JAK-2-Mutations-Analyse bei myeloproliferativen Neoplasien (MPN)

JAK-2-Mutations-Analyse bei myeloproliferativen
Neoplasien (MPN)
Genetischer Hintergrund
Die JAK-2 V617F Mutation wird in der Diagnostik von MPN eingesetzt.
Erworbene somatische Mutationen des Gens für die Januskinase 2
(JAK-2) spielen eine zentrale Rolle in der Genese von BCR-ABL1negativen MPNs. Die bei weitem häufigste Mutation JAK-2 V617F führt
zu einer zytoplasmatischen Daueraktivierung der JAK-2, die über eine
kostitutionelle Aktivierung von STAT- (signal transducer and activator of
transcription), MAPK-(mitogen activated protein kinase) und PI3K(phosphotidylinositol 3-kinase) Signalwege zu einer Transformation und
Proliferation von hämatopoietischen Vorläuferzellen führt. Fast alle
Patienten mit Polyzythämia vera (PV) und etwa die Hälfte der Patienten
mit Primärer Myelofibrose (PMF) und Essentieller Throbozythämie (ET)
weisen eine JAK-2 V617F Mutation auf. Wichtig ist dabei, daß die JAK-2
V617F Mutation nicht spezifisch für eine MPN ist und ihre Abwesenheit
auch keine MPN ausschließt.
Material
Paraffingewebe aus dem Tumor (Röllchen oder auf Leerschnitten zum
Makrodissezieren)
Testprinzip
Der Clamped Probe Assay dient der Detektion spezifischer Mutationen
bei Minderheiten von neoplastischen Zellen. Dabei wird der Bereich des
JAK-2-Gens um Codon 617 im Exon 14 mittels einer PCR mit
LightCycler FRET Hybridisierungssonden amplifiziert und anschließend
erfolgt eine Schmelzpunktanalyse. Die Sensor-Sonde enthält die
komplementäre Sequenz für die Mutation V617F, wodurch die
Schmelzpunktanalyse einen höheren Schmelzpunkt bei Amplifikation
von Sequenzen mit Mutation als von Wildtypsequenzen zeigt. Um auch
kleine Anteile von mutierten Sequenzen detektieren zu können, wenn
wenig Tumorzellen im Infiltrat vorliegen, werden LNA-Oligomere
(Clamping Oligomer) zugesetzt, die komplementär zur Wildtyp(WT)Sequenz an Codon 617 binden und aufgrund ihrer veränderten RiboseKonformation mit höherem Schmelzpunkt hybridisieren. Somit dienen sie
als Kompetitor zur Detektionssonde, die komplementär zur Mutation ist,
verhindern die Amplifikation der Wildtypsequenzen und bedingen die
Anreicherung der mutierten Sequenzen. Es werden die Schmelzkurven
aus Ansätzen mit und ohne LNA-Oligomer verglichen.
Beispiele:
Die Abbildung zeigt die Schmelzkurven der Proben von zwei Patienten nach einer PCR des JAK-2Gens im Bereich von Codon 617 mit FRET Hybridisierungssonden am LightCycler. Der Schmelzpunkt
der Sensorsonde beträgt ca. 59,5°C bei 617 Wildtypsequenz und 63,5°C bei V617F.
Im linken Bild zeigt die Patientenprobe die WT-Schmelzkurve. Bei Zugabe von LNA-Oligomer wird die
WT-Schmelzkurve stark unterdrückt durch Blockierung der Amplifikation der WT-Sequenzen. Die
Zellen des Patienten besitzen somit alle die WT-Sequenz.
Im rechten Bild zeigt die Patientenprobe ohne Zugabe von LNA-Oligomer ebenfalls die WTSchmelzkurve. Bei Zugabe von LNA-Oligomer wird aber hier die WT-Schmelzkurve unterdrückt und
es zeigt sich angereichert die V618F-Schmelzkurve. Der Patient hat somit neoplastische Zellen mit
einer V617F-Mutation.