Dissertation_K.Braumandl.20160505Druckversionfinal

Untersuchungen zu β-Catenin hinsichtlich des Mutationsstatus,
sowie klinisch-pathologischer Eigenschaften in aggressiver
Fibromatose (Desmoid-Tumor)
Aus der Abteilung Diagnostische Molekularpathologie des
Pathologischen Instituts der Universitätsklinik Erlangen
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Karin Eva Braumandl
aus Straubing
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h. c. Jürgen
Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. F. Haller
Gutachter:
Prof. Dr. A. Hartmann
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Januar 2017
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ........................................................................................ 1
Abstract .......................................................................................................... 3
1. Einleitung ................................................................................................... 5
1.1 Aggressive Fibromatose (Desmoid-Tumor) .......................................... 5
1.1.1. Einführung ..................................................................................... 5
1.1.2 Epidemiologie ................................................................................. 6
1.1.3 Lokalisation .................................................................................... 6
1.1.4 Klinisches Bild ................................................................................ 7
1.1.4.1 Gardner-Syndrom.................................................................... 7
1.1.4.2 Sporadische Desmoid-Tumore ................................................ 7
1.1.5 Pathologie ...................................................................................... 8
1.1.6 Ätiologie.......................................................................................... 9
1.1.7 Klassifikation ................................................................................ 11
1.1.8 Prognose ...................................................................................... 11
1.1.9 Therapie ....................................................................................... 12
1.2 Das Gen CTNNB1 .............................................................................. 14
1.2.1.Das Protein β-Catenin .................................................................. 14
1.2.3 Die Funktion von β-Catenin .......................................................... 14
1.2.4 Zielgene von β-Catenin ................................................................ 17
1.2.5 Die Rolle von β-Catenin in der Entstehung von sporadischen DTs
.............................................................................................................. 18
1.3 Das β-Catenin Zielgen CCND1 ........................................................... 19
1.3.1 Das Protein Cyclin D1 .................................................................. 20
1.3.2 Die Rolle von Cyclin D1 im Zellzyklus .......................................... 20
1.4 Das Gen KI67 ..................................................................................... 21
1.4.1 Das Protein KI-67 ......................................................................... 21
1.4.2 Die Rolle von KI-67....................................................................... 22
1.5 Die Steroidhormonrezeptoren ............................................................. 22
1.5.1 Die Struktur der Nukleären Hormon Rezeptoren (NRs)................ 22
1.5.2 Östrogen-Rezeptoren ................................................................... 23
1.5.3 Progesteron-Rezeptor .................................................................. 24
1.6 Fragestellung ...................................................................................... 25
2. Material und Methoden ............................................................................ 26
2.1 .Geräte, Reagenzien und Verbrauchsmaterial .................................... 26
2.1.1 Verbrauchsmaterial ...................................................................... 26
2.1.2 Geräte .......................................................................................... 27
2.1.3 Reagenzien .................................................................................. 28
2.1.3.1 Bestimmung der DNA-Qualität .............................................. 28
2.1.3.2 Polymerase-Ketten-Reaktion ................................................ 29
2.1.3.3 Pyro-Sequenzierung.............................................................. 29
2.1.3.4 Tissue Micro-Array ................................................................ 30
2.1.4 Kits ............................................................................................... 30
2.1.4.1 DNA-Extraktion...................................................................... 30
2.1.4.2 Pyrosequenzierung ............................................................... 31
2.1.4.3 Aufreinigung der PCR-Produkte ............................................ 31
2.1.4.4 Tissue Micro Array ................................................................ 31
2.1.5 Antikörper ..................................................................................... 32
2.2 Patientenkollektiv ................................................................................ 32
2.3 Methodik ............................................................................................. 35
2.3.1 DNA-Extraktion mit QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit ................... 35
2.3.2 Bestimmung der DNA-Qualität ..................................................... 37
2.3.2.1 Messung der Nukleinsäurekonzentration .............................. 37
2.3.2.2 Gelelektrophorese zur Qualitätskontrolle der DNA-Extraktion37
2.3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion ........................................................ 39
2.3.3.1 Vorbereitung der PCR ........................................................... 39
2.3.3.2 PCR-Primer ........................................................................... 40
2.3.3.3 PCR-Programm ..................................................................... 41
2.3.3.3 Gelelektrophorese zur Qualitätskontrolle der PolymeraseKetten-Reaktion ................................................................................ 41
2.3.4 Quantitative Mutationsanalyse mittels Pyrosequenzierung .......... 42
2.3.4.1 Erstellen des Assays und des Set-up .................................... 42
2.3.4.1 Vorbereitung der PCR-Produkte für die Pyrosequenzierung . 44
2.3.4.5 Pyrosequenzierung und Auswertung..................................... 45
2.3.5 Kettenabbruch-Methode nach Sanger .......................................... 46
2.3.5.1 Aufreinigung der PCR-Produkte ............................................ 46
2.3.5.2 Vorbereitung für den Versand ............................................... 47
2.3.5.3 Auswertung der Sequenzen .................................................. 47
2.3.6 Verdünnungsreihe ........................................................................ 51
2.3.6.1 Auswahl der Proben .............................................................. 51
2.3.6.2 Berechnung der Verdünnungsstufen ..................................... 51
2.3.6.3 Amplifikation und Sequenzierung .......................................... 52
2.3.7 Tissue Micro Array (TMA)............................................................. 52
2.3.7.1 Erstellen der TMAs ................................................................ 52
2.3.7.2 Immunhistochemische Färbungen ........................................ 54
2.3.7.3 Auswertung der TMAs ........................................................... 55
2.3.8. Statistische Auswertung .............................................................. 56
3. Resultate .................................................................................................. 57
3.1 Charakterisierung des Kollektivs......................................................... 57
3.1.1 Reevaluation des Kollektivs .......................................................... 57
3.1.2 Primärtumor und Rezidiv .............................................................. 57
3.1.3 Geschlechter und Altersprävalenz ................................................ 57
3.1.4 Tumorlokalisation ......................................................................... 58
3.1.5 Tumorgröße .................................................................................. 59
3.1.6 Tumorentität ................................................................................. 59
3.1.7 Immunhistochemische Eigenschaften .......................................... 60
3.1.7.1 β-Catenin............................................................................... 60
3.1.7.2 Die Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1 ...................... 61
3.1.7.2.1 Cyclin D1 ........................................................................ 61
3.1.7.2.2 MIB-1 .............................................................................. 62
3.1.7.3 Die Steroidrezeptoren ERα und PR ...................................... 62
3.1.7.3.1 Östrogen-Rezeptor α ...................................................... 62
3.1.7.3.2 Progesteron-Rezeptor .................................................... 62
3.1.8 Mutationsstatus ............................................................................ 63
3.1.8.1 Häufigkeitsverteilung der Mutationen .................................... 63
3.1.8.2 Beschreibung der Mutationen im Exon 3 des CTNNB1-Gens 63
3.2 Vergleich der Tumorcharakteristika .................................................... 66
3.2.1 Geschlecht und Alter .................................................................... 66
3.2.2 Lokalisation und Tumorgröße ....................................................... 67
3.2.3 Lokalisation und Alter ................................................................... 68
3.2.4 Lokalisation und Geschlecht......................................................... 70
3.2.5 Immunhistochemie und Alter ........................................................ 70
3.2.5.1 Alter und Immunhistochemie für β-Catenin ........................... 70
3.2.5.1.1 Alter und Anteil β-Catenin-positiver Zellen in Prozent..... 70
3.2.5.1.2 Alter und Intensität der Anfärbung für β-Catenin ............ 71
3.2.5.1.3 Alter und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle ........... 72
3.2.5.2 Alter und Immunhistochemie für die Proliferationsmarker
Cyclin D1 und MIB-1 ......................................................................... 73
3.2.5.2.1 Alter und Cyclin D1 ......................................................... 73
3.2.5.2.2 Alter und MIB-1 Score .................................................... 73
3.2.5.3 Alter und Immunhistochemie für ERα .................................... 74
3.2.6 Immunhistochemie und Geschlecht ............................................. 74
3.2.6.1 Geschlecht und Immunhistochemie für β-Catenin ................. 74
3.2.6.1.1 Geschlecht und Anteil β-Catenin- positiver Zellen in
Prozent .......................................................................................... 74
3.2.6.1.2 Geschlecht und Intensität der Anfärbung für β-Catenin .. 75
3.2.6.1.3 Geschlecht und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle . 76
2.3.6.2 Geschlecht und Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1... 76
2.3.6.2.1 Cyclin D1 und das Geschlecht ........................................ 76
2.3.6.2.2 MIB-1 und das Geschlecht.............................................. 77
3.2.6.3 Geschlecht und ERα ............................................................. 77
3.2.7 Immunhistochemie und Lokalisation............................................. 78
3.2.7.1 Lokalisation und Immunhistochemie für β-Catenin ................ 78
3.2.7.1.1 Lokalisation und Anteil β-Catenin positiver Zellen in
Prozent .......................................................................................... 78
3.2.7.1.2 Lokalisation und Intensität der Anfärbung für β-Catenin . 79
3.2.7.1.3 Lokalisation und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle 80
3.2.7.2 Lokalisation und Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1.. 80
3.2.7.2.1 Cyclin D1 und die Lokalisation ........................................ 80
3.2.7.2.2 MIB-1 und die Lokalisation ............................................. 81
3.2.7.3 Lokalisation und ERα ............................................................ 82
3.2.8 Immunhistochemie und Tumorgröße ............................................ 82
3.2.8.1 Tumorgröße und Immunhistochemie für β-Catenin ............... 82
3.2.8.1.1 Tumorgröße und Anteil β-Catenin-positiver Zellen in
Prozent .......................................................................................... 82
3.2.8.1.2 Tumorgröße und Intensität der Anfärbung für β-Catenin 83
3.2.8.1.3 Tumorgröße und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle 84
3.2.8.2 Tumorgröße und Immunhistochemie für die
Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1 ........................................ 85
3.2.8.2.1 Die Expression von Cyclin D1 im Vergleich mit der Tumorgröße ............................................................................................. 85
3.2.8.2.2 MIB-1-Score im Vergleich mit der Tumorgröße .............. 85
3.2.8.3 Tumorgröße im Vergleich mit der Expression von ERα ......... 86
3.2.9 Immunhistochemie und Tumorentität ........................................... 87
3.2.9.1 Tumorentität und Immunhistochemie für β-Catenin .............. 87
3.2.9.1.1 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der βCatenin-Positivität in Prozent ......................................................... 87
3.2.9.1.2 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Intensität der Anfärbung für β-Catenin ........................................... 87
3.2.9.1.3 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Lokalisation von β-Catenin in der Zelle .......................................... 88
3.2.9.2 Tumorentität und Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1 88
3.2.9.2.1 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Immunhistochemie für Cyclin D1 ................................................... 88
3.2.9.2.2 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Immunhistochemie für MIB-1 ......................................................... 89
3.2.9.3 Tumorentität im Vergleich mit der Expression von ERα ........ 90
3.2.10 Mutationsstatus und Alter ........................................................... 90
3.2.11 Mutationsstatus und Geschlecht ................................................ 92
3.2.12 Mutationsstatus und Tumorgröße ............................................... 92
3.2.13 Mutationsstatus und Tumorlokalisation ...................................... 93
3.2.14 Mutationsstatus und Tumorentität .............................................. 94
3.2.15 Mutation und Immunhistochemie ................................................ 94
3.2.15.1 Mutation und Immunhistochemie für β-Catenin ................... 94
3.2.15.1.1 Mutation und Anteil β-Catenin positiver Zellen in Prozent
...................................................................................................... 94
3.2.15.1.2 Mutation und Intensität der Anfärbung für β-Catenin .... 95
3.2.15.1.3 Mutation und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle ... 96
3.2.15.2 Mutation und Immunhistochemie für die Proliferationsmarker
Cyclin D1 und MIB-1 ......................................................................... 97
3.2.15.2.1 Mutation und Immunhistochemie für Cyclin D1............. 97
3.2.15.2.2 Mutation und Immunhistochemie für MIB-1 .................. 97
3.2.15.3 Mutation und Immunhistochemie für ERα ........................... 98
3.3 Überleben ........................................................................................... 99
3.3.1 Überleben und Geschlecht ........................................................... 99
3.3.2 Überleben und Altersgruppen nach Raitamo et al. ..................... 100
3.3.3 Überleben und Lokalisation ........................................................ 101
3.3.4 Überleben und Tumorgröße ....................................................... 102
3.3.5 Überleben und Tumorentität ....................................................... 103
3.3.6 Überleben und Immunhistochemie ............................................. 103
3.3.6.1 Überleben und Immunhistochemie für β-Catenin ................ 103
3.3.6.1.1 Überleben und Anteil an β-Catenin positiven Zellen in
Prozent ........................................................................................ 103
3.3.6.1.2 Überleben und Intensität der Anfärbung ....................... 105
3.3.6.1.3 Überleben und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle 106
3.3.6.2 Überleben und Immunhistochemie für die Proliferationsmarker
Cyclin D1 und MIB-1 ....................................................................... 107
3.3.6.2.1 Überleben und Cyclin D1 .............................................. 107
3.3.6.2.2 Überleben und MIB-1.................................................... 108
3.3.6.3 Überleben und Immunhistochemie für ERα......................... 109
3.3.7 Überleben und Mutationsstatus .................................................. 109
3.4 Vergleich der Methode nach Sanger und der Pyro- Sequenzierung . 110
4. Diskussion.............................................................................................. 113
4.1 Das tumorfreie Überleben ............................................................. 113
4.2 Die Rolle des Alters, Geschlechts und der Tumorentität für das
Wachstum von DTs ............................................................................. 114
4.3 Die Tumorlokalisation an den Extremitäten kann nicht als negativer
prädiktiver Faktor bestätigt werden ..................................................... 116
4.4 Die MIB-1 Expression ist abhängig von der Tumorgröße .............. 117
4.5 Mutationen im CTNNB1-Gen als Mittel zur Diagnosesicherung von
Desmoidtumoren ................................................................................. 117
4.6 Der Einfluss des Mutationsstatus auf β-Catenin im Wnt-Signalweg
............................................................................................................ 119
4.7 Cyclin D1 als Zielgen von β-Catenin .............................................. 120
4.8 Der Einfluss der Mutation auf das DFS ......................................... 121
4.9 Der Einfluss des Mutationsstatus auf die Tumorgröße .................. 122
4.10 Cyclin D1 und MIB-1 als negative prädiktive Marker ................... 122
4.11 Die Expression von β-Catenin in Zusammenhang mit dem DFS . 123
4.12 Ausblick ....................................................................................... 124
Literaturverzeichnis .................................................................................... 125
Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 143
Zusammenfassung
Desmoid-Tumore (DTs), auch aggressive Fibromatose genannt, sind
semimaligne Neoplasien, die niemals metastasieren jedoch lokal aggressiv
wachsen und häufig rezidivieren. Sie entstehen aus Fibroblasten des
Bindegewebes der Muskeln, der Faszien, oder des Omentums. DTs treten
syndromal bei Familiärer Adenomatöser Polyposis Coli (FAP), oder
sporadisch auf. Es ist bekannt, dass in sporadischen DTs vermehrt
Mutationen im Exon 3 des CTNNB1-Gens auftreten. Dieses Gen kodiert für
β-Catenin, ein Schlüsselmolekül des Wnt-Signalweges. In dieser Studie
wurde ein Fokus auf sporadische DTs gelegt.
Wir haben es uns als Ziel gesetzt, DTs in Bezug auf epidemiologische
Eigenschaften, deren Mutationsstatus im CTNNB1-Gen und dessen nukleäre
Akkumulation zu erforschen. Im Verlauf war von Interesse, wie sich die
Expressionsmuster anderer Proteine, die zum Teil auch Bestandteil des WntSignalweges sind, im Vergleich mit dem Mutationsstatus und den klinischpathologischen Eigenschaften verhalten.
Das Patientenkollektiv bestand aus 56 Fällen von 40 Patienten (3-81 Jahre).
Die DNA wurde aus Formalin-fixiertem in Paraffin eingebettetem (FFPE)
Gewebe
extrahiert
und
mittels
Polymerase-Ketten-Reaktion
(PCR)
amplifiziert. Zur Ermittlung des Mutationsstatus an Codon 41 und 45 wurde
die Methode nach Sanger und die Pyro-Sequenzierung genutzt. Mit Hilfe von
Tissue Micro Arrays (TMAs) wurde die Immunhistochemie für β-Catenin,
Cyclin
D1,
Mindbomb-1
(MIB-1),
Östrogen-Rezeptor
α
(ERα)
und
Progesteron-Rezeptor (PR) durchgeführt.
Bei 18 (32,1 %) der untersuchten Fälle, davon zwei mit der Diagnose FAP,
handelte es sich um Wildtyp-Tumore (Wt). In 33 (59 %) Fällen konnte eine
Mutation des Exons 3 des CTNNB1-Gens nachgewiesen werden. Davon
handelte es sich in 17 (30,4 %) Fällen um eine Mutation in Codon 41, in 15
(26,8 %) Fällen um eine Mutation im Codon 45 und in einem (1,8 %) Fall um
eine Doppelmutation sowohl in Codon 41 als auch in 45. Alle untersuchten
Fälle exprimierten β-Catenin, Cyclin D1 und MIB-1 in unterschiedlichem
1
Maße. ERα konnte in 15 (26,8 %) von 53 auswertbaren Fällen nachgewiesen
werden. PR war in allen Fällen negativ.
Wir stellten fest, dass Frauen im fertilen Lebensalter signifikant öfter an
einem DT erkranken als Männer aller Altersgruppen (p=0,01). Passend zu
dieser Beobachtung konnte ERα ausschließlich in Patienten der juvenilen
und fertilen Altersgruppe nachgewiesen werden (p=0,048). Betrachtet man
den Mutationsstatus im Vergleich mit der Immunhistochemie für β-Catenin,
so ist eine Tendenz zu einer höheren β-Catenin-Expression in mutierten
Tumoren erkennbar (p=0,07). Im Gegensatz dazu zeigte Cyclin D1 eine
tendenziell höhere Expression in Wt-Tumoren (p=0,051). Keiner der WtTumore exprimierte β-Catenin im Nukleus, während 81,8 % der mutierten
Fälle β-Catenin entweder nur im Nukleus, oder gleichsam nukleär wie
zytosolisch exprimierten (p=0,005). Die nukleäre Expression von β- Catenin
konnte als negativer prädiktiver Faktor für das tumorfreie Überleben (DFS)
ermittelt werden (p=0,048). Als weitere negative prädiktive Faktoren für das
DFS konnten erhöhte Level von Cyclin D1 und MIB-1 festgestellt werden
(p=0,051 und p=0,013).
Die Entstehung von DTs könnte von Hormonen beeinflusst sein. DTs mit
verschiedenen
β-Catenin-Mutationen
und
Wt-Status
sind
durch
unterschiedliche Aktivierungsprofile des Wnt-Signalweges gekennzeichnet.
Die Mutationsanalyse von β-Catenin sowie die Immunhistochemie für βCatenin, Cyclin D1 und MIB-1 könnten in Zukunft zu einem nützlichen
Hilfsmittel in der Vorhersage des DFS in DTs werden.
2
Abstract
Desmoid-Tumors
(DTs),
also
called
aggressive
fibromatosis,
are
intermediate neoplasms which do not metastasize but grow locally
aggressive and recur frequently. They develop from fibroblasts of the
connective tissue of the muscles, fascia, ligaments, or the omentum. DTs
occur syndromally in Familial Adenomatous Polyposis (FAP), or sporadically.
It is known that mutations of the exon 3 of the β-Catenin-gene (CTNNB1gene), a key-molecule of the Wnt-signaling pathway, are increasingly
detected in sporadic DTs. This study focused on sporadic DTs.
Our aim was to evaluate, how DTs behave regarding to epidemiological data,
if there was a correlation between the different mutations of the CTNNB1gene and its nuclear accumulation. The more we wanted to know how other
proteins, partly, also members of the Wnt-signaling-pathway; are expressed
in DTs and how their expression-profiles correlate with the mutations and the
clinico-pathological features.
The cohort consisted of 56 specimens of 40 patients (age 3-81). DNA was
extracted from formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissue and amplified
by polymerase chain reaction (PCR). Mutation status of ß-catenin codons 41
and 45 was evaluated by direct Sanger-Sequencing and Pyro-Sequencing.
Tissue
Micro
Arrays
(TMAs)
were
constructed,
and
stained
immunohistochemically for β-catenin, cyclin D1, mindbomb-1 (MIB-1),
estrogen receptor α (ERα) and progesterone receptor (PR).
18 cases (32.1 %) were of wildttype-status (Wt), including 2 cases in the
clinical setting of FAP. 33 cases (59%) harbored mutations of β-catenin,
including 17 cases (30.4%) with a mutation at codon 41, 15 cases (26.8%)
with a mutation at codon 45 and one case (1.8%) with a double mutation at
codon 41 and 45 of the CTNNB1-gene. All examined cases expressed βCatenin, Cyclin D1 and MIB-1 in varying intensity. ERα was expressed in 15
(26.8 %) of 53 valuable cases. PR was negative in all cases.
We observed that fertile woman are significantly more often affected by a DT
than men at all ages (p=0.01). Fitting this result, ERα was only expressed in
patients in the juvenile and fertile age group (p=0.048). Watching the
3
mutations in comparison with the data of the immunohistochemistry there is a
trend to a higher β-catenin expression in mutated tumors than in Wt-tumors
(p=0.07). In contrast, Cyclin D1 showed a tendency to a higher expression in
Wt-samples (p=0.051). None of the Wt-tumors expressed β-Catenin in the
nucleus, while 81.8% of the mutated samples showed it in the nucleus as
well as the cytosol (p=0.005). The nuclear expression of β-Catenin could be
ascertained as a negative predictive factor for the disease free survival (DFS)
(p=0.048). The DFS was also negatively affected by a higher intracellular
level of Cyclin D1 and MIB-1 (p=0.051 and p=0.013).
The genesis of DTs may be hormone-dependent. DTs with different ßcatenin mutations and Wt-status are characterized by distinct activation
profiles of the Wnt-signaling pathway. Mutation analysis of the CTNNB1gene, as well as the immunohistochemistry for β-Catenin, MIB-1 and Cyclin
D1 might emerge as a valuable diagnostic tool for prediction of local
recurrence in DTs in the future.
4
1. Einleitung
1.1 Aggressive Fibromatose (Desmoid-Tumor)
1.1.1. Einführung
Fibromatosen sind monoklonale Proliferationen aus Fibroblasten in Muskeln,
Sehnen und Ligamenten (Li et al.1996, Alman et al. 1997, Lucas et al. 1997).
Sie werden eingeteilt in oberflächliche und tiefe Fibromatosen. Die
aggressive Fibromatose, auch Desmoid-Tumor (DT) genannt gehört zu den
tiefen Fibromatosen, die an Hand Ihrer Lokalisation in abdominelle,
intraabdominelle und extraabdominelle DTs eingeteilt werden. Zugehörige
aller
Gruppen
weisen
ähnliche
klinische,
morphologische,
immunhistochemische und molekulargenetische Eigenschaften auf, grenzen
sich jedoch durch spezifische Merkmale voneinander ab (Weiss und
Goldblum. 2008).
Es handelt sich um semimaligne Bindegewebsneoplasien mesenchymalen
Ursprungs, welche nicht metastasieren, jedoch lokal aggressiv wachsen und
häufig rezidivieren (Mitchell et al. 1998, Colleen et al. 2010, Lips et al. 2009).
Sie entstehen aus Fibroblasten des Bindegewebes der Muskeln, oder deren
bedeckender
Faszie,
sowie
des
Mesenteriums,
Omentums
und
intraabdomineller Ligamente (Weiss und Goldblum 2008). DTs treten
sporadisch, oder syndromal im Zusammenhang mit Familiärer adenomatöser
Polyposis Coli (FAP) als Gardner-Syndrom auf.
Als Proteine des Wnt-Signalweges stellen Adenomatosis Poliposis Coli
(APC) und β-Catenin Schlüsselproteine in der Entstehung der DTs dar
(Tejpar et al1999, Sinha et al. 2011). In der Routinediagnostik dient die
Bestimmung von β-Catenin mittels Immunhistochemie als wichtiger Marker
zur Diagnose der Tumoren. In dieser Arbeit wurde ein Augenmerk auf die
sporadischen DTs gelegt.
Johannes Müller verwendete 1938 erstmals die Bezeichnung „Desmoid“ als
Beschreibung für die „Fasergeschwulst“. Es stammt von dem griechischen
Wort „desmos“ ab und heißt übersetzt band-, oder sehnenähnlich (Müller
1838, Escobar et al. 2011).
5
1.1.2 Epidemiologie
Obwohl DTs 85% der tiefen Fibromatosen ausmachen, sind sie insgesamt
sehr selten (Katenkamp. 2008). Sie stellen nur 0,3% aller Neoplasien und nur
3% der Bindegewebstumoren dar. Die geschätzte Inzidenz liegt bei 2-4
Erstdiagnosen pro 1 Million Menschen pro Jahr (Escobar et al. 2011). Dies
konnte in einer über zehn Jahre geführten Populationsstudie der Niederlande
mit einer Neuerkrankungsrate von 3,4 pro eine Million Einwohner bestätigt
werden. Von den 519 diagnostizierten DTs wurde bei 39 (7,5%) Patienten
zusätzlich die Diagnose einer FAP gestellt (Nieuwenhuis et al. 2011). DTs
können in jedem Alter auftreten, wobei das mittlere Erkrankungsalter
zwischen dem 25. und 35. Lebensjahr liegt und Frauen häufiger betroffen
sind als Männer (Weiss und Goldblum 2008, Hansmann et al. 2004). An FAP
erkrankte Patienten haben im Vergleich zur Gesamtbevölkerung eine 852fach erhöhte Wahrscheinlichkeit an einem DT zu erkranken (Belchetz et al.
1996, Righettie et al. 2011).
1.1.3 Lokalisation
DTs können auf Grund Ihrer Entstehung aus Fibroblasten des Bindegewebes
an nahezu jeder Körperstelle entstehen (Biermann 2000). Sie werden
klinisch-pathologisch
an
Hand
Ihrer
Lokalisation
in
abdominelle,
intraabdominelle (bestehend aus mesenterialen und pelvischen DTs) und
extraabdominelle DTs eingeteilt. Die abdominellen Tumoren machen in etwa
30-40% der DTs aus und wachsen an der Bauchwand, während
intraabdominelle Tumore am Mesenterium, oder im kleinen Becken lokalisiert
sind. Weniger als 10% aller DTs wachsen intraabdominell, wobei hier eine
Unterscheidung zwischen sporadischen und mit FAP-assoziierten Tumoren
zu treffen ist: Nur 5% der sporadischen DTs sind intraabdominell lokalisiert,
aber 80% der mit FAP assoziierten DTs entstammen dem Abdomen. Mehr
als 50% aller DTs wachsen extraabdominell (Miettinen 2010, Kasper et al.
2011). Am häufigsten treten diese im Bereich der Schultern (22,1%), des
Brustkorbs und Rückens (17,2%), der Hüfte (12,5%), sowie im Kopf und
Halsbereich auf (9,5%) (Weiss und Goldblum 2008).
6
1.1.4 Klinisches Bild
DTs können im Zusammenhang mit FAP als sogenanntes Gardner-Syndrom,
oder sporadisch auftreten.
1.1.4.1 Gardner-Syndrom
Tritt ein DT, ein Osteom, oder Epidermoid-Zysten im Zusammenhang mit
Familiärer Adenomatöser Polyposis Coli (FAP) auf, so spricht man von
einem Gardner-Syndrom (Gardner und Richards 1953). Die FAP beruht auf
einer autosomal dominant vererbten Mutation des APC-Gens, welche zu
einer vermehrten Proliferation der Kolonschleimhaut führt (Groden et al.
1991, Kinzler et al. 1991). An FAP erkrankte Patienten zeigen einen
Massenbefall des Kolons mit mehr als 100 Polypen (Bodmer et al. 1987). Da
es sich um eine obligate Präkanzerose handelt, entstehen ca. 1 % aller
kolorektalen Karzinome auf dem Boden einer FAP (Righettie et al. 2011). Zu
den häufigen extraintestinalen Manifestationen gehören die kongenitale
Hypertrophie des retinalen Pigmentepithels (70-80%) und DTs (15%)
(Katenkamp 2008). Die mit FAP-assoziierten DTs wachsen zumeist
intraabdominell und verhalten sich klinisch identisch wie sporadisch
aufgetretene Tumore.
1.1.4.2 Sporadische Desmoid-Tumore
DTs unterscheiden sich je nach Lokalisation in Ihrem klinischen Verhalten,
haben jedoch auch Eigenschaften, die für nahezu alle Tumoren gleich sind.
Es handelt sich um eine semimaligne Neoplasie, die niemals metastasiert,
jedoch häufig rezidiviert und lokal aggressiv wächst. In der Regel führt dieser
Tumor nicht zum Tod, beachtet in seinem Wachstum jedoch die
Strukturgrenzen umliegender Organe und Gewebe nicht, infiltriert in diese
und zerstört sie. Auf Grund dessen sind einzelne Fälle mit tödlichem
Ausgang beschrieben, gerade wenn es sich bei den destruierten Geweben
um lebensnotwendige Organe handelt (Mitchell et al. 1998, Colleen et al..
2010, Lips et al. 2009).
Die meisten Patienten mit einem extraabdominellen DT stellen sich mit einer
tief gelegenen, soliden, schlecht abgrenzbaren Veränderung vor, die
langsam wächst und nur geringe Schmerzen verursacht. Teilweise zeigen
7
sich
abhängig
betroffenen
von
der
Muskels,
Nervenkompression,
wie
Lokalisation
sowie
Funktionseinschränkungen
neurologische
Taubheit,
Kribbeln
Erscheinungen
und
stumpfer,
des
bei
oder
einschießender Schmerz (Weiss und Goldblum 2008, Sri-Ram et al. 2012).
Abdominelle DTs entstammen in der Regel der Muskulatur des Musculus
rectus abdominis, oder der Musculi Obliquus abdomini und treten vermehrt
bei jungen Frauen im gebärfähigen Alter auf. Sie wachsen vermehrt an
Körperstellen, an denen sich durch Traumata, wie chirurgische Eingriffe,
Kaiserschnitte, oder Unfälle, Narben bildeten (Häyry et al. 1982, Reitamo et
al. 1982, Reitamo et al. 1986). Intraabdominelle DTs treten vermehrt bei
Patienten mit FAP auf und können weiter in pelvische und vom Mesenterium
ausgehende DTs eingeteilt werden. Sie verursachen selten Schmerzen und
erreichen dadurch häufig eine große Tumormasse. Das unbemerkte
Tumorwachstum kann zu verschiedenen Komplikationen wie Obstipation,
Blutungen, oder Perforationen führen (Miettinen 2010).
1.1.5 Pathologie
DTs können histologisch nicht in Gruppen eingeteilt werden. Ebenso kann
von der Histologie kein Rückschluss auf die Tumorherkunft im Körper
gezogen werden. Sie bestehen aus ineinander übergreifende Bündel von
Spindelzellen mit unterschiedlich starker Expression von Kollagen, welche in
die umliegenden Strukturen infiltrieren (Mitchell G et al. 1998, Alman et al.
1997, Li et al. 1996, Lucas et al. 1997). Die Mitosezahl ist gering und
Nekrosen sind selten (Shields et al. 2001). Sie zeigen im Vergleich zu
gesundem Gewebe eine erhöhte nukleäre Expressivität für β-Catenin. Die
immunhistochemische Färbung für β-Catenin ist in der Diagnostik üblich,
stellt jedoch keinen spezifischen Marker dar, denn β-Catenin wird ebenso
vermehrt in oberflächlichen Fibromatosen, low-grade myofibroblastischen
Sarkomen, sinonasalen Hämangioperizytomen und Solitär fibrösen Tumoren
exprimiert (Carlson und Fletcher 2007, Alman et al. 1997, Haller et al. 2014).
Zudem sind DTs gewöhnlich stark positiv für Vimentin und zeigen eine
variable Aktivität für das Aktin der glatten Muskelzelle, Cyclooxygenase-2
(COX-2), Steroidrezeptoren und c-Kit (Carlson und Fletcher 2007, Signoroni
et al. 2007, Deyrup et al. 2006, Cho et al. 2012).
8
a
b
Abbildung 1: a) HE-Färbung eines sporadischen DT mit spindelförmig
angeordneten Zellen und Kollagen b) Immunhistochemische Färbung eines
DTs mittels Antikörper für β-Catenin
DTs sind derbe bindegewebsartige Knoten, die im Mittel zum Zeitpunkt der
Diagnose in etwa 5 cm groß sind. In Einzelfällen können sie einen
Durchmesser von mehr als 20 cm erreichen (Miettinen 2010). In der Regel
treten Sie solitär auf, es können jedoch auch mehrere DTs an einer
Lokalisation auftreten. Metastasen sind nicht beschrieben (Escobar et al.
2011, Shinagare et al. 2011, Mankin et al. 2010).
Abbildung 2: Makroskopisches Bild eines DT
1.1.6 Ätiologie
Die Ätiologie von DTs ist nur lückenhaft erforscht. Man geht aktuell von einer
multifaktoriellen Genese aus, die durch hormonelle, physikalische (Trauma,
Operation) und genetische Faktoren bedingt ist.
Die Beobachtung, dass DTs, v.a. abdominelle Tumore, in Zusammenhang
mit Schwangerschaft, oder unter der Einnahme von Kontrazeptiva auftreten,
9
führt zu der Vermutung, dass Sie durch Hormone beeinflusst werden (Clark
und Phillips 1996). Zudem haben Frauen ein etwa 3,5-Fach erhöhtes Risiko
an einem DT zu erkranken als Männer (Hansmann et al. 2004). Nachfolgend
konnten in verschiedenen Studien die Steroidhormonrezeptoren ÖstrogenRezeptor α (ERα) und β (ERβ) in einem Großteil der untersuchten DTs
nachgewiesen werden (Deyrup et al. 2006, Picariello et al. 2006).
68-86% der intraabdominellen und abdominellen DTs bei Gardner-Syndrom
entstehen nach Abdominal-Chirurgie (Gurbuz et al. 1994, Jones et al. 1986).
Nur 32% der sporadischen DTs der Bauchwand entstehen nach einem
Trauma und wachsen häufig aus Narbengewebe (Häyry et al 1982, Clark
Phillips 1996). Dies veranlasste uns dazu die Patienten bezüglich
vorhergehender Operationen und anderer Traumata am Entstehungsort zu
befragen.
Eine besondere Rolle in der Entstehung von DTs wird Mutationen und
chromosomalen Veränderungen, welche die Funktionen der Proteine des
Wnt-Signalweges beeinflussen, zugeschrieben. So führt eine Mutation im
APC-Gen bei FAP, oder eine Mutation im CTNNB1-Gen bei sporadischen
Tumoren zu einem erhöhten Level an β-Catenin in der Zelle und nachfolgend
zu einer größeren Wahrscheinlichkeit an einem DT zu erkranken (Belchetz et
al 1996, Righettie et al. 2011, Tejpar et al. 1999, Alman et al. 1997). Le
Guellec et al. konnten Mutationen des CTNNB1-Gens ausschließlich in DTs,
jedoch in keiner der wichtigen Differentialdiagnosen nachweisen (Le Guellec
et al. 2012). Haller et al. gelang es mit Hilfe einer Genom-Sequenzierung
identische
Mutationen
im
CTNNB1-Gen
in
Sinonasalen
Hämangioperyzytomen nachzuweisen (Haller et al. 2014).
Auf chromosomaler Ebene konnten als widerkehrende Veränderungen ein
Verlust von Chromosom 6, oder Chromosom 5, sowie ein zusätzliches
Chromosom 8, oder 20 nachgewiesen werden (Salas et al. 2010). Weitere
Studien beschreiben einen Verlust des langen Arms des Chromosoms 5q,
sowie Veränderungen weiterer Abschnitte der Chromosomen 1, 5, 9, 13 und
20 (Bridge et al. 1992, Dangel et al. 1994, Larramendy et al.1998).
10
1.1.7 Klassifikation
DTs werden nach Allen an Hand ihrer Lokalisation in extraabdominelle,
abdominelle,
intraabdominelle,
multiple
und
bei
Gardner
Syndrom
auftretende DTs eingeteilt. Diese Einteilung wurde getroffen, da die Tumore
histologisch nicht ihrer Lokalisation zugeordnet werden können, aber deren
Entstehung und Wachstum vermutlich durch unterschiedliche Faktoren
begünstig wird (Allen 1977, Kruse et al. 2010).
Eine weitere Unterteilung erfolgt an Hand des Alters und Geschlechts der
Erkrankten. Reitamo et al. konnten, wie in Tabelle 1 dargestellt in einer
großen finnischen Populationsstudie vier große Altersgruppen definieren
(Reitamo et al. 1982).
Altersgruppe
Alter in
Jahren
Vorzugsweise
Lokalisation
Juvenil
Fertil
Menopausal
< 15
15-.45
45-60
Extraabdominell
Abdominell
Abdominell
Senescent
> 60
Geschlechtsprädominanz
überwiegend weiblich
weiblich
Keine
geschlechtsspezifische
Verteilung
Abdominell
und Keine
Extraabdominell mit Geschlechtsspezifische
gleicher Verteilung
Verteilung
Tabelle 1: Altersgruppen nach Reitamo et al.
1.1.8 Prognose
Obwohl inzwischen viele Verfahren zur Diagnostik von DTs etabliert sind, ist
es schwer an Hand des aktuellen wissenschaftlichen Standes deren
Wachstums- und Rezidivverhalten einzuschätzen. Unabhängig von den
Eigenschaften des jeweiligen Tumors und der Behandlung werden
Rezidivraten von 20-60% beschrieben (Rock et al. 1984, Merchant et al.
1999,
Spear
et
al.
1998,
Gronchi
et
al.
2003).
Eine
offizielle
Risikostratifizierung gibt es nicht.
Die Studien beschreiben vor Allem klinisch-pathologische Daten im
Zusammenhang mit einem erhöhten Rezidivrisiko. Während in aktuellen
Studien von Bertani et al. und Salas et al beschrieben wird, dass eine
11
Tumorgröße von mehr als 10 cm ein erhöhtes Risiko für ein Rezidiv darstellt,
wurde dies von anderen Studien wiederlegt (Bertani et al. 2012, Mullen et al.
2012, Salas et al. 2011). Widersprüchliche Daten liegen ebenso zum
Erkrankungsalter im Zusammenhang mit dem Rezidivrisiko vor (Ballo et al.
1999, Mullen et al. 2012). Eine sehr kontrovers diskutierte Theorie ist der
Einfluss einer R0-Situation auf die Prognose. Mehrere Studien beschreiben
einen positiven Einfluss auf das Wachstumsverhalten bei tumorfreien
Rändern, der in anderen Studien nicht belegt werden konnte (Bonvalot et al.
2008, Spear et al. 1998, Posner et al. 1989, Salas et al. 2011, Merchant et al.
1999). Nur die Tumorlokalisation an den Extremitäten und die Assoziation mit
FAP wurden von allen Studien gleichermaßen als negative prädiktive
Faktoren bestätigt (Mullen et al. 2012, Bertani et al. 2012, Salas et al. 2011,
Bonvalot et al. 2008, Escobar et al. 2011).
Neuere Studien lassen einen Zusammenhang zwischen der Mutation, der βCatenin-Expression und dem Rezidivverhalten vermuten (Dômont et al.
2010, Lazar et al. 2008). Besonders Patienten mit einer Mutation an Codon
45 des CTNNB1-Gens und einer geringen β-Catenin-Expression sollen ein
erhöhtes Risiko für ein Rezidiv haben (Colombo et al. 2013, Lazar et al.
2008).
1.1.9 Therapie
Auf Grund des nicht vorhersagbaren Verhaltens von DTs wird die Therapie
seit Jahren kontrovers diskutiert. Die Standardtherapie ist nach wie vor die
chirurgische Exzision mit tumorfreien Rändern. Doch zum einen stellen das
infiltrative Wachstum und die Lage des Tumors häufig Probleme bei der
Exzision dar und zum anderen ist die vollständige Resektion keine Garantie
für ein rezidivfreies Überleben (Escobar et al. 2011, Mankin et al. 2010). Da
in einzelnen Fällen eine spontane Rückbildung der DTs beschrieben wurde,
stellt die Therapie des watchfull-waiting in nicht-progressiven DTs eine
weitere Therapieoption dar (Fiore et al. 2009, Lewis et al. 1999).
Eine Alternative zur chirurgischen Entfernung bei inoperablen Tumoren stellt
die Radiotherapie dar. Laut einer Studie von Gluck et al. entstehen keine
Therapievorteile bei operativer Entfernung im Vergleich zur Radiotherapie,
12
oder Kombination beider Verfahren (Gluck et al. 2011). Die Rolle einer
adjuvanten Radiotherapie ist noch nicht vollständig geklärt. Laut Leitlinien
sollte eine postoperative Bestrahlung mit 50-70 Gray über 5-7 Wochen bei
großen Tumoren oder tumorpositiven Exzisionsrändern in Erwägung
gezogen werden, zeigt jedoch keine Vorteile bei erreichtem R0-Status
(Escobar et al. 2011, Goy et al. 1997, Ballo et al. 1998).
Bei schnellem Tumorwachstum, oder starker Symptomatik kann eine
Chemotherapie in Erwägung gezogen werden. Es wurden verschiedene
Kombinationen aus Doxorubicin, liposomalem Doxorubicin, Ifosfamid und
Methotrexat mit Vinca-Alkaloid angewendet. Die Ergebnisse reichten von
partiellem Ansprechen des Tumors mit einer Stabilisierung bis hin zum
vollständigen Regress (Patel und Benjamin 2006, Gega et al. 2006).
Weitere Therapieansätze, wie die Behandlung mit Tamoxifen/Raloxifen,
Imatinib
und
Non-steroidalen
anti-inflammatorischen
Medikamenten
(NSAIDs) wurden in den letzten Jahren erforscht. Tamoxifen und Raloxifen
sind selektive Östrogen-Rezeptor-Modulatoren, die das Tumorwachstum
durch Bindung an den Östrogenrezeptor hemmen (Picariello et al. 2004,
Bocale et al. 2011). Das Ansprechen auf die Östrogen-Rezeptor-Modulatoren
steht jedoch in keinem Zusammenhang mit der Expression der Rezeptoren
(Benson und Baum 1993). Mifepriston, ein Progesteron-Rezeptor-Modulator
wird ebenso als Therapie-Option in Erwägung gezogen (Halevy et al. 2010).
Imatinib ist ein selektiver Tyrosin-Kinase Inhibitor mit hemmender Wirkung an
verschiedenen Tyrosin-Kinasen, wie dem Plateled derived Growth Factor
(PDGF) und c-Kit. Der genaue Wirkmechanismus bei DTs ist unklar. Es wird
ein Zusammenhang mit Mutationen im Exon 10 des KIT-Gens vermutet
(Heinrich et al. 2006, Dufresne et al. 2010). Signoroni et al. konnten in 100%
der untersuchten Fälle COX-2 nachweisen (Signoroni et al. 2007). Diese
Forschungsergebnisse decken sich mit einigen Beschreibungen über einen
Regress
unter
der
Behandlung
Langzeitstudien
mit
mehreren
mit
Fällen
NSAIDs.
zur
Hier
besseren
stehen
jedoch
Bewertung
der
Wirksamkeit aus (Teshima et al. 2012, Nishida et al. 2010, Tanaka et al.
2008).
13
1.2 Das Gen CTNNB1
In bis zu 87% der sporadischen DTs kann eine somatische Mutation im
CTNNB1-Gen, das für das Protein β-Catenin kodiert nachgewiesen werden
(Amary et al. 2007, Tejpar et al. 1999, Lazar et al. 2008). Das Gen CTNNB1,
in Drosophila auch Armadillo genannt, besteht aus 16 Exons und ist auf dem
kurzen Arm des Chromosom 3 lokalisiert (Kraus et al. 1994, Nollet et al.
1996).
1.2.1.Das Protein β-Catenin
β-Catenin gehört zu der Proteingruppe der Catenine, bestehend aus αCatenin, β-Catenin und Plakoglobin (γ-Catenin). Die Primärstruktur von βCatenin besteht aus einer Amino-terminalen Domäne mit 149 Aminosäuren.
Darauf folgt eine zentrale Domäne mit 515 Aminosäuren, zusammengesetzt
aus 12 sogenannten Armadillo (ARM) repeats. Das C-terminale Ende wird
von weiteren 108 Aminosäuren gebildet (Huber und Weis 2001). Die zentrale
ARM-repeat-Domäne dient als Bindungsstelle für die Cadherine, Axin, den
Tumor-Supressor
APC
und
die
Transkriptionsfaktoren
der
T-Cell-
N-terminal
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
ARM
transcription factor (TCF) Familie (Hülsken et al. 1994, Pai et al. 1996).
C-terminal
Zentrale Domäne mit 12 ARM-Repeats
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Primärstruktur von β-Catenin
1.2.3 Die Funktion von β-Catenin
Die Catenine spielen zum einen in Interaktion mit E-Cadherin und Aktin eine
wichtige Rolle bei der Zell-Zell Adhärenz, zum anderen hat β-Catenin eine
wichtige Funktion im Wnt-Signalweg (Ozawa et al. 1990, Cowin 1994,
Rubinfeld et al. 1993, Su et al. 1993). Dem Wnt-Signalweg werden
Schlüsselfunktionen
in
der
embryonalen
Entwicklung
und
in
der
Regeneration von Geweben im Erwachsenenalter zu Teil. Mutationen und
Fehlregulierung von Proteinen des Wnt-Signalweges können Krankheiten,
vor Allem Neoplasien verursachen (Klaus und Birchmeier 2008). Eine
14
zentrale Rolle spielt dabei die β-Catenin-Stabilität, welche maßgeblich durch
Mutationen im CTNNB1-Gen beeinflusst wird (Munemitsu et al. 1995, van
Leeuwen et al. 1994). Die folgenden Beschreibungen sind auf wichtige
Interaktionspartner beschränkt.
Die 19 verschiedenen Wnt-Proteine, binden an die sogenannten FrizzledProteine, bestehend aus sieben transmembranären Domänen. Diese
fungieren zusammen mit den Co-Rezeptoren Low Density Lipoprotein
Rezeptor related Protein 5 (LRP5) und Low Density Lipoprotein-Rezeptor
related Protein 6 (LRP6) als Rezeptoren in der Plasmamembran zur
Aktivierung und Deaktivierung des Wnt-Signalweges (Wang et al. 1996,
Pinson et al. 2000, Tamai et al. 2000). Es sind zahlreiche Inhibitoren der
Interaktion zwischen Wnt und dem Frizzled-Rezeptor bekannt, wie zum
Beispiel die Frizzled- related Proteins (SFRPs) und die Dickkopfs (DKK)
(Finch et al. 1997, Glinka et al. 1998).
In Abwesenheit eines Wnt-Liganden wird zytoplasmatisches β-Catenin an
einen Abbau-Komplex, bestehend aus APC und Axin gebunden (Behrens et
al. 1998, Salic et al. 2000). In diesem Komplex gebunden kann β-Catenin
zuerst durch die Serin-Kinase Casein-Kinase 1α (CK1α) an Serin 45
phophoryliert und nachfolgend durch die Glykogen Synthase Kinase 3 β
(GSK3β) an Threonin 41, Serin 37 und Serin 33 am N-terminalen Ende
phosphoryliert werden (Yost et al. 1996, Liu et al. 2002, Amit et al. 2002,
Peifer et al. 1994). Die Phosphorylierung dient als Markierung für die
Ubiquitinylierung. Das phosphorylierte β-Catenin wird durch β-transducin
repeat-containing Protein (β-Trcp), einer E3 Ubiquitin Ligase erkannt,
ubiquitinyliert und zuletzt dem Abbau im Proteasom zugeführt (Winston et al.
1999, Liu et al. 1999). Demzufolge ist die intrazelluläre Konzentration an βCatenin in Abwesenheit von Wnt-Liganden gering (Siehe Abb. 4 a).
In Anwesenheit eines kanonischen Wnt-Liganden wird LRP5 und LRP6 von
CK1α und GSK3β phophoryliert (Davidson et al. 2005). Darauf folgt eine
Interaktion des Proteins Dishevelled (DSH) mit der intrazellulären Domäne
des Frizzled-Rezeptors (Jung et al. 2013). Dadurch wird eine Kaskade
ausgelöst, die zur Bindung von Aktin in einem Komplex führt. β-Catenin kann
dadurch nicht mehr erkannt und nicht mehr durch Phosphorylierung für den
15
Abbau im Proteasom markiert werden (Behrens et al. 1998, Li et al. 2012).
Vermutlich kommt es zu einer Hemmung der Phosphorylierung durch die
Bindung des GSK3 β Inhibitors Gunalylate Binding Protein (GBP) (Yost et al.
1998). β-Catenin akkumuliert folglich im Zytosol und kann in den Zellkern
translozieren. Im Zellkern wirkt es in Interaktion mit den Molekülen lymphoidenhancing
factor
Transkriptionsfaktor
1
(LEF-1)/T-Cell-transcription
factor
für
bestimmte
unter
Zielgene,
die
(TCF)
1.2.4
als
näher
beschrieben werden (Siehe Abb. 4 b) (Behrens et al. 1996, Molenaar et al.
1996, Aoki et al. 1999).
16
Abbildung 4: a) In Abwesenheit eines Wnt-Liganden wird
zytoplasmatisches β-Catenin an einen Komplex, bestehend aus APC und
Axin gebunden. So kann β-Catenin erkannt, gebunden und zuerst durch
CK1α an S45 phophoryliert und dann durch GSK3β an T41, S37 und S33
phosphoryliert werden. Die Phosphorylierung dient als Markierung für die
Ubiquitinylierung. Das phosphorylierte β-Catenin wird durch β-Trcp (nicht
dargestellt) ubiquitinyliert und zuletzt dem Abbau im Proteasom zugeführt.
Die intrazelluläre Konzentration an β-Catenin ist in Abwesenheit von WntLiganden demnach gering. b) In Anwesenheit eines kanonischen WntLiganden wird LRP5 und LRP6 von CK1α und GSK3β phophoryliert. Darauf
folgt eine Interaktion von DSH mit der intrazellulären Domäne des FrizzledRezeptors. Dadurch wird eine Kaskade ausgelöst, die zur Bindung von Axin
führt. Der gesamte Komplex, der für den Abbau von β-Catenin zuständig ist,
ist über Axin gebunden. β-Catenin kann dadurch nicht mehr erkannt und
nicht mehr durch phosphorylierung für den Abbau im Proteasom markiert
werden. Vermutlich kommt es zu einer Hemmung der Phosphorylierung
durch GBP. β -Catenin akkumuliert im Zytosol und kann in den Zellkern
translozieren und dort in Interaktion mit LEF-1/TCF als Transkriptionsfaktor
dienen.
1.2.4 Zielgene von β-Catenin
β-Catenin wirkt im Zellkern gebunden an die Proteine der LEF-1/TCF Familie
als Transkriptionsfaktor. Als direkte Zielgene mit einer TCF-Bindungsstellle
sind beispielhaft das CCND1 Gen, das E-Cadherin-Gen und VEGF-Gen zu
nennen (Klein und Assoian 2008). Einige Zielgene deren Transkription von βCatenin beeinflusst wird, sind selbst Proteine des Wnt-Signalweges, wie zum
Beispiel
Axin-2,
TCF
und
LEF.
Sie
werden
somit
via
17
Rückkopplungsmechanismen reguliert (Roose et al. 1999, Hovanes et al.
2001, Jho et al. 2002).
1.2.5 Die Rolle von β-Catenin in der Entstehung von sporadischen
DTs
Wie unter 1.1.6 beschrieben kann bei sporadischen DTs in den meisten
Fällen eine Mutation des CTNNB1-Gens identifiziert werden (Alman et al.
1997, Tejpar et al. 1999). Häufig handelt es sich dabei um eine
Punktmutation an Codon 41, oder 45 des Exon 3, die zu einem Austausch
der betroffenen Aminosäure führt. Dies hat fatale Folgen für die Zelle, denn
es
handelt
sich
bei
diesen
Codonen
um
zwei
der
vier
Phosphorylierungsstellen von β-Catenin. Am häufigsten wird durch die
Punktmutationen Threonin an Codon 41 durch Alanin (p.T41A), oder Serin
an Codon 45 durch Phenylalanin (p.S45F), bzw. Prolin (p.S45P) ersetzt
(siehe Tabelle 2) (Colombo et al. 2011, Lazar et al. 2008). Wird mutiertes βCatenin an den Abbau-Komplex gebunden können die spezifischen
Serin/Threonin-Kinasen CK1α und GSK 3β keine Phosphorylierung mehr an
der jeweils veränderten Aminosäure vornehmen (Xu und Kimelman 2007,
Willert und Jones 2006). Folglich kann β-Catenin nicht mehr von β-Trcp
erkannt und für den Abbau im Proteasom vorbereitet werden. β-Catenin
kumuliert und wird vermehrt in den Nukleus eingeschleust. Gebunden an die
Proteine der TCF/LEF-Familie kommt es dort zu einer vermehrten, oder
verminderten Transkription der unter 1.2.4 beschriebenen Zielgene (Behrens
et al. 1996, Aoki et al. 1999, Molenaar et al. 1996).
18
a) Mutation auf DNA-Ebene
Kodierung auf DNA- Veränderung in der Basenabfolge
Ebene
c.121A>G
c.134C>T
ACT ACC ACA
CCT TCT CTG
ACT GCC ACA
CCT TTT CTG
c.133T>C
CCT TCT CTG
CCT CCT CTG
b) Mutation auf Protein-Ebene
Kodierung
auf Veränderung der betroffenen Aminosäure
Protein-Ebene
p.T41A
p.S45F
p.S45P
Tabelle 2: Darstellung der häufigsten Mutationen im Exon 3 des CTNNB1
Gens bei DTs auf DNA- und Protein-Ebene. A) Der Austausch einer Base
durch Punktmutation führt zur Veränderung in der Basenabfolge. B) Diese
Punktmutation führt zum Austausch der jeweiligen Aminosäure. Dabei kommt
es zum Verlust der jeweiligen Hydroxy-Gruppe und demzufolge zum Verlust
der Phosphorylierungsstelle. Ohne eine ausreichende Phosphorylierung
kann β- Catenin nicht mehr für den Abbau im Proteasom markiert und
vorbereitet werden.
1.3 Das β-Catenin Zielgen CCND1
Das Gen CCND1 liegt auf dem Chromosom 11q13. Das Gen hat eine Länge
von ca. 15 Kilobasenpaaren mit 5 Exons und kodiert für das 295
Aminosäuren lange Protein Cyclin D1. Der Aufbau des Gens spricht dafür,
dass es sich dabei um ein sogenanntes „Housekeeping-Gene“ handelt
(Motokura et al. 1991, Motokura und Arnold 1993).
19
1.3.1 Das Protein Cyclin D1
Cyclin D1 gehört zur Gruppe der Cycline vom D-Typ, bestehend aus Cyclin
D1, Cyclin D2 und Cyclin D3. Cycline sind in Ihrer Struktur sehr verschieden.
Sie gleichen sich nur durch eine ca. 100 Aminosäuren lange zentrale Region,
die sogenannte Cyclin-Box (Xiong et al. 1992). Im Gegensatz zu anderen
Cyclinen ist die Progression, Expression und Akkumulation von D-Cyclinen
stark abhängig von extrazellulären mitotischen Reizen. Sie stellen eine Art
mitotische Sensoren dar, die extrazelluläre Signale an den Zell-Zyklus im
Zellkern übermitteln (Kim und Diehl 2009). In Assoziation mit den Cyclinabhänigen Kinasen 4 und 6 (CDK4, CDK6) spielt Cyclin D1 sowohl in der
ersten Gap-1-Phase (G1-Phase) als auch im Übergang von der G1-Phase
zur Synthese-Phase (S-Phase) des Zellzyklus eine wichtige Rolle (Sherr
1993).
N-terminal
Cyclin-Box
C-terminal
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Primärstruktur von Cyclin D1
1.3.2 Die Rolle von Cyclin D1 im Zellzyklus
Das Cyclin D1 Level in der Zelle wird durch verschiedene Mechanismen
reguliert. Die Expression und Akkumulation von Cyclin D1 wird von
mitotischen Wachstumsfaktoren induziert. Ist die Zelle mitotischen Stimuli
ausgesetzt, werden mehrere Rezeptor-Tyrosin-Kinasen aktiviert, die zum
Auslösen sequentieller Signalwege führen (Musgrove 2006). Daraus
resultieren über komplexe Mechanismen eine vermehrte Transkription und
Translation, ein verringerter Abbau von Cyclin D1 und eine verminderte
Ausschleusung von Cyclin D1 aus dem Zellkern (Kim und Diehl 2009, Diehl
et al. 1998). Das vermehrt gebildete Cyclin D1 führt in Verbindung mit CK4
zur Hemmung des Retinoblastom (RB) Proteins. Durch die Hemmung des
RB-Proteins kommt es zur Aktivierung eines Gen-Netzwerkes, das den
Eintritt und die Progression der Synthese-Phase reguliert (Weinberg 1995).
Auf Grund der Rolle im Zellzyklus und somit der vermehrten Expression in
mitotisch aktiven Zellen stellt ein erhöhter Cyclin D1-Gehalt in der Zelle einen
20
Marker für die Proliferation und Prognostik bei verschiedenen Tumoren dar
(Kim und Diehl 2009, Saito et al. 2001).
1.4 Das Gen KI67
Das Gen KI67 kodiert für das Protein KI-67. MKI67 ist auf Chromosom 10
lokalisiert und setzt sich zusammen aus 14 Introns und 15 Exons. Es sind
verschiedene Varianten bekannt, die durch Splicing entstehen: Die beiden
wichtigsten kodieren für zwei Proteine mit einer kalkulierten Masse von 320
und 395 Kilodalton (kDa). Ein 66 Basenpaare langes Epitop in Exon 13 dient
als Bindungsstelle für den MIB 1/KI-67 Antikörper (Schlüter et al. 1993).
1.4.1 Das Protein KI-67
Die Primärstruktur des Proteins besteht aus einer N-terminalen Domäne,
einer zentralen Domäne mit 17 Repeats einer 122 Aminosäuren langen
Sequenz und einer C-terminalen Domäne (Hofmann und Bucher 1995).
Diese ist charakterisiert durch 10 mögliche Zielsequenzen, 8 Konsensusstellen mit der Cyclin-abhängigen Kinase 2 (CDK2) und insgesamt 234
potentiellen Phosphorylierungsstellen für verschiedene Kinasen (Endl und
Gerdes 2000). KI-67 und MIB-1 Antikörper sind gegen das gleiche Epitop
von KI-67 gerichtet. In der klinischen Anwendung wird inzwischen meist der
MIB-1 Antikörper verwendet, da er im Gegensatz zu dem original KI-67
Antikörper auch an Formalin-fixierten in Paraffin eingebetteten (FFPE)
Schnitten verwendet werden kann (Key et al.1993).
Nterminale
Domäne
Cterminale
Domäne
Zentrale Domäne mit 17 Repeats
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Primärstruktur von KI-67,
bestehend aus einer N-terminalen Domäne, einer zentralen Domäne aus 17
Repeats einer 122 Aminosäuren langer Sequenz und einer C-terminalen
Domäne.
21
1.4.2 Die Rolle von KI-67
Die Funktion von KI-67 ist trotz zahlreicher Forschungen noch weitgehend
unbekannt. Man geht davon aus, dass es eine wichtige Rolle im Zell-Zyklus
spielt. Die Expression von KI-67 ist stark von der Proliferation der Zelle
abhängig und kann in allen sich proliferierenden Geweben des Menschen in
allen Phasen des Zellzyklus nachgewiesen werden (Gerdes et al. 1983,
Bullwinkel et al. 2006). Aus diesem Grund hat KI-67 in der Routinediagnostik
als Proliferationsmarker einen hohen Stellenwert erlangt und wurde auch in
unserem Kollektiv als Proliferationsmarker verwendet.
1.5 Die Steroidhormonrezeptoren
Die Steroidhormonrezeptoren sind intrazelluläre Rezeptoren, die für die
Signalweiterleitung der Steroidhormone wie zum Beispiel Östrogen und
Progesteron zuständig sind. Sie werden den Nukleären Hormon Rezeptoren
(NRs) der Gruppe 3 zugeordnet (Committee 1999). Die NRs sind wiederum
Teil einer Superfamilie von Transkriptionsfaktoren, die maßgeblich in ein
breites Spektrum physiologischer Abläufe in der Zelle eingreifen, oder diese
bedingen (Germain et al. 2006). In dieser Arbeit soll ein Augenmerk auf die
Rezeptoren Östrogen Rezeptor α (ER α) und Progesteron Rezeptor gelegt,
werden, da diese immunhostochemisch untersucht wurden.
1.5.1 Die Struktur der Nukleären Hormon Rezeptoren (NRs)
Die Struktur und Funktion aller NRs ist ähnlich und besteht aus fünf bis sechs
verschiedenen Domänen. Die N-terminale A/B Region hat mittels der
Transkriptionsaktivierenden Domänen (AF) eine Transkriptionsregulierende
Funktion, welche Liganden-unabhängig Einfluss auf die Transkription
nehmen kann. Darauf folgt die zentrale C-Region, die DNA-Bindungsdomäne
(DBD). Mit dieser Domäne können NRs mit Hilfe von Zink-Finger-Strukturen
an spezifische DNA-Sequenzen, die sogenannten „Hormone Response
Elements“ (HREs) binden. Die D-Region fungiert vermutlich als ein Gelenk
zwischen der DBD und der darauffolgenden Liganden-Bindungsdomäne
(LBD). Die LBD, oder E-Region vermittelt die Ligandenbindung und
Dimerisierung und hat eine Liganden-abhängige Transaktivierungsfunktion.
22
Zuletzt schließt sich eine variable C-terminale Domäne, die F-Region an, die
nicht in allen NRs nachweisbar ist (siehe Abbildung 7) (Germain et al. 2006).
A/B
C
D
E
F
Nterminale
Domäne
DNA-BindungsDomäne (DBD)
GelenkRegion
Liganden-BindungsDomäne (LBD)
Cterminale
Domäne
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Primärstruktur von NRs,
bestehend aus einer N-terminalen Domäne, einer DBD, einer Gelenkregion
einer LBD und dem C-terminalen
1.5.2 Östrogen-Rezeptoren
Die biologischen Funktionen von Östrogenen, wie z.B. 17β-Estradiol werden
durch zwei verschiedene Rezeptorsubtypen vermittelt: Erα und Erβ. Die
Rezeptoren werden von verschiedenen Genen kodiert, die auf Chromosom
6q15 und Chromosom 14q23 liegen. Beide Rezeptoren sind jedoch auf
Aminosäurelevel sehr ähnlich. So sind ca. 97% der DBD identisch. Da die
LBD von Erα nur zu etwa 60% mit der LBD von Erβ übereinstimmt, haben sie
ein verschiedenes Spektrum an Liganden. Der N-terminus gleicht sich nur zu
24% (Dahlman-Wright et al. 2006).
Bindet
ein
Ligand
an
die
LBD
eines
ER
kommt
es
zur
Konformationsänderung des Rezeptors, die über verschiedene Ereignisse zu
Veränderungen in der Transkription der Zielgene von ER führt. Der genaue
Ablauf
und
die
Reihenfolge
sind
nicht
vollständig
erforscht.
Die
Transkriptionsregulation durch ERs ist streng kontrolliert von einer Reihe von
Interaktionspartnern, wie die Chaperon-Proteine, die zur Familie der HeatShock Protein (HSP) gehören. Insgesamt haben ERs viele strukturelle und
regulatorische Gemeinsamkeiten, der größte Unterschied der beiden
Rezeptoren liegt jedoch in Ihrer Funktion: Während Erα die Zellproliferation
fördert, wird diese durch Erβ gehemmt (Powell et al. 2010).
Die Untersuchung mittels Immunhistochemie für die ERs in DTs in zwei
Studien ergab, dass bis zu 100% der DTs für Erβ, jedoch keine Fälle für Erα
positiv waren (Deyrup et al.2006, Leithner et al. 2005). Dies veranlasste
Picarello et al. zu weiteren Untersuchungen mit sensibleren Methoden: Erβ
23
konnte ebenso in 100% der Tumoren nachgewiesen werden und auch Erα
wurde in allen außer einem Fall nachgewiesen (Picariello et al. 2006). Da
Erβ in nahezu allen Studien diesbezüglich in allen DTs exprimiert war, haben
wir uns dazu entschieden nur Erα mittels Immunhistochemie zu bestimmen.
1.5.3 Progesteron-Rezeptor
Der Progesteron-Rezeptor (PR) dient der Vermittlung der biologischen
Wirkung des Hormons Progesteron in der Zelle. Das PGR-Gen auf
Chromosom 11q22 kodiert für beide Isoformen des PR: PR-A und PR-B (Law
et al. 1987). In Abwesenheit von Progesteron ist der PR an einen Komplex
mit HSPs gebunden und dadurch inaktiv. Bindet Progesteron an den
Rezeptor, so kommt es zu einer Konformationsänderung, Phosphorylierung,
Dissoziation von HSPs und Dimerisierung. Dadurch kann der LigandenRezeptor-Komplex in den Nukleus translozieren, dort an die DNA-binden und
die Transkription der Zielgene regulieren (Wardell et al. 2002). Nach
aktuellem Stand der Wissenschaften geht man von weiteren nichtgenomischen Funktionen des PRs aus. Der genaue Ablauf und die Funktion
sind weitestgehend unerforscht (Gadkar-Sable et al. 2005).
Es gibt nur wenige Studien mit kontroversen Ergebnissen zur Expression von
PR in DTs. Während zwei Studien PR mittels Immunhistochemie nicht
detektieren konnten, wurde der Rezeptor in einer Studie von Ishizuka et al. in
etwa 25% der Fälle nachgewiesen (Santos et al. 2010, Leithner et al. 2005,
Ishizuka
et
al.
2006).
Die
unklare
Datenlage
veranlasste
uns
immunhistochemische Untersuchungen PR betreffend durchzuführen.
24
1.6 Fragestellung
In Anbetracht der aktuellen Forschungslage wurde folgende Fragestellung
behandelt:
1. Wie sind DTs über die Altersgruppen verteilt und wie ist das
Wachstumsmuster von DTs?
2. Welche Risikofaktoren können das Wachstum von DTs begünstigen?
3. Wie ist das Verteilungsmuster der unter 1.2 beschriebenen Mutationen
im CTNNB1-Gen?
4. Welche der oben beschriebenen Proteine sind Immunhistochemisch
nachweisbar und welche Aussage kann mit Hilfe der Anfärbung
getroffen werden?
5. Welche Zusammenhänge bestehen zwischen dem Mutationsstatus
und der Expression der Proteine?
6. Wie ist das tumorfreie Überleben in unserem Kollektiv und durch
welche klinisch-pathologischen Faktoren wurde es beeinflusst?
7. Welche der verwendeten Methoden zur Mutationsanalyse in DTs ist
sensitiver?
25
2. Material und Methoden
2.1 .Geräte, Reagenzien und Verbrauchsmaterial
2.1.1 Verbrauchsmaterial
Material
Collection tubes (2ml)
Bezeichung
Collection tubes (2ml)
Falcon
Falcon®
Parafilm
Parafilm „M“ laboratory
film
PCR tubes
PCR-tubes
Pipettenspitzen mit Filter •
•
•
Tip.O
ne. Graduated filter
tip
Ep.T.I.P.S. PCR
clean dualfilter
Pipettenspitzen ohne
Filter
•
•
Pyrosequencing Plate
PyroMark Q24 Plate
QIAamp MinElute®
Columns
Reaction Plate
QIAamp MinElute®
Colums
Thermo-Fast® 24-well
plate
Zentrifuge-Tubes
Zentrifugen-Röhrchen
1,5 ul
Tip.One. Tip
Ep.T.I.P.S. ohne
Filter
Hersteller
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
BD Biosciences, San
Jose, USA
Pechiney Plastic
Packaging, Chicago,
USA
Starlab, Hamburg,
Deutschland
Starlab, Hamburg,
Deutschland
Eppendorf, WesselingBerzdorf,
Deutschland
Starlab, Hamburg,
Deutschland
Eppendorf, WesselingBerzdorf,
Deutschland
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
Abgene®, Epsom, UK
Eppendorf, WesselingBerzdorf,
Deutschland
Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien
Alle
nicht
aufgeführten
Verbrauchsmaterialien
sind
Standard
Laborausrüstung.
26
2.1.2 Geräte
Gerät
Bezeichnung
Hersteller
Elektrophorese-Kammer
Geldokumentationssystem
BioRAD Sub-Cell
Model 192
E-Box VX2
Graustufen-Videoprinter
SONY UP-897MD
Kartusche
PyroMark Q24
Cartridge
Leica RM2245
Rotary Microtome
Bio-Rad, München,
Deutschland
Vilber-Lourmat,
Eberhardzell,
Deutschland
Sony, Brooklands,
Großbrittanien
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
Leica Biosystems
Nussloch GmbH,
Nussloch,
Deutschland
neoLab, Heidelberg,
Deutschland
Microtom
Minizentrifuge
Plateholder
Pyrosequencer
Spannungsgerät
Spectrophotometer
System zur automatisierten
immunhistochemischen
Färbung
Thermocycler
Thermomixer
TMA-Station
Vacuum Prep Throughs
Vakuumpumpe
Vortex
Wärmeschrank
3-Speed
Minizentrifuge
D6015
PyroMark Q24
Plateholder
PyroMark Q 24
BioRAD PowerPac
Universal Power
Supply
Nanodrop ND1000 V3.8
Benchmark Ultra
SensoQuest
labcycler
Eppendorf
Thermomixer
Comfort
Manual Tissue
Arrayer – MTA1
PyroMark Q24
Vacuum Prep
Throughs
2511 Dry Vacuum
Pump
Vortex Genie 2
Memmert Loading
Modell 100-800
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
Bio-Rad, München,
Deutschland
Thermo Fisher
Scientific,
Wilmington, USA
Ventana, Tucson,
USA
SensoQuest,
Göttingen,
Deutschland
Eppendorf,
Wesseling-Berzdorf,
Deutschland
Beecher Instruments
Inc., Sun Prairie, USA
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
Welch, Niles, USA
Scientific Industries,
New York, USA
Memmert,
Schwabach,
27
Workstation
PyroMark Q24
Vacuum
Workstation (220
V)
Eppendorf
Centrifuge 5424
Zentrifuge
Zentrifuge
Centrifuge 5415D
Deutschland
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
Eppendorf,
Wesseling-Berzdorf,
Deutschland
Eppendorf,
Wesseling-Berzdorf,
Deutschland
Tabelle 4: Geräte
2.1.3 Reagenzien
2.1.3.1 Bestimmung der DNA-Qualität
Reagenz
Agarose, UniversalAgarose
TAE-Puffer 50x Stock
(Tris-Acetat-EDTAPuffer)
Loading dye 6x
GeneRuler™ 100bp
DANN ladder
GeneRuler™ 1kb DANN
Ladder
Ethidiumbromidbad
Zusammensetzung
Agarose
•
EDTA Na2 2H2O
(18,61 g/L, 0,05 M )
• Eisessig (60,05 g/L, 1
M)
• Tris (242,28 g/L, 2 M)
• 10 mM Tris-HCl (pH
7.6),
• 0.03%
Bromophenolblau,
• 0.03% Xylen Cyanol
FF,
• 60% glycerol,
• 60 mM EDTA
Storage Buffer:
• 10 mM Tris-HCl (pH
7.6)
• 1 mM EDTA.
Loading dye 6x (s.o.)
Storage Buffer (s.o.)
Loading dye (s.o.)
Ethidiumbromid 10mg/ml
Hersteller
PEGLAB, Erlangen,
Deutschland
Carl Roth, Karlsruhe,
Deutschland
Fermentas, St. LeonRot, Deutschland
Fermentas, St. LeonRot, Deutschland
Fermentas, St. LeonRot, Deutschland
Tabelle 5: Reagenzien zur Bestimmung der DNA-Qualität
28
2.1.3.2 Polymerase-Ketten-Reaktion
10x PCR Buffer S ( mit
MgCl₂)
dNTPs
Taq-Polymerase 250
units
•
100 mM Tris-HCI (pH
9.0 at 25°C)
• 500 mM KCl
• 15 mM MgCl2
• 1.0% Triton X-100
dATP, dGTP, dCTP,
dTTP (final: 10mM)
Taq-Polymerase
• 5u/ul
Storage und
Dilutionbuffer
• 20mM Tris-HCI (pH
8.3)
• 100mM KCl
• 0.1mM EDTA
• 1mM DTT
• 50% glycerol
• 0.5% Nonidet P40
• 0.5% Tween 20 Unit
Genaxxon BioScience,
Ulm, Deutschland
PEGLAB, Erlangen,
Deutschland
Genaxxon BioScience,
Ulm, Deutschland
Tabelle 6: Reagenzien zur Durchführung der Polymerase-Ketten Reaktion
2.1.3.3 Pyro-Sequenzierung
PyroMark Annealing
Buffer
PyroMark Wash Buffer
10x, concentrate
Pyromark Binding
Buffer
Denaturation Solution
Ethanol
Streptavidin
Sepharose™ High
Performance
unbekannt
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (1,0-2,5%)
unbekannt
•
10ml
Sodiumhydroxide
Solution, 10M
• 490ml milliQ
Wasser
Ethanol 70%
Sepharase
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
Sigma Aldrich,
Steinheim, Deutschland
Fisher Scientific,
Leicestershire, UK
GE Healthcare,
Freiburg, Germany
Tabelle 7: Reagenzien zur Durchführung der Pyro-Sequenzierung
29
2.1.3.4 Tissue Micro-Array
Reagenz..
ULTRA Cell
Conditioner CC1
Zusammensetzung
unbekannt
Hersteller
Ventana, Tucson, USA
Tabelle 8: Reganzien zur Herstellung der Tissue Micro-Arrays
2.1.4 Kits
2.1.4.1 DNA-Extraktion
Bezeichung
Hersteller
QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit
QIAGEN, Hilden, Deutschland
Buffer ATL, Tissue
Natriumlaurylsulfat (2,5- QIAGEN, Hilden,
Lysis Buffer
10%)
Deutschland
Buffer AL
Guanidiniumchlorid (25- QIAGEN, Hilden,
50%)
Deutschland
Buffer AW1
Guanidiniumchlorid
QIAGEN, Hilden,
(Concentrate) Wash
(50-100%)
Deutschland
buffer
Buffer AW.2
Natriumazid (<1%)
QIAGEN, Hilden,
(Concentrate)
weitere Inhaltsstoffe
Deutschland
Wash buffer
nicht bekannt
Buffer ATE, Elution
Natriumazid (<1%)
QIAGEN, Hilden,
Buffer
weitere Inhaltsstoffe
Deutschland
nicht bekannt
Proteinase K
Proteinase K
QIAGEN, Hilden,
Deutschland
Tabelle 9: Kits zur Durchführung der DNA Extraktion
30
2.1.4.2 Pyrosequenzierung
Bezeichnung
PyroMark Gold Kit Q24
Reagenz
Enzyme-Mixture
Substrate-Mixture
Nukleotide
Hersteller
QIAGEN, Hilden, Deutschland
Zusammensetzung
Hersteller
• DNA-Polymerase QIAGEN, Hilden,
Deutschland
• ATP-Sulfurylase
• Luciferase
• Single-StrandedBinding-Protein
QIAGEN, Hilden,
• Adenosin-5’Deutschland
Phosphosulfat
QIAGEN, Hilden,
• dCTP
Deutschland
• dGTP
• dTTP
• dATPαS
Tabelle 10: Kits zur Durchführung der Pyrosequenzierung
2.1.4.3 Aufreinigung der PCR-Produkte
Bezeichnung
Hersteller
QIAquick PCR Purification Kit
QIAGEN, Hilden, Deutschland
Reagenz
Zusammensetzung
Hersteller
Buffer PB
QIAGEN, Hilden,
• Guanidiniumchlorid
Deutschland
• Isopropanol
Buffer PE
Zusammensetzung nicht
QIAGEN, Hilden,
Concentrate
bekannt
Deutschland
Buffer EB
Zusammensetzung nicht
QIAGEN, Hilden,
bekannt
Deutschland
Tabelle 11: Kits zur Aufreinigung der PCR-Produkte
2.1.4.4 Tissue Micro Array
Bezeichnung
Prep Kit # 61
Hersteller
Ventana, Tucson, USA
Tabelle 12: Kits zur Herstellung der TMAs
31
2.1.5 Antikörper
Zielstruktur
β-Catenin
Cyclin D1
Antikörper Verdünnung Klon
Maus
1:50
14/ β-Catenin
Klon
Kaninchen 1:200
SP4-Klon
KI-67
Maus
ÖstrogenMaus
Rezeptor α
Progesteron- Maus
Rezeptor
1:100
MIB-1
Ready to
use
1:200
SP1
PGR 312/2
Hersteller
BD, Piscataway,
USA
Neomarkers,
Fremont, USA
Dako, Glostrup,
Dänemark
Ventana,
Tucson, USA
Leica
Biosystems,
Nussloch,
Deutschland
Tabelle 13: Antikörper für die Immunhistochemischen Färbungen
2.2 Patientenkollektiv
Das Patientenkollektiv besteht aus 56 Fällen von 40 Patienten aus den
Archiven des Pathologischen Institutes der Friedrich-Alexander Universität
Erlangen-Nürnberg aus den Jahren 1999 bis 2012. Es wurde Formalinfixiertes in Paraffin eingebettetes Gewebe von primären DTs und Rezidiven
verwendet. Bioptisch gewonnenes Gewebe wurde ausgeschlossen.
Bei zwei Patienten war eine FAP bekannt. Das Tumorgewebe hatte seinen
Ursprung an verschiedenen Körperregionen und wurde gemäß der
Klassifikation nach Allen in folgende Gruppen eingeteilt: extra-abdominell,
abdominell, intra-abdominell und mit FAP-assoziiert (Allen 1977). Zudem
wurden entsprechend der Einteilung nach Raitamo et al Altersgruppen
geformt: Juvenil, Fertil, Post-Menopausal und Senescent (siehe auch 1.1.7).
Um einen Zusammenhang mit der Entität der Tumoren festzustellen wurde
außerdem die Abstammung von Narbengewebe mit untersucht.
Primäre DTs und Rezidive wurden voneinander getrennt behandelt: Während
für die Analyse der Daten der Immunhistochemie und Mutationsanalysen alle
Fällen in die Statistischen Berechnungen einbezogen wurden, wurden für die
Analysen im Zusammenhang mit den Follow-up Daten der Patienten nur die
Primärtumore verwendet.
32
Das Kollektiv wurde weiter an Hand der Mutation in drei Gruppen eingeteilt:
Tumore mit einer Mutation an Codon 41, einer Mutation an Codon 45, oder
mit Wt-Status.
Die Studie wurden von dem lokalen Ethikkomitee begutachtet und genehmigt
(No. 292_12B, Votum vom 12.12.2012).
Patienten- Fall- GeID
ID
schleht
1
1
M
Alter
12
Lokalisation
Größe
(cm)
6,2
Vorgeschichte
leer
2
2
M
51
Quadriceps
femoris
Biceps brachii
6,6
leer
3
3.1
M
32
Supraclavicular
1,2
leer
4
3.2
4.1
M
M
33
8
Supraclavicular
Scapula
1,5
4,0
Rezidiv
Rezidiv
5
4.2
5.1
5.2
M
F
F
8
31
31
3,5
3,5
3,0
Rezidiv
NA
Rezidiv
6.1
F
38
Scapula
Mamma
Rectus
abdominis
Biceps femoris
6
14,5
leer
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
F
F
F
F
F
39
41
43
44
45
8
7.1
7.2
7.3
8.1
M
M
M
F
9
10
9.1
10.1
11
4,0
9,5
10,0
3,5
2,4
Rezidiv
Rezidiv
Rezidiv
Rezidiv
Rezidiv
69
69
71
33
Biceps femoris
Biceps femoris
lower leg
lower leg
Fossa
poplitealis
Supraclaviculär
Cervical
Schulter
Bauchwand
2,5
3,0
1,5
6,5
F
M
25
75
Bauchwand
Cervical
4,6
13,0
11.1
F
27
Gluteal
2,5
12
13
11.2
12.1
13,1
F
M
F
27
46
74
Gluteal
Cervical
Schulter
7,0
4,3
4,7
14
14,1
F
33
Quadriceps
femoris
2,0
NA
Rezidiv
Rezidiv
Sectio
caesarea
NA
MelanomExzision
MelanomExzision
Rezidiv
NA
MelanomExzision
Rezidiv
7
33
Patienten- Fall- GeID
ID
schleht
15
15.1 F
Alter
24
Lokalisation
Axilla
Größe
(cm)
3,0
18
19
20
21
16.1
17.1
17.2
18.1
19.1
20.1
21.1
F
M
M
M
F
F
F
24
73
77
41
27
81
44
Bauchwand
Nacken
Nacken
Intraabdominell
Intraabdominell
Axilla
Schulter
NA
5,5
7,0
3,3
8,0
14,0
4,5
Vorgeschichte
MammaTumorExzision
NA
NA
Rezidiv
FAP
NA
NA
leer
16
17
22
23
24
25
26
27
28
21.2
22.1
23.1
24.1
25.1
26.1
27.1
28.1
F
F
M
M
F
M
M
M
45
23
44
44
46
79
59
3
10,0
2,8
2,2
2,5
8,8
12,0
1,2
8,0
Rezidiv
NA
NA
FAP
leer
leer
NA
leer
29
29.1
M
27
6,0
leer
30
31
30.1
31.1
F
F
18
37
Schulter
Unterschenkel
Intraabdominell
Intraabdominell
Oberschenkel
Brustwand
Intraabdominell
Fossa
poplitealis
Fossa
Poplitealis
Brustwand
Nacken
3,0
4,0
36
31.2
32.1
33.1
34.1
35.1
35.2
35.3
36.1
F
F
F
F
F
F
F
F
37
26
48
36
25
25
25
34
Nacken
Mamma
Oberschenkel
Gluteal
Unterschenkel
Unterschenkel
Unterschenkel
Bauchwand
5,0
1,0
16,0
18,0
3,0
3,2
6,5
7,2
37
38
37.1
38.1
F
M
33
68
Bauchwand
Schulter
6,0
12,0
39
39.1
F
30
Bauchwand
2,8
NA
Neckdissect
ion
Rezidiv
NA
NA
Rezidiv
leer
Rezidiv
Rezidiv
Sectio
caesarea
leer
NaevusExzision
leer
40
40.1
M
44
Schulter
20,5
NA
32
33
34
35
Tabelle 14: Patientenliste mit klinisch-pathologischen Eigenschaften
34
2.3 Methodik
2.3.1 DNA-Extraktion mit QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit
Für die DNA-Extraktion wurden von jedem Fall fünf bis sechs Leerschnitte
benötigt. Um entscheiden zu können welche Paraffinblöcke zur Extraktion
geeignet sind wurden die HE-Schnitte unter dem Lichtmikroskop begutachtet
und das Areal mit dem Tumorgewebe markiert. Im Folgenden wurden
Anhand dessen die geeigneten Paraffinblöcke ausgewählt und je fünf bis
sechs Leerschnitte von einem einzelnen Block mit einer Dicke von bis zu 10
µm mit dem Microtom (Leica RM2245 Rotary Microtome: Leica Biosystems
Nussloch GmbH, Nussloch, Deutschland) angefertigt. Diese wurden zum
entparaffinieren zunächst für 30 Minuten bei 60°C in den Wärmeschrank
(Memmert Loading Modell 100-800: Memmert, Schwabach, Deutschland)
gestellt. Danach wurden sie für 30 Minuten in ein Xylolbad und für weitere 15
Minuten in ein 100%es Isopropanolbad gegeben. Zuletzt wurden die Schnitte
wiederum für 15 Minuten in ein 80%es Isopropanolbad gestellt.
Nachdem die vollständig entparaffinierten Leerschnitte getrocknet waren
wurde mit Hilfe des zuvor markierten HE-Schnittes mit einem Skalpell von
den jeweils fünf bis sechs Leerschnitten genau das Areal abgekratzt,
welches das Tumorgewebe enthält und in 180 µl Tissue Lysis Buffer (Buffer
ATL:
Quiagen,
Reaktionsgefäß
Hilden,
Deutschland)
(Eppendorf-Cup:
in
einem
Eppendorf,
1,5
µl
Eppendorf-
Wesseling-Berzdorf,
Deutschland) gelöst. Wobei darauf geachtet wurde, dass möglichst wenig
gesundes Gewebe mit abgekratzt wurde. Dazu wurden 20 µl Poteinase K
(Proteinase K: QIAGEN, Hilden, Deutschland) gegeben und die EppendorfCups über Nacht bei 56 °C und 800 revolutions per minute (rpm) auf einem
Thermomixer (Eppendorf Thermomixer Comfort: Eppendorf, WesselingBerzdorf, Deutschland) inkubiert, um einen optimalen Verdau des Gewebes
zu erreichen.
Am darauffolgenden Tag wurden die Eppendorf-Cups zuerst von dem
Thermomixer genommen, und dieser auf 90 °C vorgeheizt. Danach wurden
sie eine weitere Stunde bei 800 rpm auf einer auf 90 °C vorgeheizten Platte
inkubiert. Daraufhin erfolgte eine Zentrifugation (Eppendorf Centrifuge 5424:
35
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) bei 6000 x g (800rpm) für eine
Minute bei Raumtemperatur (RT) (In den folgenden Schritten der DNAExtraktion wurde die Zentrifugation, wenn nicht anders beschrieben, mit
diesen Parametern durchgeführt). Darauffolgend wurden zuerst 200 µl ALPuffer (Buffer AL: QUIAGEN, Hilden, Deutschland) hinzugefügt und mit
einem Vortex-Mixer (Vortex Genie 2: Scientific Industries, New York, USA)
gemischt und dann 200 µl Ethanol 100% (Ethanol, 100%, Fisher Scientific,
Leicestershire, UK) zugegeben und wiederum gevortext und zentrifugiert. Die
Lösung wurde dann vollständig in eine QIAamp MinElute Säule (QIAamp
MinElute® Column: QIAGEN, Hilden, Deutschland), mit einem Auffanggefäß
(2 ml Collection tube: QIAGEN, Hilden, Deutschland) darunter, überführt, um
die DNA daran zu binden. Nach einer weiteren Zentrifugation, wurde das
Auffanggefäß mit dem Durchfluss verworfen und die Säule in einem neuen
Auffanggefäß platziert. Nun folgten zwei Waschschritte. Zuerst wurden 500
µl Waschpuffer 1 (Buffer AW1: QIAGEN, Hilden, Deutschland) auf die
Membran der Säule pipettiert, zentrifugiert und das Auffanggefäß mit dem
Durchfluss verworfen. Der letzte Schritt wurde wie zuvor beschrieben für den
Waschpuffer 2 (Buffer AW2: QUIAGEN, Hilden, Deutschland) wiederholt. Um
die Membran zu trocknen und somit Reaktionen des Ethanols in den
darauffolgenden Arbeitsschritten zu vermeiden erfolgte eine Zentrifugation
bei 20 000 x g (14 000 rpm) bei RT für drei Minuten. Das Auffanggefäß
wurde verworfen und die Säule in einem neuen 1,5 µl Eppendorf-Cup
platziert. Zum eluieren der DNA wurden 50 µl ATE-Puffer (Buffer ATE:
QUIAGEN, Hilden, Deutschland) auf die Membran pipettiert und für drei
Minuten bei RT stehen gelassen, um die höchstmögliche Konzentration an
DNA in dem Eluat zu erreichen. Danach wurden die Eppendorf-Cups mit den
Säulen bei 20 000 x g (14 000 rpm) für eine Minute bei RT zentrifugiert und
die Säulen verworfen. Die DNA war nun vorbereitet für die darauffolgenden
Arbeitsschritte.
Um längere Stehzeiten des Materials zu vermeiden wurde die DNAExtraktion immer mit zehn bis zwölf Fällen pro Tag durchgeführt.
Bei elf Fällen konnten zu Beginn nur niedrige Konzentrationen an DNA
erreicht werden. In diesen Fällen wurde die DNA erneut wie oben
36
beschrieben extrahiert. Jedoch wurde das Eluat im letzten Schritt erneut auf
die Membran pipettiert und wiederum nach drei Minuten Einwirkzeit bei RT
bei 20 000 g (14 000 rpm) für eine Minute zentrifugiert, um die DNAKonzentration zu erhöhen.
2.3.2 Bestimmung der DNA-Qualität
2.3.2.1 Messung der Nukleinsäurekonzentration
Zur Bestimmung der Qualität des Eluats wurde zuerst die Konzentration an
Nukleinsäure mit Hilfe des Spectralphotometers Nanodrop 1000 (NanoDrop
1000, Spectrophotometer:
Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA)
gemessen. Hierfür wurde wie folgt vorgegangen. Zunächst wurde das Gerät
kalibriert indem 1,5 µl milliQ-water auf die untere Messplattform aufgetragen
und der Hebel mit der oberen Messplattform nach unten geklappt wurde,
sodass beide Messplattformen aufeinander zum Liegen kamen. Darauf folgte
die Messung einer Leerprobe auf die gleiche weiße. Hierfür muss immer das
Reagenz benutzt werden in welchem die DNA eluiert wurde. Bei der DNAExtraktion wird hierfür daher der ATE-Puffer (Buffer ATE: QUIAGEN, Hilden,
Deutschland) verwendet. Auch hier wurden 1,5 µl aufgetragen und genauso
vorgegangen, wie für die Initialisierung beschrieben. Erst dann werden je 1,5
µl des Eluats auf die Messplattform aufgetragen und wie beschrieben
gemessen. Die Messung erfolgte für jede Probe. Das Programm zu
NanoDrop 1000 berechnet die Konzentration an Nukleinsäuren an Hand
einer Modifikation des Lambert-Beerschen Gesetztes wie folgt: c = (A * e)/b,
wobei c die Konzentration an Nukleinsäuren in ng/µl ist, A ist die Absorption
in AU, e der von der Wellenlänge abhängige Extinktionskoeffizient in ngcm/µl (für Doppelsträngige DNA: 50 ng-cm/µl) und b ist die Pfadlänge (hier:
0,2 mm). Somit kann die Konzentration an DNA in ng/µl direkt abgelesen
werden.
2.3.2.2 Gelelektrophorese zur Qualitätskontrolle der DNA-Extraktion
Hierbei handelt es sich um eine analytische Methode zur Trennung von
verschiedenartigen, oder verschiedengroßen Molekülen, die unter Einfluss
eines elektrischen Feldes durch ein Gel wandern, welches in einer leitenden
Pufferlösung liegt. Hierfür wurde ein Agarose-Gel (Agarose, Universal37
Agarose, PEGLAB, Erlangen, Deutschland) mit einer Konzentration von 1,2
% verwendet. Dieses wird hergestellt durch lösen und aufkochen von 3,6 g
Agarose in 300 ml 50-fach verdünntem TAE-Puffer (TAE-Puffer: Carl Roth,
Karlsruhe, Deutschland). Dies erfolgte bei 600 Watt in der Mikrowelle, so
lange bis keine Schlieren mehr in dem Gel sichtbar waren. Danach wurde es
in einer zuvor austarierten Kammer mit eingesetzten Kämmen gegossen.
Nachdem es abgekühlt und fest war, konnten die Kämme entfernt werden
und das Gel mit den Taschen wurde in eine Gelelektrophorese-Kammer
(Elektrophorese-Kammer: BioRAD Sub-Cell Model 192, Bio-Rad, München,
Deutschland) mit demselben 50-fach verdünnten TAE-Puffer überführt. Bevor
die DNA-Produkte eingesetzt werden konnten wurde diese, um sie im
Nachhinein vergleichen zu können, alle auf eine Nukleinsäurekonzentration
von 250 ng pro 10 µl DNA gebracht. Anschließend wurden diese 10 µl
zusammen mit je 2 µl Loading dye (LD: 6 x Loading Dye: Fermentas, St.
Leon-Rot, Deutschland) in die Taschen pipettiert. LD enthält Glycerol,
welches
zum
beschweren
der
Probe
diente
und
LD
Farbstoffe
(Bromphenolblau, Xylenecyanol), welche es ermöglichen zu beobachten, wie
weit die aufgetragenen Proben gelaufen sind. Durch die im Folgenden
angelegte Spannung von 200 Volt wandern die negativ geladenen
Fragmente zur Anode und trennen sich je nach Größe in dem Agarose-Gel
auf. Wobei größere Fragmente eher zum liegen kommen und kleinere
Fragmente weiter in Richtung Anode laufen, da sie die Poren des AgaroseGels leichter passieren.
Nach ca. 45 Minuten Laufzeit wird das Gel aus der Elektrophorese-Kammer
entnommen und für 20 Minuten in Ethidiumbromid (Ethidiumbromidbad:
Ethidiumbromid 10mg/ml) entwickelt. Das Ethidiumbromid interkalliert in die
DNA
und
kann
anschließend
unter
UV-Licht
in
dem
Geldokumentationssystem E-Box (Geldokumentationssystem: E-Box VX2,
Vilber-Lourmat, Eberhardzell, Deutschland) angesehen, abfotografiert (Siehe
Abbildung 8) und gespeichert werden.
38
Abbildung 8: Beispiel für eine Gelelektrophorese von extrahierter DNA
2.3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion
Zur
Durchführung
einer
Mutationsanalyse
und
zur
Evaluation
der
interessierenden Genabschnitte müssen diese zuerst mittels PolymeraseKetten-Reaktion (PCR) amplifiziert werden.
2.3.3.1 Vorbereitung der PCR
Da für die Sanger- und Pyrosequenzierung verschieden lange Genabschnitte
benötigt werden, musste die Vorbereitung für die PCR getrennt erfolgen.
Dafür wurde zunächst mit Excell (Microsoft, Seattle, USA) je eine Tabelle mit
den vorgeschlagenen Volumina für die PCR-Reagenzien erstellt in welcher
direkt die Mengen für die Anzahl der Proben errechnet wurden (siehe
Tabelle15 und 16).
10 x Puffer S (mit 15 mM MgCl₂)
dNTP-Gemisch
Primer-Gemisch (10 µM, final 0,5 µM)
H₂O (mQ)
DNA-Probe (200ng DNA)
Genaxxon Taq-Polymerase (5 u/µl)
Gesamtvolumen
µl pro tube
5
1
2,5
31
10
0,5
50
Tabelle 15: PCR-Mastermix für die Sanger-Sequenzierung
39
10 x Puffer S (mit 15 mM MgCl₂)
dNTP-Gemisch
Primer-Gemisch (10 µM, final 0,5 µM)
H₂O (mQ)
DNA-Probe (200ng DNA)
Genaxxon Taq-Polymerase (5 u/µl)
Gesamtvolumen
µl pro tube
2,5
0,5
0,5
11,25
10
0,25
25
Tabelle 16: PCR Mastermix für die Pyro-Sequenzierung
Die Reagenzien wurden während des Pipettierens dauerhaft auf Eis gekühlt,
um unerwünschte frühzeitige Reaktionen zu vermeiden. Um eine einheitliche
Menge an PCR-Produkt zu erhalten, wurde die DNA auf eine Menge von 200
ng DNA pro 10 µl Ansatz durch Beimengen von H₂0 verdünnt und in die PCR
Tubes vorgelegt. Im Folgenden wurden die Reagenzien für den Mastermix in
ein 1,5 ml Eppendorf-Cup vorgemischt und gevortext. Es ist dabei darauf zu
achten, dass die Polymerase als letztes Reagenz hinzugefügt wird, um
frühzeitige Reaktionen mit den einsträngigen Primern zu vermeiden. Zuletzt
wurden je 40 bzw. 15 µl des Mastermix zu den vorgelegten DNA-Proben
gegeben. Die PCR-Reaktionsgefäße wurden daraufhin verschlossen und der
Inhalt durch Schwenken vermengt.
Für jeden PCR-Lauf wurde eine Negativkontrolle mitgeführt, um mögliche
Verunreinigungen detektieren zu können. Hierfür wurden 10 µl H₂O anstelle
der verdünnten DNA-Probe vorgelegt. Der Mastermix wurde zu allen Proben,
auch zu der Negativkontrolle aus dem gleichen Gefäß zugegeben.
2.3.3.2 PCR-Primer
Für die verschiedenen Arten der Sequenzierung müssen verschiedene
Primer verwendet werden, denn für die Pyrosequenzierung wird zum einen
nur eine kurze Sequenz benötigt und zum anderen muss diese an einer Seite
durch Biotinylierung markiert sein. Bei den Primern handelt es sich jeweils
um ein Gemisch aus einem Forward- und einem Reverse-Primer des Exon 3
des CTNNB1-Gens. Die Basensequenzen sind in Tabelle 17 aufgeführt.
40
Sequenzierung
Pyrosequenzierung
SangerSequenzierung
PCR-Primer
Sequenz
CTNNB1_ex3_F1
CTNNB1_ex3_bioR1
CTNNB1_ex3_for5
CTNNB1_ex3_rev+1
Product
-size
GTCACTGGCAGCAACAGT 120 bp
CTT
Biotin_GGACTTGGGAGGT
ATCCACAT
TTTGATGGAGTTGGACAT 225 bp
GG
CCAGCTACTTGTTCTTGA
GTGAA
Tabelle 17: Primer für die Amplifikation mittels PCR
2.3.3.3 PCR-Programm
Die PCR-Läufe wurden mit dem Thermocycler (SensoQuest labcycler,
SensoQuest, Göttingen, Deutschland) mit dem in Tabelle 18 aufgeführten
Programm durchgeführt.
Schritt
Zeit
Temp.
1. Initiale Denaturierung
2. Denaturierung
3. Annealing
4. Elongation
5. Abschließende Elongation
5 min
30 sec
1 min
1 min
5 min
95 °C
55 °C
65° C
72 °C
Zyklenanzahl
50 Zyklen
Tabelle 18: PCR-Programm
2.3.3.3 Gelelektrophorese zur Qualitätskontrolle der Polymerase-KettenReaktion
Ebenso, wie die extrahierte DNA-Probe, wurde auch das PCR-Produkt einer
Qualitätskontrolle unterzogen. Die Vorgehens- und Funktionsweise der
Gelelektrophorese ist unter 2.3.2.2 beschrieben.
Das PCR-Produkt umfasst eine wesentlich kürzere Sequenz als die gesamte
DNA-Probe, daher war es notwendig eine Konzentration von 2,5% für das
Agarosegel zu verwenden. Durch die Erhöhung der Konzentration an
Agarose entstehen kleinere Poren durch welche die kürzeren DNAFragmente besser aufgetrennt werden können.
41
Abbildung 9: Beispiel für eine Gelelektrophorese von PCR-Produkten
2.3.4 Quantitative Mutationsanalyse mittels Pyrosequenzierung
Eine Methode zur DNA-Sequenzierung ohne Elektrophorese, wie die PyroSequenzierung wurde erstmals 1996 von Ronaghi et al. beschrieben
(Ronaghi et al. 1996). Sie stellt eine sensible Methode zum quantitativen
Nachweis von Mutationen in kurzen DNA-Sequenzen dar.
2.3.4.1 Erstellen des Assays und des Set-up
Zur Durchführung einer Sequenzierung mit dem Pyrosequenzierer PyroMark
Q24
(Qiagen,
Hilden,
Deutschland)
musste
ein
Assay
mit
dem
dazugehörigen Programm PyroMark Q24 Software (Qiagen, Hilden,
Deutschland) erstellt werden.
Für die Detektion einer Mutation wurde die Funktion „New AQ Assay“
ausgewählt und im Folgenden die zu sequenzierende Basenabfolge, die
sogenannten „Dispensation Order“ in das dafür vorgesehene Eingabefeld
eingegeben. An der Stelle, an der eine Punktmutation erwartet wurde,
musste das erwartete mutierte Nukleotid hinter dem Wildtyp (Wt)-Nukleotid
eingefügt werden und mit einem „/“ gekennzeichnet werden. Eine mögliche
Mutation, deren Lokalisation, aber Nukleotid nicht bekannt ist wird in der
Basenabfolge gekennzeichnet in dem das Wt-Nukleotid durch ein „N“ ersetzt
wird. Dann wurde durch das Programm eine „Dispensation Order
erstellt“(siehe Abbildung 13). Darin stellen das erste und das dritte Nukleotid
42
in der Basenabfolge sogenannte „blank-dispensations“ dar und sind eine
Negativkontrolle.
Abbildung 10: Beispiel für eine Dispensation Order für das Exon 3 des
CTNNB1- Gens
Im Folgenden wurde ein Setup erstellt, wie in Abbildung 14 für 12 Fälle
dargestellt ist. Dafür wird für jeden einzelnen Fall ein eigenes Feld mit
genauem Volumen erstellt und das Assay eingefügt. Somit können die
Proben nach der Sequenzierung wieder identifiziert werden und das
Programm kann an Hand der Anzahl der angegebenen Proben die benötigte
Menge an Reagenzien zum Befüllen der Kartusche (PyroMark Q24
Cartridge: Qiagen, Hilden, Germany) berechnen.
43
1
2
3
4
5
6
7
8
CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V
A
2
2
2
2
2
2
2
2
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Sample 5
Sample 6
Sample 7
Sample 8
CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V CTNNB1_S1V
B
2
2
2
2
20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
Sample 9
Sample 10
Sample 11
Sample 12
Abbildung 11: Setup für die Pyro-Sequenzierung
2.3.4.1 Vorbereitung der PCR-Produkte für die Pyrosequenzierung
Zu Beginn wurde eine Verdünnung der Streptavidin-Sepharase (Streptavidin
Sepharose™ High Performance Sepharase, GE Healthcare, Freiburg,
Germany) erstellt. Für jede Probe wurden dazu 2 µl der StreptavidinSepharase mit 38 µl Binding Buffer (Pyromark Binding Buffer, QIAGEN,
Hilden, Deutschland) gemischt. Dann wurden je 20 µl biotinyliertes PCRProdukt mit 10 µl mQ-water in die Vertiefung einer Reaction plate (Reaction
Plate, Thermo-Fast® 24-well plate, Abgene®, Epsom, UK) vorgelegt und je
40 µl der Streptavidin-Sepharase-Verdünnung dazu pipettiert. Dies wurde auf
einem Mixer (Thermomixer, Eppendorf Thermomixer Comfort, Eppendorf,
Wesseling-Berzdorf,) für 10 Minuten inkubiert. Währenddessen wurde die
Pyrosequencing-plate (PyroMark Q 24 Plate, QIAGEN, Hilden, Deutschland)
vorbereitet indem in jede Vertiefung jeweils 2,5 µl Sequenzierprimer und 22,5
µl
Annealing
Buffer (PyroMark
Annealing
Buffer,
QIAGEN,
Hilden,
Deutschland) gegeben wurden.
Im Folgenden wurde die PCR-Reaction-Plate und die Q24-Pyrosquencing
Plate in der Vacuum Workstation, platziert. Die verschiedenen Behälter
(Vacuum Prep Throughs, PyroMark Q24 Vacuum Prep Throughs, QIAGEN,
Hilden, Deutschland) enthalten 70% Ethanol, PyroMark Denaturation
Solution (Denaturation Solution, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland),
44
PyroMark
Wash
Buffer
(PyroMark
Wash
Buffer,
QIAGEN,
Hilden,
Deutschland), und mQ-Water.
Danach wurde das Vacuum-Prep-Tool in die PCR-Platte gesteckt und dort
für ca. 15 Sekunden belassen. Das PCR-Produkt konnte nun an das
Vacuum-Prep-Tool binden und wurde in den Behälter mit 70%-Alkohol
überführt und für 5 Sekunden gewaschen. Genauso wurde mit der
Denaturation Solution vorgegangen. Zuletzt wurden die Proben in den
PyroMark Wash Buffer überführt und für weitere 10 Sekunden darin
belassen. Nach Abschalten des Vakuums wurde das Vacuum Prep Tool auf
die Q24 Pyrosequencing-Plate gelegt und für 20 Sekunden inkubiert. Die
PCR-Produkte wurden dabei gelöst und mit den Sequenzier-Primern
gemischt. Die Pyrosequencing-Plate wurde nachfolgend für 2 Minuten bei 80
°C zur Denaturierung der DNA und zum Binden der Sequencing-Primer
inkubiert. Der Sequenzierprimer ist in Tabelle 19 aufgeführt.
Primer Pyrosequenzierung
Sequencing-Primer
CTNNB1ex3_S1V1
Sequenz
cattctggtgccact
Tabelle 19: Primer für die Pyro-Sequenzierung
Während die Pyrosequencing-Plate mehrere Minuten bei Raumtemperatur
abkühlte, wurde die Kartusche mit den zuvor berechneten Volumina an
dCTP, dGTP, dTTPd, ATPαS, Enzym und Substrat-Mixtur befüllt (Nukleotide,
Quiagen, Hilden, Deutschland).
2.3.4.5 Pyrosequenzierung und Auswertung
Nachdem alle Vorbereitungen getroffen wurden, wurde der Sequenzierer mit
der Pyrosequencing-plate und der Kartusche bestückt. Zuletzt wurden Set-up
und Assay mittels eines USB-Sticks auf das Gerät übertragen und der Lauf
gestartet. Der Lauf konnte nachfolgend mit der PyroMark Q24 Software an
einem Computer ausgewertet werden. Die Mutationsrate wurde in Prozent
angegeben und die Qualität der Sequenzierung an Hand verschiedener
Parameter, wie Peakeigenschaften, oder Hintergrundrauschen bewertet.
45
Abbildung 12: Beispiel für ein Pyrogramm einer Sequenz
2.3.5 Kettenabbruch-Methode nach Sanger
Die Kettenabbruch-Methode nach Sanger stellt eine Methode zur qualitativen
DNA-Sequenzierung dar. Die Sequenzierung erfolgte in einem externen
Labor in Göttingen (Seqlab; Sequence Laboratories Göttingen GmbH,
Göttingen, Deutschland).
2.3.5.1 Aufreinigung der PCR-Produkte
Um die PCR-Produkte zur Sanger-Sequenzierung verschicken zu können,
mussten
diese
zuerst
von
Unreinheiten
der
Konservation
und
vorhergehenden Reaktionskomponenten mit Hilfe des QIAquick Purification
Kit (Quiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt werden. Um eine Verdünnung
des PCR-Produktes von 1:5 zu erreichen wurden 45 µl PCR-Produkt zu 225
µl PB Puffer pipettiert und anschließend in eine QIAquick spin column
(Qiagen, Hilden, Deutschland), die in einem 2ml Eppendorf-Cup platziert
wurde, überführt. Die QIAquick spin column besteht aus einer Säule mit einer
Membran in der die DNA gebunden werden kann. Nach einer Zentrifugation
von 60 Sekunden bei 13000 rpm (Zentrifugeneinstellungen wurden für alle
folgenden Schritte übernommen) wurde der Durchfluss verworfen und die
QIAquick spin column mit der gebundenen DNA erneut in das Eppendorf
Cup gesteckt. Um die Probe erneut zu waschen wurden 0,75 ml PE-Puffer
auf die Säule gegeben und die Probe zentrifugiert. Um Verunreinigungen
durch den PE-Puffer zu vermeiden, wurde derDurchfluss verworfen und die
Probe erneut für eine Minute zentrifugiert. Die Säule wurde dann in ein 1,5 ml
46
Mikrozentrifugen-Röhrchen gegeben, mit 30 µl EB-Puffer für drei Minuten
inkubiert, um die gereinigte DNA aus der Membran der Säule zu lösen und
erneut zentrifugiert. Im letzten Schritt wurde die DNA aus der Membran
gelöst und die QIAquick spin column wurde verworfen.
2.3.5.2 Vorbereitung für den Versand
Da eine Mindestkonzentration von 50 ng/µl für die Sequenzierung notwendig
ist, wurde die DNA-Konzentration mit Hilfe des Nanodrop gemessen. Um ein
Volumen von 7 µl mit einer möglichst hohen DNA-Konzentration zu
erreichen, wurden jeweils 5,6 µl aufgereinigtes PCR-Produkt eingesetzt.
Dazu wurden 20 pmol entweder des Forward-, oder des Reverse- Primers
mit einem Volumen von 1,4 µl pipettiert. Die Sequenzierung mit dem
Reverse-Primer erfolgte, wenn das Ergebnis der Forward-Sequenzierung
bestätigt werden musste. Die Sequenzen der Primer können der Tabelle 20
entnommen werden.
Sequenzierung Sequenzier-Primer
Sequenz
Forward
CTNNB1_ex3_for37
Reverse
CTNNB1_ex3_rev_192
GCCATGGAACCA
GACAGAAA
AAAATCCCTGTTC
CCACTCA
Product
-size
175 bp
175 bp
Tabelle 20: Primer für die Sanger-Sequenzierung
Die Proben wurden in fortlaufend nummerierte 0,2 ml Reaktionsgefäße
pipettiert und in Falcons in einem wattierten Kuvert im Emil-Fischer-Zentrum
in Erlangen abgeben. Von dort erfolgte ein spezieller Transport zum Seqlab
nach Göttingen, um eine möglichst gute DNA-Qualität zu erhalten. Vor
Abgabe wurde online ein Bestellcode generiert, mit Hilfe dessen die fertigen
Sequenzen abgerufen werden konnten.
2.3.5.3 Auswertung der Sequenzen
Die Chromatogramme konnten nach zwei bis drei Tagen ausgewertet
werden. Als Vergleichssequenz diente die Wt-Sequenz des CTNNB1-Gens.
Als Referenzsequenz wurde die von der offiziellen Seite des National Center
for Biotechnology Information (NCBI) aufgeführte Sequenz verwendet. Die
Sequenzen für das CTNNB1-Gen (catenin beta-1 [Homo sapiens]) wurden
sowohl auf DNA als auch auf Proteinebene nach der offiziellen Nomenklatur
47
„Nomenclature
for
the
description
of
sequence
variants“
(http://www.hgvs.org/mutnomen/) der Human Genome Variation Society
(HGVS)
mit
der
Referenznummer
NP_001091680.1
ermittelt.
Die
Aminosäuren wurden entsprechend dem Ein-, oder Dreibuchstabencode laut
IUPAC-IUB, wie in Tabelle 21 zu sehen ist abgekürzt (IUPAC-IUB 1984).
Aminosäure
Dreibuchstabencode
Alanin
Arginin
Asparagin
Asparaginsäure
Cystein
Glutamin
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin
Phenylanalin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
Einbuchstabencode
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
A
E
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
Tabelle 21: IUPAC-Nomenklatur zur Abkürzung von Aminosäuren
Da es sich bei den beschriebenen Mutationen ausschließlich um
Punktmutationen
Beschreibung
im
Exon
3
des
CTNNB1-Gens
der Auswertungsmethode
auf
diese
handelte,
ist
beschränkt.
die
Eine
Punktmutation beruht auf dem Austausch von nur einem einzigen Nukleotid
durch ein anderes Nukleotid. Da aber nicht jede Punktmutation auf DNAEbene zu einer Veränderung auf Proteinebene führt, wurde jedes
Basentriplett mit Hilfe des genetischen Codes, wie in Tabelle 22 dargestellt,
überprüft (Matthaei et al. 1962).
48
Zweite Base
U
Phenylalanin
U UUA
C
A
UCU
UCC
UAU
UAC
UCA
Serin
UAA
Leucin
C
A
UUG
UCG
UAG
CUU
CUC
CUA
CUG
AUU
AUC
AUA
CCU
CCC
CCA
CCG
ACU
ACC
ACA
CAU
CAC
CAA
CAG
AAU
AAC
AAA
Erste Base
AUG
G
GUU
GUC
GUA
GU
G
Leucin
Isoleucin
Prolin
Threo
-nin
Methioni
n (StartCodon)
ACG
AAG
Valin
GCU
GCC
GCA
GC
G
GAU
GAC
GAA
GA
G
Alanin
G
Tyrosin
StopCodon
Histidin
Glutamin
Asparagin
Lysin
Asparagin
-säure
Glutaminsäure
UGU
UGC
UGA
UGG
CGU
CGC
CGA
CGG
AGU
AGC
AGA
AGG
GGU
GGC
GGA
GG
G
Cystei
n
StopCodon
Tryptophan
Arginin
Serin
Arginin
Glycin
U
C
A
G
Dritte Base
UUU
UUC
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
Tabelle 22: Der genetische Code: Wobei A für Adenin, G für Guanin, C für
Cytosin und U für Uracil steht.
Auf DNA-Ebene wurden die Nukleinsäuren mit einem vorangestellten „c.“
gekennzeichnet, darauf folgte die Nummerierung des Nukleotids und der
jeweilige Buchstabe A, T, G, oder C, wobei A für Adenosin, T für Thymin, G
für Guanin und C für Cytosin steht. So wurde zum Beispiel Adenin an
Position 121 mit c.121A beschrieben. Auf Proteinebene wurde die
Nummerierung des Basentripletts ebenso in der Wt-Sequenz abgelesen. Die
Basen können an Hand des genetischen Codes, wie oben beschrieben einer
Aminosäure zugeordnet werden. Auf Proteinebene wird der Aminosäure ein
„p.“ vorangesetzt, darauf folgt die Nummerierung des Codons uns der
Einbuchstabencode für die Aminosäure. Hat man nun an Position 41 die
Basenabfolge ACC, so entspricht dies der Aminosäure Threonin und wird mit
p.T41 beschrieben.
49
40
42
41
Abbildung 13: Ausschnitt aus einem Chromatogramm einer Wt-Sequenz
Lag nun eine Mutation vor bei der ein Adenin an Position 121 durch ein
Guanin ersetzt wurde, wie in Abbildung 17, so wurde bei der Beschreibung
auf DNA-Ebene das ausgetauschte Nukleotid hintangestellt und mit
c.121A>G beschrieben. Hier veränderte sich also die Triplettfolge von ACC
zu GCC. Überprüft man dies mit Hilfe des genetischen Codes, so erhält man
eine
Veränderung
der
Aminosäure
von
Threonin
zu
Alanin.
Die
Nummerierung der Aminosäure kann in der Wt-Sequenz abgelesen werden
und entspricht hier dem Codon 41. Auf Proteinebene wird nun der
Aminosäure ein „p.“ vorangesetzt, darauf folgt die Nummerierung des
Codons und der Einbuchstabencode für die Aminosäure. Eine Punktmutation
an Codon 41, wie in Abbildung 17 wird demzufolge mit p.T41A beschrieben.
40
41
42
Abbildung 14:Ausschnitt aus einem Chromatogramm mit einer
Punktmutation an Codon 41 mit einer Änderung der Basensequenz von ACC
zu GCC. Durch die Mutation wird an Stelle von Threonin Alanin in das
Protein eingebaut. Beschreibung entsprechend der HGVS: c.121A>G;
p.T41A
50
2.3.6 Verdünnungsreihe
Um einen direkten Vergleich der Methode nach Sanger und der PyroSequenzierung zu erhalten wurde eine Verdünnungsreihe für eine der
Proben durchgeführt.
2.3.6.1 Auswahl der Proben
Es wurde eine DNA-Probe gewählt, die in der quantitativen PyroSequenzierung eine Mutationsrate von 40% ergab mit einer DNAKonzentration ([c]DNA) in der Ausgangsprobe vor PCR von 70 ng/ µl. Da in
der Verdünnungsreihe die Konzentration an mutierten Zellen verschieden
sein sollte, wurde die mutierte Probe für die verschiedenen Ansätze mit WtDNA eines anderen Patienten verdünnt. Dafür wurde eine Probe mit einer
[c]DNA von 210 ng/ µl gewählt. Um das pipettieren zu erleichtern wurden die
20 µl der Wt-DNA mit 40 µl mQ-water verdünnt, um ebenso eine [c]DNA von
70 ng/ µl für die Wt-DNA zu erreichen. Es wurde besonders darauf geachtet,
dass die DNA für die Pyro- und die Sanger-Sequenzierung einer
Verdünnungsstufe immer aus dem gleichen Aliquot pipettiert wurde, um eine
genaue Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
2.3.6.2 Berechnung der Verdünnungsstufen
Die Verdünnungsstufen wurden auf DNA-Ebene an Hand der oben
beschriebenen Mutationsraten und Konzentrationen berechnet. Tabelle 21
zeigt die Angaben für ein Endvolumen von 10 µl, welches für den Ansatz
einer PCR benötigt wurde. Es wurde immer die 2,5-Fache Menge für jede
Verdünnungsstufe hergestellt, um beide PCR-Ansätze aus einem Aliquot zu
erhalten.
51
Mutation
40
30
25
20
15
10
in %
DNA in ng
200 150 125 100 75
50
[c]DNA
in
70
70
70
70
70
70
ng/µl
DNA
2,86 2,14 1,79 1,43 1,07 0,71
mutiert in µl
Wt-DNA in
0,00 0,72 1,07 1,43 1,79 2,15
µl
mQ-water
7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14
Volumen
Gesamt
10
10
10
10
10
10
7,5
5
2,5
1
37,5
25
12,5
2
70
70
70
70
0,54 0,36 0,18 0,03
2,32 2,50 2,68 2,83
7,14 7,14 7,14 7,14
10
10
10
10
Tabelle 23: Verdünnungsstufen der Verdünnungsreihe
2.3.6.3 Amplifikation und Sequenzierung
Für die PCR wurde für jede Verdünnungsstufe eine Ansatz für die Pyro- und
ein Ansatz für die Sanger-Sequenzierung pipettiert. Dabei wurde die DNA für
eine Verdünnungsstufe für beide Methoden aus dem Gleichen Aliquot
genommen. Die PCR-Reagenzien wurden unter gleichen Bedingungen, wie
die anderen Patientenproben pipettiert. Negativkontrollen wurden mitgeführt.
Sowohl die Reagenzien für die Pyro- Sequenzierung, als auch die
Reagenzien für die Methode nach Sanger wurden in dem gleichen PCRLauf, wie unter 2.3.3 beschrieben amplifiziert.
Nach
abgelaufener
PCR
wurde
eine
Qualitätskontrolle
mittels
Gelelektrophorese durchgeführt. Die Sequenzierungen und Auswertungen
der Sequenzen erfolgten wie oben beschrieben.
2.3.7 Tissue Micro Array (TMA)
Bei Tissue Micro Array handelt es sich um eine Methode, mit deren Hilfe
viele verschiedene in Paraffin eingebettete Gewebeproben histologisch und
immunhistochemisch parallel untersucht werden können.
2.3.7.1 Erstellen der TMAs
Für die Erstellung eines TMAs war es notwendig die zuvor angefertigten HESchnitte aller FFPE-Blöcke eines Falles erneut lichtmikroskopisch zu
52
begutachten und die Tumorareale zu markieren. Es wurden von jedem Fall
ein bis maximal zwei Tumorblöcke ausgewählt. Die Tumorblöcke und die
zugehörigen markierten Schnitte wurden dann nebeneinander platziert, um
eine genaue Zuordnung treffen zu können. Zur Herstellung der TMAs wurde
ein Durchmesser der Stanzen von 1 mm gewählt. Es wurden vier Reihen mit
je acht Stanzen und einer Negativkontrolle festgelegt, sodass insgesamt
maximal 32 Stanzen von acht Fällen und vier Stanzen als Negativkontrollen
untersucht werden konnten. Narbengewebe und ein Gastrointestinaler
Stromatumor (GIST) wurden als Negativkontrollen zur Qualitätskontrolle
gewählt.
Zuerst musste ein Leerblock aus Paraffin gegossen werden, der sogenannte
Empfängerblock. Dieser wurde dann in die TMA-Station (Manual Tissue
Arrayer: MTA1, Beecher Instruments Inc., Sun Prairie, USA) arretiert und
eingespannt. Nun wurde mit einer Stanze, die ausschließlich für den
Empfängerblock genutzt wurde ein Zylinder ausgestanzt und verworfen. Im
nächsten Schritt wurde mit einer zweiten Stanze aus dem Tumorblock, dem
sogenannten Spenderblock an Hand des vorher markierten Schnittes
Tumormaterial entnommen und auf den Empfängerblock übertragen. Wenn
acht Stanzen in einer Reihe waren, so wurde ein größerer Abstand
genommen und pro Reihe je eine Stanze einer Negativkontrolle eingefügt.
Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis der Empfängerblock voll war.
Wenn der Block fertig gestanzt war, wurde er auf einer Heizplatte für ca. 10
Minuten bei 55°C erwärmt, um eine Verbindung zwischen den eingefügten
Stanzen und dem Empfängerblock herzustellen. Zur Orientierung und
Zuordnung der Stanzen zu dem jeweiligen Fall wurden Tabellen mit der
Lokalisation und der Fallnummer erstellt. Beispielhaft ist dies in Abbildung 18
dargestellt.
53
1
9
3
2
5
9
7
1.5
1
9
3
2
5
9
7
1.5
1
10
3
1
5
10
7
2.4
1
10
3
1
5
10
7
2.4
2
5
4
4
6
II11
8
14
2
5
4
4
6
II11
8
14
2
6
4
6
6
II2
2
6
4
6
6
II2
GIST
GIST
Narbe
Narbe
Abbildung 15: Die fett gedruckten Zahlen stehen für die Fallnummer, die
Zahl darunter ist die Bezeichnung für den jeweiligen Block. Durchgestrichene
Felder bedeuten, dass von dem jeweiligen Fall nur ein Block vorhanden war
und die folgenden zwei Stanzen frei gelassen wurden. Rechts wurden die
Negativkontrollen aufgeführt, die zur besseren Orientierung durch einen
geringen Abstand von den Fällen abgehoben wurden.
2.3.7.2 Immunhistochemische Färbungen
Es wurden 2 µm dicke Schnitte von jedem TMA mit einem Microtom erstellt
und auf Objektträger übertragen. Alle Färbungen wurden mit dem
BenchMark ULTRA (Ventana, Tucson, USA) durchgeführt.
Diese wurden dann für die Färbung mit β-Catenin mit dem ULTRA Cell
Conditioner (CC1, Ventana, Tucson, USA) bei 95 °C für 8 Minuten
vorbehandelt und mit dem Maus-Antikörper für β-Catenin (BD, Piscataway,
USA; Verdünnung: 1:50; 14/β-catenin-Klon) für weitere 32 Minuten inkubiert.
Zuletzt erfolgte eine Gegenfärbung mit Hematoxylin Eosin (HE).
Für die immunhistochemische Färbung von Cyclin D1 mussten die Schnitte
zuerst mit dem Prep Kit # 61 behandelt werden und wurden folgend mit den
Kaninchen-Antikörper für Cyclin D1 bei 37°C für 32 Minuten (Neomarkers,
Fremont, USA; Verdünnung: 1:200, SP4-Klon) inkubiert. Es folgte eine
Gegenfärbung mit HE und ein Amplifizierungsschritt.
Für KI-67 erfolgte zuerst eine Behandlung mit CC1 für 52 Minuten bei 95 °C.
Darauf folgte die Antikörper Inkubation mit dem Klon MIB-1 (Dako, Glostrup,
Denmark; Verdünnung: 1:100, MIB-1 Klon) für 32 Minuten bei 37 °C. Zuletzt
wurden die Schnitte mit HE gegengefärbt.
Um die TMA-Schnitte mit den Antikörpern für ERα zu färben, mussten diese
zuerst 64 Minuten bei 95 °C mit CC1 vorbehandelt werden. Darauf folgte
54
eine Inkubationszeit von 20 Minuten bei 37 °C mit dem ERα-Antikörper
(Ventana, Tucson, USA; Verdünnung: Ready-to-use, SP1-Klon). Auch hier
wurde mit HE gegengefärbt.
Für die Immunhistochemische Färbung mit den Antikörpern für PR wurden
diese zuerst 64 Minuten bei 95 °C mit CC1 vorbehandelt und dann weitere
32 Minuten bei 37 °C mit dem Antikörper für PR (Leica Biosystems,
Nussloch, Deutschland; Verdünnung: 1:200, PGR 312/2-Klon) inkubiert.
Zuletzt wurden die Schnitte mit HE gegengefärbt.
Zudem wurden von jedem TMA eine HE-Färbung und eine Masson-GoldnerFärbung angefertigt.
2.3.7.3 Auswertung der TMAs
Im Vorfeld wurden die HE-Schnitte der TMAs begutachtet und hinsichtlich
der Qualität beurteilt. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei darauf gelegt,
ob Stanzen abgeschwemmt wurden, ob genügend Tumormaterial auf den
TMA übertragen wurde und ob Färbeartefakte vorhanden waren. Die
verschiedenen
immunhistochemischen
Färbungen
wurden
nach
verschiedenen Gesichtspunkten beurteilt. Es wurde immer darauf geachtet,
dass die Negativkontrollen unauffällig waren.
Für die mit den Antikörpern für β-catenin behandelten Schnitte wurde
zunächst eine Entscheidung darüber getroffen, ob die Anfärbung stärker
zytosolisch oder stärker nukleär lokalisiert ist, oder keinen Unterschied zeigt.
Zudem wurde beurteilt, ob die Anfärbung eher schwach (+), moderat (++),
oder stark (+++) ist. Zuletzt wurden pro Stanze 100 Zellen auf deren βcatenin–Positivität untersucht. So konnte der Prozentsatz an β-Catenin
positiven Zellen erfasst werden. Um Abweichungen zu minimieren wurde der
Mittelwert aus den auswertbaren Stanzen eines Falles gebildet.
Für die Antikörperfärbung mit Cylcin D1 und MIB-1 wurden ebenso 100
Zellen ausgezählt und hinsichtlich deren Positivität beurteilt. Auch hier wurde
die Prozentzahl positiver Zellen angegeben und der Mittelwert aus allen
Stanzen eines Falles gebildet. Für MIB-1 wurde wegen der geringen
Positivität ein Score etabliert. Je nach Anzahl MIB-1positiver Zellen wurden
55
die Tumore einer bestimmten Gruppe 1 bis 4, wie in Tabelle 24 beschrieben
zugeordnet.
Anzahl an MIB-1 positiven Zellen ≤1
von 100 Zellen
Score
1
2-5
6-10
>10
2
3
4
Tabelle 24: Definition MIB-1 Score
Die immunhistochemischen Färbungen der Hormonrezeptoren ER-α und PR
wurde auf positive Zellen untersucht. Es wurde begutachtet, ob die Stanzen
eines Falles Zellen enthalten, die für den jeweiligen Rezeptor positiv (+)
waren, oder negativ (-).
2.3.8. Statistische Auswertung
Alle statistischen Berechnungen und Graphiken wurden mit SPSS-19 (IBM,
Ehingen, Germany) erstellt.
Um metrische Daten der Immunhistochemie, der Mutationsanalysen und der
klinisch-pathologischen Daten zu evaluieren wurde der Kruskal-Walis Test
genutzt. Kategorische Daten wurden mit Chi-Quadrat Test und dem exakten
Test nach Fischer in Zusammenschau mit Kreuztabellen beurteilt.
Boxplots dienten als graphische Darstellung für den Vergleich von
metrischen und kategorischen Variablen. Das krankheitsfreie Überleben
wurde mit Hilfe der Kaplan-Meier Methode dargestellt.
56
3. Resultate
3.1 Charakterisierung des Kollektivs
3.1.1 Reevaluation des Kollektivs
Zu Beginn der Untersuchungen wurden die HE-Schnitte aller Fälle erneut
lichtmikroskopisch begutachtet um mögliche Fehldiagnosen auszuschließen.
Für jeden der Fälle konnte die in der Routinediagnostik getroffene Diagnose
DT bestätigt werden.
3.1.2 Primärtumor und Rezidiv
Von 56 Fällen von 40 Patienten handelte es sich bei 35 (62,5 %) Fällen um
den Primärtumor, während 21 (37,5 %) Fälle in Folge eines zuvor operativ
entfernten DTs wuchsen. Bei 7 Fällen von 4 Patienten stand nur ein Rezidiv
zur Verfügung, nicht jedoch der Primärtumor.
Primärtumor
Sekundärtumor/Rezidiv
Sekundärtumor ohne zur
Primärtumor
Gesamt
Verfügung
Fälle
36
20
stehenden 7
56
Patienten
36
10
4
40
Tabelle 25: Primär und Sekundärtumore
3.1.3 Geschlechter und Altersprävalenz
Von 35 Patienten mit Primärtumor handelte es sich bei 16 (44,4%) Patienten
um Männer und bei 20 (55,5%) um Frauen. Das mittlere Alter zum Zeitpunkt
der Operation lag bei Frauen bei 35,9 (+/- 16,1) Jahren und bei Männern bei
43,6 (+/- 26,12) Jahren. Das mittlere Alter beider Geschlechter lag bei 39,3
(+/- 21,19) Jahren.
57
Abbildung 16: Diagramm zur Altersverteilung innerhalb des Geschlechts
Wie unter 1.1.7 beschrieben wurde zudem die Zugehörigkeit der Patienten
zu den Altersgruppen nach Raitamo et al bestimmt. Drei (8,6 %) der 35
Patienten waren jünger als 15 Jahre. 20 (57,1 %) Patienten konnten der
fertilen Altersgruppe zugeordnet werden. Fünf (14,2 %) Patienten waren
zwischen 45 und 60 Jahren. Sieben (20,0 %) der Patienten wurden der
senescenten Altersgruppe zugeordnet.
3.1.4 Tumorlokalisation
Wie unter 1.1.3 beschrieben wurden die Tumore je nach Ihrer Lokalisation in
Extraabdominelle, Abdominelle, Intraabdominelle und mit FAP assoziierte
Tumore eingeteilt. 24 (68,8%) der primären DTs wuchsen an den
Extremitäten. Acht (22,9%) der Tumore entstanden an der Bauchdecke. Nur
drei (8,6%) Patienten entwickelten einen Tumor intraabdominell. Bei 3 (8,6
%) der Patienten wuchs der Tumor im Rahmen einer FAP. Von einem der
Patienten mit FAP stand uns jedoch nur das Rezidiv zur Untersuchung zur
Verfügung.
58
Abbildung 17: Diagramm zur Tumorlokalisation
3.1.5 Tumorgröße
Der kleinste Tumor hatte einen Durchmesser von 1,0 cm während der größte
Tumor einen Durchmesser von 20 cm erreichte. Der mittlere Durchmesser
aller Tumore lag bei 6,0 cm (+/- 4,46).
Abbildung 18: Diagramm zur Tumorgröße
3.1.6 Tumorentität
Mit Hilfe der Befunde und Fragebögen an die Hausärzte konnte ermittelt
werden, dass bei neun (16,1 %) der 56 Tumoren zuvor eine Operation, eine
Nävi-Exzision, oder andere Traumata mit Narbenbildung an der Stelle des
späteren
Tumorwachstums
stattgefunden
haben.
Diese
wurden
als
„cicatricial“, also „von Narbengewebe ausgehend“ bezeichnet.
59
Abbildung 19: Verteilung der Tumorentität
Bei zwei der Patientinnen wurde in der Vorgeschichte ein Kaiserschnitt
durchgeführt. Dies entspricht 10 % aller Tumore bei Frauen. Auf Grund der
geringen Fallzahlen wurde dies in die weitere Auswertung nicht mit
aufgenommen.
3.1.7 Immunhistochemische Eigenschaften
3.1.7.1 β-Catenin
Für die Färbung mit β-Catenin wurden lichtmikroskopisch verschiedene
Parameter begutachtet und evaluiert. Vier (7,1 %) der 56 Fälle konnten für βCatenin auf Grund der nicht ausreichenden Qualität der Stanzen nicht
evaluiert
werden.
Die
übrigen
52
Fälle
exprimierten
β-Catenin
in
unterschiedlich starkem Maße. Der prozentuale Anteil an β-Catenin positiven
Zellen über alle Fälle gemittelt lag bei 66,6 % (+/- 17,7 %).
60
Abbildung 20: Häufigkeitsverteilung der Tumore mit dem prozentualen
Anteil an β-Catenin positiven Zellen
Die Auswertung der Intensität der Anfärbung ergab für sechs (10,7 %) der
Tumore eine schwache Expression von β-Catenin, während 33 (58,9 %)
Tumore β-Catenin moderat exprimierten und 13 (23,2 %) Fälle eine starke
Expression von β-Catenin aufwiesen.
Die Auswertung der Lokalisation von β-Catenin in der Zelle ergab für acht
(14,3 %) Tumore eine vorwiegend nukleäre Expression von β-Catenin,
während bei 23 Patienten (41,1%) β-Catenin vorrangig im Zytosol lokalisiert
war. Bei 21 Tumoren (37,5 %) war β-Catenin in beiden Zellkompartimenten
gleichsam exprimiert.
3.1.7.2 Die Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1
3.1.7.2.1 Cyclin D1
Sieben der Fälle (12,5 %) konnten auf Grund der schlechten Qualität
hinsichtlich Cyclin D1 nicht ausgewertet werden. Alle übrigen Fälle
exprimierten Cyclin D1 in unterschiedlichem Maße. Im Mittel exprimierten
16,9% (+/- 17,1 %) der Zellen Cyclin D1.
61
Abbildung 21: Häufigkeitsverteilung der Tumore mit dem prozentualen
Anteil an Cyclin D1 positiven Zellen
3.1.7.2.2 MIB-1
Für die Immunhistochemische Färbung mit MIB-1 konnten sieben (12,5 %)
der 56 Fälle aus Qualitätsgründen nicht untersucht werden. Zur Beurteilung
wurde der unter 2.3.7.3 beschriebene Score verwendet. MIB-1 war in allen
Fällen positiv, jedoch in unterschiedlichem Maße. 35 (62,5 %) exprimierten
KI-67 gemäß dem Score 1. Neun (16,1 %) Tumore wurden dem Score 2
zugeordnet, 4 (7,1 %)Tumore dem Score 3 und nur ein (1,8%) Tumor wurde
dem Score 3 zugeordnet.
MIB-1 positive Zellen pro 100 Zellen
Score
Anzahl an Tumoren
≤1
1
35
2-5
2
9
6-10
3
4
>10
4
1
Tabelle 26: Häufigkeitsverteilung der Tumore in den Gruppen 1 bis 4
3.1.7.3 Die Steroidrezeptoren ERα und PR
3.1.7.3.1 Östrogen-Rezeptor α
Für ERα wurde entschieden, ob die Tumore den Rezeptor exprimierten, oder
nicht. In drei (5,6 %) Fällen war die Qualität der Stanzen nicht ausreichend,
um lichtmikroskopische Untersuchungen durchzuführen. 38 (67,9 %) Tumore
waren negativ für ERα, während 15 (26,8 %) Fälle ERα exprimierten.
3.1.7.3.2 Progesteron-Rezeptor
Der Progesteron-Rezeptor konnte in keinem der 56 untersuchten Fälle
nachgewiesen werden und ist somit aus den weiteren statistischen
Untersuchungen ausgeschlossen.
62
3.1.8 Mutationsstatus
Von allen 56 Tumorproben wurden Mutationsanalysen für das Exon 3 des
CTNNB1-Gens durchgeführt. Bei fünf (9,8 %) Fällen gelang die Analyse nur
unzureichend, da der DNA- Gehalt in der Probe zu gering war. Bei allen fünf
nicht analysierbaren Fällen handelte es sich um Primärtumore. Diese Fälle
wurden von den weiteren statistischen Analysen ausgeschlossen.
3.1.8.1 Häufigkeitsverteilung der Mutationen
Bei 18 (32,1%) Tumoren konnte keine Mutation im Exon 3 des CTNNB1Gens nachgewiesen werden. Diese Fälle wurden in unserem Kollektiv als Wt
bezeichnet. Bei 17 (30,4 %) Fällen handelte es sich um eine Mutation im
Codon 41, während in 15 (26,8 %) Tumoren eine Mutation in Codon 45
nachweisbar war. In einem (1,8 %) Fall konnte eine Mutation sowohl in
Codon 41, als auch in Codon 45 nachgewiesen werden.
Abbildung 22: Häufigkeitsverteilung der Mutationen
3.1.8.2 Beschreibung der Mutationen im Exon 3 des CTNNB1-Gens
Bei allen Mutationen im Codon 41 des CTNNB1-Gens handelte es sich um
Punktmutationen mit einem Ersatz von Adenin durch Guanin an Position 121
(c.121A>G). Dadurch entstand auf Protein-Ebene an Stelle der Aminosäure
Threonin Alanin (p.T41A).
In Codon 45 konnten drei verschiedene Mutationen nachgewiesen werden,
die mit unterschiedlicher Häufigkeit auftraten. Bei der häufigsten Mutation in
Codon 45 mit 11 Fällen (19,6 % des Gesamtkollektivs) handelte es sich um
eine Punktmutation bei der es durch den Austausch der Base Cytosin durch
Thymin an Position 134 (c.134C>T) zum Einbau von Phenylalanin an Stelle
63
von Serin kam (p.S45F). In drei Tumorproben (5,4 % des Gesamtkollektivs)
kam es zu einem Austausch von Thymin durch Cytosin an Position 133
(c.133T>C). Daraus resultierte der Einbau von Prolin an Stelle von Serin
(p.S45P). In einem (1,8 % des Gesamtkollektivs) der Tumore konnte eine
Deletion mit nachfolgender Insertion nachgewiesen werden. Der Verlust der
Basen Thymin und Cytosin an Position 133 und 134 führte zum Einbau
zweier Adenine (c.133_134delinsAA). Folglich wurde auf Proteinebene an
Stelle von Serin Asparagin eingebaut (p.S45N). Bei einem (1,8%) der Fälle
konnte eine Doppelmutation nachgewiesen werden. Bei der Tumorprobe war
sowohl eine Mutation an Codon 41 (p.T41A), als auch eine Mutation an
Codon 45 (p.S45F) nachweisbar. Alle Mutationen sind in Tabelle 27
aufgeführt.
64
Mutation auf DNA-Ebene
Codon
41
Kodierung auf
DNA- Ebene
c.121A>G
Codon 45
c.134C>T
c.133T>C
Doppelmutation
c.133_134delins
AA
c.121A>G;
c.134C>T
Veränderung in
der
Basenabfolge
ACT ACC ACA
ACT GCC ACA
CCT TCT CTG
CCT TTT CTG
CCT TCT CTG
CCT CCT CTG
CCT TCT CTG
CCT AAT CTG
ACT ACC ACA
ACT GCC ACA
CCT TCT CTG
CCT TTT CTG
Mutation auf Protein-Ebene
Kodierung
auf ProteinEbene
p.T41A
p.S45F
p.S45P
p.S45N
p.T41A;
p.S45F
Veränderung in
der Aminosäureabfolge
Thr Thr Thr
Thr Ala Thr
Pro-Ser-Leu
Pro-Phe-Leu
Pro Ser Leu
Pro-Pro-Leu
Pro Ser Leu
Pro-Asn-Leu
Thr Thr Thr
Thr Ala Thr
Pro-Ser-Leu
Pro-Phe-Leu
Tabelle 27: Beschreibung der Mutation im Exon 3 des CTNNB1-Gens, Die
Veränderung in der Basen-, bzw. Aminosäureabfolge ist rot gekennzeichnet.
Für die statistischen Untersuchungen des Mutationsstatus wurden die
Tumore nach ihrem Mutationstatus in drei Gruppen eingeteilt: Tumore, die an
Codon 41 mutiert sind, Tumore die an Codon 45 mutiert sind und Tumore mit
Wt-Status. Zudem wurde eine Einteilung in Tumore mit Mutation und Tumore
mit Wt-Status getroffen.
65
3.2 Vergleich der Tumorcharakteristika
Im
Folgenden
sollen
die
bereits
in
Kapitel
3.1
beschriebenen
Tumorcharakteristika miteinander verglichen und dargestellt werden. Die
folgenden Tests wurden, wenn nicht anders beschrieben nur mit den
Primärtumoren durchgeführt.
3.2.1 Geschlecht und Alter
Das mittlere Alter zum Zeitpunkt der Operation lag bei Frauen bei 35,9 (+/16,1) Jahren und bei Männern bei 43,6 (+/- 26,12) Jahren. Die jüngste
weibliche Patientin war 18 Jahre alt, die älteste Patientin war 81 Jahre zum
Zeitpunkt der Operation. Bei den männlichen Patienten reichte das
Erkrankungsalter von drei bis 79 Jahre. Es konnte auf diese Weise zuerst
kein Zusammenhang zwischen dem Alter bei der Operation und dem
Geschlecht nachgewiesen werden (T-test nach Fischer mit p=0,158).
Abbildung 23: Alter zum Zeitpunkt der OP im Vergleich mit dem Geschlecht
Im Vergleich mit den Altersgruppen zeigte sich jedoch, dass 16 (80 % der
Frauen) der 20 Frauen im fertilen Lebensalter waren zum Zeitpunkt der
Operation. Zwei Frauen konnten der Menopausalen und zwei Frauen der
Senescenten Altersgruppe zugeordnet werden. Keiner der juvenilen
Patienten war weiblich, während 3 männliche Patienten jünger als 15 Jahre
waren. Vier der männlichen Patienten konnten der fertilen, drei der
66
menopausalen und fünf der senescenten Altersgruppe zugeordnet werden.
Frauen erkranken demnach signifikant häufiger im fertilen Lebensalter an
einem DT, während bei Männern das Wachstum gleichmäßig auf die
Altersgruppen verteilt ist (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,01).
Abbildung 24: Häufigkeitsverteilung in den Altersgruppen nach Raitamo et
al.
3.2.2 Lokalisation und Tumorgröße
Die extraabdominell gelegenen DTs hatten im Mittel eine Größe von 6,5 cm
(+/- 5,11) und reichten von einem cm bis maximal 20 cm, während die
abdominellen Tumore eine mittlere Größe von 5,6 cm (+/- 2,00) erreichten.
Der kleinste abdominelle Tumor war 3 cm groß, der Größte 9 cm. Die
intraabdominellen Tumore hatten eine durchschnittliche Größe von 5,7 cm
(+/- 5,51) und reichten von 2 bis 12 cm. Die Tumorgröße ist unabhängig von
der Lokalisation des DTs (Kruskal-Wallis Test für unabhängige Stichproben
mit p=0,88).
67
Abbildung 25: Tumorgröße über die verschiedenen Lokalisationen
3.2.3 Lokalisation und Alter
Das mittlere Erkrankungsalter bei extraabdominellen Tumoren lag bei 41,8
Jahren (+/- 22,23). Die erkrankten Patienten waren zwischen 3 und 81
Jahren zum Zeitpunkt der Operation. Die abdominellen DTs wurden im Mittel
mit 34,5 Jahre (+/- 18,82) entfernt. Der jüngste Patient mit einem
abdominellen Tumor war 18 Jahre, der älteste Patient war 79 Jahre alt. Die
intraabdominellen DTs hatten ein mittleres Erkrankungsalter von 43,33
Jahren (+/-16,1) mit einer Alterszeitspanne von 27 bis 59 Jahren. Es konnte
kein Zusammenhang zwischen der Lokalisation und dem Erkrankungsalter
ermittelt werden (Kruskal-Wallis Test für unabhängige Stichproben mit
p=0,52)
68
Abbildung 26: Boxplot zum Alter im Zusammenhang mit der
Tumorlokalisation
Auch im Hinblick auf die Altersgruppen nach Raitamo et al im Vergleich mit
der Lokalisation konnte kein signifikanter Zusammenhang festgestellt werden
(Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p= 0,38).
Juvenil
Fertil
Menopausal
Senescent
Summe
Extraabdominell
Anzahl Anteil in
%
3
12,5
11
45,8
4
16,7
6
24
25,0
100
Abdominell
Anzah Anteil in
l
%
0
0
7
87,5
0
0
1
8
12,5
100
Intraabdominell
Anzahl Anteil in %
0
2
1
0
66,7
33,3
0
3
0
100
Tabelle 28: Lokalisation im Vergleich zur Altersgruppe
69
3.2.4 Lokalisation und Geschlecht
Von den 24 extraabdominellen DTs wuchsen zwölf bei männlichen und zwölf
bei weiblichen Patienten. Sieben der acht abdominellen Tumore waren von
Frauen, während nur einer aus der Bauchdecke eines Mannes entstammte.
Zwei der intraabdominellen Tumore wuchsen bei männlichen Patienten, ein
DT entstammte einer Frau. Die Tumorlokalisation ist somit nicht vom
Geschlecht abhängig (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,12).
männlich
weiblich
Summe
Extraabdominell
Anzahl Anteil in
%
12
50,0
12
50,0
24
100
Abdominell
Anzahl Anteil in
%
1
12,5
7
87,5
8
100
Intraabdominell
Anzahl
Anteil in
%
2
66,6
1
33,3
3
100
Tabelle 29: Lokalisation im Vergleich mit dem Geschlecht
3.2.5 Immunhistochemie und Alter
3.2.5.1 Alter und Immunhistochemie für β-Catenin
3.2.5.1.1 Alter und Anteil β-Catenin-positiver Zellen in Prozent
Juvenile Tumore exprimierten β-Catenin zwischen 14 % und 67 % mit einer
mittleren Expression von 48,3 % (+/- 29,7). Bei fertilen DTs reichte die
Expression von 42 % bis 90 % mit einer mittleren Positivität von 70,1 % (+/12,5). In menopausalen DTs konnte β-Catenin in 57 % bis 89 % der Zellen
nachgewiesen werden mit einem Mittelwert von 70,0 % (+/- 11,7). Bei DTs,
die in der senescenten Altersgruppe wuchsen lag die Expression zwischen
41 % und 72 % mit einer mittleren Positivität von 61,4 % (+/- 12,2). Der
Wachstumsort des DTs hat keinen signifikanten Einfluss auf die Expression
von β-Catenin (Kruskal-Wallis Test für unabhängige Stichproben mit p=
0,20).
70
Abbildung 27: Boxplot zur β-Catenin-positivität in Prozent im Vergleich mit
den Altersgruppen
3.2.5.1.2 Alter und Intensität der Anfärbung für β-Catenin
Während die DTs der juvenilen Patienten gleichsam mit je einem Fall den
Gruppen schwach, moderat und stark zugeordnet werden konnte, waren 16
der fertilen Tumore moderat anfärbbar und 4 stark anfärbbar. Vier der
Menopausalen DTs exprimierten β-Catenin moderat, ein Tumor exprimierte
es stark. Von den Tumoren die im senescenten Alter wuchsen, exprimierten
drei Tumore β-Catenin moderat und zwei DTs stark. Es konnte nur knapp
kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Intensität der Anfärbung für
β-Catenin und dem Alter ermittelt werden (Chi-Quadrat Test nach Pearson
mit p= 0,068).
71
schwach
Juvenil
Fertil
Menopausal
Senescent
Summe
An- Antei
zahl l in %
1
100
0
0
0
0
0
0
1
100
moderat
Anzahl
1
16
4
3
24
Anteil
in %
4,2
66,7
16,7
12,5
100
stark
Anzahl
1
4
1
2
8
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
0
0
0
0
2
100
2
100
Anteil
in %
12,5
50,0
15,2
25,0
100
Tabelle 30: Vergleich der Intensität der Anfärbung für β-Catenin im Vergleich
mit den Altersgruppen nach Raitamo et al.
3.2.5.1.3 Alter und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle
Während β-Catenin bei DTs der juvenilen Patienten ausschließlich im
Zytosol exprimiert war, konnte bei einem Großteil der fertilen Tumore kein
Unterschied zwischen der Lokalisation im Zytosol und im Nukleus festgestellt
werden. Die menopausalen DTs waren vorwiegend zytosolisch für β-Catenin
anfärbbar. Zwei der senescenten Tumore waren diesbezüglich nicht
auswertbar, ein Fall vorwiegend zytosolisch positiv und vier der Fälle waren
gleichsam nukleär und zytosolisch angefärbt. Während β-Catenin bei
juvenilen DTs ausschließlich im Zytosol lokalisiert war, war es mit
zunehmendem Alter gleichsam auf den Nukleus und das Zytosol verteilt (ChiQuadrat Test nach Pearson mit p=0,04).
Juvenil
Fertil
Menopausal
Senescent
Summe
Nukleär
Zytosolisch
Anzahl
0
2
1
0
3
Anzahl
3
6
3
1
13
Anteil
in %
0
66,7
33,3
0
100
Anteil
in %
23,1
46,2
23,1
7,7
100
Nukleär/
Zytosolisch
An- Anteil
zahl in %
0
0
12
70,6
1
5,9
4
23,5
17
100
Nicht
Auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
0
0
0
0
2
100
2
100
Tabelle 31: Lokalisation von β-Catenin in der Zelle im Vergleich mit den
Altersgruppen nach Raitamo et al.
72
3.2.5.2 Alter und Immunhistochemie für die Proliferationsmarker Cyclin
D1 und MIB-1
3.2.5.2.1 Alter und Cyclin D1
Die Positivität für Cyclin D1 lag bei Juvenilen Patienten zwischen 40 % und
66 % mit einem Mittelwert von 48,7 % (+/- 15,0) Bei fertilen Tumoren reichte
die Expression von 1 % bis 50 % mit einer mittleren Expression von 13,6 %
(+/- 14,7). Die menopausalen Tumore exprimierten Cyclin D1 zu 4 % bis 36
% mit einem Mittelwert 20,3 % (+/- 16,0). Bei senescenten Tumoren war
Cyclin D1 in 1 % bis 14 % der Zellen nachweisbar mit einer mittleren
Positivität von 3,6 % (+/- 5,8). Der Anteil an Cyclin D1 positiven Zellen war
am siginifkant höchsten in Juvenilen Tumoren und am geringsten in
senescenten Tumoren (Kruskal-Wallis Test für unabhängige Stichproben mit
p=0,01).
Abbildung 28: Boxplot zur Cyclin D1 Positivität in Prozent im Vergleich mit
den Altersgruppen nach Raitamo et al.
3.2.5.2.2 Alter und MIB-1 Score
Die
drei
juvenilen
und
vier
senescenten
DTs
exprimierten
MIB-1
ausschließlich zu maximal einem Prozent. 14 der Tumore die im fertilen Alter
wuchsen wurden dem Score 1, vier dem Score 2 und zwei dem Score 3
zugeordnet. Zwei der menopausalen DTs konnten dem Score 1 und ein
Tumor konnte dem Score 3 zugeordnet werden. Keiner der Primärtumore
exprimierte MIB-1 in mehr als 10 % der Zellen. Die Expression von MIB-1 ist
73
über alle Altersgruppen gleichmäßig verteilt (Chi-Quadrat Test nach Pearson
mit p= 0,55).
Score 1
Juvenil
Fertil
Menopausal
Senescent
Summe
Anzahl
3
14
2
4
23
Anteil
in %
13,0
60,9
8,7
16,7
100
Score 2
Anzahl
0
4
0
0
4
Score 3
Anteil
in %
0
100
0
0
100
Anzahl
0
2
1
0
3
Anteil
in %
0
66,7
33,3
0
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
0
0
2
40
3
60
5
100
Tabelle 32: MIB-1 Score im Vergleich mit den Altersgruppen nach Raitamo
et al.
3.2.5.3 Alter und Immunhistochemie für ERα
Zwei der drei juvenilen Tumore exprimierten ERα, sowie acht der 19 fertilen
Tumore. Alle menopausalen und senescenten DTs waren negativ für ERα.
ERα wurde demnach ausschließlich in der juvenilen und der fertilen
Altersgruppe exprimiert (Chi- Quadrat Test nach Pearson mit p= 0,048).
Juvenil
Fertil
Menopausal
Senescent
Summe
Negativ
Positiv
Anzahl Anteil in Anzahl
%
1
4,3
2
11
47,8
8
5
21,7
0
6
26,1
0
23
100
10
Anteil
%
20
80
0
0
100
Nicht auswertbar
in Anzahl Anteil in
%
0
0
1
50
0
0
1
50
2
100
Tabelle 33: ERα im Vergleich mit den Altersgruppen nach Raitamo et al.
3.2.6 Immunhistochemie und Geschlecht
3.2.6.1 Geschlecht und Immunhistochemie für β-Catenin
3.2.6.1.1 Geschlecht und Anteil β-Catenin- positiver Zellen in Prozent
Bei den männlichen Patienten reichte die Expression von β-Catenin von 14
% bis 89 % mit einer mittleren Positivität von 64,7 % (+/- 20,5). Bei den
weiblichen Patienten lag die Expression von β-Catenin zwischen 42 % und
89 % mit einem Mittelwert von 68,2 % (+/- 10,7). Die Expression von βCatenin war über die Geschlechter gleich verteilt (Mann- Whitney U-Test
unabhängiger Stichproben mit p = 0,98).
74
Abbildung 29: Boxplot zur β-Catenin Positivität im Vergleich mit dem
Geschlecht.
3.2.6.1.2 Geschlecht und Intensität der Anfärbung für β-Catenin
Während sieben der männlichen Patienten für β-Catenin moderat und fünf
stark anfärbbar waren, konnte es nur in einem Fall schwach positiv
nachgewiesen werden. Keiner der Tumore weiblicher Patienten konnte der
Gruppe der schwach anfärbbaren DTs zugeordnet werden, 17 waren
moderat und drei stark anfärbbar. Das Geschlecht nimmt keinen signifikanten
Einfluss auf die Expression von β-Catenin (Chi-Quadrat Test nach Pearson
mit p= 0,11).
schwach
männlich
weiblich
Summe
Anzahl
1
0
1
Anteil
in %
100
0
100
moderat
Anzahl
7
17
24
Anteil
in %
29,2
70,8
100
stark
Anzahl
5
3
8
Anteil
in %
62,5
37,5
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
2
100
0
0
2
100
Tabelle 34: Intensität der Anfärbbung von β-Catenin im Vergleich mit dem
Geschlecht
75
3.2.6.1.3 Geschlecht und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle
Zwei der Tumore von männlichen Patienten exprimierten β-Catenin im
Nukleus, sieben exprimierten es im Zytosol und vier gleichsam im Zytosol
und im Nukleus. Bei den weiblichen Patienten war β-Catenin bei einer
Patientin nur nukleär, bei 6 Patientinnen nur im Zytosol und bei 13
Patientinnen sowohl im Zytosol als auch im Nukleus exprimiert. Es konnte
kein Zusammenhang zwischen dem Geschlecht und der Lokalisation von βCatenin in der Zelle hergestellt werden (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit
p=0,15).
nukleär
männlich
weiblich
Summe
Anzahl
Anteil
in %
2
1
3
66,7
33,3
100
zytosolisch
Anzahl
Anteil
in %
7
6
13
53,8
46,2
100
Zytosolisch/
nukleär
An- Anteil
zahl
in %
4
13
17
23,5
76,5
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
2
0
2
100
0
100
Tabelle 35: Lokalisation von β-Catenin in der Zelle im Vergleich mit dem
Geschlecht
2.3.6.2 Geschlecht und Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1
2.3.6.2.1 Cyclin D1 und das Geschlecht
Die Expression von Cyclin D1 lag bei den männlichen Patienten bei 1 % bis
66 % mit einer mittleren Positivität von 20,1 % (+/- 23,5). Die weiblichen
Patienten exprimierten Cyclin D1 von 1 % bis zu 50 % mit einer mittleren
Positivität von 14,2 % (+/- 14,4). Das Geschlecht hat keinen signifikanten
Einfluss auf die Expression von Cyclin D1 (Mann-Whitney-U-Test für
unabhängige Stichproben mit p= 0,81).
76
Abbildung 30: Boxplot zur Cyclin D1 Positivität in Prozent im Vergleich mit
dem Geschlecht
2.3.6.2.2 MIB-1 und das Geschlecht
Neun der Fälle von männlichen Patienten waren zu weniger als 1 %, oder
genau zu 1 % Positiv und ein Fall konnte dem Score 3 zugeordnet werden.
Von den Fällen der weiblichen Patienten konnten 14 dem Score 1, vier dem
Score 2 und zwei dem Score 3 zugeordnet werden. Keiner der Primärtumore
konnte dem Score 3 zugeordnet werden. Es konnte kein signifikanter
Zusammenhang für den Proliferationsmarker MIB-1 im Vergleich mit dem
Geschlecht ermittelt werden (Chi-Quadrat nach Pearson mit p = 0,31).
Score 1
männlich
weiblich
Summe
Anzahl
9
14
23
Anteil
in %
13,0
60,9
100
Score 2
Anzahl
0
4
4
Anteil
in %
0
100
100
Score 3
Anzahl
1
2
3
Anteil
in %
0
66,7
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
5
0
0
0
5
100
Tabelle 36: MIB-1 Score im Vergleich mit dem Geschlecht
3.2.6.3 Geschlecht und ERα
Während nur drei der männlichen Patienten für ERα positiv waren, konnte
ERα bei sieben der Patientinnen nachgewiesen werden. Die statistische
Auswertung ergab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem
Geschlecht und ERα (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,34).
77
männlich
weiblich
Summe
Negativ
Anzahl Anteil in
%
11
47,8
12
52,2
23
100
Positiv
Anzahl Anteil in
%
3
30
7
70
10
100
Nicht auswertbar
Anzahl
Anteil in
%
1
50
1
50
2
100
Tabelle 37: ERα im Vergleich mit dem Geschlecht
3.2.7 Immunhistochemie und Lokalisation
3.2.7.1 Lokalisation und Immunhistochemie für β-Catenin
3.2.7.1.1 Lokalisation und Anteil β-Catenin positiver Zellen in Prozent
Von den extraabdominellen Tumoren waren im Mittel 66,4 % (+/- 15,4) der
Zellen positiv für β-Catenin. Die Expression reichte von 14 % bis 89 %. Die
Positivität der abdominellen Tumore reichte von 42 % bis 81 % mit einem
Mittelwert von 67,9 % (+/- 13,6 %). Intraabdominelle DTs exprimierten βCatenin von 46 % bis 90 % mit einer mittleren Positivität von 67,7 % (+/22,0). Die Lokalisation steht in keinem Zusammenhang mit der β-CateninExpression (Kruskal-Wallis-Test für unabhängige Stichproben mit p=0,92).
Abbildung 31: Boxplot zur β- Catenin Positivität in Prozent im Vergleich mit
der Lokalisation des Tumors
78
3.2.7.1.2 Lokalisation und Intensität der Anfärbung für β-Catenin
Von den extraabdominell gelegenen Tumoren war einer schwach, 16
moderat und fünf stark anfärbbar für β-Catenin. Die abdominellen Tumore
exprimierten β-Catenin in fünf Fällen moderat und in zwei Fällen stark. Die
intraabdominellen Tumore waren ausschließlich moderat anfärbbar. Die
Lokalisation spielt demzufolge keine Rolle für die Intensität der Färbung mit
den Antikörpern für β-Catenin (Chi Quadrat nach Pearson mit p =0,81).
schwach
Extraabdominell
abdominell
Intraabdominell
Summe
moderat
stark
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
Anzahl
Anteil
in %
Anzahl
Anteil
in %
Anzahl
Anteil
in %
1
100
16
66,7
5
71,4
2
100
0
0
5
20,9
2
28,6
0
0
0
0
3
12,5
0
0
0
0
1
100
24
100
7
100
2
100
Tabelle 38: Vergleich der Intensität der Anfärbung mit β-Catenin mit der
Lokalisation des Tumors
79
3.2.7.1.3 Lokalisation und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle
Von den extraabdominellen DTs war β-Catenin in zwei Fällen nur im Nukleus
exprimiert, bei 12 Fällen war es ausschließlich im Zytosol und bei neun
Fällen sowohl im Zytosol als auch im Nukleus nachweisbar. Die
abdominellen DTs exprimierten β-Catenin in einem Fall nur im Nukleus und
in sechs Fällen gleichsam im Zytosol und im Nukleus. Bei zwei der
intraabdominellen DTs konnte es sowohl im Nukleus als auch im Zytosol
angefärbt werden und bei einem ausschließlich im Nukleus. Die Lokalisation
von β-Catenin in der Zelle steht in keinem signifikantem Zusammenhang mit
der Lokalisation des DTs (Chi-Quadrat-Test nach Pearson bei p=0,16).
nukleär
Extraabdominell
abdominell
Intraabdominell
Summe
zytosolisch
Zytosolisch/
nukleär
An- Anteil
zahl
in %
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
Anzahl
Anteil
in %
Anzahl
Anteil
in %
2
66,7
12
92,3
9
52,9
1
100
1
33,3
0
0
6
35,3
1
0
0
0
1
7,7
2
11,8
0
0
3
100
13
100
17
100
2
100
Tabelle 39: Vergleich der Lokalisation von β-Catenin in der Zelle im
Vergleich mit der Lokalisation des Tumors
3.2.7.2 Lokalisation und Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1
3.2.7.2.1 Cyclin D1 und die Lokalisation
Die extraabdominellen Tumore waren im Mittel zu 16,84 % (+/- 19,3) positiv
für Cyclin D1. Die Expression reichte von 1 % bis 66 %. Die abdominellen
DTs erwiesen sich zu 1 % bis 37 % als positiv für Cyclin D1 mit einem
Mittelwert von 17,9 % (+/- 14,7). Bei den intraabdominellen DTs waren 1%
bis 36% der Zellen positiv für Cyclin D1 mit einer mittleren Positivität von
12,7
%
(+/-
20,1).
Tumorlokalisation
Die
abhängig
Cyclin
D1-Expression
(Kruskal-Wallis
Test
ist
nicht
für
von
der
unabhängige
Stichproben mit p=0,76)
80
Abbildung 32: Boxplot zur Expression von Cyclin D1 in Prozent und der
Lokalisation des Tumors
3.2.7.2.2 MIB-1 und die Lokalisation
Von den extraabominell gewachsenen DTs exprimierten 15 MIB-1 sehr
gering und wurden dem Score 1 zugeordnet, zwei wurden dem Score 2 und
drei dem Score 3 zugeordnet. Die abdominellen Tumore waren mit sechs
Fällen dem Score 1 und mit einem Fall dem Score 2 zugeordnet. Von den
intraabdominellen DTs wurden zwei dem Score 1 und einer dem Score zwei
zugeordnet. Die Tumorlokalisation nimmt keinen Einfluss auf die MIB1Expression (Chi-Quadrat nach Pearson bei p=0,61).
Score 1
Extraabdominell
Abdominell
Intraabominell
Summe
Score 2
Score 3
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
Anzahl
Anteil
in %
Anzahl
Anteil
in %
Anzahl
Anteil
in %
15
65,2
2
50
3
100
4
80
6
26,1
1
25
0
0
1
20
2
8,7
1
25
0
0
0
0
23
100
4
100
3
100
5
100
Tabelle 40: MIB-1 Score im Vergleich mit der Lokalisation des Tumors
81
3.2.7.3 Lokalisation und ERα
Von den extraabdominell gewachsenen DTs exprimierten vier ERα, während
18 negativ für ERα waren. In fünf der abdominellen DTs konnte ERα
nachgewiesen werden, drei waren diesbezüglich negativ. Zwei der drei
intraabominellen Tumore waren negativ für ERα. Die Tumorlokalisation steht
in keinem signifikanten Zusammenhang mit der ERα-Expression (ChiQuadrat Test nach Pearson mit p=0,20).
Negativ
Anzahl Anteil in
%
Extraabdominell
abdominell
Intraabdominell
Summe
Positiv
Anzahl Anteil in
%
Nicht auswertbar
Anzahl Anteil in
%
18
78,3
4
40
2
100
3
13,0
5
50
0
0
2
8,7
1
10
0
0
23
100
10
100
2
100
Tabelle 41: ERα-Expression im Vergleich mit der Lokalisation des Tumors
3.2.8 Immunhistochemie und Tumorgröße
3.2.8.1 Tumorgröße und Immunhistochemie für β-Catenin
3.2.8.1.1 Tumorgröße und Anteil β-Catenin-positiver Zellen in Prozent
Die DTs mit einem Durchmesser < 2cm exprimierten β-Catenin zu 64 % bis
81 % mit einer mittleren Positivität von 71,3 % (+/- 8,7). Bei einem
Durchmesser zwischen 2 cm und 5 cm war die Positivität zwischen 14 % und
90 % mit einem Mittelwert von 58,6 % (+/- 18,5). Die Tumore von 5 cm bis 10
cm waren im Mittel zu 72,3 % (+/- 12,5) positiv für β-Catenin. Der Anteil
positiver Zellen reichte von 41 % bis 89 %. DTs mit einem Durchmesser >10
cm exprimierten β-Catenin zu 58 % bis 80 % mit einem mittleren Anteil
positiver Zellen von 69,8 % (+/- 8,3). Die Expression von β-Catenin nimmt in
unserem Kollektiv keinen signifikanten Einfluss auf die Tumorgröße (KruskalWallis Test für unabhängige Stichproben mit p= 0,076).
82
Abbildung 33: Vergleich der β-Catenin Positivität in Prozent mit der
Tumorgröße
3.2.8.1.2 Tumorgröße und Intensität der Anfärbung für β-Catenin
Von den Tumoren mit einem Durchmesser < 2 cm war einer moderat
anfärbbar und zwei stark anfärbbar. Die 2-5 cm großen Tumore exprimierten
β-Catenin in 11 Fällen moderat und in einem Fall stark. Von den 5-10 cm
großen Tumoren exprimierte einer β-Catenin schwach, sieben weitere
moderat und vier stark. Von den sechs Tumoren mit einem Durchmesser >
10 cm konnte einer stark und fünf moderat angefärbt werden. Die Intensität
der Immunhistochemischen Färbung für β-Catenin ist nicht abhängig von der
Tumorgröße (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,28).
schwach
< 2 cm
2-5 cm
5-10 cm
> 10 cm
Summe
Anzahl
0
0
1
0
1
Anteil
in %
0
0
100
0
100
moderat
Anzahl
1
11
7
5
24
Anteil
in %
4,2
45,8
29,2
20,8
100
stark
Anzahl
2
1
4
1
8
Anteil
in %
25
12,5
50
12,5
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
1
50
1
50
0
0
2
100
Tabelle 42: Vergleich der Intensität der Anfärbung mit β-Catenin mit der
Tumorgröße
83
3.2.8.1.3 Tumorgröße und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle
In zwei der drei Tumore mit einem Durchmesser < 2 cm war β-Catenin
vorwiegend im Zytosol lokalisiert; der dritte Tumor exprimierte es vorwiegend
nukleär. Bei den 2-5 cm großen DTs war β-Catenin bei einem Fall
vorwiegend im Nukleus, bei fünf Fällen vorwiegend im Zytosol und bei sechs
Fällen gleichsam im Zytosol und im Nukleus lokalisiert. Von den 5-10 cm
großen DTs konnte β-Catenin bei einem hauptsächlich im Nukleus, bei vier
Tumoren hauptsächlich im Zytosol und bei sieben Tumoren sowohl im
Zytosol als auch im Nukleus nachgewiesen werden. Von den Tumoren mit
einem Durchmesser größer als 10 cm exprimierten zwei β-Catenin
vorwiegend im Zytosol, vier Tumore exprimierten es sowohl im Zytosol als
auch im Nukleus. Die Lokalisation von β-Catenin in der Zelle hat keinen
Einfluss auf die Tumorgröße (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p = 0,72).
nukleär
<2 cm
2-5 cm
5-10 cm
>10 cm
Summe
Anzahl
1
1
1
0
3
Anteil
in %
33,3
33,3
33,3
0
100
zytosolisch
Anzahl
2
5
4
2
13
Anteil
in %
15,4
38,5
30,8
15,4
100
Zytosolisch/
nukleär
AnAnteil
zahl
in %
0
0
6
35,3
7
41,2
4
23,5
17
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
1
50
1
50
0
0
2
100
Tabelle 43: Lokalisation von β-Catenin in der Zelle im Vergleich mit der
Tumorgröße
84
3.2.8.2 Tumorgröße und Immunhistochemie für die Proliferationsmarker
Cyclin D1 und MIB-1
3.2.8.2.1 Die Expression von Cyclin D1 im Vergleich mit der Tumorgröße
Die Tumore mit einem Durchmesser < 2 cm exprimierten Cyclin D1 zu 21 %
bis 40 % mit einem Mittelwert von 30,5 % (+/- 13,4). In den Fällen mit einer
Größe von 2-5 cm war Cyclin D1 im Mittel in 18,9 % (+/- 22,0) der Zellen
nachweisbar mit einer Nachweisbreite von 1 % bis 66 %. Die 5-10 cm großen
DTs waren zu 1 % bis 40 % positiv für Cyclin D1. Der Mittelwert betrug 13,4
% (+/- 15,9). Bei den DTs > 10 cm lag die mittlere Expression bei 11,3 % (+/12,9) und reichte von 1% bis 36%. Die Expression von Cyclin D1 hat in
unserem Kollektiv keinen Einfluss auf die Tumorgröße (Kruskal-Wallis für
unabhängige Stichproben mit p =0,48).
Abbildung 34: Boxplot zur Cyclin D1 Expression und der Tumorgröße
3.2.8.2.2 MIB-1-Score im Vergleich mit der Tumorgröße
Die DTs mit einem Durchmesser > 2cm wurden in einem Fall dem Score 1
und in zwei Fällen dem Score 2 zugeordnet. Von den 2-5 cm großen
Tumoren konnten acht Fälle dem Score 1, zwei Fälle dem Score 2 und nur
ein Fall dem Score 3 zugeordnet werden. Die 5-10 cm großen DTs
exprimierten MIB-1 in neun Fällen zu weniger als 1 % und in einem Fall zu 25 %. Auch die Tumore > 10 cm wurden mit fünf Fällen dem Score 1 und mit
85
nur einem Fall dem Score zwei zugeordnet. Keiner der DTs > 5 cm
exprimierten MIB-1 zu mehr als 5 %. Zudem konnte keiner der Primärtumore
dem Score 4 zugeordnet werden. Es zeigte sich, dass die Tumore größer 5
% weniger MIB-1 exprimierten, als die kleinen Tumore (Kruskal-Wallis Test
für unabhängige Stichproben mit p= 0,04).
< 2cm
2-5 cm
5-10 cm
> 10 cm
Summe
Score 1
Score 2
Score 3
Anzahl
1
8
9
5
23
Anzahl
0
2
1
1
4
Anzahl
2
1
0
0
3
Anteil
in %
4,3
34,8
39,1
21,7
100
Anteil
in %
0
50,0
25,0
25,0
100
Anteil
in %
66,7
33,3
0
0
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
4
80
1
20
0
0
0
0
5
100
Tabelle 44: Immunhistochemie für MIB-1 im Vergleich mit der Tumorgröße
3.2.8.3 Tumorgröße im Vergleich mit der Expression von ERα
Alle drei der Tumore < 2 cm waren negativ für ERα. Von den 2-5 cm großen
DTs waren je sechs positiv und sechs negativ. Acht der 5-10 cm großen
Tumore exprimierten kein ERα, vier davon exprimierten den Rezeptor. Alle
Tumore > 10 cm waren negativ für ERα. Es zeigte sich kein signifikanter
Zusammenhang zwischen der ERα-Expression und der Tumorgröße (ChiQuadrat Test nach Pearson mit p=0,10).
< 2cm
2-5 cm
5-10 cm
> 10 cm
Summe
Negativ
Anzahl Anteil in
%
3
13,0
6
26,1
8
34,8
6
26,1
23
100
Positiv
Anzahl
Anteil in
%
0
0
6
60
4
40
0
0
10
100
Nicht auswertbar
Anzahl
Anteil in
%
0
0
1
50
1
50
0
0
2
100
Tabelle 45: Tumorgröße im Vergleich mit der Expression von ERα
86
3.2.9 Immunhistochemie und Tumorentität
3.2.9.1 Tumorentität und Immunhistochemie für β-Catenin
3.2.9.1.1 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der βCatenin-Positivität in Prozent
Die Tumore, bei denen in der Krankengeschichte eine Narbe als
Ursprungsort nachgewiesen werden konnte exprimierten β-Catenin von 62 %
bis 77 % mit einer mittleren Expression von 70,0 % (+/- 5,6 %). Die anderen
DTs waren im Mittel zu 66,1 % (+/- 16,5) positiv für β- Catenin. Der Anteil
positiver Zellen reichte von 14 % bis 90 %. Der Ursprung aus Narbengewebe
nimmt keinen signifikanten Einfluss auf die β-Catenin-Expression (KruskalWallis Test für unabhängige Stichproben mit p=0,77).
Abbildung 35: Boxplot zur Expression von Cyclin D1 in Prozent im Vergleich
mit der Entität.
3.2.9.1.2 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Intensität der Anfärbung für β-Catenin
Von den von Narbengewebe ausgehenden DTs waren vier moderat und zwei
stark anfärbbar. Die übrigen Tumore konnten mit einem Fall der Gruppe der
schwach anfärbbaren, mit 20 Fällen den moderat anfärbbaren und mit sechs
Fällen den stark anfärbbaren DTs zugeordnet werden. Auch die Intensität der
Anfärbung von β-Catenin ist nicht abhängig von der Tumorentität aus
Narbengewebe (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p= 0,78).
87
schwach
cicatricial
Noncicatricial
Summe
moderat
stark
Anzahl
0
1
Anteil
in %
0
100
Anzahl
4
20
Anteil
in %
16,7
83,3
Anzahl
2
6
Anteil
in %
0,25
0,75
1
100
24
100
8
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
2
100
0
0
2
100
Tabelle 46: Vergleich der Intensität der Anfärbung für β-Catenin mit der
Entität
3.2.9.1.3 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Lokalisation von β-Catenin in der Zelle
Von den DTs mit einer Narbe in der Vorgeschichte war einer zytosolisch für
β-Catenin anfärbbar und fünf gleichsam zytosolisch wie nukleär. Die DTs
ohne eine Narbe in der Vorgeschichte waren in drei Fällen nukleär, in zwölf
Fällen zytosolisch und in zwölf Fällen gleichsam zytosolisch, wie nukleär
anfärbbar für β-Catenin. Der Ursprung aus Narbengewebe nimmt keinen
Einfluss auf die Lokalisation von β-Catenin in der Zelle (Chi-Quadrat Test
nach Pearson mit p= 0,22).
nukleär
cicatricial
Noncicatricial
Summe
Anzahl
0
3
Anteil
in %
0
100
3
100
zytosolisch
Anzahl
1
12
Anteil
in %
7,7
92,3
13
100
Zytosolisch/
nukleär
AnAnteil
zahl
in %
5
29,4
12
70,6
17
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
2
100
0
0
2
100
Tabelle 47: Vergleich der Lokalisation von β-Catenin in der Zelle mit der
Entität
3.2.9.2 Tumorentität und Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1
3.2.9.2.1 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Immunhistochemie für Cyclin D1
Die DTs mit einer Narbe am Entstehungsort in der Krankengeschichte waren
zu 1 % bis 50 % positiv für β-Catenin mit einer mittleren Positivität von 21,8
% (+/- 20,0 %). Die Expression von Cyclin D1 reichte in den übrigen
Tumoren von 1 % bis 66 % mit einem Mittelwert von 14,7 % (+/- 17,3 %). Die
88
Cyclin D1 Expression steht in keinem signifikantem Zusammenhang mit der
Tumorentität (Kruskal-Wallis Test für unabhängige Stichproben mit p=0,49).
Abbildung 36: Boxplot zur Expression von Cyclin D1 in Prozent im Vergleich
mit der Tumorentität
3.2.9.2.2 Abstammung von Narbengewebe im Vergleich mit der
Immunhistochemie für MIB-1
Alle Tumore die von Narbengewebe abstammen wurden dem Score 1
zugeordnet. Die übrigen DTs wurden ebenso mit 17 Fällen dem Score 1, mit
4 Fällen dem Score 2 und mit 3 Fällen dem Score 3 zugeordnet. Die
Tumorentität hatte in unserem Kollektiv keinen Einfluss auf die MIB-1
Expression (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,32).
Score 1
cicatricial
Noncicatricial
Summe
Score 2
Score 3
Anzahl
6
17
Anteil
in %
26,1
73,9
Anzahl
0
4
Anteil
in %
0
100
Anzahl
0
3
Anteil
in %
0
100
23
100
4
100
3
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
2
100
5
100
Tabelle 48: MIB-1 Score im Vergleich mit der Tumorentität
89
3.2.9.3 Tumorentität im Vergleich mit der Expression von ERα
Zwei der Sechs von Narbengewebe aushenden DTs waren Negativ für ERα,
vier waren positiv. Acht der übrigen DTs exprimierten ERα, während es in 19
Tumoren
nicht
exprimiert
wurde.
Es
konnte
kein
signifikanter
Zusammenhang zwischen der Tumorentität und der Expression von ERα
nachgewiesen werden (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,86).
cicatricial
Noncicatricial
Summe
Negativ
Anzahl Anteil in
%
4
17,4
19
82,6
23
Positiv
Anzahl Anteil in
%
2
20
8
80
100
10
100
Nicht auswertbar
Anzahl
Anteil in
%
0
0
2
100
2
100
Tabelle 49: Vergleich der Expression von ERα mit der Tumorentität
3.2.10 Mutationsstatus und Alter
Das Alter zum Zeitpunkt der Operation von Patienten mit einer Mutation an
Codon 41 reichte von 18 bis 81 Jahre mit einem mittleren Erkrankungsalter
von 45,4 (+/- 22,9) Jahren. Patienten mit einer Mutation an Codon 45 wurden
im Mittel mit 35,0 (+/- 18,0) Jahren operiert. Der jüngste Patient war 18 Jahre
alt, der älteste war 75 Jahre. Insgesamt lag das Alter der Patienten mit einem
mutierten Tumor zwischen 12 und 81 Jahren mit einem mittleren Alter zum
Zeitpunkt der Operation von 40,9 (+/- 21,1) Jahren. Die Patienten ohne
Mutation waren zwischen drei und 69 Jahre alt zum Zeitpunkt der Operation.
Das mittlere Alter zum Zeitpunkt der Operation betrug 34,7 (+/- 23,4) Jahre.
Der Mutationsstatus steht in keinem signifikanten Zusammenhang mit dem
Alter zum Zeitpunkt der Operation (Kruskal-Wallis Test für unabhängige
Stichproben mit p=0,53 und p=0,74).
90
Abbildung 37: Boxplot zum Vergleich des Mutationsstatus mit dem Alter
zum Zeitpunkt der Operation
Auch für den Mutationsstatus im Vergleich mit den Altersgruppen nach
Raitamo et al konnte kein signifikantes Ergebnis ermittelt werden (ChiQuadrat Test nach Pearson mit p=0,24 und p= 0,10). Von den DTs mit einer
Mutation an Codon 41 waren acht der Patienten im fertilen, einer im
menopausalen, und vier im senescenten Lebensalter. Von den Patienten mit
einer Mutation an Codon 45 waren sieben Patienten in der fertilen
Altersgruppe und je ein Patient in der juvenilen, ein Patient in der
menopausalen und ein Patient in der senescenten Altersgruppe. In Summe
war nur einer der juvenilen DTs mutiert, 15 der fertilen, zwei der
menopausalen und 5 der senescenten. Die DTs ohne Mutation konnten mit
zwei Fällen der juvenilen, mit zwei Fällen der fertilen, mit zwei Fällen der
menopausalen und mit einem Fall der senescenten Altersgruppe zugeordnet
werden.
Juvenil
Fertil
Menopausal
Senescent
Summe
Codon 41
Codon 45
Wildtyp
Anz
ahl
0
8
1
4
13
Anzahl
1
7
1
1
10
Anzahl
2
2
2
1
7
Anteil
in %
0
61,5
7,7
30,8
100
Anteil
in %
10,0
70,0
10,0
10,0
100
Anteil
in %
28,6
28,6
28,6
14,3
100
Nicht
Auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Tabelle 50: Vergleich des Mutationsstatus mit den Altersgruppen nach
Raitamo et al.
91
3.2.11 Mutationsstatus und Geschlecht
Die männlichen Patienten waren gleichsam mit je fünf Fällen an Codon 41
und an Codon 45 mutiert und 5 weitere waren Wt. Insgesamt hatten zehn der
männlichen Patienten einen mutierten DT. Die Tumore die von weiblichen
Patienten stammten waren mit acht Fällen an Codon 41 mutiert und mit 5 an
Codon 45. Demzufolge waren 13 der DTs, die Frauen entnommen wurden
mutiert. In nur zwei Fällen konnte keine Mutation nachgewiesen werden. Das
Geschlecht spielt jedoch keine Rolle für den Mutationsstatus in unserem
Kollektiv (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,37 und p=0,20).
Codon 41
Männlich
Weiblich
Summe
Anzahl
5
8
13
Anteil
in %
38,5
61,5
100
Codon 45
Anzahl
5
5
10
Anteil
in %
50,0
50,0
100
Wildtyp
Anzahl
5
2
7
Anteil
in %
71,4
28,6
100
Nicht
Auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
0
0
0
0
Tabelle 51: Mutationsstatus im Vergleich mit dem Geschlecht
3.2.12 Mutationsstatus und Tumorgröße
Tumore mit einer Mutation an Codon 41 reichten von 1,0 cm bis 12,0 cm mit
einem mittleren Durchmesser von 5,6 (+/- 2,9). Die DTs mit einer Mutation an
Codon 45 waren im Mittel 9,5 (+/- 5,0) cm groß. Deren Durchmesser reichte
von 3,0 cm bis 20,0 cm. Insgesamt hatten die mutierten DTs einen
Durchmesser von 1,0 cm bis 20,0 cm mit einem Mittelwert von 7,4 (+/- 4,5)
cm. Wt- Tumore hatten einen Durchmesser von 1,0 bis 7,0 cm. Der
Mittelwert betrug 3,1 (+/-1,9). Den Berechnungen zu Folge sind mutierte DTs
signifikant größer als Wt-Tumore, wobei die an Codon 45 mutierten Tumore
den größten Durchmesser erreichen (Kruskal-Wallis Test für unabhängige
Stichproben mit p=0,008 und p=0,009).
92
Abbildung 38: Boxplot zum Vergleich des Mutationsstatus mit der
Tumorgröße
3.2.13 Mutationsstatus und Tumorlokalisation
Von den DTs, die an Codon 41 mutiert sind, waren sechs extraabdominell,
fünf abdominell und zwei intraabdominell gelegen. Die an Codon 45
mutierten Tumore wurden in sieben Fällen zu den extraabominellen und in
drei Fällen zu den abdominellen Tumoren gezählt. Insgesamt wuchsen von
den mutierten DTs 13 extraabdominell, acht abdominell und zwei
intraabdominell. Sechs der Tumore ohne Mutation waren abdominell
lokalisiert und ein DT lag intraabdominell. Der Mutationsstatus steht in
keinem statistisch nachweisbaren Zusammenhang mit der Tumorlokalisation
(Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,26 und p=0,19)
Codon 41
Extraabdominell
abdominell
Intraabdominell
Summe
Codon 45
Wildtyp
Nicht
Auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
Anzahl
6
Anteil
in %
46,2
Anzahl
7
Anteil
in %
70,0
Anzahl
6
Anteil
in %
85,7
5
2
38,5
15,4
3
0
30,0
0
0
1
0
14,3
0
0
0
0
13
100
10
100
7
100
0
0
Tabelle 52: Mutationsstatus im Vergleich mit der Tumorlokalisation
93
3.2.14 Mutationsstatus und Tumorentität
Von den DTs mit einer Mutation an Codon 41 stammten drei von
Narbengewebe
ab,
während
für
10
DTs
keine
Narbe
in
der
Krankengeschichte bekannt war. Die an Codon 45 Mutierten Tumore
standen in einem Fall mit Narbengewebe in Zusammenhang, in Neun Fällen
war keine Narbe in der Krankengeschichte nachweisbar. Insgesamt
stammten vier der mutierten DTs von Narbengewebe ab, während für 19
Tumore keine Narbe in der Vorgeschichte bekannt war. Keiner der Sieben
Wt-Tumore stammte von einer Narbe ab. Es konnte kein Zusammenhang
zwischen dem Mutationsstatus und der Abstammung von Narbengewebe
nachgewiesen werden (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,33 und
p=0,24).
Codon 41
Cicatricial
Noncicatricial
Summe
Codon 45
Wildtyp
Anzahl
3
10
Anteil
in %
23,1
76,9
Anzahl
1
9
Anteil
in %
10,0
90,0
Anzahl
0
7
Anteil
in %
0
100
13
100
10
100
7
100
Nicht
Auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
0
0
0
0
Tabelle 53: Mutationsstatus im Vergleich mit der Abstammung von
Narbengewebe
3.2.15 Mutation und Immunhistochemie
3.2.15.1 Mutation und Immunhistochemie für β-Catenin
3.2.15.1.1 Mutation und Anteil β-Catenin positiver Zellen in Prozent
Die Expression von β-Catenin reichte in den Tumoren mit einer Mutation an
Codon 41 von 41 % bis 90 % mit einer mittleren Expression von 68,9 % (+/12,6). Die Tumore mit einer Mutation an Codon 45 waren von 42 % bis 89 %
positiv für β-Catenin mit einem Mittelwert von 72,5 % (+/-13,4). Alle mutierten
Tumore exprimierten demzufolge β-Catenin von 41% bis 90% mit einem
mittleren Anteil positiver Zellen von 70,6 % (+/-12,8). Die Wt-Tumore waren
zu 14 % bis 78 % positiv für β- Catenin. Der Mittelwert betrug 54,5 % (+/22,6). Für den Mutationsstatus im Vergleich mit dem Anteil β-Catenin
positiver Zellen kann eine Tendenz vermutet werden, es zeigte sich jedoch
94
kein signifikantes Ergebnis (Kruskal-Wallis für unabhängige Stichproben mit
p=0,130 und p=0,07).
a
b
Abbildung 39: a) Boxplot zur β-Catenin-Positivität in Prozent im Vergleich
mit den Mutationen an Codon 41, Codon 45 und Wt b) Boxplot zur βCatenin-Positivität in Prozent im Vergleich mit mutierten und Wt-Tumoren.
3.2.15.1.2 Mutation und Intensität der Anfärbung für β-Catenin
Von den an Codon 41 mutierten Tumore waren neun moderat anfärbbar und
einer stark anfärbbar. Die DTs mit einer Mutation an Codon 45 exprimierten
β-Catenin in einem Fall schwach, in sechs Fällen moderat und in drei Fällen
stark. Insgesamt waren die mutierten Tumore demzufolge in einem Fall stark,
in 15 Fällen moderat und in sechs Fällen stark anfärbbar. Die DTs ohne eine
nachweisbare Mutation in unserem Kollektiv exprimierten β-Catenin in fünf
Fällen moderat und in einem Fall stark. Es konnte kein signifikanter
Zusammenhang zwischen der Intensität der Anfärbung für β-Catenin und
dem Mutationsstatus nachgewiesen werden (Chi Quadrat nach Pearson mit
p=0,66 und p=0,73).
95
schwach
Codon 41
Codon 45
Wildtyp
Summe
Anzahl
0
1
0
1
Anteil
in %
0
100
0
100
moderat
Anzahl
9
6
5
20
Anteil
in %
45,0
30,0
25,0
100
stark
Anzahl
3
3
1
7
Anteil
in %
42,9
42,9
14,3
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
1
50
0
0
1
50
2
100
Tabelle 54: Intensität der Anfärbung für β-Catenin im Vergleich mit dem
Mutationsstatus
3.2.15.1.3 Mutation und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle
Bei den DTs mit einer Mutation an Codon 41 war β-Catenin in zwei Fällen
vorwiegend nukleär, in einem Fall vorwiegend zytosolisch und in neun Fällen
gleichermaßen zytosolisch und nukleär lokalisiert. Die an Codon 45 mutierten
Tumore exprimierten β-Catenin in einem Fall vorwiegen nukleär in drei Fällen
vorwiegend zytosolisch und in sechs Fällen gleichsam zytosolisch wie
nukleär. Demzufolge wurden die mutierten DTs insgesamt mit drei Fällen den
nukleär anfärbbaren DTs, mit vier Fällen den zytosolisch anfärbbaren DTs
und mit 15 Fällen den gleichsam zytosolisch und nukleär anfärbbaren DTs
zugeordnet. Die Wt-Tumore exprimierten β-Catenin mit sechs Fällen
ausschließlich im Zytosol (Chi-Quadrat Test nach Pearson mit p=0,001 und
p=0,005).
Codon 41
Codon 45
Wildtyp
Summe
nukleär
zytosolisch
Anzahl
2
1
0
3
Anzahl
1
3
6
10
Anteil
in %
66,7
33,3
0
100
Anteil
in %
10,0
30,0
60,0
100
Zytosolisch/
nukleär
AnAnteil
zahl in %
9
60,0
6
40,0
0
0
15
100
Nicht
auswertbar
AnAnteil
zahl in %
1
50
0
0
1
50
2
100
Tabelle 55: Lokalisation von β-Catenin in der Zelle im Vergleich mit dem
Mutationsstatus
96
3.2.15.2 Mutation und Immunhistochemie für die Proliferationsmarker
Cyclin D1 und MIB-1
3.2.15.2.1 Mutation und Immunhistochemie für Cyclin D1
Die DTs mit einer Mutation an Codon 41 waren zu 1 % bis 37 % positiv für βCatenin mit einer mittleren Positivität von 13,4 % (+/- 15,0). Die Expression
von β-Catenin reichte bei den an Codon 45 mutierten DTs von 1 % bis 40 %
und betrug im Mittel 11,7 % (+/- 14,2). In Summe reichte die Anzahl βCatenin positiver Zellen bei allen mutierten DTs von 1 % bis 40 % mit einem
Mittelwert von 12,6 % (+/- 14,3). Die Wt-Tumore exprimierten β-Catenin zu 1
% bis 66 % mit einer mittleren Expression von 27,4 % (+/- 26,9). Der
Mutationsstatus
steht
in
unserer
Studie
in
keinem
signifikantem
Zusammenhang mit der Cyclin-D1-Expression (Kruskal-Wallis Test für
unabhängige Stichproben mit p=0,43 und p=0,22).
Abbildung 40: a) Boxplot zur Mutation an Codon 41, 45 und Wt im Vergleich
mit dem Anteil Cyclin D1 Positiver Zellen in Prozent. b) Boxplot zu mutierten
Wt-Tumoren im Vergleich mit dem Anteil Cyclin D1 Positiver Zellen in
Prozent.
3.2.15.2.2 Mutation und Immunhistochemie für MIB-1
Sieben der an Codon 41 mutierten Tumore konnten dem Score 1, zwei dem
Score 2 und zwei dem Score 3 zugeordnet werden. Von den neun an Codon
45 mutierten Fällen wurden acht dem Score 1 und einer dem Score 2
zugeordnet. Insgesamt wurden 15 der mutierten DTs dem Score 1, drei
97
Tumore dem Score 2 und zwei Tumore dem Score drei zugeordnet. Die WtTumore wurden in vier Fällen dem Score 1 zugeordnet und ein Fall wurde
dem Score 2 zugeordnet. Es konnte kein Zusammenhang zwischen der MIB1-Expression und dem Mutationsstatus ermittelt werden (Chi-Quadrat Test
nach Pearson mit p=0,75 und p= 0,53).
Score 1
Codon 41
Codon 45
wildtyp
Summe
Anzahl
7
8
4
19
Anteil
in %
36,8
42,1
21,1
100
Score 2
Anzahl
2
1
1
4
Anteil
in %
50,0
25,0
25,0
100
Score 3
Anzahl
2
0
0
2
Anteil
in %
100
0
0
100
Nicht
Auswertbar
AnAnteil
zahl
in %
0
0
0
0
0
0
0
0
Tabelle 56: Mutationsstatus von DTs im Vergleich mit der Immunhistochemie
für MIB-1
3.2.15.3 Mutation und Immunhistochemie für ERα
Vier der 13 an Codon 41 mutierten DTs waren positiv für ERα. Die an Codon
45 mutierten Fälle waren in acht Fällen negativ für ERα und in zwei Fällen
positiv. Insgesamt erwiesen sich 15 mutierte Fälle als negativ und sechs
Fälle als positiv. Die Wt-Tumore exprimierten in vier Fällen ERα und waren in
drei Fällen negativ. Für den Mutationsstatus im Vergleich mit der ERαExpression konnte kein signifikanter Zusammenhang ermittelt werden (Chi
Quadrat Test nach Pearson mit p=0,48 und p=0,57).
Codon 41
Codon 45
Wildtyp
Summe
Negativ
Anzahl Anteil in
%
7
36,8
8
42,1
4
21,1
19
100
Positiv
Anzahl Anteil in
%
4
44,4
2
22,2
3
33,3
9
100
Nicht auswertbar
Anzahl
Anteil in
%
2
100
0
0
0
0
2
100
Tabelle 57: Mutationsstatus von DTs im Vergleich mit der Immunhistochemie
für ERα
98
3.3 Überleben
Der folgende Abschnitt befasst sich mit dem Tumorfreien Überleben,
nachdem
ein
DT
operativ
entfernt
wurde
im
Vergleich
mit
den
Tumorcharakteristika. Das tumorfreie Überleben wird mit „Disease-FreeYears“ (DFS) beschrieben. Insgesamt gelang es 33 Fälle hinsichtlich des
DFS zu untersuchen.
Das durchschnittliche DFS lag in unserem Kollektiv bei 58,5 (+/- 45,7)
Monaten. Das erste Rezidiv trat nach drei Monaten auf, das letzte nach zehn
Monaten.
3.3.1 Überleben und Geschlecht
Das mittlere DFS lag bei den männlichen Patienten bei 48,2 (+/- 39,9)
Monaten. Das erste Rezidiv trat nach drei Monaten, das letzte nach 40
Monaten auf. Die weiblichen Patienten waren im Mittel 68,2 (+/- 49,5)
Monate tumorfrei, während das erst Rezidiv drei nach Monaten und das
letzte nach zehn Monaten auftrat. Das DFS ist bei Männern und Frauen
gleich (Log-Rank Test mit p=0,945).
Abbildung 41: Kaplan-Meier Kurve zum DFS in männlichen und weiblichen
Patienten.
99
3.3.2 Überleben und Altersgruppen nach Raitamo et al.
Tumore, die im juvenilen und im menopausalen Alter wuchsen hatten im
untersuchten Zeitraum keine Rezidive, die senescenten Tumore rezidivierten
in zwei Fällen nach drei Monaten und nach 20 Monaten. Am häufigsten
rezidivierten die Tumore, die im fertilen Alter wuchsen. Das erste Rezidiv trat
nach drei Monaten auf, das letzte nach zehn Monaten. Bei den juvenilen
Tumoren lag der Mittelwert für das DFS bei 85,3 (+/-85,7) Monaten, bei den
fertilen Patienten lag es bei 52,8 (+/- 45,4) Monaten, bei den menopausalen
Patienten bei 35,3 (+/- 31,8) Monaten und bei den senescenten Tumoren lag
es bei 68,4 (+/- 56,3) Monaten. Die Auswertung ergab keinen signifikanten
Zusammenhang für das DFS in den verschiedenen Altersgruppen, obwohl
die DTs, die im menopausalen und im juvenilen Alter wuchsen nicht
rezidivierten (Log Rank Test mit p = 0,484).
Abbildung 42: Kaplan-Meier Kurve zum DFS in Monaten in den
verschiedenen Altersgruppen nach Raitamo et al.
100
3.3.3 Überleben und Lokalisation
Das mittlere DFS der Patienten mit einem extraabdominell gelegenen DT lag
bei 54,3 (+/-47,8) Monaten. Das erste Rezidiv trat nach drei, das letzte nach
40 Monaten auf. Die abdominell gelegenen DTs
rezidivierten nicht und
hatten ein mittleres DFS von 65,7 (+/- 44,8) Monaten. Nur einer der
intraabdominellen DTs rezidivierte nach zwölf Monaten. Das mittlere DFS lag
bei 51,0 (+/- 36,8) Monaten. Es konnte, trotz der Tatsache, dass die
abdominellen Tumore nicht rezidivierten kein signifikantes Ergebnis erzielt
werden (Log-Rank Test mit p=0,23).
Abbildung 43: Kaplan-Meier Kurve zum DFS bei extraabdominell,
abdominell und intraabdominell gelegenen DTs.
101
3.3.4 Überleben und Tumorgröße
Zwei der DTs mit einem Durchmesser < 2 cm rezidivierten nach drei
Monaten und fünf Monaten und hatten ein mittleres DFS von 42,3 (+/- 44,7)
Monaten. Ebenso rezidivierten zwei der DTs mit einem Durchmesser von 2
bis 5 cm nach drei Monaten und sechs Monaten mit einem mittleren DFS von
57,9 (+/- 50,5) Monaten. Die Tumore mit einer maximalen Größe von 5 bis
10 cm rezidivierten im Mittel nach 60,3 (+/- 44,4) Monaten. Das erste Rezidiv
wuchs sechs Monate nach der Operation des Primärtumors, das letzte 40
Monate danach. Die Tumore mit einem Durchmesser von mehr als 10 cm
rezidivierten im Mittel nach 54,5 (+/- 50,4) Monaten mit dem ersten Rezidiv
nach acht Monaten und dem letzten Rezidiv nach zehn Monaten. Es konnte
für die verschiedenen Tumorgröße kein signifikanter Unterschied im DFS
ermittelt werden (Log-Rank Test mit p= 0,504).
Abbildung 44: Kaplan-Meier Kurve für das DFS bei Tumoren mit
verschiedenen Tumorgrößen
102
3.3.5 Überleben und Tumorentität
Die Tumore bei denen eine Narbe in der Krankengeschichte nachweisbar
war rezidivierten in nur einem Fall nach drei Monaten mit einem mittleren
DFS von 47,4 (+/- 43,4) Monaten. Die DTs ohne eine Narbe in der
Krankengeschichte rezidivierten zum ersten Mal nach drei Monaten und zum
letzten Mal nach 40 Monaten mit einem mittleren DFS von 59,8 (+/- 46,5)
Monaten. Es konnte kein signifikanter Unterschied im DFS bei DTs, die von
Narbengewebe abstammen und solchen, bei denen keine Narbe in der
Krankengeschichte bekannt war, ermittelt werden (Log-Rank Test mit
p=0,607).
Abbildung 45: Kaplan-Meier Kurve für das DFS von DTs aus
Narbengewebe und solchen ohne Narbengewebe in der Krankengeschichte.
3.3.6 Überleben und Immunhistochemie
3.3.6.1 Überleben und Immunhistochemie für β-Catenin
3.3.6.1.1 Überleben und Anteil an β-Catenin positiven Zellen in Prozent
Der Mittelwert von 66,6 % wurde als Schnittpunkt gewählt und die DTs in
zwei Gruppen eingeteilt: eine Gruppe mit weniger als 66,6% β-Catenin
Expression und eine Gruppe mit mehr als 66,6 % β-Catenin Expression. In
der Gruppe mit weniger als 66,6 % β-Catenin Expression rezidivierte der
103
erste Tumor nach acht Monaten, der letzte nach 40 Monaten. Das mittlere
DFS lag bei 66,6 (+/- 48,5) Monaten. Von den DTs mit mehr als 66,6 % βCatenin Expression rezidivierte der erste Tumor nach drei Monaten und der
letzte nach sechs Monaten. Das mittlere DFS lag bei 53,3 (+/- 44,3). Die
Expression von β-Catenin nimmt in unserer Studie keinen Einfluss auf das
DFS (Log-Rank Test mit p=0,789).
Abbildung 46: Kaplan-Meier Kurve zum DFS bei einer β-Catenin Expression
von weniger als 66,6 % und mehr als 66,6 %
104
3.3.6.1.2 Überleben und Intensität der Anfärbung
Die schwach anfärbbaren Tumore rezidivierten in einem Fall nach acht
Monaten mit einem mittleren DFS von 58,3 (+/- 50,5) Monate. Die moderat
mit β-Catenin anfärbbaren Tumore rezidivierten im Mittel nach 60,7 (+/- 44,7)
Monaten. Das erste Rezidiv entstand nach sechs Monaten, das letzte nach
zwölf. Die stark anfärbbaren Tumore rezidivierten insgesamt zwei Mal nach
fünf und nach 40 Monaten. Das mittlere DFS lag bei 51,7 (+/- 53,5) Monaten.
Das DFS ist hinsichtlich der Anfärbung gleich (Log-Rank-Test mit p=0,932).
Abbildung 47: Kaplan-Meier Kurve zum DFS bei verschiedener Intensität
der Anfärbbarkeit für β-Catenin
105
3.3.6.1.3 Überleben und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle
Die Tumore mit einer vorwiegend nukleären Lokalisation von β-Catenin
rezidivierten im Mittel nach 15,0 (+/- 12,1) Monaten. Das erste Rezidiv
entstand nach drei Monaten, das zweite nach fünf Monaten. Von den
vorwiegend zytosolisch anfärbbaren DTs rezidivierte der erste Tumor nach
drei und der letzte nach 40 Monaten. Das mittlere DFS lag bei 47,3 (+/- 37,7)
Monaten. Die Patienten mit Tumoren mit einer gleichsam zytosolischen wie
nukleären Anfärbung für β-Catenin rezidivierten nur in einem Fall nach sechs
Monaten und hatten ein mittleres DFS von 79,0 (+/-47,2) Monaten. Die
Auswertung ergab, dass DTs mit einer vorwiegend nukleären Expression die
schlechteste Prognose hinsichtlich der Rezidivraten haben. Die DTs mit einer
gleichsam zytosolischen wie nukleären Expression rezidivieren nur sehr
selten und DTs, bei welchen β-Catenin vorwiegen zytosolisch lokalisiert ist
liegen im DFS dazwischen (Log-Rank Test mit p=0,048).
Abbildung 48: Kaplan-Meier Kurve zum DFS und der Lokalisation von βCatenin in der Zelle
106
3.3.6.2 Überleben und Immunhistochemie für die Proliferationsmarker
Cyclin D1 und MIB-1
3.3.6.2.1 Überleben und Cyclin D1
Für fünf der 33 Fälle konnten keine immunhistochemischen Auswertungen
für Cyclin D1 durchgeführt werden. Auch hier diente der Mittelwert als
Trennlinie. Die Gruppen wurden demzufolge in DTs mit einer Expression von
weniger als 16,9 % und mehr als 16,9 % eingeteilt.
Die Patienten mit weniger als 16,9 % Cyclin D1 Expression hatten ein
mittleres DFS von 77,4 (+/- 44,3) Monaten. Das erste Rezidiv entstand nach
zehn Monaten das letzte nach zwölf. Die DTs mit einer Cyclin D1 Expression
von mehr als 16,9 % hatten ein deutlich kürzeres mittleres DFS von 33,6 (+/37,2) Monaten, wobei das erste Rezidiv nach drei Monaten und das letzte
nach acht Monaten diagnostiziert wurde. Es zeigte sich eine Tendenz
dahingehend, dass DTs mit einer Cyclin D1-Expression von mehr als 16,9 %
ein kürzeres DFS haben, also solche mit weniger als 16,9 % Cyclin D1
Expression (Log-Rank Test mit p=0,051).
Abbildung 49: Kaplan-Meier Kurve zum DFS in Patienten mit weniger als
16,9 % Cyclin D1 Expression und mehr als 16,9 % Cyclin D1 Expression.
107
3.3.6.2.2 Überleben und MIB-1
Die Fälle die dem Score 1 zugeordnet wurden rezidivierten in zwei Fällen
nach acht Monaten und nach zehn Monaten. Das mittlere DFS lag bei 75,7
(+/- 43,4) Monaten. Die DTs mit einer mittleren KI-67 Expression rezidivierten
in einem Zeitraum von drei Monaten bis zwölf Monaten mit einem mittleren
DFS von 38,5 (+/- 40,5) Monaten. Die DTs, die dem Score 3 zugeordnet
wurden rezidivierten in zwei Fällen nach fünf und nach sechs Monaten. Das
mittlere DFS betrug 23,0 (+/- 30,3) Monate. Die Auswertungen ergaben, dass
DTs mit einer geringen MIB-1 Expression ein signifikant längeres DFS, als
DTs mit einer mittleren oder hohen MIB-1 Expression haben. Die
schlechteste Prognose haben Tumore, die dem Score 3 für MIB-1
zugeordnet wurden (Log-Rank Test mit p=0,013).
Abbildung 50: Kaplan-Meier Kurve zum DFS bei DTs mit verschiedenem
MIB-1 Score.
108
3.3.6.3 Überleben und Immunhistochemie für ERα
In zwei Fällen konnten die immunhistochemischen Eigenschaften für ERα
nicht bestimmt werden. Die Fälle ohne ERα Expression rezidivierten im Mittel
nach 52,2 (+/- 54,2) Monaten. Der erste Tumor rezidivierte nach drei
Monaten, der letzte nach 40 Monaten. Die Patienten mit ERα Expression
hatten ein mittleres DFS von 76,0 (+/- 48,7) Monaten. Nur ein Patient erlitt
ein Rezidiv nach sechs Monaten. Es konnte kein signifikanter Einfluss der
ERα Expression auf das DFS nachgewiesen werden (Log-Rank Test mit
p=0,335).
Abbildung 51: Kaplan-Meier Kurve zum DFS bei ERα Expression.
3.3.7 Überleben und Mutationsstatus
Bei Patienten mit einer Mutation an Codon 41 wurden Rezidive in einem
Zeitraum von fünf bis 40 Monaten nach der Erstoperation entfernt. Das
mittlere DFS lag bei 62,4 (+/- 47,2) Monaten. Die DTs mit einer Mutation an
Codon 45 rezidivierten in keinem Fall und hatte ein mittleres DFS von 73,1
(+/- 50,9) Monaten. Das mittlere DFS aller mutierter Tumore lag bei 66,8 (+/47,8) Monaten. Die Wt-Tumore rezidivierten von drei Monaten bis acht
Monaten nach operativer Entfernung des Primärtumors mit einem mittleren
DFS von 35,6 (+/- 32,6) Monaten. Es ist eine Tendenz dahingehend
erkennbar, dass DTs mit Wt-Status sehr häufig und solche mit einer Mutation
109
an Codon 45 gar nicht rezidivieren. Es konnte jedoch kein signifikantes
Ergebnis für das DFS im Zusammenhang mit dem Mutationsstatus erzielt
werden (Log-Rank Test mit p= 0,084 und p= 0,080).
a
b
Abbildung 52: a) Kaplan-Meier Kurve zum DFS in Patienten mit einer
Mutation an Codon 41, Codon 45 und Wt-Tumoren b) Kaplan-Meier Kurve
zum DFS in Patienten mit mutierten und Wt-Tumoren
3.4
Vergleich
der
Methode
nach
Sanger
und
der
Pyro-
Sequenzierung
Um die Genauigkeit der Mutationsanalysen zu verbessern wurden alle Fälle
sowohl mit der Methode nach Sanger als auch mittels Pyro-Sequenzierung
untersucht. Zum Vergleich der Methoden wurde wie unter 2.3.6 beschrieben
eine Verdünnungsreihe genutzt. Wie in Tabelle 56 zu sehen ist, konnte kein
wesentlicher Unterschied in der Sensitivität der Methoden festgestellt
werden. Bei beiden Methoden ist die Mutation bis zu einer Konzentration von
7,5 % mutierter DNA sicher möglich. Bei Verdünnungen mit geringerer
Konzentration kann der Mutationsstatus zwar vermutet, aber nicht sicher
bestätigt werden.
110
Mutierte
DNA in
%
Pyro-Sequenzierung
Sanger-Sequenzierung
10
7,5
5
2,5
1
Tabelle 58: Vergleich der Methode nach Sanger und der PyroSequenzierung: Darstellung der Verdünnungsstufen mit weniger als 10 %
mutierter DNA.
111
In diesem Zusammenhang wurde auch getestet, wie gut die Sensitivität der
Methoden in unserem Kollektiv war. Diesbezüglich wurden alle 56 Fälle
dahingehend betrachtet, ob die Mutation mit Hilfe der Methode nach Sanger,
oder der Pyro-Sequenzierung ermittelt werden konnte. Hierzu ergab sich,
dass die Mutation bei fünf (8,9 %) Fällen weder mit Pyro-, noch mit SangerSequenzierung ermittelt werden konnte. Vier (7,1 %) der Fälle konnten mit
Hilfe der Methode nach Sanger, jedoch nicht mittels Pyro-Sequenzierung
entschlüsselt werden. Ebenso konnten umgekehrt vier (7,1 %) Fälle mittels
Pyro-Sequenzierung,
jedoch
nicht
mittels
Sanger-Sequenzierung
diagnostiziert werden. Bei den übrigen 43 (76,8 %) Fällen war die
Sequenzierung mit beiden Methoden erfolgreich. Somit konnte auch in
unserem Kollektiv kein signifikanter Unterschied in der Sensitivität der
Untersuchungen festgestellt werden.
Methode nach Sanger
PyroNicht möglich
Sequenzierung möglich
Summe
Nicht
möglich
5
4
9
Summe
möglich
4
43
47
9
47
56
Tabelle 59: Vergleich der Methode nach Sanger und der PyroSequenzierung im untersuchten Kollektiv
112
4. Diskussion
DTs können trotz einiger Studien zur Tumorätiologie, Prognose und Therapie
hinsichtlich ihres Rezidivverhaltens nur unzureichend beurteilt werden. Die
Studien untersuchten zumeist nur einzelne Kriterien an einem Kollektiv,
während der Gesamtüberblick außer Acht blieb. Im Folgenden soll der
Zusammenhang
von
DTs
hinsichtlich
der
genetischen,
der
immunhistochemischen und der klinisch-pathologischen Eigenschaften,
sowie deren Einfluss auf die Prognose und die Rolle einzelner Proteine, wie
β-Catenin, Cyclin D1und KI-67 im Vergleich mit anderen Arbeiten dargestellt
und diskutiert werden.
4.1 Das tumorfreie Überleben
DTs metastasieren nicht, wachsen jedoch lokal aggressiv und rezidivieren
häufig (Mitchell et al. 1998, Colleen et al. 2010, Lips et al. 2009). Unabhängig
von den Eigenschaften des jeweiligen Tumors und der Behandlung werden
Rezidivraten von 20-60% beschrieben, wobei es bis jetzt nicht gelungen ist
Prädiktivfaktoren für ein etwaiges Rezidiv zu benennen (Rock et al. 1984,
Merchant et al. 1999, Spear et al. 1998, Gronchi et al. 2003). Dieses schwer
einschätzbare Rezidivverhalten stellt ein großes Problem in der Therapie von
DTs dar. Deshalb wurde auch in dieser Studie das DFS genutzt, um
mögliche Parameter für eine Prognoseeinschätzung mittels klinischpathologischer Daten festzustellen. In unserem Kollektiv lag die Rezidivrate
bei 24,4 % mit einem mittleren DFS von 58,5 Monaten. Die Spannweite der
Angaben zu Rezidiven in den verschiedenen Studien ist groß. Diese
Abweichungen sind möglicherweise durch die Größe der Kollektive, die
unterschiedlichen Einschlusskriterien in die Kollektive, oder dadurch, dass
das Rezidiv an einem anderen Zentrum operiert wurde und dadurch nicht
mehr in der Datenbank eines Klinikum aufgelistet werden konnte, bedingt.
Um ein möglichst genaues Bild des DTs zu erhalten, haben wir versucht
möglichst alle DTs, die am Universitätsklinikum Erlangen von 1999 bis 2012
operiert wurden in die Studie aufzunehmen. Außerdem sendeten wir den
Hausärzten der Patienten einen standardisierten Fragebogen zu, in dem die
wichtigen klinisch-pathologischen Daten, sowie die Rezidive erfragt wurden
mit dem Ziel einer genauen Erfassung aller wichtigen Tumormerkmale. Auf
113
die Größe des Kollektivs konnten wir auf Grund der geringen Inzidenz von
DTS leider keinen Einfluss nehmen.
4.2 Die Rolle des Alters, Geschlechts und der Tumorentität für das
Wachstum von DTs
Das in unserer Studie ermittelte mittlere Erkrankungsalter von 39,3 Jahren
lag über dem von Sharon et al. beschriebenen Erkrankungsgipfel zwischen
25 und 35 Jahren (Weiss und Goldblum 2008). Die Abweichungen könnten
durch die unterschiedliche Größe der Kollektive, oder regionale Unterschiede
in der Inzidenz bedingt sein.
Interessant ist jedoch die Verteilung des Tumorwachstums auf die
Geschlechter und die Altersgruppen. Insgesamt waren mehr Frauen als
Männer betroffen. Die meisten Erkrankten (57,1 %) beider Geschlechter
befanden sich im fertilen Lebensalter zwischen dem 15. und 45. Lebensjahr.
Dies betraf besonders die Frauen. Sie waren zu 80 % im fertilen Lebensalter
erkrankt, während Männer in allen Altersgruppen nahezu gleich häufig
erkrankten.
Diese
Beobachtung
passt
zu
der
in
anderen
Studien
beschriebenen Annahme, dass die Entstehung von DTs durch weibliche
Geschlechtshormone beeinflusst wird (Clark und Phillips 1996, Deyrup et al.
2006, Aoki et al. 1999, Picariello et al. 2006). In diesem Zusammenhang
interessierte uns folglich, ob in den Tumoren unseres Kollektivs auch auf
zellulärer Ebene Anhalte für eine Beeinflussung durch Östrogene, oder
Progesteron
ermittelt
immunhistochemischer
wurde.
Färbung
Diesbezüglich
versucht
den
ERα
wurde
und
mittels
den
PR
nachzuweisen. Der PR konnte, wie in den Studien von Santos et al. und
Leithner et al. in keinem der Fälle nachgewiesen werden (Santos et al. 2010,
Leithner et al. 2005). ERα war anders als bei Picariello et al, die in allen DTs
ERα nachweisen konnten, in unserem Kollektiv nur in 26,8 % der Fälle
positiv (Picariello et al. 2006). Möglicherweise konnte ERα in unserem
Kollektiv auf Grund der Wahl einer weniger sensitiven Methode als bei
Picariello et al. nur in Tumoren mit einer besonders hohen ERα-Expression
nachgewiesen werden. Dennoch handelt es sich um eine Methode mit deren
Hilfe verschiedene Zusammenhänge ermittelt werden konnten. Es zeigte
114
sich, dass der Rezeptor in beiden Geschlechtern gleichmäßig exprimiert war,
jedoch ausschließlich in Tumoren des juvenilen und fertilen Lebensalters
nachgewiesen werden konnte. Demzufolge war er vor Allem in Tumoren von
Patienten exprimiert, die altersbedingt unter Östrogen-Exposition standen.
Eine weitere Beobachtung in diesem Zusammenhang ist, dass v.a.
abdominelle Tumore in Zusammenhang mit Schwangerschaft, oder unter der
Einnahme von Kontrazeptiva, also unter verstärktem hormonellem Einfluss,
auftreten und vorwiegend Frauen betreffen (Clark und Phillips 1996).
Deshalb interessierte uns, wie sich das Geschlecht auf die Tumorlokalisation
auswirkt. Diesbezüglich ergab sich kein signifikantes Ergebnis. Es ist eine
Tendenz dahingehend erkennbar, dass sieben der acht abdominellen DTs
bei Frauen wuchsen, während die anderen Tumore gleichmäßig über
weibliche und männliche Patienten verteilt waren.
Ähnliche Ergebnisse, wie in unserem Kollektiv wurden in den letzten Jahren
zum Anlass für Forschungen zur Prognose und für Therapieversuche mit
Östrogen-Rezeptor-Modulatoren genommen. Bislang konnte jedoch kein
Zusammenhang zwischen der Expression von ERα, dem DFS und dem
Therapieansprechen festgestellt werden (Bocale et al. 2011, Picariello et al.
2004, Benson und Baum 1993). Auch bei den Untersuchungen an unserem
Kollektiv konnte kein Einfluss der Expression von ERα, oder der
Zugehörigkeit zu einer Altersgruppe auf das Überleben nachgewiesen
werden.
Ein weiterer diskutierter Faktor in der Entstehung von DTs ist das Wachstum
auf Grund einer Operation, einer Narbe, oder eines Traumas in der
Vorgeschichte am Wachstumsort des DTs (Häyry et al. 1982, Clark und
Phillips 1996). In unserem Kollektiv konnte in 16,1 % der Fälle in der
Vorgeschichte eine der oben genannten Ereignisse ermittelt werden. Die
Auswertungen zur Tumorentität im Vergleich mit den klinisch-pathologischen
Daten, der Immunhistochemie und dem Mutationsstatus ergab keine
Zusammenhänge. Auch hinsichtlich der Prognose verhielten sich die DTs in
unserem Kollektiv über beide Gruppen gleich.
115
Betrachtet man die Ergebnisse unserer und anderer Studien, so spricht dies
für eine hormonelle Beeinflussung der Entstehung und des Wachstums der
DTs. Da man noch nicht weiß von welchen klinisch-pathologischen
Parametern der Erfolg einer Therapie mit Östrogen-Rezeptor-Modulatoren
abhängt, sind an dieser Stelle noch viele Fragen offen, welche zur
Beantwortung weitere Studien erfordern.
4.3 Die Tumorlokalisation an den Extremitäten kann nicht als
negativer prädiktiver Faktor bestätigt werden
Auf Grund der Entstehung aus Fibroblasten des Bindegewebes können DTs
an nahezu jeder Stelle des Körpers wachsen, sie zeigen jedoch eine
bestimmte Häufigkeitsverteilung in Ihrem Wachstum (Biermann 2000). So
ergab unsere, wie auch andere Studien, dass DTs am häufigsten an den
Extremitäten, gefolgt von der Bauchdecke und am seltensten intraabdominell
wachsen (Miettinen 2010, Kasper et al. 2011). Verschiedene Studien
untersuchten diesbezüglich die Lokalisation des Tumors im Hinblick auf die
Prognose und so konnte ein Wachstum an den Extremitäten mehrfach als
negativer Faktor für die Prognose bestimmt werden (Mullen et al. 2012,
Bertani et al. 2012, Salas et al. 2011, Bonvalot et al. 2008, Escobar et al.
2011). Deshalb interessierte uns bei unserem Kollektiv zuerst, ob die
Tumorlokalisation einen Einfluss auf die Größe des Tumors zum Zeitpunkt
der Operation hat. Es zeigte sich jedoch, dass die Lokalisation des Tumors
keinen Einfluss auf die Tumorgröße nimmt. Im Folgenden wurden
diesbezüglich die Proliferationsmarker Cyclin D1 und MIB-1, die in unserem
Kollektiv mit einer schlechteren Prognose einhergehen, untersucht und es
ergab sich auch bei deren Betrachtung kein signifikanter Unterschied für die
verschiedenen Wachstumsorte. Zuletzt sollte ein möglicher Unterschied des
DFS in den verschiedenen Lokalisationsgruppen ermittelt werden. Jedoch
ergaben die Auswertungen auch hier keinen signifikanten Unterschied.
Folglich kann gemäß unserer Daten die Tumorlokalisation an den
Extremitäten nicht als negativer prädiktiven Faktor bestätigt werden. Auch
hier kann die Abweichung der Ergebnisse von anderen Studien durch die
unterschiedlichen
Einschlusskriterien
in
die
Kollektive,
oder
die
Kollektivgröße bedingt sein.
116
4.4 Die MIB-1 Expression ist abhängig von der Tumorgröße
DTs liegen meist in der Tiefe, wachsen langsam und werden dadurch des
Öfteren erst bei einem großen Tumordurchmesser von mehr als 10 cm
bemerkt (Weiss und Goldblum 2008). So stellte sich mehrfach die Frage,
welchen Einfluss die Tumorgröße auf die Prognose hat. Die Ergebnisse
hierzu waren in den verschiedenen Studien widersprüchlich: Während in
einer aktuellen Studie von Bertani et al. und Salas et al beschrieben wird,
dass ein Tumordurchmesser von mehr als 10 cm ein erhöhtes Risiko für ein
Rezidiv darstellt, wurde dies von anderen Studien wiederlegt (Bertani et al.
2012, Mullen et al 2012, Salas et al. 2011). Auch in unserem Kollektiv konnte
keine direkte Abhängigkeit des DFS von der Tumorgröße ermittelt werden.
Jedoch stellte sich bei der Auswertung der Proliferationsmarker heraus, dass
kleine Tumore signifikant mehr MIB-1 exprimieren, als Tumore mit einem
Durchmesser von mehr als 5 cm. In Zusammenschau mit den Ergebnissen
der Auswertung der Immunhistochemie für die MIB-1 Expression hinsichtlich
der Prognose zeigte sich dann ein interessanter Zusammenhang. Eine hohe
MIB-1 Expression stellt laut unseren Daten einen negativen Faktor für die
Prognose von DTs dar. Demzufolge haben kleine Tumore mit viel MIB-1
Expression möglicherweise eine schlechtere Prognose, als DTs mit einem
größeren Durchmesser. Dieses widersprüchliche Ergebnis die MIB-1
Expression betreffend könnte dadurch bedingt sein, dass Tumore, die ein
schnelles und aggressives Wachstum aufweisen durch die Patienten eher
bemerkt werden, als diese, die langsam wachsen und deshalb schon mit
einem kleinen Durchmesser entfernt werden.
4.5 Mutationen im CTNNB1-Gen als Mittel zur Diagnosesicherung
von Desmoidtumoren
Eine besondere Rolle in der Entstehung von DTs werden Punktmutationen
des CTNNB1-Gens, das für β-Catenin kodiert zugeschrieben (Alman et al.
1997, Tejpar et al. 1999). Die drei häufigsten Mutationen sind in Codon 41
und 45 des Exon 3 des CTNNB1-Gens lokalisiert. Am häufigsten ist eine
Punktmutation in Codon 41 (c.121A>G), die zu einem Austausch von
Threonin durch Alanin führt. Im Codon 45 sind zwei verschiedene Mutationen
117
bekannt, die zu einem Austausch von Serin durch Phenylalanin (c.134C>T)
und eine weitere die zu einem Austausch von Serin durch Prolin (c.133T>C)
führt (Colombo et al. 2011). Insgesamt war der Durchschnitt aller Studien bei
etwa 50 % Mutationsrate (Lazar et al. 2008). Durch die Mutationsanalysen in
unserer Studie konnten alle zuvor beschriebenen Mutationen in gleicher
Häufigkeitsabfolge ermittelt werden. Insgesamt waren 67,9 % mutiert, wobei
in 32,1 % der Fälle keine Mutation nachweisbar war. Außerhalb der bereits
beschriebenen Mutationen konnte eine zuvor unbekannte Mutation an Codon
45 ermittelt werden, die zu einem Austausch von Serin zu Asparagin führt
(p.S45N; c.133_134delinsAA), sowie eine Doppelmutation an Codon 41 und
Codon 45 (pT41A; p.S45F). Interessanterweise zeigte sich bei der
Doppelmutation ein besonders aggressives Wachstum mit mehreren
Rezidiven.
Da DTs an Hand klinischer und lichtmikroskopischer Begutachtung nur
schwer diagnostizierbar sind, wurde die Mutationsanalyse als mögliches
Mittel zur Diagnosefindung in Erwägung gezogen. In einer Studie von Le
Guellec et al. wurden DTs und deren Differentialdiagnosen hinsichtlich Ihres
Mutationsstatus
ausschließlich
analysiert.
in
DTs,
Mutationen
jedoch
in
im
keiner
CTNNB1-Gen
der
konnten
Differentialdiagnosen
nachgewiesen werden (Le Guellec et al. 2012). Beachtet man, dass es
aktuell noch keine Klassifikation gibt, die bei der Diagnosestellung mittels
histologischer Bewertung, oder klinisch-pathologischer Daten unterstützt,
stellt die Mutationsanalyse auf Grund der hohen Mutationsraten von DTs
eine mögliche Option zur Diagnosefindung in schwer diagnostizierbaren
Fällen dar.
Um die Mutationsanalyse in Zukunft in der Diagnostik möglichst effektiv
verwenden zu können, stellte sich die Frage, welche Untersuchungsmethode
die besseren Ergebnisse liefert. So führten wir einen direkten Vergleich
zwischen der Pyro-Sequenzierung und der Methode nach Sanger mit Hilfe
einer Verdünnungsreihe durch. Beide Methoden erwiesen sich im direkten
Vergleich als gleich gut. Die Mutation konnte mit unserem Essay jeweils bis
zu einem Mutationslevel von 7,5% nachgewiesen werden. Bei geringeren
Mutationsraten war der Nachweis nicht mehr sicher möglich. Betrachteten wir
118
nun die Nachweisraten in unserem Kollektiv, so stellten sich auch hier beide
Methoden als gleich gut heraus, wobei es in je 4 Fällen mit der jeweils
anderen
Methode
gelang
eine
zuvor
nicht
nachweisbare
Mutation
nachzuweisen. In Zusammenschau spielt die Wahl der Methode hinsichtlich
der Sensitivität keine Rolle und kann nach Verfügbarkeit erfolgen. Scheitert
die Analyse jedoch z.B. mittels der Pyro-Sequenzierung, so sollte eine
weitere Analyse mittels der Methode nach Sanger erwogen werden und
umgekehrt. Die Verlässlichkeit unseres Essays zur Mutationsanalyse
bestätigte sich in einer nachfolgend durchgeführten Studie von Haller et al.
zu Mutationen im CTNNB1-Gen in sinonasalen Hämangioperyzytomen
(Haller et al. 2014).
4.6 Der Einfluss des Mutationsstatus auf β-Catenin im WntSignalweg
Eine besonders große Bedeutung in der Entstehung der DTs werden
Mutationen im Protein β-Catenin, dem zentralen Regulationsprotein des WntSignalweges, zugeschrieben (Alman et al. 1997) (Tejpar et al. 1999). Die
unter 4.5 beschriebenen Mutationen führen zu Konformationsänderungen in
β-Catenin mit gravierenden Auswirkungen auf die Zelle. Die Aminosäure
Serin an Codon 45 dient dabei als Phosphorylierungsstelle für CK1α,
während Threonin an Codon 41 ebenso wie Serin an Codon 33 und 37 durch
GSK3β phosphoryliert werden (Yost et al. 1996, Liu et al. 2002, Peifer et al.
1994, Amit et al. 2002). Ist β-Catenin ausreichend phosphoryliert so kann es
ubiquitinyliert und im Proteasom abgebaut werden (Winston et al. 1999, Liu
et al. 1999). Kommt es nun zu einer Punktmutation an Codon 41, oder 45
des Exon 3 des CTNNB1-Gens, so gehen die Phosphorylierungsstellen
verloren und β-Catenin kann dem Abbau im Proteasom nicht mehr zugeführt
werden (Xu und Kimelman 2007, Willert und Jones 2006). Dies führt zu einer
Akkumulation von β-Catenin im Zytosol, welches nachfolgend in den Zellkern
transloziert und dort als Transkriptionsfaktor wirksam ist (Behrens et al. 1996,
Molenaar et al. 1996, Aoki et al. 1999). Mittels Immunhistochemie gelang es
demzufolge Lazar et al. in 98 % der DTs eine erhöhte Expression von βCatenin nachzuweisen, jedoch nur in zwei aus 17 Fällen der Negativkontrolle
(Narbengewebe) (Lazar et al. 2008). Auch in unserem Kollektiv zeigte β119
Catenin in allen Fällen eine erhöhte Expression. Betrachtet man diese
Beobachtungen nun in Zusammenschau mit dem Mutationsstatus zeigte sich
bei Lazar et al., dass Tumore mit einer Mutation an Codon 41 eine höhere
Expression von β-Catenin aufwiesen, als diese mit anderem Mutationsstatus
(Lazar et al. 2008). In Unserem Kollektiv konnten wir zwar keinen
signifikanten Unterschied zwischen Mutierten und Wt-Tumoren ermitteln, es
ist jedoch ein deutlicher Trend dahingehend erkennbar, dass mutierte
Tumore mehr β-Catenin exprimieren, als Wt-Tumore.
Wie weiter oben beschrieben steigt durch die beschriebenen Mutationen im
CTNNB1-Gen nachfolgend das β-Catenin Level in der Zelle und β-Catenin
kann gemäß dem Wnt-Signalweg in den Zellkern translozieren, wo es als
Transkriptionsfaktor fungiert. Im Folgenden war also von Interesse, wo βCatenin bei den verschiedenen mutierten Tumoren in der Zelle lokalisiert ist
und es stellte sich heraus, dass β-Catenin gemäß unserer Annahme in
keinem der Wt-Tumore im Nukleus nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu
exprimierten 81,8% der mutierten Tumore β-Catenin entweder nur im
Nukleus, oder sowohl im Nukleus als auch im Zytosol. Dies bestätigt die
Annahme, dass der Mutationsstatus einen Einfluss auf die Lokalisation von
β-Catenin in der Zelle hat. In Zusammenschau mit der Funktion von βCatenin als Transkriptionsfaktor für bestimmte Zielgene spielt dies eine
bedeutende Rolle für die Zelle, wie auch unter 4.10 in Bezug auf die
Prognose weiter ausgeführt ist. Des Weiteren kann β-Catenin als
Immunhistochemische Färbung in der Diagnostik von DTs bestätigt werden,
da es auch in unserem Kollektiv in 100% der Tumore exprimiert war.
4.7 Cyclin D1 als Zielgen von β-Catenin
Nachdem unter 4.6 der Einfluss von Mutationen im CTNNB1 Gen auf die
Expression und Lokalisation von β-Catenin in der Zelle beschrieben wurde,
soll nun weiterführend ein Augenmerk auf die Konsequenzen für die
Expression des Zielgens und des Proliferationsmarkers Cyclin D1 gelegt
werden.
Gemäß
verschiedener
Studien
ist
β-Catenin
ein
positiver
Transkriptionsfaktor für Cyclin D1 (Klein und Assoian 2008, Dufresne et al.
2010). Demnach erwarteten wir, dass Cyclin D1 in Tumoren mit hoher β120
Catenin Expression ebenso vermehrt exprimiert ist. Jedoch war das
Verhältnis
der
Cyclin
D1
und
der
β-Catenin
Expression
genau
entgegengesetzt: während Cyclin D1 in mutierten Tumoren verringert
exprimiert war, konnte es in Wt-Tumoren vermehrt nachgewiesen werden
(Siehe 3.2.15). Dieses widersprüchliche Ergebnis lässt uns vermuten, dass in
Wt-Tumoren andere, oder zusätzliche Regulationsmechanismen für die
Cyclin D1-Expression verantwortlich sind, die zum aktuellen Zeitpunkt nicht
bekannt sind. In Zusammenschau mit dem DFS, wie unter 4.9 näher
beschrieben wird, stellt diese Kontroverse eine Interessante Frage für
weitere Studien dar.
4.8 Der Einfluss der Mutation auf das DFS
Im Zusammenhang mit den zahlreichen Rezidiven bei DTs, wurde auch der
Mutationsstatus als negativer prädiktiver Faktor mehrfach diskutiert.
Während Lazar et al. den Tumoren mit einer Mutation an Codon 45 ein
dreifach erhöhtes Risiko für ein Rezidiv im Vergleich zu den an Codon 41
mutierten und den Wt-Tumoren zuschreiben, konnte dies von Dômont et al.
nicht bestätigt werden. Dômont et al. konnten eine bessere Prognose für WtTumore als für mutierte Tumore ermitteln, es gelang Ihnen jedoch nicht einen
Unterschied zwischen den Mutationen festzustellen (Lazar et al. 2008,
Dômont et al. 2010). Die Ergebnisse unserer Studie weichen von beiden der
oben genannten Studien ab. In unserem Kollektiv rezidivierte keiner der an
Codon 45 mutierten Tumore, während die Tumore mit einer Mutation an
Codon 41 und Wt-Tumore häufig rezidivierten. Folgt man der Theorie, dass
Serin an Codon 45 durch CK1α phosphoryliert wird und Serin an Codon 33
und 37, sowie Threonin an Codon 41 durch die GSK-3β, so könnten die
Mutationen an Codon 45 teilweise durch die höhere Phosphorylierungsrate
der GSK3β an drei Codonen kompensiert werden (Yost et al. 1996, Liu et al.
2002, Peifer et al. 1994, Amit et al. 2002). Demzufolge müsste das Level an
β-Catenin in Tumoren mit einer Mutation an Codon 45 geringer sein, als in
solchen mit einer Mutation an Codon 41. Wir konnten unter den mutierten
Tumoren jedoch keinen Unterschied feststellen. Dies könnte zum einen an
den geringeren Fallzahlen in unserer Studie liegen und zum anderen durch
die verschiedenen Zusammenstellungen der Kollektive bedingt sein:
121
Während Dômont et al. Ihre Studie auf extraabdominelle Tumore
beschränkten, wurden in der Studie von Lazar et al. und in unserer Studie
Tumore aller Entitäten verwendet (Lazar et al 2008, Dômont et al 2010).
4.9 Der Einfluss des Mutationsstatus auf die Tumorgröße
Wir betrachteten in diesem Zusammenhang auch den Mutationsstatus im
Vergleich mit dem maximalen Durchmesser. Die Tumore mit einer Mutation
an Codon 45 waren größer zum Zeitpunkt der Operation, als die an Codon
41
mutierten
und
die
Wt-Tumore.
In
Zusammenschau
mit
der
Immunhistochemie für Cyclin D1, dem Proliferationsmarker, ist deutlich
sichtbar, dass in den Tumoren mit einer Mutation an Codon 45 weniger
Cyclin D1 exprimiert wurde, als in den Tumoren mit einer Mutation an Codon
41, oder mit Wt-Status (Siehe 3.3.6.2). In Anbetracht der Auswirkungen des
erhöhten Levels an Cyclin D1 auf das Rezidivverhalten, wie unter 4.10
beschrieben, gelang es uns auch in diesem Zusammenhang nicht, die
Tumorgröße als einen negativen Prädiktiven Faktor zu bestimmen. Der
größere Durchmesser der Tumore mit einer Mutation an Codon 45 zum
Zeitpunkt der Operation könnte dadurch bedingt sein, dass diese Tumore
langsamer wachsen und deshalb von den Betroffenen erst später bemerkt
werden, als die schnell wachsenden Tumore.
4.10 Cyclin D1 und MIB-1 als negative prädiktive Marker
Cyclin D1 wird auf Grund seiner Rolle im Zellzyklus vermehrt in sich
teilenden
Zellen
exprimiert
und
dient
seit
mehreren
Jahren
als
Proliferationsmarker für verschiedene Tumore, so auch dem DT (Kim und
Diehl 2009, Saito et al. 2001). Für MIB-1 wurde sogar nachgewiesen, dass
es ausschließlich in sich proliferierenden Zellen exprimiert ist (Gerdes et al.
1984, Bullwinkel et al. 2006). Wie bereits unter 4.4 beschrieben, hat die
Expression von KI-67 einen signifikanten Einfluss auf die Tumorgröße.
Interessanter ist jedoch, dass sowohl Tumore mit einer hohen Cyclin D1 als
auch mit einer hohen MIB-1 Expression zu einem kürzeren DFS führen, als
solche mit geringerer Expression. Für Cyclin D1 konnte lediglich ein p-Wert
von 0,051 nachgewiesen werden, jedoch ist deutlich erkennbar, dass die
Tumore mit einer Expression von mehr als 16,9 % eine schlechtere
122
Prognose haben, als die Tumore mit weniger als 16,9 % Cyclin D1
Expression (Siehe 3.3.6.2). Ebenso war es mit dem Score für MIB-1: je höher
die Expression von MIB-1, desto kürzer war das DFS (Siehe 3.3.6.2). Somit
stellen die Proliferationsmarker auf Grund Ihrer langjährigen Erprobung an
anderen Tumoren in der alltäglichen Routinediagnostik möglicherweise in
Zukunft einen günstigen und allseits verfügbaren Marker zur Einschätzung
der Prognose von DTs dar.
4.11 Die Expression von β-Catenin in Zusammenhang mit dem
DFS
In einer Studie von Lazar et al. wurde ein niedriges β-Catenin Level in der
Zelle zusammen mit einer Mutation an Codon 45 als negativer prädiktiver
Marker für das DFS ermittelt (Lazar et al. 2008). Wie unter 4.8 beschrieben,
wich unser Ergebnis dahingehend ab, dass wir kein erniedrigtes β-Catenin
Level in mutierten DTs feststellen konnten. Des Weiteren konnte für die βCatenin Expression kein signifikanter Unterschied im DFS nachgewiesen
werden. Da β-Catenin jedoch im Zellkern als Transkriptionsfaktor wirksam ist,
stellte sich nun folglich die Frage, welchen Einfluss die Lokalisation von βCatenin in der Zelle auf das DFS hat. Dabei ergab sich, dass Tumore mit
einer ausschließlich nukleären Expression am ehesten ein Rezidiv
entwickelten, während bei den Tumoren mit einer gleichsam zytosolischen,
wie nukleären Expression das DFS am längsten war. Die Tumore mit einer
rein zytosolischen Expression lagen im DFS dazwischen. Die Beobachtung,
dass eine nukleäre Expression am ehesten mit einem Rezidiv einhergeht,
passt zu den Regulationsmechanismen des Wnt-Signalweges, wie unter 4.6
diskutiert. Wir konnten in unserem Kollektiv das β-Catenin Level in der Zelle
zwar nicht als prädiktiven Marker für die Prognose bestätigen, jedoch gelang
es uns die Lokalisation von β-Catenin ausschließlich im Nukleus mit einem
signifikant
kürzeren
möglicherweise
eine
DFS
in
einfache
Verbindung
Methode
zu
in
bringen.
der
Dies
Einschätzung
stellt
des
Rezidivverhaltens dar.
123
4.12 Ausblick
DTs sind eine heterogene Gruppe von Tumoren. Auf Grund der fehlenden
Kriterien zur Diagnosestellung und Klassifikation von DTs, sind sowohl die
Pathologen, als auch die behandelnden Ärzte immer wieder vor eine
Herausforderung gestellt. Ist die Diagnose einmal gestellt, so stellt sich
immer noch die Frage der richtigen Therapie. In dieser Studie konnten
Möglichkeiten zur leichteren Diagnosefindung dargestellt werden, jedoch ist
es in Zukunft nötig weitere genaue histologische und klinisch-pathologische
Kriterien zu einer Klassifikation zusammenzuführen. Solche Klassifikationen
sind wichtig zur Einschätzung der Prognose um die beste Wahl der Therapie
für den Patienten zu treffen. Es gibt viele Möglichkeiten zur Therapie von
DTs, eine Therapie der ersten Wahl konnte trotz zahlreicher Studien noch
nicht bestimmt werden. Wichtig ist hierbei, dass an Hand der klinischpathologischen Merkmale des Patienten und des Tumors die Therapie mit
der geringsten Beeinträchtigung für den Patienten gewählt wird. Hierzu
ergaben sich in unserer, wie in anderen Studien verschiedene Marker zur
Vorhersage des Rezidivverhaltens bei DTs. Besondere Kontroversen stellten
dabei die Mutationsanalysen und die Immunhistochemie für Cyclin D1 und βCatenin dar. Die gegensätzliche Expression von Cyclin D1 und β-Catenin
spricht
für
unterschiedliche
Regulationsmechanismen,
abhängig
vom
Mutationsstatus. Somit bietet die aktuelle Datenlage Potential für weitere
Forschungen sowohl zu den Regulationsmechanismen der Proteine, als
auch zur besseren Einschätzung und Therapiefindung der DTs.
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142
Abkürzungsverzeichnis
[c]DNA
DNA-Konzentration
AF
Transkriptionsaktivierende Domäne
APC
Adenomatous-Polyposis-Coli
CC1
Ultra Cell Conditioner
CDK2
Cyclin-dependent Kinase 2
CDK4
Cyclin-dependent Kinase 4
CDK6
Cyclin-dependent Kinase 6
CK1α
Casein-Kinase 1α
DBD
DNA-Bindungsdomäne
ddNTP
Dideoxynukleotidtriphosphat
DFS
Disease Free Years (krankheitsfreies Überleben)
DKK
Dickkopf
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DSH
Dishevelled (DSH)
DT
Desmoid-Tumor
ERα
Östrogen- Rezeptor α
ERβ
Östrogen- Rezeptor β
FAP
Familiäre Adenomatöse Polyposis Coli
G0-Phase
Gap0-Phase
G1-Phase
Gap1-Phase
G2-Phase
Gap2-Phase
GBP
Gunalylate Binding Protein
143
GIST
Gastrointestinaler Stromatumor
GSK3β
Glykogen Synthase Kinase 3 β
H₂O
mQ-Wasser
HE
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
HRE
Hormone-Response-Element
HSP
Heat-Shock-Protein
KI-67
Kiel 67
LBD
Liganden-Bindungs-Domäne
LD
Loading dye
LEF-1
Lymphoid-Enhancing Factor 1
LRP5
Low Density Lipoprotein Rezeptor related Protein 5
LRP6
Low Density Lipoprotein Rezeptor related Protein 6
MIB-1
Mindbomb-1
NR
Nukleärer Hormon Rezeptor
NSAIDs
Non Steroidal anti-inflammatory Drugs
NTP
Nukleotidtriphosphat
PCR
Polymerase-Chain-Reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion)
PDGF
Plateled derived Growth Factor
PR
Progesteron-Rezeptor
rDNA
Ribosomale Desoxyribonukleinsäure
Rpm
Revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
rRNA
Ribosomale Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
SFRPs
Frizzled- related Proteins
144
S-Phase
Synthese-Phase
TCF
T-Cell-transcription factor
TMA
Tissue Micro Array
UBF
Upstream Binding Factor
Wnt
Wingless Interaction 1
Wt
Wildtyp
β-Trcp
β-transducin repeat-containing Protein
145
Wissenschaftliche Publikationen
•
Recurrent mutations within the amino-terminal region of β-catenin are
probable key molecular driver events in sinonasal
hemangiopericytoma.
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PMID: 25482924
146
Danksagung
An erster Stelle möchte ich meinen Doktorvater Professor Haller nennen. Er
hat diese Arbeit überhaupt erst möglich gemacht, stand mir immer mit Rat
und Tat zur Seite und hat es mir ermöglicht meine eigenen Ideen
umzusetzen und meinen Forschungsgeist auszuleben. Herzlichen Dank!
Besonderer
Dank
gilt
dem
gesamten
Team
der
Diagnostischen
Molekularpathologie. Herr Dr. Moskalev hat mich stets gut beraten und sich
immer Zeit genommen mich in komplizierten Fragestellungen zu beraten und
neue Methoden gemeinsam zu erproben. Vielen Dank auch Simone Hebele,
ohne deren Zeit, Hilfe und Unterstützung es mir nie möglich gewesen wäre
all die Vorgänge im Labor zu erlernen. Nicht zu vergessen natürlich die
moralische Unterstützung, die mir entgegengebracht wurde.
An dieser Stelle möchte ich auch Sarah Barthelmeß nennen. Sie war jeden
Tag im Labor an meiner Seite, hat mit mir Probleme diskutiert, sich durch
sämtliche Schwierigkeiten mit mir gemeinsam gekämpft, hatte immer ein
offenes Ohr und hat für den nötigen Ausgleich in der Freizeit gesorgt. Vielen
Dank für die schöne Zeit und eine wunderbare Freundschaft!
Das gilt natürlich auch in besonderem Maße meiner Schwester Andrea,
meiner Mama Helga und meinem Papa Thomas. Sie haben mir immer
zugehört, mich mit aufmunternden Worten aufgeheitert, mich motiviert und
mich das Ziel nie aus den Augen verlieren lassen. Das ist für mich nicht
selbstverständlich. Nur mit eurer Hilfe und Unterstützung, egal in welchen
Lebensbereichen, war es möglich diesen Weg zu gehen. Dafür bin ich euch
auf ewig dankbar.
Darüber hinaus gilt mein Dank allen Verwandten, Freunden und Bekannten,
die mein Jammern jahrelang ertragen und mich immer wieder aufgebaut und
motiviert haben. Vielen Dank!
147
Lebenslauf/ Curriculum Vitae
Name:
Karin Braumandl
Geburtsdatum:
19.08.1989
Geburtstort:
Straubing
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Eltern:
Helga Braumandl
Thomas Braumandl
Schulausbildung:
1995 – 1996
Dr.-Johanin-Stadler Volksschule Parkstetten
1996 – 1999
Grundschule Hunderdorf
1999 – 2009
Gymnasium der Ursulinen – Schulstiftung
Straubing
26.06.2009
Allgemeine Hochschulreife
Wehrdienst:
01.07.2009
Eintritt in den Sanitätsdienst der Bundeswehr
Uniformträgerin der Luftwaffe
Studium:
2009 - 2015
Studium der Humanmedizin an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen/ Nürnberg
24.08.2011
1. Staatsexamen
148
09.10.2014
2. Staatsexamen
11.12.2015
3. Staatsexamen
16.12.2015
Erhalt der Approbation
Promotion
12.12.2012
Beginn der Promotion am Lehrstuhl für
Diagnostische Molekularpathologie des Instituts
für Pathologie am Universitätsklinikum Erlangen
unter der Betreuung von Prof. Dr. med. Florian
Haller
Berufstätigkeit
21.12.2015
Abteilung für Neurologie am
Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz
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