Dokument_5.

Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
1
ZUSAMMENFASSUNG
SUMMARY
1
4
1.1
1.2
2
EINLEITUNG
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.6.1
2.6.2
2.6.3
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
3
BIOLOGIE UND PATHOGENESE DER GATTUNG LEGIONELLA
VORKOMMEN VON LEGIONELLEN IN DER UMWELT
AUFNAHMEMECHANISMEN VON LEGIONELLEN IN PROTOZOEN- UND SÄUGERWIRTSZELLEN
INTRAZELLULÄRE REPLIKATION VON LEGIONELLEN
LYSE DER WIRTSZELLEN DURCH LEGIONELLEN
VIRULENZFAKTOREN VON LEGIONELLEN
Sekretionssysteme und ihre Effektormoleküle
Oberflächenstrukturen
Eisenaufnahmesysteme und weitere Virulenz-assoziierte Faktoren
WIRTSZELLMODELLE FÜR DIE ANALYSE VON LEGIONELLA-INFEKTIONEN
ALLGEMEINE CHARAKTERISTIKA VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
BIOCHEMIE DER PHAGOZYTOSE
BIOCHEMIE DES ENDOZYTISCHEN PATHWAYS
MODIFIZIERUNG DES ENDOZYTISCHEN PATHWAYS DURCH PATHOGENE BAKTERIEN
ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT
MATERIAL UND METHODEN
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.7.1
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.15.1
3.15.2
3.15.3
3.15.4
3.15.5
3.15.6
3.15.7
3.16
3.17
3.18
3.19
3.20
3.21
3.22
3.23
3.24
3.25
3.26
5
5
8
9
11
13
14
14
16
17
18
20
21
22
23
24
25
GERÄTE
25
VERWENDETE BAKTERIENSTÄMME
26
VERWENDETE WIRTSZELLEN
26
VERWENDETE AX2-DICTYOSTELIEN-MUTANTEN
27
ANTIKÖRPER
28
28
CHEMIKALIEN
ANZUCHT DER BAKTERIENSTÄMME
29
Medien
29
KULTIVIERUNG VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
30
KULTIVIERUNG VON ACANTHAMOEBA CASTELLANII, HARTMANNELLA VERMIFORMIS,
TETRAHYMENA PYRIFORMIS UND NAEGLERIA GRUBERI
31
KULTIVIERUNG UND STAMMHALTUNG DER HUMANEN MAKROPHAGENZELLINIE U937
33
33
INFEKTION VON U937-ZELLEN
QUANTIFIZIERUNG DER INTRAZELLULÄRE REPLIKATION MITTELS CFU-WERT-BESTIMMUNG
34
QUANTIFIZIERUNG DER INVASIVITÄT VON BAKTERIEN MITTELS FACS-ANALYSE
34
BESTIMMUNG DER FRUCHTKÖRPERBILDUNG NACH LEGIONELLA-INFEKTION
35
MIKROSKOPISCHE METHODEN
35
Fixierung von Zellen für die Elektronenmikroskopie
35
Fixierung verschiedener Fraktionen eines Optiprepgradienten für die Elektronenmikroskopie 36
Fixierung der Zellen für die Immunfluoreszenz
36
Herstellung einer 4% Paraformaldehydlösung
36
Fixierung der Zellen für die In-situ-Hybridisierung
37
Färbung von Zellen mittels 16S rRNA In-situ-Hybridisierung
37
Immunfluoreszenzfärbung zur Lokalisierung des lysosomalen Markers DdLIMP mit Bakterien 38
ANNEXINFÄRBUNG INFIZIERTER DICTYOSTELIEN ZUR DETEKTION APOPTOTISCHER ZELLEN
38
BESTIMMUNG DES INTRAPHAGOSOMALEN PH-WERTES MITTELS FACS-ANALYSE
(MODIFIZIERT NACH KUEHNEL ET AL.)
39
REMI (RESTRICTION ENZYME MEDIATED INTEGRATION)-MUTAGENESE VON DICTYOSTELIEN 40
SCREENING DER REMI-MUTANTEN NACH LEGIONELLA-RESISTENTEN KLONEN
41
PLASMIDISOLIERUNG FÜR DIE REMI-MUTAGENESE
42
BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION UND DES REINHEITSGEHALTES
42
BEHANDLUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
43
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
43
AUFTRENNUNG VON PROTEINEN MITTELS SDS-PAGE (POLYACRYLAMID-GELELEKTORPHORESE) 44
PROTEINENTRANSFER AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN MITTELS WESTERNBLOT
UND ECL-ENTWICKLUNG
46
STRIPPEN VON WESTERNBLOTS
47
Inhaltsverzeichnis
3.27
3.27.1
3.27.2
3.27.3
3.27.4
3.28
3.29
3.29.1
3.29.2
3.29.2.1
3.29.2.2
3.29.2.3
3.29.3
3.29.4
DIE ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE
Rehydratisierung der IPG-Streifen
Die isoelektrische Fokussierung: erste Dimension
Äquilibrierung von IPG-Streifen
Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese: zweite Dimension
SILBERFÄRBUNG VON 2D-GELEN
ISOLIERUNG BAKTERIENHALTIGER PHAGOSOMEN AUS DICTYOSTELIUM
Aufschluss infizierter Zellen
Isolierung von Phagosomen mit Hilfe magnetischer Beads
Protein G-beschichtete Beads
Streptavidin-beschichtete Beads
Tosylierte Beads
Isolierung von Phagosomen mittels Dichtegradientenzentrifugation
Isolierung von Phagosomen mittels Zentrifugation und magnetischer Entfernung
von verunreinigenden Lysosomen
3.29.4.1
Herstellung kolloidaler Eisenpartikel (nach Rodriguez-Paris et al., 1993)
3.29.4.2
Herstellung eines Elektromagneten für die magnetische Eliminierung von Lysosomen
3.29.4.3
Reinigung der Phagosomen unter gleichzeitiger Eliminierung der Lysosomen
3.29.5 Reinigung von Phagosomen nach vorheriger Behandlung mit INT
3.30
TRITONBEHANDLUNG GEREINIGTER PHAGOSOMEN
3.31
PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD
3.32
BESTIMMUNG DER SAUREN PHOSPHATASEAKTIVITÄT
48
48
48
49
50
50
52
52
53
53
53
54
54
4
59
ERGEBNISSE
4.1
4.1.1
4.1.2
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.3.7
4.3.8
4.4
4.4.1
4.4.1.2
4.4.1.3
4.4.2
4.4.2.1
4.4.2.2
4.4.2.3
4.4.2.4
4.4.2.5
4.4.3
4.4.3.1
WIRTSZELLSPEZIFITÄT DER GATTUNG LEGIONELLA
Untersuchung zur Spezifität der Legionella-Wirtszell-Interaktion
Zusammenfassung
ETABLIERUNG VON DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM ALS NEUES WIRTSZELLSYSTEM
Wahl des Infektionsmediums
Einfluss verschiedener Zucker auf die Invasionseffizienz
Nachweis der intrazellulären Vermehrung von Legionellen in Dictyostelium mittels
In-situ-Hybridisierung und Elektronenmikroskopie
Einfluss einer Legionella-Infektion auf die Entwicklung von Dictyostelium und die
Ausbildung von Fruchtkörpern
Untersuchungen zur Legionella-spezifischen Induktion der Apoptose in
D. discoideum und T. pyriformis
Zusammenfassung
ANALYSE BENÖTIGTER WIRTSFAKTOREN WÄHREND EINER LEGIONELLA-INFEKTION
IN DICTYOSTELIUM
Herstellung und Screening zufälliger Mutanten von D. discoideum
Untersuchung spezifischer AX2-Zytoskelett-Mutanten hinsichtlich ihres Einflusses
auf eine Infektion mit Legionellen
Untersuchung der REMI-Mutante RB2 sowie der spezifischen Knock-out Mutante lmpAEinfluss verschiedener Calcineurin Überexpressionsmutanten auf eine Infektion mit Legionellen
Untersuchung zur Kolokalisierung des lysosomalen Markers DdLIMP mit Phagosomen
Bestimmung des intraphagosomalen pH-Wertes von Legionella-Stämmen in D. discoideum
Einfluss von Bafilomycin auf die Infektion von Dictyostelium mit Legionella
Zusammenfassung
ISOLIERUNG BAKTERIEN-HALTIGER PHAGOSOMEN AUS D. DISCOIDEUM
Isolierung von Bakterien-gelabelten Magnetbeadphagosomen
Kopplung von Bakterien an verschiedene magnetische Beads
Magnetische Reinigung von Phagosomen
Isolierung Bakterien-haltiger Phagosomen über diskontinuierliche Optiprepgradienten
Bestimmung eines geeigneten Gradienten
Versuch der spezifischen Lyse der Lysosomen mit GPN (Strømhaug et al., 1998)
Magnetische Eliminierung von Lysosomen aus Homogenaten
Elimination kontaminierender Mitochondrien aus der phagosomalen Fraktion
Analyse der Phagosomenpräparation mittels Enzymassays und Western Blotting
Analyse von Phagosomenpräparationen mittels 2D-Gelelktrophorese
Zusammenfassung
55
55
55
56
55
57
57
58
59
69
69
69
71
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81
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87
88
88
89
89
90
94
94
96
97
98
102
105
107
Inhaltsverzeichnis
5
DISKUSSION
5.1
5.2
5.3
5.3.1
5.3.2
5.4
5.5
WIRTSSPEZIFITÄT DER GATTUNG LEGIONELLA
DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM, EIN NEUES WIRTSMODELL
DETEKTION VON WIRTSFAKTOREN BEI EINER LEGIONELLA-INFEKTION
Untersuchung infektionsresistenter AX2 Mutanten nach ungerichteter Mutagenese
Unersuchung spezifischer Dictyostelienmutanten
CHARAKTERISIERUNG INTRAPHAGOSOMALER PH-WERTE VERSCHIEDENER
LEGIONELLA-SPEZIES
CHARAKTERISIERUNG UND ISOLIERUNG BAKTERIEN-HALTIGER PHAGOSOMEN
AUS DICTYOSTELIUM
109
109
112
114
114
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119
121
6
LITERATURVERZEICHNIS
128
7
ANHANG
140
7.1
7.2
7.3
7.4
ABKÜRZUNGEN
PUBLIKATIONEN
TAGUNGSBEITRÄGE
LEBENSLAUF
140
142
142
143