeführt. Hierzu wurden Glasobjektträger durch eine schonende Methode mit Collagen
Ergebnisse
92
IV beschichtet. Nach Inkubation von Collagen IV mit 8 µg Mip-FITC und gleicher Menge an
unmarkiertem Mip, konnte die Abnahme der Fluoreszenz mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskopes beobachtet werden. Als Negativkontrolle wurde Collagen IV mit unmarkiertem
Mip inkubiert. Abbildung 28 stellt die Abnahme der Fluoreszenz dar.
A
B
C
Abb. 28 Bindung von Mip-FITC an Collagen IV unter Zugabe gesteigerter Mengen unmarkiertem Mip. Bild A
zeigt die Bindung von 8 µg Mip-FITC an Collagen-beschichtete Objektträger. In Bild B ist die Bindung von
8 µg Mip-HRP unter Zugabe von 8 µg unmarkiertem Mip dargestellt. Bild C zeigt als Negativkontrolle die
Bindung von 8 µg unmarkiertem Mip an Collagen IV ohne Zugabe von FITC-markiertem Mip.
4.4.3.1
Entfernung der Zuckerreste von Collagen IV
Collagen IV ist das Hauptglycoprotein von Basalmembranen. In folgenden Versuchen wurde
untersucht, ob es bei der Bindung von Mip an Collagen IV um eine Protein-Protein Bindung
handelt, oder ob Mip an die Zuckerreste von Collagen IV bindet. Hierzu wurde Collagen IV
wie in 3.22.4 beschrieben an die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte gebunden. Die
Zuckerreste des Collagen IV wurden wie in 3.22.5 beschrieben durch eine 16 stündige
Behandlung mit 10 mM Periodat oxidiert bzw. durch Zugabe von 2,5 mU/ml
Endoglycosidase H entfernt. Milde Behandlung mit Periodat führt zur Oxidation von
Neuraminyl- und Galactosylresten. In folgender Abbildung ist die Bindung von Mip-HRP an
Collagen IV, mit Periodat behandeltes Collagen IV, mit Endoglycosidase H behandeltes
Collagen IV und BSA dargestellt.
Ergebnisse
93
Bindung (A 450nm)
2,5
Collagen IV
2
Collagen IV + Periodate
1,5
Collagen IV + Endoglycosidase H
1
0,5
BSA
0
5
10
20
40
80
Konzentration Mip-HRP
[µg/ml]
Abb. 29 Bindung von Mip-HRP an immobilisiertes Collagen IV, mit Periodat bzw. Endoglycosidase H
behandeltes Collagen IV und an die Negativkontrolle BSA. Die Bindung an Collagen IV und an deglycosyliertes
Collagen IV nimmt mit steigender Konzentration von Mip zu, während die Bindung an die Negativkontrolle
BSA trotz steigender Mip-HRP Konzentration gleich bleibt. Die Versuche wurden dreimal unabhängig
voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Wie in Abbildung 29 zu erkennen ist, bindet Mip-HRP an immobilisiertes Collagen IV. Nach
Entfernen der Zuckerreste des Glycoproteins Collagen IV durch milde Behandlung mit
Periodat bzw. Endoglycosidase H ist die Bindung von Mip-HRP an Collagen IV nicht
beeinträchtigt. Die Bindung ist konzentrationsabhängig, da mit steigender Konzentration an
zugegebenem Mip-HRP die Absorption und somit die Bindung an Collagen IV zunimmt. In
der Negativkontrolle BSA ist keine Bindung von Mip-HRP detektierbar. Da die Bindung von
Mip-HRP an Collagen IV nach Entfernen der Kohlenhydratreste nicht beeinträchtigt ist,
handelt es sich um eine Protein-Protein Bindung.
4.4.4
Transwell-Experimente
Transwell-Versuche dienen dazu, um zu unteruchen, ob Bakterien in der Lage sind, durch
einen dichten Zellverband zu penetrieren. In diesen Versuchen soll die Penetration der
Legionellen durch die Lungenepithelbarriere gezeigt werden. Hierzu wurden Filterchen mit
bakteriendurchlässigen 3 µm großen Poren in die Vertiefungen einer 24-Loch-Schale gehängt.
Die Filter wurden mit Lungenepithelzellen NCI-H292 beimpft und bei 37°C und 5% CO2
inkubiert, bis ein dichter Zellverband gewachsen ist. Folgende rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen die Filter ohne Zellen (Bild A), mit einem dichten Zellverband
aus Lungenepithelzellen NCI-H292 auf der Unterseite (Bild B) und mit Zellen und
Ergebnisse
94
Legionellen auf der Oberseite des Filters (Bild C). Die Zellen sind in der Lage aufgrund von
Pseudopodien durch die Poren zu kriechen und sich auf der Unterseite des Filters auszubreiten
und dort ebenfalls einen Monolayer zu bilden.
A
B
C
Abb. 30 Elektronenmikroskopische Aufnahmen der Filtereinsätze im Transwellsystem. Das erste Bild zeigt die
3 µm großen Poren des Filters. Auf Bild B ist die Unterseite zu sehen, an der die Lungenepithelzellen einen
dichten Zellverband gebildet haben. Bild C zeigt die Oberseite des Filters mit Zellen und Bakterien. Die
jeweilige Größe des Markers ist unten an jedem Bild angegeben.
4.4.4.1
Transwell-Versuche mit Legionella pneumophila Mip-Varianten
Um zu testen, ob das Mip-Protein aus L. pneumophila für die Penetration der Legionellen
durch Lungenepithelzellen verantwortlich ist, wurden der mip-positive Wildtyp Stamm
L. pneumophila PhilI JR32, die mip-negative Mutante L. p. PhilI JR32-2, die mit mip
transformierte Komplementante L. p. PhilI JR32-2.1, die PPIase-defizienten Stämme L. p.
PhilI JR32-2.2 (2% PPIase) und L. p. PhilI JR32-2.3 (6,2% PPIase) sowie der monomeres
Mip-exprimierende Stamm L. p. PhilI JR32-2.4 für die Versuche verwendet. Vor Zugabe der
Bakterien wurde im Transwellsystem das Medium durch FCS-freies Medium ausgetauscht
um eventuelle Wechselwirkungen mit Serumbestandteilen zu verhindern. Nach 5 h Inkubation
der Bakterien auf dem Filter, wurden die Filter entfernt und der untere Teil des TranswellSystems in geeigneten Verdünnungen ausplattiert. In Abb. 31 ist die Menge der Bakterien
angegeben, die in der Lage ist, nach 5 h durch eine dichte Barriere aus Lungenepithelzellen
durchzutreten.
Ergebnisse
95
8000
7000
CFU/ml
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
JR32
JR32-2
JR32-2.1
JR32-2.2
JR32-2.3
JR32-2.4
Abb. 31 Penetration der Mip-Varianten von L. pneumophila durch eine dichte Barriere aus Lungenepithelzellen
NCI-H292 5 h nach Zugabe der Bakterien. Die Versuche wurden wie unter 3.23 beschrieben durchgeführt.
Wildtypisches Mip-exprimierende Legionellen (L. pneumophila PhilI JR32 und JR32-2.1) sowie monomeres
Mip-exprimierende Legionellen (L. pneumophila PhilI JR32-2.4) sind in der Lage einen Lungenepithelzellmonolayer zu durchdringen. Die mip-negative Mutante L. pneumophila PhilI JR32-2 kann den Monolayer
nicht durchdringen. Die Penetrationsrate der Isomerase-defizienten Legionellen (L. pneumophila PhilI JR32-2.2
und JR32-2.3) ist vermindert. Die Versuche wurden fünfmal unabhängig voneinander durchgeführt. Die
resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
In Abbildung 31 ist die Penetrationsrate der verschiedenen L. pneumophila PhilI JR32 MipVarianten dargestellt. Nach einer Inkubation der Bakterien von 5 h auf dem Zellmonolayer
waren im Mittel 5200 L. pneumophila PhilI JR32 in der Lage die Barriere zu durchbrechen.
Die mit wildtypischem mip komplementierte Mutante JR32-2.1 und die monomeres Mipexprimierende Variante JR32-2.4 waren ebenfalls in der Lage die Zellbarriere auf
wildtypischem Niveau zu penetrieren. Im Gegensatz dazu konnte die mip-negative Mutante
die Barriere aus Zellen mit extrazellulärer Matrix nur mit einer Zellzahl von 45 Bakterien/ml
durchbrechen. Ebenso war die Penetration der PPIase-defizienten Varianten auf eine
Bakterienzahl von 1300 Bakterien/ml (JR32-2.2) bzw. 3000 Bakterien/ml (JR32-2.3)
reduziert.
Um auszuschließen, dass es sich bei den Ergebnissen um spezifische Phänomene des
Stammes L. pneumophila PhilI handelt, wurde der gleiche Transwell-Versuch mit den
Stämmen L. pneumophila Corby und L. pneumophila Wadsworth durchgeführt. In Abb. 32
sind die Penetrationsraten des Wildtyps, der mip-negativen Mutanten und der mit
wildtypischem mip komplementierten Mutanten der Stämme L. pneumophila PhilI JR32,
Corby und Wadsworth aufgezeigt.
Ergebnisse
96
CFU/ml
10000
1000
100
W
M
C
pE
-1
(
C
or
by
10
W
3)
ad
sw
or
W
ad th N
sw
U
W
20
ad orth
1
sw
N
U
or
20
th
3
N
U
20
3.
1
-1
y
or
by
or
b
C
Ph
i
Ph
ilI
JR
32
lI
JR
Ph
32
ilI
JR -2
32
-2
.1
10
Abb. 32 Vergleich der Penetrationsraten der Stämme L. pneumophila PhilI JR32, Corby und Wadsworth. Es
wurde jeweils der Wildtyp (PhilI JR32, Corby, Wadsworth NU 201), die mip-negative Mutante (PhilI JR32-2,
Corby-1, Wadsworth NU 203) sowie die mit wildtypischem mip komplementierte Mutante (PhilI JR32-2.1,
Corby-1(pEWM 103), Wadsworth NU 203.1) getestet. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander
durchgeführt. Die daraus resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Wie aus Abbildung 32 zu entnehmen, sind die Penetrationsraten der drei Stämme
vergleichbar. Die Durchgängigkeit der wildtypischen Stämme L. pneumophila PhilI JR32,
Corby und Wadsworth NU 201 lag zwischen 5200 und 6600 Bakterien/ml. Von den mipnegativen Mutanten L. pneumophila PhilI JR32-2, Corby-1 und Wadsworth NU 203 gingen
40 bis 57 Bakterien/ml durch die Barriere aus Lungenepithelzellen und ihrer Matrix. Die
Durchgangsrate der mit wildtypischem mip komplementierten Mutanten L. pneumophila PhilI
JR32-2.1, Corby-1(pEWM 103) und Wadsworth NU 203.1 lag im wildtypischen Bereich von
4400 bis 5700 Bakterien/ml.
4.4.4.2
Zugabe von rekombinantem Mip
Mip-negative Mutanten von L. pneumophila sind nicht in der Lage, durch eine Barriere aus
Lungenepithelzellen NCI-H292 zu penetrieren. Im Folgenden wurde untersucht, ob der Effekt
durch Zugabe von rekombinantem Mip aufgehoben werden kann. Es wurden TranswellVersuche wie oben beschrieben durchgeführt. Die mip-negativen Mutanten L. pneumophila
PhilI JR32-2 wurden mit aufsteigenden Konzentrationen von rekombinantem Mip auf das
Transwell-Filterchen pipettiert. Nach 5 h Koinkubation wurde der untere Teil auf BCYE-Agar
ausplattiert. In Abbildung 33 ist die Penetrationsrate von JR32-2 durch eine Lungenepithelzellbarriere nach Zugabe von rekombinantem Mip dargestellt.
Ergebnisse
97
100000
log CFU/ml
10000
1000
100
10
recombinantes Mip/ml
Abb. 33 Darstellung der Penetrationsraten von L. pneumophila PhilI JR32-2 durch eine Barriere aus
Lungenepithelzellen im Transwell-System nach Zugabe aufsteigender Konzentrationen von rekombinantem
Mip. Bei erhöhter Zugabe von rekombinantem Mip sind mehr Bakterien in der Lage durch die Barriere zu
gelangen Die Sättigung liegt bei etwa 240 µg/ml. Die Mittelwerte resultieren aus vier unabhängig voneinander
durchgeführten Versuchen. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Wie in Abbildung 33 zu erkennen ist, waren die mip-Mutanten nach Zugabe von
rekombinantem Mip in der Lage eine Barriere aus Lungenepithelzellen im Transwell-System
zu penetrieren. Die Durchgangsrate der Bakterien ist von der Konzentration des zugegebenen
Proteins abhängig, wobei ein Minimum an 1 µg zugegeben werden musste, um einen Effekt
zu sehen. Bei Zugabe von 240 µg gingen ca. 1,7 x 104 Legionellen durch, wobei hier eine
Sättigung erreicht wurde.
4.4.4.3
Hemmung der PPIase-Aktivität
In folgenden Versuchen wurde untersucht, ob die Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase
Aktivität (PPIase) von Mip während der Penetration der Bakterien durch Epithelzellen eine
Rolle spielt. Die Versuche wurden wie unter 3.23 beschrieben durchgeführt. Hierzu wurde die
enzymatische Aktivität von Mip durch die Vorinkubation der wildtypischen Bakterien mit
Rapamycin und FK506 gehemmt. Nach Zugabe der vorinkubierten Bakterien auf den Filter
und 5 h Koinkubation, wurde der untere Teil des Transwell-Systems auf BCYE-Agar
ausplattiert. In Abbildung 34 ist die Durchgangsrate von L. pneumophila PhilI JR32 ohne
Hemmung und mit Hemmung der PPIase-Aktivität durch FK506 bzw. Rapamycin dargestellt.
Ergebnisse
98
logCFU/ml
10000
1000
100
10
JR32
JR32 + FK506
JR32 + Rapamycin
Abb. 34 Transwell-Versuch mit L. pneumophila PhilI JR32 ohne Hemmung und mit Hemmung der PPIaseAktivität durch FK506 bzw. Rapamycin. Nach Hemmung der enzymatischen Aktivität gehen weniger Bakterien
durch den Monolayer. Die Versuche wurden wie unter 3.23 beschrieben fünfmal unabhängig voneinander
durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
In Abbildung 34 ist zu erkennen, dass die Penetrationsrate von L. pneumophila PhilI JR32
nach Zugabe der PPIase-Hemmer FK506 und Rapamycin um etwa 2 log-Stufen abnimmt.
Nach 5 h Koinkubationszeit auf den Lungenepithelzellen im Filter gehen etwa 6,6 x 103
wildtypische Legionellen durch die Barriere. Wird die PPIase-Aktivität jedoch durch 100 µg
FK506 gehemmt, so sind nur noch etwa 80 Legionellen/ml in der Lage, die Barriere zu
durchbrechen. Nach Hemmung durch Rapamycin gehen nur noch etwa 50 Bakterien durch die
Lungenepithelzellbarriere.
Um zu bestätigen, dass die PPIase-Aktivität von Mip eine Rolle bei der Penetration der
Legionellen durch Lungenepithelzellen spielt, wurden Komplementationsversuche mit
rekombinantem, mutiertem Mip gemacht. Hierzu wurden die Transwell-Experimente wie
unter 3.23 beschrieben durchgeführt. Zu den mip-negativen Legionellen wurden im
Transwell-Filter je 30 µg PPIase-defizientes bzw. monomeres Mip-Protein gegeben. Das
Mip(Y185-A) besitzt noch eine PPIase-Restaktivität von 2%, wobei Mip(D142-L) eine
PPIase-Restaktivität von 6% aufweist. In Abbildung 35 sind die Penetrationsraten von
L. pneumophila PhilI JR32 und L. pneumophila PhilI JR32-2 mit und ohne Zugabe von
rekombinantem Mip-Protein dargestellt.
Ergebnisse
99
logCFU/ml
10000
1000
100
)
om
on
(M
ip
-2
JR
32
JR
32
-2
+M
ip
+M
ip
+M
-2
JR
32
er
L)
2(D
14
5(Y
18
JR
32
JR
32
-2
A)
10
Abb. 35 Darstellung der Penetrationsraten von L. pneumophila PhilI JR32 und JR32-2 durch eine Barriere aus
Lungenepithelzellen im Transwell-System. Wobei die Zugabe von Mip(Y185-A) und Mip(D142-L) den
Durchgang von JR32-2 nur leicht verbessert, gehen die Mutanten nach Komplementierung mit dem
rekombinanten monomeren Mip mit annähernd wildtypischen Niveau durch die Barriere. Die Versuche wurden
viermal unabhängig voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von
Fehlerbalken dargestellt.
Durch Komplementationsversuche im Transwell-System mit der mip-negativen Mutante
JR32-2 und rekombinanten mutierten Mip-Proteinvarianten konnte gezeigt werden, dass
durch die Zugabe von monomerem Mip die fehlende mip-Expression der Mutante annähernd
kompensiert werden kann. Nach 5 h Inkubation der Bakterien auf dem Filter gehen im Mittel
5300 wildtypische L. pneumophila PhilI JR32 durch die Barriere aus Lungenepithelzellen und
extrazellulärer Matrix. Der Durchgang der Mutante JR32-2 liegt bei 45 Bakterien/ml. Bei
Zugabe von 30 µg/ml von Mip(Y185-A) bzw. Mip(D145-L) wird die Penetrationsrate der
Mutante JR32-2 auf 155 Bakterien/ml gesteigert. Dies kann auf die geringe PPIase-Aktivität
der gereinigten Proteinvarianten zurückgeführt werden. Bei Zugabe von monomeren
rekombinanten Mip mit voller PPIase-Aktivität sind mit 1500 Bakterien/ml wesentlich mehr
Mutanten in der Lage die Barriere zu penetrieren.
4.4.4.4
Transwell-Versuche mit Escherichia coli
Um zu untersuchen, ob nur Legionellen mit Hilfe von Mip in der Lage sind einen
Lungenepithelzellmonolayer
zu
penetrieren,
wurden
die
Transwell-Versuche
mit
Escherichia coli durchgeführt. Hierzu wurden die Versuche wie in 3.23 beschrieben
durchgeführt. Es wurden die wildtypischen, mip-negativen E. coli HB101 mit dem Vektor
pBR322, sowie die mit dem mip-tragenden Vektor pBLL106 transformierten E. coli HB101
Ergebnisse
100
verwendet. Der Vektor pBLL106 resultiert aus dem Vektor pBR322 mit einem 4,5 kb BamH
I-Cla I mip-tragenden Fragment. Ebenso wurde getestet, ob durch Zugabe von gereinigtem
rekombinanten Mip-Protein die wildtypischen mip-negativen E. coli HB 101 in der Lage sind,
durch den Monolayer zu gelangen (Abb. 37). Durch Gewinnung von Gesamtzellproteinen aus
beiden E. coli Stämmen und Westernblotanalyse konnte gezeigt werden, dass E. coli HB101
transformiert mit dem Vektor pBLL106 in der Lage ist Mip zu exprimieren. Die Ergebnisse
des Westernblots (Abb. 36) belegen, dass E. coli HB101 transformiert mit pBLL106 im
Gegensatz zu wildtypischen E. coli HB 101 Mip exprimiert.
Mip-Monomer (25 kDa)
Abb. 36 Westernblot aus Gesamtproteinen aus E. coli hybridisiert mit Mip-AK 2D8 und sek. Ak anti-MausPeroxidase. Spur M stellt den Rainbowmarker dar. In Spur 1-4 sind Gesamtzellproteine aus E. coli HB101
pBLL106 (exprimiert Mip) aufgetragen. Spur 5 ist frei. In Spur 6 sind Gesamtzellproteine aus E. coli HB101
pBR322 (mip-negativ) aufgetragen.
Ergebnisse
101
1000000
logCFU/ml
100000
10000
1000
100
10
-
+
-
-
E. coli (Mip ) E. coli (Mip ) E. coli (Mip ) E. coli (Mip )
+ 30 µg Mip + 100 µg Mip
Abb. 37 Darstellung der Durchgangsraten von wildtypischen E. coli HB 101 und dem mip-exprimierenden
E. coli HB 101 transformiert mit pBLL 106. Nach Zugabe von rekombinantem Mip-Protein sind wildtypische
E. coli in der Lage den Lungenepithelzellmonolayer zu durchdringen. Die Versuche wurden viermal unabhängig
voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
In Abbildung 37 sind die Penetrationsraten der Stämme E. coli HB 101 (Vektorkontrolle) und
E. coli HB 101 pBLL106 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass wildtypische E. coli nicht in der
Lage sind, eine Barriere aus Lungenepithelzellen zu durchdringen. Nach Transformation mit
dem Legionella-mip-tragenden Vektor pBLL106, bzw. nach Zugabe von rekombinantem
Legionella-Mip können diese E. coli den Monolayer penetrieren. Bei Zugabe von 30 µg Mip
sind im Mittel 5600 Bakterien/ml durch den Monolayer gegangen, wobei bei Zugabe von
100 µg knapp doppelt so viele Bakterien/ml penetrieren konnten. Zusammenfassend lässt sich
sagen, dass E. coli mit Hilfe des Mip-Proteins von L. pneumophila eine Barriere aus
Lungenepithelzellen und ihrer extrazellulären Matrix penetrieren können.
4.4.4.5
Hemmung der Proteaseaktivität
Für die Degradation der extrazellulären Matrix ist die Aktivität proteolytischer Enzyme notwendig. Einige invasive Bakterien können durch tissue-type Plaminogenaktivator (tPA) das
an ihre Oberfläche gebundene Plasminogen aktivieren. Plasmin gehört zu den Serinproteasen
und ist in der Lage verschiedene Proteine der extrazellulären Matrix zu degradieren, so dass
die Bakterien in das daruntergelegene Gewebe eindringen können (Lähteenmäki et al., 2000).
In folgenden Versuchen wurde getestet, ob während der Penetration der Legionellen durch die
Barriere aus Lungenepithelzellen und extrazellulärer Matrix Proteasen eine Rolle spielen.
Ergebnisse
102
Darzu wurde die Proteaseaktivität durch Zugabe eines Proteaseinhibitorcocktails im Transwell-System gehemmt. Wie unter 3.23 beschrieben wurde eine Tablette des Complete EDTAfree Protease Inhibitor Cocktails in 20 ml Medium gelöst. Die Bakterien wurden mit diesem
inhibitorhaltigen Medium abgeschwemmt und 20 min vor Zugabe zum Transwell-System bei
37°C inkubiert. Ebenso wurde das Medium im Transwell-System durch dieses Medium ausgetauscht. Nach Zugabe der Bakterien auf den Filter und 5 h Inkubation, wurde der untere
Teil des Transwell-Systems auf BCYE-Agar ausplattiert. In folgender Abbildung ist die
Penetrationsrate von L. pneumophila PhilI JR32 ohne und mit Proteaseinhibitor dargestellt.
Zur Kontrolle der Undurchlässigkeit des Monolayers wurde die mip-negative Mutante
L. pneumophila PhilI JR32-2 ohne und mit Proteaseinhibitor getestet. Ebenso wird die Durch-
gangsrate der Mip-Varianten L. pneumophila Phil JR32-2.2, JR32-2.3 und JR32-2.4 gezeigt.
logCFU/ml
100000
10000
1000
100
hi
bi
to
r
t.i
n
hi
bi
to
r
2.
4+
Pr
o
JR
32
-
2.
3+
Pr
o
t.i
n
hi
bi
to
r
t.i
n
JR
32
-
JR
32
-
2.
2+
Pr
o
t.i
n
hi
bi
to
r
2
2+
Pr
o
JR
32
JR
32
-
JR
32
+
JR
32
Pr
ot
ea
se
in
hi
bi
to
r
10
Abb. 38 Darstellung der penetrierten Bakterien durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen NCI-H292 im
Transwell-System. Von den wildtypischen Legionellen JR32 sind 1,6 x 104 Bakterien/ml in der Lage zu
penetrieren. Nach Hemmung der Proteaseaktivität im System sind es 106 Bakterien/ml. Im Vergleich können 34
mip-negative Mutanten JR32-2 durch die Barriere. Nach Hemmung der Proteaseaktivität im Transwell-System
sind von den Stämmen JR32-2.2, JR32-2.3 und JR32-2.4 nur noch zwischen 20 und 60 Bakterien/ml in der Lage
die Barriere zu durchbrechen. Die Versuche wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die
resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Wie in Abbildung 38 zu sehen ist, sind nach Hemmung der Proteaseaktivitäten nur noch 106
wildtypische Legionellen in der Lage durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen und ihrer
extrazellulären Matrix zu gelangen. Im Vergleich gehen 1,6 x 104 wildtypische Legionellen/ml ohne Hemmung der Proteaseaktivitäten durch den Monolayer. Zur Kontrolle ist die
Durchgängigkeit der mip-negativen Mutante dargestellt. Sie beträgt ohne Proteaseinhibitor 34
Bakterien/ml und mit Proteaseinhibitor 20 Legionellen/ml. Ebenso ist die Penetrationsrate der
Mip-Varianten von L. pneumophila PhilI JR32 nach Hemmung der Proteaseaktivität auf
weniger als 60 Bakterien/ml reduziert.
Ergebnisse
103
Da der Proteaseinhibitorcocktail ein breites Spektrum an Serin- und Cysteinproteasen inhibiert, wurde in folgenden Versuchen getestet, ob es sich um eine Serin- oder Cysteinprotease
handelt, die gehemmt wird. Hierzu wurden gleiche Transwell-Versuche wie oben beschrieben
durchgeführt. Zum einen wurden die Serinproteasen durch die Zugabe von 30 µg/ml Pefabloc
SC bzw. 170 µg (1 mM) PMSF gehemmt. Pefabloc SC (AEBSF) ist 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonylfluorid. PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) ist ein irreversibler Inhibitor
von Serinproteasen wie Trypsin und Chymotrypsin sowie von Thiolproteasen wie Papain. Die
Cysteinproteasen wurden durch 10 µg/ml E-64 (N-[N-(L-3-trans-Carboxyoxiran-2-carbonyl)L-leucyl]-agmatin) blockiert. Die Mengenangaben beziehen sich auf die empfohlene Arbeitskonzentration der Firmen Roche bzw. Sigma, von denen Chemikalien bezogen wurden. Bei
Pefabloc SC musste die empfohlene Konzentration von 100 auf 30 µg/ml reduziert werden, da
bei höherer Dosierung die Bakterien abgetötet wurden. Vor Zugabe der Bakterien auf die
Transwell-Filter, wurden diese mit der angegebenen Konzentration der Proteaseinhibitoren 20
min bei 37°C vorinkubiert. Ebenso wurde das Medium im Transwell-System durch proteaseinhibitorhaltiges Medium ausgetauscht. Nach 5 h Inkubation der Bakterien auf der Zellbarriere wurde der untere Teil des Transwell-Systems auf BCYE-Agar ausplattiert. In Abbildung 39 ist die Penetrationsrate der wildtypischen L. pneumophila PhilI JR32 ohne und mit
Hemmung der Serinproteasen durch Pefabloc SC bzw. PMSF und Hemmung der Cysteinproteasen durch E-64 dargestellt.
logCFU/ml
10000
1000
100
10
JR32
JR32+Pefabloc
SC
JR32+PMSF
JR32+E-64
Abb. 39 Penetrationsraten von L. pneumophila PhilI JR32 durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen NCIH292 im Transwell-System. Nach Hemmung der Serinproteasen durch Pefabloc SC bzw. PMSF konnte die
Durchgängigkeit von JR32 von 6500 auf 90 bzw. 45 Bakterien/ml reduziert werden. Die Hemmung der
Cysteinproteasen zeigt keinen Effekt auf die Penetrationsrate der Legionellen. Die Versuche wurden viermal
unabhängig voneinander durchgeführt. Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken
dargestellt.
Ergebnisse
104
In Abbildung 39 ist die Penetrationsrate von L. pneumophila PhilI JR32 durch eine Barriere
aus Lungenepithelzellen im Transwell-System dargestellt. Nach Hemmung der Serinproteasen
durch Pefabloc SC bzw. PMSF im System ist die Durchgangsrate der Bakterien von 6500 auf
90 bzw. 50 Bakterien/ml reduziert. Der Cysteinproteasehemmer E-64 zeigt keinen Effekt auf
die Durchgängigkeit der wildtypischen Legionellen. Nach Hemmung mit E-64 konnten noch
knapp 3300 Bakterien/ml im unteren Teil des Transwell-Systems detektiert werden. Anhand
dieser Versuche konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von Serinproteasen im TranswellSystem eine Rolle bei der Penetrationsfähigkeit der Legionellen durch eine Barriere aus
Lungenepithelzellen und ihrer extrazellulären Matrix spielen.
4.4.5
Transwell-Versuche mit A549- und Calu3-Zellen
Wie in den Transwell-Versuchen mit NCI-H292 Zellen zu sehen ist, spielt die Anwesenheit
des Mip-Proteins eine entscheidende Rolle für die Penetrationsfähigkeit von L. pneumophila
durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen und ihrer extrazellulären Matrix. Ob das
Vorhandensein der extrazellulären Matrix hierbei wichtig ist, sollten Transwell-Versuche mit
Lungenepithelzellen zeigen, die keine extrazelluläre Matrix bilden. Hierzu wurden TranswellExperimente wie unter 3.23 beschrieben mit A549 bzw. Calu3-Zellen durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass sich A549-Zellen für Transwell-Versuche nicht eignen. Nach
5 Tagen der Zellen auf dem Transwell-Filter und täglichem Mediumwechsel, war es nicht
möglich eine dichte Barriere von Zellen auf dem Filter zu erhalten. Für die Versuche wurden
1 x 107 Legionellen auf den Filter pipettiert. Nach 5 h wurden geeignete Verdünnungen des
unteren Teils des Transwell-Systems auf BCYE-Agarplatten ausplattiert um die Anzahl der
Bakterien zu bestimmen, die in der Lage waren durch die Lage an A549-Zellen zu gelangen.
Da sowohl L. pneumophila PhilI JR32 WT wie auch die mip-negative Mutante in der Lage
waren annähernd komplett in den unteren Teil des Transwell-Systems zu gelangen, kann
davon ausgegangen werden, dass die Barriere an Zellen nicht dicht genug war. Aus diesem
Grund wurden gleiche Versuche wie oben beschrieben mit der Epithelzelllinie Calu3
durchgeführt. In Abbildung 40 sind die Penetrationsraten von L. pneumophila PhilI JR32 und
der mip-negativen Mutante L. pneumophila PhilI JR32-2 dargestellt.
Ergebnisse
105
logCFU/ml
100000
10000
1000
JR32
JR32-2
Abb. 40 Darstellung der penetrierten Legionellen im Transwell-System mit Calu3-Zellen. Sowohl die wildtypischen Legionellen als auch die mip-negativen Mutanten von L. pneumophila JR32 sind in der Lage eine
Barriere aus Calu3-Zellen zu penetrieren. Die Versuche wurden viermal unabhängig voneinander durchgeführt.
Die resultierende Standardabweichung ist in Form von Fehlerbalken dargestellt.
Wie in Abbildung 40 zu erkennen ist, sind 1,9 x 104 wildtypische L. pneumophila PhilI JR32
und 3,1 x 104 mip-negative L. pneumophila PhilI JR32-2 im unteren Teil des TranswellSystems nachzuweisen. Dieser Versuch mit Calu3-Zellen, die keine extrazelluläre Matrix
bilden, zeigt, dass sowohl Wildtyp als auch mip-negative Legionellen in der Lage sind, die
Barriere zu penetrieren.
4.4.6
Degradationsassay
Die Pathogenität von L. pneumophila wird unter anderem durch die Fähigkeit dieser
Bakterien verursacht, tief in das Lungengewebe einzudringen und hier Makrophagen und
Epithelzellen zu befallen. Viele invasive Bakterien sind hierzu in der Lage die extrazelluläre
Matrix und Basalmembranen zu degradieren. Die extrazelluläre Matrix besteht hauptsächlich
aus Collagenen, Proteoglykanen, Elastin und Glykoproteinen wie Laminin, Fibronektin und
Entaktin. Dieses dichte Flechtwerk zu degradieren erfordert proteolytische Aktivität der
Bakterien. Um zu untersuchen, ob L. pneumophila extrazelluläre Matrix abbauen kann,
wurden Degradationsversuche mit radioaktivmarkierter Matrix durchgeführt. Hierzu wurden
Lungenepithelzellen NCI-H292 wie unter 3.26 beschrieben in 24-Loch-Platten kultiviert.
Durch Zugabe von L-[35S]Methionin und L-[35S]Cystein werden diese Aminosäuren in die
generierende Matrix eingebaut. Nach Erreichen eines konfluenten Monolayers, werden die
Lungenepithelzellen wie unter 3.21 beschrieben zerstört und die extrazelluläre Matrix
gewonnen. Nach Zugabe der Bakterien wird nach entsprechender Zeit ein Aliquot aus der
Ergebnisse
106
Vertiefung der 24-Loch-Platte abgenommen und in Scintillationsflüssigkeit pipettiert. Die
freigewordene Radioaktivität wurde am Scintillationsmessgerät bestimmt. In folgender
Abbildung ist der Abbau der extrazellulären Matrix im Laufe der Inkubationszeit mit
L. pneumophila PhilI JR32 mit und ohne Pefabloc SC, JR32-2 ohne und mit 30 µg Mip und
100 µg Mip alleine angegeben. Als Positivkontrolle dienten 2 Units Proteinase K und als
Negativkontrolle Puffer.
2500
JR32
2000
CPM
JR32 + Pefabloc SC
JR32-2
1500
JR32-2 + 30 µg Mip
1000
100 µg Mip
Proteinase K
500
Buffer
0
0
5
10
20
40
60
120
Zeit [min]
Abb. 41 Degradation der extazellulären Matrix von Lungenepithelzellen NCI-H292. Darstellung der steigenden
counts per minutes (cpm) im Laufe der Inkubationszeit mit Proteinase K, L. pneumophila PhilI JR32 und JR32-2
mit 30 µg Mip. Es ist keine freiwerdende Radioaktivität messbar bei Inkubation mit L. pneumophila PhilI JR32
+ Pefabloc SC, JR32-2, 100 µg Mip und der Negativkontrolle Puffer.
In Abbildung 41 ist die zeitabhängige Degradation der extrazellulären Matrix dargestellt. Mit
Hilfe des Scintillationsmessgerätes wurde die freiwerdende Radioaktivität bestimmt. Gut zu
erkennen ist die steigende Degradation der Matrix innerhalb 120 Minuten nach Inkubation mit
der Positivkontrolle Proteinase K. Ebenfalls sind wildtypische L. pneumophila PhilI JR32 und
mip-negative JR32-2 nach Zugabe von 30 µg rekombinantem Mip in der Lage die extra-
zelluläre Matrix zu zerstören. Nach Hemmung der Serinproteaseaktivitäten durch Zugabe von
Pefabloc SC, können L. pneumophila PhilI JR32 die Matrix nicht mehr degradieren. Ebenso
scheint das Mip-Protein für die Degradation wichtig zu sein, da mip-negative Legionellen
JR32-2 nicht mehr in der Lage sind, die Matrix innerhalb von 2 h zu zerstören. Bei Zugabe
von 100 µg rekombinantem Mip ist keine freiwerdende Radioaktivität zu messen, was darauf
hinweist, dass Mip alleine keine Proteaseaktivität besitzt. Degradationsassays konnten zeigen,
dass wildtypische Legionellen in Anwesenheit von Serinproteaseaktivität die extrazelluläre
Matrix von Lungenepithelzellen degradieren können.
Ergebnisse
4.4.7
107
Zusammenfassung
Anhand von Bindestudien konnte gezeigt werden, dass das Mip-Protein aus L. pneumophila
an die extrazelluläre Matrix der Lungenepithelzelllinie NCI-H292 bindet. Eine konzentrationsabhängige Bindung konnte an die Collagene und vor allem an das Collagen IV
nachgewiesen
werden.
Eine
Behandlung
des
Glykoproteins
Collagen
IV
durch
Endoglykosidase H bzw. Periodat beeinflusst die Bindung von Mip nicht. Dies führt zu der
Annahme, dass es sich um eine Protein-Protein Bindung handelt. Kompetitionsassays mit
markiertem und unmarkiertem Mip haben ebenfalls gezeigt, dass es sich um eine spezifische
Bindung handelt. Transwell-Versuche mit extrazellulärer Matrix exprimierenden Lungenepithelzellen NCI-H292 zeigen, dass sowohl das Mip-Protein von L. pneumophila, als auch
das Vorhandensein einer Serinproteaseaktivität für die Penetration von Legionellen und
E. colis durch eine Barriere dieser Zellen eine Rolle spielen. Für die Penetration ist nicht die
volle PPIase-Aktivität notwendig. Bei einer Restaktivität von nur 2% ist jedoch die
Penetrationsfähigkeit deutlich niedriger als bei einer PPIase-Aktivität von 6%. Ebenso konnte
nach Hemmung der PPIase-Aktivität durch FK506 bzw. Rapamycin die Penetrationsfähigkeit
stark reduziert werden. Nach Zugabe von rekombinantem wildtypischen Mip bzw.
monomerem Mip waren die mip-negativen Mutanten JR32-2 in der Lage auf annähernd
wildtypischem Niveau durch die Barriere aus Lungenepithelzellen und ihrer extrazellulären
Matrix zu gelangen. Mit Hilfe von Proteaseinhibitoren konnte gezeigt werden, dass
Serinproteasen für die Durchdringung der Legionellen durch die Barriere notwendig sind.
Degradationsassays mit S35-markierter extrazellulärer Matrix zeigten, dass Legionellen in
Anwesenheit von Mip und einer Serinproteaseaktivität in der Lage sind, die extrazelluläre
Matrix von Lungenepithelzellen zu degradieren.
Diskussion
108
5 Diskussion
5.1
5.1.1
Dictyostelium discoideum als Modellsystem
Dictyostelium discoideum als Modellsystem zur Untersuchung von WirtPathogen-Interaktionen
In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass sich die Amöbe Dictyostelium discoideum
zur Untersuchung von Wirt-Pathogen Interaktionen eignet. Hägele et al. und Solomon et al.
konnten zeigen, dass verschiedene Legionella-Spezies in der Lage sind, sich in D. discoideum
zu vermehren und die Infektion nach denselben Mechanismen abläuft wie sie z. B. für
Acanthamoeba castellanii bekannt sind (Hägele et al., 2000; Solomon et al., 2000). Der
Vorteil dieses Dictyostelium-Modellsystems liegt in der einfachen Handhabung und Haltung
der Dictyostelien im Labor. Des Weiteren ist die Amöbe haploid und somit genetisch leichter
zugänglich. Es gibt ein cDNA Projekt und ein Genomprojekt, das sich nach Abschluss der
Sequenzierung nun in der Analysephase befindet. Dictyostelium eignet sich nicht nur zur
Untersuchung von Legionella, sondern auch als Infektionsmodell für andere Bakterien. Neben
Legionellen können sich auch Mycobacterium avium und M. marinum in D. discoideum
vermehren (Skriwan et al., 2002; Solomon et al., 2003). In dieser Arbeit konnte gezeigt
werden, dass sich verschiedene obligat intrazelluläre Bakterien in Dictyostelien vermehren
können. Hierzu wurden die Endozytobionten TUME1, UWE25 und UWC6 aus den
Originalwirten A. castellanii isoliert und für die Infektion in Zellkulturflaschen mit
D. discoideum pipettiert. Da die Endozytobionten ohne Wirtszelle nicht kultivierbar sind,
wurde das Vorhandensein der intrazellulären Bakterien mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung
sichtbar gemacht. Mit Hilfe von spezifischen Cy3-markierten 16S-rRNA-Sonden wurde die
intrazelluläre Zunahme der Bakterien über 48 h beobachtet. Zum Zeitpunkt 48 h nach
Inokulation konnte eine erhöhte Anzahl der drei Endozytobionten in D. discoideum
festgestellt werden. Fritsche et al. haben gezeigt, dass ca. 22% aller Acanthamöbenisolate mit
nicht kultivierbaren, obligat intrazellulären Endozytobionten infiziert sind. Diese gehören
hauptsächlich zu den Chlamydiales und Rickettsiales. TUME1 ist ein Neochlamydienverwandter Endozytobiont, UWE25 ist ein Parachlamydien-verwandter Endozytobiont und
UWC6 gehört zu den β-Proteobakterien. Anhand von elektronenmikroskopischen Aufnahmen
konnte gezeigt werden, dass die Stämme TUME1 und UWE25 im Zytoplasma des Wirtes von
membranösen Strukturen eng umschlossen sind. UWC6 konnte sowohl in Vakuolen als auch
Diskussion
109
frei im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Lokalisierung der Endozytobionten entspricht
ihrer Lokalisierung in ihren natürlichen Wirten (Horn et al., 2002; Fritsche et al., 2000). Im
Gegensatz zu TUME1 und UWC6 ist UWE25 in der Lage Dictyostelien zu lysieren. Dies
konnte unter dem Lichtmikroskop 48 h nach Infektion durch einen großen Teil abgelöster
Wirtszellen und das Vorhandensein vieler Zellfragmente beobachtet werden. Dieses
Phänomen zeigt, dass UWE25 in D. discoideum kein Endosymbiont ist, sondern ein Parasit.
Die Zerstörung der Wirtszelle kann durch verschiedene Faktoren zustande kommen. Zum
einen kann es sich um einen rein physikalischen Vorgang handeln, bei dem die Wirtszelle
aufgrund der starken Vermehrung der Bakterien platzt. In anderen Wirtszellen als
Dictyostelium kann die Zerstörung auch durch Apoptose hervorgerufen werden. Des Weiteren
ist es auch möglich, dass das Bakterium die Zytolyse durch Porenbildung initiiert. Dies ist ein
bekannter Vorgang während der Infektion von Makrophagen und Epithelzellen mit
L. pneumophila (Alli et al., 2000).
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich D. discoideum nicht zur Untersuchung der
intrazellulären Interaktion von Wirt mit dem Bakterium Pseudomonas aeruginosa eignet.
Cosson et al. haben jedoch festgestellt, dass man Dictyostelium für Studien zur interzellulären
Interaktion von Wirt und Bakterium verwenden kann (Cosson et al., 2002). Pseudomonas
aeruginosa wird hauptsächlich im Boden und im Wasser gefunden. Es ist bekannt, dass dieser
Keim ganz verschiedene Wirte wie Pflanzen, Insekten, Acanthamöben und Caenorhabditis
elegans infizieren kann (Michel et al., 1995; Tan et al., 1999). Im Menschen verursacht er
häufig nosokomiale Infektionen sowie schwere Pneumonie und Bakteriämie. Als
opportunistischer Keim besiedelt dieses Bakterium häufig die Lungen von Patienten mit
Zystischer Fibrose und verursacht dort erhebliche Lungenschäden. Das Vorhandensein vieler
Stämme mit multipler Antibiotikaresistenz stellt ebenso erhöhten Handlungsbedarf in der
Pseudomonadenforschung dar. Für Infektionsexperimente wurden in Zellkulturflaschen
Dictyostelien mit Pseudomonaden infiziert. Da sich die Bakterien auch extrazellulär
vermehren
können,
war
während
der
ganzen
Infektionsdauer
eine
geringe
Gentamicinkonzentration vorhanden. Nach 3 h, 17 h und 24 h wurden Aliquots aus der
Infektionsflasche entnommen, mit Puffer gewaschen um das Antibiotikum zu entfernen und
in geeigneten Verdünnungen auf LB-Agarplatten ausplattiert. Zum Zeitpunkt 0´ h wurden nur
0,4% der Pseudomonaden von den Dictyostelien aufgenommen. Die intrazelluläre Anzahl
verminderte sich innerhalb 17 h nach Aufnahme, wobei nach 24 h annähernd keine
Pseudomonaden mehr intrazellulär detektiert werden konnten. Zur Kontrolle der
Infektionsexperimente wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen von pseudomonaden-
Diskussion
110
infizierten Dictyostelien gemacht. Bereits 3 h nach Infektion konnten Pseudomonaden
identifiziert werden, die von ihrer Wirtszelle verdaut werden. Cosson et al. haben ebenso die
Interaktion von Pseudomonaden mit D. discoideum untersucht. Sie konnten zeigen, dass
D. discoideum für ihre Fragestellung ein geeignetes Wirtszellsystem ist, um die Pathogenität
von P. aeruginosa zu untersuchen. Bei ihren Untersuchungen wurden Dictyostelien
zusammen mit Pseudomonaden auf einen Rasen von Klebsiella pneumoniae ausgestrichen.
Das Vorhandensein von P. aeruginosa hemmt das Wachstum von D. discoideum und somit
die Plaquebildung auf dem Klebsiella-Rasen. Ebenso konnten Dictyostelien auch nicht auf
einem Pseudomonadenrasen wachsen. Dies zeigt, dass P. aeruginosa kein Futterbakterium für
D. discoideum ist. Pseudomonaden werden von Dictyostelien bis zu zehnmal schlechter
aufgenommen als Klebsiellen (Pukatzki et al., 2002). Die Versuche von Cosson et al. zielten
darauf hinaus, zu testen, inwieweit P. aeruginosa das Wachstum von D. discoideum
inhibieren kann. Somit stellten sie auch fest, dass selbst der Kulturüberstand der
Pseudomonaden ausreicht, um das Wachstum der Dictyostelien zu inhibieren und sie zu
lysieren. Beteiligt an der Lyse scheinen hier die las und rhl Signalwege zu sein, die zur
Expression verschiedener Virulenzgene wie Proteasen, Rhamnolipiden, Pyocyanin und
Exotoxin A führen (Cosson et al., 2002). Somit scheint das Dictyostelienmodell geeignet zu
sein, um die extrazelluläre Pathogenität von Pseudomonas zu untersuchen, jedoch nicht die
intrazelluläre.
5.1.2
5.1.2.1
Genexpression von Dictyostelium discoideum nach Infektion mit Legionella
Genexpression 24 h nach Infektion mit Legionella pneumophila
In Zusammenarbeit mit Patrick Farbrother von der Universität Köln wurde die Genexpression
von Dictyostelium discoideum während der Infektion mit Legionellen mit Hilfe eines DNAMicroarrays untersucht. Auf diesem Microarray befinden sich 450 Sonden von bereits
publizierten Genen, 5423 Sonden cDNAs des japanischen cDNA Projekts sowie 33
Kontrollen. Jede Sonde wird zweimal auf das Array gespottet, die Kontrollen sogar bis zu
sechsmal. Dies ergibt eine Anzahl von 14620 Punkten insgesamt auf dem Array. Die
Nachweisgrenze des Microarray-Systems liegt bei etwa 5 pg mRNA. Die RNA-Isolierung
wurde nach dem RNeasy Midi Protokoll zur Isolierung zytoplasmatischer RNA durchgeführt.
Die Isolierung erfolgte pro Ansatz aus 1,5 x 107 infizierten bzw. nicht infizierten
Dictyostelien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion. Für die Infektion wurden die
Diskussion
111
Bakterien mit einer MOI von 10 eingesetzt. Die mRNAs wurden revers transkribiert und mit
den Farbstoffen Cy3 oder Cy5 markiert. Nach Hybridisierung wurden die Microarrays mit
ScanArray Express gescannt und anschließend mit dem Programm R normalisiert. Für die
Identifikation differentiell exprimierter Gene eines Experiments wurde das Programm
Significance Analysis of Microarrays (SAM) verwendet. Sequenzvergleiche der cDNASequenzen mit bekannten Proteinsequenzen wurden mit dem Programm BLAST des NCBI
oder des EBI durchgeführt (Farbrother, 2004). Um die Fehler der Microarrays möglichst
gering zu halten, wurden die Messungen der Genexpression mit mehreren Microarrays
wiederholt. Ebenso wurden die Farbmarkierungen Cy3 und Cy5 von Experiment- und
Kontroll-cDNA vertauscht. Somit wurde ein möglicher genspezifischer Effekt der Farbstoffe
minimiert. Die größten Schwankungen wurden jedoch durch die wiederholte Messung von
unabhängig isoliertem biologischen Material ausgeglichen. Ebenso war es sinnvoll einen
Schwellenwert von mehr als 1,5 für den Faktor der Genregulation einzuführen, da die
Genexpressionen erst dann reproduzierbar waren und mit quantitativer PCR überprüft werden
konnten.
In den ersten Versuchen wurde die Genexpression von legionelleninfizierten und uninfizierten
Dictyostelien 24 h nach Infektion verglichen. Hierbei wurden 1218 Gene als differentiell
exprimiert identifiziert. Nach Erhöhung des Schwellenwertes für Induktion und Repression
auf 1,5, blieben 152 induzierte und 117 reprimierte Gene übrig. Es wurden zahlreiche Gene
gefunden, deren Funktion nicht zuzuordnen war. Es konnten jedoch auch einige bekannte
Gene identifiziert werden, bzw. Gene, denen man eine Funktion zuteilen konnte. Zu den
bekannten Genen, die während der Infektion induziert werden, gehört das rtoA-Gen. RtoA ist
ein 39,8 kDa großes Protein, das für die Fusion von Endozytose-Vesikeln wichtig ist. In
Mutanten ist die Fusion von Endo- und Exozytose-Vesikeln verringert (Brazill et al., 2000).
Da L. pneumophila in D. discoideum die Fusion des Phagosoms mit Endosomen und
Lysosomen verhindert, kann es sein, dass die Wirtszelle darauf mit gesteigerter Expression
von rtoA reagiert. Des Weiteren wird die Expression von manA induziert. Die Induktion der
manA-Expression führt zu einer Erhöhung der lysosomalen α-Mannosidase. Diese wiederum
spaltet α-mannosidische Bindungen. Mannose ist neben Rhamnose, Glucosamin und anderen
Zuckern Bestandteil der äußeren Membran von L. pneumophila (Otten et al., 1986). Ein Teil
der Phagosomen in Dictyostelien verschmelzen mit Lysosomen, was zu einem Verdau der
darin befindlichen Legionellen führen kann (Hägele et al., 2000). Dies könnte zu einem
vermehrtes Vorkommen von Mannose in infizierten Dictyostelien führen. Ebenso konnte ein
Gen gefunden werden, das große Ähnlichkeiten zum Discoidin I von D. discoideum zeigt.
Diskussion
112
Discoidin I ist ein Lectin, das an Lipopolysaccharide der äußeren Mebran von Gramnegativen Bakterien wie K. aerogenes und E. coli bindet (Breuer & Siu, 1981). Ob Discoidin I
oder das Genprodukt der Sonde SSL850 auch an Lipopolysaccharide von Legionellen bindet,
ist nicht bewiesen. Die Sonde SSK605 zeigt Ähnlichkeit zu der Phosphoribosylaminoimidazol Carboxylase von Bifidobacterium longum. Dies ist ein Enzym der Purin-Biosynthese. Da L. pneumophila für seine intrazelluläre Vermehrung Nukleotide benötigt, könnte
eine erhöhte Expression dieses Gens erklärbar sein. Die Sonde SLD769 ist ähnlich zur
Endopeptidase ClpB von Rhodopseudomonas palustris. Sie gehört zur Familie der molekularen Chaperone Clp/Hsp100, welche Proteinaggregate auflösen, die durch Hitzeschock oder
andere Arten von Stress gebildet werden. Da eine Infektion durch L. pneumophila für die
Wirtszelle eine erhöhte Stresssituation darstellt, erscheint die Überexpression solcher
Chaperone plausibel.
Während einer Infektion von D. discoideum mit L. pneumophila werden vermehrt Gene
exprimiert, die hohe Ähnlichkeiten zu den calciumbindenden Proteinen (CBP) 4a und 4b von
D. discoideum haben. In D. discoideum sind die calciumbindenden Proteine (CBP) Calnexin
und Calreticulin an der Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts beteiligt (MüllerTaubenberger et al., 2001). Die Aufnahme und die Vermehrung von L. pneumophila in
Calnexin- und Calreticulin-Mutanten von D. discoideum ist vermindert. Mit Hilfe der
konfokalen Lasermikroskopie ist gezeigt worden, dass GFP-markiertes Calnexin und
Calreticulin während der Phagozytose von L. pneumophila im phagozytischen Cup
angereichert werden. Im Gegensatz zur Vakuole in der sich E. colis befanden, wurden beide
Proteine an der replikativen Vakuole von L. pneumophila in D. discoideum gefunden (Fajardo
et al., 2004). Die Rolle der calciumbindenden Proteine 4a und 4b während des Infektionsprozesses ist jedoch nicht bekannt.
Coat proteine (COPs) umhüllen Vesikel, die am Transport innerhalb des Golgi-Apparates
sowie am Transport zwischen Golgi und ER beteiligt sind (Lowe & Kreis, 1998). Die Sonde
VSE168 zeigt Ähnlichkeiten zum β´-COP von Bos taurus. Falls das Homolog dazu in
D. discoideum Endosomen und Lysosomen umhüllt, könnte eine Beeinflussung während des
Infektionsprozessen durch L. pneumophila denkbar sein.
Des Weiteren werden Gene induziert, deren Produkte ähnlich zur Acetyl-CoA Hydrolase,
einer Glutathion S-Transferase und zu short-chain Dehydrogenasen sind. Die Acetyl-CoA
Hydrolase ist für die Regulation des intrazellulären Acetyl-CoA Spiegels zur Fettsäure- und
Cholesterinsynthese, sowie für die Fettsäureoxidation verantwortlich. Die Glutathion STransferase wirkt als Antioxidans und neutralisiert schädigende freie Radikale im Gewebe
Diskussion
113
(Aguilera et al., 2001). Eine Erhöhung dieser Enzyme während einer Infektion der Zelle
scheint verständlich, da sich die Wirtszelle vermutlich gegen die Infektion zur Wehr setzt.
Die Stearoyl-CoA Desaturase (SCD) katalysiert die Synthese von langkettigen Fettsäuren wie
Oleat (C18:1) und Palmitoleat (C16:1). Diese sind die wichtigsten einfach ungesättigten
Fettsäuren von Membranphospholipiden, Triglyzeriden, Wachsestern und Cholesterinestern
(Rahman et al., 2004). Eine Repression dieses Enzyms während der Infektion könnte für die
Wirtszelle zur Energieeinsparung dienen, da eventuell alle nicht unbedingt notwendigen
Funktionen der Zelle gedrosselt werden.
Dp87 und CotB sind Proteine der Sporenhülle und werden während des Entwicklungszyklusses von D. discoideum exprimiert und sezerniert (Araki & Maeda, 1998; Hopper et al,
1995). Eine Induktion von dp87 und eine Repression von cotB steht im Widerspruch. Eine
Induktion eines Proteins der Sporenhülle könnte so erklärt werden, dass sowohl eine Infektion
wie auch ein Nahrungsmangel erheblichen Stress für die Zelle bedeuten, der zur Aggregation
der Zellen und letztendlich zur Bildung von Sporen führen würde. Ebenso kann eine
Repression eines Sporenhüllproteins erklärt werden. Die Wirtszelle könnte von den
Legionellen soweit umprogrammiert werden, so dass es nicht zur Ausbildung von Sporen
kommt, in denen sich die Bakterien nicht mehr effektiv vermehren könnten. Es konnte
beobachtet werden, dass mit Legionellen infizierte Dictyostelien nur noch eingeschränkt in
der Lage sind, sich in Fruchtkörper zu differenzieren und Sporen zu bilden (Hägele et al.,
2000).
5.1.2.2
Infektion mit Legionella hackeliae und einer dotA-Mutante von
Legionella pneumophila
Pathogene Legionellen können sich in Dictyostelien vermehren. Im Gegensatz dazu werden
82% von L. hackeliae durch D. discoideum in den Phagosomen verdaut (Hägele et al., 2000).
Für die Fragestellung, welche Gene bei einer Infektion durch L. pneumophila eine Rolle
spielen, wurde zur Kontrolle RNA aus uninfizierten Zellen aber auch aus Zellen gewonnen,
die mit apathogenen L. hackeliae bzw. mit einer dotA-Mutante von L. pneumophila infiziert
wurden. DotA ist Teil des Typ-IV-Sekretionssystems und befindet sich in der inneren
Membran von L. pneumophila. Es spielt während der frühen Phase der Infektion eine Rolle
indem es die Fusion von Phagosom und Lysosom verhindert (Roy et al., 1998). Vergleicht
man das Expressionsmuster von D. discoideum, die mit wildtypischen Legionellen infiziert
wurden, mit dem Expressionsmuster von Dictyostelien, die mit L. hackeliae oder einer dotA-
Diskussion
114
Mutante infiziert wurden, so sind Gemeinsamkeiten und auch Unterschiede zu erwarten. In
allen drei Ansätzen kommt es zum Kontakt der Wirtszelle mit L. pneumophila, L. hackeliae
bzw. der dotA-Mutante. Ebenso findet eine Aufnahme der Bakterien statt. Die für Kontakt
und Aufnahme der Bakterien verantwortlichen Gene sollten in allen Ansätzen reguliert sein.
Im Idealfall wären keine Unterschiede der Genexpression messbar. Der Vergleich von
L. pneumophila infizierten Dictyostelien mit solchen, die L. hackeliae verdauen, sollte Gene
liefern, die aufgrund einer Infektion statt eines Verdaues differentiell exprimiert sind. Bei
einem Vergleich von L. pneumophila infizierten Dictyostelien mit uninfizierten Zellen, erhält
man 269 Gene, die differentiell exprimiert werden. Dagegen werden 588 Gene differentiell
exprimiert, wenn man L. pneumophila infizierte Zellen mit L. hackeliae infizierten Zellen
vergleicht. Somit gibt es 197 Gene, die in beiden Experimenten reguliert sind. Sie könnten die
Gene darstellen, die durch den Infektionsvorgang beeinflusst werden. Viele der 588
differentiell exprimierten Gene könnten falsch positiv sein, da hier nur RNAs aus einem
Infektionsexperiment mit mehreren parallelen Ansätzen verwendet wurden. Genauer sind
wahrscheinlich die Ergebnisse des Expressionsvergleiches von uninfizierten Dictyostelien im
Vergleich zu Dictyostelien, die mit L. pneumophila infiziert wurden. Bei diesen Experimenten
wurde die RNA aus vier voneinander unabhängigen Ansätzen isoliert. Es hat sich gezeigt,
dass die Schwankungen in der Genexpression am häufigsten dadurch verursacht werden, dass
unabhängige Ansätze verglichen werden. Ein Vergleich möglichst vieler RNAs aus mehreren
Kulturen, die unabhängig voneinander angesetzt wurden, vermindert somit den Erhalt falscher
Ergebnisse. Beim Vergleich von L. pneumophila infizierten Zellen mit Zellen, die mit der
dotA-Mutante von L. pneumophila infiziert wurden, erhält man 649 Gene als differentiell
exprimiert. Vergleicht man nun die differentiell exprimierten Gene von L. pneumophila
infizierten Zellen mit den drei Kontrollen (uninfiziert, L. hackeliae infiziert und dotA-Mutante
infiziert) so erhält man die Gene, die in D. discoideum als Reaktion auf eine Infektion mit
L. pneumophila reguliert werden. Es wurden 250 Gene gefunden, die differentiell exprimiert
werden. Davon konnten 140 Gene (56%) gefunden werden, die mit Genen aus dem Vergleich
gegen uninfizierte Zellen übereinstimmen. Bei den induzierten Genen ist RtoA, die
lysosomale α-Mannosidase, Discoidin I und sein Homolog, das Homolog zu ClpB sowie die
nicht annotierbaren Sonden SSB153, SSM409 und SSM847 darunter. In allen drei
Experimenten konnten die Gene der Sonden SSC374, SSC645, SSM741, VSG118 sowie das
β´-COP Homolog, cotB und die drei Homologe der calciumbindenden Proteine gefunden
werden.
5.1.2.3
Diskussion
115
Genexpression während einer Infektion über 48 h
Mit Hilfe von Genexpressionsstudien anhand einer Zeitreihe kann man zelluläre Prozesse, die
während einer Infektion ablaufen, untersuchen. Hierzu wurden zum Zeitpunkt 1 h, 3 h, 6 h,
24 h und 48 h nach Infektion aus je drei unabhängigen Ansätzen RNA isoliert und mit sechs
Microarrays hybridisiert. Die höchste Anzahl differentiell regulierter Gene konnte zu den
Zeitpunkten 3 h und 24 h nach Infektion gefunden werden. Was genau zu diesen Zeitpunkten
in der Zelle passiert, ist jedoch unbekannt. Zeitliche Vergleiche zur Infektion in Makrophagen
können nur bedingt gezogen werden, da hier die Infektion wesentlich schneller abläuft. In
Makrophagen etabliert sich eine legionellenhaltige Vakuole, die völlig unabhängig vom
endosomalen Netzwerk ist, bereits nach 6 h. Schon nach 10 bis 15 h erwerben die legionellenhaltigen Phagosomen lysosomale Eigenschaften. Nach 20 h werden die bis dahin neutralen
Vakuolen bereits angesäuert, was darauf hindeutet, dass die Phagosomen mit dem
lysosomalen Kompartiment fusionieren. Hierdurch wird die Vermehrung der Legionellen
gefördert. Kurze Zeit später werden die Legionellen aus den Wirtszellen freigesetzt (Swanson
& Fernandez-Moreira, 2002). In D. discoideum läuft dieser Vorgang vermutlich langsamer ab,
da eine Wirtszelllyse erst nach 72 h zu beobachten ist. Zum Zeitpunkt 24 h nach Infektion
wäre zu vermuten, dass sich hier das replikative Phagosom ausgebildet hat, die Bakterien sich
angepasst haben und nun in ihre replikative Phase übergehen. Von den insgesamt 1133
differentiell exprimierten Genen aus der Zeitreihe, konnten nur 179 Gene annotiert werden.
Um herauszufinden, welche Gruppen von Genen vor allem reguliert werden, wurden die
Sonden des Microarrays in funktionelle Kategorien eingeteilt. Diese funktionelle Kategorisierung basiert auf der Kategorisierung für Saccharomyces cerevisiae des Munich Information
Centre for Protein Sequences (MIPS, http://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.html). Mit
aufgenommen wurden noch Kategorien für die Multizellularität von D. discoideum während
des Entwicklungszyklusses (Urushihara et al., 2004; Farbrother, 2004). In Tabelle 9 sind die
funktionellen Kategorien der 5423 cDNA Sonden des D. discoideum Microarrays aufgeführt.
Die bereits bekannten Gene repräsentieren vor allem die Kategorien 6 Cellular biogenesis and
organization und 10 Stress response and cell rescue Da eine Infektion durch L. pneumophila
in D. discoideum zu Prozessen der Umorganisation führen und erheblichen Stress für die
Zelle bedeuten, ist eine Überrepräsentation dieser Kategorien plausibel.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass sich das DNA-Microarray eignet, um Expressionsmuster
zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster von D. discoideum nach
Infektion mit L. pneumophila untersucht. Zur Kontrolle dienten uninfizierte Zellen, und
Zellen, die mit L. hackeliae bzw. einer dotA-Mutante von L. pneumophila koinkubiert
Diskussion
116
wurden. Diese beiden Stämme weisen eine verminderte Pathogenität bzw. ein deletiertes
Pathogenitätsgen auf. Für den Zeitpunkt 24 h nach Infektionsbeginn wurden 140 Gene
gefunden, die in D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion mit L. pneumophila
differentiell exprimiert sind. Einige Gene codieren bereits bekannte Proteine von
D. discoideum. Dazu gehören das RtoA, Discoidin I, CotB und die lysosomale α-
Mannosidase. Weiteren Proteinen konnte durch Homologie-Suche eine Funktion zugeteilt
werden. Hierzu zählen die Chaperone ClpB, β’-COP und drei calciumbindende Proteine.
Nach Einteilung in funktionelle Kategorien, konnte gezeigt werden, dass während eines
Infektionsprozesses über 48 h viele Gene reguliert werden, deren Produkte am NukleotidMetabolismus beteiligt sind, oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt.
5.1.3 Nramp von Dictyostelium discoideum
Das nramp1-Gen kodiert für das natural resistance-associated macrophage protein 1. Gene der
nramp Familie sind sowohl unter Eukaryoten und Prokaryoten weit verbreitet (Cellier et al.,
2001). Homologe Gene in der Maus wurden mit der Kontrolle von Infektionen mit
Salmonella typhimurium (Ity), Leishmania donovanii (Lsh) und Mycobacterium bovis (Bcg) in
Zusammenhang gebracht (Lang et al., 1997). In D. discoideum konnte ein Homolog des
Nramp1-Proteins gefunden werden. Es befindet sich in der phagosomalen Membran und ist
für den Transport von zweiwertigen Kationen zuständig. Da noch nicht aufgekärt wurde, wie
der Transport genau stattfindet, existieren zwei Hypothesen. Nach der ersten Hypothese
werden zweiwertige Kationen wie Fe2+ aus dem Phagosom heraustransportiert. Da Fe2+ als
Kofaktor in vielen Enzymen vorkommt, können Bakterien im Phagosom viele Enzyme nicht
bilden, die wichtig sind für die Ausbildung ihrer Virulenz. Die zweite Hypothese schlägt
einen Transport von Eisen in das Phagosom vor. Hier fördert der erhöhte Fe2+-Spiegel die
Bildung von Sauerstoffradikalen nach der Haber-Weiss Reaktion. Dies wiederum würde zum
Abtöten der im Phagosom befindlichen Bakterien führen (S. Bozzaro, pers. Mitteilung). Das
Vorhandensein von Eisen stellt für Legionellen einen wichtigen Faktor dar. So konnte gezeigt
werden, dass die Vermehrungsfähigkeit der Legionellen in Säugerzellen eisenabhängig ist
(Pope et al., 1996). Die Zugabe von γ-Interferon inhibiert das Wachstum von Legionellen,
indem der intrazelluläre Eisenspiegel reduziert wird (Byrd et al., 1989). Ein optimales
Wachstum von Legionellen wird ab einem Eisenspiegel von 20 µM erreicht (Mengaud et al.,
1993). Das sind sehr hohe Mengen an Eisen, wenn man bedenkt, dass in einem bakterien-
Diskussion
117
haltigen Phagosom nur ca. 0,1 µM Eisen vorhanden ist (Portillo et al., 1992). Legionellen
müssen somit in der Lage sein, potente Eisenaquisitionssysteme zu exprimieren.
5.1.3.1
Infektion von Dictyostelium discoideum WT und einer nramp-Mutante
In dieser Arbeit wurde die Rolle von Nramp1 aus D. discoideum während einer Infektion
durch L. pneumophila und M. avium untersucht. Anhand von FACS-Analysen wurde die
Aufnahmerate von L. pneumophila in wildtypische Dictyostelien mit der Aufnahmerate in die
nramp-Knockout-Mutante verglichen. Hierzu wurden die Dictyostelien mit GFP-markierten
Legionellen infiziert und die Phagozytoserate nach 3 h Koinkubation am FACS-Gerät
ausgewertet. Die Auswertung über die Quadrantstatistik ergibt eine Phagosytoserate von 20%
in Ax2 Wildtypzellen und 10% in die Mutante. Dies bedeutet, dass die Mutante 50% weniger
Legionellen aufnimmt als der Wildtyp. Die FACS-Analyse bietet eine schnellere Methode der
Messung der Phagozytoserate als die zeitaufwendige Bestimmung der CFU-Werte. Um die
Ergebnisse zu überprüfen, wurden Invasionsassays wie in 3.15 beschrieben durchgeführt. 3 h
nach Zugabe der Legionellen, wurden die extrazellulären Bakterien durch Gentamicinbehandlung abgetötet. Die Anzahl der aufgenommenen Bakterien wurde durch Ausplattieren
geeigneter Verdünnungen auf BCYE Agar bestimmt. Es wurden 1 x 105 L. pneumophila in
5 x 105 D. discoideum WT aufgenommen. Geht man davon aus, dass jede Wirtszelle jeweils
nur ein Bakterium aufnimmt, so entspricht das einer Infektionsrate von 20%. Im Gegensatz
zum Wildtyp nimmt die nramp-Mutante nur etwa halb so viele (5,7 x 104) Legionellen auf.
Die Aufnahmerate in die nramp-Mutante ist also im Vergleich zum WT um 50% reduziert.
Die Vermehrung von L. pneumophila ist in Abbildung 14 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass
die Anzahl der Legionellen sowohl im WT als auch in der Mutante in den ersten 24 h
abnimmt. Dies ist evtl. dadurch zu erklären, dass in D. discoideum rund 16% der Phagosomen
mit Lysosomen fusionieren und die sich darin befindlichen Legionellen verdaut werden
(Hägele et al., 2000). Zudem müssen sich die Bakterien an das veränderte Milieu in der Zelle
anpassen, bevor sie in die replikative Phase übergehen können. Dies kann durchaus dazu
führen, dass die Anzahl der intrazellulären Bakterien in den ersten 24 h abnimmt. Während
sich die Legionellen in der Mutante bereits nach 48 h vermehrt haben, nehmen die Bakterien
im Wildtyp weiter ab. Erst nach 72 h ist eine deutliche Vermehrung um das knapp Vierfache
des Inokulums zu erkennen. Die Legionellen in der Mutante haben sich nach 72 h bereits um
das Siebenfache vermehrt. Nach 96 h wird der Unterschied in der Replikationsrate noch
deutlicher. Während sich L. pneumophila im WT um das 22-fache vermehrt hat, nahm die
Diskussion
118
Anzahl von L. pneumophila in der nramp-Mutante um das 80-fache zu. Da sich M. avium
ebenfalls in D. discoideum replizieren kann, wurde die Aufnahmerate dieses Bakteriums
sowohl in AX2 als auch in die nramp-Mutante mittels eines Amikazinassays bestimmt.
Hierzu wurden die Dictyostelien 3 h mit Mykobakterien koinkubiert. Nach Entfernen der
extrazellulären Bakterien durch Amikazin wurden geeignete Verdünnungen auf 7H11 Agar
ausplattiert. Ebenso wurden Invasionsassays wie unter 3.12.4 beschrieben durchgeführt um
die intrazelluläre Vermehrung von M. avium in D. discoideum zu vergleichen. Wie anhand
der Abbildung 15 zu erkennen ist, wurden sowohl die wildtypischen Dictyostelien als auch
die nramp-Mutanten zum Zeitpunkt 0 h mit etwa gleich vielen Mykobakterien infiziert. Nach
Entfernen der extrazellulären Bakterien wurden zum Zeitpunkt 0’ h von der nramp-Mutante
nur etwa halb so viele Mykobakterien aufgenommen wie von wildtypischen Dictyostelien.
Die Mykobakterien vermehrten sich in D. discoideum WT um knapp zwei log-Stufen. Trotz
der niedrigeren Aufnahme in die nramp-Mutante, vermehrten sich die Mykobakterien
innerhalb von 96 h um knapp 2,7 log-Stufen. Die erhöhte Replikationsrate von
L. pneumophila und M. avium in der nramp-negativen Mutante HSB60 resultiert aus dem
Fehlen des Nramp-Proteins. Die Wirtszelle hat hier einen ihrer Abwehrmechanismen gegen
intrazelluläre Pathogene verloren. Hackam et al. konnten zeigen, dass Mäuse mit einer
Mutation im nramp1-Gen deutlich anfälliger für mykobakterielle Infektionen sind. Der pHWert in Phagosomen von nramp1-exprimierenden Mäusen war deutlich niedriger als in
Mutanten (Hackam et al., 1998).
5.1.3.2
Expression von nramp in Dictyostelium discoideum während einer Infektion
Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Expression von nramp1 während der Infektion von
D. discoideum mit L. pneumophila und M. avium untersucht. Hierzu wurden Dictyostelien mit
den Bakterien mit einer MOI von 10 infiziert. Nach 0 h, 24 h und 48 h wurde die RNA wie in
3.17.2 beschrieben mit Trizol isoliert. In Zusammenarbeit mit Salvatore Bozzaro wurden die
RNA-Isolate auf das Vorhandensein von nramp-RNA mit Hilfe von Northern-Blots und einer
spezifischen nramp-Sonde untersucht. Zur Kontrolle der Methode fanden parallel
Hybridisierungen mit den Sonden VatB und Actin statt. Zur Kontrolle der nramp-Expression
wurde RNA aus uninfizierten Dictyostelien isoliert und auf das Vorhandensein von nrampRNA untersucht. Hier ist zu sehen, dass die nramp-Expression in uninfizierten Dictyostelien
innerhalb von 48 h stark abnimmt. Dennoch ist nramp-RNA nach 48 h noch nachweisbar.
Ebenso nimmt die nramp-Expression bei L. pneumophila infizierten Dictyostelien stark ab.
Diskussion
119
Schon nach 48 h ist keine nramp-RNA mehr nachweisbar. Das bedeutet, dass Legionellen in
der Lage sind, die nramp-Expression zu unterdrücken. Im Gegensatz dazu ist während der
Infektion mit M. avium über 48 h ein nahezu konstanter Level an nramp-RNA nachweisbar.
Demnach konnte gezeigt werden, dass trotz Vermehrung der Mykobakterien, Dictyostelien in
der Lage sind, nramp zu exprimieren. Eventuell könnte dies an unterschiedlichen Eisenanforderungen der Legionellen und Mykobakterien liegen. Es konnte gezeigt werden, dass
Deferoxamin, ein Eisen-Chelator einen leicht stimulierenden Effekt auf die nramp-Expression
hat. Ebenso wird durch Zugabe von Eisen die Expression von nramp reprimiert (S. Bozzaro,
pers. Mitteilung). Durch einen sehr hohen Eisenbedarf von M. avium könnte es zum Fehlen
von Eisen für die Wirtszelle kommen. Dadurch könnte Dictyostelium angeregt sein, nramp zu
exprimieren, um für sich selber Eisen zur Verfügung zu stellen. Anhand dieser Versuche
konnte gezeigt werden, dass sich D. discoideum eignet, um eine Infektion von Legionellen
und Mykobakterien zu untersuchen. Um den Einfluss von Eisen auf die Infektion zu
verstehen, könnten Invasionsassays mit Legionellen und Mykobakterien unter Zugabe von
Eisen bzw. Eisenchelatoren gemacht werden.
5.2
Funktionelle Analyse des Legionella pneumophila Mip-Proteins
Ein seit knapp 15 Jahren bekannter Virulenzfaktor von L. pneumophila ist das 25 kDa große
Mip-Protein (macrophage infectivity potentiator). Elektronenmikroskopische Aufnahmen und
das Markieren von Mip durch goldgebundene Antikörper konnte zeigen, dass sich Mip auf
der Oberfläche der Legionellen befindet aber auch in die phagosomale Membran inseriert
wird (Helbig et al., 2001). Mip-ähnliche Proteine und mip-verwandte DNA-Sequenzen
können auch in anderen intrazellulären Organismen wie Chlamydia trachomatis, Chlamydia
psittaci, Coxiella burnetii, Trypanosoma cruzi und auch in Escherichia coli und anderen
Enterobakterien gefunden werden (Helbig et al., 2003). Im Jahre 2001 konnte die
Kristallstruktur von Mip aufgeklärt werden (Riboldi-Tunnicliffe et al., 2001). Mip gehört zu
den FK506-Bindeproteinen (FKBP). Jedes Monomer des homodimeren Proteins besteht aus
einer N-terminalen Domäne, die für die Dimerisierung verantwortlich ist, einer verbindenden
α-Helix und einer C-terminalen PPIase Domäne. Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen
(PPIasen) stellen die Isomerisierung von Peptidyl-Prolylbindungen ein. Infektionsstudien mit
Mip-Varianten haben gezeigt, dass die N-terminale Domäne und die Dimerisierung von Mip,
nicht jedoch seine PPIase-Aktivität eine Rolle während der Infektion von Acanthamoeba
castellanii und U937 Makrophagen spielen. Für die volle Virulenz von Legionella in Meer-
Diskussion
120
schweinchen sind sowohl die Dimerisierung als auch die PPIase-Aktivität notwendig (Köhler
et al., 2003). Im Hinblick darauf könnte die PPIase-Aktivität eine extrazelluläre Rolle
während der Infektion von höheren Organismen spielen. In dieser Arbeit wurde die extrazelluläre Funktion von Mip näher untersucht.
5.2.1.1
Invasionsassays von Legionellen in Lungenepithelzellen
Legionellen können sich sowohl in Lungenmakrophagen als auch in Lungenepithelzellen
vermehren. Neben den Lungenepithelzellen, die 93% der alveolären Oberfläche ausmachen,
kann die darunter liegende extrazelluläre Matrix eine große Rolle während der frühen Phase
der Infektion spielen. Um zu untersuchen, welchen Einfluss das Mip-Protein, die
Dimerisierung und die PPIase-Aktivität dieses Proteins auf die Vermehrung von
L. pneumophila haben, wurden Invasionsassays von L. pneumophila PhilI JR32, JR32-2,
JR32-2.1, JR32-2.2, JR32-2.3 und JR32-2.4 in den Lungenepithelzellen NCI-H292
durchgeführt. Diese Zellen sind in der Lage extrazelluläre Matrix zu bilden (Lähteenmaki et
al., 1998). Für die Infektion der Lungenepithelzellen wurden wie unter 3.19 beschrieben
Invasionsassays durchgeführt. Alle Bakterienstämme wurden gleich gut in die Lungenepithelzellen aufgenommen. Nach 24 h haben sich der Wildtyp JR32, die Komplementante
JR32-2.1 und die monomeres Mip-exprimierende Variante JR32-2.4 um eine knappe logStufe vermehrt. Die mip-Mutante JR32-2 vermehrte sich innerhalb 24 h nicht und die PPIasedefizienten Varianten JR32-2.2 und JR32-2.3 konnten ihre Anzahl verdreifachen. Nach 72 h
konnten sich der Wildtyp JR32, die Komplementante JR32-2.1 und die monomeres Mipexprimierende Variante JR32-2.4 um 2,5 log-Stufen vermehren. Die mip-Mutante konnte sich
nur leicht mehr als 1 log-Stufe vermehren, die PPIase-defizienten Varianten JR32-2.2 um 1,5
log-Stufen und JR32-2.3 um 2 log Stufen. Dies zeigt deutlich, dass die PPIase-Aktivität von
Mip für die Vermehrung in Lungenepithelzellen eine Rolle spielt, die Dimerisierung jedoch
nicht wichtig ist. Dies steht im Gegensatz zu den Invasionsstudien in A. castellanii und U937Makrophagen, in denen die PPIase-Aktivität nicht relevant ist, die Dimerisierung von Mip
aber notwendig ist, für die volle Virulenz von L. pneumophila. Lungenepithelzellen gehören
jedoch nicht zu den professionell phagozytierenden Zellen. Zudem exprimieren sie
extrazelluläre Matrix, die eventuell einen Einfluss auf die PPIase-Aktivität haben könnte.
Diskussion
5.2.1.2
121
Bindestudien von Mip
Im Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Mip sowohl an Lungenepithelzellen
wie auch an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen NCI-H292 bindet. Vor allem
werden hier Collagene, speziell Collagen IV gebunden. Die Bindung an die extrazelluläre
Matrix sowie an die Collagene wurde durch Bindestudien mit Mip-FITC und Mip-HRP wie in
3.22 beschrieben durchgeführt. Durch direkte Bindung von FITC oder HRP an das Protein
benötigt man keinen primären bzw. sekundären Antikörper um eine Bindung von Mip an
ECM oder rekombinante Proteine nachzuweisen. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, die Bindung durch die Dot-Blot Methode nachzuweisen. Hierzu wurden die
gereinigten Matrixproteine durch ein Vakuum auf eine PVDF-Membran angesaugt. Die freien
Bindungsstellen wurden mit Milch blockiert. Nach Inkubation mit Mip und der Nachweis der
Bindung mit Hilfe von primärem und sekundärem Antikörper, konnte man eine schwache
Bindung an Collagen IV erkennen. Allerdings war eine starke positive Bindung an Laminin
zu sehen. Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass durch Verwenden des sekundären
Antikörpers falsch-positive Ergebnisse produziert wurden. Daher wurde auf die Verwendung
von Antikörpern im weiteren Verlauf der Versuche verzichtet, um falsch-positive Ergebnisse
auszuschliessen. Mip wurde zum Nachweis direkt mit FITC oder HRP gekoppelt. Zudem
konnte festgestellt werden, dass Mip nicht gut an geblottetes Collagen bindet. Es ist zu
vermuten, dass die Proteine durch das Blotten und das Ansaugen auf die Membran ihre
natürliche Konformation ändern und somit die Bindestellen für Mip nicht mehr frei
zugänglich sind. Daher wurde im weiteren Verlauf der Bindestudien als Methode der Wahl
das Aufbringen auf Glasobjektträger bzw. das Anheften an Chamberslides durch Inkubation
der Proteine über Nacht durchgeführt. Die Versuche wurden in Anlehnung an Westerlund et
al. und Eberhard et al. durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung von MipHRP an Collagene konzentrationsabhängig ist, wobei eine Bindung von Mip an Collagen II
und III erst ab einer Konzentration von 40 µg/ml nachzuweisen ist. Eine vermehrte Bindung
an Collagen IV ist schon ab 2,5 µg/ml zu sehen. In Kompetitionsbindestudien wurden die
Versuche gleichzeitig mit markiertem und unmarkiertem Mip durchgeführt. Sowohl bei der
Auswertung über ELISA mit Mip-HRP als auch am Mikroskop mit Mip-FITC konnte die
Bindung von markiertem Mip durch Zugabe gesteigerter Mengen an unmarkiertem Mip
vermindert werden.
Um die Bindedomäne von Mip an Collagen IV zu finden, wurden Bindestudien mit dem
monomeren N-terminal verkürzten Mip(77-213) durchgeführt. Es konnte kein Unterschied in der
Bindung an Collagen IV festgestellt werden, was darauf hinweist, dass die N-terminale
Diskussion
122
Domäne von Mip nicht an der Bindung von Mip an Collagen IV beteiligt ist. Ebenso wurde
das enzymatische Zentrum von Mip durch Zugabe von 100 µg/ml Rapamycin bzw. FK506
gehemmt. In Abbildung 26 ist zu sehen, dass hier die Bindung an immobilisiertes Collagen IV
deutlich vermindert ist. Dies deutet darauf hin, dass die C-terminale Domäne an der Bindung
beteiligt sein könnte. Rapamycin bzw. FK506 könnten durch ihre große Struktur jedoch
weitere Bereiche von Mip blockieren. Um genauere Aussagen über eine Bindedomäne von
Mip machen zu können, müssten weitere Bindestudien mit C-terminal verkürztem Mip
durchgeführt werden.
Die Bindung von bakteriellen Proteinen an Epithelien, extrazelluläre Matrixproteine und vor
allem an Collagen IV konnte schon mehrfach gezeigt werden. So sind z. B. Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus und
Escherichia coli in der Lage an immobilisiertes Collagen IV zu binden (Eberhard et al., 1999;
Gil et al., 1996; Pouttu et al., 1999; Kostrzynska et al., 1989; Patti et al., 1994). Bei der
Bindung von Mip an Collagen IV handelt es sich um eine Protein-Protein Bindung und nicht
um eine Bindung an die Kohlenhydratseitenketten des Glykoproteins Collagen. Durch
Behandlung mit 100 mM Periodat bzw. mit 2,5 mU Endoglykosidase H für 16 h wurden die
Kohlenhydrate von immobilisiertem Collagen IV oxidiert bzw. entfernt. Bindestudien mit
Mip-HRP an diese Collagene haben gezeigt, dass eine Bindung nach Entfernen der
Kohlenhydrate nicht beeinträchtigt ist. Westerlund et al. haben gezeigt, dass das O75X
Adhäsin von uropathogenen E. coli ein Collagen IV-Bindeprotein ist und ebenfalls an den
Proteinteil des Collagens bindet (Westerlund et al., 1989). Komponenten der extrazellulären
Matrix sind stark mit Wirtszelloberflächen in Geweben assoziiert. Laminin und Collagen IV
werden hauptsächlich auch in Basalmembranen gefunden. In der Lunge tritt vermehrt
Collagen IV auf (Gelse et al., 2003). Vermutlich stellt die Bindung von Mip an Collagen IV
einen Hauptfaktor für die Kolonisierung der Legionellen in der Lunge dar.
5.2.1.3
Transwell-Versuche mit Legionella Mip-Varianten und Escherichia coli
Zahlreiche pathogene Bakterien sind in der Lage anatomische Barrieren zu durchbrechen, um
in angrenzende Gewebe oder den Blutkreislauf zu gelangen. Die Einwanderung vieler
Bakterien wie z. B. Streptococcus pneumoniae, Borellia burgdorferi, Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae und Helicobacter pylori geschieht nach Plasminogenaktivierung, die
wiederum zur Aktivierung proteolytischer Enzyme führt (Eberhard et al., 1999). In dieser
Arbeit wird ein neuer PPIase-abhängiger Mechanismus für die Invasion von Bakterien in ein
Diskussion
123
Gewebe beschrieben. Als geeignetes Modell zur Untersuchung der Invasion von Bakterien in
Gewebe hat sich das Transwell-System etabliert. Das Transwell-System besteht aus einem
Filtereinsatz mit einer Membran, die 3 µm große Poren besitzt. Diese Poren sind durchlässig
für Legionellen. Auf der Membran befindet sich ein Monolayer aus Lungenepithelzellen NCIH292. Diese Zellen gehören zu den Typ II-Alveolarepithelzellen und sind in der Lage
extrazelluläre Matrix zu produzieren. Das Vorhandensein der extrazellulären Matrix dichtet
den Zellmonolayer zusätzlich ab. Der Filtereinsatz wird in die Vertiefungen einer 24-LochPlatte eingehängt. Bakterien können nun in den oberen Teil des Systems pipettiert werden.
Nach entsprechender Inkubationszeit wird der untere Teil des Transwell-Systems auf
Agarplatten ausplattiert, um zu kontrollieren, wieviele Bakterien in der Lage waren, den
Monolayer zu transmigrieren. Die Transwell-Versuche wurden mit den Mip-Varianten von
Legionella
pneumophila
PhilI
JR32
(Wildtyp),
JR32-2
(Mip-negativ),
JR32-2.1
(Komplementante), JR32-2.2 (Variante mit 2% PPIase-Aktivität), JR32-2.3 (Variante mit 6%
PPIase-Aktivität) und JR32-2.4 (monomeres Mip) durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass
Legionellen mit voller PPIase-Aktivität in der Lage sind, durch einen Monolayer aus Lungenepithelzellen zu penetrieren. Die Legionellen mit 6% PPIase-Aktivität von Mip kommen zu
60% durch den Monolayer und die Legionellen mit 2% PPIase-Aktivität gehen nur noch zu
20% durch im Vergleich zu den wildtypischen Legionellen. Die Migration ist durch das
monomere N-terminal verkürzte Mip nicht beeinträchtigt. Dass die Fähigkeit der Penetration
nicht nur für L. pneumophila PhilI JR32 gilt, zeigten Versuche mit den Stämmen
L. pneumophila Wadsworth und L. pneumophila Corby. Hier sind ebenfalls die wildtypischen
Legionellen, sowie die Komplementanten in der Lage durch einen Monolayer aus Lungenepithelzellen zu penetrieren. Um zu untersuchen, ob nur Legionellen mit Hilfe von Mip in der
Lage sind einen Lungenepithelzellmonolayer zu penetrieren, wurden die Transwell-Versuche
mit Escherichia coli durchgeführt. Für die Versuche wurden E. coli HB101 verwendet. Diese
Bakterien exprimieren im Gegensatz zu dem Laborstamm E. coli K12 DH5α keine Flagellen
oder Fimbrien. Eine Reihe von Fimbrien von Enterobakterien sind an der Bindung an extrazelluläre Matrix und auch an Collagen IV beteiligt und führen zur erhöhten Invasivität dieser
Bakterien in Zellgewebe (Westerlund & Korhonen, 1993). Es wurden die wildtypischen, mipnegativen E. coli HB101 mit dem Vektor pBR322, sowie die mit dem mip-tragenden Vektor
pBLL106 transformierten E. coli HB101 verwendet. Der Vektor pBLL106 resultierte aus dem
Vektor pBR322 mit einem 4,5 kb BamH I-Cla I mip-tragenden Fragment. Ebenso wurde
getestet, ob durch Zugabe von gereinigtem rekombinanten Legionella-Mip-Protein die
wildtypischen mip-negativen E. coli HB 101 in der Lage sind, durch eine Barriere aus
Diskussion
124
Lungenepithelzellen mit ihrer Matrix zu gelangen. Es konnte gezeigt werden, dass wildtypische E. coli nicht in der Lage sind, diese Barriere aus Lungenepithelzellen zu durchdringen. Nach Transformation mit dem Legionella-mip-tragenden Vektor pBLL 106, bzw.
nach Zugabe von rekombinantem Legionella-Mip konnten diese E. coli den Monolayer
penetrieren. Bei Zugabe von 30 µg Mip sind im Mittel 5600 Bakterien/ml durch den
Monolayer gegangen, wobei bei Zugabe von 100 µg knapp doppelt so viele Bakterien/ml
penetrieren konnten. Diese Versuche haben gezeigt, dass die Penetrationsfähigkeit durch die
Anwesenheit von Mip ein genereller Mechanismus für L. pneumophila ist um durch eine
Barriere aus Lungenepithelzellen mit ihrer extrazellulären Matrix zu gelangen und auf E. coli
übertragen werden kann.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Fehlen von Mip in der Mutante JR32-2 durch
die Zugabe von rekombinantem Mip kompensiert werden kann. Im Transwell-Versuch penetrieren vermehrt Mutanten umso mehr rekombinantes Mip zugegeben wird. Der Effekt ist
konzentrationsabhängig und erreicht bei einem Wert von 240 µg/ml seine Sättigung. Durch
Zugabe von 30 µg rekombinantem monomeren Mip ist ebenfalls eine Steigerung der Penetrationsrate von JR32-2 zu beobachten, wobei die Zugabe von je 30 µg rekombinantem
Mip(D142-L) und Mip(Y185-A) die Penetrationsrate nur von 50 auf 150 Legionellen erhöht.
Dies bestätigt die These, dass die Dimerisierung von Mip für die Penetrationsfähigkeit von
L. pneumophila durch einen Monolayer aus Lungenepithelzellen nicht notwendig ist. In
weiteren Versuchen wurde gezeigt, dass die Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase Aktivität von
Mip während der Penetration der Bakterien durch Epithelzellen eine Rolle spielt. Hierzu
wurde die enzymatische Aktivität von Mip durch Vorinkubation der wildtypischen Bakterien
mit Rapamycin und FK506 gehemmt. Während der Koinkubation von 5 h befanden sich
100 µg Rapamycin bzw. FK506 im Transwell-System. Die Penetrationsrate von
L. pneumophila PhilI JR32 konnte durch Zugabe der PPIase-Hemmer FK506 und Rapamycin
um etwa zwei log-Stufen reduziert werden. Die Notwendigkeit der PPIase-Aktivität während
der Penetration durch den Lungenepithelzellmonolayer korrelliert mit den Ergebnissen im
Meerschweinchenmodell. Auch hier sind die Legionella Mutanten mit niedriger PPIaseAktivität deutlich attenuiert (Köhler et al., 2003). Wahrscheinlich erhöht die PPIase-Aktivität
die Virulenz von Legionella, indem die Invasivität in das Lungengewebe verbessert wird.
5.2.1.4
Diskussion
125
Inhibierung der Proteaseaktivitäten
Die Fähigkeit von invasiven Bakterien in Gewebe einzudringen erfordert proteolytische
Aktivität (Lähteenmäki et al., 2000). Um zu testen, ob während des Prozesses der Penetration
durch Lungenepithelzellen Proteasen beteiligt sind, wurden Transwell-Versuche mit Proteaseinhibitoren durchgeführt. Durch Zugabe eines Protease Inhibitor Cocktails konnte gezeigt
werden, dass die Penetrationsrate der Legionellen um etwa zwei log-Stufen vermindert wurde.
Complete EDTA-free Cocktail Tabletten hemmen ein breites Spektrum Serin- und Cysteinproteasen. Metallo- und Aspartatproteasen werden nicht gehemmt. Ob es sich um eine Serinoder Cysteinprotease handelt, wurde in weiteren Versuchen getestet. Hierzu wurden gleiche
Transwell-Versuche wie oben beschrieben durchgeführt. Zum einen wurden die Serinproteasen durch die Zugabe von Pefabloc SC (4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid) bzw.
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) gehemmt. Die Cysteinproteasen wurden durch E-64 (N[N-(L-3-trans-carboxyoxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-agmatin) blockiert. Die Mengenangaben
beziehen sich auf die empfohlene Arbeitskonzentration der Firma Roche, von der die
Chemikalien bezogen wurden. Bei Pefabloc SC musste die empfohlene Konzentration von
100 µg/ml auf 30 µg/ml reduziert werden, da bei höherer Dosierung die Bakterien abgetötet
wurden. Nach Hemmung der Serinproteasen im System war die Durchgangsrate der Bakterien
von 6500 auf 90 bzw. 45 Bakterien/ml reduziert. Der Cysteinproteasehemmer E-64 zeigte
keinen Effekt auf die Durchgängigkeit der wildtypischen Legionellen. Nach Hemmung der
Cysteinproteasen mit E-64 konnten noch knapp 3300 Bakterien/ml im unteren Teil des
Transwell-Systems detektiert werden. Ein genereller Mechanismus für invasive Bakterien ist
die Degradation der extrazellulären Matrix und der Basalmembranen. Bei vielen Bakterien ist
dieser Prozess von der Plasminogenaktivierung abhängig, was zu einer Serinproteaseaktivität
führt (Boyle & Lottenberg, 1997).
5.2.1.5
Degradation der extrazellulären Matrix
Um genauere Erkenntnisse über die proteolytische Aktivität während der Penetration von
Legionellen durch Gewebe zu bekommen, wurden Degradationsassays mit radioaktivmarkierter extrazellulärer Matrix durchgeführt. Um radioaktivmarkierte extrazelluläre Matrix
(ECM) zu erhalten, wurden die Lungenepithelzellen wie unter 3.26 beschrieben mit L[35S]Methionin und L-[35S]Cystein während ihres Wachstums inkubiert. Nach Erreichen eines
konfluenten Monolayers wurden die Lungenepithelzellen wie unter 3.21 beschrieben zerstört
Diskussion
126
und die extrazelluläre Matrix gewonnen. Nach Zugabe der Bakterien wurde nach
entsprechender Zeit ein Aliquot aus der Vertiefung der 24-Loch-Platte abgenommen und in
Scintillationsflüssigkeit pipettiert. Die freigewordene Radioaktivität wurde am Scintillationsmessgerät bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass wildtypische L. pneumophila PhilI JR32
und mip-negative JR32-2 nach Zugabe von 30 µg rekombinantem Mip in der Lage sind die
extrazelluläre Matrix zu zerstören. Nach Hemmung der Serinproteaseaktivitäten durch
Zugabe von Pefabloc SC, konnten L. pneumophila PhilI JR32 die Matrix nicht mehr
degradieren. Ebenso scheint das Mip-Protein für die Degradation wichtig zu sein, da mipnegative Legionellen JR32-2 nicht mehr in der Lage waren, die Matrix innerhalb von 2 h zu
zerstören. Bei Zugabe von 100 µg rekombinantem Mip alleine konnte keine freiwerdende
Radioaktivität gemessen werden. Dies weist darauf hin, dass das Mip-Protein selber keine
proteolytische Aktivität besitzt. Vielmehr weisen die Versuche darauf hin, dass zusätzlich
eine Serinproteaseaktivität benötigt wird um extrazelluläre Matrix abzubauen.
In dieser Arbeit konnten Collagene, speziell Collagen IV als extrazellulärer Bindungspartner
von Mip aus Legionella pneumophila identifiziert werden. Zudem konnte gezeigt werden,
dass PPIase-positive Legionellen in der Lage sind mit Hilfe serinproteolytischer Aktivität
extrazelluläre Matrix zu degradieren und einen Monolayer aus Lungenepithelzellen zu penetrieren. Dass das Mip-Protein mit der extrazellulären Matrix während der Penetration der
Legionellen interagiert, zeigen auch Transwell-Versuche mit Lungenepithelzellen, die keine
Matrix bilden. Hierzu wurden Calu3-Zellen verwendet. Sowohl wildtypische als auch mipnegative Legionellen konnten in annähernd gleicher Menge durch einen Monolayer aus
Calu3-Zellen gelangen.
Es gibt zahlreiche Proteine ganz unterschiedlicher Bakterien, die an die extrazelluläre Matrix
binden können. So konnten die mykobakteriellen Proteine 85A, 85B und 85C in vitro das
extrazelluläre Matrixprotein Fibronektin binden (Naito et al., 1998). Des Weiteren konnten als
Fibronektin-Bindeproteine noch das FnBPA aus S. aureus, das Sfb aus Streptococcus
pyogenes, das FnBA und FnBB aus Streptococcus dysgalactiae und das FSE aus
Streptococcus equisimilis identifiziert werden (Greene et al., 1995). Zudem gibt es noch das
Collagen-Bindeprotein CnA aus S. aureus (Xu et al., 2004). Die Bindung an Fibrinogen ist für
die Adhärenz und Kolonisation von S. aureus und Streptococcus sanguis wichtig. Mutanten
sind nur noch geschwächt in der Lage eine infektive Endokarditis zu verursachen (Westerlund
& Korhonen, 1993). Zudem binden eine Reihe von enterobakteriellen Fimbrien an
Glykoproteine der extrazellulären Matrix. So binden Typ 1 und Typ S Fimbrien von E. coli an
Oligosaccharidketten von Laminin. Die Dr-Fimbrien von E. coli O75X binden in Form einer
Diskussion
127
Protein-Protein Interaktion an Typ IV Collagen, speziell an die 7S Domäne (Westerlund &
Korhonen, 1993). Das YadA Protein von Yersinia enterocolitica und Y. pseudotuberculosis
bildet eine polymetrische Matrix auf der Bakterienoberfläche. Es vermittelt die Adhärenz der
Bakterien an gelöstes und immobilisiertes Collagen I, II, III, IV, V und XI und in geringerem
Maße auch an Laminin und Fibronektin. Eine yadA-Mutation führt zu einer 100-fach
geringeren Infektivität der Bakterien in Mäusen (Roggenkamp et al., 1995).
Bei Infektionen im Meerschweinchenmodell mit mip-negativen Mutanten, konnte eine um 60fach reduzierte Anzahl an Bakterien in der Lunge gefunden werden als in Meerschweinchen,
die mit wildtypischen Legionellen infiziert wurden (Köhler et al., 2003). Dies ist evtl. an der
verminderten Adhäsionsfähigkeit der mip-negativen Mutanten zurückzuführen. Bei allen
ECM-Bindeproteinen wie auch bei Mip konnte eine Abhängigkeit der Bindung von der
Konformation des ECM-Proteins festgestellt werden. Die Protein-ECM Interaktionen
variieren jedoch in ihrem Mechanismus. So kann es sich wie bei Mip und Collagen IV um
eine Protein-Protein Bindung handeln oder um eine Bindung an die Kohlenhydratketten der
Glykoproteine (Pouttu et al., 1999). Ebenso gibt es die Bindung über einen Brückenmechanismus, der über ein bivalentes, lösliches Protein vermittelt wird. Für einige der ECMBindeproteine konnte gezeigt werden, dass sie die Kolonisation der Bakterien fördern und die
Invasivität in Gewebe erhöhen (Eberhard et al., 1999). Ebenso wie zur Adhäsion dienen
Fimbrien auch zur Plasminogenaktivierung (Kukkonen et al., 1998). Neben Gram-positiven
Bakterien wie Streptokokken sind auch wichtige Gram-negative Pathogene in der Lage
Plasminogen auf ihrer Oberfläche zu binden. Durch wirtszelleigene Plasminogenaktivatoren
wird Plasminogen in seine proteolytische Form Plasmin aktiviert (Saksela & Rifkin, 1988).
Plasmin gehört zu den trypsinähnlichen Serinproteasen mit einer breiten Substratspezifität
und weiteren Funktionen wie die Degradierung von Fibrin und anderen Proteinen der
extrazellulären Matrix (Kukkonen et al., 1998).
Während der Metastase von Tumorzellen ist die Aktivierung von Prokollagenasen notwendig,
da Tumorzellen wesentlich größer sind als Bakterien. Somit ist die Adhärenz an Laminin und
die Plasminogenaktivierung für die Metastase von Tumorzellen wichtig. Man spekuliert, dass
die Metastase von Tumorzellen und das Eindringen von Bakterien in das Gewebe ähnlich
abläuft, da beide Arten von Zellen durch das dichte Geflecht der ECM und der Basalmembran
kommen müssen um sich im Gewebe ausbreiten zu können (Lähteenmaki et al., 1998).
Eine besondere Rolle während der „Metastase“ von Legionellen scheint vor allem die PPIaseAktivität von Mip zu spielen. Wie Bindestudien gezeigt haben, ist die C-terminale Region von
Mip an der Bindung an Collagen IV beteiligt. Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen
Diskussion
128
katalysieren die Faltung der Tripelhelix von Collagenen. Collagene bestehen aus drei
Strängen, Jeder Strang bildet eine Kette aus etwa 1000 Wiederholungen von Gly-XAA-YAA,
wobei XAA oft Prolin und YAA Hydroxyprolin ist. Die cis/trans Isomerisierung bildet den
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Bildung der Collagen-Tripelhelix (Davis et al.,
1989).
Im Hinblick auf die vorliegende Arbeit könnte ein Modell für die Invasion von
L. pneumophila in Lungengewebe postuliert werden. Die Adhärenz von membran-
gebundenem Mip an Collagen IV erhöht die Kolonisierung von Legionellen in der Lunge. Die
Bindung des C-terminalen Endes von Mip an Collagen IV könnte zur Aktivierung einer
Serinprotease führen bzw. könnte Collagen sensitiv für den Abbau durch eine Serinprotease
machen. Beides würde zur Spaltung von Proteinen in der extrazellulären Matrix führen, was
den Eintritt der Legionellen in das tiefere Lungengewebe erleichtern würde.
5.3
Ausblick
In meiner Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich Dictyostelium als Modell zur Untersuchung
der Interaktionen zwischen Wirt mit intrazellulären Pathogenen und Symbionten eignet. In
Zukunft könnten durch Interaktionsstudien in ein und demselben Wirtssystem mit weiteren
intrazellulären Pathogenen und anderen Symbionten allgemeine Strategien untersucht werden,
die beiden Arten der Interaktion zu Grunde liegen. Neben der Untersuchung bakterieller
Faktoren, könnten auch Wirtszellfaktoren betrachtet werden, die wichtig für die Etablierung
einer Infektion sind. Hierzu könnten Invasionsstudien in verschiedenen bereits existierenden
Mutanten von D. discoideum mit Pathogenen und Symbionten durchgeführt werden.
Anhand der Invasionsstudien konnte gezeigt werden, dass sich D. discoideum eignet, um eine
Infektion von Legionellen und Mykobakterien zu untersuchen. Im Gegensatz zu legionelleninfizierten Dictyostelien, ist während einer Infektion mit Mykobakterien über 48 h nrampRNA nachzuweisen. Um den Einfluss von Eisen auf eine Infektion zu verstehen, könnten
Invasionsassays mit Legionellen und Mykobakterien unter Zugabe von Eisen bzw. Eisenchelatoren gemacht werden.
Mit Hilfe des D. discoideum Microarrays konnten zahlreiche Gene identifiziert werden, die
während einer Infektion mit L. pneumophila eine Rolle spielen. In weiteren Versuchen
können diese Gene und Proteine näher untersucht werden. Es sollte kontrolliert werden, ob
sich die Proteinkonzentration in gleichem Maße ändert wie die mRNA-Konzentration des
dazugehörigen Gens. Findet man ein interessantes Protein, könnte sein Gen deletiert bzw.
Diskussion
129
überexrimiert werden. Anhand von Invasionsassays kann die Auswirkung auf die Infektion
untersucht werden. Für genauere Aussagen zur Genexpression in Dictyostelium wird ein
neuer Chip entworfen, der zusätzlich die Gene trägt, die durch das inzwischen abgeschlossene
Sequenzierprojekt identifiziert wurden. Des Weiteren wird in Zukunft das Suchen nach
Homologien wesentlich vereinfacht, da die Genome von immer mehr Organismen komplett
sequenziert werden.
Das Mip-Protein von Legionellen ist in der Lage an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen besonders an Collagen IV zu binden. Die Bindung an Collagen IV und die
Aktivierung einer Serinprotease ermöglicht es Legionellen durch die Barriere aus Epithelzellen und ihrer extrazellulären Matrix zu gelangen. In weiteren Versuchen sollte getestet
werden, ob es sich um eine Wirtszell- oder eine bakterielle Serinprotease handelt. Ebenso
sollte die Serinprotease näher charakterisiert werden. Zur Untermauerung der Hypothese
sollten Infektionen im Meerschweinchenmodell durchgeführt werden. Bisher konnte gezeigt
werden, dass das intrazelluläre Überleben der mip-negativen Mutante L. pneumophila PhilI
JR32 im Tiermodell deutlich reduziert ist (Köhler et al., 2003). Es sollte nun aber auch
untersucht werden, ob mip-negative Legionellen vermindert in das Lungengewebe eindringen
können. Hierzu sollten Meerschweinchen zum einen mit wildtypischen L. pneumophila und
zum anderen mit mip-Mutanten infiziert werden. Ein histologischer Vergleich der
Meerschweinchenlungen würde Aufschlüsse über die Invasionsfähigkeit des L. pneumophila
WT und der mip-Mutante in vivo aufzeigen.
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67-75
Anhang
139
7 Anhang
7.1
Abkürzungen
Abb.
ACES
ad
AX
BCYE
bp
bzw.
ca.
°C
CFU
cm
DEPC
dest.
DMSO
DNA
EDTA
EST
et al.
etc.
EtOH
evtl.
FCS
FISH
FLUOS
g
Gal/GalNAc
h
IPTG
kb
kDa
LB
LPS
Lsg.
min
ml
µl
µm
M
MG
MOI
mRNA
mV
NK
OADC
OD
Abbildung
N-2-Acetoamido-2-aminomethansulfonsäure
auffüllen auf
axenisch
buffered charcoal yeast extract
Basenpaare
beziehungsweise
circa
Grad Celsius
„colony forming units“, koloniebildende Einheiten
Zentimeter
Diethyl-Pyrocarbonat
destilliert
Dimethylsulfonamid
desoxyribonucleic acid
Ethylendiamintetraacetat
expressed sequence tag
et altera (= und andere)
et cetera
Ethanol
eventuell
fetal calf serum
fluoreszierende in situ Hybridisierung
Fluorescein
Gramm
Galaktose-N-acetyl-Galaktosamin
hour(s)
Isopropyl-β-D-Thiolgalactopyranosid
Kilobasen
Kilodalton
Luria Bertani
Lipopolysaccharide
Lösung
Minute(n)
Milliliter
Mikroliter
Mikrometer
Molar
Molekulargewicht
multiplicity of infection
messenger ribonucleic acid
Millivolt
Negativkontrolle
oleic acid-albumin-dextrose complex
optische Dichte
Anhang
PBS
PFA
(p)ppGpp
RNA
rpm
rRNA
RT
SDS
sp.
spp.
t
Tab.
TAE
Tris
TU
u. a.
U
ÜN
v. a.
VBNC
Vol.
WT
X-Gal
z. B.
140
phosphate buffered saline
Paraformaldehyd
(Guanosin-3`,5`-bis-diphosphat)
ribonucleic acid
rounds per minute
ribosomal ribonucleic acid
Raumtemperatur
sodium dodecyl sulfate
Spezies (Einzahl)
Spezies (Mehrzahl)
time
Tabelle
Tris-Acetat-EDTA
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Technische Universität
unter anderem
Units
über Nacht
vor allem
viable but nonculturable
Volumen
Wildtyp
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucosid
zum Beispiel
Anhang
7.2
141
Publikationen
Wagner C, Khan S, Kamphausen T, Fischer G, Hacker J, Steinert M. (2004) Collagen
binding of Mip enables Legionella pneumophila to transmigrate through the lung epithelial
barrier. EMBO in Revision
Farbrother P, Steinert M, Wagner C, Morio T, Urushihara H, Tanaka Y, Schleicher M,
Eichinger L. Dictyostelium transcriptional host cell response upon infection with Legionella.
In Vorbereitung
Peracino B, Wagner C, Balest A, Balbo A, Pergolizzi B, Ceccarelli A, Noegel A, Steinert
M, Bozzaro S. The Dictyostelium homologue of Nramp1 is required for efficient
phagocytosis and resistance to pathogenic bacteria. In Vorbereitung
Skriwan C, Fajardo M, Hägele S, Horn M, Wagner M, Michel R, Krohne G, Schleicher
M, Hacker J, Steinert M. (2002) Various bacterial pathogens and symbionts infect the
amoeba Dictyostelium discoideum. Int J Med Microbiol 291: 615-24
Heuner K, Dietrich C, Skriwan C, Steinert M, Hacker J. (2002) Influence of the
alternative s 28 factor on virulence and flagellum expression of L. pneumophila. Infect Immun
70: 1604-08.
7.3
Übersichtsartikel und Tagungsbeiträge
Steinert M, Hägele S, Skriwan C, Grimm D, Köhler R, Ludwig W, Schleicher M,
Hacker J. (2000) Interaction of Legionella pneumophila with Dictyostelium discoideum and
other host organisms. 5th International Conference on Legionella, Ulm, Deutschland,
September 2000.
Wagner C, Khan S, Köhler R, Kamphausen T, Fischer G, Hilgenfeld R, Hacker J,
Steinert M. (2003) Functional analysis of the Legionella pneumophila Mip-Protein.
55. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), Dresden,
Deutschland, September 2003.
Steinert M, Fajardo M, Wagner C, Heuner K, Hacker J. (2003) Dictyostelium
discoideum: a new model system for pathogen and symbiont interactions. Nova Acta
Leopoldina 33: 79-84
Steinert M, Wagner C, Khan S, Köhler R, Kamphausen T, Fischer G, Hacker J. (2004)
Functional analysis of the collagen binding Mip-Protein of Legionella pneumophila. 56.
Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), Münster,
Deutschland, September 2004.
Anhang
7.4
142
Lebenslauf
Name
Carina Wagner (geb. Skriwan)
Anschrift
Friedenstrasse 46
97072 Würzburg
geboren am
17.01.1974 in Würzburg
Familienstand
verheiratet, eine Tochter
Ehemann
Bartosz Wagner, Diplom Informatiker
Schulausbildung
1980 bis 1993 Steinbachtal-Grundschule und St. Ursula
Gymnasium in Würzburg
Berufsausbildung
1993 bis 1995 Ausbildung zur Medizinisch-technischen
Assistentin an der Staatl. MTA Schule in Würzburg mit
Examen im Oktober 1995
Akademischer Werdegang
Studium
1995 bis 2000 Studium der Biologie an der Bayerischen
Julius-Maximilians-Universität in Würzburg. Diplom im
September 2000 mit den Schwerpunkten Mikrobiologie,
Tierphysiologie und Biochemie.
Diplomarbeit
„Dictyostelium discoideum als Wirtsmodell für intrazelluläre Pathogene“.
Am Institut für molekulare Infektionsbiologie in Würzburg
bei Prof. J. Hacker von Januar 2000 bis September 2000.
Promotion
2000 bis 2004 (Mutterschutz und Elternzeit Okt. 2002 –
April 2003) am Institut für molekulare Infektionsbiologie