Aus dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen
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Aus dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover ________________________________________________________________ Untersuchung der murinen, pulmonalen Infektion mit Listeria monocytogenes im Hinblick auf eine mögliche Eignung des Bakteriums als Vektor für die somatische Gentherapie der Cystischen Fibrose INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Antje Munder aus Remscheid Hannover 2003 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H.J. Hedrich 1. Gutachter: 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.J. Hedrich Univ.-Prof. Dr. G. Herrler Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2003 Die Dissertation wurde aus Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft, He1058/2-3, gefördert und erhielt finanzielle Unterstützung der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig, an der ein Teil der experimentellen Arbeit durchgeführt wurde. Für meine Familie und im Andenken an meinen Sohn Lennard INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 13 2 LITERATURÜBERSICHT 15 2.1 Cystische Fibrose (CF) 15 2.1.1 Pathogenese der pulmonalen Erkrankung der CF 17 2.1.2 CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) 18 2.1.3 Murines Cftr 20 2.2 Mausmodelle für die CF 21 2.3 Ansätze zur Gentherapie der CF 25 2.3.1 Die Lunge als Zielorgan der Gentherapie für die CF 25 2.3.2 Vektormodelle für die Gentherapie der CF 27 2.3.3 Virale Vektoren 29 2.3.3.1 Adenoviren 30 2.3.3.2 Adenoassoziierte Viren 31 2.3.3.3 Retroviren 32 2.3.4 Nicht-virale Vektoren 33 2.3.4.1 Kationische Liposomen 35 2.3.4.2 Kationische Polymere 35 2.3.4.3 Nackte Plasmid-DNA 36 2.4 Bakterien in der Gentherapie 37 2.4.1 Salmonella typhimurium 39 2.4.2 Salmonella typhi 41 2.4.3 Shigella flexneri 42 2.4.4 Escherichia coli 42 2.5 Listeria 43 2.5.1 Infektionszyklus und Virulenzfaktoren von L. monocytogenes 44 2.5.2 Listeriose 49 2.5.3 Attenuierte Mutanten von L. monocytogenes 52 2.5.4 L. monocytogenes-vermittelter Gentransfer 53 2.6 Murine Suszeptibilität gegenüber Infektionserregern 56 2.6.1 BALB/c 56 2.6.2 DBA/2J 56 2.6.3 C57BL/6 57 2.6.4 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes 58 3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 62 3.1 Material 62 3.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 62 3.1.2 Geräte und Laborgegenstände 67 3.1.3 Versuchstiere 69 3.1.3.1 Mäuse 69 3.1.3.2 Haltung der Mäuse 69 3.1.3.3 Kaninchen 70 3.1.4 L. monocytogenes-Stämme 72 3.1.5 Kulturmedien 72 3.2 Methoden 73 3.2.1 Herstellen der Inokulationssuspension 73 3.2.1.1 Titration einer Wachstumskurve von L. monocytogenes 75 3.2.2 Narkose der Versuchstiere 76 3.2.3 Applikationsmethoden 76 3.2.3.1 Intratracheale (i.t.) Applikation 76 3.2.3.2 Blinde Instillation 77 3.2.3.3 Tracheotomie 77 3.2.3.4 Nasale Applikation 77 3.2.3.5 Intragastrische (i.g.) Applikation 77 3.2.4 Messung der Rektaltemperatur 78 3.2.5 Messung des Körpergewichts (KGW) 79 3.2.6 Beurteilung des Allgemeinzustandes 79 3.2.7 Versuchsaufbau 82 3.2.7.1 Methodischer Vergleich von Applikationstechniken 84 3.2.7.2 Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge nach i.t. Infektion 84 3.2.7.3 Vergleich von i.g. und i.t. Listerieninfektion 85 3.2.7.4 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes EGD wt 86 3.2.7.5 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP 3.2.7.6 87 Dosis-Zeit-Beziehungen der i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP 87 3.2.7.7 Frühe Organdissemination 88 3.2.7.8 Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von L. monocytogenes EGD wt in der Lunge nach i.t. Applikation 88 3.2.8 Sektion und Organentnahme 89 3.2.9 Keimzahlbestimmung in den Organen 90 3.2.10 Histologie 91 3.2.10.1 Paraffinschnitte 91 3.2.10.2 Gefrierschnitte 92 3.2.10.3 Präparation für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) 93 3.2.10.4 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 93 3.2.11 Mikroskopie 95 3.2.11.1 Lichtmikroskopie 95 3.2.11.2 Fluoreszenzmikroskopie und konfokale Lasermikroskopie 96 3.2.11.3 REM 98 3.2.11.4 TEM 99 3.2.12 Statistische Auswertung 100 4 ERGEBNISSE 4.1 Methodischer Vergleich von Applikationstechniken für die Lunge 101 101 4.2 Rechts-Links-Verteilung in der Lunge nach i.t. Instillation 106 4.3 Vergleich von i.g. und i.t. Listerieninfektion 4.4 Suszeptibilität der Maustämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6 für die i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD 4.5 111 Suszeptibilität für L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP 4.6 108 119 Dosis-Zeit-Beziehungen der i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP 122 4.7 Frühe Organdissemination 126 4.8 Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von L. monocytogenes EGD wt in der Lunge nach i.t. Applikation 129 4.9 Histologische Beurteilung 131 4.9.1 Gramfärbungen 131 4.9.2 Fluoreszenzmikroskopie 132 4.9.3 Konfokale Lasermikroskopie 137 4.9.4 REM 141 4.9.5 TEM 142 5 DISKUSSION 150 5.1 Das intratracheale Infektionsmodell 151 5.1.1 Die i.t. sichtkontrollierte Instillation 151 5.1.2 Die Verteilung der Listerien in der Lunge nach i.t. Instillation 155 5.2 Vergleich der Keimsituation in der Lunge nach i.g. und i.t. Infektion 5.3 Suszeptibilität von BALB/c-, DBA/2- und C57BL/6-Mäusen 157 gegen L. monocytogenes EGD wt und L. monocytogenes EGD hlyW491 A + pERL3-CMVGFP 5.4 159 Infektionsverlauf und Pathogenität des attenuierten Stamms L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3CMVGFP nach i.t. Infektion in der Maus 5.5 162 Frühe Ausbreitung der attenuierten Listerien nach i.t. Infektion 165 5.6 Die histologischen Befunde der i.t. Listerieninfektion 166 5.6.1 Pathohistologische Veränderungen des Lungengewebes 167 5.6.2 Der allgemeine Nachweis von Listerien im histologischen Präparat 168 5.6.3 Die Differenzierung intrazellulärer Listerien 169 5.7 Der quantitative Nachweis von Listerien in Epithelzellen der murinen Lunge 171 5.8 Der Versuchsansatz 172 5.9 Ausblick 175 6 ZUSAMMENFASSUNG 176 7 SUMMARY 178 8 LITERATURVERZEICHNIS 180 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS α alpha AAV Adenoassoziierte Viren Abb. Abbildung Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare bzw. beziehungsweise ca. cirka cAMP zyklisches (cyclo-) Adenosinmonophosphat CF Cystische Fibrose CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (human) Cftr Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (murin) cGMP zyklisches (cyclo-) Guaninmonophosphat CH Schweiz CHO Chinese Hamster Ovary cm Zentimeter Cy3 Indocarbocyanin Cy5 Indodicarbocyanin d Tag D Deutschland d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli et al. und andere FITC Fluoreszein-Isothiocyanat γ gamma GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung GenTG Gentechnikgesetz GenTSV Gentechniksicherheitsverordnung GFP grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein) gg. gegen h Stunde HE Hämatoxylin-Eosin hly Listeriolysin-Gen i.d.R. in der Regel IE Internationale Einheit i.g. intragastrisch IL Interleukin i.n. intranasal INF Interferon Inl Internalin i.p. intraperitoneal i.t. intratracheal i.v. intravenös IVC einzeln ventilierter Käfig (individually ventilated cage) Kap. Kapitel KBE koloniebildende Einheiten kbp Kilobasenpaare kDa Kilodalton KGW Körpergewicht l Liter LD50 Letale Dosis von 50% für der Versuchstiere LLO Listeriolysin L. monocytogenes Listeria monocytogenes L.m. Listeria monocytogenes µg Mikrogramm µl Mikroliter MHC Haupthistokompatibilitätskomplex min Minuten mind. mindestens mm Millimeter mmol Millimol mRNA Boten (messenger) Ribonukleinsäure NL Niederlande nm Nanometer OD optische Dichte PBS Phosphat gepufferte Salzlösung PD Potentialdifferenz p.i. post infectionem rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) REM Rasterelektronenmikroskopie RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur s Sekunden s. siehe s.c. subkutan SF Standardfehler S. typhi Salmonella typhi S. typhimurium Salmonella typhimurium S. flexneri Shigella flexneri S2 Sicherheitsstufe 2 nach GenTG TEM Transmissionselektronenmikroskopie TNF Tumornekrosefaktor u.U. unter Umständen v.a. vor allem vgl. vergleiche wt Wildtyp z.B. zum Beispiel ZTL Zentrales Tierlabor Einleitung 1 13 EINLEITUNG Bei der Cystischen Fibrose handelt es sich um eine schwere monogene Erbkrankheit, der häufigsten in der kaukasischen Bevölkerung. Trotz Fortschritten in der Therapie und einer Verlängerung der Lebenszeit der Patienten bis ins Erwachsenenalter ist die Krankheit bis heute unheilbar. Als Ende der 80er Jahre erste Ansätze für Gentherapien geschaffen wurden, stand die CF aufgrund der Häufigkeit ihres Auftretens und der Schwere der Erkrankung immer im Fokus einer solchen Therapie. Anfänglich große Hoffnungen in schnelle Heilungsmöglichkeiten durch Gentherapie haben sich bisher nicht erfüllt, obwohl zwischenzeitlich zahlreiche potentielle Genvektoren untersucht wurden. Als virale Vektoren dienten Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren. Bei den nicht-viralen Vektoren wurden nackte DNA, Liposomen und Molekularkonjugate untersucht. Neben in vivo Experimenten wurden seit 1993 auch klinische Studien durchgeführt, die Ergebnisse blieben jedoch bis heute unbefriedigend. Neben einer mangelnden Effizienz der Transfektion, die auch durch eine nur kurze Expression des transfizierten Gens ausgedrückt wurde, traten Probleme wie die vektorinduzierte Immunantwort des Wirtes und mangelnder Zielzelltropismus der Vektoren auf. Außer einer Verbesserung der vorhandenen Vektoren wurde deshalb auch nach neuartigen Gentransfersystemen gesucht. Da Bakterien zur DNA-Vakzinierung bereits erfolgreich eingesetzt wurden, fokussierte man nun das Interesse auf ihre mögliche Eignung als Genfähren (WEISS u. KRUSCH, 2001). Nach Erfolg versprechenden in vitro Studien (KRUSCH et al., 2002) untersucht die vorliegende Arbeit das grampositive Bakterium Listeria (L.) monocytogenes nun in vivo auf seine Eignung als Vektor für eine somatische Gentherapie. Es wurden dabei der Wildtypstamm L. monocytogenes EGD und ein attenuierter Listerienstamm, der in vitro gute Transfektionsergebnisse zeigte, verglichen. Als Tiermodell diente die Maus, wobei etablierte Mausinzuchtstämme verwendet wurden, auf deren genetischem Hintergrund im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover gentechnisch modifizierte CF-Mäuse gezüchtet werden. 14 Einleitung Die Arbeit konzentriert sich besonders auf die Fragestellung, ob L. monocytogenes nach topischer Applikation in die Lunge der Maus intrazellulär nachgewiesen werden kann und wenn ja, in welchen Zellen. Um diese Problemstellung bearbeiten zu können, wurde zunächst ein intratracheales Infektionsmodell entwickelt (MUNDER et al., 2002) und die experimentelle pulmonale Listerieninfektion der Mäuse durch verschiedene Dosis-Zeitbeziehungen charakterisiert. Neben der Beschreibung des Infektionsverlaufs durch die Parameter Organkeimzahlen, Allgemeinbefinden, Körpergewicht und Rektaltemperatur wurden mit verschiedenen histologischen Techniken Präparate Listerien-infizierter Lungen angefertigt, die unter den Kriterien Entzündungsreaktionen der Lunge und Dichte und Lokalisation der Keime im Lungengewebe beurteilt wurden. Literaturübersicht 15 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Cystische Fibrose (CF) Bei der CF handelt es sich um eine monogene autosomal rezessiv vererbte Funktionsstörung, die durch eine generalisierte Dysfunktion exokriner Drüsen bedingt wird. Mit einer Frequenz von einem heterozygoten Träger auf ca. 20 Menschen ist die CF die häufigste schwere Stoffwechselerkrankung der kaukasischen Rasse. Die Inzidenz der klinischen Erkrankung liegt bei etwa einem Krankheitsfall auf 2500 Geburten (DAVIS et al., 1996). Die Krankheit wurde bereits 1938 beschrieben und erhielt ihren Namen aufgrund der beobachteten cystischen Pankreasfibrose (ANDERSEN, 1938). In den frühen 80er Jahren wurde der pathophysiologische Defekt der CF als Fehlregulation eines cAMP-gesteuerten Chlorid (Cl)-Kanals definiert (KNOWLES et al., 1981; KNOWLES et al., 1983), 1985 wurde der Defekt auf Chromosom 7 lokalisiert (TSUI et al., 1985). 1989 wurde schließlich das verantwortliche Gen identifiziert (KEREM et al., 1989; RIORDAN et al., 1989; ROMMENS et al., 1989) und sein Produkt als Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator krankheitsauslösende (CFTR) Mutationen bezeichnet. identifiziert Seither (CYSTIC wurden FIBROSIS über 1000 GENETIC ANALYSIS CONSORTIUM, 2003), von denen mit annähernd 70 % die häufigste die F508del ist. Es handelt sich dabei um eine In-frame-Deletion, die den Verlust der Aminosäure Phenylalanin an Position 508 verursacht (DAVIS et al., 1996). Von den übrigen Mutationen kommen nur noch G542X, G551D, W1282X, N1303K und R553X in > 1% der Krankheitsfälle vor (CYSTIC FIBROSIS FOUNDATION, 2003; GALLATI, 2001). Die Mutationen bedingen das Fehlen oder eine Fehlfunktion bzw. Verlagerung des cAMP-gesteuerten CFTR-Kanals, was eine eingeschränkte ClLeitfähigkeit der Zellmembran und damit den gestörten transepithelialen Elektrolytund Flüssigkeitstransport zur Folge hat. Mit dem Wissen über die genetischen Grundlagen der CF begann auch die Suche nach neuen, kausalen Therapieansätzen, wie z.B. der somatischen Gentherapie. 16 Literaturübersicht Gleichzeitig wurde durch die Verbesserung konventioneller und Einführung neuer symptomatischer Therapien und ein verbessertes Krankheitsmanagement die Lebenserwartung der CF-Patienten deutlich erhöht (DAVIS et al., 1996). In Europa lag der Überlebensmedian 1940 bei einem Jahr, 1960 bei 10 Jahren, 1997 bei 32 Jahren (in Deutschland bei 29,6 Jahren, HAUBER et al., 2001). Neuere Zahlen belegen einen weiteren Anstieg der Lebenserwartung (CYSTIC FIBROSIS FOUNDATION, 2003; HAUBER et al., 2001). Die Diagnose CF wird gestellt, wenn bei einem Patienten die Cl-Konzentration im Schweiß > 60 mmol/l liegt und gleichzeitig eine chronische pulmonale Erkrankung oder eine Pankreasinsuffizienz oder beides vorliegt oder ein CF-Fall in der nahen Verwandtschaft bekannt ist (EICHLER et al., 2001; ROSENSTEIN u. CUTTING, 1998). Ein abnormer SchweißTest stellt zusammen mit Lungen- und Pankreas-Erkrankung die „diagnostische Trias“ der klassischen CF dar (DAVIS u. DI SANT'AGNESE, 1984). Es gibt jedoch atypische Formen, die nur durch eines dieser Merkmale charakterisiert sein können (DAVIS et al., 1996; DAVIS et al., 1980). Eine Genotypisierung, wie sie für die häufigsten Mutationen möglich ist, kann die Diagnose ebenso absichern, wie die Messung der nasalen, transepithelialen Potentialdifferenz (PD) oder die Messung der Cl-Leitfähigkeit einer Rektumbiopsie (Intestinal Current Measurement) (DEQUEKER et al., 2000; KNOWLES et al., 1981). Da es sich bei der CF um eine systemische Veränderung der sezernierenden Zellen aller exokrinen Drüsen handelt, sind sowohl Respirations- und Gastrointestinaltrakt als auch exokrines Pankreas, hepatobiliäres System und die Fortpflanzungsorgane betroffen. Im Vordergrund der CF stehen aber die pulmonalen und gastrointestinalen Symptome, wobei meistens die pulmonale Erkrankung prägend für den Krankheitsverlauf ist, da sie die Todesursache von über 90% der Patienten darstellt (DAVIS et al., 1996). Symptome der pulmonalen Erkrankung der CF sind die Verlegung der Atemwege durch zähen Schleim, chronische bakterielle Infektionen, Entzündungsreaktionen, wie Bronchitis, Peribronchitis und Pneumonie und schließlich der Verlust der Lungenfunktion (EICHLER et al., 2001; PSCHYREMBEL, 1993; ROBINSON, 2001). Da die Lunge das Zielorgan der somatischen Gentherapie darstellt, soll im Folgenden die Entwicklung der pulmonalen Erkrankung der CF kurz umrissen werden. Literaturübersicht 2.1.1 17 Pathogenese der pulmonalen Erkrankung der CF Obwohl die Erkrankung der Lunge die Ursache der Mortalität in den meisten CFFällen darstellt, werden intrauterin bzw. kurz nach der Geburt noch keine pathologischen Auffälligkeiten festgestellt (STURGESS u. IMRIE, 1982; ARMSTRONG et al., 1995). Die Aufweitung der Ausführungsgänge der submukösen Drüsen durch Hypersekretion und Sekretansammlung tritt als erster histopathologischer Befund noch vor Infektionen der Atemwege auf. Auch ohne infektiöse Stimuli kommt es im Respirationstrakt zu Entzündungsreaktionen (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999; ZAHM et al., 1997). Die Drüsenzellen der submukösen Drüsen besitzen mehr CFTR-mRNA als die Epithelzellen (KALIN et al., 1999; AEBI et al., 2001), so dass in diesen Drüsen bereits im frühen Krankheitsstadium Veränderungen durch das Fehlen oder die Dysfunktion des CFTR-Kanals nachgewiesen werden. Der eingeschränkte Transport von Cl-Ionen und Flüssigkeit führt zur Sekreteindickung und damit zur Störung der mukoziliären Clearance. Diese Clearance bezeichnet den Abtransport von Bronchialsekret und inhalierten Partikeln durch das zilientragende respiratorische Epithel und ist neben dem Husten der wichtigste Selbstreinigungsmechanismus der Lunge. Die pathophysiologischen Verhältnisse in der CF-Lunge begünstigen die bakterielle Kolonisation, die mukoziliäre Clearance wird weiter beeinträchtigt, und es kommt zu erneuten Infektionen (Abb. 1). Die beschriebene Schwächung der mechanischen Abwehr des Respirationstraktes hat die Besiedlung mit vorwiegend opportunistischen Keimen eines erstaunlicherweise kleinen Spektrums zur Folge: Staphylococcus aureus, nicht bekapselte Haemophilus influenzae, mukoide Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia und Stenotrophomonas maltophilia (TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999; RATJEN u. DÖRING, 2003; GOVAN u. DERETIC, 1996). Als natürlicher Bewohner der Nasenschleimhaut verursacht Staphylococcus aureus oft die ersten Infektionen der CF-Lunge im frühen Kindesalter und ist durch ansteigende Antibiotikaresistenzen zunehmend schwer zu bekämpfen (DAVIS et al., 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). 18 Literaturübersicht Später im Krankheitsverlauf kommt es zur Besiedlung mit Pseudomonas aeruginosa (GOVAN u. DERETIC, 1996). Da Pseudomonas aeruginosa chemotherapeutisch kaum zu eliminieren ist, wird dabei häufig die lebenslange Kolonisation durch einen einzigen Klon des Erregers beobachtet (GOVAN u. DERETIC, 1996; ROMLING et al., 1994; TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Infektionen mit Burkholderia cepacia werden nur bei wenigen heranwachsenden oder erwachsenen CF-Patienten gefunden, wobei chronische Infektionen in etwa einem Drittel der Fälle zu einer dramatischen Verschlechterung des Krankheitsverlaufs führen. Abb. 1: Pathophysiologische Kaskade der pulmonalen Erkrankung der CF (nach DAVIS et al., 1996). Erläuterung im Text. 2.1.2 CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) 1989 wurde auf Chromosom 7 an Position q31 das 250 kbp große und 27 Exone umfassende CFTR-Gen identifiziert (BUCHWALD et al., 1989; KEREM et al., 1989; ROMMENS et al., 1989; RIORDAN et al., 1989). Das Produkt des CFTR-Gens stellt einen aus 1480 Aminosäuren bestehenden, apikalen Kanal dar, der durch cAMP Literaturübersicht 19 reguliert wird (ANDERSON et al., 1991c, BEAR et al., 1991; FRIZZELL, 1995). Strukturell kann das Protein als funktionelles Dimer angesehen werden (Abb. 2), wobei jede Hälfte eine membranumfassende Domäne (MSD1, MSD2) aus jeweils sechs transmembranen Segmenten (Abb.2, als graue Zylinder dargestellt) und eine ATP-spaltende Nukleotid-bindende Domäne (NBD1, NBD2) besitzt, die Sequenzhomologien zur sogenannten ATP-binding Cassette (ABC) aufweisen (SHEPPARD u. WELSH, 1999; AKABAS, 2000; DEVIDAS u. GUGGINO, 1997; RIORDAN, 1993; RIORDAN et al., 1989). Wegen der Anordnung seiner äußeren hydrophoben transmembranen und inneren hydrophilen Domänen wird CFTR zur Superfamilie der ABC-Transporter gezählt. Die hydrophilen NBDs sind hoch konserviert und werden auch als Walker A- und Walker B-Motive, die bei CFTR funktionell nicht äquivalent sind, bezeichnet. Zwischen den beiden MSD/NBDMotiven befindet sich eine große Domäne mit vielen geladenen Aminosäureresten, die von Exon 13 kodiert wird und die man als regulatorische oder R-Domäne bezeichnet. Die R-Domäne besitzt zahlreiche Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase A (PKA, Abb. 2) und Proteinkinase C und eine cGMP-abhängige Proteinkinase. Von den Funktionen der CFTR-Domänen bestehen heute folgende Vorstellungen (ANDERSON et al., 1991a; ANDERSON et al., 1991b; FRIZZELL, 1995; HWANG et al., 1994; RICH et al., 1991; SHEPPARD et al., 1993): 1. Die MSD-Domänen bilden die Cl-selektive Membranpore des Kanals. 2. Die Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase A bedingt eine Phosphorylierung der R-Domäne und damit eine Öffnung des Kanals. 3. Die Dephosphorylierung durch Spaltung von energiereichen Nukleosidtriphosphaten, wie ATP, an den NBD-Domänen schließt den Kanal. Öffnen und Schließen des CFTR-Kanals ist eng an das Gleichgewicht der Aktivität von Proteinkinasen und Phosphatasen und an die intrazellulären ATP-Spiegel gekoppelt. Cl-Ionen strömen passiv entlang des zwischen Innen- und Außenseite der Zellmembran bestehenden elektrochemischen Gradienten durch den CFTRKanal. Die Kontrolle des Ionenflusses erfolgt durch den Öffnungszustand des Kanals. Neben seiner Funktion als Cl-Kanal reguliert CFTR weitere Ionenkanäle und Transportproteine (AKABAS, 2000). Es ist bisher noch unklar, ob diese 20 Literaturübersicht Regulationsmechanismen direkt oder indirekt durch andere Proteine vermittelt werden. Obwohl heute eine recht genaue Vorstellung von CFTR als Cl-Kanal in seiner Struktur und Funktion existiert, bedarf vor allem das Zusammenspiel von CFTR mit anderen Kanälen - und damit auch zellulärer Regulationsmechanismen epithelialer Transportvorgänge und deren Pathophysiologie - weiterer Untersuchung. Abb. 2: Struktur der Domänen des CFTR-Proteins (nach SHEPPARD u. WELSH, 1999). CFTR besitzt eine symmetrische Struktur mit fünf Untereinheiten: Zwei transmembrane Domänen (MSD1, MSD2), die ihrerseits aus je sechs, die Plasmamembran durchdringenden Segmenten bestehen; NBD1 und NBD2, die als Nukleotid-bindende Domänen jeweils auf die transmembranen Domänen folgen; die regulatorische Domäne R und PKA als cAMPabhängige Proteinkinase. 2.1.2 Murines Cftr 1991 wurden Klonierung und Sequenzierung des dem humanen CFTR-Gen entsprechenden murinen Gens Cftr von TATA et al. (1991) und YORIFUJI et al. (1991) beschrieben. Die cDNA der Maus hatte dabei eine Länge von über 6,3 kbp (vgl. Mensch: 6,5 kbp, RIORDAN et al., 1989) und codierte für ein 1476 Aminosäuren großes Protein (vgl. Mensch: 1480 Aminosäuren, Kap. 2.1.2). Humanes und murines CFTR sind in über 78% ihrer Aminosäurensequenzen homolog. Die Sequenzen der transmembranen Domänen und der Nukleotid-bindenden Domänen entsprechen sich Literaturübersicht 21 sogar in über 80% (TATA et al., 1991; YORIFUJI et al., 1991). Auch Bereiche, in denen beim Menschen Deletionsmutationen gefunden wurden, wurden bei der Maus übereinstimmend beschrieben. Besondere Bedeutung kommt hier der Aminosäure Phenylalanin an Position 508 zu, der die häufigste menschliche Mutation F508del zugrunde liegt (KELLEY et al., 1992; TATA et al., 1991; YORIFUJI et al., 1991). Murines Cftr wird in Darm, Lunge, Magen, Nieren und Speicheldrüsen exprimiert, im Gegensatz zum humanen CFTR jedoch nur in geringem Maße in Leber und Pankreas (KELLEY et al., 1992). Der Genort des murinen Cftr lokalisiert zentromernah auf Chromosom 6 in einem konservativen Chromosomensegment, welches seine Entsprechung, einschließlich benachbarter Gene, beim Menschen auf Chromosom 7 findet (KELLEY et al., 1992; SIEGEL et al., 1992). Da bei der Maus keine spontanen Mutationen des Cftr-Gens bekannt sind, wurden durch zielgerichtete Mutagenese verschiedene Mausmodelle für die cystische Fibrose generiert (Kap. 2.2). 2.2 Mausmodelle für die CF Seit der Klonierung und Sequenzierung des murinen Cftr-Gens (s. Kap. 2.1.2) sind durch zielgerichtete Mutagenese zahlreiche Cftr-Mausmodelle entstanden (s. Tab. 1; GRUBB u. BOUCHER, 1999). Die meisten dieser Mutanten zeigen als Homozygote massive pathologische Veränderungen des Gastrointestinaltrakts und eine dadurch bedingte, stark verkürzte Lebensdauer (SNOUWAERT et al., 1995; TEBBUTT, 1995). Die bei der humanen cystischen Fibrose häufig dominierende pulmonale Erkrankung (s. Kap. 2.1.1) wird bei den wenigsten CF-Modellen beschrieben. Der Grund liegt wahrscheinlich in der geringen Lebenserwartung der Mäuse oder in ihrer Fähigkeit, alternative Cl-Kanäle im respiratorischen Epithel zu nutzen (KENT et al., 1997; LARBIG et al., 2002; SNOUWAERT et al., 1992; SNOUWAERT et al., 1995; TEBBUTT, 1995). Tabelle 1 stellt einige wichtige Mausmodelle der cystischen Fibrose vor. 22 Literaturübersicht Tab. 1: Übersicht einiger Mausmodelle der CF mit Beschreibung der Mutationen und der bestimmenden Organpathologie. Stamm Art der Phänotyp bzw. Pathologie Mutation Cftrtm1Unc Stammbeschreibung In-frame- • deutlich verkürzte Lebensdauer SNOUWAERT et Stopcodon • Wachstumshemmung und vermindertes al., 1995 in Exon 10 (Knockout) KGW • ungestörte Fertilität • überwiegend Darmpathologie (Ileus) • kaum Lungenpathologie Cftrtm1Cam In-frame- • deutlich verkürzte Lebensdauer RATCLIFF et al., Stopcodon • Wachstumshemmung und vermindertes 1993 in Exon 10 (Knockout) KGW • überwiegend Darmpathologie • kaum Lungenpathologie (kein Cftr in der Trachea bei Tieren < 30 g nachweisbar, Tiere > 30 g normale Level) Cftrtm1Bay Duplikation • verkürzte Lebensdauer O'NEAL in Exon 3 • Wachstumshemmung 1993 (Knockin) • überwiegend Darmpathologie (Ileus) et al., • Keine Funktionsstörung von Leber, Respirationstrakt oder Gonaden • Störungen der PD in Darm und Trachea CftrTgHm1G551D G551D (homologe Rekombination) • Lebensdauer: 70% überleben Absatzalter DELANEY et al., • Wachstumshemmung 1996 • Darmpathologie (entspricht G551DPatienten) • Peritonitis, Entzündungen der Gallenblase • ungestörte Fertilität • kaum Lungenpathologie (nasale PD erhöht; Akkumulation eosinen Materials) • Mutanten besitzen etwa 4% Wildtyp-Cftr Literaturübersicht 23 Es wurden eine Reihe weiterer CF-Mutanten generiert, darunter auch solche, die die F508del-Mutation tragen (GRUBB u. BOUCHER, 1999). Auch wenn einige dieser beschriebenen Stämme eine schwächere Darmsymptomatik zeigen, weist doch keiner eine pulmonale Erkrankung auf, die der des Menschen vergleichbar wäre. Ein gentechnisch modifizierter Mausstamm mit phenotypisch schwächeren Krankheitssymptomen und v.a. respiratorischen Symptomen ist die Cftrtm1Hgu-Maus (DORIN et al., 1992a; DORIN et al., 1992b). Der Stamm wird seit 1994 im ZTL der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet. In den Infektionsexperimenten der vorliegenden Arbeit wurden die Hintergrundstämme der congenen Stämme der Cftrtm1Hgu-Maus (s. unten) verwendet, deshalb soll diese Mutante hier ausführlicher beschrieben werden. Bei der Knockin-Mutation der Cftrtm1Hgu-Maus handelt es sich um die Insertion des CFTR-Vektors plus eines 3,5 kbp großen HindIII-Fragments in Intron 9 und Exon 10, wodurch es zu einer partiellen Verdopplung der Gensequenzen kommt. Phenotypisch ist die Cftrtm1Hgu-Maus wie folgt charakterisiert: • Lebensdauer: bis auf wenige Ausnahmen erreichen die Mäuse das Absatzalter, 90% ein adultes Alter (DORIN, 1995). • Retardierung von Wachstum und Entwicklung des KGWs wird nicht beobachtet. • Gastrointestinaltrakt: Seltenes Auftreten von Mekoniumileus, geringgradige Dilatation des Dickdarms mit erhöhter Mukusansammlung, Aufweitung von Drüsenzellen v.a. in den Darmkrypten. • Keine Funktionsstörung der Bauchspeicheldrüse oder der Gonaden. • Respirationstrakt: Erhöhung der nasalen PD, erhöhte Spiegel von SurfactantPhospholipiden in der bronchoalveolären Lavage, gestörte mukoziliäre Clearance, teilweise pulmonale Atelektasen, generell aber bei spezifiziertpathogen-freier Haltung keine Lungenaffektionen (BERNHARD et al., 2001; LARBIG et al., 2002) • Bakterielle Suszeptibilität: Nach aerogener Infektion mit Staphylococcus aureus und Burkholderia cepacia zeigten Cftrtm1Hgu-Mäuse im Vergleich zu 24 Literaturübersicht Kontrolltieren eine signifikant höhere Empfänglichkeit (DAVIDSON et al., 1995). • Unterschiede in den Messungen der nasalen und der rektalen PD zu normalen Mäusen weisen auf den elektrophysiologischen Basisdefekt des gestörten Ionentransports hin. Der cAMP-vermittelte Cl-Transport im Darm ist um 30% vermindert, in der Trachea und nasalem Gewebe um 50% (SMITH et al., 1995). Eine molekulare Analyse der Cftrtm1Hgu-Maus ergab, dass die partielle Verdopplung von DNA-Sequenzen, zu der es bei der Insertion des Transgens kommt, offensichtlich zu einem Exon-Skipping und aberrierendem Spleißen führt. Die Tiere sind in der Lage, einen geringen Anteil wildtypischer Cftr-mRNA zu produzieren (DORIN et al., 1994; LARBIG et al., 2002). Die Cftrtm1Hgu-Maus stellt demnach mit ihrer, im Vergleich zu anderen CF-Mäusen, längeren Lebensdauer und den abgeschwächten gastrointestinalen Symptomen, der Störungen in SurfactantHomöostase und mukoziliärer Clearance und der Suszeptibilität gegen CF-typische Infektionserreger ein probates Modell zur Erforschung der CF-Lungenkrankheit dar (BERNHARD et al., 2001; DAVIDSON et al., 1995; DORIN et al., 1994; LARBIG et al., 2002). Da die 1994 in Hannover erhaltenen Founder-Tiere einen segregierenden genetischen Hintergrund (C57BL/6, 129Sv, MF1, DORIN et al., 1992a; LARBIG et al., 2002) besaßen, wurden zunächst vier von diesen Tieren ausgehende Stämme etabliert und ingezüchtet (CF/1 - CF/4). Außerdem wurden durch Rückkreuzen auf die etablierten Inzuchtstämme BALB/c, DBA/2J und C57BL/6J drei Cftrtm1Hgucongene Stämme erzeugt (DORSCH u. HEDRICH, persönliche Mitteilung). Die Integration des Cftrtm1Hgu-Gens in das Cftr-Gen der gezüchteten Tiere wird durch Southernblot-Analysen und die Expression von aberrant und korrekt gespleißtem Cftr durch Realtime-PCR kontrolliert (TÜMMLER, DORSCH u. HEDRICH, persönliche Mitteilung). Literaturübersicht 2.3 25 Ansätze zur Gentherapie der CF Mit dem Fortschritt in der molekulargenetischen Forschung und der daraus resultierenden Option, genetisches Material in Zellen transferieren zu können, eröffneten sich Anfang der neunziger Jahre erstmals Möglichkeiten zur somatischen Gentherapie (COLLINS, 1992). Zur Zeit gibt es weltweit 636 gentherapeutische klinische Studien, unter denen die CF mit derzeit 30 Studien vertreten ist (WILEY, 2003). Die zunächst scheinbar leichte Zugänglichkeit der Atemwege und die durch ihre pulmonale Erkrankung verursachte hohe Morbidität und Mortalität machten die CF zur Modellerkrankung und die Lunge zum Zielorgan der Gentherapie (FLOTTE u. LAUBE, 2001; PILEWSKI, 2002; WEST u. RODMAN, 2001). ANDERSON (1998) unterscheidet drei Ansätze einer somatische Gentherapie: • ex vivo: Körperzellen werden außerhalb des Organismus mit einem Vektor inkubiert, erfolgreich transfizierte Zellen werden wieder in den Organismus eingeschleust (übliche Vorgehensweise für Blutzellen). • in situ: Der Vektor wird direkt in das betroffene Gewebe eingebracht (z. B. bei der Infusion von Adenoviren in Trachea oder Bronchien von CF-Patienten, oder bei der Injektion rekombinanter Tumorzellen, denen das Gen für ein Zytokin oder Toxin transferiert wurde). • in vivo: Vektoren können direkt in den Blutstrom appliziert werden und transfizieren bei Erreichen der Zielzellen die rekombinante Erbinformation (bisher noch nicht realisiert). 2.3.1 Die Lunge als Zielorgan der Gentherapie für die CF Da die respiratorischen Manifestationen den Krankheitsverlauf der CF entscheidend bestimmen, stellt die Lunge das Zielorgan der somatischen Gentherapie dar (ANDERSON, 1998). Auf zellulärer Ebene werden neben den Zilien tragenden Zellen des respiratorischen Epithels auch die serösen Zellen der submukösen Drüsen als Zielzellen für eine funktionelle Korrektur der Elektrolytstörung definiert (BALS et al., 26 Literaturübersicht 2001), da in diesen Zellarten CFTR-Expression nachgewiesen wurde (KALIN et al., 1999). Die Epithelzellen von CF-Patienten besitzen nur begrenzt die Fähigkeit, Cl-Ionen zu sezernieren, absorbieren jedoch in hohem Maße Na+-Ionen und Flüssigkeit (KNOWLES et al., 1995b) und weisen damit alle Merkmale eines gestörten Ionentransports durch CFTR-Mangel auf. In Untersuchungen an Zellkulturen aus einschichtigem, respiratorischen CF-Epithel wurde gezeigt, dass 6 - 10% der Zellen, die funktionelles CFTR exprimieren, ausreichend für eine Korrektur des ClTransports sind (JOHNSON et al., 1992). Um einen Na+-Transport in physiologischer Höhe zu erreichen, mussten adenovirale Vektoren dagegen nahezu 100% der Zellen transfizieren (JOHNSON et al., 1995). Der Grad, der mittels Gentherapie zur Korrektur verschiedener CFTR-Funktionen erreicht werden muss, ist demnach unterschiedlich. Da es sich bei den apikalen Zellen des respiratorischen Epithels um ausdifferenzierte Zellen mit begrenzter Lebensdauer handelt (etwa 120 Tage, WARBURTON et al., 1998), würde selbst eine vollständige Expression funktionellen CFTRs in diesen Zellen den pathophysiologischen Defekt nicht dauerhaft korrigieren. Um langfristig von Nutzen zu sein, müsste der Gentransfer entsprechend wiederholt werden, oder es müssten Stammzellen, wie basale Zellen des mehrschichtigen Epithels der Bronchien, erreicht werden. Besonders hohe CFTR-Level exprimieren die serösen Zellen der submukösen Drüsen (ENGELHARDT et al., 1992; KALIN et al., 1999). Die Hypertrophie dieser Drüsen gehört zu den frühen strukturellen Veränderungen der CF-Lungenkrankheit (STURGESS u. IMRIE, 1982). Der pathologisch veränderte Flüssigkeits- und Ionentransport der Drüsen trägt zur Ansammlung des zähen Schleims bei, der für das Krankheitsbild charakteristisch ist (JIANG et al., 1997; YAMAYA et al., 1991). Da Mäusen die submukösen Drüsen in Bronchien und in Trachea fehlen, zeigen gentechnisch modifizierte Tiere, denen murines Cftr fehlt, deutlich weniger Lungensymptome als CF-Patienten (CLARKE et al., 1992; SNOUWAERT et al., 1995). Dies unterstreicht die Bedeutung der CFTR-Expression der serösen Drüsenzellen des Menschen. Ebenso wie die basalen Vorläuferzellen des Epithels sind auch die Drüsenzellen durch Verzweigungen der Drüsenazini für apikal Literaturübersicht 27 angreifende Vektoren schwer erreichbar. In bisherigen klinischen Studien zum CFGentransfer erfolgte eine topische Applikation des viralen oder nicht-viralen Vektors (BALS et al., 2001). 2.3.2 Vektormodelle für die Gentherapie der CF Mittlerweile ist die anfängliche Euphorie darüber, mit der Gentherapie ein Instrument zur Heilung einer großen Anzahl menschlicher Krankheiten zur Hand zu haben, der Erkenntnis gewichen, dass bis heute, abgesehen von Berichten vereinzelter Patienten (CAVAZZANA-CALVO et al., 2000), kein Protokoll existiert, nach dem eine Krankheit mittels Gentherapie zuverlässig geheilt werden kann (ANDERSON, 1998; PILEWSKI, 2002; WEST u. RODMAN, 2001). Offensichtlich sind die Abwehrmechanismen sehr wirkungsvoll, die der menschliche Organismus gegen Angriffe von außen, wozu auch die Einschleusung von Fremd-DNA in das eigene Genom gehört, entwickelt hat (ANDERSON, 1998). Bisher veröffentlichte klinische Studien zeigen daher nur eine geringe Effizienz des Gentransfers, häufig begleitet von heftigen Enzündungsreaktionen des Wirtsorganismus (BOUCHER et al., 1994; CRYSTAL et al., 1994; NOONE et al., 2000; REIX et al., 2002). FLOTTE und LAUBE (2001) beschreiben einen idealen Genvektor folgendermaßen: • Ausreichende Trägerkapazität: Neben der Information des therapeutischen Gens müssen regulatorische Sequenzen, Voraussetzung für eine kontrollierte und effiziente Expression des therapeutischen Gens, eingefügt werden. • Effizienz und Spezifität des Gentransfers: Um den Defekt der cystischen Fibrose zu korrigieren, müssen Zielzellen in ausreichendem Maß transfiziert werden, darüber hinaus muss das Targeting des Vektors für die Zielzellen spezifisch sein. • Immunogenität: Weder eine humorale noch eine zelluläre Immunantwort des Wirts darf induziert werden, da neutralisierende Antikörper die wiederholte Applikation des Vektors unwirksam machen, während eine zelluläre 28 Literaturübersicht Immunantwort transfizierte Zellen angreifen würde. Im optimalen Fall sollte der Vektor keinerlei inflammatorische Reaktion des Wirts hervorrufen. • Sicherheit: Der Vektor darf zu keiner Zeit eine Gefahr für den Wirtsorganismus darstellen, auch dann nicht, wenn er in bereits entzündetes Gewebe (CFLunge) mit anderen prädispositionierenden Faktoren appliziert wird. Auch bei der Herstellung des Vektors darf es keine Sicherheitsrisiken geben. • Ausreichende Dauer der Genexpression: Für die langzeitige Expression, wie bei der cystischen Fibrose notwendig, muss der Vektor das therapeutische Gen entweder in das Chromatin der Zielzelle einschleusen oder ein Episom in deren Zellkern generieren, welches sicher repliziert und an Tochterzellen weitergegeben wird. • Möglichkeit zur wiederholten Applikation: Ist keine langzeitige Expression des therapeutischen Gens gewährleistet, muss der Vektor wiederholt sicher applizierbar sein. Bei den gegenwärtigen Vektoren unterscheidet man zwischen viralen und nichtviralen Vektoren. Zahlreiche Viren stellen potentielle Vektoren für den Gentransfer in das Atemwegsepithel dar (BALS et al., 2001). Die Entwicklung von adeno-, adenoassoziierten und retroviralen Vektoren ist am weitesten fortgeschritten, deshalb sollen diese im folgenden Abschnitt besprochen werden. Bei den nicht-viralen Vektoren existieren Ansätze mit kationischen Liposomen, kationischen Polymeren und nackter Plasmid-DNA. Die überwiegende Anzahl klinischer Studien befasst sich mit viralen Vektoren (etwa 75%, WILEY, 2003), da diese im allgemeinen einen wirkungsvolleren Gentransfer versprechen. Doch die viralen Vektoren besitzen auch Nachteile wie geringe Trägerkapazität, hohe Immunogenität und das Restrisiko einer Infektion. Dagegen bieten die u.U. weniger effizienten nicht-viralen Vektoren eine größere Kapazität für das Transgen, eine kaum induzierte Immunantwort des Wirts und mehr Sicherheit. Literaturübersicht 2.3.3 29 Virale Vektoren Viren haben im Laufe der Evolution die Fähigkeit entwickelt, Wirtszellen zu infizieren und diese durch die Expression viraler Gene zur Produktion neuer Viren zu benutzen (BALS et al., 2001). Die Befürworter viraler Vektoren argumentieren daher, dass Viren ideale Genfähren darstellten, während ihre Gegner auf die potenten Abwehrmöglichkeiten des menschlichen Organismus gegenüber Viren hinweisen (FLOTTE u. LAUBE, 2001). Der virale Zyklus wird grob in die Prozesse der Adsorption und Penetration und nachfolgende Replikation des Virus in der Wirtszelle unterteilt. Hierbei wird das virale Genom in die Zelle eingeschleust und in der sich anschließenden frühen Expressionsphase produziert die Wirtszelle virale regulatorische Proteine. Darauf folgt die Spätphase, in der das Virusgenom repliziert wird, Strukturgene exprimiert werden und der Aufbau neuer Viruspartikel erfolgt. Die Phase der Replikation sollte in der Gentherapie unterdrückt werden, da der Vektor nach der Transfektion der Zielzelle, d.h. Infektion und Einbau des Transgens in das Wirtszellgenom, seine Aufgabe erfüllt hat. Tabelle 2 stellt die Vor- und Nachteile der am weitesten entwickelten viralen Vektoren dar. Tab. 2: Übersicht viraler Genvektoren, die in vorklinischen oder klinischen Untersuchungen zum Transfer von CFTR-cDNA verwendet werden (―: nicht vorhanden, +: geringgradig, +++: hochgradig; nach ALBELDA et al., 2000). Virus Größe des Infektion nicht- Dauer der Immunantwort Transgens replizierender Expression (kbp) Zellen Adenovirus 7-8 + transient +++ Adenoassoziiertes 4,5 + Langzeit + Retrovirus <8 ― Langzeit + Lentivirus <8 + Langzeit + Virus 30 Literaturübersicht 2.3.3.1 Adenoviren Die ersten Vektoren, die in vivo für den Gentransfer in die Lunge zum Einsatz kamen, waren Adenoviren (CRYSTAL et al., 1994; ROSENFELD et al., 1991; ROSENFELD et al., 1992). Die weite Verbreitung des primären Rezeptors, des Coxsackie und Adenovirus Rezeptor (CAR), ermöglicht diesen doppelsträngigen DNA-Viren, ein breites Spektrum an Zellen im Wirtsorganismus zu infizieren, dazu gehören auch die Zellen des respiratorischen Epithels (BARNETT et al., 2002). Eine Infektion des Atemtrakts geht natürlicherweise mit Erkältungssymptomen einher (WEST u. RODMAN, 2001). Das 36 kbp große Genom der Wildtyp-Adenoviren besteht aus Genen, die in der frühen Phase der Infektion wichtig sind, und aus Genen, die erst in der Replikationsphase abgelesen werden und für virale Strukturproteine codieren (BALS et al., 2001). Bei adenoviralen Vektoren der ersten Generation wurde der Beginn der viralen Replikation gehemmt (FISHER et al., 1996; HARVEY et al., 2001). Durch Deletion der Genregion, welche die DNA-Replikation anschaltet, gewann man zusätzlich Platz für die therapeutische Geninformation. Die Mehrzahl der Studien mit diesen ersten Vektoren zeigten einen recht effektiven Gentransfer, die Dosierung der Vektoren war jedoch durch massive Entzündungsreaktionen beschränkt (CRYSTAL et al., 1994; HARVEY et al., 2001). Die Immunantwort gegen die Vektoren der ersten Generation bestand aus einer unspezifischen Immunreaktion und aus einer zellvermittelten Immunreaktion, die gegen verbliebene Virusproteine gerichtet war, sowie einer humoralen Immunreaktion, die sich gegen Kapsid-Proteine des rekombinanten Virus richtete (YANG et al., 1994; YANG et al., 1996; YEI et al., 1994). Die Entzündungsreaktion schränkte die transgene Expression ein und war potentiell schädigend für den Wirt (REIX et al., 2002). In Vektoren der zweiten Generation wurden zusätzliche Deletionen vorgenommen, um die Vektor-induzierte Immunantwort abzuschwächen (YANG et al., 1996). Diese Vektoren zeichneten sich durch längere Aktivität und eine schwächere zellvermittelte Immunantwort aus (FLOTTE u. LAUBE, 2001). Derzeit wird an der Entwicklung adenoviraler Vektoren gearbeitet, die keine viralen Gene mehr besitzen (Gutless oder delta-adenovirale Vektoren), diese sollen wiederum eine verlängerte Literaturübersicht 31 Aktivitätsdauer und eine größere Trägerkapazität (bis zu 35 kbp) besitzen und die Immunantwort minimieren (FISHER et al., 1996; MORRAL et al., 1999). Trotz dieser Verbesserungen der adenoviralen Vektoren bleibt das Problem der humoralen Immunantwort, deren neutralisierende Antikörper gegen Kapsid-Proteine des Virus gerichtet sind, bestehen. Neben dem adaptiven Immunsystem stehen weitere Schutzmechanismen des Respirationstraktes wie Alveolarmakrophagen (WORGALL et al., 1997) und die mukoziliäre Clearance einem effizienten Gentransfer entgegen. Strategien, den Gentransfer zu verbessern, sehen daher beispielsweise eine Immunsuppression nach der Vektorgabe vor (ANDERSON, 1998; STEIN et al., 1998). Ein weiteres Problem der adenoviralen Vektoren ist die Lokalisation des CAR. Der Rezeptor findet sich überwiegend auf der basolateralen Seite des polarisierten respiratorischen Epithels, so dass die lokale Vektorapplikation, z.B. über nasale Applikation oder Inhalation, nur in geringem Maße zur Transfektion von Zellen führt (KNOWLES et al. 1995a; PICKLES et al. 2000; WALTERS et al., 1999). Adenoviren sind in der Lage, sowohl sich teilende als auch nicht-teilende Zellen zu infizieren (ANDERSON, 1998). Kurz nach der Transfektion ist die Expression des rekombinanten Gens deshalb hoch. Ein Großteil der viralen DNA verbleibt jedoch episomal, so dass es durch Zellproliferation zu einem Verdünnungseffekt der transfizierten Zellen und schlussendlich nur zu einer transienten Expression kommt (ZABNER et al., 1993). Einer wiederholten Vektorapplikation steht jedoch die bereits erwähnte starke Immunantwort des Wirts entgegen (KAPLAN et al., 1996). 2.3.3.2 Adenoassozierte Viren (AAV) AAV sind nicht mit Adenoviren verwandt, sondern gehören zu den apathogenen humanen Parvoviren (BUELER, 1999). Sie benötigen jedoch Adeno- bzw. Herpesviren als obligate Helfer für ihre in vivo-Replikation. Auch bei den AAV handelt es sich um DNA-Viren, ihr Genom ist jedoch im Vergleich zu den Adenoviren sehr klein (4,7 kbp, FLOTTE, 2001). In Abwesenheit eines Helfervirus integriert das Virus spezifisch in Chromosom 19 des Menschen (WEST u. RODMAN, 2001), wo es bei Infektion durch das Helfervirus aktiviert wird. Das Genom der AAV besteht aus 32 Literaturübersicht Inverted Terminal Repeats (ITR) an den Enden des DNA-Strangs, dazwischen liegen die Gene, die für Integration, Replikation und Kapsid-Proteine kodieren (BALS et al., 2001). AAV-Vektoren werden erzeugt, indem diese viralen Gene deletiert werden und das Transgen zwischen die ITRs eingefügt wird. Durch den Verlust der viralen Gene vermag das Virus jedoch auch nicht länger spezifisch zu integrieren, so dass es zu einer zufälligen Integration oder der Ausbildung episomaler DNA kommt (WEST u. RODMAN, 2001). Aufgrund der geringen Kapazität des Vektors ist es kaum möglich, zusätzlich zur therapeutischen Geninformation regulierende Promotorsequenzen einzufügen, was die effiziente Expression mindert (FLOTTE et al., 1993b). Dennoch zeigen AAV-Vektoren in vitro hohe Transfektionsraten und eine langfristige Expression (FLOTTE et al., 1994). Auch in vivo konnte eine teilweise effiziente Transfektion ohne nennenswerte Immunreaktion des Wirtes oder gar Toxizität gezeigt werden (BUELER, 1999; FLOTTE et al., 1993a). Erste klinische Studien an CF-Patienten wiesen eine teilweise Korrektur des elektrophysiologischen Defekts über mehrere Wochen nach (WAGNER et al., 1998). AAV-Vektoren sind demnach - mit einigen Einschränkungen, wie der geringen Vektorgröße und der limitierten Fähigkeit, das apikale Epithel zu transfizieren - ein relativ sicheres und ausbaufähiges Vektorsystem. 2.3.3.3 Retroviren Retroviren sind teilweise onkogen und besitzen das Enzym reverse Transkriptase, welches nach dem Eindringen in die Wirtszelle das RNA-Virengenom in DNA umkopiert, welche dann durch eine Integrase in das Wirtgenom integriert wird (ROLLE u. MAYR, 1993, S. 377). Die Fähigkeit der Viren, ihre Information in das Wirtsgenom zu integrieren und so eine chronische, vom Wirtsorganismus meist gut tolerierte Infektion zu etablieren, macht bei der Infektion von Atemwegsstammzellen eine wiederholte Applikation überflüssig. Durch Deletion viraler Gene können Retroviren eine Trägerkapazität für Fremd-DNA von bis zu 8 kbp erhalten (ALBELDA et al., 2000). Literaturübersicht 33 Für den Gentransfer in die Lunge haben Retroviren begrenzten Einsatz gefunden, da sie für Infektion und Integration replizierende Zellen benötigen und der den Zelleintritt vermittelnde Rezeptor wenig im respiratorischen Epithel exprimiert wird (ALBELDA et al. 2000; DRUMM et al. 1990; GUNZBURG et al., 1996). Andere physikalische Faktoren wie die apikale Glycokalix und die Surfactant-Produktion des Epithels hemmen den in vivo-Gentransfer zusätzlich und verringern die Bedeutung dieses Vektorsystems für die CF-Gentherapie (WANG et al., 2002). Im Gegensatz zu herkömmlichen Retroviren sind Lentiviren, zu denen auch das humane Immundefizienz Virus (HIV) gehört, in der Lage, auch nicht replizierende Zellen zu infizieren und ihr Genom zu integrieren (JOHNSON 2001; WANG et al., 2000). Diesen Vorteilen stehen die Nachteile einer niedrigen Transfektionsrate des Atemwegsepithels, die starke Barrierefunktion der apikalen Membran (JOHNSON, 2001) und Sicherheitsbedenken gegenüber möglicher Rückmutationen zum WildtypVirus gegenüber. Hinzu kommt, dass die Integration des Virusgenoms ein spontanes Ereignis ist, mit dem Risiko, körpereigene Tumorsuppressorgene ab- bzw. Onkogene anzuschalten. 2.3.4 Nicht-virale Vektoren Obwohl nicht-virale Vektoren nur begrenzt in Zielzellen aufgenommen werden und diese das Transgen meist nur vorübergehend exprimieren, stellen nicht-virale Vektoren den sichersten Ansatz einer somatischen Gentherapie dar. Hinzu kommt, dass die Größe der zu transferierenden DNA nicht in dem Maße beschränkt ist, wie bei viralen Vektoren. Da auch die Introns eines Gens zur Regulation seiner Expression beitragen (WILLIAMS et al., 2003), gewinnt die Transferkapazität zunehmend an Bedeutung. Benötigte Plasmid-DNA kann einfach und in großem Umfang in Bakterien hergestellt werden, wobei bakteriell produzierte CpG-Motive (Dinukleotidsequenzen, in denen Guanin auf Cytosin folgt) nicht methyliert sind und im Wirt eine Zytokin-vermittelte Entzündungsreaktion induzieren (KRIEG, 1999). Dieser bei DNA-Vakzinierung willkommene Effekt ist in der somatischen Gentherapie 34 Literaturübersicht unerwünscht. Die wiederholte Verabreichung von Plasmid-DNA ist dennoch möglich, da die Immunantwort zum einen unspezifisch verläuft und außerdem durch ausreichende Zeitintervalle zwischen den Applikationen (evtl. in Kombination mit Immunsuppressiva) vermindert werden kann. Die Reduktion der CpG-Motive in der Plasmid-DNA trägt ebenfalls zur Herabsetzung der Immunantwort bei (YEW et al., 2000). Vor- und Nachteile der am weitesten entwickelten nicht-viralen Vektoren sind in Tabelle 3 dargestellt. Tab.3: Übersicht nicht-viraler Genvektoren, von denen bisher erst die kationischen Liposomen in klinischen Studien zum Einsatz kamen (+: geringgradig, ++: mittelgradig, +++: hochgradig; nach ZIADY et al., 2003). Vektor in vivo- Effizienz in Effizienz in nicht- Immun- Degra- replizierenden replizierenden dation Zellen Zellen und in Zellspezifität antwort vivo Kationische geschützt, Liposome +++ + wenn ++ (CpG- Promotor- induziert) abhängig + +++: wenn komplexiert Kationische geschützt, +++: wenn Polymere wenn Rezeptor- Rezeptor- komplexiert vermittelt vermittelt+ - + - ++: wenn ++: wenn nicht Rezeptor- nicht vermittelt Rezeptor- +++ vermittelt Nackte hoch Plasmid- empfindlich DNA + + + (CpG- Promotor- induziert, abhängig in hohen Dosen) Literaturübersicht 2.3.4.1 35 Kationische Liposomen Von den nicht-viralen Vektoren sind bisher nur die kationischen Liposomen in klinischen Studien getestet worden (ALBELDA et al., 2000; BRAGONZI u. CONESE, 2002). Liposome sind Komplexe aus Lipiden und DNA (FLOTTE u. LAUBE, 2001). Sie sind einfach synthetisierbar, können in Größe und Zusammensetzung unterschiedlich gestaltet werden und sind kaum toxisch (BALS et al., 2001). Die überwiegend kationisch geladenen Lipide bilden mit der polyanionisch geladenen DNA kleine, virusähnliche Partikel, die mit der Wirtszellmembran fusionieren und deren Aufnahme in die Zellen gegenüber nackter DNA um ein Vielfaches gesteigert ist (BALS et al., 2001; FLOTTE u. LAUBE, 2001). Nach Aufnahme in die Zelle durch Endozytose wird ein großer Anteil der aufgenommenen DNA in lysosomalen Vesikeln zerstört, und nur ein Bruchteil gelangt in episomaler Form in den Zellkern, wo er transient exprimiert wird. Dieser Mechanismus erklärt die geringe Transfektionsrate und Effizienz kationischer Liposomen (BRAGONZI u. CONESE, 2002). Verneblungsexperimente im CF-Mausmodell zeigten eine teilweise Korrektur des elektrophysiologischen Defekts (ALTON et al., 1993; DORIN et al., 1996; EASTMAN et al., 1997), welche ebenfalls bei der Verabreichung kationischer Liposomen an CF-Patienten nachgewiesen werden konnte (BRAGONZI u. CONESE, 2002; CAPLEN et al., 1995; PORTEOUS et al., 1997). Obwohl diese Studien eine Immunreaktion der Empfänger nicht nachwiesen bzw. diese nicht berichteten, gibt es andere Untersuchungen, in denen nach Applikation kationischer Liposomen deutliche dosisabhängige Entzündungsreaktionen beobachtet wurden (SCHEULE et al., 1997; YEW et al., 1999). Als Ursache dieser Zytotoxizität der kationischen Liposomen wird die unmethylierte Plasmid-DNA vermutet (s. Kap. 2.3.4). 2.3.4.2 Kationische Polymere Wie bei den kationischen Lipiden führt auch die Komplexierung der cDNA mit kationischen Polymeren zu einer DNA-Kondensation, und die resultierende positive Ladung des Komplexes erlaubt dessen Aufnahme in die Zelle durch Endozytose 36 Literaturübersicht (BALS et al., 2001). Die Freisetzung der DNA im Zytoplasma erfolgt vermutlich durch osmotische Schwellung und schließlich das Platzen der Endosomen (BALS et al., 1999; BOUSSIF et al., 1995). Im Gegensatz zu den kationischen Liposomen sind Polymere eher in der Lage, in Anwesenheit von Surfactant stabil zu bleiben und die mukosale Barriere des Atemtrakts zu überwinden (BRAGONZI u. CONESE, 2002). Mit dem Polymer Polyethylenimin wurde in vivo ein effizienter, wenn auch transienter Gentransfer nachgewiesen. Eine Weiterentwicklung der kationischen Polymere stellt deren Targeting auf spezifische Rezeptoren dar (RUDOLPH et al., 2002; ZIADY et al., 2002). Solcherart Rezeptor-vermittelter Gentransfer zeigte im Tiermodell Genexpression mit teilweiser Korrektur des elektrophysiologischen Defekts und länger anhaltend als bei der alleinigen Verwendung kationischer Polymere. Die Effizienz kationischer Polymere wurde in klinischen Studien bisher nicht überprüft. 2.3.4.3 Nackte Plasmid-DNA Obwohl der Mechanismus des Zelleintritts ungeklärt ist, wurde in vivo nach direkter Applikation nackter DNA in das Zielgewebe, eine wirksame Transfektion der Zellen nachgewiesen (WOLFF et al., 1992; ZIADY et al., 2003). Ohne komplexierende Agenzien ist nackte DNA extra- und intrazellulär empfindlich für Degradation. Je größer die Plasmid-DNA, desto unbeweglicher ist sie im Zytosol, sodass ihre Aufnahme in den Kern stark beschränkt wird (LUKACS et al., 2000). Dennoch wiesen klinische Studien, in denen nackte Plasmid-DNA als Kontrolle für liposomalen Gentransfer diente, im Vergleich zu diesem gleich gute bzw. bessere Transfektionsergebnisse auf (ALTON et al., 1993; KNOWLES et al., 1995a). Trotz dieser Befunde bleibt nackte Plasmid-DNA bisher ein noch instabiles Vektorsystem, welches hohe Dosen des Vektors und unterstützende Maßnahmen benötigt (ZIADY et al., 2003). Literaturübersicht 2.4 37 Bakterien in der Gentherapie Bakterien sind in der Lage, Plasmide sowohl zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien (CHARPENTIER et al., 1999; TRIEU-CUOT et al., 1993) als auch zwischen Bakterien und Hefen auszutauschen (HEINEMANN u. SPRAGUE, 1989). In der Erzeugung rekombinanter Pflanzen wird der Bakterien-vermittelte Gentransfer seit mehr als zehn Jahren kommerziell genutzt (LESSL u. LANKA, 1994). Da invasive Bakterien offenbar auch in der Lage sind, eukaryotische Expressionsplasmide in Wirbeltierzellen einzuschleusen (DIETRICH et al., 1998; SIZEMORE et al., 1995), war der direkte in vivo- und in vitro-Transfer von PlasmidDNA in Wirtszellen nur ein weiterer Schritt dieser Entwicklung. Der ursprüngliche Gedanke zu Bakterien-vermitteltem Plasmid-Gentransfer war, dass bakterielle Vektoren in die Zielzellen eindringen, weil diese entweder phagozytotisch sind oder Phagozytose durch die Bakterien induziert wird (WEISS u. KRUSCH, 2001). In den Zielzellen werden die Bakterien aus dem Phagosom freigesetzt, was entweder durch bakterieneigene oder rekombinante Virulenzfaktoren, die von anderen Erregern in die Bakterien eingeschleust wurden, vermittelt wird. Schließlich kommt es im Zytosol der Zielzellen zur Lyse. Diese wird beispielsweise dadurch ausgelöst, dass auxotrophe Mutanten verwendet werden, die metabolisch attenuiert sind, d.h. sie benötigen Substanzen, die nicht von der Wirtszelle substituiert werden. Alternativ können ein autolytischer Prozess induziert oder geeignete Antibiotika verwendet werden (WEISS, 2003; WEISS u. KRUSCH, 2001). Durch die Lyse des bakteriellen Trägers wird das Expressionsplasmid freigesetzt, in den Zellkern transferiert und exprimiert. Als gezeigt wurde, phagozytotischen dass Vesikel Salmonella verbleibt, typhimurium, dennoch in der ein Erreger, Lage ist, der in im vitro Expressionsplasmide in Makrophagen zu transferieren (DARJI et al., 1997), musste diese Grundidee überdacht werden. Prinzipiell bestehen nach WEISS und KRUSCH (2001) zwei Einsatzmöglichkeiten für den Bakterien-vermittelten Gentransfer: DNA-Vakzinierung oder Gentherapie. Ziel der DNA-Vakzinierung ist es, ein Expressionsplasmid in die Zelle einzuschleusen, 38 Literaturübersicht welches entweder für das Antigen eines Krankheitserregers oder eines Tumorantigens kodiert (WEISS, 2003). Durch die Synthese des Antigens wird im Wirt eine Immunantwort gegen Pathogene oder Tumoren induziert. So sollen durch die Bakterien-vermittelte DNA-Vakzinierung auch Pathogene bekämpft werden können, für die derzeit keine herkömmlichen Impfstoffe existieren, wie Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium malariae und das humane Immundefizienzvirus (GURUNATHAN et al., 2000a; SEDER u. GURUNATHAN, 1999). Eine erfolgreiche DNA-Vakzinierung soll eine langfristige, sowohl zellvermittelte als auch humorale Immunität vermitteln. ANGELAKOPOULOS et al. (2002) führten eine Pilotstudie mit adulten Probanden durch, denen attenuierte Listerien oral verabreicht wurden. Partiell konnten dabei, ohne dass gravierende Krankheitserscheinungen durch die bakterielle Infektion auftraten, sowohl eine zellvermittelte als auch eine humorale Immunantwort beobachtet werden, die den Einsatz attenuierter Listerien als DNAVektoren sinnvoll erscheinen ließen. Ein weiteres Ziel ist es, die mukosale als die einfachste Art der Verabreichung, d.h. entweder die orale oder nasale Applikation der Vakzine, zu ermöglichen (WEISS, 2003). DIETRICH et al. (2000) und WEISS und KRUSCH (2001) sehen zusätzliche Vorteile, die bakterielle Genvektoren für die DNA-Vakzinierung erbringen könnten: • Bakterien dringen im Allgemeinen über die Schleimhautpforte in den Organismus ein, was eine mukosale Verabreichung der Vakzine erleichtert. • Viele Bakterien infizieren Zellen des Immunsystems, das antigene Transgen würde entsprechend dort exprimiert, wo die Immunreaktion induziert werden soll. • Teile der bakteriellen Zellwand oder nicht-methylierte bakterielle DNA sind immunstimulierend und könnten wie Adjuvanzien wirken (s. Kap. 2.3.4). • Der bakterielle Vektor und das Antigen tragende Expressionsplasmid stellen voneinander getrennte Einheiten dar, die entsprechend getrennt voneinander modifiziert werden können. • Bakterien können günstig vermehrt, einfach gehandhabt und durch Antibiose gut kontrolliert werden. Außerdem ist die Trägerkapazität ihrer Literaturübersicht 39 Expressionsplasmide praktisch unbegrenzt, so dass auch Mehrfachimpfstoffe technisch möglich wären. Grundsätzlich unterscheidet man zwischen Bakterien, die durch eigene oder rekombinante Virulenzfaktoren aus einem Phagosom in das Zytosol der Wirtszelle freigesetzt werden (S. flexneri, L. monocytogenes, E. coli) und solchen, die im Phagosom abgetötet werden und deren Expressionsplasmide auf noch ungeklärtem Wege ins Zytosol gelangen (DIETRICH et al., 2000; WEISS u. KRUSCH, 2001). Aufgrund ihrer Eigenschaften schlagen WEISS und KRUSCH (2001) Bakterien auch als Vektoren für die Gentherapie vor: • Gute Kontrolle durch Antibiotika. • Die Zellspezifität mancher Bakterien kann zum gezielten Gentransfer in bestimmten Geweben beitragen und der Eintritt der Erreger über die Schleimhautbarriere erleichtert ihre Verabreichung. • Einige Bakterien sind in der Lage, sich interzellulär auszubreiten, was u.U. auch zur Transfektion von Zellen führt, die für nicht-replizierende Vektoren unerreichbar bleiben. • Die große Trägerkapazität bakterieller Plasmide erlaubt auch große Transgene und entsprechende regulatorische Sequenzen zu transfizieren. • Eine vektorspezifische Immunreaktion kann durch frühes Abtöten der Erreger unterdrückt werden. Im Folgenden werden einige Beispiele Bakterien-vermittelten Gentransfers dargestellt. 2.4.1 Salmonella typhimurium Bei S. typhimurium handelt es sich um einen für die Maus pathogenen Serovar, der durch Untersuchungen attenuierter Stämme im natürlichen Wirt zum Modellorganismus des Bakterien-vermittelten Gentransfers wurde (WEISS, 2003). Zuerst konnte in der Maus nach einmaliger, oraler Applikation von attenuierten S. typhimurium (rekombinant verändert mit einem Plasmid, das für die Gene hly und 40 Literaturübersicht actA, zwei Virulenzfaktoren von L. monocytogenes, codiert) sowohl eine humorale, wie eine zellvermittelte Immunantwort gegen diese Antigene induziert werden (DARJI et al., 1997). Mit Transformanten, die das Listeriolysin-Gen hly trugen, konnte den Mäusen sogar eine protektive Immunität gegen eine letale Infektion mit L. monocytogenes vermittelt werden (DARJI et al., 1997; DARJI et al., 2000). XIANG et al. (2000) beobachteten in Mäusen mit murinen Melanomen Wachstumshemmung und Abstoßung der Tumoren, nachdem diese mit attenuierten Salmonellen, die ein Expressionsplasmid mit Tumorepitopen trugen, transfiziert wurden. Offensichtlich konnte die Toleranz des Immunsystems gegen Tumorantigene durch den Gentransfer aufgehoben werden. MEI et al. (2002) wiesen allerdings auf die Bedeutung einer optimalen therapeutischen Dosis für derlei Erfolge hin. Beim Vergleich der Immunantworten nach nasaler und oraler Applikation von DNAVakzinen auf der Basis von S. typhimurium, war eine wiederholte nasale Applikation notwendig, um in der Milz eine T-Zell-Antwort zu induzieren, die bereits nach einmaliger oraler Applikation erfolgte (DARJI et al., 2000). Auch das Auftreten von Antikörpern war von dem Ort der Applikation beeinflusst. Die langfristige Antigenpräsentation nach einmaliger oraler Applikation war Ursache für die wirksame Induktion einer T-zellvermittelten Immunantwort (DARJI et al., 2000; WEISS u. KRUSCH, 2001). Für den Mechanismus des S. typhimurium-vermittelten Gentransfers existiert die Vorstellung, dass die Bakterien nach oraler Applikation die Darmschranke über MZellen passieren, um dann phagozytierende Zellen der Peyerschen Platten, wie Makrophagen und dendritische Zellen, zu infizieren (WEISS u. KRUSCH, 2001). Nach der Lyse der Bakterien wird das Transgen direkt von diesen Zellen exprimiert (Antigenpräsentation durch MHC I-Moleküle). Gleichzeitig können die Salmonellen in Makrophagen Apoptose induzieren, was zu einer starken Antigenpräsentation durch dendritische Zellen führt, die apoptotische Makrophagen phagozytiert haben (Antigenpräsentation durch MHC II-Moleküle). Mittlerweile existieren Modelle zum S. typhimurium-vermittelten Gentransfer für Infektionsmodelle (WOO et al., 2001) ebenso wie für Tumormodelle (JAIN, 2001; MEI et al. 2002; XIANG et al., 2000). Neben der DNA-Vakzinierung wurden Literaturübersicht 41 Salmonellen auch gentherapeutisch bei Interferon (IFN) γ-defizienten Mäusen eingesetzt (PAGLIA et al., 2000). Knockout-Mäuse mit diesem monogenetischen Defekt sterben normalerweise an einer Infektion mit attenuierten S. typhimurium, die rekombinanten Bakterien trugen jedoch ein Expressionsplasmid mit dem Gen des murinen INF γ. Der Transfer des Gens führte zur Reparatur des Defekts in den murinen Makrophagen, so dass die Mäuse die Infektion überlebten. Um die Effizienz des Salmonellen-vermittelten Gentransfers zu erhöhen, wurde in attenuierte Stämme von S. typhimurium das hly-Gen von L. monocytogenes eingeschleust, das für den Virulenzfaktor LLO kodiert, welcher die Zerstörung der phagosomalen Wand vermittelt (GENTSCHEV et al., 1995). So konnte in primären Makrophagen die Antigenexpression nach Ko-Infektion mit LLO-sezernierenden Salmonellen und Salmonellen, die ein für Ovalbumin codierendes Plasmid trugen, erhöht werden (CATIC et al., 1999). Eine ähnliche Verbesserung in der Expression von GFP als Reportergen wurde bei Mäusen gefunden, denen oral S. typhimurium appliziert wurde, welche neben dem GFP-Expressionsplasmid auch LLO exprimierten (GENTSCHEV et al., 2001). Die generierte Fähigkeit der Salmonellen, dem Phagosom zu entweichen, stellt demnach einen Vorteil für den Bakterien-vermittelten Gentransfer dar (WEISS u. KRUSCH, 2001). 2.4.2 Salmonella typhi Durch die Entwicklung von Impfstoffen gegen den Erreger des Typhus beim Menschen stehen attenuierte Stämme von S. typhi zur Verfügung (GERMANIER u. FUER, 1975). S. typhi ist nicht pathogen in der Maus, weshalb für dieses Tiermodell nur die nasale oder intraperitoneale Applikation in Frage kommt (WEISS u. KRUSCH, 2001). Attenuierte Salmonellen wurden zur Immunisierung von Mäusen gegen das Masernvirus, das humane Immundefizienzvirus und gegen Tetanustoxin verwendet (FENNELLY et al., 1999; SHATA et al., 2000), wobei die Tiere eine durch zytotoxische T-Zellen charakterisierte Immunantwort zeigten bzw. mit der Produktion spezifischer Antikörper reagierten. Bei der Immunisierung mit Tetanustoxin konnte gezeigt werden, dass mehr Antikörper produziert wurden, wenn das Antigen unter 42 Literaturübersicht der Kontrolle eines eukaryotischen Promotors stand als unter der eines prokaryotischen. Dies spricht für die Effizienz des Bakterien-vermittelten Gentransfers bei der Verwendung eukaryotischer, regulatorischer Sequenzen. 2.4.3 Shigella flexneri Shigellen sind die Erreger akuter Darminfektionen des Menschen (ROLLE u. MAYR, 1993, S. 625), und S. flexneri gehört zu den ersten Bakterien, für die Bakterienvermittelter Gentransfer untersucht wurde (COURVALIN et al., 1995; SIZEMORE et al., 1995). Die verwendeten Stämme besitzen entweder Defekte in der Zellwandsynthese oder sind auxotroph für die Synthese bestimmter Aminosäuren. Da Mäuse und Meerschweinchen für S. typhi und S. flexneri nicht suszeptibel sind, wurde eine nasale oder konjunktivale Applikation gewählt, um das Potential von S. flexneri für den Bakterien-vermittelten Gentransfer zu überprüfen (FENNELLY et al., 1999; NORIEGA, et al. 1996). Nach Immunisierung, z.B. mit dem Reportergen für β-Galaktosidase oder Antigenen des Masernvirus, wurde sowohl zellvermittelte Immunität als auch eine mäßige Antikörperproduktion beobachtet (SIZEMORE et al., 1997). Im Gegensatz zu S. typhi zeigte S. flexneri nach nasaler Applikation jedoch von der Lunge ausgehend kein Disseminationsverhalten. 2.4.4 Escherichia coli Colibakterien gehören natürlicherweise nicht zu den invasiven mikrobiellen Pathogenen. Durch Einschleusen eines S. flexneri-eigenen Virulenzplasmids erhielt der Laborstamm E. coli K 12 jedoch nicht nur die Fähigkeit, in Wirtszellen einzudringen, sondern zusätzlich dem Phagosom der Wirtszelle zu entkommen (COURVALIN et al., 1995). In einer Folgestudie wurde eine E. coli K 12-Mutante mit dem Invasin von Yersinia pseudotuberculosis erzeugt. Obwohl die Bakterien im Phagosom verblieben, konnte der Transfer des Plasmids durch das Reporterprotein Literaturübersicht 43 GFP nachgewiesen werden (GRILLOT-COURVALIN et al., 1998). Außerdem wurden Colibakterien generiert, die neben dem Invasin der Yersinien auch das Gen hly für das Listeriolysin von L. monocytogenes trugen. Die Erwartung, dass diese Bakterien das Phagosom verlassen und deshalb eine höhere Effizienz des Gentransfers aufweisen würden, wurde jedoch nicht erfüllt. E. coli K 12 ist demnach offenbar in der Lage, seine Expressionsplasmide aus dem Phagosom auszuschleusen, so dass sie für einen Transport in den Zellkern zur Verfügung stehen (WEISS u. KRUSCH, 2001). 2.5 Listeria Zur Gattung Listeria zählen gegenwärtig sechs Arten: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshmeri und L. grayi. Nur L. monocytogenes hat eine Bedeutung als Krankheitserreger, obwohl auch L. ivanovii potentiell pathogen ist. Zum ersten Mal wurden die Erreger 1924 beschrieben, als L. monocytogenes bei einer septikämischen Erkrankung von Kaninchen und Meerschweinchen in Cambridge isoliert wurde (MURRAY et al., 1926). Listerien sind grampositive, fakultativ anaerobe Stäbchen, die 0,4 µm breit und zwischen 1,0 und 1,5 µm lang sind. Sie formen keine Sporen und besitzen keine Kapsel (ROCOURT, 1999). Die Keime sind an einen weiten Temperaturbereich adaptiert, ihre obere Wachstumsgrenze liegt bei 42 – 44°C (ROLLE u. MAYR, 1993; S. 719). Auch gegen kalte Temperaturen zeigen sie sich relativ widerstandsfähig, so dass Wachstum noch bei 1,7°C beobachtet werden kann (JUNTTILA et al., 1988). Zwischen 20 – 25°C bilden Listerien eine peritriche Begeißelung aus, ab 37°C ist ihre Motilität jedoch deutlich reduziert (PEEL et al., 1988). Listerien können im Boden, Abwasser, in zahlreichen Lebensmitteln und Fäzes von Mensch und Tieren nachgewiesen werden. Als natürliches Habitat der Keime wird verrottendes Pflanzenmaterial angesehen, wo sie saprophytär leben (WEIS u. SEELIGER, 1975). Vermutlich spielen Hauswiederkäuer eine Schlüsselrolle bei der immer wiederkehrenden oralen Infektion des Menschen durch tierische Lebensmittel 44 Literaturübersicht (FENLON, 1999). Listerien sind in der Lage, den Menschen und ein breites Spektrum von Wirbeltieren zu infizieren, einschließlich Vögel und Säugetiere. L. monocytogenes verursacht sowohl lokale als auch generalisierte Infektionen, die als Listeriose bezeichnet werden. Da die Keime in der Umwelt weit verbreitet sind, kontaminieren sie häufig Rohstoffe zur industriellen Erzeugung von Lebensmitteln (GRAVANI, 1999). Ihre Toleranz niedriger pH-Werte, hoher Salzkonzentrationen und ihre Fähigkeit, sich auch bei Kühlschranktemperaturen noch zu vermehren, machen Listerien dabei zu einer ernsten Bedrohung für die Lebensmittelsicherheit (LOU u. YOUSEF, 1999). Aus immunologischer Sicht wurde L. monocytogenes bereits in den frühen sechziger Jahren interessant, da sich in Labornagern - und hier primär in der Maus - eine der menschlichen Listeriose sehr ähnliche Krankheit erzeugen ließ. Die Eigenschaft in Makrophagen zu überleben und sich zu vermehren (MACKANESS, 1962), machten das Bakterium zum Prototypen eines intrazellulären Erregers (COSSART u. MENGAUD, 1989), und das Modell der murinen Listeriose trug viel zum Verständnis der zellulären Immunität bei (SHEN et al., 1998). 2.5.1 Infektionszyklus und Virulenzfaktoren von L. monocytogenes Listerien sind nicht nur in der Lage, in professionell phagozytierenden Zellen wie Makrophagen, Monozyten (MACKANESS, 1962) und dendritischen Zellen (GUZMAN et al., 1995) zu überleben und sich dort zu vermehren, sondern können die eigene Aufnahme auch in normalerweise nicht-phagozytierende Zellen induzieren (COSSART u. LECUIT, 1998). Dies konnte für Epithelzellen (PORTNOY et al., 1988), Fibroblasten (KUHN et al., 1988; SUN et al., 1990), Hepatozyten (DRAMSI et al., 1995), Endothelzellen (PARIDA et al., 1998) und Nervenzellen (DRAMSI et al., 1998) gezeigt werden. In allen diesen Zellen entwickelt das Bakterium einen Lebenszyklus mit den gleichen charakteristischen Merkmalen. Der Zyklus beginnt mit der Anheftung an die Oberfläche und wird gefolgt von dem Eindringen des Bakteriums in die eukaryotische Wirtszelle (Abb. 3). Obwohl der Mechanismus der Literaturübersicht 45 Aufnahme noch nicht vollständig aufgeklärt ist, scheinen verschiedene eukaryotische Rezeptoren beteiligt zu sein. Die Komplementrezeptoren C3bi und C1q sollen bei der Internalisierung von L. monocytogenes in professionell phagozytierende Zellen eine Rolle spielen (DREVETS u. CAMPBELL, 1991; DREVETS et al., 1993). Der Scavenger-Rezeptor von Makrophagen bindet die Lipotheichonsäure der Listerien und soll daher in die Interaktion zwischen Bakterium und Makrophagen involviert sein (DUNNE et al., 1994). Die Aufnahme in nicht-phagozytierende Zellen wird von Oberflächenproteinen von L. monocytogenes induziert, den sogenannten Internalinen (Inl) (DREVETS et al., 1995). Mittlerweile wurde eine große Gruppe dieser Invasine identifiziert, deren Gemeinsamkeit in einer Leucin-reichen Tandem Repeat Domäne besteht (DRAMSI et al., 1997). Am besten charakterisiert sind die zuerst gefundenen Inl A und Inl B (codiert von inlA und inlB, GAILLARD et al., 1991). Der Wirtszellrezeptor für Inl A ist E-Cadherin, ein interzelluläres Adhäsionsprotein auf der Oberfläche epithelialer Zellen, wie Enterozyten (MENGAUD et al., 1996). E-Cadherin kommt auch auf der Oberfläche von Hepatozyten, dendritischen Zellen, mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns und den Endothelzellen des Choroidplexus und der plazentären Chorionvilli vor. Alle diese Zellen sind potentielle Zielzellen einer Listerieninfektion. Auch für Inl B wurden zwei Rezeptoren identifiziert, der Tyrosinkinase-Rezeptor cMet und ein zellulärer Ligand des C1q-Komplementrezeptors (SHEN et al., 2000). Es ist jedoch noch unklar, ob diese beiden Rezeptoren gemeinsam oder unabhängig voneinander die Aufnahme von L. monocytogenes bewirken. Tatsächlich besitzen Inl A und Inl B unterschiedliche Aufgaben bei der Aufnahme von L. monocytogenes in Wirtszellen. So ist nur Inl A essentiell für die Invasion humaner Enterozyten, während nur Inl B die Aufnahme in murine Hepatozyten zu vermitteln vermag. Beide Internaline sind dagegen zur Internalisierung von L. monocytogenes in humane Hepatozyten notwendig (DRAMSI et al., 1995). Inl A vermittelt außerdem mindestens 50% der Serum-unabhängigen Phagozytose durch murine Makrophagen (SAWYER et al., 1996). Die Funktion des Inl A für die Aufnahme in eine Wirtszelle ist aus gegenwärtiger Sicht auf E-Cadherin-exprimierende Zellen beschränkt, während Inl B den Eintritt in verschiedene Zelltypen verschiedener Spezies vermittelt, so in Hep-2-, 46 Literaturübersicht HeLa-, CHO-Zellen und in Hepatozyten und Endothelzellen (DRAMSI et al., 1997; MENGAUD et al., 1996; PARIDA et al., 1998). Ein Durchbruch im Verständnis der Inl A-Funktion gelang LECUIT et al. (1999) mit dem Nachweis, dass die Aminosäure Prolin an Position 16 in der ersten extrazellulären Domäne des E-Cadherin entscheidend für die Anheftung von L. monocytogenes an die Wirtszelle ist. So sind Enterozyten von Mensch und Meerschweinchen empfänglich für eine Inl A-vermittelte Listerieninvasion, nicht jedoch die Enterozyten von Maus und Ratte, deren E-Cadherin an Position 16 die Aminosäure Glutaminsäure trägt. SCHUBERT et al. (2002) stellten die unterschiedlichen räumlichen Strukturen des humanen und des murinen E-Cadherins dar. Während der Invasion wird L. monocytogenes in eine phagozytische Vakuole eingeschlossen (GAILLARD et al., 1987; TILNEY u. PORTNOY, 1989). Dieses Phagosom wird durch Verschmelzen mit Lysosomen zum angesäuerten Phagolysosom, durch dessen Milieu etwa 90% der internalisierten Listerien abgetötet werden (DE CHASTELLIER u. BERCHE, 1994). Durch den niedrigen pH-Wert wird jedoch auch das von den Bakterien sezernierte Hämolysin LLO aktiviert, welches ein pH-Optimum von 5,5 besitzt (GEOFFROY et al., 1987). LLO ist das Produkt des hlyGens, welches als erstes Virulenzgen von L. monocytogenes identifiziert wurde und eine Schlüsselfunktion in der Pathogenese der Listerieninfektion innehat. Das LLO ist dem Streptolysin O von Streptococcus pyogenes (SLO) verwandt (GEOFFROY et al., 1987; JENKINS et al., 1964) und gehört zur Familie der Cholesterin-abhängigen, porenformenden Toxine (GEOFFROY et al., 1987). Es handelt sich um ein Polypeptid, bestehend aus 529 Aminosäuren, welches nur der Spezies L. monocytogenes eigen ist (MENGAUD et al., 1988). In Zellkulturstudien wurde nachgewiesen, dass LLO essentiell für das Überleben und die Vermehrung von L. monocytogenes in Makrophagen und nicht-phagozytierenden Zellen ist (PORTNOY et al., 1988). LLO bewirkt die Zerstörung der phagolysosomalen Membran und ermöglicht dem Bakterium, etwa 30 min nach seiner Aufnahme, ins Zytosol der Wirtszelle zu gelangen. Neben LLO sind weitere Virulenzfaktoren, wie eine Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (Plc A, codiert von plcA), die Literaturübersicht 47 unspezifische Phospholipase C (Lecithinase oder PIc B, codiert von plcB) an der Freisetzung ins Zytosol beteiligt (CAMILLI et al., 1993; LEIMEISTER-WÄCHTER et al., 1991). PIc B wird dabei durch eine Metalloprotease aktiviert (POYART et al., 1993). Es wird vermutet, dass die Poren oder Membranläsionen, die LLO erzeugt, den Phospholipasen Zutritt zu ihren Substraten verschaffen, wodurch es zur Zerstörung der physikalischen Barriere und somit zur Auflösung des Phagosoms kommt (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001). Nach dem Entweichen aus der Vakuole beginnen die Bakterien sich im Zytosol zu vermehren und werden gleichzeitig von Aktinfilamenten der Wirtszelle umgeben. Innerhalb von 2 h führt diese zunächst unsymmetrische Polymerisierung des Aktins zur Ausbildung einer Art „Kometenschweif“, mit dessen Hilfe sich die Bakterien mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 0,3 µm/s durch das Zytosol fortbewegen können (TILNEY u. PORTNOY, 1989). Die Polymerisierung des Aktins ist histologisch nachweisbar (COSSART u. LECUIT, 1998; DOMANN et al., 1993; MARQUIS et al., 1995). Ein weiterer Virulenzfaktor der Listerien, das Act A, ein 90 kDa membranständiges Protein, initiiert dabei die Polymerisierung der freien Aktinfilamente an dem Aktinschweif (DARJI et al., 1998; KOCKS et al., 1992). Act ADeletionsmutanten sind intrazellulär nicht mobil und zeigen in vivo keine Virulenz. Die Aktin-vermittelte, nicht zielgerichtete Bewegung lässt einige Listerien mit der Plasmamembran ihrer Wirtszelle in Kontakt gelangen, die daraufhin fingerförmige als Protrusionen bezeichnete - Ausstülpungen bildet (PORTNOY et al., 1992). Diese Protrusionen dringen in die benachbarte Zelle ein bzw. werden von dieser phagozytiert, worauf ein Bakterium in einem jetzt doppelwandigen Phagosom in der neuen Wirtszelle vorliegt. Innerhalb weniger Minuten tritt die Listerie, vermittelt durch LLO, Plc A und Plc B, aus diesem zweiten Phagosom aus (VAZQUEZ-BOLAND et al., 1992) und gelangt ins Zytosol, worauf der Infektionszyklus geschlossen ist und erneut beginnen kann. Durch den beschriebenen Mechanismus des interzellulären Spreadings vermag L. monocytogenes den Angriff von Effektormolekülen des humoralen Immunsystems, wie Antikörper und Komplementfaktoren, zu umgehen. Für humane Endothelzellen wurden sowohl die direkte Inl-vermittelte Invasion als auch ein Spreading über adhäsive, Listerien-infizierte Makrophagen beschrieben 48 Literaturübersicht (DREVETS et al., 1995). Auf diese Art und Weise scheinen Listerien auch Bluthirnund Plazentarschranke überwinden zu können (GREIFFENBERG et al., 1998; PARIDA et al., 1998). Abb. 3: Infektionszyklus von L. monocytogenes (nach TILNEY und PORTNOY, 1989). Entgegen des Uhrzeigersinns: Eintritt des Bakteriums in die Wirtszelle, Einschluss im Phagosom, Freisetzung aus dem Phagosom, zytosolische Aktinpolymerisation und Replikation, Bewegung mittels Aktinschweif, Ausbildung von Protrusionen, Internalisierung der Ausstülpung durch die Nachbarzelle, Einschluss in ein doppelwandiges Phagosom, Freisetzung aus dem zweiten Phagosom, Neubeginn des Infektionszyklus. Literaturübersicht 2.5.2 49 Listeriose Davon ausgehend, dass Listerien ubiquitär verbreitet sind und mit großer Häufigkeit Nahrungsmittelrohstoffe und industriell erzeugte Nahrungsmittel kontaminieren (FARBER u. PETERKIN, 1991), ist die Aufnahme der Erreger mit der Nahrung vermutlich ein alltägliches Geschehen (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001). Die Inzidenz humaner Listeriose-Fälle ist jedoch mit 2 - 8 Fällen pro eine Million Menschen in Europa und den USA als sehr gering einzustufen (FARBER u. PETERKIN, 1991; TAPPERO et al., 1995). Kommt es dagegen zu epidemischen Verläufen in Zielpopulationen, steigt die Inzidenz dramatisch (bis Faktor 10) an (ADAK et al., 2002; TAPPERO et al., 1995). Dies weist zum einen auf die Bedeutung der Wirtssuszeptibilität, zum anderen darauf hin, dass Listerien offensichtlich eine niedrigere Pathogenität als andere Nahrungsmittelerreger besitzen. Damit stimmt auch die im Mausmodell gefundene hohe LD50 für L. monocytogenes (orale LD50: 109 KBE, parenterale LD50: 105 - 106 KBE) überein (AUDURIER et al., 1980; OKAMOTO et al., 1994). Obwohl die minimale Dosis, die beim Menschen eine Listerieninfektion hervorruft, nicht bekannt ist, wurden in kontaminierten, infektionsauslösenden Nahrungsmitteln stets hohe Keimzahlen (etwa 106 KBE) gefunden. Eine entscheidende Rolle für den Ausbruch der Krankheit spielt die Wirtssuszeptibilität. In immunkompetenten Erwachsenen verläuft die Listerieninfektion meist unbemerkt oder mit erkältungsähnlichen Symptomen und spontaner Genesung. Patienten mit Listeriose haben dagegen häufig einen physiologischen oder pathologischen Defekt der T-Zellimmunität (VAZQUEZBOLAND et al., 2001). Risikogruppen sind Schwangere und Neugeborene, ältere Menschen (> 60 Jahre) oder immunsupprimierte Menschen (SCHUCHAT et al., 1991). Bei diesen Patienten können die Erreger schwere invasive Infektionen hervorrufen, die in Form von Septikämie oder Meningoenzephalitis auftreten (LORBER, 1997). opportunistischen Es ist daher Krankheitserreger gerechtfertigt, anzusprechen, L. monocytogenes auch wenn als neuere epidemiologische Untersuchungen vom Auftreten durch Listerien verursachter 50 Literaturübersicht fiebriger Gastroenteritiden bei immunkompetenten Patienten berichten (AURELI et al., 2000; MIETTINEN et al., 1999). Da kontaminierte Nahrungsmittel als Hauptinfektionsquelle der Listerieninfektion angesehen werden, geht man vom Gastrointestinaltrakt als Eintrittspforte für die Erreger aus. Bei Gastroenteritiden beginnt der klinische Verlauf etwa 20 h nach Aufnahme hochgradig kontaminierter Nahrungsmittel (DALTON et al., 1997). Die Inkubationszeit der invasiven Erkrankung ist mit etwa 20 Tagen dagegen deutlich länger (RIEDO et al., 1994). Bevor die Bakterien den Darm erreichen, wird vermutlich ein großer Teil der Erreger durch das azidophile Milieu des Magens abgetötet (SCHLECH, et al., 1993). Es wird kontrovers diskutiert, wie die verbleibenden Keime die mukosale Barriere passieren (JENSEN et al., 1998; MARCO et al., 1997). Neuere Untersuchungen scheinen dafür zu sprechen, dass es sich um einen unspezifischen Prozess handelt, bei dem weder Enterozyten noch M-Zellen bevorzugt werden (PRON et al., 1998). Nach Überwinden der Darmschranke werden die Listerien über Blut- und Lymphwege in die mesenterialen Lymphknoten, Leber und Milz transportiert. Die i.v. Infektion im Mausmodell zeigt eine schnelle Beseitigung der Keime aus dem Blut durch in Milz und Leber angesiedelte Makrophagen (MACKANESS, 1962). So scheint die Interaktion zwischen Listerien-infizierten Makrophagen und natürlichen Killer (NK)-Zellen ausschlaggebend für die Wirtsabwehr in dieser frühen Phase der Infektion zu sein (UNANUE, 1997). Infizierte Makrophagen sezernieren den Tumornekrosefaktor (TNF) α und Interleukin (IL) 12, zwei wichtige Zytokine des unspezifischen Immunsystems. Diese beiden Zytokine regen die NK-Zellen zur Produktion von IFN γ an. Die Kombination aus TNF α und IFN γ aktiviert die Makrophagen zu Produktion freier, die Listerien abtötender Radikale (BECKERMAN et al., 1993). Ein entscheidender Vorteil der Listerien in der Interaktion mit Zellen des Immunsystems liegt darin, dass T-Lymphozyten, die auf LLO exprimierende, antigenpräsentierende Zellen treffen, von diesen nicht stimuliert, sondern im Gegenteil durch LLO in ihrer MHC II-vermittelten Immunantwort inhibiert werden. Dies stellt einen die Infektion begünstigenden Faktor dar (DARJI et al., 1997). Literaturübersicht 51 Etwa 90% der im Blut zirkulierenden Bakterien werden von den Kupfferschen Zellen der Leber aufgenommen und abgetötet (EBE et al., 1999). Verbleibende Bakterien beginnen dagegen zu wachsen, was sich im Mausmodell an steigenden Keimzahlen in den Organen zwischen Tag 2 und 5 p.i. erkennen lässt (CHEERS et al., 1978; DE CHASTELLIER u. BERCHE, 1994; FLEMING u. CAMPBELL, 1997; MANDEL u. CHEERS, 1980). Hauptreplikationsort für die Listerien in der Leber sind die Hepatozyten (CONLAN u. NORTH, 1992). Infizierte Hepatozyten setzen Chemokine frei, die neutrophile Granulozyten anlocken (CONLAN u. NORTH, 1992; ROGERS et al., 1996). Dadurch kommt es erst zur Bildung von Mikroabszessen und schließlich auch zur Zerstörung der infizierten Hepatozyten. Der Neutrophileninflux verändert sich an Tag 2 - 4 p.i. zugunsten einer Infiltration mit Makrophagen und T-Zellen, die charakteristische Granulome ausbilden (MANDEL u. CHEERS, 1980). Diese Granulome stellen eine physikalische Barriere zur Abgrenzung der Infektionsherde dar (PORTNOY et al., 1992). Zwischen Tag 5 und 7 p.i. beginnt in der Maus eine Elimination der Keime als Ergebnis der Makrophagenaktivität und aktivierter CD8+-T-Zellen, die durch Sekretion von Perforin, TNF α und IFN γ zur Ausbildung der antilisteriellen Immunität beitragen (WHITE et al., 2000a; WHITE et al., 2000b). Gelingt es dem Wirtsorganismus nicht, der Infektion der Leber eine entsprechende Immunantwort entgegen zu setzen, so kommt es im weiteren zu einer verlängerten bakteriämischen Phase, in deren Folge sekundäre Zielorgane wie das Gehirn oder bei Schwangeren die Plazenta und anschließend der Fötus infiziert werden. Dass Listerien neurotrop sind, zeigt das häufige Auftreten der zerebralen Listeriose bei Wiederkäuern nach Aufnahme kontaminierter Silage, oft ausgeprägt als Syndrom der Circling Disease (WESLEY, 1999). Während die Infektion des zentralen Nervensystems beim Wiederkäuer charakteristischerweise in einer Enzephalitis des Rautenhirns resultiert, bildet der Mensch überwiegend eine Meningoenzephalitis aus (PARIDA et al., 1998). Zur Ausprägung der fötomaternalen Listeriose kommt es bei Schwangeren, wenn die Listerien die Plazentarschranke durchbrechen. Die detaillierte Kenntnis des murinen Infektionsmodells von L. monocytogenes und die Möglichkeit, die Keime durch Antibiotika sicher aus dem Modellorganismus 52 eliminieren Literaturübersicht zu L. monocytogenes können, zu machen einem das interessanten fakultativ intrazelluläre Kandidaten für die Bakterium somatische Gentherapie (WEISS u. KRUSCH, 2001). 2.5.3 Attenuierte Mutanten von L. monocytogenes Es besteht eine enge Korrelation zwischen hämolytischer Aktivität und Pathogenität bei der Gattung Listeria. So sind L. monocytogenes und L. ivanovii hämolytisch, die übrigen apathogenen Arten nicht (SEELIGER u. JONES, 1986). Durch TransposonMutagenese erzeugte, isogene LLO-Mutanten von L. monocytogenes zeigten in der Maus eine starke Abschwächung ihrer Virulenz (Anstieg der LD50 um den Faktor 104 KBE, COSSART et al., 1989; PORTNOY et al., 1988). Umgekehrt zeigten spontane Revertanten nach Verlust des Transposons wieder ihre ursprüngliche hämolytische Aktivität und Pathogenität (COSSART et al., 1989; GAILLARD et al., 1986). Die genetische Analyse solcher Mutanten führte zur Identifizierung des hlyGens (MENGAUD et al. 1987). Trotz seiner Bedeutung für die Freisetzung der Listerien aus dem Phagosom findet man auch Zellen, in denen LLO nicht für den Austritt in das Zytosol benötigt wird (HENSE et al., 2001; MARQUIS et al., 1995; PORTNOY et al., 1988). Der Stamm L. monocytogenes EGD-e, Serotyp 1/2a wurde 1989 von LEIMEISTERWÄCHTER und CHAKRABORTY beschrieben. Trotz schwacher Hämolyseeigenschaften zeigt er im Mausmodell eine starke Virulenz (KAUFMANN, 1984). Nach einer Klassifizierung, die das Auftreten verschiedener Serovare in humanen und tierischen Krankheitsfällen zugrunde legt, ist der Serotyp 1/2a in die Gruppe der Stämme einzuordnen, die sowohl Infektionen beim Menschen - keine Schwangerschaftslisteriose - als auch beim Tier erzeugt (WIEDMANN et al., 1997). Auf der Basis dieses Stammes wurde die isogene hly-Deletionsmutante ∆hly generiert, die kein LLO exprimierte und nicht hämolytisch war (GUZMAN et al., 1995). Obwohl sie eine erniedrigte Infektionsrate zeigte (2% anstelle von 17%), war diese Mutante in der Lage, murine dendritische Zellen zu infizieren und in diesen zu Literaturübersicht 53 überleben. Weitere Deletionsmutanten, in denen die Gene inlA, inlB, mlp oder actA ausgeschaltet wurden, zeigten ähnliche Kinetiken in der Infektion dendritischer Zellen (GUZMAN et al., 1995). Mit einem actA-Promotor-kontrollierten Autolysin-Gen aus Bakteriophagen im Listeriengenom gelang es, ein autolytisches System zu erzeugen, dessen lytischer Faktor vorwiegend nach der Freisetzung des Bakteriums im Zytosol aktiviert wird (DIETRICH et al., 1998). 2.5.4 L. monocytogenes-vermittelter Gentransfer Von den grampositiven Bakterien hat bislang nur L. monocytogenes das Interesse für Bakterien-vermittelten Gentransfer geweckt (WEISS u. KRUSCH, 2001). Mit seinen Fähigkeiten, sowohl phagozytotische als auch nicht-phagozytotische Zellen zu infizieren und aus dem Phagosom der Wirtszelle zu entkommen, ähnelt L. monocytogenes S. flexneri (DIETRICH et al., 2000). Mit dem oben erwähnten autolytischen System ließ sich die Expression verschiedener Reportergene in murinen Makrophagen nachweisen (DIETRICH et al., 1998). BALB/c-Mäuse ließen sich mit attenuierten rekombinanten Listerien gegen das Antigen Leishmania-activated C-Kinase immunisieren (SAKLANI-JUSFORGUES et al., 2003). Die Mäuse zeigten nach enteraler Applikation der Bakterien eine signifikante Erhöhung von INFγ und IL 4 durch Aktivierung von CD4+-T-Zellen. Eine einmalige Immunisierung von Mäusen mit L. monocytogenes- Deletionsmutanten, bei denen verschiedene Virulenzgene ausgeschaltet waren, führte durch Induktion von CD8+-Gedächtniszellen zu einem lang anhaltenden Schutz gegen die Infektion mit dem Wildtyp-Stamm (DARJI et al., 2003). In vitro gelang des weiteren die Transfektion muriner dendritischer Zellen (DIETRICH et al., 2000), und auch in vivo konnten aus Maus und Baumwollratte Makrophagen isoliert werden, die das Reportergen exprimierten (SPRENG et al. 2000). Nach Transfer eines Modellantigens in murine Makrophagen ließ sich eine MHC Ivermittelte Immunantwort nachweisen. 54 Literaturübersicht Das Abtöten der intrazellulären Erreger zu gewissen Zeitpunkten durch Antibiotika bietet eine weitere Möglichkeit, ein rekombinantes Plasmid aus L. monocytogenes in der eukaryotischen Wirtszelle freizusetzen (KRUSCH et al., 2002; WEISS u. KRUSCH, 2001). Indem sie L. monocytogenes EGD-e, Serotyp 1/2a als Vektor einsetzten, konnten HENSE et al. (2001) den Transfer eines GFP-tragenden Expressionsplasmids (s. Abb. 4) in verschiedene epitheliale, fibroblastische und Makrophagen-Zelllinien und die Expression des GFP in den eukaryotischen Zellen zeigen. In dieser Arbeitsgruppe wurde auch eine isogene Mutante des Stamms L. monocytogenes EGD-e, Serotyp 1/2a generiert, bei der die Aminosäure Tryptophan an Position 491 des hly-Gens durch Alanin ersetzt wurde (L. monocytogenes EGD hly W 491 A). Durch diese Punktmutation gelang es, die hämolytische Aktivität des Stamms auf 10% zu reduzieren (KRUSCH et al., 2002). Nachdem in diesen Stamm das GFP-tragende Expressionsplasmid (s. oben und Abb. 4) eingeschleust worden war, zeigte die Infektion von CHO-Zellen einen deutlich höheren Anteil GFP-exprimierender Zellen, verglichen mit den Stämmen L. monocytogenes EGD-e, Serotyp 1/2a und L. monocytogenes ∆hly, einer LLODeletionsmutante (Abb. 5). In einem weiteren Experiment, bei dem das CFTRtragende Plasmid pERL3-CMVCFTR-neo in L. monocytogenes EGD hlyW491A eingeschleust worden war, konnte die Transfektion von CHO-Zellen durch Nachweis funktionellen CFTRs mittels Immunhistochemie, Immunoblot- und Whole-cell Patchclamp-Analyse bewiesen werden. Durch Steigerung der Dosis und Verwendung geeigneter Antibiotika (Hemmstoffe der bakteriellen Zellwandsynthese wie Penicillin) ließ sich die Transferrate deutlich erhöhen. Die Autoren folgerten, dass mit dem Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP aufgrund der abgeschwächten Virulenz, bei bestehendem Vermögen, einem Phagosom zu entkommen, und der guten Kontrollierbarkeit durch Antibiotika ein geeigneter Vektor für den Gentransfer sowohl des Reportergens GFP, aber auch des CFTR-Gens gefunden sei (KRUSCH et al., 2002; WEISS u. KRUSCH, 2001). Literaturübersicht 55 % GFP-expressing cells 4 MOI 50:1 MOI 500:1 3 2 1 0 EGD hlyW491A ∆hly2 L. monocytogenes strain Abb. 4: Eukaryotisches Expressionsplasmid Abb.5: Durchflusszytrometrisch bestimmte nach HENSE et al. (2001). GFP-Expression in CHO-Zellen nach durch pBR ori: E. coli-Replikationsursprung, L. monocytogenes-vermittelten Gentransfer pAMß1 ori: L. monocytogenes- Replika- (KRUSCH et al., 2002). tionsursprung, EM r: Erythromycin- Die Zellen wurden mit verschiedenen Resistenz, P CMV IE: immediate early L. monocytogenes-Stämmen infiziert (EGD: human cytomegalovirus-Promotor, SV 40 L.m. EGD; hlyW491A: L.m. EGD hlyW491A SD/SA: SV 40 Splice-Donor/ Splice-Akzep- + pERL3-CMVGFP, ∆hly: L.m. ∆hly), MOI: tor, GFP: cDNA für GFP codierend, SV 40 Multiplizität der Infektion. poly-A: SV 40-Polyadenylierungssignal 56 2.6 Literaturübersicht Murine Suszeptibilität gegenüber Infektionserregern Die Hintergrundstämme der im ZTL erzeugten congenen Cftrtm1Hgu-Stämme wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Suszeptibilität gegenüber bakteriellen Infektionen ausgewählt (AUTENRIETH et al., 1994; BUTLER 1973; CHIODINI u. BUERGELT, 1993; MORISSETTE et al., 1995; PLANT u. GLYNN, 1974; ROBSON u. VAS, 1972; SADARANGANI et al., 1980; TANAKA et al., 1994). 2.6.1 BALB/c Der Albinostamm ist seit 1913 etabliert und gehört zu den am häufigsten eingesetzten Inzuchtstämmen. BALB/c-Substämme zeichnen sich durch eine hohe Fruchtbarkeit aus und haben unter konventionellen Haltungsbedingungen eine mittlere Lebensdauer (weibliche Tiere im Mittel 575 Tage, STORER, 1966). Die Mäuse sind suszeptibel für eine Reihe von Infektionserregern, so z.B. für S. typhimurium (PLANT u. GLYNN, 1974), Mycobacterium paratuberculosis (CHIODINI u. BUERGELT, 1993) und Yersinia enterocolitica (AUTENRIETH et al., 1994). Resistent zeigen sich Mäuse dieses Stammes dagegen gegen Helicobacter pylori (MÄHLER et al., 2002) und Pseudomonas aeruginosa (MORISSETTE et al., 1995). 2.6.2 DBA/2 Der Stamm DBA wurde 1909 von Little wegen seiner Fellfarbe (milchkaffeefarben) abgegrenzt und ist damit der älteste Mausinzuchtstamm überhaupt. Zwischen 1929 und 1930 wurden die beiden Substämme DBA/1 und DBA/2 geschaffen, die in so zahlreichen Genorten polymorph sind, dass man eher von verschiedenen Stämmen als von Substämmen sprechen kann (FESTING, 1999). DBA/2-Mäuse zeigen in konventioneller Haltung eine lange Lebensdauer (im Mittel 714 Tage für weibliche Literaturübersicht 57 Tiere, STORER, 1966). Die Mäuse sind resistent gegenüber Infektionen mit Helicobacter pylori (MÄHLER et al., 2002), suszeptibel dagegen für S. typhimurium (PLANT u. GLYNN, 1974) und Pseudomonas aeruginosa (MORISSETTE et al., 1995). Die Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa sind durch eine hohe Mortalität gekennzeichnet. 2.6.3 C57BL/6 Der Substamm ging schon vor 1937 aus dem 1921 entstandenen Stamm C57BL (schwarz, Little und Lathrop) hervor. C57BL/6 ist heute der am häufigsten eingesetzte Inzuchtstamm der Welt und der genetische Hintergrundstamm zahlreicher congener Stämme. C57BL/6-Mäuse besitzen eine hohe Lebensdauer (750 Tage für weibliche Tiere, ROWLATT et al., 1976), sie zeigen allerdings eine hohe Bereitschaft zu Aggressivität und Kannibalismus (BUTLER, 1973). Suszeptibel sind C57BL/6-Mäuse für Infektionen mit S. typhimurium (ROBSON u. VAS, 1972) und Mycobacterium paratuberculosis (TANAKA et al., 1994). Sie zeigen sich dagegen resistent gegen Infektionen mit Yersinia enterocolitica (AUTENRIETH et al., 1994), Helicobacter pylori (MÄHLER et al., 2002) und besitzen auch eine sehr hohe Resistenz gegenüber Listeria monocytogenes (s. Kap. 2.6.4). Als Vorteil für die Nachahmung der pulmonalen Erkrankung der humanen CF wäre die Empfänglichkeit gegen CF-typische Erreger wie Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia anzusehen (DAVIDSON et al., 1995; RATJEN u. DÖRING 2003; TÜMMLER u. KIEWITZ, 1999). Da in der vorliegenden Arbeit die Eignung des grampositiven Bakteriums L. monocytogenes als Vektor einer möglichen somatischen Gentherapie für die CF im Infektionsmodell Maus untersucht werden soll, ist die Suszeptibilität der Mausstämme für diesen Erreger hier von besonderer Bedeutung (s. Kap. 2.6.4). 58 Literaturübersicht 2.6.4 Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes Die Infektion der Maus mit L. monocytogenes gilt als gut untersuchtes Modell der Pathogenese intrazellulärer Erreger und der Regulation zellulärer Immunität (CZUPRYNSKI et al., 2003; MACKANESS, 1962; MANDEL u. CHEERS, 1980; MILON, 1997). In Abhängigkeit von ihrem genetischen Hintergrund unterscheidet man bei Mausstämmen zwei grundsätzlich unterschiedliche Immunreaktionen auf eine parenterale Listerieninfektion, die als „frühe Resistenz“ und „frühe Suszeptibilität“ beurteilt werden (CZUPRYNSKI u. BROWN, 1986; MILON, 1997). Zwischen resistenten und suszeptiblen Stämmen wurden Unterschiede in der LD50 und in den Keimzahlen von Leber und Milz um den Faktor 100 nachgewiesen (CHEERS u. MCKENZIE 1978; CZUPRYNSKI et al. 2003; KONGSHAVN 1986; SADARANGANI et al., 1980). Die murine systemische Listerieninfektion ist durch ein Überleben der Erreger in Makrophagen und Hepatozyten gekennzeichnet (ZHAN et al., 1998). Bereits sehr früh im Infektionsverlauf kommt es zu einer Makrophagen-Akkumulation in der Leber, wobei es sich bei den Makrophagen vorwiegend um unreife, sich rasch teilende phagozytäre Blutmonozyten handelt (STEVENSON et al., 1981). Diese durch die zelluläre Immunantwort gekennzeichnete frühe Phase, noch vor dem Auftreten sensibilisierter T-Zellen, ist entscheidend für den weiteren Infektionsverlauf (SADARANGANI et al., 1980; STEVENSON et al., 1981). Infizierte Makrophagen aktivieren natürliche Killerzellen und induzieren die primäre Immunantwort (UNANUE, 1997a). Die T-Zellantwort beinhaltet sowohl die Aktivierung von CD4+- als auch von CD8+-T-Zellen, die beide eine protektive Immunität vermitteln (LADEL et al., 1994). Dass die Immunantwort gegen L. monocytogenes zellulär und nicht humoral vermittelt ist, belegen Untersuchungen, die zeigen, dass eine Immunisierung sowohl resistenter als auch suszeptibler Mäuse durch Verabreichung sensibilisierter T-Zellen, nicht aber durch Antikörper möglich ist (CHEERS et al., 1978). Das Schlüsselzytokin der Aktivierung naiver T-Zellen zu Th 1-Helfer-Zellen ist das von den infizierten Makrophagen produzierte IL 12 (UNANUE, 1997a). Die Th 1-Helfer- Literaturübersicht 59 Zellen ihrerseits produzieren INF γ und IL 2, die wiederum neue Makrophagen zu bakterizider Aktivität stimulieren (MACKANESS, 1969; UNANUE, 1997a). Der Unterschied der genetisch bedingten Suszeptibilität wird bereits in den ersten 48h der Infektion deutlich (CHEERS et al. 1978; MACKANESS 1969 SADARANGANI et al., 1980; STEVENSON et al., 1981). Resistente Stämme zeigen den beschriebenen massiven Einstrom von Makrophagen und Entzündungsmediatoren (INF γ, TNF α, IL 1, IL 6 und IL 12, UNANUE, 1997a), während es bei suszeptiblen Stämmen zur Proliferation der Erreger in Leber und Milz kommt, in Abhängigkeit von der Infektionsdosis (> 104 KBE; STEVENSON et al., 1981) gefolgt von Bakteriämie und schließlich dem Tod der Tiere. Die Qualität der frühen zellulären Immunantwort ist dabei v.a. durch folgende Parameter gekennzeichnet (CHEERS u. MCKENZIE 1978; KONGSHAVN u. SKAMENE 1984; SADARANGANI et al., 1980): • die Größe des Reservoirs unreifer phagozytotischer Monozyten • die Geschwindigkeit ihrer Mobilisierung und Reifung • die Effizienz ihrer Phagozytose- und bakteriziden Aktivität Untersuchungen, in denen das Knochenmark und damit das Reservoir des mononukleären phagozytotischen Systems durch Bestrahlung zerstört wurde, zeigen eine Aufhebung der natürlichen Resistenz, während die Keimzahlen suszeptibler Stämme sich nicht veränderten (SADARANGANI et al., 1980). Die angenommene genetische Ursache der Suszeptibilität gegenüber L. monocytogenes wurde durch Rückkreuzungsstudien zwischen resistenten und suszeptiblen Stämmen untersucht (CHEERS u. MCKENZIE, 1978; KONGSHAVN, 1986 SKAMENE et al., 1979) und als MHC-unabhängiges, autosomales und unvollständig dominant exprimiertes Listeria resistance (Lsr1)-Gen bzw. Gencluster mit dem Hc-Lokus von Chromosom 2 beschrieben (CHEERS u. MCKENZIE, 1978; SADARANGANI et al., 1980; SKAMENE et al., 1979; STEVENSON et al., 1981). Neben der Rückführung der frühen zellvermittelten Immunität auf ein MHCunabhängiges Gen gibt es jedoch auch Anzeichen, dass zumindest die später erfolgende T-zellvermittelte Immunantwort MHC-kontrolliert ist (KONGSHAVN, 1986). So beginnt die T-zellvermittelte Immunantwort in resistenten Stämmen etwa 60 Literaturübersicht 24 – 48 h früher als in suszeptiblen (CHEERS et al., 1978; KONGSHAVN, 1986). Die Beobachtung, dass Listerien-resistente Mausstämme den MHC-Haplotyp H 2b und Listerien-suszeptible Stämme den Haplotyp H 2a oder H 2d besitzen, unterstützt diese Vermutung (KONGSHAVN, 1986; SKAMENE et al., 1979; STEVENSON et al., 1981). Tabelle 4 beschreibt die Suszeptibilität der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Stämme unter Angabe ihres MHC-Haplotyps. Die meisten Untersuchungen des murinen Listerien-Infektionsmodells wurden als parenterale, d.h. i.p oder i.v. induzierte Infektionen durchgeführt. Die natürliche Listerieninfektion erfolgt jedoch meist oral, so dass der Gastrointestinaltrakt bzw. die Darmmukosa die natürliche Eintrittspforte der Erreger darstellt (CZUPRYNSKI et al., 2003; DANIELS et al., 2000). Beim Menschen erfolgt der Eintritt in die Enterozyten über die Inl A-vermittelte Bindung an das Adhäsionsprotein E-Cadherin (MENGAUD et al., 1996). Wie bereits beschrieben (s. Kap. 2.4.1) sind Listerien nicht in der Lage, das murine E-Cadherin als Rezeptor zu erkennen, da dieses eine andere Aminosäuresequenz besitzt (LECUIT et al., 1999). Darmepithelzellen gentechnisch modifizierter Mäuse, die humanes E-Cadherin exprimieren, können dagegen von Listerien infiziert werden (FINLAY, 2001; LECUIT et al., 2001). Diese natürliche Resistenz der Maus gegen eine orale Infektion mit Listerien galt es demnach mit dem Ziel der Nachahmung der natürlichen Listerieninfektion des Menschen zu überwinden (CZUPRYNSKI et al., 2003; FINLAY, 2001). In einem Ligated LoopModell des Ileums der Ratte disseminierten 0,01% Listerien innerhalb von 15 min nach Applikation von 109 KBE in mesenteriale Lymphknoten, Leber und Milz (PRON et al., 1998). Das Überwinden der Darmschranke erfolgte unabhängig vom lymphatischen Gewebe der Peyerschen Platten, wo jedoch eine vermehrte Replikation der Keime gesehen wurde. Auch Untersuchungen in der Maus wiesen darauf hin, dass Listerien im Gegensatz z.B. zu Salmonellen oder Shigellen keine bestimmte Zellart für ihren Eintritt in die Darmmukosa benötigen (DANIELS et al., 2000). Die Geschwindigkeit, mit der die Listerien auch hier in Leber und Milz nachgewiesen werden konnten, spricht für eine direkte Dissemination über das Blut und nicht für den Umweg über phagozytierende Makrophagen. Obwohl der zelluläre Mechanismus, mit dem Listerien die Darmschranke der Maus überwinden, noch nicht Literaturübersicht geklärt ist, 61 belegen die Untersuchungen, dass eine gastrointestinale Listerieninfektion durch eine entsprechend hohe Infektionsdosis (≤ 109 KBE) möglich ist. Neuere Untersuchungen konnten zeigen, dass die durch den Hc-Lokus auf Chromosom 2 vermittelte natürliche Resistenz bzw. Suszeptibilität von Mausstämmen gegen eine parenterale Listerieninfektion entsprechend auch eine gastrointestinale Infektion mit L. monocytogenes reguliert (CZUPRYNSKI et al., 2003). Tab. 4: Suszeptibilitäten der verwendeten Mausinzuchtstämme unter Angabe ihres MHCHaplotyps (Lsr1r: resistent, Lsr1s: suszeptibel). Mausstamm Lsr1-Allel MHC-Haplotyp Referenzen BALB/c Lsr1s H 2d CHEERS u. MCKENZIE, 1978; CHEERS et al., 1978; KONGSHAVN, DBA/2 Lsr1 s H2 d 1986; MANDEL u. CHEERS, 1980; SKAMENE u. KONGSHAVN, 1979; C57BL/6 Lsr1r H 2b SKAMENE et al., 1979 62 Eigene Untersuchungen 3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1 Material 3.1.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterial Wurde keine Herstellerangabe gemacht, wurden die Chemikalien von Merck, Darmstadt, D, bezogen. Verdünnungen wurden, soweit nicht anders angegeben, mit Aqua bidest. hergestellt. Allgemein Aceton 10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100% Aqua bidest. (laboreigene Anlage) Ethanol 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100% NaCl 0,9% (Braun, Melsungen, D) PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung, NaCl 8 g/l, KCL 2 g/l, Na2 HPO4 1,44 g/l, KH2O4 0,2 g/l) Petrischalen (Greiner, Solingen, D) 2-Propanol Reaktionsgefäße 1,5 ml (Eppendorf, Hamburg, D) Reaktionsgefäße 15 ml, 50 ml (Greiner, Solingen, D) Rollrandgläschen, 5 ml (Omnilab, Bremen, D) Mausnarkose und Sektion Ketamin (Ketamin Gräub, A. Albrecht, Aulendorf, D) Midazolam (Dormicum, Curamed, Karlsruhe, D) Atropin (Atropinsulfat, Braun, Melsungen, D) Venenkatheter Introcan 0,7 x 19 mm, (Braun, Melsungen, D) Nahtmaterial Mersilene 5/0, 1 metric (Ethicon, Norderstedt, D) Eigene Untersuchungen 63 Zubehör für die Tierhaltung (GBF Braunschweig) Nestbaumaterial (Stärke 12, Abedd, Köflach, D) Tiereinstreu (Espenholzgranulat, harzfrei, Schnitzelgröße 5 x 5 x 1 mm, Abedd, Köflach, D) Tierfutter, pelletiert (R/M-H, ssniff Spezialdiäten, Soest, D) Tierkäfige, einzeln ventiliert, U-TempTM-Kunststoff (Sealsafe IVC cages, Tecniplast, Hohenpeißenberg, D) Infrarot Wärmelampe (150 W, Philips, Hamburg, D) Listerienanzucht Agar (Bacto-Agar, Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA) 16 g/l BHIMedium Brain Heart Infusion (BHI)-Medium, 37 g/l (Difco, Detroit, USA) Erythromycin (Sigma-Aldrich, München, D) Glycerin, wasserfrei Octylphenyl-polyethylenglycol (Igepal CA 630, Sigma-Aldrich, München, D) Photometerküvetten (Omnilab, Bremen, D) Histologie, allgemein Deckgläschen (Menzel, Braunschweig, D) Eosin G, gelblich Formaldehydlösung mind. 37% gepuffertes Formalin, 4% in PBS Film Ektachrom 64 T (Kodak, Stuttgart, D) Immersionsöl (518 N, Zeiss, Oberkochen, D) Objektträger (Menzel, Braunschweig, D) OCT Compound (Tissue-Tek, Sakura, USA) 64 Eigene Untersuchungen Gewebeaufarbeitung Gefrierschnitte Kunststoff-Förmchen 10 mm x 10 mm x 5 mm (Disposable Vinyl Specimen Molds, Miles Inc., Elkhart, Indiana, USA) Paraformaldehyd Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich, München, D) Stickstoff, flüssig, -196°C (Linde, Braunschweig, D) Triton X 100 Gewebeaufarbeitung Paraffinschnitte Chloroform 100% Eisessig Einbettkassetten (Reku-Plast, Wertheim, D) Entellan Paraffin (Paraplast Plus, Thermo Shandon, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) Xylol 100% Gewebeaufarbeitung REM Cacodylatpuffer (0,1 M Cacodylat, 0,01 M Saccharose, pH 6,9) Goldfilm (Plano, Wetzlar, D) Kohle-Aufkleber (Plano, Wetzlar, D) Kohlendioxid, flüssig (Linde, Braunschweig, D) Präparatehalter (Plano, Wetzlar, D) Gewebeaufarbeitung TEM Beem-Kapseln (Plano, Wetzlar, D) Bleicitrat Epon (Serva, Heidelberg, D) Glutaraldehyd,1,5% (Plano, Wetzlar, D) CaCl2, 0,01 M MgCl2, 0,09 M Eigene Untersuchungen 65 Hepes-Puffer, 0,15 M, Osmolarität 300 - 340 mOsmol, pH 7,35 (Serva, Heidelberg, D) Metallnetze für Ultradünnschnitte (Nickel-Grids, Plano, Wetzlar, D) Natrium-Cacodylat-Puffer 0,1 M Osmolarität 340 mOsmol, pH 7,4 (Fluka, Buchs, Schweiz) Osmiumtetroxid, 1% Paraformaldehyd, 1,5% Planfilme SO 163 (Kodak, Stuttgart, D) Uranylacetat, halbgesättigtes, wässriges Uranylacetat, 1,75 g auf 50 ml Aqua bidest. (Riedel-de-Häen, Seelze, D) HE-Färbung Hämalaunlösung nach MEYER: 1 l Aqua bidest. 1 g Hämatoxylin 50 g Chloralhydrat 50 g KAl(SO4)2 0,2 g NaJO3 1 g kristalline Zitronensäure Eosinlösung (2 g Eosin / 200 ml Aqua bidest + 2 Tropfen Eisessig) Gramfärbung Karbolgentianaviolettlösung (Grams Kristallviolettlösung) Jod-Kaliumjodidlösung 1% (Lugols Lösung für Mikroskopie) Karbolfuchsinlösung (Ziehl-Neelsen-Karbolfuchsinlösung, 1/10 verdünnt mit 5%igem Ethanol) Aceton-Propanol-Lösung 1/1 Eosin, 1%ige Lösung 66 Eigene Untersuchungen Immunfluoreszenzfärbung Alexa Fluor 568 Phalloidin (Molecular Probes, Leiden, NL) anti-Listerien-Antikörper (Rabbit-anti-Listeria monocytogenes, Biodesign Inter- national, Saco, Maine, USA) anti-Keratin-Antikörper (Rabbit-anti-Keratin, Dako, Hamburg, D) anti-MAC-1-Antikörper (M1/70, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) Gammaglobulin Ratte (Dianova, Hamburg, D) Präimmunserum Kaninchen (selbsthergestellt, Kaninchen 6 Wochen alt, Chinchilla Bastard, Charles River Deutschland, Sulzfeld, D) anti-Kaninchen-Antikörper, Cy3-konjugiert (Cy3-conjugated AffinityPure Goat-antiRabbit IgG, Dianova, Hamburg, D) anti-Kaninchen-Antikörper, Cy5-konjugiert (Cy5-conjugated AffinityPure Goat-antiRabbit IgG, Dianova, Hamburg, D) anti-Kaninchen-Antikörper, FITC-konjugiert (FITC-conjugated AffinityPure Goatanti-Rabbit IgG, Dianova, Hamburg, D) anti-Ratte-Antikörper (Cy3-conjugated AffinityPure Goat-anti-Rat IgG, Dianova, Hamburg, D) Bovines Serum Albumin (BSA, Sigma-Aldrich, München, D) wasserfreies Eindeckmittel (Neo-Mount, Merck, Darmstadt, D) Wachsstift (Dako Pen, Dako, Hamburg, D) Eigene Untersuchungen 3.1.2 67 Geräte und Laborgegenstände Absaugpumpe Type ME2 (Vacuubrand, Wertheim, D) Brutschrank (Heraeus, Hanau, D) Edelstahlkanülen 14 28 LL, 0,67 x 28 mm mit Spitzenolive, (Acufirm, Dreieich, D) Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop Gemini DSM982 mit Rückstreu- Elektronendetektor nach Everhart-Thornley und In-lens-Detektor (Zeiss, Oberkochen, D) Fluoreszenzmikroskop Axiovert 135 TV Mikroskop mit Fluoreszenzlampe AttoArc HBO 100 W (Zeiss, Oberkochen, D) mit Digitalkamera TE/CCD-1000 (TKB, Princeton Instruments, Trenton, New Jersey, USA) Gefriermikrotom Cryotome SME (Thermo Shandon, Pittsburgh, USA) Gewebeeinbettautomat Citadel 2000 (Thermo Shandon, Pittsburgh, USA) Gewebehomogenisator Polytron PT 3000 (Kinematica AG, Luzern, CH) Heizplatte (Heidolph, Kehlheim, D) Inkubationskammer, aus mit Alufolie beklebten Kunststoffdeckeln selbst hergestellt Kaltlichtlampe 64 23 (Philips, Hamburg, D) Konfokale Lasermikroskope: (Zeiss, Oberkochen, D) • Biorad MRC1024 UV mit zwei Lasern (UV-Laser: 351nm, 363 nm, 514 nm, 488nm; Krypton/Argon-Laser, sichtbar: 488 nm, 568 nm, 647 nm); Filter : 405/35 DAPI, AMCA; 522/35 FITC, Cy2, Alexa488; 605/35 Cy3, Texas Red, Rhodamin; 680DF32 Cy5, APC • LSM510 Meta mit drei Lasern (Laser 1: 450 nm, 477 nm, 488 nm für FITC, Cy2, 514 nm; Laser 2: 543 nm für Cy3, Alexa546; Laser 3: 633 nm für Cy5); Filter: Bandpassfilter für FITC, Cy3 und Cy5 mit selektiver Anregung Kopflupe KS, 8-fach Vergrößerung (Zeiss, Jena, D) Laborfeinthermometer DIN 12 775, Messunsicherheit ± 0,03°C (Amarell, Kreutzwertheim, D) Leuchtschirm zum Koloniezählen KZG 75 (Dinkelberg Labortechnik, Neu-Ulm, D) Lichtmikroskop Axiophot (Zeiss, Oberkochen, D) Mikroliterspritze, 100 µl (Hamilton, Bonaduz, CH) 68 Eigene Untersuchungen Objektive: Plan-Apochromat 20 x/0,60; 40 x/0,95; 63x/1,40 oil; 100 x/1,40 oil, Neofluar 20x/0,50; 40x/1,30 oil; 63 x/1,25 oil; 100x/1,30 oil (Zeiss, Oberkochen, D) Orbitalschüttler Multitron, (Infors AG, Bottmingen, CH) Photometer Spectronic 20 (Bausch & Lomb, Feldkirchen, D) Schiefe Ebene, Acrylglas,Höhe 18 cm, Breite 12 cm (Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover, D) Schlittenmikrotom Hn 40, (Reichert-Jung, Nussloch, D) Schüttler KS 501 D (Jahnke & Kunkel, Staufen, D) Sicherheitswerkbank Sterilgard III Advance (Baker, Sanford, Maine, USA) Temperaturmessfühler MD 30 24 (Beckmann+Egle, Kernen, D) Temperaturmessgerät, digital, MD 30 50, Messunsicherheit ± 0,1°C (Beckmann+Egle, Kernen, D) Ultradünnmikrotom Ultra Cut E (Reichert-Jung, Nussloch, D) Vortexer (Bender & Hohbein, Karlsruhe, D) Tiefkühlschrank –70°C MDF-U50V (Sanyo, München, D) Tischzentrifuge Biofuge pico (Heraeus, Hanau, D) Transmissionselektronenmikroskop EM 10 (Zeiss, Oberkochen, D) Eigene Untersuchungen 3.1.3 69 Versuchstiere Die durchgeführten Tierversuche wurden durch die Bezirksregierung Hannover genehmigt (Mäuse: AZ 98/71, AZ 02/592; Kaninchen: AZ 98/71). 3.1.3.1 Mäuse Es wurden weibliche Mäuse der Inzuchtstämme BALB/c, DBA/2, und C57BL/6J verwendet. Alle drei Stämme stammen ursprünglich aus dem Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA (BALB/c seit 1955, DBA/2 seit 1959, C57BL/6 seit 1974) und werden seit 1997 von Harlan gezüchtet. Die Tiere aller drei Stämme trugen die Herkunftsbezeichnung OlaHsd der niederländischen Zuchtstätte (Harlan, Horst, NL). Die Tiere stammten aus einer Barriere-Haltung (Barrier HNL 1) des Züchters, wo sie entsprechend den Empfehlungen der FELASA mikrobiologisch kontrolliert wurden (FELASA WORKING GROUP, 2002). 3.1.3.2 Haltung der Mäuse Die Tiere wurden bis zu Versuchsbeginn in der Barriere-geschützten Isolierabteilung der Tierhaltung der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF) untergebracht. Dort wurden die Mäuse in einzeln ventilierten Käfigen (Typ III H, Bodenfläche 810 cm2) in Gruppen von 10 Tieren gehalten. Die Raumtemperatur betrug 21 ± 2°C, bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 ± 5%. Die Luft im Tierraum wurde 13 - mal pro Stunde gewechselt, der Luftwechsel in den Käfigen erfolgte 80 - mal pro Stunde. Als Futter wurde den Tieren autoklaviertes Standarddiätfutter mit einer Pelletgröße von 10 mm ad libitum angeboten. Über die Zusammensetzung des Futters gibt Tabelle 5 Auskunft. Getränkt wurden die Tiere ebenfalls ad libitum über Flaschen mit autoklaviertem Leitungswasser, das mit 5%iger Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 angesäuert wurde. Als Einstreu wurde Espenholzgranulat verwendet, zusätzlich erhielten die 70 Eigene Untersuchungen Mäuse Nestbaumaterial. Die Käfige wurden mindestens einmal wöchentlich bzw. entsprechend des Versuchsplanes gewechselt. Mindestens eine Woche vor einer experimentellen Infektion wurden die Tiere zur Anpassung an die dort herrschenden Umweltbedingungen in die S2-Infektionseinheit der Tierhaltung verbracht. Die Haltung im Experiment erfolgte in einzeln ventilierten Käfigen (Typ II L, Bodenfläche 530 cm2), es wurde jeweils eine Versuchsgruppe (3 6 Tiere) pro Käfig gehalten. 3.1.3.3 Kaninchen Von einem Kaninchen wurden im Alter von 6 Wochen durch Punktion der Ohrarterie 10 ml Blut gewonnen, das für die Herstellung von Prä-Immunserum genutzt wurde. Das Tier von der Rasse Chinchilla Bastard, bezogen von Charles River,Sulzbach, D, war zum Zeitpunkt der Blutentnahme 6 Wochen alt und wurde in der Kaninchenhaltung des ZTL der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. Eigene Untersuchungen 71 Tabelle 5: Zusammensetzung von Ssniff R/M-H, Alleinfutter für Ratten und Mäuse – Haltung Inhaltsstoffe Spurenelemente (je kg) Rohprotein 19,0% Mangan 90 mg Rohfett 3,3% Kupfer 12 mg Rohfaser 4,9% Zink 75 mg Rohasche 6,7% Jod 2 mg Calcium 1,0% Eisen 220 mg Phosphor 0,7% Selen 0,2 mg 0,25% Cobalt Natrium Magnesium 0,2% Kalium 0,9% Aminosäuren 2 mg Vitamine (je kg) Lysin 1,0% A Methionin 0,3% D3 Cystin 0,3% E 100 g Glycin 0,9% B1 10 mg Leucin 1,3% B2 20 mg Isoleucin 0,7% B6 12 mg Arginin 1,2% B12 80 µg Phenylalanin 0,9% Biotin 400 g Pantothensäure 30 mg 1600 g Tryptophan 0,25% Histidin 0,5% Cholin Tyrosin 0,6% Folsäure Asparaginsäure 1,7% Nikotinsäure Glutaminsäure 3,8% K3 Valin 0,9% Inosit Threonin 0,7% 15000 IE 1000 IE 4 mg 60 mg 5 mg 50 mg 72 Eigene Untersuchungen 3.1.4 L. monocytogenes-Stämme In den Infektionsversuchen (s. Tab. 10) kamen zwei Listerienstämme zur Verwendung, deren Stammkulturen Eigentum der GBF Braunschweig sind. Es handelt sich um etablierte und bereits zuvor beschriebene Stämme von L. monocytogenes EGD (s. Kap. 2.5.3). Die Stammkulturen wurden in BHI-Medium, dem 15% Glycerin zugegeben wurde, bei –70°C gelagert: • Listeria monocytogenes EGD-e, Serotyp1/2a, virulenter, schwach hämolysierender Wildtyp-Stamm. • Listeria monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP, attenuierte, isogene Mutante des Wildtyp-Stamms, die in vitro gute Transfektionsergebnisse zeigte. 3.1.5 Kulturmedien Für Übernachtkulturen und Kulturen mit exponentieller Wachstumsphase wurden die Listerien in BHI-Medium bei 37°C unter aeroben Kulturbedingungen angezüchtet. Für das Medium wurden 37 g BHI-Trockensubstanz in 1 l Aqua bidest. gelöst, der pHWert auf 7,4 ± 0,2 eingestellt und das fertige Medium bei 121°C autoklaviert. Zum Herstellen der Kulturplatten für die Keimzahlbestimmung wurden dem Medium 16 g Agar /l Medium zugesetzt. Für die Flüssigkulturen des Stammes L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3CMVGFP wurden dem Medium zusätzlich 5 µg/ml Erythromycin zugesetzt, um Organismen, die das Plasmid pERL3-CMVGFP eliminiert hatten, am Wachstum zu hindern. Eigene Untersuchungen 3.2 73 Methoden Aufgrund der Einstufung der Versuche in die Sicherheitsstufe 2 (s. GenTG §7, GenTSV §11, Anhang III) wurde von der Bezirksregierung Hannover die Erlaubnis erteilt, die Infektionsversuche mit L. monocytogenes im S2-Labor der GBF in Braunschweig durchzuführen. Die Arbeiten mit den Bakterien erfolgten in zwei Laboren der Sicherheitsstufe II, die durch die Bezirksregierung Braunschweig unter den Genehmigungsnummern 501.40611/0901/101 und 501.40611/0922/101 zugelassen sind. Soweit möglich, wurden die einzelnen Arbeitsschritte unter einer sterilen Sicherheitswerkbank durchgeführt. 3.2.1 Herstellung der Inokulationssuspension Von den bei –70°C gelagerten Stammkulturen wurde Material mit einer sterilen Öse abgenommen und auf einer BHI-Agarplatte ein Verdünnungsausstrich angelegt. Die Platte wurde mindestens 48 h bei 37°C bebrütet und anschließend makroskopisch auf Reinheit der Kolonien überprüft. Mit einer sterilen Öse wurde eine einzelne Kolonie von der Platte abgenommen und in einem sterilen 15 ml-Reaktionsgefäß in 5 ml BHI-Medium suspendiert. Das Röhrchen wurde luftdurchlässig verschlossen, um die aeroben Bedingungen der Kultur zu gewährleisten und über Nacht bei 37°C bei 150 -180 rpm geschüttelt. Von dieser Übernacht-Kultur wurden 500 µl in einen sterilen 250 ml- Erlenmeyerkolben pipettiert, in den 25 ml BHI-Medium vorgelegt worden waren. Der Kolben wurde mit einer Kappe luftdurchlässig verschlossen und die Kultur für 3 – 4 h bei 37°C und 150 - 180 rpm geschüttelt. Nach dieser Zeit befanden sich die Bakterien in der Kultur in ihrer exponentiellen Wachstumsphase. Anhand des Trübungsgrades der Kultur wurde dann makroskopisch geschätzt, welches Volumen für das Ansetzen der Inokulationslösung benötigt wurde. Zwei bis acht 1,5 ml- 74 Eigene Untersuchungen Reaktionsgefäße wurden mit der Kulturlösung gefüllt und 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Vakuum-Pumpe abgesaugt, die Bakterienpellets mit 1,5 ml PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert. Am Ende dieses Waschvorgangs wurden alle Pellets in insgesamt 250 µl PBS aufgenommen. Von dieser Suspension wurde mit PBS eine 1/100-Verdünnung hergestellt, deren optische Dichte bei 600 nm photometrisch bestimmt wurde. Der Leerwert des Photometers wurde mit PBS eingestellt. Aus der Titrationskurve (Abb. 6) wurde die Anzahl der KBE pro ml Suspension abgelesen und die Ausgangssuspension mit PBS auf die gewünschte Infektionsdosis für den jeweiligen Versuch verdünnt. Durch Plattieren dieser Inokulationslösung auf BHI-Agarplatten wurde die tatsächliche Infektionsdosis ermittelt. Eigene Untersuchungen 3.2.1.1 75 Titration einer Wachstumskurve von L. monocytogenes Zur Herstellung standardisierter Bakteriensuspensionen für die Infektionsversuche wurden von einer Listerien-Kultur in BHI-Medium in ihrer exponentiellen Wachstumsphase zu unterschiedlichen Zeitpunkten Aliquots entnommen und deren optische Dichte (OD) bei 600 nm photometrisch bestimmt. Nach der Messung wurden die Proben auf BHI-Agarplatten ausplattiert und nach 24-stündiger Bebrütung bei 37°C die Anzahl der KBE auf den Platten bestimmt. Anhand dieser Keimzahlen wurde eine Wachstumskurve von L .monocytogenes erstellt (Abb. 6). KBE/ml 10 10 10 9 10 8 10 7 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 OD Abb. 6: Darstellung der OD einer L. monocytogenes-Suspension bei einer Wellenlänge von 600 nm als Funktion der Keimzahl/ml. Beschreibung der Titration s. Text. 76 3.2.2 Eigene Untersuchungen Narkose der Versuchstiere Vor der Anästhesie wurden die Mäuse in ihren Versuchsgruppen durch Farbmarkierungen am Schwanz eindeutig gekennzeichnet und anschließend gewogen. Die Anästhesie wurde entsprechend des KGWs dosiert. Zur Reduktion der Salivation erhielten die Tiere als Prä-Medikation etwa zehn Minuten vor der Narkose 0,5 µg Atropin / 10 g KGW s.c. in eine Nackenfalte injeziert. Zur Narkose wurden 1 mg Ketamin + 50 µg Midazolam / 10 g KGW i.p. verabreicht. Eine ausreichende Narkosetiefe wurde durch Kneifen des Schwanzes bzw. durch Vorlagern der Zunge aus der Mundhöhle überprüft. Nach Applikation der Listeriensuspension wurden die Tiere bis zum Wiedererwachen unter eine Wärmelampe gelegt, um eine Narkose-bedingte Auskühlung zu vermeiden. 3.2.3 Applikationsmethoden Alle Applikationstechniken außer der i.g. Applikation wurden an anästhesierten Mäusen durchgeführt. Das applizierte Volumen betrug jeweils 30 µl. Die i.g. Applikation erfolgte an wachen Mäusen, das applizierte Volumen betrug hier 100 µl. 3.2.3.1 Intratracheale (i.t.) Instillation Für die i.t. Instillation unter Sichtkontrolle wurden die Mäuse mit den oberen Incisivi mittels eines Gummibandes atraumatisch an einer schiefen Ebene fixiert. Die Kehlregion der Tiere wurde dabei mit einer Kaltlichtlampe punktuell beleuchtet. Mit einer Irispinzette wurde die Zunge vorgelagert und nach ventral gezogen. Unterkiefer und Zunge wurden durch Druck mit einem schmalen, manuell gebogenen Spatel fixiert. Unter Sichtkontrolle einer achtfach vergrößernden Kopflupe wurde ein feiner Venenkatheter, dessen Mandrin stumpf gekürzt wurde, bis in die Trachea der Maus vorgeschoben. Auf den Venenkatheter wurde die Mikroliterspritze mit der aufgezogenen Bakteriensuspension aufgesetzt und diese langsam in die Trachea Eigene Untersuchungen 77 appliziert. Um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen aus dem Katheter in die Trachea gelangte, wurde im Anschluss Luft durch den Katheter geblasen. 3.2.3.2 Blinde Instillation Bei der blinden Instillation wurde ebenso verfahren, wie bei der sichtkontrollierten Instillation, aber die Position des Venenkatheters wurde nicht mit der Kopflupe kontrolliert, sondern es wurde „blind“ instilliert. 3.2.3.3 Tracheotomie Für die Tracheotomie wurden die Mäuse in einem Winkel von ca. 30° schräg kopfaufwärts gelagert. Oberhalb der Trachea wurde median eine Schnittinzision von etwa 0,5 - 1 cm in der Haut gesetzt und das Unterhautbindegewebe wurde, ebenso wie die Speicheldrüsen, stumpf präpariert. Die Bakteriensuspension wurde dann mit einer flach eingestochenen Kanüle direkt und langsam in die Trachea appliziert. Im Anschluss wurde das Unterhautgewebe reponiert und der Hautschnitt mit einem Knopfheft verschlossen. 3.2.3.4 Die nasale Nasale Applikation Applikation erfolgte in Seitenlage der Tiere, indem die Bakteriensuspension mit einer Pipette tropfenweise im Atemrhythmus auf ein Nasenloch aufgetropft und dabei von den Tieren inhaliert wurde. 3.2.3.5 Intragastrische (i.g.) Applikation Die wachen Mäuse wurden mit einer Hand an Nacken- und Rückenfell und Schwanz derart fixiert, dass der Kopf eine überstreckte Position einnahm und die Mundhöhle leicht geöffnet war. In die geöffnete Mundhöhle wurde die olivenbesetzte Edelstahlkanüle mit aufgesetzter Spritze dorsal bis zum Kehlkopf vorgeführt. Der folgende Schluckakt wurde abgewartet, um die Kanüle weiter bis in den Magen vorschieben und die Bakteriensuspension applizieren zu können. Die Applikation erfolgte sehr langsam, um eine eventuelle falsche Applikation in die Lunge durch 78 Eigene Untersuchungen Auftreten von Husten, Atemgeräuschen oder Dyspnoe bemerken zu können bzw. um ein Regurgitieren des Volumens bei schneller Applikation zu vermeiden. 3.2.4 Messung der Rektaltemperatur Kommt es bei einer bakteriellen Infektion zu einer systemischen Antwort des betroffenen Organismus, geht diese mit einer Störung in der Temperaturregulation einher, die sich als Hypo- oder Hyperthermie äußert (BONE et al., 1989). Neben weiteren Merkmalen eines durch Bakteriämie verursachten septischen Syndroms wie Tachykardie, Tachypnoe, Hypoxämie, kann also die pathologisch veränderte Körpertemperatur als Maßstab für die Störung der körpereigenen Homöostase dienen. Um Veränderungen der rektalen Körpertemperatur durch eine Infektion nachweisen zu können, wurden zunächst die Temperaturwerte der unbehandelten Tiere bestimmt. Die Messungen der Körpertemperatur begannen deshalb zwei Tage vor einer Infektion, so dass mit dem Infektionstag pro Tier insgesamt drei Ausgangswerte (Tag -2, -1, 0) zur Verfügung standen. Die Rektaltemperatur wurde bei den Mäusen mit einem elektronischen Digitalthermometer bestimmt, das mit einem 1 m langen teflonbeschichteten Kabelfühler verbunden war. Der Fühler besaß eine Ansprechzeit von 0,3 s. Das Fühlerende wurde im Abstand von 1,5 cm mit Isolierband umwickelt, um die Länge zu markieren, bis zu welcher der Fühler rektal in die Maus eingeführt wurde. Das Thermometer wurde im Wasserbad mit einem zertifizierten Laborfeinthermometer im Abstand von 0,5°C im Bereich von 33,0 - 42,0°C geeicht. Vor den Temperaturmessungen wurde das Fühlerende in Vaseline getaucht, um eine bessere Gleitfähigkeit zu erhalten. Die Mäuse wurden während der Messungen, die durchschnittlich 3 ± 2 s dauerten, auf den Gitterrost ihres Käfigs gesetzt und leicht am Schwanz mit zwei Fingern fixiert. Eigene Untersuchungen 3.2.5 79 Messung des Körpergewichts (KGW) Ebenso wie Veränderungen der Temperatur kann das KGW als Parameter zur Charakterisierung eines Infektionsverlaufs verwendet werden. Das Gewicht der Tiere wurde, beginnend zwei Tage vor der Infektion, täglich bestimmt. Mit der Wägung am Infektionstag standen pro Tier insgesamt drei Ausgangswerte (Tag -2, -1, 0) der gesunden Tiere zur Verfügung. 3.2.6 Beurteilung des Allgemeinzustandes Um das Befinden von Versuchstieren im Experiment beurteilen zu können, bedient man sich neben messbaren Parametern, wie Veränderungen in KGW und Rektaltemperatur, auch der Beobachtung der Tiere (WELSH et al., 1993). Für schwer messbare Veränderungen in Verhalten und Befinden werden bestimmte Kriterien erstellt, um gemachte Beobachtungen zu objektivieren und zu bewerten (MORTON u. GRIFFITHS, 1985). Die Anwendung eines solchen Bewertungsschemas an Tieren, die unter Versuchsbedingungen gehalten werden, erlaubt die Abschätzung des Normalzustandes der Tiere in der experimentellen Haltung. Das Befinden der Mäuse während der Infektion wurde mit einem Bewertungsschema beurteilt, das sich aus neun Merkmalen zusammensetzte (Tab. 7). Die einzelnen Kriterien wurden mit maximal zwei Punkten als Abweichung vom physiologischen Normalzustand bewertet (Tab. 6). Tab. 6: Einteilung der Störung des Allgemeinbefindens durch ein Punkteschema. Allgemeinbefinden ungestört geringgradig gestört mittelgradig gestört hochgradig gestört moribund Punkte 0-1 2-4 5-7 8 - 10 ≥ 11 Atmung Lokomotion Haltung Piloerektion Vokalisation Merkmal 2 auf der Seite liegend (Tiere wurden getötet, da kein Überleben zu erwarten war) spontane Bewegung im Käfig ohne Provokation oder wenn schlafend, nach Öffnen des Käfigs und 0 1 2 Tachypnoe Tachypnoe mit eingezogenem Abdomen und/oder unregelmäßiger Atemrhythmus 2 keine Ortsbewegung Atmung ungestört 1 Bewegung des wachen Tieres erst nach Provokation Provokation 1 aufgekrümmt 0 0 2 Fell am ganzen Körper gesträubt und stumpf unauffällig 1 Fell glänzend, partiell gesträubt 2 spontane Lautäußerung 0 1 Lautäußerungen beim Herausnehmen der Tiere aus dem Käfig und während des Handlings Fell glatt anliegend, glänzend 0 Punkte keine Lautäußerung Ausprägung entsprechender Bewertung durch Punkte. Tab. 7: Merkmale zur Beurteilung des Allgemeinzustandes von Mäusen, mit der Einstufung unterschiedlicher Ausprägungen und 80 Eigenen Untersuchungen 1 Tier ist eingeschränkt aufmerksam, nimmt die Umgebung wahr, zeigt aber keine Reaktionen, 2 verschmutzt mit Urin und Sekret wie bei 1 Punkt, zusätzlich mit Kot verklebt 0 2 aufgezogene Hautfalte bleibt stehen) beim Wiegen wird kein Urin abgesetzt bzw. herabgesetzter Hautturgor (auf dem Rücken 1 beim Wiegen wird Urin abgesetzt bzw. normaler Hautturgor 1 sauber Analregion Exsikkose 0 muköses Sekret oder purulentes Sekret Nase) 1 seröses Sekret aus Augen und 0 kein Sekret somnolent 2 0 Tier ist aufmerksam, beobachtet die Umgebung, zeigt Reaktionen auf äußere Reize (Fluchtreflex bei Annäherung, Umgebungserkundung, z.B. auf der Waage) Stillsitzen beim Wiegen Punkte Ausprägung Sekret (Ausfluss Aufmerksamkeit Merkmal Fortsetzung Tab. 7. Eigene Untersuchungen 81 82 3.2.7 Eigene Untersuchungen Versuchsaufbau Tabelle 8 gibt eine Übersicht der durchgeführten Versuche, einschließlich der verwendeten Maus- und Listerienstämme, der Infektionsdosis und der Untersuchungszeitpunkte. Tiere, deren Organe ausschließlich für die histologische Untersuchung präpariert wurden, sowie Tiere, die vor Versuchsende gestorben sind oder getötet wurden und die nicht in die Versuchsauswertung eingingen, sind in dieser Übersicht nicht erfasst. 6 BALB/c BALB/c Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von L.m. EGD wt BALB/c Suszeptibilität für. L.m. EGD wt BALB/c, DBA/2, C57BL/6J Suszeptibilität für. L.m. EGD BALB/c, hlyW491A + pERL3-CMVGFP DBA/2, C57BL/6J BALB/c Dosis-Zeit-Beziehungen: A) Kinetik I B) Kinetik II C) Kinetik III D) Kinetik IV Frühe Organdissemination BALB/c 7 BALB/c Methodischer Vergleich von Applikationstechniken: A) i.t. sichtkontrollierte Instillation B) Tracheotomie C) blinde Instillation D) nasale Applikation Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge nach i.t. Infektion: Vergleich i.g./i.t. Applikation 3 4 4 2 4 4 4 3 3 3 24 5 5 5 3 3 3 3 6 2 Gruppen: Größe Anzahl 5 8 Mausstamm Versuchsbezeichnung Tab. 8: Übersicht über den Versuchsablauf. 8-10 8 8-10 8-10 8-10 8-10 8-10 8-10 8-10 8-10 5-6 10-12 Alter (Wo.) 6 16 20 20 20 9 9 9 72 36 14 Tierzahl im Versuch 40 EGD hlyW 491A + pERL 3-CMVGFP EGD wt EGD hlyW 491A + pERL 3-CMVGFP EGD hlyW 491A + pERL 3-CMVGFP EGD wt EGD wt EGD wt EGD wt verwendeter L.m.-Stamm 6,0 x 108 5,4 x 105 8,9 x 105 1,8 x 106 4,2 x 107 3,6 x 106 3,6 x 108 (i.g.) 7,3 x 103 (i.t.) 4,2 x 103 4,2 x 103 4,2 x 103 2,5 x 106 2,5 x 106 2,5 x 106 3,3 x 104 5,1 x 104 5,1 x 104 3,4 x 104 4,5 x 104 Infektionsdosis (KBE) 30 min, 1 h, 2h 4 h, 8 h, 12 h, 18h 0 d (=1h), 1 d, 2 d, 3 d, 4d, 14d 1 d, 4 d, 14 d 1 d, 4 d, 14 d 2 h, 1 d, 4 d 1 h, 24 h Keimzahlbestimmung (h, d) 1 h, 24 h Eigene Untersuchungen 83 84 Eigene Untersuchungen 3.2.7.1 Methodischer Vergleich von Applikationstechniken Ziel dieses methodischen Vergleichs war es, eine Technik zu finden, mit der die Listerieninfektion in der Lunge der Maus sicher zu etablieren war. Es wurden die folgenden Applikationstechniken verglichen: • Intratracheale, sichtkontrollierte Instillation • Tracheotomie • Blinde Instillation • Nasale Applikation Folgende Kriterien wurden zur Beurteilung der Methoden ausgewählt: • Effizienz, gemessen als prozentualer Anteil der Infektionsdosis, der 1 h p.i. in der Lunge detektiert werden konnte • Reproduzierbarkeit • Kontamination extrapulmonären Gewebes (Milz als exemplarisches Organ) • Invasivität der Methode und damit der experimentelle Stress, dem die Versuchstiere ausgesetzt waren • histopathologische Entzündungsreaktionen der Lunge • technischer Aufwand und Zeitverbrauch Mit jeder Applikationsmethode wurden 10 Mäuse infiziert. Um eine bestmögliche Vergleichbarkeit zu erlangen, wurde in jedem der Experimente eine einheitliche Infektionsdosis von 5 x 104 KBE angestrebt. Jeweils 5 Mäuse wurden 1 h p.i. und 5 Mäuse 24 h p.i. getötet und die Keimzahlen in den linken Lungen bestimmt. Zusätzlich wurden HE-gefärbte Paraffinschnitte der rechten Lungen angefertigt. 3.2.7.2 Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge nach i.t. Infektion Durch einen Vergleich der Keimzahlen in der linken und rechten Lunge nach sichtkontrollierter i.t. Applikation sollte untersucht werden, ob zwischen beiden Lungenhälften ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Keimzahlen besteht. Bei gleichmäßiger Verteilung der Keime auf beide Lungenhälften sollte in den folgenden Eigene Untersuchungen 85 Experimenten die linke Lunge zur Keimzahlbestimmung und die rechte Lunge zu histologischen Untersuchungen herangezogen werden. Die Anatomie der murinen Lunge ist schematisch in Abbildung 7 dargestellt. In einem Vorversuch wurden einem Tier 50 µl einer Farbstofflösung (Trypanblau) instilliert. Anschließend wurde die Maus getötet und der Thorax eröffnet. Die Verteilung des Farbstoffs auf rechte und linke Lunge wurde makroskopisch beurteilt. Bei dem Vergleich der Keimzahlen in der rechten und der linken Lunge wurden die Mäuse nach 1 h bzw. nach 24 h p.i. getötet und die Keimzahlen für beide Lungenhälften getrennt bestimmt. Abb. 7: Schemazeichnung einer Mäuselunge. Die linke Lunge der Maus (1) besteht aus nur einem Lappen, während sich die rechte Lunge aus vier Lappen (Lobus cranialis 2, Lobus medius 3, Lobus caudalis 4 und Lobus accessorius 5) zusammensetzt. 3.2.7.3 Vergleich von i.g. und i.t. Listerieninfektion Die etablierte Technik der i.g. Applikation wurde mit der in dieser Arbeit angewendeten i.t. sichtkontrollierten Instillation verglichen. Es sollte untersucht werden, ob die Lunge für die Listerien ein stärker begrenzendes Kompartiment 86 Eigene Untersuchungen darstellt als der Gastrointestinaltrakt, aus dem die Keime sehr schnell disseminieren. Für die i.g. Applikation wurde ein größeres Volumen (100 µl, vergleiche 30 µl bei i.t. Instillation) und auch eine höhere Infektionsdosis (108 KBE, vergleiche 103 bei i.t. Instillation) verwendet, um die natürliche Resistenz der Maus gegenüber einer gastrointestinalen Listerieninfektion zu berücksichtigen (s. Kap. 2.5.1). In Vorversuchen zeigten einige Tiere während bzw. nach der i.g. Applikation Auffälligkeiten in der Atmung (Husten, Atemgeräusche, Dyspnoe), die auf eine partielle oder vollständige Applikation der Bakteriensuspension in die Lunge schließen ließen. Die Versuchsgruppen wurden 2 h, 1 d und 4 d nach der i.g. bzw. i.t. Infektion getötet und die Organe Lunge, Milz, Leber und Gehirn auf ihre Keimzahlen untersucht. 3.2.7.4 Suszeptibilität gegen L. monocytogenes EGD wt Mäuse der Stämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J wurden mit dem Wildtyp-Stamm von L. monocytogenes EGD i.t. infiziert. Es sollte untersucht werden, ob die unterschiedliche Suszeptibilität der Mausstämme für eine i.v. Infektion mit L. monocytogenes bei einer i.t. Infektion ebenso nachzuweisen ist (s. Kap. 2.6.4). Neben einer Bestimmung der Keimzahlen in Lunge, Milz, Leber und Gehirn zu den Zeitpunkten Tag 1, 4 und 14 p.i. wurden die Tiere, beginnend zwei Tage vor Versuchsbeginn und während der gesamten Dauer des Versuchs, täglich zwischen 8 - 1000 Uhr gewogen und die rektale Körpertemperatur bestimmt. Anhand des erstellten Bewertungsschemas (s. Allgemeinbefinden der Tiere beurteilt. Kap. 3.2.6) wurde außerdem das Eigene Untersuchungen 3.2.7.5 87 Suszeptibilität gegen L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3CMVGFP Nach der Untersuchung der Suszeptibilität der drei Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J für die i.t. Infektion mit dem Wildtypstamm L. monocytogenes EGD, sollte das Verhalten der Mäuse gegenüber einer i.t. Infektion mit der attenuierten Mutante L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP untersucht werden. Die Keimzahlen in Lunge, Milz, Leber und Gehirn wurden zu den Zeitpunkten Tag 1, 4 und 14 p.i. bestimmt. Auf die Bestimmung der Parameter KGW, Rektaltemperatur und Allgemeinbefinden wurde verzichtet. 3.2.7.6 Dosis-Zeit-Beziehungen der i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP Um die i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP zu charakterisieren, wurden BALB/c-Mäuse mit verschieden hohen Dosen infiziert und der Infektionsverlauf in Abhängigkeit von Zeit und Infektionsdosis verfolgt. Es wurden vier Versuchsreihen durchgeführt und die Infektionsdosis von Versuchsreihe zu Versuchsreihe erhöht, um die Pathogenität des attenuierten Listerienstamms EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP zu bestimmen. Parallel zur Bestimmung der Keimzahlen in Lunge, Leber, Milz und Gehirn wurden histologische Untersuchungen an Lungengewebe durchgeführt, um die Lokalisation der Listerien darzustellen. 3.2.7.7 Mäuse Frühe Organdissemination wurden mit dem attenuierten Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP i.t. infiziert und die Organe Lunge, Milz, Leber und Gehirn 4 h, 8 h, 12 h und 18 h p.i. auf ihre Keimzahlen untersucht. Ziel des Versuchs war es, den Zeitpunkt zu bestimmen, an dem die Organdissemination der Listerien 88 Eigene Untersuchungen aus der Lunge in die anderen Organe beginnt. Parallel zur Bestimmung der Keimzahlen wurden von den Lungen der Tiere HE-Präparate angefertigt, um das zeitliche Auftreten von Entzündungssymptomen nach der i.t. Infektion zu bestimmen. 3.2.7.8 Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von L. monocytogenes EGD wt in der Lunge nach i.t. Applikation Mäuse wurden i.t. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt infiziert und ihre Lungen 0,5 h, 1 h und 2 h p.i. untersucht. Es sollte untersucht werden, ob sich die Anzahl intraepithelial nachweisbarer Listerien durch den massiven Infektionsdruck erhöhen ließe bzw. wo die Bakterien zu diesen frühen Zeitpunkten p.i. in der Lunge lokalisiert wären. Von den Lungen der Tiere, die 0,5 h bzw. 1 h p.i. getötet wurden, wurden fünf Präparate für die TEM angefertigt und die Lokalisation der Keime im Lungengewebe semiquantitativ bestimmt. Dazu wurden die Ultradünnschnitte nach dem Systematic Random Sampling-System mäanderförmig durchgemustert. Die Wahrscheinlichkeit für jedes Lungenareal war somit gleich, als Testfeld ausgewählt und ausgewertet zu werden. Je Präparat sollten mit einer 6.300-fachen Primärvergrößerung 40 Gesichtfelder (GF) ausgezählt werden, insgesamt 200 GF pro Tier. Aufgrund der Struktur der Präparate konnten von Lunge I aber nur 191 GF ausgezählt werden. Die Klassifikation zur Beurteilung der Testfelder ist in Tabelle 9 dargestellt: Eigene Untersuchungen 89 Tab. 9: Einteilung der Gesichtsfelder nach Anzahl und Lokalisation der Listerien. GF mit L.m. davon: GF mit L.m. ausschließlich im Alveolarraum GF mit L.m. ausschließlich in Makrophagen GF mit L.m. im Alveolarraum und Makrophagen GF mit L.m. in Kapillaren GF mit L.m. in Epithelzellen GF mit Makrophagen ohne intrazelluläre L.m. Durchschnittliche Häufigkeit: Mittlere Anzahl an L.m. pro GF Mittlere Anzahl an L.m. pro Makrophage 3.2.8 Sektion und Organentnahme Die Tiere wurden zu den im Versuchsplan festgelegten Zeitpunkten in der S2Infektionsabteilung der Tierhaltung der GBF getötet. Dazu wurden sie einzeln oder zu zweit in ein verschließbares Glasgefäß (1 l Volumen) gesetzt, in das Kohlendioxid eingeleitet wurde. Die Einleitung erfolgte zur Schonung der Tiere (DANNEMAN et al., 1997) erst langsam, wurde bei beginnender Bewusstlosigkeit der Tiere gesteigert und so lange fortgesetzt, bis die Atmung sicher sistiert hatte. Zur Sektion wurden die Mäuse auf Präparationsunterlagen fixiert und mit 70%igem Ethanol desinfiziert. Die Sektion erfolgte mit sterilem Sektionsbesteck, das nach Eröffnen und Präparation der Haut, sowie zwischen der Entnahme der einzelnen Organe mit 70%igem Ethanol desinfiziert wurde. Die Organe Milz, Leber, linke Lunge und Gehirn wurden unter sterilen Bedingungen entnommen und in vorbereitete 15 ml-Reaktionsgefäße mit steriler PBS-Lösung gegeben. Nach einem langen Medianschnitt zwischen Unterkieferwinkel und Becken wurden vier Entlastungsschnitte in Richtung der Gliedmaßen gesetzt und die Haut auf der 90 Eigene Untersuchungen Ventralseite des Tieres stumpf abpräpariert. Das Abdomen wurde entlang der Linea alba eröffnet. Ein weitgehendes Entbluten des Tieres erfolgte durch Durchschneiden der Bauchaorta und Entfernen des austretenden Blutes mit einem sterilen Tupfer. Nach Entnahme von Milz und Leber wurde der Thorax durch vorsichtiges Einschneiden des Zwerchfells eröffnet. Nach Kollabieren der Lunge erfolgte die großflächige Abtrennung des rippengestützten Brustkorbes und des Zwerchfellmuskels. In die Trachea wurde ein Venenkatheter eingeführt und direkt unterhalb des Kehlkopfes eine fixierende Ligatur gesetzt. Die linke Lunge wurde mit einer Klemme fixiert, ligiert und abgesetzt. Die rechte Lunge wurde entweder mit 0,5 - 0,8 ml eines 1/4-angesetzten Gemischs aus TissueTec/PBS (für Gefrierschnitte) oder mit TissueTec/Formalin über den Katheter gefüllt und nach Entfernen des Katheters abgebunden. Die einzelnen Lungenlappen wurden in Kunststoff-Förmchen mit TissueTec eingebettet und in flüssigem Stickstoff fixiert (für Gefrierschnitte) oder die gesamte rechte Lunge wurde in 5 ml-Rollrandgläschen in 4%igem, gepufferten Formalin bei 4°C bis zur Einbettung in Paraffin aufbewahrt. Am Ende der Sektion wurde die Schädelkalotte eröffnet und das Gehirn entnommen. 3.2.9 Keimzahlbestimmung in den Organen Nach ihrer Entnahme wurden Lunge, Milz und Gehirn in sterile 15 mlReaktionsgefäße gegeben, in denen je 1ml sterile PBS mit 0,2% des Detergenz Octylphenyl-polyethylene Glycol vorgelegt waren. Für die größere Leber wurden 2 ml Lösung verwendet. Die Organe wurden mit einem Gewebehomogenisator zerkleinert und die Homogenate auf BHI-Agarplatten im Doppelansatz ausplattiert. Waren hohe Keimzahlen zu erwarten, wurden mit steriler PBS entsprechende Verdünnungen (1/10, 1/100, 1/1000) der Organhomogenate angesetzt und mindestens zwei Verdünnungen plattiert. Für das Beimpfen der Kulturplatten wurde ein Plattierautomat eingesetzt, der jeweils 50 µl des Homogenats in logarithmischer Verdünnung auf die Platte aufbrachte. Die so spiralförmig beimpften Platten konnten Eigene Untersuchungen 91 manuell oder, bei hoher Keimdichte, mittels einer Schablone ausgezählt werden. Die Platten wurden bei 37°C für ca. 24 h bebrütet und dann auf einem Leuchttisch mit Zähleinheit entweder vollständig (≤ 200 Kolonien) bzw. mittels Schablone segmental ausgezählt. Anhand des ausgezählten Volumens wurde die Keimzahl auf der Platte ermittelt. Im Anschluss wurden die KBE pro gesamtes Organ oder pro Gramm Organ berechnet. 3.2.10 Histologie Schwerpunkt der histologischen Untersuchungen war die Bestimmung der Lokalisation der Listerien im Lungengewebe. Da eine Beurteilung auf die möglicherweise intrazelluläre Lage der Keime nur bei starken Vergrößerungen bzw. räumlicher Darstellung der Präparate möglich war, wurden hierfür die konfokale Lasermikroskopie, die TEM und die REM eingesetzt. Um morphologische Veränderungen im Lungengewebe beurteilen zu können, wurde die HE-Färbung verwendet. Zur Prüfung des Bakteriengehaltes im Lungengewebe wurden die GramFärbung und Einfach- bzw. Zweifachfärbungen der Immunhistochemie eingesetzt, die mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet wurden. Sofern nicht anders beschrieben, wurden die mehrlappigen rechten Lungenhälften für die histologische Untersuchung verwendet, dabei wurden die einzelnen Lungenlappen getrennt voneinander fixiert bzw. eingebettet. Bei der Herstellung der Schnittpräparate wurde das Lungengewebe soweit angeschnitten, dass das Präparat den größtmöglichen Durchmesser erhielt. 92 3.2.10.1 Eigene Untersuchungen Paraffinschnitte Die in 4%igem gepufferten Formalin konservierten Lungen wurden in die einzelnen Lappen geteilt, in Einbettkassetten eingeschlossen und über Nacht unter fließendem Leitungswasser gespült. Anschließend wurden die Kassetten in einen Gewebeeinbettautomaten gegeben. Im Automaten wurde das Gewebe zunächst in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 80%, 96%, 100%), dann in einem Ethanol/Chloroform 1/1-Gemisch und zweimal in 100%igem Chloroform dehydriert und schließlich in 60°C heißes Paraffin überführt. Die Präparate wurden in Paraffinblöcken von ca. 3 x 3 cm ausgegossen und erstarrten bei RT. Von den Paraffinblöcken wurden auf einem Schlittenmikrotom Schnitte von 6 - 7 µm angefertigt. Frisch eingebettete und angeschnittene Blöcke wurden bei RT und im Dunkeln gelagert. 3.2.10.2 Gefrierschnitte Zum Aufziehen der Gefrierschnitte wurden Objektträger mit Poly-L-Lysin beschichtet. Hierzu wurde die Poly-L-Lysin-Lösung 1/10 mit Aqua bidest. verdünnt, filtriert und vor ihrer Benutzung geringgradig erwärmt. Die Objektträger wurden durch Inkubation in 70%igem Ethanol entfettet (10 min) und mehrfach mit Aqua bidest. gespült. Nach Trocknung der Objektträger bei 40 – 45°C, wurden sie 5 min in Poly-L-Lysin inkubiert und anschließend über Nacht bei RT oder 1 h bei 60°C getrocknet. Die bei –196°C in flüssigem Stickstoff konservierten Lungenlappen wurden bei –20°C gelagert. Zum Schneiden wurden die Blöcke im Gefriermikrotom bei –20°C Kammertemperatur aus den Kunststoff-Förmchen herausgedrückt, bei –60°C auf eine Halterung aufgefroren und in das Mikrotom eingespannt. Bei –20°C Objekttemperatur wurden Schnitte von 7 – 8 µm (dünne Schnitte) und Schnitte von 30 – 35 µm (dicke Schnitte) angefertigt. Die Qualität der Präparate wurde lichtmikroskopisch überprüft. Anschließend wurden die Schnitte mindestens 2 h bei RT getrocknet, in –20°C kaltem Aceton für 2 min fixiert, wiederum luftgetrocknet und bei –20°C - luftdicht in Alufolie verpackt - gelagert. Schnitte, an denen die Aktinpolymerisation der Listerien untersucht wurde, fixierten 30 min in 4%igem Eigene Untersuchungen 93 Parafomaldehyd und anschließend noch einmal 10 min in 4%igem Parafomaldehyd und 0,1%igem Triton X 100. Im Anschluss an die Fixierung wurden die Schnitte gefärbt. 3.2.10.3 Präparation für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) Die Lungen wurden in 4%iger, gepufferter Formalinlösung fixiert, entgast und anschließend mit Cacodylatpuffer dreimal gewaschen. Danach wurden die Proben in einer ansteigenden Acetonreihe (10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%) jeweils für 15 min auf Eis und anschließend noch einmal in 100%igem Aceton bei RT für 30 min entwässert. Eine Kritische-Punkt-Trocknung mit flüssigem Kohlendioxid (–78,5°C) schloss sich an. Hierzu wurden die Proben auf 8°C abgekühlt und das Aceton gegen flüssiges Kohlendioxid ausgetauscht. Bei der folgenden Erwärmung auf 41°C ging das Kohlendioxid bei einem Druck von 73,8 bar von flüssig in gasförmig über, ohne eine Oberflächenspannung hervorzurufen. Die getrockneten Proben wurden auf Präparatehalter mit Hilfe von Kohle-Aufklebern befestigt. Mit einem zweiten Präparatehalter, ebenfalls mit einem Kohle-Aufkleber versehen, wurden die Proben leicht zusammengedrückt und durch Auseinanderziehen der beiden Präparatehalter gebrochen. Die entstandenen Bruchflächen wurden mit einem dünnen Goldfilm besputtert. 3.2.10.4 Präparation für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Die Arbeitsschritte der Gewebeaufarbeitung für die TEM sind in Tabelle 10 dargestellt. 94 Eigene Untersuchungen Tab. 10: Tabellarische Darstellung der einzelnen Arbeitsschritte der Gewebeaufarbeitung für die TEM. Arbeitsschritt Reagenz Temperatur (°C) Zeit (min) Fixierung 1,5% Glutaraldehyd, RT 120 RT 2x6 1,5% Paraformaldehyd in 0,15 M Hepes-Puffer Waschen 2 x Hepes-Puffer 4 x 0,1 M Na-Cacodylat- 4x6 Puffer Postfixierung 1% Osmiumtetroxid in RT 120 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer Waschen 4 x 0,1 M Na-Cacodylat- RT 4x5 Puffer 2x5 2 x Aqua bidest. Blockkontrastierung halbgesättigtes, wässriges RT über Nacht Uranylacetat Waschen 2 x Aqua bidest. RT 2x5 Entwässerung 2 x Aceton 70% RT 2 x 10 Einbettung Einbettung in Beem-Kapseln Schneiden: a) Semidünnschnitte, 0,5 µm b) Ultradünnschnitte, 80 nm Aufziehen der Ultradünnschnitte auf Ni-Grids 2 x Aceton 90% 2 x 10 2 x Aceton 100% 3 x 10 Aceton/Epon 1/1 RT 60 Aceton/Epon 1/3 60 100% Epon über Nacht 100% Epon 60°C über Nacht Eigene Untersuchungen 3.2.11 Mikroskopie 3.2.11.1 Lichtmikroskopie 95 Als lichtmikroskopische Färbemethoden wurden die HE-Färbung an Paraffinschnitten und die Gramfärbung an Paraffinschnitten und Gefrierschnitten verwendet. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) Vor ihrer Anfärbung mussten die Schnitte entparaffiniert werden. Sie wurden dafür in einer absteigenden Alkoholreihe inkubiert: (2 x 5 min in Xylol, dann jeweils 30 s in 100%, 96%, 70%, 50%igem Ethanol und 30 s in Aqua bidest.). Für die Färbung wurden die Schnitte in Hämalaunlösung (nach Meyer, BURCK, 1988) inkubiert (6 min), es folgte ein Waschschritt unter fließendem Leitungswasser (10 min), die Färbung in Eosin (3 min) und die Inkubation in einer aufsteigenden Alkoholreihe (jeweils 30 s in Aqua bidest., 50%, 70%, 96%, 100%igem Ethanol). Nach ihrer Trocknung wurden die Schnitte mit Entellan eingedeckt. Gramfärbung Paraffinschnitte wurden entparaffiniert (s. HE-Färbung), Gefrierschnitte rehydriert (s. Tab. 13). Zur Färbung wurden die Schnitte mit Karbolgentianaviolettlösung inkubiert (2 min) und nach Abgießen der Lösung mit Jod-Kaliumjodidlösung gebeizt (1 min). Es folgte ein Waschschritt mit Aceton-Propanol-Lösung 1/1 bis keine sichtbare Entfärbung des Gewebes mehr zu beobachten war, dann eine Inkubation mit 1/10 Karbolfuchsinlösung (30 s) und ein Waschschritt mit Aqua bidest. Zur Kontrastierung des Gewebes wurde zum Schluss der Färbung mit Eosinlösung gegengefärbt (1 min) und wieder mit Aqua bidest. gewaschen. Grampositive Bakterien wie Listerien stellen sich als dunkelviolette gerade Stäbchen mit einer Breite von 0,4 – 0,5 µm und einer Länge von ca. 0,5 – 2 µm dar (ROLLE u. MAYR, 1993, S. 719). 96 Eigene Untersuchungen 3.2.11.2 Fluoreszenzmikroskopie und konfokale Lasermikroskopie Die immunhistochemischen Färbungen wurden entweder fluoreszenzmikroskopisch oder mittels konfokaler Lasermikroskopie ausgewertet. Für beide Methoden kamen Gefrierschnitte zum Einsatz. Das Rehydrieren und die Waschschritte erfolgten in einer Glasküvette, die Färbeschritte in einer Kammer, in die feuchte Zellstofftücher eingelegt wurden, um ein Austrocknen der Schnitte während der Inkubation zu vermeiden. Die Inkubationsschritte erfolgten auf einem Schüttler bei 60 rpm. Pro Schnitt wurden 100 µl einer Antikörperverdünnung eingesetzt. Für die Negativkontrolle wurden als Primärantikörper Kontrollseren der jeweiligen Spezies verwendet. Das Kaninchenkontrollserum wurde selbst hergestellt, indem 10 ml arterielles Blut für 10 min bei 3000 rpm und 4°C zentrifugiert wurde. Das so gewonnene Serum wurde in 1,5 ml Reaktionsgefäßen aliquotiert und bei –20°C bis zu seiner Verwendung gelagert. Die einzelnen Arbeitsschritte der immunhistochemischen Färbungen sind in Tabelle 11 aufgeführt. Über die verwendeten Antiköper gibt Tabelle 12 Auskunft (Tab. 12 A: Primärantikörper, Tab. 12 B: Sekundärantikörper). Zur färberischen Darstellung der Aktinpolymerisierung durch die Listerien wurden Paraformaldehyd-fixierte Schnitte mit Alexa Fluor 568 Phalloidin gefärbt. Die Präparate wurden entweder am inversen Fluoreszenzmikroskop oder an einem konfokalen Lasermikroskop (Biorad MRC1024 UV oder LSM510 Meta) ausgewertet. Kriterien der Begutachtung waren die Menge der intrapulmonalen Listerien und deren Lokalisation im Lungengewebe. Repräsentative Bereiche der Präparate wurden am Fluoreszenzmikroskop Digitalkamera aufgenommen, Aufzeichnung der Einzelbilder bei exemplarisch der bzw. konfokalen z-Stacks mit Photonencounting bei normaler Scangeschwindigkeit. mit der angeschlossenen Mikroskopie Kalmanfilter erfolgte oder die durch Eigene Untersuchungen 97 Tab. 11: Protokoll der immunhistochemischen Färbungen. Bei Einfach- oder Zweifachfärbungen wurden die Objektträger entsprechend nach dem Waschschritt, der auf den Primär- bzw. Sekundärantikörper folgte, getrocknet und eingedeckt. Arbeitsschritt Reagenz Zeit (min) Vorbereiten der Schnitte für die Färbung: Auftauen und Lufttrocknen; Beschriften Umranden des Gewebes auf dem Objektträger Wachsstift Dako Pen Rehydrieren PBS Blocken unspezifischer Bindungsstellen BSA/PBS (5 g/l) Waschen PBS Inkubation 1. Primärantikörper Waschen PBS PBS PBS PBS Trocknen bei 37°C 5 5 60 PBS Inkubation 3. Sekundärantikörper Eindeckeln 5 60 Inkubation 3. Primärantikörper Waschen 5 60 Inkubation 2. Sekundärantikörper Waschen 5 60 Inkubation 2. Primärantikörper Waschen 30 60 Inkubation 1. Sekundärantikörper Waschen 5 5 60 Neo-Mount mind. 45 98 Eigene Untersuchungen Tab. 12 A: Primärantikörper. Spezifität Wirtsorganismus L. monocytogenes Kaninchen Isotyp polyklonal Konjugat unkonjugiert Verdünnung 1/100 Keratin Kaninchen polyklonal unkonjugiert 1/500 Mac-1 (α-Unter- Ratte (B-Zellen); Maus IgG unkonjugiert 1/200 einheit von (Myelom-Zellen), Gewebe: murinen B-Lymphozyten; Makrophagen) Hybridoma-Zellen Gammaglobulin Ratte polyklonal unkonjugiert 1/100 Kaninchen polyklonal unkonjugiert 1/10 Ratte Prä-Immunserum Kaninchen Tabelle 12 B: Sekundärantikörper Spezifität Kaninchen Ziege Isotyp IgG(H+L) Konjugat Cy3 Verdünnung 1/100 Kaninchen Ziege IgG(H+L) FITC 1/100 Kaninchen Ziege IgG(H+L) Cy5 1/100 Ratte Ziege IgG(H+L) Cy3 1/100 3.2.11.3 REM Die Proben wurden in einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 5 kV betrachtet. Über den Rückstreu- Elektronendetektor und dem In-lens-Detektor wurden die Informationen in einem 50/50 Verhältnis über die integrierte Bildspeichereinheit aufgenommen und digital gespeichert. Eigene Untersuchungen 3.2.11.4 99 TEM Im Durchlicht wurden ungefärbte Semidünnschnitte (0,5 µm) durchgemustert, anhand derer Gewebe für die Kontrastierung ultradünngeschnittener Präparate (80 nm) ausgewählt wurden. Bevorzugt wurden Gewebestücke, die Anschnitte von Bronchien zeigten. Außerdem wurden die Semidünnschnitte zur Orientierung in den ultradünngeschnittenen Präparaten verwendet. Die einzelnen Arbeitsschritte der Kontrastierung für die TEM sind in Tabelle 13 aufgeführt. Die kontrastierten Präparate wurden mit dem Transmissionselektronenmikroskop durchgemustert. Besondere Aufmerksamkeit galt dabei der Lokalisation der Listerien im Lungengewebe. Vergrößerungsbereich Es wurden zwischen hierzu Primärvergrößerungen 4000 - 40.000-fach genutzt. in dem Repräsentative Bereiche wurden mit der integrierten Planfilmkamera aufgenommen. Als Objektiv fungierten elektromagnetische Linsen, die Belichtungszeit betrug jeweils 2 s. Tab. 13: Kontrastieren der Ultradünnschnitte für die TEM. Arbeitsschritt Waschen Waschen Trocknen Reagenz Temperatur°C Zeit (min) Uranylacetat 60 13 (in Dunkelheit) Aqua bidest. RT Bleicitrat RT Aqua bidest. RT 37°C 3 100 3.2.12 Eigene Untersuchungen Statistische Auswertung Die statistische Auswertung wurde mit dem Graphik- und Statistikprogramm GraphPadPrism 3.0 (GraphPad Software, San Diego, USA) durchgeführt. Die im Ergebnisteil aufgeführten Mittelwerte ergeben sich aus dem arithmetischen Mittel. Als Maß für die Streuung der Einzelwerte um den Mittelwert wurde der Standardfehler berechnet. Die Parameter Keimzahlen in den Organen Lunge, Leber, Milz und Gehirn, KGW und Rektaltemperatur der Mäuse wurden statistisch ausgewertet. Da die erhobenen Werte nicht normalverteilt waren, wurden nicht-parametrische Testverfahren durchgeführt. Signifikanzen zwischen zwei Gruppen wurden mit dem U-Test nach Mann und Whitney errechnet, beim Vergleich mehrerer Gruppen wurde der Test nach Kruskal und Wallis verwendet. Ergaben sich bei letzterem Test signifikante Unterschiede, wurde mit dem U-Test nach Mann und Whitney geprüft zwischen welchen Gruppen diese Signifikanzen bestanden. Die Irrtumswahrscheinlichkeit (p) wurde mit jeweils ≤ 0,05 als signifikant beurteilt. In den graphischen Darstellungen wurden signifikante Differenzen mit * gekennzeichnet. Ergebnisse 101 4 ERGEBNISSE 4.1 Methodischer Vergleich von Applikationstechniken für die Lunge Durch den Vergleich der vier Applikationstechniken sollte die am besten geeignete Methode bestimmt werden, mit der eine pulmonale Listerieninfektion in der Lunge der Maus erzeugt werden kann. Nur bei der Tracheotomie handelt es sich um einen operativen Eingriff am Versuchstier und damit um eine invasive Technik. Die übrigen Methoden stellen jeweils eine nicht invasive, topische Applikation der Keime dar. Die Effizienz einer jeweiligen Technik wurde über die Keimzahlen beurteilt, die nach einer Stunde in der linken Lunge detektiert werden konnten (Abb. 8). Dabei wurden annähernd gleich hohe Keimzahlen bei der i.t. sichtkontrollierten Instillation und der Tracheotomie gefunden. Die KBE in den Lungen nach nasaler Applikation und blinder Instillation waren dagegen deutlich niedriger. Da die bei den verschiedenen Techniken verwendeten Infektionsdosen Unterschiede aufwiesen, wurde zur besseren Vergleichbarkeit der Keimzahlen deren prozentualer Anteil an der Infektionsdosis bestimmt (Abb. 9). Die relativ höchsten Keimzahlen erhielt man mit der Tracheotomie (ca. 25%), mit der i.t. sichtkontrollierten Instillation ließen sich noch ca. 10% der Infektionsdosis in der linken Lunge nachweisen. Mit der nasalen Applikation und der blinden Instillation waren weniger als 5% der Infektionsdosis nachweisbar. Anhand der Streuung der Keimzahlen in den Lungen innerhalb der Versuchsgruppen wurde die Reproduzierbarkeit der Methode bewertet (Abb. 8). Sowohl bei der blinden (1 h p.i.) als auch bei der nasalen Applikation (1 h p.i. und 24 h p.i.) gab es Tiere, bei denen überhaupt keine Keime in der Lunge nachgewiesen werden konnten (Abb. 8). Bei beiden Techniken kam es zu einer großen Streuung der Werte innerhalb der Versuchsgruppen, wie Abbildung 8, C und D (nasale Applikation: 1 h p.i., blinde Instillation 24 h p.i.) zeigen. 102 Ergebnisse Um eine extrapulmonale Kontamination zu beurteilen, wurden die Keimzahlen in der Milz betrachtet. Mit keiner der Methoden konnten 1 h p.i. Keime in der Milz nachgewiesen werden (Abb. 8). Zumindest bei den Tieren, die nasal bzw. mit der blinden Applikation infiziert wurden und in deren Lungen keine Keime nachgewiesen werden konnten, muss jedoch von einer extrapulmonalen Kontamination ausgegangen werden. Die höchsten Keimzahlen in der Milz nach 24 h wurden bei der blinden Instillation gefunden, was die Annahme einer extrapulmonalen Kontamination 1h p.i. unterstützt (Abb. 8 C) . Bei der Tracheotomie waren die Milzen 24 h p.i. nahezu steril (Abb. 8 B). Die Tiere wurden bis ca. 1 h nach Erwachen aus der Narkose und am folgenden Tag wiederum ca. 1 h bis zum Töten beobachtet. Bei den tracheotomierten Tieren fielen im Käfig eine eingeschränkte Mobilität und ein gesträubtes Fell auf, die Tiere der anderen Gruppen zeigten kein auffälliges Verhalten. Histopathologische Veränderungen des Lungengewebes wurden durch die Auswertung von HE-gefärbten Paraffinschnitten beurteilt (Abb. 10). Von der rechten Lunge jedes infizierten Tieres wurde ein Schnitt jeweils eines Lungenlappens für die Färbung verwendet. Die gefärbten Präparate wurden auf entzündliche Veränderungen durchgemustert. Mit keiner der Methoden waren 1 h p.i. Veränderungen in der Lunge nachweisbar, 24 h p.i. wurden v.a. peribronchioläre und perivaskuläre Infiltrate bei allen Methoden gefunden (Abb. 10). Entsprechend der starken Schwankungen der Keimzahlen in der Lunge nach der nasalen Applikation waren auch die histopathologischen Veränderungen sehr unterschiedlich (Abb. 10 C, Inset). Die stärksten Infiltrate neutrophiler Granulozyten und mononukleärer Entzündungszellen wurden bei den tracheotomierten Tieren gefunden (Abb. 10 B, Inset). A 125 4 125 100 75 50 25 2 103 KBE x 10 /Organ 4 KBE x 10 /Organ Ergebnisse 1 75 50 25 2 1 0 30 C D 20 10 4 10 KBE x 10 /Organ 20 0 4 KBE x 10 /Organ 30 B 100 2 1 0 2 1 0 Abb. 8: Vergleich der Keimzahlen in der linken Lunge und der Milz 1 h bzw. 24 h p.i. nach Applikation der Keime mit verschiedenen Techniken. Aufgetragen sind die KBE von L. monocytogenes EGD wt pro Organ (n = 5). A) i.t. sichtkontrollierte Instillation (Infektionsdosis 4,5 x 104 KBE), B) Tracheotomie (Infektionsdosis 3,3 x 104 KBE), C) blinde Instillation (Infektionsdosis 5,1 x 104 KBE), D) nasale Applikation (Infektionsdosis 5,1 x 104 KBE). ■ linke Lunge 1h p.i., ▲ Milz 1h p.i., □ linke Lunge 24h p.i., ∆ Milz 24h p.i. 104 Ergebnisse % 40 * 30 20 10 0 Abb. 9: Prozentualer Methodikvergleich 1 h p.i. Aufgetragen ist der Anteil der Infektionsdosis in Prozent, der 1h p.i. durch Keimzahlbestimmung in der linken Lunge nachgewiesen werden konnte. Die Werte sind Mittelwerte ± SF (n = 5). i.t., sichtkontrollierte Instillation, nasale Applikation Tracheotomie, blinde Instillation, Ergebnisse 105 Abb. 10: Histopathologische Veränderungen 24 h p.i in den Lungen von Mäusen, die mit L. monocytogenes EGD wt infiziert wurden, im Vergleich zu einer nicht-infizierten Kontrolllunge (Balken 200 µm). A) I.t. sichtkontrollierte Instillation: peribronchioläre Infiltration mit Entzündungszellen (Infektionsdosis 4,5 x 104 KBE). B) Tracheotomie: Inflammatorische Infiltrate, im Inset multifokale, Pneumonie-ähnliche Infiltrationen (Infektionsdosis 3,3 x 104 KBE). C) Nasale Applikation: schwach und stark (Inset) ausgeprägte Inflammation (Infektionsdosis 5,1 x 104 KBE). D) Blinde Instillation: keine sichtbare Inflammation bei einem Tier, dessen Lunge 24 h p.i. nahezu steril war (Infektionsdosis 5,1 x 104 KBE). E) Nicht-infizierte Kontrolle einer Lunge, der i.t. sichtkontrolliert 30 µl PBS appliziert wurden. 106 4.2 Ergebnisse Rechts-Links-Verteilung in der Lunge nach i.t. Instillation Die makroskopische Betrachtung der Farbstoff-instillierten Lunge zeigte eine annähernd symmetrische Verteilung des Trypanblau auf die rechte und linke Lungenhälfte (Abb. 11). Diese Verteilung erfolgte entlang der Luftwege, soweit dies Schnitte entlang der Bronchien der einzelnen Lungenlappen zu zeigen vermochten. Abb. 11: Lunge einer Maus mit 50 µl Trypanblau-Lösung instilliert, ex situ von ihrer zwerchfellswärtigen Seite (linke Lunge 1, rechte Lunge: Lobus cranialis 2, Lobus medius 3, Lobus caudalis 4 und Lobus accessorius 5). Bei den mit Listerien-Suspension instillierten Tieren wurde innerhalb der Gruppen (1 h bzw. 24 h) eine unterschiedliche Verteilung der Keime beobachtet (Abb. 12). So zeigten einige Tiere höhere Keimzahlen in der linken Lunge (1 h: Tier 1 und 3; 24 h: Tier 2, 3 und 4), bei anderen wurden höhere Keimzahlen in der rechten Lunge gefunden (1 h: Tier 2, 6 und 7; 24 h: Tier 5) und bei einigen waren die Keimzahlen in der rechten und linken Lunge nahezu gleich (1 h: Tier 4 und 5; 24 h: Tier 1). Nach 24 h hatten sich die Keimzahlen in den Lungen etwa um den Faktor 30 vervielfacht. Trotz der Schwankungen innerhalb der Gruppen, erwiesen sich die zu einem Untersuchungszeitpunkt in den linken bzw. rechten Lungen gefundenen Keimzahlen, als nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 13). Ergebnisse 107 Für die folgenden Versuchsreihen wurde daher bestimmt, die linke Lunge zur Keimzahlbestimmung und die rechte Lunge zur histologischen Präparation zu nutzen. 1.50 A 1.25 KBE x 10 /Lunge 50 40 4 1.00 4 KBE x 10 / Lunge B 60 0.75 0.50 30 20 0.25 10 0.00 0 linke Lunge linke Lunge rechte Lunge rechte Lunge Abb. 12: Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge 1 h (A) und 24 h (B) nach i.t. Instillation. Aufgetragen sind die KBE pro Organ (A: n = 7; B: n = 5, Infektionsdosis 3,4 x 104 Tier 2, Tier 1, KBE x 104 / Lunge KBE). Tier 3, Tier 4, Tier 5, Tier 6, Tier 7 40 30 20 10 2.5 0.0 links rechts links rechts Abb. 13: Vergleich der Keimzahlen in rechter und linker Lunge 1 h bzw. 24 h nach i.t. Instillation. Aufgetragen sind die KBE pro Organ (1 h: n = 7, 24 h: n = 5). Die Werte sind Mittelwerte ± SF. 1h 24h 108 4.3 Ergebnisse Vergleich von i.g. und i.t. Listerieninfektion Durch Vergleiche der Ausbreitung der Keime nach i.g. bzw. i.t. Applikation sollte die Eigenschaft der Lunge als ein die Dissemination begrenzendes Kompartiment beurteilt werden. Außerdem sollte die Entwicklung der Keimzahlen in der Lunge nach i.g. Applikation untersucht werden. Bei keinem der i.g. infizierten Tiere waren während bzw. nach der Applikation Auffälligkeiten in der Atmung zu beobachten, die auf eine partielle oder teilweise Applikation der Bakteriensuspension in die Lunge schließen liessen. Bei der i.g. Applikation ließen sich 2 h p.i. bei zwei Tieren keine Keime in der Lunge nachweisen, bei den übrigen vier Tieren wurden zu diesem frühen Zeitpunkt 1,2 ± 0,8 x 103 KBE detektiert (Abb. 14 A). Es bestand ein signifikanter Unterschied zu den Keimzahlen, die in den Lungen der i.t. infizierten Tiere (7,9 ± 1,9 x 103 KBE) nachgewiesen wurden. An Tag 1 p.i. zeigte von den i.g. infizierten Tieren lediglich ein Tier eine Besiedelung der Lunge mit Listerien, die übrigen Tiere waren hier steril. Die i.t. infizierten Mäuse wiesen einen allmählichen Anstieg der Listerienzahlen in der Lunge im Versuchszeitraum auf, die Keimzahlen 2 h p.i entsprachen dabei in etwa der Infektionsdosis. Bei den i.g. infizierten Tieren konnten erst an Tag 4 p.i. Listerien bei allen Tieren der Versuchsgruppe in der Lunge nachgewiesen werden. Die Werte der Keimzahlen zeigten im Vergleich zu den i.t. infizierten Mäusen jedoch eine sehr viel höhere Varianzbreite (i.t.: 1,2 ± 0,1 x 107 KBE, i.g.: 6,5 ± 5,7 x 105 KBE). Die Infektionskinetiken von Milz (Abb. 14 B) und Leber (Abb. 14 C) wiesen für beide Applikationstechniken einen allmählichen Anstieg der Keimzahlen im Versuchszeitraum auf. Eine Besiedlung mit Listerien wurde bei allen Tieren wiederum für beide Applikationstechniken sowohl für die Milz als auch für die Leber ab Tag 1 p.i. beobachtet. Im Gehirn konnten Listerien nach i.t. Infektion bei vier Tieren an Tag 1 p.i. nachgewiesen werden, bei der i.g. Infektion wurden hier erst an Tag 4 p.i. Keime detektiert (Abb. 14 D). Alle Tiere wiesen vier Tage p.i. Listerien im Gehirn auf, unabhängig von der Infektionsart. KBE/Organ KBE/Organ Ergebnisse 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 109 A * * * 2h 1d 4d 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 B 2h 1d 4d Abb. 14, A und B: Keimzahlen in den Organen Lunge (A) und, Milz (B), als Einzelwertdarstellung mit Mittelwerten (——) 2 h, 1 d und 4 d p.i. nach i.g. bzw. i.t. Applikation von L. monocytogenes EGD wt (n = 6). Die Infektionsdosis betrug 3,6 x 108 KBE für die i.g. Applikation ( ) und 7,3 x 103 KBE für die i.t. Applikation (■). KBE/Organ KBE/Organ 110 Ergebnisse 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 C 2h 1d 4d D 2h 1d 4d Abb. 14, C und D: Keimzahlen in den Organen Leber (C) und Gehirn (D) als Einzelwertdarstellung mit Mittelwerten (——) 2 h, 1 d und 4 d p.i. nach i.g. bzw. i.t. Applikation von L. monocytogenes EGD wt (n = 6). Die Infektionsdosis betrug 3,6 x 108 KBE für die i.g. Applikation ( ) und 7,3 x 103 KBE für die i.t. Applikation (■). Ergebnisse 4.4 111 Suszeptibilität der Maustämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6 für die i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD Die Inzuchtstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6J zeigen eine unterschiedliche Suszeptibilität gegenüber einer parenteralen Infektion mit L. monocytogenes (s. Kap. 2.6.4). Ob sich diese charakteristische Empfänglichkeit bzw. Resistenz der drei Mausstämme gegen den Erreger nach einer lokalen, nämlich der i.t. Infektion ebenso darstellt, sollte in diesem Versuch untersucht werden. Neben Keimzahlbestimmungen in Lunge, Milz, Leber und Gehirn dienten auch Veränderungen des KGWs, der Rektaltemperatur und des Allgemeinbefindens der Tiere als Untersuchungsparameter. Keimzahlbestimmung Zwischen den Keimzahlen der Lungen der Mausstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6J an Tag 1 p.i. mit L. monocytogenes EGD wt wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet (Abb. 15 A). Auch in den übrigen untersuchten Organen Milz, Leber und Gehirn waren zu diesem Zeitpunkt keine signifikanten Unterschiede nachweisbar (Abb. 15 B, C, D). Bereits an Tag 4 p.i. wurde jedoch ein signifikantes Absinken der Keimzahlen in Lunge, Milz und Leber bei den C57BL/6J-Mäusen deutlich (Abb. 15 A, B, C). Im Gehirn war dagegen keine unterschiedliche Entwicklung der Keimzahlen zu beobachten (Abb. 15 D). An Tag 6 p.i. waren bereits alle BALB/c- und bis auf ein Tier auch die DBA/2-Mäuse an der Infektion gestorben bzw. moribunde Tiere getötet worden (s. auch Allgemeinbefinden, KGW und Rektaltemperatur). Bis zum Ende des Beobachtungszeitraums an Tag 14 p.i. hatten lediglich die C57BL/6JTiere überlebt, die Tiere der BALB/c- und DBA/2-Vergleichsgruppen waren an den Tagen 4, 5 und 6 p.i. gestorben bzw. getötet worden. Die letzte DBA/2-Maus starb an Tag 9 p.i. KBE/Lunge 112 Ergebnisse 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 A * 4 1 7 KBE/Milz alle BALB/c gestorben 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 4 Zeit d alle DBA/2 gestorben B * 1 14 7 alle BALB/c gestorben 14 Zeit d alle DBA/2 gestorben Abb. 15, A und B: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in Lunge (A) und Milz (B). Dargestellt sind die Werte der einzelnen Tiere mit Mittelwerten (—) der Gruppen an 1 d, 4 d, 7 d und 14 d nach i.t. Infektion mit 4,2 x 103 KBE L. monocytogenes EGD wt (n = 5). BALB/c, DBA/2, C57BL/6J Ergebnisse 113 KBE/Leber 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 C * 4 1 7 KBE/Gehirn alle BALB/c gestorben 14 alle DBA/2 gestorben 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 Zeit d D 4 1 7 alle BALB/c gestorben 14 Zeit d alle DBA/2 gestorben Abb. 15, C und D: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in Leber (C) und Gehirn (D). Dargestellt sind die Werte der einzelnen Tiere mit Mittelwerten (—) der Gruppen an 1 d, 4 d, 7 d und 14 d nach i.t. Infektion mit 4,2 x 103 KBE L. monocytogenes EGD wt (n = 5). BALB/c, DBA/2, C57BL/6J 114 Ergebnisse Messung der rektalen Körpertemperatur Veränderungen der Körpertemperatur spielen bei Infektionen eine wichtige Rolle. Die Bestimmung der rektalen Temperatur kann deshalb mit zur Charakterisierung des Infektionsverlaufs beitragen. Bei den BALB/c-Mäusen lag der Mittelwert für die gesunden Tiere bei 37,3 ± 0,1°C, bei den DBA/2-Mäusen bei 37,2 ± 1,0°C und bei den C57BL/6J-Mäusen bei 37,0 ± 1,0°C (Abb. 16). Bei den BALB/c- und den DBA/2-Tieren kam es jeweils an Tag 3 p.i. zu einer nicht signifikanten, jedoch tendenziell erkennbaren Temperaturerhöhung (Abb. 16 A, B). Daraufhin fiel die Rektaltemperatur bei den BALB/c-Mäusen kontinuierlich bis unter 26,0 °C ab (Abb. 16 A), bevor die Tiere an der Infektion verstarben bzw. getötet wurden. Die DBA/2-Mäuse zeigten zwischen Tag 3 und Tag 5 p.i einen Abfall der Körpertemperatur, dem eine geringgradige Temperaturerhöhung an Tag 6 p.i. folgte (Abb. 16 B, nicht signifikant). Dann setzte auch bei diesen Tieren ein Absinken der Körpertemperatur bis zum Tode ein. Bei den C57BL/6J-Mäusen kam es dagegen zu keiner signifikanten Änderung der Körpertemperatur während der Infektion (Abb. 16 C). Ergebnisse 115 40 A Temp. [°C] 38 36 34 32 * 30 28 26 24 † -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Infektion 40 B Temp. [°C] 38 36 * 34 32 † 30 28 26 24 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ze it d Infektio n 40 C Temp. [°C] 38 36 34 32 30 28 26 24 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Infe ktio n Abb. 16: Änderungen der rektalen Körpertemperatur bei den Mausstämmen BALB/c (A), DBA/2 (B), C57BL/6J (C) nach i.t. Infektion mit 4,2 x 103 KBE L. monocytogenes EGD wt. Aufgetragen sind die Mittelwerte in [°C] ± SF (n = 5), die von den Tieren über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg einmal täglich ermittelt wurden. BALB/c, DBA/2, C57BL/6J 116 Ergebnisse Messung des KGWs Eine eingeschränkte Futteraufnahme und der daraus folgende Verlust von KGW können Anzeichen einer systemischen Infektion eines Organismus sein und deshalb Auskunft über seine Suszeptibilität dem Infektionserreger gegenüber geben. Die Ausgangsgewichte der gesunden Tiere lagen für die BALB/c-Mäuse bei 20,1 ± 0,1 g, bei den DBA/2-Mäusen bei 19,6 ± 0,3 g und bei den C57BL/6J-Mäusen bei 19,3 ± 0,2 g (Abb. 17). Bei den BALB/c- und DBA-Tieren war ab Tag 2 p.i. ein signifikanter Abfall des KGWs zu verzeichnen (Abb.17 A, B), welcher sich kontinuierlich bis zum Tod der Tiere durch die Infektion fortsetzte. Im Gegensatz dazu kam es bei den C57BL/6J-Mäusen zu einem geringgradigen Verlust des KGWs (Abb. 17 C, nicht signifikant) bis Tag 7p.i. Anschließend erfolgte - vom Ausgangsgewicht ausgehend - eine signifikante Gewichtszunahme bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes. Ergebnisse 117 22 KGW [g] 20 A * 18 16 † 14 12 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Infektion KGW [g] 22 B 20 * 18 16 † 14 12 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 13 14 Ze it d In fektio n KGW [g] 22 C 20 18 16 14 12 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Infektion Abb. 17: Änderungen des KGWs bei den Mausstämmen BALB/c (A), DBA/2 (B), C57BL/6J (C) nach i.t. Infektion mit 4,2 x 103 KBE L. monocytogenes EGD wt. Aufgetragen sind die Mittelwerte in [g] ± SF (n = 5), die von den Tieren über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg einmal täglich ermittelt wurden. BALB/c, DBA/2, C57BL/6J 118 Ergebnisse Beurteilung des Allgemeinzustandes Die Bewertung des Allgemeinzustandes der Mäuse anhand des selbstentwickelten Beurteilungsschemas (Kap. 3.2.6) erfolgte ebenfalls zur Charakterisierung der Suszeptibilität der Mausstämme gegen eine i.t. Infektion mit L. monocytogenes. Die Beurteilung wurde zwei Tage vor der Infektion begonnen und einmal täglich durchgeführt (Abb. 18). Die drei Ausgangswerte, die so vor der Infektion der Tiere bestimmt wurden, zeigten für alle drei Mausstämme ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Dieses blieb an Tag 1 p.i. bei allen Tieren bestehen. Bereits an Tag 2 p.i. setzte bei den BALB/c- und den DBA/2-Mäusen eine Verschlechterung des Allgemeinbefindens ein, welche kontinuierlich anstieg, bis an Tag 7 p.i. alle BALB/c-Tiere und an Tag 9 p.i. auch das letzte DBA/2-Tier gestorben waren bzw. getötet werden mussten. Die C57BL/6-Mäuse zeigten dagegen über den gesamten Beobachtungszeitraum ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Allgemeinbefinden tot moribund hgr.gestö mgr.gestö ggr.gestö ungestört -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 Zeit d Abb. 18: Darstellung des Allgemeinzustandes der Mausstämme BALB/c, DBA/2, und C57BL/6J nach i.t. Infektion mit 4,2 x 103 KBE L. monocytogenes EGD wt. Die Säulen stellen Mittelwerte ± SF (n = 5) dar, die auf der Basis des selbstentwickelten Scores zur Beurteilung des Allgemeinzustandes fußen. Die Parameter des Beurteilungsschemas wurden über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg einmal täglich ermittelt. B A L B /c , D B A /2 , C 5 7 B L /6 J Ergebnisse 4.5 119 Suszeptibilität für L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP Nach Untersuchung der Suszeptibilität der Mausstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6J für L. monocytogenes EGD, sollte die Empfänglichkeit bzw. Resistenz dieser Stämme auch für den attenuierten Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A +pERL3-CMVGFP bestimmt werden. In den Lungen der BALB/c- und C57BL/6J-Tiere waren während der ersten vier Tage p.i. annähernd gleichmäßige Keimzahlen (zwischen 105 - 106 KBE/Lunge) zu beobachten (Abb. 19 A). Die Keimzahlen der DBA/2-Tiere stiegen dagegen weiter an bis 4,1 x 107 ± 9,6 x 106 KBE/Lunge (Abb. 19 A, nicht signifikant). Maximale Keimzahlen der Lungen wurden bei allen drei Stämmen an Tag 4 p.i. bestimmt. Am Ende des Versuchs waren bei allen drei Stämmen die Keimzahlen in den Lungen gesunken, während die BALB/c-Tiere alle Keime eliminiert hatten, waren bei den DBA/2- und C57BL/6J-Tieren bei jeweils einem Tier weiterhin Keime nachweisbar (Abb. 19 A). Im Vergleich zu den Lungen zeigten Milzen und Lebern der Tiere (Abb. 19 B, C) eine sehr ähnliche Organkinetik. Die KBE stiegen über Tag 1 bis Tag 4 p.i. an, und waren am Ende des Beobachtungszeitraums wieder gesunken. Bei den BALB/c-Mäusen waren beide Organe an Tag 14 p.i. steril, während die DBA/2und die C57BL/6J-Tiere zu Versuchsende weiterhin Listerien in den Organen aufwiesen. Das Maximum an Keimzahlen in Milzen und Lebern wurde bei den DBA/2-Mäusen an Tag 4 p.i. bestimmt (7,3 x 106 ± 6,0 x 105 KBE/Milz und 5,1 x 107 ± 1,2 x 106 KBE/Leber). Generell wurden höhere Keimzahlen in den Lebern als in den Milzen gefunden. Ähnliche Organkinetiken wie in Milzen und Lebern wiesen auch die Gehirne der Tiere auf (Abb. 19 D). Hier blieben die Keimzahlen insgesamt jedoch sehr viel niedriger (zwischen 103 - 105 KBE/Gehirn). Übereinstimmend mit den Befunden aus Milzen und Lebern wurden bei den DBA/2-Mäusen mit 1,8 x 105 ± 5,5 x 104 KBE/Gehirn an Tag 4 p.i. die höchsten Keimzahlen gefunden. Eine Sterilität der Gehirne zum Ende des Versuches wiesen nur die DBA/2-Tiere auf, bei BALB/cund C57BL/6J-Tieren waren noch Listerien nachweisbar. 120 Ergebnisse 10 8 A 10 7 KBE/Lunge 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d 10 8 B 10 7 KBE/Milz 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Abb. 19, A und B: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in den Organen Lunge (A) und Milz (B) nach i.t. Infektion mit 2,5 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A +pERL3-CMVGFP. Aufgetragen sind die Mittelwerte der KBE ± SF pro Organ (n = 3), die von den Tieren zu den Zeitpunkten Tag 1, 4 und 14 p.i. ermittelt wurden. BALB/c, DBA/2, C57BL/6J Ergebnisse 121 10 8 C 10 7 KBE/Leber 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 10 8 10 14 Zeit d D 7 KBE/Gehirn 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Abb. 19, C und D: Keimzahlen der Mausstämme BALB/c, DBA/2, C57BL/6J in den Organen Leber (C) und Gehirn (D) nach i.t. Infektion mit 2,5 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A +pERL3-CMVGFP. Aufgetragen sind die Mittelwerte der KBE ± SF pro Organ (n = 3), die von den Tieren zu den Zeitpunkten Tag 1, 4 und 14 p.i. ermittelt wurden. BALB/c, DBA/2, C57BL/6J 122 Ergebnisse 4.6 Dosis-Zeit-Beziehungen der i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP Durch die Infektion von BALB/c-Mäusen mit unterschiedlichen Dosen des Stamms L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP sollten in vier Versuchsreihen der Infektionsverlauf nach i.t. Infektion und die Pathogenität des attenuierten Bakteriums untersucht werden. In den Lungen der Tiere aller vier Versuchsreihen wurden in den ersten vier Tagen p.i. mehr oder weniger stabile Keimzahlen gefunden, so dass die Kurven in dieser Phase der Infektion einem Plateau glichen (Abb. 20 A). Ab Tag 4 p.i. nahmen die Keimzahlen in der Lunge bei allen Tieren ab. In drei Versuchsreihen (I: 5,4 x 105 KBE; III: 1,8 x 106 KBE und IV: 4,2 x 107 KBE) eliminierten die Tiere die Listerien dabei vollständig aus der Lunge. Lediglich bei den in Versuchsreihe II (8,9 x 105 KBE) infizierten Mäusen war ein Tier, in dessen Lunge nach 14 Tagen p.i. weiterhin Listerien nachgewiesen wurden (2,9 x 103 KBE). Wie die Abbildungen 20 B und C zeigen, wiesen Milz und Leber ähnliche Kinetiken auf. Das Maximum der Keimzahlen wurde in beiden Organen jeweils zwischen Tag 2 und Tag 4 p.i. erreicht. Ab Tag 4 p.i. reduzierten sich auch die Keimzahlen in Milz und Leber, wobei die meisten Tiere die Keime aus beiden Organen zu eliminieren vermochten. Geringe Keimzahlen blieben in den Milzen der Tiere aus Versuchsreihe II (4,0 x ± 0,5 x 101 KBE), einem Tier der Versuchsreihe III (8,0 x 101 KBE) und in den Lebern der Tiere aus Versuchsreihe II (8,0 x ± 4,6 x 101 KBE) zurück. In den vier Versuchsreihen zeigten die Keimzahlen der Gehirne starke Schwankungen und lagen allgemein deutlich niedriger als in den übrigen Organen (Abb. 20 D). Die höchsten Keimzahlen wurden hier von Tieren der Versuchsreihe III an Tag 4 p.i. erreicht (6,5 ± 2,6 x 103 KBE). Bei der überwiegenden Mehrheit der Mäuse blieben die Gehirne insgesamt steril (Tab. 14). Bei den Tieren aller Versuchsreihen wurden die Listerien bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes an Tag 14 p.i. aus den Gehirnen eliminiert. In Versuchsreihe III starb ein Tier an Tag 6 p.i. und in Versuchsreihe IV starben zwei Tiere an Tag 5 p.i. mit jeweils hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden. Ergebnisse 123 Trotz Unterschieden in den Infektionsdosen um den Faktor 102 konnten im Verlauf der Infektionen in den vier durchgeführten Versuchsreihen keine dosisspezifischen Unterschiede nachgewiesen werden. Insgesamt war in den ersten 18 h p.i. eine geringe Keimbelastung der untersuchten Organe Milz, Leber (zwischen 102 – 103 KBE) und Gehirn (ca. 101 KBE) nachweisbar. Tab.14: Anzahl der Mäuse je Versuchsreihe, in deren Gehirn sich Listerien nachweisen ließen (n = 16 Tiere pro Versuchsreihe). Versuchsreihe I Infektionsdosis KBE L.m. EGD hly 5,4 x 10 II 5 8,9 x 10 III 5 1,8 x 10 IV 6 4,2 x 107 W491A + pERL3-CMVGFP Mäuse mit infizierten Gehirnen 2 4 6 9 124 Ergebnisse 10 8 A 10 7 KBE/Lunge 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d 10 8 B 10 7 KBE/Milz 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Abb. 20, A und B: Keimzahlen in den Organen Lunge (A) und Milz (B) nach i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP. Die Tiere wurden mit Dosen von 5,4 x 105 KBE (Versuchsreihe I), 8,9 x 105 KBE (Versuchsreihe II), 1,8 x 106 KBE (Versuchsreihe III) und 4,2 x 107 KBE (Versuchsreihe IV) infiziert. Aufgetragen sind die Mittelwerte ± SF der KBE pro Organ (n = 3) zu den Zeitpunkten Tag 0 (1h), 1, 2, 3, 4 und 14 p.i. Versuchsreihe I, Versuchsreihe II, Versuchsreihe III, Versuchsreihe IV Ergebnisse 125 10 8 C 10 7 KBE/Leber 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d 10 8 D KBE/Gehirn 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zeit d Abb. 20, C und D: Keimzahlen in den Organen Leber (C) und Gehirn (D) nach i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP. Die Tiere wurden mit Dosen von 5,4 x 105 KBE (Versuchsreihe I), 8,9 x 105 KBE (Versuchsreihe II), 1,8 x 106 KBE (Versuchsreihe III) und 4,2 x 107 KBE (Versuchsreihe IV) infiziert. Aufgetragen sind die Mittelwerte ± SF der KBE pro Organ (n = 3), zu den Zeitpunkten Tag 0 (1h), 1, 2, 3, 4 und 14 p.i. Versuchsreihe I, Versuchsreihe II, Versuchsreihe III, Versuchsreihe IV 126 4.7 Ergebnisse Frühe Organdissemination Die Bestimmung der Keimzahlen in den ersten 18 h p.i. sollte Beginn und Verlauf der Organdissemination nach i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP charakterisieren. In der Lunge zeigten die Keimzahlen in den ersten 18 h nach i.t. Infektion ein Plateau ohne signifikante Veränderungen (Abb. 21). Auch in den Organen Milz, Leber und Gehirn wurden bereits 4 h p.i. Keimzahlen nachgewiesen, 4,9 x 102 ± 4,4 x 102 KBE in der Leber, 4,3 x 102 ± 3,6 x 102 KBE in der Milz und 2,4 x 101 ± 1,4 x 101 KBE im Gehirn. Während die Keimzahlen in Milz und Leber ab 12 h p.i. anzusteigen begannen, zeigte sich im Gehirn bei deutlich niedrigeren und stark schwankenden Keimzahlen keine Vermehrung der Listerien (Abb. 21). Die Entwicklung der Keimzahlen in Milz und Leber hat gezeigt, dass keine Zeitspanne existiert, in der die Listerien allein auf die Lunge beschränkt bleiben. Die relative Keimbelastung bezogen auf das Gewicht war allerdings in den extrapulmonalen Geweben deutlich geringer als in der infizierten Lunge. Dieses Verhältnis veränderte sich während der ersten 18 h p.i. nicht. Histologisch waren im Lungengewebe 4h p.i. keine Veränderungen sichtbar, eine geringgradige Infiltration mit Entzündungszellen (Abb. 22) begann 8 h p.i. und verstärkte sich während der nächsten zehn Stunden deutlich. Die meisten der inflammatorischen Infiltrate wurden peribronchiolär und perivaskulär gefunden. Ergebnisse 127 10 8 10 7 KBE/g Organ 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Zeit h Abb. 21: Organdissemination von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP in den ersten 18h nach i.t. Infektion mit 3,6 x 106 KBE. Aufgetragen sind die Mittelwerte ± SF der KBE pro g Organ (n = 4), zu den Zeitpunkten 4 h, 8 h, 12 h und 18 h p.i. Lunge, Milz, Leber, Gehirn 128 Ergebnisse Abb. 22: HE-Färbung von histologischen Veränderungen im Lungengewebe 4 h (A), 8 h (B), 12 h (C) bzw. 18 h (D) nach einer i.t. Infektion mit 3,6 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP (Balken: 20 µm, Pfeile: inflammatorische Infiltrate). Alle Aufnahmen zeigen Bronchioli, in deren Umgebung ab 8 h p.i. entzündliche Infiltrate sichtbar werden, die in ihrem Ausmaß in Abhängigkeit von der Zeit zunehmen. Ergebnisse 4.8 129 Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von L. monocytogenes EGD wt in der Lunge nach i.t. Applikation Der Versuch sollte zeigen, ob ein durch eine hohe Dosis verursachter, massiver Infektionsdruck die Zahl intraepithelialer Bakterien erhöht bzw. wo die Listerien zu den frühen Zeitpunkten p.i. lokalisiert sind. Von zwei Lungen (Lunge I, 10 min p.i. und Lunge II, 30 min p.i.) wurden jeweils fünf Ultradünnschnitte auswertet. Listerien wurden in über der Hälfte der ausgewerteten Gesichtsfelder gesehen. Der größte Teil der Bakterien, etwa 40%, war dabei im Alveolarraum lokalisiert. In etwa 10% der ausgewerteten Gesichtsfelder traten die Keime sowohl frei im Alveolarraum liegend, als auch phagozytiert in Makrophagen auf. Es gab sowohl Gesichtsfelder, in denen alle gezählten Bakterien von Makrophagen phagozytiert worden waren als auch solche, in denen Makrophagen ohne bakterielle Einschlüsse beobachtet wurden. In beiden Lungen wurden in 1% der Gesichtsfelder Listerien in Kapillaren detektiert. In keinem Gesichtsfeld konnten Listerien als sicher intrazellulär in einer Epithelzelle identifiziert werden. 130 Ergebnisse Tab. 15: Semiquantitative Beurteilung der Lokalisation von L.monocytogenes EGD wt in der Lunge nach i.t. Applikation. Dargestellt sind die Werte der absolut und prozentual in den Präparaten ausgezählten Keime. Die in Klammern dargestellten prozentualen Werte beziehen sich auf die Gesamtzahl der ausgezählten GF je Präparat. Bewertungskriterium Präparat Lunge I, Lunge II, 10 min p.i. 30 min p.i. (191 GF) (200 GF) L.m. im GF 121 (63,3) 103 (58,0) davon: L.m. ausschließlich im Alveolarraum 79 (41,4) 87 (43,5) L.m. ausschließlich in Makrophagen 13 (6,8) 8 (4,0) L.m. im Alveolarraum und in 27 (14,1) 19 (9,5) L.m. in Kapillaren 2 (1,0) 2 (1,0) L.m. in Epithelzellen 0 (0,0) 0 (0,0) 70 (36,6) 72 (36,0) 8,4 8,9 5,4 6,3 Makrophagen Makrophagen ohne intrazelluläre L.m Durchschnittliche Häufigkeit: Mittlere Anzahl an L.m. pro GF Mittlere Anzahl an L.m. pro Makrophage Ergebnisse 4.9 131 Histologische Beurteilung Histologische Präparate wurden angefertigt, um einerseits durch Listerien verursachte entzündliche Veränderungen der Lunge beurteilen zu können und andererseits v.a. die Lokalisation der Bakterien im Lungengewebe zu bestimmen. Die Beurteilung pathohistologischer Veränderungen des Lungengewebes erfolgte an HE-gefärbten Paraffinschnitten und wurde für die Versuche ‚Methodischer Vergleich von Applikationstechniken’ und ‚Frühe Organdissemination’ gezeigt (s. dort). Mit Hilfe der Gramfärbung und immunhistochemischer Einfachfärbungen wurden Infektionsdosen bestimmt, bei denen Listerien in hoher Dichte in der Lunge vorlagen (> 106 KBE), so dass die Lokalisation einzelner Keime gut bestimmbar war. Der Nachweis von intrazellulären Listerien in Epithelzellen gelang mit den gewählten Infektionsdosen und Untersuchungszeitpunkten nur vereinzelt. Auf eine quantitative Auswertung der histologischen Präparate wurde daher verzichtet. Im folgenden Abschnitt werden repräsentative Färbungen der Lunge der Maus nach i.t. Infektion dargestellt. 4.9.1 Gramfärbungen Die Färbung diente der Einschätzung der Keimdichte im Lungengewebe nach der i.t. Infektion sowie der Lokalisation der Listerien in der Gewebeübersicht (Abb. 23). Die grampositiven Listerien erscheinen nach der Färbung dunkelviolett, die mit Eosin gegengefärbten Zellen des Lungengewebes rosarot. Lichtmikroskopisch lassen sich Listerien ab einer 400-fachen Vergrößerung darstellen, so dass die Keime mit einer maximal 1000-fachen Primärvergrößerung deutlich erkennbar sind. Aussagen über eine mögliche intrazelluläre Lokalisation lassen sich mittels der Gramfärbung jedoch nicht treffen. 132 Ergebnisse Abb. 23: Lungenhistologien nach Gramfärbung mit einer Infektionsdosis von 6,0 x 108 KBE L. monocytogenes EGD wt (Pfeile: Listerien; Lu: Alveolar- oder Bronchiallumen; Ep: Epithel; Balken 5 µm). A) Peripheres Alveolargewebe mit zahlreichen Bakterien, welche sowohl frei in den Alveolen als auch in Kontakt mit Alveolarepithelzellen liegen (30 min p.i.; Gefrierschnitt). B) Alveole gefüllt mit Listerien, z.T. im Alveolarlumen, z.T. in Akkumulation mit Mukus adhäsiv an der Alveolarwand (1 h p.i.; Paraffinschnitt). C) Bronchialepithel mit adhäsiven Listerien, die überwiegend als Cluster an den Epithelzellen haften (30 min p.i.; Paraffinschnitt). D) Längsschnitt durch einen Bronchus; Listerien liegen frei im Bronchiallumen, adhäsiv an der Bronchialwand und peribronchiolär (30 min p.i.; Paraffinschnitt). E) Querschnitt durch Bronchialepithel mit adhäsiven Listerien (30 min p.i.; Gefrierschnitt). F) Listeriencluster in Adhäsion zu Alveolarepithel (30 min p.i.; Gefrierschnitt). Ergebnisse 4.9.2 133 Fluoreszenzmikroskopie Durch immunhistochemische Fluoreszenzfärbungen konnten Listerien, Makrophagen und Epithelzellen der Lunge dargestellt werden. Einfachfärbungen der Listerien mit FITC dienten der Beurteilung der Dichte der Bakterien im Präparat. Die färberische Darstellung der Bakterien im grünen Fluoreszenzkanal zeigte eine recht starke Autofluoreszenz des Gewebes, durch die auch die Mikroanatomie der Lunge erkennbar war (Abb. 24). Abbildung 24 A zeigt eine Übersicht über Lungengewebe mit einem zentral liegenden Bronchus. Zu einem frühen Untersuchungszeitpunkt (hier: 1 h) waren sowohl im Alveolargewebe (Abb. 24 B) als auch im Bereich des Bronchialepithels (Abb. 24 C) zahlreiche Listerien nachweisbar. Die Bakterien wurden einzeln oder in Clustern liegend gesehen. Mehrfach traten Keimansammlungen im Lumen von Atemwegen in Akkumulation mit Mukus auf (Abb. 24 A, Pfeil). Im Alveolargewebe waren 1 h p.i. lokal deutlich begrenzte, nahezu kreisförmige Listeriencluster nachweisbar (Abb. 24 B). Die Form dieser Keimansammlungen lässt auf eine erfolgte Phagozytose durch Alveolarmakrophagen schließen. Durch eine Oberflächenfärbung des Zytokeratins von Epithelzellen ließen sich deren Zellgrenzen darstellen (Abb. 25). Doppelfärbungen gegen Zytokeratin und Bakterien sollten die Lage der Keime zu den Zellen definieren. Die Aussagekraft dieser Färbungen war durch die angesprochene Autofluoreszenz des Gewebes nur sehr eingeschränkt möglich. Auf eine Darstellung dieser Färbungen wurde deshalb verzichtet. Durch Färbung von Listerien und Makrophagen ließ sich die Ko-Lokalisation der Bakterien und der phagozytierenden Zellen darstellen (Abb. 26). Die Mehrheit der Keime wurde peribronchiolär nachgewiesen. Vor allem in der Umgebung von Listerienclustern wurden vermehrt Alveolarmakrophagen nachgewiesen. 134 Ergebnisse Abb. 24: Immunhistochemisch gefärbtes Lungengewebe der Maus 1 h p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. (Br: Bronchus; Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel). Darstellung der Listerien mit FITC (grün). Bakterienansammlungen mit Pfeilen markiert . A) Übersicht über Lungengewebe. Im zentral liegenden Bronchus findet sich eine große Ansammlung von Listerien. Eine scheinbare Mehrschichtigkeit des Bronchialepithels ist bedingt durch die Schnittführung im Präparat (Balken 50 µm). B) Alveolargewebe mit zahlreichen Listerienclustern (Balken 20 µm). C) Anschnitt eines Bronchus, in dessen Epithelschicht zahlreiche Listerien zu sehen sind (Balken 20 µm). Ergebnisse 135 Abb. 25: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung von Bronchial- (A) und Trachealepithel (B) der Maus nach Zytokeratinfärbung mit Cy 3 (rot). Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel. A) Epithel zweier Bronchien (Balken 50 µm). B) Epithel der Trachea (Balken 10 µm). 136 Ergebnisse Abb. 26: Immunhistochemisch gefärbtes Lungengewebe der Maus 1 d p.i. mit 2,5 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP. Zweifachfärbung gegen Makrophagen und Listerien (Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel; Balken 50 µm). A). Eingerahmt wurden zwei peribronchioläre Listeriencluster markiert, in deren Umgebung sich zahlreiche Alveolarmakrophagen angesammelt haben. B) Einfachfärbung gegen Listerien mit FITC (grün). C) Einfachfärbung gegen Makrophagen mit Cy 3 (rot). Ergebnisse 4.9.3 137 Konfokale Lasermikroskopie Bei den gezeigten Bildern handelt es sich um Dreifachfärbungen von Listerieninfiziertem Lungengewebe. Die Fluoreszenzen der einzelnen Antikörper wurden durch die jeweiligen Laser des konfokalen Mikroskops gescant und die Einzelfärbungen digital übereinander projiziert. Wurden Bakterien mit FITC (grün) und Zytokeratin mit Cy 5 (blau) gefärbt, so kam es zu einer Doppelbindung an den Primärantikörper gegen Listerien, der in einer türkisgrünen Färbung (FITC + Cy 5) der Bakterien resultierte. Da die Präparate bei der konfokalen Lasertechnik schichtartig durchgemustert werden können, erlauben die Färbungen eine Beurteilung der Lokalisation der Listerien sowohl zu den Epithelzellen als auch zu den Makrophagen. Dies gilt besonders für Präparate mit einer Schnittdicke von 35 µm (Abb. 27 C). Die Visualisierung solcher Präparate ist als dreidimensionale Imagedateien möglich (s. beiliegende CD-ROM). Übersichtsaufnahmen der Lunge zeigten kurze Zeit nach der Applikation (2 h p.i.) eine Verteilung der Bakterien über das gesamte Lungengewebe (Abb. 27 A). Wie schon bei der Fluoreszenzmikroskopie wurden im Lumen größerer Luftwege dem Epithel anhaftende Listeriencluster gesehen (Abb. 27 A, Pfeil). Bei stärkerer Vergrößerung war eine überwiegend peribronchioläre Lokalisation der Bakterien erkennbar (Abb. 27 B). Wiederum wurden zahlreiche Alveolarmakrophagen peribronchiolär, d.h. in der Nähe der Listerien detektiert (Abb. 27 C). In Gewebeschnitten von 35 µm konnten vereinzelt intraepitheliale Listerien in Zellen des Bronchialepithels nachgewiesen werden (Abb. 27 D, Pfeile). Eine sichere Identifizierung intraepithelialer Bakterien erlaubte die dreidimensionale Darstellung solcher dicken Gewebeschnitte (CD-ROM). Um eine mögliche Aktinpolymerisierung intrazellulärer Listerien sichtbar zu machen, wurden 35 µm dicke Gefrierschnitte mit Phalloidin gefärbt. Es konnten jedoch keine Aktinschweife nachgewiesen werden, weshalb auf die Darstellung verzichtet wurde. 138 Ergebnisse Abb. 27: Konfokale Lasermikroskopie dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 2 h nach der i.t. Infektion mit 3,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. A) Übersicht über Lungengewebe mit zentral liegendem Bronchus und Listeriencluster (Balken 50 µm). B) Bronchus mit peribronchiolär liegenden Listerien (Balken 10 µm). Färbung der Epithelzellen mit Cy 5 (blau), Makrophagen mit Cy 3 (rot) und Listerien mit FITC + Cy 5 (türkisgrün). (Pfeile: Listerien; Br: Bronchus; Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel) Ergebnisse 139 Abb. 27 C: Konfokale Lasermikroskopie dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 2 h nach der i.t. Infektion mit 3,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Bronchus mit peribronchiolär liegenden Listerien, in deren Nähe sich zahlreiche Makrophagen angesammelt haben (Pfeile: Listerien; Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel; Balken 20 µm). Färbung der Epithelzellen mit Cy 5 (blau), Makrophagen mit Cy 3 (rot) und Listerien mit FITC + Cy 5 (türkisgrün). 140 Ergebnisse Abb. 27 D: Konfokale Lasermikroskopie dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 2 h nach der i.t. Infektion mit 3,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Intrazelluläre Listerien wurden mit Pfeilen markiert. Bronchialepithel mit intrazellulär liegenden Listerien (Pfeile: Listerien; Lu: Bronchiallumen; Ep: Epithel; Balken 10 µm, Schnittdicke des Präparates 35 µm). Listerien wurden Cy 3 (rot), Epithelzellen Cy 5 (blau) und Makrophagen FITC (grün, nicht sichtbar) gefärbt. CD-ROM: Dreidimensionale Imagedateien dreifach gefärbten, murinen Lungengewebes 1 h p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. A) Bronchus mit intraepithelial und peribronchiolär liegenden Listerien. B) Alveolargewebe mit zahlreichen Listerien und Alveolarmakrophagen. C) Alveolargewebe. Listerien mit direktem Epithelkontakt mit Pfeilen markiert. Aktivierte Alveolarmakrophagen sind unmittelbar benachbart der Bakterien aufzufinden. D) Bronchialepithel mit intrazellulärem Bakterium (Pfeil) und peribronchiolären Makrophagen. Färbung der Epithelzellen mit Cy 5 (blau), Makrophagen mit Cy 3 (rot) und Listerien mit FITC + Cy 5 (türkisgrün); Schnittdicke der Präparate 35 µm. Ergebnisse 4.9.4 141 REM Ebenso wie die konfokale Lasermikroskopie erlaubt die REM eine räumliche Darstellung der Präparate und eignet sich somit zu Beurteilung der Lokalisation von Listerien im Lungengewebe. In den REM-Präparaten wurden häufig Listeriencluster in Adhäsion an Epithelzellen des Respirationstrakts nachgewiesen. Solche Anlagerungen fanden sich sowohl an Alveolarepithelzellen (Abb. 28 A, B, C, D) als auch an den zilientragenden Epithelzellen der großen Luftwege (Abb. 28 E, F). Die Bakterien lagen dabei oft in Vertiefungen oder Schleimhautfalten (Abb. 28 A, B). Im Bereich der Anlagerung von Bakterien war die Lungenoberfläche durch Auflagerung von entzündlichem Fibrin verändert (Abb. 28 C, D). Eine Invasion der Listerien in Epithelzellen oder die Phagozytose durch Alveolarmakrophagen wurde in den REM-Präparaten nicht nachgewiesen. 142 Ergebnisse Abb. 28: REM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus 30 min nach i.t. Infektion mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. A) Listeriencluster (Pfeil) in Adhäsion zu einer Alveolarwand (Balken 2 µm). B) Eine Gruppe von Listerien (Pfeil) scheint in die Falte einer Alveolarwand einzuwandern (Balken 1 µm). Inset: alveoläre Lungenarchitektur (Balken 50 µm). Ergebnisse 143 Abb. 28: REM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus 30 min nach i.t. Infektion mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. C) Listerien (Pfeile) in Adhäsion zu einer Alveolarwand (Al), deren Oberfläche stellenweise zerstört bzw. durch Fibrinauflagerungen (Fi) verändert ist. Direkt neben dem Bakteriencluster ragen Erythrozyten (Er) aus einer eröffneten Kapillare (Balken 2 µm). D) Listerien (Pfeile) in Adhäsion zu einer Alveolarwand mit Fibrinbelägen (Balken 1 µm). 144 Ergebnisse Abb. 28: REM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus 30 min nach i.t. Infektion mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. E) und F) Listerien (Pfeile) in Adhäsion zu den Zilien (Zi) des respiratorischen Epithels eines kleinen Bronchus, mit typischerweise zahlreichen Clarazellen (Cl) (E: Balken 5 µm; F: Balken 2 µm). Inset: Auskleidung eines kleinen Bronchus mit zilientragendem, respiratorischen Epithel mit zahlreichen, sich mehr oder weniger ins Lumen des Luftweges vorwölbenden Clarazellen (Balken 20 µm). Ergebnisse 4.9.5 145 TEM Die starken Vergrößerungen in der TEM ermöglichen die Beurteilung der Lokalisation der Listerien im Lungengewebe. Da sich mit den ultradünngeschnittenen Präparaten (80 nm) nur sehr kleine Bereiche der murinen Lunge erfassen lassen, wurden Semidünnschnitte (0,5 µm) angefertigt, um in den Präparaten eine bessere Orientierung zu erlangen. Auch die Auswahl der Gewebebereiche, die als Ultradünnschnitte aufgearbeitet werden sollten, erfolgte anhand der Semidünnschnitte. In den Ultradünnschnitten waren besonders Zellgrenzen, Phagozytose und bakterielle Adhäsion darstellbar. In den TEM-Präparaten wurde die Mehrzahl der Listerien in den Alveolarräumen nachgewiesen (Abb. 29 A, B). Hier wurden auch proliferierende Bakterien gesehen. Partiell wurden Listerien in Adhäsion zum Alveolarepithel gesehen, die die Oberfläche der Epithelzellen mikroanatomisch zu verändern schienen (Abb. 29 A). Listerien traten selten in Kapillaren des Alveolargewebes auf (Abb. 29 C, D). Zahlreiche Bakterien waren dagegen von Makrophagen phagozytiert worden (Abb. 29 E, F). Die überwiegende Anzahl phagozytoseaktiver Makrophagen hatte dabei mehrere Listerien aufgenommen. Es wurden bis zu 20 Bakterien in einer Fresszelle gezählt. Zwischen Bakterienwand und Membran des Phagosoms war jeweils ein deutlicher Spaltraum (Halo) zu erkennen. Als weiterer Befund wurde die Proliferation phagozytierter Listerien in den Makrophagen gesehen (Abb. 29 F). Häufig wurden auch sezernierende Clarazellen der murinen Lunge in den Präparaten beobachtet (Abb. 29 G, H). Die teilweise elektronendichten Granula dieser Zellen (Abb. 29 H) waren von intrazellulären Listerien trotz starker Primärvergrößerungen (16.000-fach) nicht eindeutig zu differenzieren. 146 Ergebnisse Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion. A) Listerien im Alveolarraum 24 h p.i. mit 1,8 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491 A + pERL3-CMVGFP (Balken 1 µm). Stellenweise besitzt die Bakterienwand direkten Kontakt zum Alveolarepithel (Pfeile; Al: Alveolarzelle; Ba: Basalmembran; Nu: Zellkern). Inset: Übersicht des alveolären Raums mit mehreren Bakterien 72h p.i. mit 5,4 x 105 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP (Balken 1 µm). B) Intraalveoläre Listerien (Pfeile) 30 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Die Bakterien liegen in einer Alveole, die mit verschiedenen Surfactantformen (Su) gefüllt ist (Ba: Basalmembran Alveolarepithelzelle; Balken 2 µm). Ergebnisse 147 Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion. C) Kapillare mit zwei Erythrozyten (Er) und einem intraluminal proliferierenden Bakterium 10 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Im Alveolarraum liegen zwei weitere Listerien (Pfeile) ohne Epithelkontakt (Balken 2 µm). D) Kapillare mit Erythrozyt (Er) und intraluminalem, proliferierenden Bakterium (Pfeil) 10 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt (Ba: Basalmembran von Alveolar- und Endothelzellen; Ka: Kapillarlumen; Lu: Alveolarlumen; Balken 2 µm). 148 Ergebnisse e Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion. E) Alveolarmakrophage (Nu: Zellkern; Za: Zellausstülpungen) mit phagozytierten Listerien 30 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt. Der Spaltraum zwischen Bakterienwand und Membran der Phagosomen ist deutlich zu erkennen (Pfeile). Das unterhalb des Makrophagen gelegene Alveolarepithel zeigt eine Diskontinuität der Zelloberflächen (Pfeile) und damit die lokale Zerstörung der epithelialen Barriere (Balken 2 µm). F) Alveolarmakrophage (Nu: Zellkern; Ve: Vesikel) mit phagozytierten Listerien 10 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt (Balken 2 µm). Die Freßzelle besitzt zahlreiche Zellausstülpungen (Za) und beginnt mit diesen ein weiteres Bakterium zu umschliessen (Pfeil). Zwei bereits phagozytierte Bakterien zeigen intrazelluläre Proliferation (Pfeile). Ergebnisse 149 Abb. 29: TEM-Aufnahmen aus der Lunge der Maus nach i.t. Listerieninfektion. G) Clarazelle (Cl, Nu: Zellkern) zwischen zilientragenden Zellen (Zi) des respiratorischen Epithels 24 h p.i. mit 1,8 x 106 KBE von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3CMVGFP. Die weißen Pfeile markieren elektronendichte Granula der Zelle, der schwarze Pfeil eine Listerie (Balken 1 µm). H) Elektronendichter Einschluss einer Clarazelle 10 min p.i. mit 6,0 x 108 KBE von L. monocytogenes EGD wt (Balken 2 µm). Die Zelle besitzt weitere, deutlich weniger elektronendichte Granula (Pfeile). Oberhalb des Einschlusses sind Zilien des respiratorischen Epithels angeschnitten. 150 5 Diskussion DISKUSSION Mit der Identifizierung des CFTR-Gens wurde die genetische Ursache der cystischen Fibrose (CF) gefunden (KEREM et al. 1989; RIORDAN et al., 1989; ROMMENS et al., 1989). Fortschritte in der molekulargenetischen Technik stärkten die Hoffnung, mit der somatischen Gentherapie bald über die Möglichkeit zur Heilung schwerer monogenischer Erkrankungen wie der CF zu verfügen (WEST u. RODMAN, 2001). Aufgrund der Sequenzierung des murinen Cftr-Gens konnten verschiedene gentechnisch modifizierte Mausstämme generiert werden, die zumindest einen Teil der humanen CF modellierten (GRUBB u. BOUCHER, 1999). Trotz Entwicklung und Erprobung zahlreicher viraler und nicht-viraler Vektoren blieben die erwarteten Erfolge mit der somatischen Gentherapie jedoch aus, so dass derzeit an der Verbesserung vorhandener und der Suche neuer Vektoren gearbeitet wird (PILEWSKI, 2002). Wie der Einsatz von Bakterien bei der DNA-Vakzinierung gezeigt hat, können diese Organismen Expressionsplasmide in Wirtszellen einschleusen und so eine langfristige Immunität gegen Krankheitserreger oder Tumoren induzieren (GURUNATHAN et al., 2000b; WEISS, 2003). Der Gedanke, bakterielle Vektoren für die somatische Gentherapie zu entwickeln, lag demnach nahe. Die murine Infektion mit L. monocytogenes stellt eines der bestuntersuchten Modelle für zelluläre Immunität und Pathogenitätsmechanismen intrazellulärer Bakterien dar (COSSART u. MENGAUD, 1989; SHEN et al., 1998). Der Lebenszyklus des Bakteriums zeigt eine interzelluläre Ausbreitung, die sowohl die Immunantwort des Wirtsorganismus umgehen als auch die Infektion tiefer liegender Zellschichten ermöglichen könnte (TILNEY u. PORTNOY, 1989). Ausgehend von diesen Eigenschaften des Erregers wurden attenuierte Stämme generiert und ihre Fähigkeit zur Transfektion eukaryotischer Zellen untersucht (HENSE et al., 2001). Die viel versprechenden in vitro-Transfektionsergebnisse des Stammes L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP (KRUSCH et al., 2002) ließen in vivoUntersuchungen im Tiermodell sinnvoll erscheinen. Diskussion 151 Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines pulmonalen Infektionsmodells in der Maus mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3CMVGFP und mit dem Wildtypstamm L. monocytogenes EGD. Da dieses Modell hinsichtlich der Eignung der Bakterien als Vektoren für eine somatische Gentherapie der CF untersucht werden sollte, wurde besonderes Augenmerk auf die zelluläre Lokalisation der Listerien in der Lunge gerichtet. Zur Charakterisierung des pulmonalen Listerien-Infektionsmodells wurden Mausinzuchtstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6 verwendet, die eine unterschiedliche Suszeptibilität für L. monocytogenes besitzen. 5.1 Das intratracheale Infektionsmodell Um die Eignung des Bakteriums L. monocytogenes als potentiellen Vektor einer somatischen Gentherapie in vivo untersuchen zu können, wurde zunächst die i.t. sichtkontrollierte Instillation als Applikationstechnik etabliert und die Verteilung der applizierten Bakteriensuspension in der Lunge untersucht. 5.1.1 Die i.t. sichtkontrollierte Instillation Es stehen verschiedene topische Applikationsarten für die Lunge der Maus zur Verfügung, die zur Verabreichung von Therapeutika, Pathogenen bzw. Vektoren für gentherapeutische Studien dienen. Häufig angewandte Techniken sind die intranasale Applikation (FENNELLY et al. 1999; SAJJAN et al., 2001; SAUNDERS u. CHEERS, 1996; SCHROEDER et al., 2001; ZIADY et al., 2002) und die aerogene Infektion (ALTON, et al. 1993; ANTONINI et al., 2000; BRACEGIRDLE et al., 1994; EASTMAN et al., 1997; FIEL, 2001; LEFFORD et al., 1978; VOGEL et al., 1996). Bei der in der Literatur beschriebenen i.t. Applikation handelt es sich i.d.R. um die operative Eröffnung der Trachea (CHIU et al., 2001; CHRONEOS et al., 2000; HEITMANN, et al. 1999; SINIKOVIC et al., 2001; VOGEL et al., 1996), weshalb diese 152 Diskussion Technik hier als Tracheotomie bezeichnet wird. Es existierte jedoch kein qualitativer Vergleich dieser Methoden hinsichtlich ihrer Effizienz, Reproduzierbarkeit und extrapulmonalen Kontamination. Zur Bestimmung der probatesten Applikationstechnik wurde deshalb ein methodischer Vergleich durchgeführt, der die i.t. sichtkontrollierte Instillation, die Tracheotomie, die blinde Instillation und die nasale Applikation umfasste (Kap. 3.2.7.1). Bei der oralen i.t. Instillation handelt es sich um eine Technik, die bei der Ratte etabliert ist (LIZIO et al., 2001; LUHRMANN et al. 2002; PABST et al., 2003), bei der Maus jedoch aufgrund der geringen Größe des oropharyngealen Raums nur selten angewendet wird (RUDOLPH et al., 2000). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Methode der i.t. sichtkontrollierten Instillation entwickelt (s. Kap. 3.2.3.1), bei der die direkte Applikation in die Trachea der Maus durch Verwendung einer Kopflupe ermöglicht wurde. Vergleichsweise wurde die Technik auch ohne diese optische Kontrolle durchgeführt und dann als blinde Instillation bezeichnet. Die Milz wurde als Referenzorgan für eine extrapulmonale Kontamination gewählt. Die signifikant höchsten Keimzahlen wurden in der Lunge mit der Tracheotomie nachgewiesen, d.h. diese Methode ist hinsichtlich ihrer Effektivität am besten zu beurteilen (Abb. 9). Gut reproduzierbare Ergebnisse ließen sich auch mit der i.t. sichtkontrollierten Instillation in der Lunge detektieren. Die nasale Applikation und die blinde Instillation wurden dagegen als unzuverlässig eingestuft, da eine kontrollierte Applikation in die Lunge nicht möglich war, wie eine breite Streuung der Werte zeigte (Abb. 8). Einige Tiere, die mit der nasalen Applikation oder der blinden Instillation infiziert wurden, wiesen 1 h p.i. weder Bakterien in der Lunge noch in der Milz auf. Bei diesen Tieren muss zwangsläufig eine extrapulmonale Kontamination in den Gastrointestinaltrakt stattgefunden haben. Für eine solche Kontamination sprechen auch die später bei der blinden Instillation nachgewiesenen, hohen Keimzahlen in der Milz (Abb. 8; vgl. Kap. 5.2, Diskussion der i.g. Infektion). Bei den tracheotomierten Tieren wurden keine Wundkomplikationen beobachtet. Für solche unerwünschten Nebenwirkungen besteht bei längerem Überleben der Tiere (hier: maximal 24 h p.i.) bzw. bei wiederholter Durchführung der Tracheotomie aber ein deutliches Risiko. Da die Applikation über eine Schnittinzision der Haut erfolgt, Diskussion 153 handelt es sich hier um eine mehr oder weniger bakteriell kontaminierte Wunde. Aufgrund der Invasivität der Methode und der beobachteten Störung des Allgemeinbefindens bei den tracheotomierten Tieren (Piloerektion und herabgesetzte Mobilität), wurde der experimentelle Stress für diese Tiere am höchsten bewertet. Der technische Aufwand der Applikation war bei der Tracheotomie am größten, gefolgt von der i.t. sichtkontrollierten Instillation. Da bei der blinden Instillation die Kontrolle der Position des Katheters durch die Kopflupe entfiel, ließ sich diese Technik weniger aufwendig und schneller durchführen als die i.t. sichtkontrollierte Instillation. Am schnellsten und wenigsten aufwendig war die nasale Applikation. Untersuchungen, bei denen Listerien durch Verneblung in die Lunge von Mäusen eingebracht wurden, haben gezeigt, dass hierfür eine sehr viel höhere Infektionsdosis notwendig ist als bei einer direkten Applikation (BRACEGIRDLE et al. 1994; LEFFORD et al., 1978; MUNDER et al., 2002). Als Ursachen sind neben einer hohen extrapulmonalen Kontamination auch eine Schädigung der grampositiven Organismen durch den Prozess der Verneblung annehmbar. In diesem Fall wird der Organismus des inhalierenden Versuchstieres durch nicht lebensfähige Bakterien mit einer hohen Menge antigenen Materials belastet, während sich die in die Lunge gelangenden lebensfähigen Keime nur im Promillebereich der Infektionsdosis bewegen. Auf die mögliche Schädigung der als Vektoren eingesetzten Organismen durch die aerogene Applikation wiesen bereits FLOTTE und LAUBE (2001) hin. Ein weiterer Nachteil der aerogenen Applikation ist der bei LARBIG et al. (2002) beschriebene Zeit- Verneblungskammer und Arbeitsaufwand, adaptiert werden mit müssen, dem um die eine Tiere an die stressbedingte Hyperventilation zu vermeiden. Da bei gentherapeutischen Studien häufig eine mehrfache Vektorapplikation notwendig ist (FLOTTE u. LAUBE, 2001) und gentechnisch modifizierte CF-Mäuse in ihrer Vitalität ohnehin eingeschränkt sind (DORIN, 1995; GRUBB u. BOUCHER, 1999), erscheint die Anwendung einer invasiven Applikationsmethode wie der Tracheotomie obsolet. Die aerogene Applikation kommt wegen ihrer mangelnden Effektivität, verbunden mit der starken antigenen Belastung und des hohen sowohl zeitlichen als auch technischen Aufwandes, ebenfalls nicht in Betracht. Die schnell 154 Diskussion und einfach durchführbaren Methoden der blinden Instillation und der nasalen Applikation erwiesen sich als schlecht reproduzierbar und unsicher hinsichtlich der tatsächlichen pulmonalen Verabreichung. Als nicht-invasive Technik, die sich durch gute Reproduzierbarkeit und geringe extrapulmonale Kontamination auszeichnet und die für die Versuchstiere einen mittelgradigen experimentellen Stress bedeutet, bietet sich nach diesem methodischen Vergleich die sichtkontrollierte i.t. Instillation für die pulmonale Applikation an (MUNDER et al., 2002). In Tabelle 16 sind noch einmal die Vor- und Nachteile der Methoden zur topischen Applikation in die Lunge der Maus zusammengefasst: Tab. 16: Übersicht über Vorteile und Nachteile von Techniken zur topischen Applikation einer Listeriensuspension in die Lunge. Vorteil: + gering, ++ mittelgradig, +++ hochgradig, ++++ außerordentlich; Nachteil: - gering, - - mittelgradig, - - - hochgradig, - - - - außerordentlich. i.t. sichtkon- Tracheo- blinde nasale aerogene trollierte tomie Instillation Applikation Applikation +++ ++++ ++ ++ + +++ +++ ++ + ++ - - --- --- ---- -- ---- -- - --- technischer Aufwand --- ---- -- - ---- Zeitaufwand ---- ---- -- - ---- Instillation Keimzahlen in der Lunge Anteil des Inokulums in der Lunge 1 h p.i. Reproduzierbarkeit Nebeneffekte extrapulmonale Kontamination experimenteller Stress für Versuchstiere Methodik Diskussion 5.1.2 155 Die Verteilung der Listerien in der Lunge nach i.t. Instillation Nach der Entscheidung für die i.t. sichtkontrollierte Instillation als Applikationsmethode der Wahl, stellte sich die Frage der intrapulmonalen Verteilung nach i.t. Applikation. Vergleiche zwischen i.t. Instillation und aerogener Applikation bei der Maus haben gezeigt, dass die Verteilung nach i.t. Instillation vorwiegend entlang des Tracheobronchialsystems erfolgt und peripheres alveoläres Lungengewebe nicht immer erreicht wird (VOGEL et al., 1996). Durch Verneblung applizierte Substanzen erreichten dagegen die gesamte Lungenoberfläche. Dies ist jedoch bei einer Gentherapie für die CF nicht erforderlich, da die Zielzellen für eine Transfektion die CFTR-exprimierenden Zellen der Lunge sind. Diese Zellen des respiratorischen Epithels und der submukösen Drüsen von Trachea, Bronchien und in abnehmendem Maß kleinerer Luftwege (AEBI et al. 2001; KALIN et al., 1999) werden bei i.t. Applikation erreicht. Die pulmonale Verteilung nach i.t. Applikation entspricht demnach eher der angestrebten Verwendung der Bakterien als Vektoren als nach Verneblung (s. Abb. 11). Für die praktische Durchführung der Experimente bot es sich an, sowohl die Keimzahlbestimmung als auch die histologische Präparation an einem Organ durchzuführen. Voraussetzung für ein solches Vorgehen war die symmetrische Verteilung der applizierten Keime auf die beiden Lungenhälften, so dass die einlappige linke Lunge zur Keimzahlbestimmung und die mehrlappige rechte Lunge für histologische Untersuchungen genutzt werden konnten (Kap. 4.2). Die Verteilung einer i.t. applizierten Suspension entlang des Tracheobronchialsystems wird beeinflusst durch die Position des Katheters, mit dem appliziert wird. Kaum zu kontrollierende Variablen der i.t. Applikation sind deshalb individuelle Unterschiede in Länge und Durchmesser der Trachea der Mäuse, die Tiefe, bis zu der der Katheter vorgeschoben wird oder seine Lage in der Schleimhaut. Solche Variablen können individuelle Unterschiede der Keimzahlen erklären, sie sind letztendlich aber jeder Applikationsmethode inhärent. 156 Diskussion Die Betrachtung der Lunge der Maus zeigt, dass sich die mehrlappige rechte Lunge etwa doppelt so groß darstellt wie die einlappige linke Lunge (POPESKO et al., 1992). Dieses Verhältnis spiegeln auch die Gewichte der beiden Lungenhälften wieder, die in mehreren Versuchsreihen ermittelt wurden (Daten nicht gezeigt). Wie nachgewiesen wurde, waren die Keimzahlen nach i.t. Applikation in rechter und linker Lunge nicht signifikant unterschiedlich (Kap. 4.2). Als Folge der annähernd gleichmäßigen Verteilung der Bakteriensuspension auf die unterschiedlich großen Lungenhälften ist die kleinere linke Lunge demnach einer entsprechend höheren Keimbelastung ausgesetzt. Dies bedeutet auch eine unterschiedliche Bakteriendichte in den Geweben der rechten und der linken Lunge. Um den Verbrauch an Versuchstieren zu reduzieren (FESTING, 1994) und um zugleich eine bessere Vergleichbarkeit zu erhalten, wurde der Keimzahlbestimmung an histologisch untersuchten Tieren der Vorzug vor der Möglichkeit zu histologischen Untersuchungen an beiden Lungenhälften gegeben. Da die Präparation der rechten Lunge für die Histologie die separate Verwendung einzelner Lungenlappen erlaubte, wurde in den folgenden Versuchen die linke Lunge zur Keimzahlbestimmung verwendet. 5.2 Vergleich der Keimsituation in der Lunge nach i.g. und i.t. Infektion Der Vergleich der beiden Applikationsmethoden sollte zum einen die Dissemination der Listerien in die Lunge nach i.g. Infektion beurteilen und zum anderen Auskunft darüber geben, ob die Lunge nach i.t. Infektion als ein die Dissemination begrenzendes Kompartiment angesehen werden kann (Kap. 4.3). Die natürliche Listerieninfektion erfolgt im allgemeinen nach oraler Infektion entlang der gastrointestinalen Route (FARBER u. PETERKIN, 1991). Bei der Maus wird aber eine natürliche Resistenz gegen die orale bzw. experimentell erzeugte i.g. Infektion beobachtet, die die Tiere, in Abhängigkeit von ihrem genetischen Hintergrund, vor Letalität schützt (CZUPRYNSKI et al., 2003; LECUIT et al., 2001; MARCO, et al. 1997; OKAMOTO et al., 1994). Wie DANIELS et al. (2000) und CZUPRYNSKI et al. Diskussion 157 (2003) zeigten, gelingt es durch eine Erhöhung der i.g. Infektionsdosis - etwa um den Faktor 104 der parenteralen LD50 - zumindest teilweise, die intestinale Barriere bei der Maus zu durchbrechen. Um eine gastrointestinale Listerieninfektion in der Maus zu erzeugen, sind damit Infektionsdosen von >108-109 KBE nötig (BRACEGIRDLE et al. 1994; CZUPRYNSKI et al., 2003; OKAMOTO et al., 1994; ROLL u. CZUPRYNSKI, 1990), wie sie auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden. Untersuchungen, die sich mit der oralen bzw. i.g. Listerieninfektion in der Maus beschäftigten, charakterisierten den Infektionsverlauf meist durch Keimzahlbestimmungen in Milz und Leber und nur selten in der Lunge (BRACEGIRDLE et al., 1994; CZUPRYNSKI et al., 2003 MARCO, et al. 1997; ROLL u. CZUPRYNSKI, 1990). Beim Vergleich der i.g. mit der i.t. Applikation interessierte in dieser Arbeit gerade die Lunge, da nach lokaler i.t. Applikation die Dissemination der Listerien aus der Lunge der Ausbreitung der Keime nach i.g. Applikation gegenüber gestellt werden sollte (Kap. 4.3). Im Versuch wurden die Keimzahlen 2 h, 1 d und 4 d p.i. bestimmt. Während an Tag 1 p.i. die i.g. infizierten Tiere bis auf eine Ausnahme in der Lunge steril waren, wurden zuvor, d.h. 2 h p.i. überraschenderweise schon bei vier der i.g. infizierten Tiere Listerien in der Lunge nachgewiesen (Abb. 14). Bei diesen Tieren schien bei der i.g. Applikation zumindest ein Teil des Inokulums in die Lunge gelangt zu sein, obwohl keines der Tiere während bzw. nach der Applikation Auffälligkeiten der Atmung gezeigt hatte. In Vorversuchen (Daten nicht gezeigt) hatte die Applikation des 100 µl-großen Inokulums bei mehreren Tieren Husten oder Dyspnoe ausgelöst. In diesen Fällen wurde eine unerwünschte Applikation in die Lunge angenommen. Trotz sorgfältiger Durchführung der Methode durch streng dorsale Führung der Kanüle, Abwarten des Schluckreflexes, Beobachtung von Veränderungen der Atmung, kann es bei den hier durchgeführten i.g. Infektionen - u.U. in Abhängigkeit vom Füllungszustand des Magens - zumindest zum partiellen Regurgitieren der Bakteriensuspension bei den Mäusen gekommen sein. BRACEGIRDLE et al. (1994) und DANIELS et al. (2000) ließen die Mäuse vor einer i.g. Infektion mehrere Stunden bzw. über Nacht hungern. Da die Keimbelastung der Lunge nach oraler bzw. i.g. Applikation nur in den wenigsten Studien untersucht wurde, lässt sich jedoch keine 158 Diskussion Aussage darüber treffen, ob eine Nahrungskarenz die direkte Kontamination der Lunge bei oder kurz nach der i.g. Applikation verhindert. Sieht man von einer möglichen pulmonalen Kontamination bei der i.g. Applikation ab, ähneln sich die Keimzahlen und die Verläufe beider Infektionen in Milz, Leber und Gehirn (Abb. 14). Übereinstimmende Organkinetiken werden für Milz und Leber auch von ROLL und CZUPRYSNKI (1990) und BRACEGIRDLE et al. (1993) beschrieben. Es wurden zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede der Keimzahlen nachgewiesen, obwohl die i.g. Infektionsdosis die i.t. Dosis etwa um den Faktor 5 x 104 überstieg. Eine geringe bakterielle Translokation über die intestinale Barriere, wie sie von DANIELS et al. (2000), LECIUT et al. (2001) und ROLL und CZUPRYNSKI (1990) beschrieben wird, konnte im Versuch bestätigt werden, da 24 h p.i. maximal 10-5 KBE des Inokulums in Milz oder Leber detektiert wurden. Die Keimzahlen in den Gehirnen waren für beide Infektionsrouten nicht signifikant unterschiedlich. Insgesamt wurden in den Gehirnen die niedrigsten Keimzahlen der untersuchten Organe nachgewiesen. BRACEGIRDLE et al. (1993) beschreiben dagegen in Abhängigkeit der verwendeten Listerienstämme Unterschiede der im Gehirn nachgewiesenen Keimzahlen nach aerogener bzw. i.g Infektion. Die Ausbreitung der Keime in die Lunge nach i.g. Infektion kann nicht bewertet werden, da bei der wie beschrieben durchgeführten i.g. Applikation (s. Kap. 3.2.3.5) die pulmonale Kontamination nicht ausgeschlossen werden kann. Je weiter der Untersuchungszeitpunkt von der Applikation entfernt ist, desto unbestimmter ist die Aussage, ob die Lunge bei der Infektion kontaminiert wurde. Eine Dissemination aus der Lunge nach i.t. Infektion findet offensichtlich innerhalb der ersten 24 h p.i. zumindest in Milz und Leber statt (Abb. 14 B und C), an Tag 4 p.i. waren bei allen i.t. infizierten Tieren auch im Gehirn Keime nachweisbar (Abb. 14 D). Die Lunge kann dementsprechend Kompartiment angesehen werden. nicht als weitgehend geschlossenes Diskussion 159 5.3 Suszeptibilität von BALB/c-, DBA/2- und C57BL/6-Mäusen für L. monocytogenes EGD wt und L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP Schon Ende der siebziger Jahre wurde der unterschiedliche Verlauf einer parenteralen Listerieninfektion in verschiedenen Mausstämmen beschrieben (SKAMENE u. KONGSHAVN, 1979; SKAMENE et al., 1979). Bei Tieren mit dem genetischen Hintergrund des C57BL/6-Stamms konnte eine 100-fach höhere LD50 verabreicht werden als bei suszeptibel beschriebenen Stämmen (CHEERS u. MCKENZIE, 1978; SADARANGANI et al., 1980). Von denen in dieser Arbeit verwendeten Stämmen werden BALB/c und DBA/2 als suszeptibel, C57BL/6, wie erwähnt, als resistent beschrieben (KONGSHAVN, 1986; MANDEL u. CHEERS, 1980). Die Ausprägung dieser Suszeptibilität bei intratrachealer Infektion mit L. monocytogenes EGD sollte im Vergleich zur Suszeptibilität bei parenteraler Infektion untersucht werden (Kap. 4.4). Als Parameter der Untersuchung dienten die Keimzahlen verschiedener Organe, KGW, Rektaltemperatur und das Allgemeinbefinden der Mäuse. Tiere der drei Stämme wurden mit einer Dosis infiziert, die nach BRACEGIRDLE et al. (1994) und LEFFORD et al. (1978) im Bereich der LD50 für eine pulmonale Infektion mit L. monocytogenes EGD lag. Bereits an Tag 4 p.i. hatte bei den C57BL/6-Tieren eine Eliminierung der Bakterien eingesetzt, die sich in signifikant gesunkenen Keimzahlen ausdrückte, während zu diesem Zeitpunkt die ersten BALB/c- und DBA/2-Tiere starben (Abb. 15). SKAMENE und KONGSHAVN (1979) beobachteten Unterschiede in den Keimzahlen von Milz und Leber zwischen suszeptiblen und resistenten Stämmen bereits zwischen 24 h und 48 h p.i., die zumindest für die Leber auch von MANDEL und CHEERS (1980) gezeigt wurden. Diese Differenzen konnten im hier durchgeführten Infektionsversuch nur eingeschränkt nachgewiesen werden, da an Tag 2 p.i. keine Bestimmung der Keimzahlen erfolgte. Eine deutliche Verringerung des KGWs und eine Störung des Allgemeinbefindens war bei den BALB/c und den DBA/2-Tieren aber bereits an Tag 2 p.i. erkennbar (Abb. 17, Abb. 18). Diese Untersuchungsparameter sprechen für 160 Diskussion den Einfluss einer unterschiedlichen frühen T-Zell-unabhängigen Immunantwort der Mäuse, wie sie von CHEERS et al. (1978), KONGSHAVN und SKAMENE (1984) und SADARANGANI et al. (1980) postuliert wurden. Im weiteren Versuchsverlauf zeigte sich die unterschiedliche Suszeptibilität für die Infektion mit L. monocytogenes EGD noch deutlicher (Abb. 15, Abb. 16, Abb. 17, Abb. 18). Während die C57BL/6-Tiere die Listerien nahezu vollständig eliminierten und bei ungestörtem Allgemeinbefinden sogar eine Gewichtszunahme zeigten, starben die BALB/c- und DBA/2-Mäuse mit hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden, gesunkener Rektaltemperatur und einem Verlust des KGWs. Die zusammenfassende Betrachtung der hier untersuchten Infektionsparameter bestätigt die in der Literatur beschriebene Suszeptibilität von BALB/c- und DBA/2Mäusen für eine parenterale Infektion mit L. monocytogenes EGD auch für die i.t. Infektion. Die C57BL/6-Tiere zeigten dagegen im Versuch die Resistenz, die auch nach parenteraler Infektion beobachtet wurde (CHEERS et al., 1978; KONGSHAVN, 1986; MANDEL u. CHEERS, 1980; SKAMENE u. KONGSHAVN, 1979; SKAMENE et al., 1979; STEVENSON et al., 1981). Nachdem die Suszeptibilität der Maustämme für die i.t. Infektion mit L.monocytogenes EGD bestimmt worden war, sollte dies auch für den attenuierten Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP geschehen. Die Bestimmung von KGW, Rektaltemperatur und Allgemeinbefinden hat gezeigt, dass sich diese Parameter entsprechend der Organkinetiken der Keimzahlen verändern (Abb. 15; Abb. 16; Abb. 17, Abb. 18). Die alleinige Keimzahlbestimmung erschien deshalb für die Untersuchung der Suszeptibilität dieser Stämme für den attenuierten Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP ausreichend (Kap. 4.5). Als Untersuchungszeitpunkte wurden Tag 1, 4 und 14 p.i. gewählt, um Aussagen über die frühe Infektion, den Höhepunkt der Infektion und das Infektionsende treffen zu können (Abb. 19). In Zellkulturstudien ist die Infektionsdosis von L. monocytogenes EGD wegen des zytotoxischen Effekts der Bakterien nur begrenzt zu erhöhen (KRUSCH et al., 2002). Der attenuierte Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP konnte dagegen in höheren Dosen eingesetzt werden, da die zytotoxische Aktivität Diskussion 161 der Bakterien verringert ist. Die Infektionsdosis für L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP wurde deshalb mit 2,5 x 106 KBE deutlich höher gewählt als bei der Infektion der Mausstämme mit dem Wildtypstamm (vgl. Kap. 4.4). Dennoch wurde keine Letalität bei den als suszeptibel beschriebenen Mausstämmen beobachtet. Zu keinem Zeitpunkt der Infektion konnten signifikante Unterschiede der Keimzahlen zwischen den Stämmen nachgewiesen werden (Abb. 19). Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass die statistische Aussagekraft des Experiments aufgrund der kleinen Grundgesamtheit (n = 3) eingeschränkt ist. Hinzu kommt v.a. zu Versuchsende eine breite Streuung der Werte, da nicht alle Tiere die Listerien aus allen Organen eliminiert hatten. Die fehlende Letalität und Toleranz einer Infektionsdosis von >106 KBE bei den BALB/c- und DBA/2-Tieren machen den geringen Einfluss der Suszeptibilität für die i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP deutlich. Die Versuche zum Verlauf der Infektion und Organdissemination konnten daher mit der suszeptiblen BALB/c-Maus durchgeführt werden. 5.4 Infektionsverlauf und Pathogenität des attenuierten Stamms L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP nach i.t. Infektion in der Maus Für die Charakterisierung der i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP wurde ein Versuchszeitraum von 14 Tagen gewählt, da die Eliminierung der Listerien aus dem Organismus der Maus innerhalb dieser Zeit in mehreren Arbeiten nach unterschiedlicher Inokulationsroute beschrieben wird (BARBOUR et al., 2001; KONGSHAVN 1986; LEFFORD et al., 1978). Nach aerogener Infektion eines Mausauszuchtstamms geben BRACEGIRDLE et al. (1994) für den Wildtypstamm L. monocytogenes EDG eine LD50 von 104 KBE an. Eine erhöhte Mortalität beobachteten LEFFORD et al. (1978) schon nach der Implantation von 5 x 103 KBE von L. monocytogenes EDG in die Lunge von Kreuzungstieren der Inzuchtstämme C57BL/6 und DBA/2. Sie verwendeten in 162 Diskussion weiteren Untersuchungen die aerogene Infektionsdosis 5 x 108 KBE, da mit dieser Dosis eine Keimimplantation zwischen 1 x 103 und 3 x 103 KBE in die Lunge möglich sein sollte. Ein Vergleich der in der Literatur beschriebenen Ergebnisse wird dadurch erschwert, dass teilweise Dosen angegeben wurden, die für die Verneblung zum Einsatz kamen, teilweise von den Dosen gesprochen wurde, mit denen nach der Verneblung in der murinen Lunge zu rechnen war (BRACEGIRDLE et al., 1994; LEFFORD et al., 1978; TRUITT u. MACKANESS, 1971). Bei den hier durchgeführten Infektionsexperimenten mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP wurden ansteigende Infektionsdosen verwendet (Kap. 4.5). Die bereits erwähnte - im Vergleich zu L. monocytogenes EGD verminderte zytotoxische Aktivität des attenuierten Stamms (KRUSCH et al., 2002) sollte damit hinsichtlich einer übereinstimmenden Abschwächung der Virulenz in vivo untersucht werden. TRUITT und MACKANESS (1971) zeigten nach aerogener Infektion, dass die Wachstumskinetik von L. monocytogenes EDG in der Lunge dosisabhängig ist. Bei einer Infektion mit 104 KBE stellte sich offenbar ein Gleichgewicht zwischen Proliferation der Keime und deren Eliminierung aus der Lunge ein, eine Infektionsdosis von 107 KBE führte zur systemischen Ausbreitung der Erreger und die Infektion mit über 108 KBE war gekennzeichnet durch eine 100%ige Mortalität der Tiere. Die Vermehrung der Erreger überstieg hier offensichtlich das Vermögen des Wirtsorganismus, die Listerien zu eliminieren. Unabhängig von der Infektionsdosis wurden in dieser Arbeit dagegen nach i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP in den einzelnen Organen ähnliche Keimzahlkinetiken beobachtet (Abb. 20). In der Lunge glichen die Keimzahlen zu Beginn der Infektion einem Plateau, wie es TRUITT und MACKANESS (1971) beschrieben und als Gleichgewicht zwischen Keimproliferation und abwehrbedingter Eliminierung aus der Lunge deuteten. LEFFORD et al. (1978) beobachteten für den Infektionsverlauf in der Lunge eine exponentielle Vermehrung der Listerien in den ersten 24 – 48 h, gefolgt von einem Keimzahlplateau bei ca. 106 KBE und der schnellen Eliminierung der Bakterien ab Tag 6 – 8 p.i. Diskussion 163 Maximale Keimzahlen wurden mit wenigen Ausnahmen an Tag 4 p.i. nachgewiesen. Dieser Zeitpunkt wird auch von BARBOUR et al. (2001) und BRACEGIRDLE et al. (1994) als Höhepunkt der Infektion beschrieben, während KONGSHAVN (1986) und LEFFORD et al. (1978) die maximalen Keimzahlen 1 - 2 Tage zuvor bzw. auf einem länger anhaltenden Plateau beobachteten. Da keine Bestimmung der Keimzahlen zwischen Tag 4 und Tag 14 p.i. erfolgte, ließ sich keine genaue Aussage über den Beginn der Keimeliminierung treffen. Weitere Versuche zur Organkinetik (Daten nicht gezeigt) und Vergleiche mit den bereits erwähnten Arbeiten zeigten eine Reduktion der Listerien ab Tag 4 - 7 p.i. Die Infektionsverläufe in Milz und Leber glichen einander, wobei die Keimzahlen in der Milz nicht ganz das Niveau der Leber erreichten, sondern etwa um Faktor 101102 niedriger blieben (Abb. 20 B, C). Ähnliche Kinetiken dieser Organe wurden auch von BRACEGIRDLE et al. (1994) und LEFFORD et al. (1978) beschrieben. Deutlich niedrigere Keimzahlen wurden in allen vier Versuchsreihen im Gehirn detektiert. Bis auf die Infektion mit der höchsten verwendeten Dosis überwog die Anzahl der Tiere, deren Gehirne steril blieben (Tab. 15), wodurch es innerhalb der Gruppen zu einer breiten Streuung kam (Abb. 20 D). Für die verminderte Infektion der Gehirne mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP wurde in der Literatur über aerogene Infektionen mit L. monocytogenes EGD keine Entsprechung gefunden (BRACEGIRDLE et al., 1994). Für die pulmonale Infektion mit L. monocytogenes EGD wurden letale Verläufe ab einer Dosis von 5 x 103 KBE beobachtet (BRACEGIRDLE et al., 1994; LEFFORD et al., 1978). Der attenuierte Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3CMVGFP konnte dagegen mit deutlich höheren Dosen infizieren, ohne dass es zu einer Letalität bei den Mäusen kam. Obwohl auf die Bestimmung einer LD50 für den Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP verzichtet wurde, kam es bei Infektionsdosen > 106 - 107 KBE zu letalen Infektionen. Übereinstimmend mit den Ergebnissen aus in vivo Untersuchungen wurde für den attenuierten Listerienstamm EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP eine abgeschwächte Virulenz im suszeptiblen Mausmodell nach i.t. Infektion festgestellt (KRUSCH et al., 2002). 164 Diskussion Abgesehen von der geringen Anzahl gestorbener Tiere bei den höheren Infektionsdosen, konnten bei den jeweiligen Organkinetiken der einzelnen Versuchsreihen keine signifikanten dosisspezifischen Unterschiede nachgewiesen werden. Aufgrund der geringen Tierzahlen pro Gruppe (n = 3) war eine Aussage über signifikante Unterschiede allerdings vorsichtig zu treffen, dies galt besonders bei der hohen Varianzbreite innerhalb der Keimzahlen, wie sie in den Gehirnen gesehen wurden, zu. Die Entwicklung der Keimzahlen nach i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP war nach eigenen Untersuchungen und Auswertung der Literatur, die die Infektion mit L. monocytogenes EGD beschreibt, vergleichbar mit der des Wildtypstamms. Dem attenuierten Stamm fehlte dabei jedoch die Virulenz, schwere Krankheitsverläufe oder hohe Letalität zu erzeugen. 5.5 Frühe Ausbreitung der attenuierten Listerien nach i.t. Infektion Die Untersuchungen des Verlaufs der i.t. Infektion mit L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP mit unterschiedlichen Infektionsdosen zeigten die Disseminierung der Listerien aus der Lunge in verschiedene Organe. Besonders die für einen Gentransfer interessante frühe Phase der Infektion sollte deshalb durch engmaschigere Untersuchungszeitpunkte genauer charakterisiert werden. Werden als Vektoren reproduzierende Organismen wie attenuierte Viren oder Bakterien eingesetzt, so besteht die Gefahr der unerwünschten Ausbreitung dieser Vektoren über das Zielorgan hinaus. Derlei Sicherheitsbedenken werden in erster Linie bei der Anwendung viraler Vektoren geäußert (BALS et al., 2001; FLOTTE u. LAUBE, 2001). DIETRICH et al. (1998) generierten bereits einen autolytischen Listerienstamm, der in der Lage ist, eukaryotische Zellen zu transfizieren. Noch ist die Effizienz der Transfektion durch Suizidstämme jedoch sehr begrenzt. Eine weitere Möglichkeit, eine Listerieninfektion zu terminieren, besteht in der Verabreichung von Antibiotika. Die antibiotische Kontrolle der Infektion konnte dabei durch vollständige Eliminierung der Keime in vivo eindeutig bewiesen werden Diskussion 165 (HENSE et al., 2001; KRUSCH et al., 2002). Durch kurze Untersuchungszeitpunkte in dem Versuch zur ’Frühen Organdissemination’ sollten der Beginn und Verlauf der bakteriellen Ausbreitung in dieser Infektionsphase dargestellt werden (Abb. 21). Im Hinblick auf den Einsatz von Listerien in der Gentherapie interessiert die Dissemination, um die Bakterien möglichst früh durch Antibiotika zu eliminieren. Erfolgreich mit L. monocytogenes transfizierte Zellen wurden in vitro nach einer antibiotischen Terminierung der Infektion bereits nach 18 – 20 h nachgewiesen (KRUSCH et al., 2002). Bei den Versuchsreihen zur Charakterisierung des Infektionsverlaufs wurden Listerien in Milz und Leber und vereinzelt auch im Gehirn ab 1 h p.i. detektiert (Kap. 4.6). In Milzen und Lebern waren die Keime 24 h p.i. regelmäßig nachzuweisen. Übereinstimmend mit diesen Befunden beschrieben TRUITT und MACKANESS (1971) und LEFFORD et al. (1978) für die Milz das vermehrte Auftreten der Listerien nach aerogener Infektion ebenfalls nach etwa 24 – 48 h. Wie nach der Charakterisierung des Infektionsverlaufs (Kap. 4.6) zu erwarten war, zeigten die Keimzahlen eine geringgradige Organdissemination bereits wenige Stunden nach der Infektion (Kap. 4.7). Die Keimbelastung der untersuchten Organe blieb während der ersten 18 h p.i. jedoch gering (Abb. 21). Bei Fortschreiten der Infektion über 24 h p.i. kam es dagegen in Milz und Leber zu einer starken extrapulmonalen Kontamination (Kap. 4.6). Da in der Lunge das beobachtete Keimzahlplateau der ersten 18 h p.i mehr oder weniger auch für die ersten vier Infektionstage bestehen blieb (Abb. 20 A), wäre ein effektiverer Gentransfer durch zeitlich ansteigende Vektorproliferation nicht zu erwarten. Die antibiotische Terminierung einer experimentellen Infektion mit dem bakteriellen Vektor L. monocytogenes sollte innerhalb der ersten 12 - 24 h p.i. erfolgen, da so einerseits die vollständige systemische Ausbreitung des Bakteriums vermieden wird, andererseits genügend Zeit zur Transfektion der Zielzellen zur Verfügung steht (KRUSCH et al., 2002). Neben einer Bestimmung der Keimzahlen zur Charakterisierung der Organdissemination wurde im Versuch durch histologische Auswertung von HEgefärbten Lungenschnitten der Beginn mikroanatomisch sichtbarer 166 Diskussion Entzündungsreaktionen bestimmt (Abb. 22). Geringgradige Infiltrationen mit Entzündungszellen wurden ab 8 h p.i. beobachtet. Diese inflammatorischen Veränderungen nahmen mit anhaltender Infektion zu. Da die vektorinduzierte Immunantwort des Wirts, sichtbar an der entzündlichen Pathohistologie der Lunge, zu den unerwünschten Nebenwirkungen einer Vektorapplikation gehört (FLOTTE u. LAUBE, 2001; NOONE et al., 2000), sprechen auch die histologischen Befunde für eine frühe Terminierung der Infektion. 5.6 Die histologischen Befunde der i.t. Listerieninfektion Die Frage der Lokalisation der Listerien in der Lunge ist entscheidend für die Eignung des Bakteriums als Vektor für eine somatische Gentherapie (WEISS u. KRUSCH, 2001). Diese Einsatzmöglichkeit setzt voraus, dass die fakultativ intrazellulären Listerien (FARBER u. PETERKIN, 1991) in Epithelzellen der Lunge eindringen können. DREVETS et al. (1995) zeigten, dass die Aufnahme von Listerien in nicht-phagozytierende Zellen über Internaline vermittelt wird. Je nach Art der Wirtszelle spielen verschiedene Internaline für die Bakterieninvasion eine Rolle (DRAMSI et al. 1995; DRAMSI et al., 1997; GAILLARD et al., 1991; MENGAUD et al., 1996). Die Infektion der Lunge mit Listerien wurde bisher nur experimentell erzeugt (LEFFORD et al., 1978; TRUITT u. MACKANESS, 1971; MUNDER et al., 2002), und es existierten für dieses murine Infektionsmodell keine Kenntnisse, ob es in der Lunge zu einer direkten, d.h. über Internaline vermittelten Invasion der Listerien in Zellen des respiratorischen Epithels kommt. Außerdem wäre die bakterielle Invasion pulmonaler Epithelzellen durch infizierte Makrophagen vorstellbar, wenn es zu einem indirekten interzellulären Spreading käme, wie es DREVETS et al. (1995) und GEDDE et al. (2000) für humane Enterozyten und murine Makrophagen beschrieben. In dieser Arbeit sollte deshalb die Lokalisation von L. monocytogenes EGD und eines attenuierten Listerienstamms in der Lunge der Maus nach i.t. Applikation untersucht werden. Ein breites Spektrum histologischer Methoden diente zum Nachweis entzündungsbedingter Diskussion 167 pathohistologischer Veränderungen des Lungengewebes und der Einschätzung der Keimdichte in den infizierten Lungen. 5.6.1 Pathohistologische Veränderungen des Lungengewebes TRUITT und MACKANESS (1971) zeigten nach aerogener Infektion 12 h p.i. geringgradige und 24 h p.i massive Läsionen der Lunge, die sie als entzündliche Herde - aus Alveolarmakrophagen und Listerien bestehend - beschrieben. In dieser Arbeit wurden erste geringgradige Infiltrationen der Lunge mit inflammatorischen Zellen wie Alveolarmakrophagen und neutrophilen Granulozyten ab 8 h nach i.t. Infektion mit L. monocytogenes nachgewiesen (Abb. 22). Zahl und Größe dieser Infiltrate nahm im Verlauf der ersten 24 h p.i. zu. Die pathohistologisch beobachteten Entzündungszeichen wurden überwiegend peribronchiolär und perivaskulär detektiert und zeigten eine positive Korrelation zur Infektionsdosis (Abb. 10). Mäuse mit hohen Keimzahlen zeigten eine massive Infiltration inflammatorischer Zellen, die sich in einer Pneumonie-ähnlichen Entzündung darstellte. Die Ausprägung der Entzündung war unabhängig davon, ob die Infektion mit dem Wildtypstamm oder dem attenuierten Listerienstamm erfolgte. Für die Verwendung als Genvektor stellt die inflammatorische Reaktion des Wirts eine unerwünschte Nebenwirkung dar, die es zu vermeiden gilt (FLOTTE u. LAUBE, 2001). Die histologische Auswertung der HEFärbungen unterstreicht daher die Bedeutung der frühen Termination der Listerieninfektion (s. Kap. 5.5). 5.6.2 Der allgemeine Nachweis von Listerien im histologischen Präparat Die Gramfärbung wird zur Differenzierung grampositiver und gramnegativer Bakterien verwendet (BURCK, 1988). In der vorliegenden Arbeit wurde sie modifiziert (s. Kap. 3.2.6.1), so dass durch die Kontrastfärbung des Gewebes mit Eosin eine Abschätzung der Menge und der Lokalisation der grampositiven Listerien möglich 168 Diskussion war (Abb. 23). Ebenso wie die Gramfärbung diente auch die FluoreszenzEinfachfärbung gegen Listerien (Abb. 24) der Auswahl geeigneter Präparate für die konfokale Laser- bzw. die Elektronenmikroskopie. Weder die Gram- noch die Fluoreszenz-Einfachfärbung ermöglichten eine Bestimmung der genauen Lokalisation der Listerien im Epithel. Die gezeigten Einfachfärbungen lassen durch Dichte und Anordnung von Bakterien lediglich eine erfolgte Phagozytose vermuten (Abb. 24 B). 5.6.3 Die Differenzierung intrazellulärer Listerien Fluoreszenz-Doppelfärbungen gegen Listerien und Atemwegsepithel sollten Aufschluss geben über eine intrazelluläre Lokalisation der Bakterien in Epithelzellen, die mit einer Färbung ihres Zytokeratins dargestellt wurden (Kap. 4.9.2). Die Autofluoreszenz des Lungengewebes in den gewählten Fluoreszenzkanälen erschwerte die Bewertung dieser Präparate jedoch stark. Zur Bestimmung intrazellulärer Listerien wurden deshalb die konfokale Lasermikroskopie und die Elektronenmikroskopie herangezogen (s.unten). Nach einer parenteralen Listerieninfektion werden in der Maus über 90% der zirkulierenden Bakterien durch mononukleäre Phagozyten eliminiert (EBE et al., 1999). Die Phagozytose durch aktivierte Makrophagen stellt einen bedeutsamen Teil der zellulär dominierten Immunantwort des Wirtsorganismus gegen die Listerieninfektion dar (UNANUE, 1997b). Durch Fluoreszenz-Doppelfärbungen gegen Listerien und Makrophagen wurde in dieser Arbeit die Phagozytose der i.t. applizierten Keime durch Alveolarmakrophagen untersucht. Durch Interferenz der Fluoreszenzfarben FITC und Cy 3 konnte die Ansammlung von Makrophagen in unmittelbarer Nähe einzeln oder als Cluster auftretender Listerien nachgewiesen werden (Abb. 26). Diese Akkumulation von Bakterien und aktivierten Makrophagen wurde auch in Präparaten der konfokalen Lasermikroskopie beobachtet (Abb. 27 C; CD-ROM, B, C). Die konfokale Lasermikroskopie ermöglichte zugleich in Dreifachfärbungen die Darstellung von Listerien, Epithelzellen und Makrophagen. Da Diskussion 169 bei diesen komplexen Färbungen zwei der sekundären Antikörper dieselbe Wirtsspezifität aufwiesen (s. Tab. 12 B) und an den Primärantikörper gegen Listerien banden, erscheinen die Bakterien in den Färbungen türkisgrün. Mit der Möglichkeit, Präparate in der konfokalen Lasermikroskopie dreidimensional darzustellen, gelang vereinzelt der Nachweis intrazellulärer Bakterien in Zellen des Bronchialepithels (Abb. 27 D, CD-ROM D). Es muss jedoch eingeräumt werden, dass diese Nachweise singuläre Ereignisse waren, die sich weder mit der REM noch mit der TEM wiederholen ließen. Eine prädispositionierende Schädigung der Zellen beispielsweise durch eine mechanische Schädigung bei der Applikation, die eine bakterielle Invasion erst ermöglichte, kann dabei nicht ausgeschlossen werden. Die von TILNEY und PORTNOY (1989) beschriebene Aktinpolymerisierung, mit der sich Listerien in Wirtszellen fortbewegen können, wurde in verschiedenen Arbeiten elektronenmikroskopisch oder mit der konfokalen Lasermikroskopie gezeigt (DABIRI et al. 1990; DREVETS et al., 1995; GEDDE et al., 2000; GUZMAN et al., 1995; TILNEY u. PORTNOY 1989; VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001). In dieser Arbeit konnten in Färbungen Listerien-infizierten Lungengewebes mit Phalloidin-Alexa jedoch keine der typischen Kometenschweife detektiert werden, wie sie DABIRI et al. (1990) in Makrophagen, GUZMAN et al. (1995) in dendritischen Zellen der Maus und MARQUIS et al. (1995) in humanen Epithelzellen beobachteten. Bei den angeführten Arbeiten handelt es sich allerdings um Zellkulturstudien und nicht um den Nachweis eines interzellulären Spreadings in vivo, wie es in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde. Die in der Fluoreszenz- und der konfokalen Lasermikroskopie beobachtete Akkumulation von Bakterien und Alveolarmakrophagen konnte durch die TEM als Phagozytose der Listerien verifiziert werden (Abb. 29 E, F). Die in den Phagosomen der Makrophagen nachgewiesenen Bakterien waren zwar durch einen Halo gekennzeichnet, keine der Vakuolen wies dagegen eine doppelte Membran auf, wie sie nach einem interzellulären Spreading auftritt (GEDDE et al., 2000). Auch die von TILNEY und PORTNOY (1989) beschriebenen Protrusionen, die die Listerien im Verlauf dieser Ausbreitung zwischen den Zellen induzieren und die COSSART und 170 Diskussion KOCKS (1994) und COSSART und LECUIT (1998) nachwiesen, wurden in eigenen histologischen Präparaten nicht detektiert. Die Adhäsion von Listerien zum respiratorischen Epithel wurde dagegen sowohl in der Raster- als auch in der TEM in nachgewiesen (Abb. 28 A, B; Abb. 29 A). REMPräparate zeigten die Bakterien dabei häufig in Vertiefungen oder Schleimhautfalten liegend. Da vergleichbare Erscheinungen bei einer Bakterienadhäsion in der Literatur nicht beschrieben wurden, blieb unklar, ob die Anheftung an den beschriebenen Stellen erleichtert war oder ob erst die Anlagerung der Bakterien die Bildung solcher Einstülpungen induzierte. Die Zelloberfläche von Epithelzellen schien sich durch die Adhäsion der Listerien mikroanatomisch zu verändern (Abb. 29 A). COSSART und LECUIT (1998) zeigten ähnliche Adhäsionserscheinungen zwischen Listerien und eukaryotischen Zellen, ohne die Zellen jedoch genauer zu spezifizieren. Eine tatsächliche Invasion der Listerien, die TILNEY und PORTNOY (1989) als Folge der Adhäsion beschrieben und wie sie VAZQUEZ-BOLAND et al. (2001) in Epithelzellen rasterelektronenmikroskopisch darstellten, konnte jedoch nicht beobachtet werden. Das Auftreten von Listerien in Kapillaren des Alveolarepithels wurde in geringem Maß nachgewiesen (Abb. 29 C, D). Die ultradünngeschnittenen Präparate erlaubten keine Aussage über die Unversehrtheit der Gefäße, dennoch wurde es als wahrscheinlich angesehen, dass Listerien in der Lage sind, aktiv in Alveolarkapillaren einzudringen. Diese These wird gestützt durch die Betrachtung der Keimzahlen zur Organdissemination aus der Lunge und die Beschreibung der Invasion des Gefäßsystems nach Applikation von Listerien über die gastrointestinale Infektionsroute oder durch aerogene Infektion (BRACEGIRDLE et al., 1994; DANIELS et al., 2000). Auch von der humanen Listeriose ist bekannt, dass die Ausbreitung der Erreger über Blut- und Lymphweg erfolgt (PRON et al., 1998). Clarazellen treten in den unteren Atemwegen der Maus mit einer über 50%igen Häufigkeit auf (GRUBB u. BOUCHER, 1999) und wurden in den elektronenmikroskopischen Präparaten entsprechend oft gesehen (Abb. 28 E, F; Abb. 29 G, H). Als sezernierende Zellen besitzen sie zahlreiche Granula unterschiedlicher Elektronendichte. Schwierigkeiten bereitete teilweise die Diskussion 171 Differenzierung möglicherweise intrazellulärer Listerien und elektronendichter Granula der Clarazellen (Abb. 29 G, H). Da diesen elektronendichten ‚Einschlüssen’ jedoch der typische Halo zwischen Bakterienwand und Phagosomenmembran fehlte, wurden sie letztlich nie als Listerien bewertet. Ein wichtiger Phagozytose Befund der der Listerien histologischen durch Untersuchungen Alveolarmakrophagen. ist Trotz die massive beobachteter Proliferation in Makrophagen gelang es den Bakterien - im Gegensatz zu dem für Makrophagen von TILNEY u. PORTNOY (1989) beschriebenen interzellulären Spreading - jedoch nicht, aus den Phagozyten zu entkommen. 5.7 Der quantitative Nachweis von Listerien in Epithelzellen der murinen Lunge Die natürliche Infektion mit L. monocytogenes folgt der gastrointestinalen Infektionsroute (FARBER u. PETERKIN, 1991; VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001). Bei der i.t. infizierten Lunge handelt es sich demnach um ein atypisch infiziertes Organ. Dennoch vermehrten sich die Bakterien der beiden verwendeten Stämme in einer frühen Infektionsphase, wie die nachgewiesenen Keimzahlen zeigten (s. Kap. 4.1; Kap. 4.2). Auch histologisch wurden proliferierende Bakterien detektiert (Abb. 28 A und B; Abb. 29 C, D, F). Die Vermehrung erfolgte jedoch überwiegend intraalveolär oder in Makrophagen und war selten in Alveolarkapillaren zu beobachten. Damit stimmte die Verteilung der Proliferationshäufigkeit mit der Häufigkeit des Auftretens der Listerien, wie sie in Kapitel 4.8 beschrieben wurde, überein. Bei dieser semiquantitativen Bestimmung wurde die Phagozytose der Bakterien durch Makrophagen als ein häufiges Ereignis beobachtet (zwischen 15 – 20%, Tab. 15). Die intrazelluläre Lokalisation der Listerien in Epithelzellen wurde dagegen nur mit der konfokalen Lasermikroskopie vereinzelt beobachtet (Abb. 27 D, CD-ROM D) und war mit der TEM nicht reproduzierbar (Tab. 15). Eine Quantifizierung intraepithelialer Bakterien war weder mit dem Wildtypstamm L. monocytogenes EGD noch mit dem attenuierten Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP möglich, 172 Diskussion da die attenuierten Bakterien zu keinem untersuchten Zeitpunkt der Infektion und mit keiner der applizierten Infektionsdosen intraepithelial nachgewiesen wurden und dieser Nachweis mit dem Wildtypstamm nur singulär gelang. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den in vitro gezeigten Transfektionsergebnissen (KRUSCH et al., 2002). Die Summe der Untersuchungsergebnisse spricht dafür, dass weder der Wildtypstamm L. monocytogenes EGD noch der attenuierte Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP in vivo in der Lage sind, in Epithelzellen des Respirationstrakts eine direkte Internalin-vermittelte oder eine indirekte Invasion über infizierte Makrophagen zu induzieren (s. Kap. 5.6). 5.8 Der Versuchsansatz Das von TILNEY und PORTNOY (1989) beschriebene Modell des interzellulären Spreadings von L. monocytogenes konnte histologisch in zahlreichen in vitro Untersuchungen verifiziert werden (COSSART u. KOCKS 1994; DOMANN et al. 1993; DREVETS et al. 1995; GEDDE et al., 2000; KOCKS et al., 1992; MARQUIS et al., 1995). Im Gegensatz dazu konnten Bakterien der beiden untersuchten Listerienstämme in den in dieser Arbeit durchgeführten in vivo Experimenten nur phagozytiert nachgewiesen in Makrophagen, werden. Es nicht wurden jedoch auch intrazellulär keine in Epithelzellen doppelwandigen Vakuolen beobachtet, die zumindest auf eine aktive Ausbreitung der Listerien zwischen Makrophagen hätten schließen lassen. Wie die Arbeiten von LECUIT et al. (1999, 2001) zeigten, ist die Inl A-vermittelte Invasion der Darmschranke der Maus durch Listerien aufgrund der Struktur des murinen E-Cadherins nicht möglich. Der Mensch ist dagegen suszeptibel für die gastrointestinale Infektion mit L. monocytogenes (FARBER u. PETERKIN, 1991). MARQIS et al. konnten 1995 die intrazelluläre Proliferation und interzelluläres Spreading der Erreger in vitro in humanen Epithelzellen nachweisen. In Entsprechung der enteralen Infektion ist also vorstellbar, dass Listerien wohl humane, nicht aber murine Epithelzellen infizieren können. Die dieser Arbeit Diskussion 173 vorausgegangenen Transfektionsexperimente mit L. monocytogenes EGD und L. monocytogenes EGD hly W 491 A wurden ebenfalls in humanen Epithelzellkulturen durchgeführt (KRUSCH et al., 2002). Obwohl die experimentelle pulmonale Infektion der Maus mit L. monocytogenes in den durchgeführten Infektionsexperimenten reproduzierbar erzeugt und charakterisiert werden konnte, stellt die Maus also möglicherweise nicht das geeignete Modell für die bakterielle Invasion der Epithelzellen des Respirationstrakts dar. Bei Infektionen mit L. monocytogenes EGD konnten sehr vereinzelt intrazelluläre Bakterien in Bronchialepithelzellen detektiert werden. Dies war mit dem attenuierten Stamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP nicht der Fall. Die Virulenz des Wildtypstamms ließ eine Erhöhung der Infektionsdosis > 108 KBE nicht zu, da die infizierten Mäuse innerhalb von 1 – 2 h p.i. starben. Obwohl die abgeschwächte Virulenz von L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP Infektionsdosen von < 107 KBE bei nur geringer Mortalität der infizierten Mäuse ermöglichte, konnten auch nach Infektion mit < 1011 KBE der attenuierten Listerien, diese nicht in Epithelzellen detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Spontane oder induzierte Mutationen verschiedenster Tierspezies dienen als Krankheitsmodelle für den Menschen (KOLBERG, 1992). Bei der Maus besteht mit dem Verfahren der zielgerichteten Mutagenese die Möglichkeit, gentechnisch modifizierte Tiere zu erzeugen, die Entsprechungen krankheitsauslösender humaner Mutationen in ihrem Erbgut tragen (WURST u. JOYNER, 1995). Auf diese Weise sind auch zahlreiche Mausmodelle der CF entstanden (GRUBB u. BOUCHER, 1999). Die wenigsten dieser Mutanten weisen jedoch überhaupt Anzeichen einer respiratorischen Affektion auf (CLARKE et al., 1992; DAVIDSON et al., 1995; SNOUWART et al., 1995). Wenn die hier untersuchte Infektion muriner Epithelzellen mit Listerien erfolgreich gewesen wäre, blieben dennoch kritische Fragen zur Maus als Modell für die CF im Allgemeinen. COLLINS (1992) beispielsweise spricht die anatomischen Unterschiede des humanen und murinen Respirationstrakts an und verweist besonders auf die Bedeutung der submukösen Drüsen in Trachea und Bronchialsystem des Menschen. Diese Zellen exprimieren hohe CFTR-Level und sind in der Lunge der Maus nur eingeschränkt vorhanden. Das Fehlen 174 Diskussion respiratorischer Symptome wird von KENT et al. (1997) auf mögliche alternative ClKanäle zurückgeführt, die bei der CF-Maus zum Einsatz kommen. Mit der erfolgreichen Infektion von Epithelzellen und einer interzellulären Ausbreitung der Listerien in basale Zellschichten des respiratorischen Epithels wären demnach nur erste Schritte auf dem Weg, Listerien als Genvektoren zu etablieren, getan worden. Diskussion 5.9 175 Ausblick Rekombinante Listerien sind in der Lage, in vitro erfolgreich Epithelzelllinien mit CFTR zu transfizieren. In der Maus als Modelltier konnte in dieser Arbeit ein stabiles pulmonales Infektionsmodell etabliert werden. Gelungen ist auch die Abschwächung der Virulenz in dem attenuierten Stamm L. monocytogenes hlyW491A + pERL3CMVGFP. Mäuse können mit diesen rekombinanten Bakterien in deutlich höheren Dosen infiziert werden als mit dem Wildtypstamm L. monocytogenes EGD. Eine in vitro nachgewiesene, erfolgreiche Transfektion eukaryotischer Zellen (KRUSCH et al., 2002) scheiterte jedoch in vivo. Die untersuchten Listerienstämme waren nicht in der Lage, in Epithelzellen des Respirationstrakts einzudringen. Für den weiteren Ausbau eines bakteriellen Vektorsystems für eine somatische Gentherapie ist dies jedoch eine unabdingbare Voraussetzung. Zur Annäherung an das Ziel, L. monocytogenes als Genvektor einzusetzen, muss als nächster Schritt ein Targeting der Bakterien auf die epithelialen Zielzellen erfolgen. Es müssen apikale Strukturen respiratorischer Epithelzellen gefunden werden, die die Bindung rekombinanter Listerien und die daran anschließende Invasion ermöglichen. Trotz zahlreicher Studien wurde für die CF-Gentherapie bisher kein tatsächlicher Durchbruch erzielt (RATJEN u. DÖRING, 2003). Auch die am weitesten entwickelten viralen Vektoren sind derzeit nicht in der Lage, die apikale Barriere des Respirationstrakts effizient zu überwinden (PILEWSKI, 2002; WANG et al., 2002). Die Fähigkeit von L. monocytogenes zur interzellulären Ausbreitung (COSSART u. LECUIT 1998; DREVETS et al. 1995; GEDDE et al. 2000; GUZMAN et al. 1995; TILNEY u. PORTNOY, 1989) und zur Transfektion eukaryotischer Zellen mit CFTR (KRUSCH et al., 2002) sollten deshalb der Grund sein, an einer Weiterentwicklung dieses alternativen Vektorsystems zu arbeiten. 176 Zusammenfassung 6 ZUSAMMENFASSUNG Antje Munder: „Untersuchung der murinen, pulmonalen Infektion mit Listeria monocytogenes im Hinblick auf eine mögliche Eignung des Bakteriums als Vektor für die somatische Gentherapie der Cystischen Fibrose“ In der vorliegenden Arbeit wurde das Modell der Listerieninfektion in der Lunge der Maus nach intratrachealer (i.t.) sichtkontrollierter Instillation etabliert. Zur Bestimmung einer probaten Applikationsmethode wurde zunächst ein methodischer Vergleich verschiedener Applikationstechniken durchgeführt, bei dem die i.t. sichtkontrollierte Instillation als die am besten geeignete Methode beurteilt wurde (MUNDER et al., 2002). Da es bei der Verteilung einer i.t. applizierten Listeriensuspension nicht zu signifikanten Unterschieden der Keimzahlen in beiden Lungenhälften kam, wurde bei den folgenden Experimenten jeweils die linke Lunge zur Keimzahlbestimmung und die rechte Lunge für die histologische Präparation verwendet. Wie der Vergleich zwischen der intragastrischen (i.g.) und der i.t. induzierten Listerieninfektion zeigte, konnte einerseits die pulmonale Kontamination nach i.g. Applikation der Bakterien nicht ausgeschlossen werden, andererseits fand nach i.t. Applikation eine rasche Dissemination aus der Lunge statt, so dass die Lunge nicht als Kompartiment gesehen werden konnte, welches eine Ausbreitung der Listerien verhindert. Wie aus der Literatur bekannt, besitzen die Mausinzuchtstämme BALB/c, DBA/2 und C57BL/6 unterschiedliche Suszeptibilitäten für eine parenterale Infektion mit L. monocytogenes EGD. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass BALB/c- und DBA/2-Mäuse für die i.t. Infektion ebenso suszeptibel sind wie für die parenterale und C57BL/6-Mäuse sich für beide Infektionsarten als resistent erweisen. Die i.t. Infektion der drei genannten Mausstämme mit dem attenuierten Bakterienstamm L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP ließ dagegen keine Unterschiede in der Suszeptibilität der Tiere erkennen. Die Virulenz der Bakterien Zusammenfassung 177 war zudem stark abgeschwächt, so dass in Versuchen zur Bestimmung der Pathogenität die Infektionsdosis im Vergleich zur LD50 des Wildtypstamms um den Faktor 103 erhöht werden konnte, ohne dass es zu letalen Infektionsverläufen kam. Die untersuchten Infektionskinetiken der Organe Lunge, Milz, Leber und Gehirn unterschieden sich dabei nicht grundsätzlich von denen des Wildtypstamms L. monocytogenes EGD und wiesen auch keine dosisabhängigen Unterschiede auf. Die Charakterisierung des frühen Infektionsverlaufs nach i.t. Infektion zeigte eine relativ geringe Keimbelastung der Organe Milz, Leber und Gehirn, so dass die ersten 18 Stunden für mögliche Transfektionen mit Listerien interessant wären. Auch pathohistologische nachweisbare Entzündungszeichen wurden verstärkt nach diesem Zeitraum beobachtet und stellten sich als vorwiegend peribronchioläre und perivaskuläre Infiltrationen mit Makrophagen und neutrophilen Granulozyten dar. Für die Verwendung als Vektoren einer somatischen Gentherapie für die Cystische Fibrose ist die Invasion pulmonaler Epithelzellen durch die Listerien unabdingbare Voraussetzung. In der Arbeit wurde daher ein breites Spektrum histologischer Methoden angewandt, um die genaue Lokalisation der Listerien in der Lunge zu bestimmen. Trotz der Untersuchung verschiedener Infektionsdosen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Infektion konnten intraepitheliale Bakterien des Stamms L. monocytogenes EGD nur singulär und nicht sicher reproduzierbar nachgewiesen werden. Obwohl KRUSCH L. monocytogenes EGD hlyW491A + et al. (2002) mit pERL3-CMVGFP in dem vitro Stamm gute Transfektionsergebnisse beobachteten, zeigten sich die attenuierten Listerien in dieser Arbeit nicht in der Lage, Epithelzellen der Lunge zu infizieren. Mit der i.t. sichtkontrollierten Instillation steht nun eine nicht-invasive Methode zur Verfügung, mit der sich die Infektion in der Lunge der Maus reproduzierbar erzeugen lässt. Die herabgesetzte Virulenz des Stamms L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP ermöglicht die pulmonale Infektion suszeptibler Mäuse mit einem Vielfachen der LD50 des Wildtypstamms. Um eine Verwendung des Bakteriums L. monocytogenes als Vektor einer somatischen Gentherapie für die CF zu ermöglichen, muss ein Targeting der Bakterien auf epitheliale Zielzellen der Lunge erfolgen. 178 7 Summary SUMMARY Antje Munder: „Analysis of a murine pulmonary infection with Listeria monocytogenes regarding the feasibility of the pathogen as a vector for somatic gene therapy of cystic fibrosis“ In the present study the murine lung infection model with Listeria (L.) monocytogenes by view-controlled intratracheal (i.t.) instillation was established. First, four techniques for delivery of listeria to murine lungs were compared. Viewcontrolled i.t. instillation was superior to the other three modes of intranasal delivery, blind i.t. instillation or inoculation via tracheotomy (MUNDER et al., 2002). Since the right and left lungs were targeted with similar amounts of listeria, the left lung was chosen for bacterial viable counts and the right lung for histological examination as endpoints of experiments. Comparing an intragastric (i.g.) and an i.t. induced listerial infection, it was shown that pulmonary contamination occurred after i.g. application and there was a quick dissemination from the lung after i.t. application. In conclusion the lung is not a closed compartment for containment of listeria. Inbred mice strains BALB/c, DBA/2 and C57BL/6 are known to be differentially susceptible to a parenteral infection with L. monocytogenes EGD. In the present study it was demonstrated that BALB/c- and DBA/2-mice are as susceptible to an i.t. infection as to a parenteral infection, whereas C57BL/6-mice turned out to be resistant towards both modes of infection. Infected with the attenuated bacterial strain L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP no differences were seen between the three inbred strains. The attenuated strain was less virulent in mice; an infection dose of 1000 x LD50 of the wildtype bacteria did not cause any lethal infections. No basic differences in the kinetics of the infection in lung, spleen, liver and brain were detected in comparison to the wildtype strain and no differences were observed depending on the dose of infection. Summary 179 Characterisation of the early course of infection subsequent to i.t. infection demonstrated a relatively low bacterial burden in spleen, liver and brain, implying that the first 18 hours after infection might be interesting for possible transfections. Furthermore, pathohistologically detected signs of inflammation were more often observed after this period and predominantly in the form of peribronchial and perivascular infiltrations of alveolar macrophages and neutrophils. To apply listeria as a vector for somatic gene therapy, it is an indispensable prerequisite that these bacteria invade lung epithelial cells. In this study confocal laser microscopy, electron scanning and transmission electron microscopy were employed to determine the exact localisation of listeria in the lung. In spite of varied doses of infection at different time points, bacteria of the strain L. monocytogenes EGD could be detected in epithelial cells only sporadically und not in a reproducible way. Although KRUSCH et al. (2002) observed the transfection of cells with the strain L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP in vitro, in the present study the attenuated listeria did not have the ability to invade lung epithelial cells in vivo. In summary, the view controlled i.t. instillation represents a non-invasive method which produces stable and reproducible infections in the murine lungs. The reduced virulence of L. monocytogenes EGD hlyW491A + pERL3-CMVGFP strain allows infection of the lung of susceptible mice with a multiple of the lethal dose of the wildtype strain. Before L. monocytogenes may be used as a vector for the somatic gene therapy of cystic fibrosis, it has to be reengineered to target lung epithelial cells. 180 8 Literaturverzeichnis LITERATURVERZEICHNIS ADAK, G.K., S.M. LONG u. S.J. O'BRIEN (2002): Trends in indigenous foodborne disease and deaths, England and Wales: 1992 to 2000. Gut 51, 832-841 AEBI, C., J. BARGON, C. CASAULTA AEBISCHER, M. GÖTZ, M. GRIESE, R. KIESELMANN, R. KRAEMER, S. KRIEMLER, G. KUSENBACH, J. LIESE, H. LINDEMANN, F. RATJEN, D. REINHARDT, J. RIEDLER, M.H. SCHÖNI, A. SCHUSTER u. C. VOGELMEIER (2001): Atemwegserkrankungen. In: REINHARDT, D., M. GÖTZ, R. KRAEMER u. M.H. SCHÖNI (Hrsg.): Cystische Fibrose. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, S. 265-380 AKABAS, M.H. (2000): Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. 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Danke an Karin Westermann und Britta Wenske für die vielen kleinen und größeren Dienste, die mir erwiesen wurden. Mein großer Dank gilt Dr. A. Lührmann, die mich während meiner gesamten Arbeit begleitet hat und die mir zahllose gute Ratschläge gab. Bei Herrn Dr. S. Weiß bedanke ich mich für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe Molekulare Immunologie an der GBF und für seine stets gewährte Unterstützung. Ich danke Dr. S. Krusch für seine geduldige Einführung in die Arbeit mit Listerien und seine Hilfe bei den Infektionsversuchen. Andrea Zelmer danke ich dafür, dass sie immer bereit war, mir bei meinen Untersuchungen zur Seite zu stehen. Ich danke Susanne zur Lage und den übrigen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Molekulare Immunologie für ihre Hilfsbereitschaft und die nette Arbeitsatmosphäre. Besonders möchte ich mich bei Tanja Kleinke bedanken, die viel Zeit investierte, um mir ihre Fachkenntnisse der Immunhistochemie zu vermitteln. Herrn Prof. B. Tümmler danke ich für seine motivierende Unterstützung und fachliche Beratung bei der Anfertigung der Dissertation. Herrn Dr. K. Dittmar, Herrn Dr. M. Rohde und Herrn Dr. A. Schmiedl danke ich für ihre Anleitung und Unterstützung bei der konfokalen Fluoreszenz- und der Elektronenmikroskopie. Bei Martina Hanke bedanke ich mich für die Anfertigung der ausgezeichneten histologischen Präparate. Herzlichen Dank an Dagmar Stelte für die Bearbeitung meiner Abbildungen. Ich danke auch meiner Freundin Dr. Nina Ahrens, die mir zeigte, dass eine Promotion nicht unmöglich ist. Großer Dank gilt meinen Eltern, die mir durch ihre Unterstützung meinen beruflichen Werdegang und schließlich die Promotion ermöglichten. Christian, Dir danke ich für Deine Unterstützung, für die hilfreichen Kommentare aus der Sicht eines Sprachphilosophen und dafür, dass Du immer für mich da warst. Ich möchte jeden Leser dieser Arbeit auch an meine Versuchstiere erinnern, ohne die diese wissenschaftliche Arbeit nicht durchführbar gewesen wäre und die ihr Leben für die Suche nach einer neuen Therapie in der Bekämpfung der Cystischen Fibrose gegeben haben.
