Dokument_24.

Einfluss der Prozessivität der Reversen Transkriptase des
humanen Immundefizienzvirus Typ I auf die G-zu-A
Mutationsrate induziert durch APOBEC3-Proteine
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Stefanie Andrea Knöpfel
aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
Vorsitzender der Prüfungskommission:
Erstberichterstatter:
Zweitberichterstatter:
19.09.2008
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
PD Dr. Robert Slany
Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein
Publizierte Veröffentlichungen
Knoepfel SA, Salisch NC, Huelsmann PM, Rauch P, Walter H, Metzner KJ.
Comparison of G-to-A mutation frequencies induced by APOBEC3 proteins in H9
cells and peripheral blood mononuclear cells in the context of impaired processivities
of drug-resistant human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase variants.
J Virol. 2008 Jul;82(13):6536-45
Allers K, Knoepfel SA, Rauch P, Walter H, Opravil M, Fischer M, Günthard HF,
Metzner KJ. Persistence of lamivudine-sensitive HIV-1 quasispecies in the presence
of lamivudine in vitro and in vivo.J Acquir Immune Defic Syndr. 2007 Apr
1;44(4):377-85
“Don’t be afraid to tackle science if you enjoy it.”
Tak Mak
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung........................................................................................................1
1.1
Das humane Immundefizienz Virus .............................................................1
1.2
Pathogenese und Klinik der HIV-1 Infektion .............................................2
1.3
Genetische Variabilitiät von HIV-1..............................................................3
1.4
Die antiretrovirale Therapie und Resistenz-assoziierte Mutationen ........4
1.5
Die reverse Transkription.............................................................................5
1.6
Prozessivität von Varianten der HIV-1 Reversen Transkriptase .............7
1.7
Viral infectivity factor (Vif) und seine Interaktion mit Apolipoprotein B
mRNA-editing enzyme, catalytic polypeptide 3 (APOBEC3)-Proteinen .....8
2
Zielsetzung..................................................................12
3
Material und Methoden .............................................13
3.1
Reagenzien....................................................................................................13
3.2
Puffer, Lösungen und Medien ....................................................................14
3.3
Enzyme und Antikörper..............................................................................15
3.4
Kommerzielle Kits .......................................................................................16
3.5
Oligonukleotide ............................................................................................16
3.6
Plasmide ........................................................................................................18
3.7
Nachweis und Analyse von DNA................................................................19
3.7.1
Agarose-Gelelektrophorese ...........................................................................19
3.7.2
DNA-Präparation durch freeze & squeeze.....................................................20
3.7.3
Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA...............................20
3.8
Polymerase-Ketten-Reaktion......................................................................21
3.8.1
Quantitative real-time PCR ...........................................................................22
3.8.2
Allel-spezifische real-time PCR ....................................................................23
3.8.3
Schmelzkurven-Analyse ................................................................................23
I
Inhaltsverzeichnis
3.8.4
DNA-Sequenzierung......................................................................................24
3.9
Methoden zur RNA- und DNA-Präparation.............................................24
3.9.1
Präparation von Plasmid-DNA ......................................................................24
3.9.2
PCR-Aufreinigung .........................................................................................25
3.9.3
Isolierung genomischer DNA........................................................................25
3.9.4
Isolierung gesamtzellulärer RNA ..................................................................25
3.9.5
Isolierung viraler RNA ..................................................................................26
3.9.6
Synthese von cDNA.......................................................................................26
3.10
Zielgerichtete DNA-Mutagenese ................................................................26
3.10.1
Zweistufige PCR-Mutagenese .......................................................................26
3.10.2
Orts-gerichtete Mutagenese ...........................................................................27
3.11
Klonierung von DNA-Fragmenten.............................................................28
3.11.1
Restriktion von DNA-Fragmenten.................................................................28
3.11.2
Dephosphorylierung und Ligation von DNA-Fragmenten............................29
3.12
Nutzung von Bakterien................................................................................29
3.12.1
Kultivierung und Lagerung von Bakterien....................................................29
3.12.2
Herstellung von Transformations-kompetenten Zellen .................................30
3.12.3
Transformation durch Hitzeschock................................................................30
3.12.4
Screening der Bakterienklone ........................................................................30
3.13
Eukaryotische Zellen...................................................................................31
3.13.1
Kultivierung von eukaryotischen Zellen........................................................31
3.13.2
Isolierung und Kultivierung von peripheral blood mononuclear cells .........31
3.13.3
Zellzählung und Vitalitätsbestimmung..........................................................31
3.13.4
Transiente Transfektion von 293T-Zellen.....................................................32
3.13.5
Kryokonservierung und Auftauen von eukaryotischen Zellen......................32
3.14
Virusstock-Charakterisierung ....................................................................33
3.14.1
Virusanzucht zur Herstellung infektiöser Stock-Lösungen...........................33
3.14.2
HIV-1 p24 Antigen-ELISA ...........................................................................33
3.15
Infektion eukaryotischer Zellen mit HIV-1...............................................34
3.15.1
Bestimmung der Permissivität.......................................................................34
3.15.2
Bestimmung der G-zu-A Mutationsrate in HIV-1 DNA ...............................34
3.16
Statistische Datenauswertung .....................................................................35
II
Inhaltsverzeichnis
4
Ergebnisse...................................................................37
4.1
Replikationsverhalten von HIV-1 NL4-3 und HIV-1 NL4-3Dvif
Varianten in T-Zelllinien und PBMCs.......................................................37
4.2
APOBEC3G mRNA Gehalt in H9 Zellen ist höher verglichen mit
PBMCs vier verschiedener Spender ..........................................................39
4.3
Keine Unterschiede in der viralen Mutationsrate in Abhängigkeit von
der RT-Variante in Anwesenheit von Vif ..................................................40
4.4
Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3Dvif M184I infizierten H9 Zellen zeigen
erhöhte G-zu-A Mutationsraten.................................................................43
4.5
Keine Unterschiede in den G-zu-A Mutationsraten in nef und 3`LTR aus
infizierten H9 Zellen bezüglich der HIV-1 NL4-3Dvif RT Varianten ....46
4.6
Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3Dvif M184I und HIV-1 NL43DvifK65R/M184V infizierten PBMCs zeigen erhöhte G-zu-A
Mutationsraten.............................................................................................48
4.7
Die Analyse des Dinukleotid-Kontextes in env und nef+3`LTR zeigt
präferentielle G-zu-A Transitionsstellen...................................................51
5
Diskussion...................................................................53
6
Zusammenfassung......................................................60
7
Literaturverzeichnis...................................................62
8
Abkürzungsverzeichnis ..............................................70
9
Danksagung................................................................72
10
Erklärung ...................................................................73
III
Inhaltsverzeichnis
11
IV
Lebenslauf ..................................................................74
Einleitung
1
Einleitung
1.1
Das humane Immundefizienz Virus
1981 wurde zum ersten Mal ein Syndrom klinisch beschrieben, das bei einer Gruppe
homosexueller Männer mit schweren opportunistischen Infektionen auftrat. Grund
dafür
war
eine
schwere
Immunschwäche,
weswegen
es
als
erworbenes
Immunschwäche-Syndrom (acquired immunodeficiency symdrome, AIDS) bezeichnet
wurde. Im Jahr 1983 wurde ein Retrovirus von der Gruppe von Luc Montagnier
(Pasteur Institute, Paris) aus einem Lymphknoten eines Patienten isoliert 6. Durch
elektronenmikroskopische Untersuchungen wurde dieses neuentdeckte Virus in die
Gruppe der Lentiviren eingeordnet, und 1986 wurde es als humanes Immundefizienz
Virus (HIV) bezeichnet. Im selben Jahr wurde noch ein zweiter Typ dieses Virus aus
Patienten mit AIDS isoliert, weswegen heute zwischen dem Typ I (HIV-1) und dem
Typ II (HIV-2) unterschieden wird 17. HIV-2 tritt nur endemisch in Westafrika auf,
wohingegen HIV-1 die Pandemie verursacht hat. Bei HIV handelt sich um ein
umhülltes Virus von etwa 100 nm Durchmesser. In der Hüllmembran sind zwei
Moleküle verankert: Die Glykoproteine gp120 und gp41. Sie werden aus dem
gemeinsamen Vorläuferprotein gp160 gebildet. Im Inneren befindet sich ein Kapsid,
gebildet aus dem p24-Protein. Darin liegt das HIV Genom, das sich aus zwei
identischen Plusstrang RNA-Moleküle zusammensetzt. Zudem befinden sich im
Kapsid folgende virale Enzyme: Die Reverse Transkriptase (RT), Integrase und
Protease (Abb 1.1).
Abb 1.1 Schematische Darstellung des humanen Immundefizienz Virus Typ 1. Dargestellt sind
Strukturproteine, virale Enzyme und virale RNA 25.
1
Einleitung
Das Genom von HIV-1 besteht aus etwa 9.500-9.800 Nukleotiden und kann mit Hilfe
viraler Proteine nach der reversen Transkription in das Wirtszellgenom integriert
werden (Abb 1.2). Die Gene werden unter Mitwirkung der viralen Proteine Tat und
Rev
von
der
zelluläre
Maschinerie
transkribiert
und
translatiert.
Ein
Replikationszyklus dauert ein bis zwei Tage und die neuen Viruspartikel werden
freigesetzt.
Abb 1.2 Aufbau des proviralen HIV-1 Genoms. Angegeben sind Abkürzungen und Lage der Gene
und Genprodukte (http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/MAP/landmark.html).
Obwohl Mitte der 1980er Jahre prognostiziert wurde, dass die Entwicklung eines
wirksamen Impfstoffes gegen HIV-1 nur weniger Jahre bedarf, hat die Wissenschaft
dieses Ziel bis heute nicht erreichen können. Im Jahr 1992 war AIDS die
Haupttodesursache bei Menschen zwischen 25 und 44 Jahren in den U.S.A. 25, und im
Jahr 2007 waren weltweit etwa 33 Millionen Menschen infiziert
95
. In Deutschland
steigen nach jahrelangem Rückgang die Zahl der HIV-Neuinfektionen seit 2001
wieder an 77.
1.2
Pathogenese und Klinik der HIV-1 Infektion
Eine HIV-Infektion verläuft klinisch in mehreren Stadien (Abb 1.3). Drei bis sechs
Wochen nach der Ansteckung kommt es meist zu einem akuten HIV-Syndrom; dieses
ist durch Fieber, Abgeschlagenheit und andere Symptome gekennzeichnet. Wegen der
Ähnlichkeit mit grippalen Infektionen bleibt das akute HIV-Syndrom oft unerkannt.
In dieser Phase kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung des Virus mit einem
gleichzeitigen Abfall der CD4+ T-Lymphozyten. Sie dauert selten mehr als vier
Wochen. Danach sinkt die Viruslast im Blut und die CD4+ Zellzahl steigt wieder an,
jedoch wird der Ausgangsgehalt an CD4+ T-Lymphozyten nicht mehr erreicht.
Hierauf folgt eine Latenzphase, die bei erfolgreicher antiretroviraler Therapie (ART)
Jahre bis Jahrzehnte andauern kann. Bleibt die HIV-1 Infektion unbehandelt, sinkt die
Zahl der CD4+ T-Lymphozyten kontinuierlich ab, und es kommt im Median neun bis
elf Jahre nach der Erstinfektion zu einem schweren Immundefekt (<200 CD4 +
2
Einleitung
T-Lymphozyten/ml). Dieser führt zu AIDS-definierenden Erkrankungen. Zu diesen
zählen opportunistische Infektionen, die durch Viren, Bakterien, Pilze oder Parasiten
bedingt sind, sowie andere Erkrankungen, wie Karposi-Sarkom, malignes Lymphom,
HIV-Enzephalopathie. Unbehandelt führt AIDS zum Tod.
Abb 1.3 Krankheitsverlauf einer HIV-1 Infektion. Angegeben ist der zeitliche Verlauf von CD4 +
Zellzahlgehalt und Viruslastverlauf 25.
1.3
Genetische Variabilitiät von HIV-1
HIV-1 gehört zu den genetisch variabelsten Viren (Abb 1.4). Diese hohe
Mutationsrate ist bedingt durch zelluläre und virale Faktoren. Zu den bedeutendsten
zellulären Faktoren zählen APOBEC3 Proteine (Kapitel 1.7). Daneben beeinflussen
virale Faktoren die Mutationsrate. Der Replikationszyklus von HI-Viren beträgt nur
ein bis zwei Tage von der Anbindung an die Wirtszelle bis zum Freiwerden der
Virionen. Dies bedeutet, dass sich in der chronischen Phase alle zwei Tage etwa
1 x 1010 neue Virionen in einer HIV-1 infizierten Person bilden
35,98
. Die virale
Reverse Transkriptase besitzt keine Korrekturlese-Funktion. Ihre Fehlerrate liegt
ungefähr bei 1 Nukleotidaustausch pro 10.000 transkribierter Nukleotide. Daraus
ergibt sich theoretisch eine Mutation pro neuem Provirus. Bei der Menge an Virionen,
die täglich neu generiert werden, können theoretisch alle möglichen Punktmutationen
während eines Replikationszyklusses entstehen 72. Viele Mutationen haben keinerlei
Auswirkung auf Resistenz oder Replikationskapazität, andererseits führen viele
Mutationen
zu
replikationsinkompetenten
Virionen.
Demgegenüber
stehen
Mutationen, die Resistenz gegenüber antiretroviralen Medikamenten oder den
3
Einleitung
Immunantworten des Wirtes vermitteln. Diese können rasch selektioniert werden, so
dass sich HIV-1 schnell an verändernde Bedingungen anpassen kann.
Abb 1.4 Diversität von HIV-1 verglichen mit Influenzavirus. Gezeigt ist die Variabilität von dem
H3 Gen des Influenzavirus in 96 Individuen, von HIV-1 in einem infizierten Individuum sechs Jahre
nach Serokonversion und von HIV-1 Sequenzen aus 196 Infizierten 47.
1.4
Die antiretrovirale Therapie und Resistenz-assoziierte
Mutationen
Obwohl bisher weder die Entwicklung eines effizienten HIV-1 Impfstoffs erfolgreich
war noch eine Therapie zur Verfügung steht, die eine HIV-1 Infektion heilt, kann der
Krankheitsverlauf durch die heutige antiretrovirale Therapie deutlich verzögert
werden. Seit Mitte der 1990er wird eine Kombinationstherapie eingesetzt. Im Moment
stehen Medikamente aus fünf unterschiedlichen Klassen zur Verfügung: Die
Nukleosid-/Nukleotid-analogen Reverse Transkriptase Inhibitoren (NRTIs), die
Nicht-NRTIs (NNRTIs), Protease Inhibitoren (PI), Integrase Inhibitoren (INI) und
Eintrittsinhibitoren (Abb 1.5). Durch die Therapie kann die Viruslast dauerhaft unter
die Nachweisgrenze gesenkt werden und somit sinkt auch die Wahrscheinlichkeit,
dass sich Mutationen im HIV-1 Genom ansammeln. Dies ist wichtig, da Mutationen
in Schlüsselproteinen weitreichende Folgen haben: Es können Resistenzmutationen
oder immun-escape Varianten entstehen. Zwei der prominentesten NRTI Resistenzassoziierten Mutationen liegen im Bereich des katalytischen YMDD-Motives: M184V
(ATG zu GTG) und M184I (ATG zu ATA). Beide Transitionen führen zu Resistenz
gegen Lamivudin und Emtrizitabin. Diese Aminosäureaustausche sind zusätzlich
interessant, da sie die Fehlerrate und die Prozessivität der HIV-1 RT herabsetzen
4,47,84
. Diese Beeinträchtigung der Prozessivität wird sogar noch verstärkt, tritt neben
4
Einleitung
der M184V zusätzlich die K65R Mutantion auf; letztere führt zur Resistenz gegen
Tenofovir und Abacavir 21,62,84,100.
Integrase
inhibitors
Abb 1.5 Angriffspunkte der aktuellen antiretroviralen Therapie. Angegeben sind die essentiellen
Replikationsschritte von HIV-1 und die entsprechenden Angriffsziele der Therapie, modifiziert nach 87.
1.5
Die reverse Transkription
Die Synthese der viralen DNA nach dem Eintritt des Virus in die Zelle ist ein
komplexer Prozess (Abb 1.6). Zelluläre tRNA Lys3 (transfer RNA, die während der
Proteinbiosynthese mit Lysin beladen wird, erkennt die Kodons AAG und AAA in der
mRNA-Sequenz)
75
aus der zuvor infizierten Zelle dient als Startoligonukleotid und
bindet an die virale primer binding site (PBS). Die DNA wird entlang des RNAAusgangsstranges bis zum 5`-Ende des RNA Genoms über die U5 Region bis zur
repeat-Region (R-Region) synthetisiert. Die R-Region kommt an beiden Enden des
RNA-Genoms vor. Anschließend wird die RNA vom doppelsträngigen RNA/DNAHybrid durch die RNase H Domäne der RT verdaut, wodurch eine einzelsträngige
DNA entsteht. Nun findet der erste Strangtransfer statt, wobei die nun exponierte
5
Einleitung
einzelsträngige DNA an die R-Region des 3`-Endes der viralen RNA bindet und die
RNA-abhängige DNA-Synthese wird fortgesetzt. Die DNA-Synthese und der RNAAbbau entlang des RNA-Stranges wird bis zum Polypurin Trakt (PPT) weitergeführt,
eine spezielle Region nahe des 3`-Endes der RNA (Abb 1.6). Dieser Abschnitt ist
zunächst refraktär gegenüber dem Verdau durch die RNase H Domäne und dient nun
als Startpunkt für die DNA-abhängige DNA-Synthese, wodurch die doppelsträngige
DNA synthetisiert wird. HIV-1 besitzt zusätzlich noch einen zentralen PPT (cPPT),
der sich weiter 5` befindet und der als zweiter Startpunkt der Zweitstrangsynthese
fungiert. Die doppelsträngige DNA, ausgehend vom PPT, endet mit der PBS. Die
tRNALys3 wird degradiert, so dass die Region des PBS einzel- und plussträngig
verbleibt. Nun kommt es zum zweiten Strangtransfer, wobei diese PBS-Region an die
inzwischen
synthetisierte,
komplementäre
PBS-Region
der
einzel-
und
minussträngige DNA binden kann. Im weiteren Verlauf wird die Zweitstrangsynthese
vollständig abgeschlossen und auch die minussträngige DNA am 5`-Ende entlang des
Plusstranges vervollständigt.
Abb 1.6 Prozess der reversen Transkription. Dargestellt ist die RNA (schwarz), die minussträngige
DNA (orange) und die Plusstrang-DNA (rot). Weiterhin angegeben sind die PBS, der PPT und die
identischen long terminal repeat (LTR) Sequenzen 18.
6
Einleitung
1.6
Prozessivität von Varianten der HIV-1 Reversen
Transkriptase
Die Prozessivität einer DNA-Polymerase stellt die durchschnittliche Anzahl an
Nukleotiden dar, die an ein Oligonukleotid angehängt werden, ohne dass die DNAPolymerase vom DNA-Strang abdissoziiert 5. Man geht davon aus, dass eine
verringerte Prozessivität dazu führt, dass eine DNA-Synthese langsamer verläuft.
Mutationen im Gen der HIV-1 RT können neben der Resistenz auch die
Syntheseleistung und Prozessivität des Enzyms beeinflussen. Von besonderem
Interesse sind in diesem Zusammenhang Mutationen an den Positionen 65 und 184
der
Reversen
Transkriptase.
Die
M184V-Variante
besitzt
eine
verringerte
Prozessivität von ~82% der WT Aktivität, die M184I-Variante nur ~53% der WT
Aktivität
3,4,11,28,84
. Die Prozessivität wird noch weiter herabgesetzt, wenn die dNTP
Konzentration gering und/oder unbalanciert ist, was für primäre Zellen zutrifft
Neben
den
Medikamentenresistenz-vermittelnden
Mutationen
sollten
12
.
auch
Mutationen untersucht werden, die keine Resistenz vermitteln jedoch ebensfalls eine
eingeschränkte Prozessivität zeigen. Die Position Y115 liegt in der Nähe des
katalytischen Zentrums der RT 59. Mutationen an Position Y115 können die Fehlerrate
der RT beeinflussen, die Mutation Y115A vermittelt ein 4-10x niedrigere Fehlerrate
13,59
als die Wildtyp-RT
. Zudem ist die Prozessivität ist stark reduziert, die
Dissoziationskonstante ist viermal höher als beim Wildtyp-Enzym
59
. Die
Kombination der Mutationen R78A/Q151N besitzt eine 14x niedrigere Fehlerrate als
die Wildtyp-RT
56
. Die R78 Position liegt in der Region, die mit den template
Nukleotiden interagiert, die Q151 in der dNTP-Bindungsstelle
gezeigt,
dass
auch
beide
Mutationen
einzeln
beziehungsweise verlangsamte DNA-Synthese aufweisen
46,56
. Weiter wurde
verringerte
Prozessivität
46,99
. Schließlich liegt eine
weitere zu untersuchende RT-Mutation in der RNase H-Domäne der RT an Position
D549; dies ist eine hochkonservierte Aminosäure in RTs sowohl von Bakterien als
auch von Retroviren
19
. In single-replication assays verursacht die D549N Mutation
eine 5-10x Reduktion viraler Titer, gleichzeitig vermittelt sie schwache Resistenz
gegen Azidothymidin und Stavudin
68
. Durch die verlangsamte RNase H Aktivität
wird gleichzeitig die DNA-Polymerase Aktivität der RT erniedrigt.
7
Einleitung
1.7
Viral infectivity factor (Vif) und seine Interaktion mit
Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic
polypeptide 3 (APOBEC3)-Proteinen
Abb 1.7 Die Rolle von Vif im Zusammenhang mit der antiretroviralen Aktivität von
APOBEC3G. Ohne Vif wird APOBEC3G in die Viruspartikel verpackt und in der nächsten
Infektionsrunde kommt es zu G-zu-A Transitionen. Bei Vif-Expression wird APOBEC3G degradiert
und gelangt somit nicht in die Virionen 34.
Vif ist ein basisches, 23 kDa großes Phosphoprotein, das spät im HIV-1
Replikationszyklus exprimiert wird und in allen Lentiviren außer dem equinen
infektiösen Anämie Virus vorkommt. Vif zählt zu den akzessorischen Proteinen von
HIV-1. Für die Replikation von HIV-1 ist es in einigen T-Zelllinien und in PBMCs
essentiell (nicht-permissive Zellen), wohingegen Vif in anderen T-Zelllinien nicht
vorhanden sein muss, um eine virale Replikation zu ermöglichen (permissive Zellen).
Eine wichtige Beobachtung dabei war, dass Vif-defiziente HI-Viren alle Zellen in der
8
Einleitung
ersten Infektionsrunde infizieren konnten und auch Virionen generiert wurden, diese
in
der
nächsten
Zielzelle
aber
nicht
replizieren
26
konnten
.
Durch
Zellfusionsexperimente permissiver und nicht-permissiver Zellen konnte gezeigt
werden, dass ein zellulärer Faktor für die Hemmung der Replikation Vif-defizienter
Viren verantwortlich sein muss
charakterisiert
53
. 2002 wurde dieses Protein isoliert und
85
. Es handelt sich um APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA-editing
enzyme, catalytic polypeptide like 3G).
APOBEC3G wird in der Abwesenheit von Vif mit in neue Virionen verpackt und erst
in der nächsten Zielzelle wird HIV-1 durch dieses zelluläre Protein inhibiert
Dieser
Einbau
innerhalb
des
Kapsids
wird
durch
Interaktionen
Nukleokapsidregion des HIV-1 Gag Polyproteins vermittelt
58,88
mit
.
der
2,14,51
. Zusätzlich wird
diese Verbindung durch die Affinität von APOBEC3G zu einzelsträngigen
Nukleinsäuren gestärkt, im Fall von HIV-1 durch die virale RNA
44,81,92,106
.
Stoöchiometrische Untersuchungen ergaben, dass pro Virion etwa 4-7 APOBEC3G
Moleküle verpackt werden
102
.
In der neuinfizierten Zelle verändert APOBEC3G die virale, einzelsträngige,
Minusstrang-DNA durch C-zu-U Deamination während der reversen Transkription
91,105
. Diese derart mutierte DNA wird teilweise durch zelluläre DNA-Reparatur-
Enzyme wie der Uracil DNA Glykosylase-2 abgebaut
83,103
. Nicht- degradierte virale
DNA kann in das Wirtszellgenom integriert werden. Die C-zu-U Deamination in der
minussträngigen DNA führt im Plusstrang dementsprechend zu G-zu-A Mutationen,
dabei können bis zu 10% aller Guaninmoleküle mutiert sein
32,49,54,107
. APOBEC3G
führt bei einzelsträngiger DNA zur C-zu-U Deamination, nicht jedoch in RNA oder in
doppelsträngiger DNA. Während der reversen Transkription bleiben der Polypurin
Trakt im Zentrum (cPPT) und am 3`Ende (PPT) weitgehend doppelsträngig und somit
unzugänglich für APOBEC3G (Abb 1.6). Der Kinetik der reversen Transkription
entsprechend findet man in der proviralen HIV-1 DNA zwei 5` bis 3` polarisierte Gzu-A Gradienten, jeder mit einem Maximum jeweils 5` zum cPPT und PPT. Die
Gradienten entsprechen der Zeit, in der die virale DNA einzelsträngig ist
15,90,105
.
Ist Vif vorhanden, bindet es an APOBEC3G und führt zu dessen Degradation durch
den Proteasomenweg
86
. Dadurch kann APOBEC3G nicht in die Viren verpackt
werden und die Replikation von HIV-1 ist nicht gehemmt. Die Funktion von Vif und
die antiretrovirale Aktivität von APOBEC3G ist in Abbildung Abb 1.7 dargestellt.
9
Einleitung
Antiretrovirale Aktivität ist auch bei weiteren APOBEC3 Proteine beschrieben
worden: APOBEC3B 23, APOBEC3C
104
, APOBEC3DE
20
und APOBEC3F
108
. Alle
führen zu G-zu-A Hypermutationen im viralen Plusstrang. APOBEC3DE und
APOBEC3F werden wie APOBEC3G durch Vif antagonisiert, APOBEC3B und
APOBEC3C sind resistent gegenüber Vif. Wobei jedoch APOBEC3B nicht in den
Zielzellen von HIV-1 exprimiert wird und somit keine Rolle in der zellulären Abwehr
gegen HIV-1 spielt; APOBEC3C besitzt nur eine geringe antiretrovirale Aktivität
23,104
. Weiterhin ist die Hemmung der HIV-1 Replikation durch APOBEC3G
speziesabhängig
58
: Murines APOBEC3G wird nicht durch Vif von HIV-1
antagonisiert und hemmt die Replikation von HIV-1 in der Ab- oder Anwesenheit von
Vif
23
. Auch APOBEC3G aus den Affenspezies Afrikanische grüne Meerkatze und
Rhesusaffen
hemmt
die
Replikation
von
HIV-1.
Aufgrund
der
hohen
Sequenzhomologie von 95% zum humanen APOBEC3G findet eine Interaktion
zwischen HIV-1 Vif und Schimpanzen-APOBEC3G statt, folglich wird HIV-1
dadurch nicht gehemmt
58
. Umgekehrt wird die Replikation von simian
immunodeficiency virus (SIV) aus Rhesusaffen (Rh) nicht durch APOBEC3GRh
jedoch durch humanes APOBEC3G inhibiert 58.
Im Gegensatz zu anderen Vertretern der APOBEC-Familie wie APOBEC1 und AID,
die nur eine katalytische Domäne besitzen, enthält APOBEC3G zwei Cytidin
Deaminsase Domänen
48
Bindung
C-terminale
und
die
: Die N-terminale katalytische Domäne vermittelt RNA
Deaminaseaktivität
31,37,66,67
Dinukleotid am 3`-C
10,33,50,54,101,107
.
katalytische
APOBEC3G
Domäne
deaminiert
die
Deoxycytidin
präferentiell
das
CC
. Im Plusstrang findet man deswegen präferentiell
GG-zu-AG Mutationen.
APOBEC3G hat zusätzlich noch Deaminase-unabhängige antivirale Aktivitäten. 1)
Die Aktivität der HIV-1 RT kann durch die RNA-Bindung von APOBEC3G
reduzieren werden
. 2) Die Anwesenheit von APOBEC3G in Dvif-Virionen
9,67,101
vermindert die Fähigkeit des tRNA Lys3 Primers die reverse Transkription zu starten
um ~50% 30. 3) APOBEC3G kann einen Fehler der tRNA Lys3 Abspaltung während des
Plusstrang DNA Transfers verursachen, was zu Bildung von aberranten viralen DNA
Enden führt, die bei der Integration von proviraler DNA interferieren können
60,101
. 4)
APOBEC3G kann im Zytosol einer Zelle in zwei molekularen Formen vorkommen:
In >700 kDa hochmolekularen (high molecular mass = HMM) Ribonukleoprotein
(RNP) Komplexen und in 46-100 kDa low molecular mass Formen. APOBEC3G
10
Einleitung
HMM-Komplexe befinden sich insbesondere in primären aktivierten CD4 + TLymphozyten und Makrophagen, den Zielzellen von HIV-1. Nur in der LMM Form
besitzt APOBEC3G seine Deaminase-Aktivität. So kommt das Enzym vor allem in
primären, ruhenden CD4+ T-Lymphozyten und Monozyten vor, wo APOBEC3G dazu
führt, dass die virale Replikation im Stadium des Präintegrationskomplexes (PIC)
gestoppt wird 16.
11
Zielsetzung
2
Zielsetzung
Die erstbeschriebene antiretrovirale Aktivität von APOBEC3 Proteinen ist die
Deamination von Cytodinen in einzelsträngiger viraler DNA während der reversen
Transkription. Dadurch entstehen im Minusstrang C-zu-U Mutationen, die im
Plusstrang zu G-zu-A Austauschen führen. Dieser Effekt kann insbesondere
beobachtet werden, wenn das HIV-1 Protein Vif nicht exprimiert wird, da Vif zur
Degradation dieser zellulären Deaminasen führt. Werden APOBEC3 Proteine nicht
degradiert, so werden sie in die neuentstehenden Viruspartikel eingebaut und wirken
nach dem Zelleintritt während der reversen Transkription in der nächsten Zielzelle.
Unter Behandlung mit Lamivudin oder Emtrizitabin können die resistenten RTVarianten M184V und M184I selektioniert werden. Beide zeigen eine verringerte
Fehlerrate und außerdem eine verlangsamte DNA-Synthese. Eine weitere Mutation im
Gen der RT, die K65R Mutation, vermittelt Resistenz gegen Tenofovir oder Abacavir
und schränkt die Prozessivität der RT in Kombination mit der M184V Mutation
zusätzlich ein. Es ergab sich daraus die Fragestellung, ob die verringerte
Synthesegeschwindigkeit
mit
einer
höheren,
APOBEC3-bedingten
G-zu-A
Mutationsrate korreliert. Außerdem sollte der Effekt der Deamination der viralen
DNA durch APOBEC3-Proteine in den physiologischen Zielzellen untersucht werden,
da bislang alle Experimente mit Zelllinien beziehungsweise APOBEC3G/Ftransfizierten Zellen durchgeführt wurden.
Zu diesem Zweck sollten APOBEC3G/F-exprimierende H9 Zellen und PBMCs mit
HIV-1 NL4-3Dvif infiziert werden. Neben der Wildtyp RT sollten auch die RT
Varianten M184V, M184I und K65R/M184V verwendet werden. APOBEC3beinhaltende Viren sollten generiert und zur zweiten Infektion dieser Zielzellen
verwendet werden. Die virale DNA sollte kloniert, sequenziert und mit der
Referenzsequenz verglichen werden. Die G-zu-A Mutationsraten sollten verglichen
und eine mögliche Korrelation zur Prozessivität der RT untersucht werden.
Desweiteren sollten die G-zu-A Mutationsraten in Bezug auf APOBEC3G mRNAExpression und der Replikationskapazität der Viren in den verschiedenen Zelltypen
verglichen werden.
Diese Untersuchungen sollen zeigen, wie groß die Auswirkung der Prozessivität der
RT auf die APOBEC3-induzierte G-zu-A Mutationsrate ist und wie ausgeprägt der
Deaminaseeffekt in PBMCs ist.
12
Material und Methoden
3
Material und Methoden
3.1
Reagenzien
Reagenz
Agar
Agarose
Ampicillin
ATP
Bacto-Trypton
Bacto-Hefeextrakt
Bacto-Trepton
b-Mercaptoethanol
Bromphenolblau
BSA
CaCl 2
6-Caroxyl-X-Rhodamin
CDP-StarTM/Saphire IITM
Chloroquin
Chlorophorm
Cohn II
DEPC
Di-Natriumhydrogenphosphat
DMSO
dNTPs
DTT
EDTA
Essigsäure
Ethanol absolut
Ethidiumbromid
Empigen
FKS
Formamide
Glukose
Gene Ruler 1 kb DNA ladder
Glutamin
Glycerol
Histopaque -1077
HIV-1 p24, rekombinant
IL-2
Isopropanol
KAc
KaCl
Kaliumdihydrgenphosphat
KCl
Lipofectamin 2000
M-CSF, human, rekombinant
MgCl 2
MnCl 2
Natriumazid
NAD
NaCl
Na-MOPS
NaOH
Orange G
Hersteller
Becton Dickinson, Heidelberg
Invitrogen, Karlsruhe
Sigma, München
Novagen, Bad Soden
Becton Dickinson
Becton Dickinson
Becton Dickinson
Sigma
Merck, Darmstadt
Sigma
Merck
Molecular Probes, Oregon, USA
Applied Biosystems, Darmstadt
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Merck
Applichem, Darmstadt
Eppendorf, Hamburg
Sigma
Applichem
Applichem
Applichem
Applichem
Merck
Gibco, Eggenstein
Merck
Merck
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Merck
Sigma
Sigma
Aalto Bio Reagents Ltd., Dublin, Irland
Roche, Mannheim
Roth, Karlsruhe
Merck
Merck
Merck
Applichem
Invitrogen
R & D Systems, Wiesbaden
Merck
Merck
Sigma
Biochemika, Duisburg
Merck
Merck
Merck
Sigma
Lagerung
21°C
21°C
-20°C
-20°C
21°C
21°C
21°C
21°C
4°C
4°C
21°C
-20°C
4°C
4°C
-20°C
-20°C
4°C
21°C
21°C
-20°C
-20°C
21°C
21°C
21°C
4°C
21°C
-20°C
21°C
21°C
4°C
21°C
21°C
4°C
4°C
-20°C
21°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
4°C
-20°C
21°C
21°C
21°C
4°C
21°C
21°C
21°C
21°C
13
Material und Methoden
Reagenz
PBS, pH 7,4
Penicillin
PHA
Phenolrotlösung
Perfectin
Schafserum
SDS
Streptomycin
SYBR Green I
Tris
Trizol
Trypanblau
Trypton-Pepton
Trypsin
Tween
Xylencyanol FF
Hersteller
Merck
Sigma
Sigma
Merck
Peqlab, Erlangen
Sigma
Applichem
Sigma
Molecular Probes
Tris
Peqlab
Sigma
Becton Dickinson
Merck
Sigma
Sigma
Lagerung
21°C
-20°C
-20°C
21°C
4°C
-20°C
21°C
-20°C
-20°C
21°C
21°C
21°C
21°C
4°C
21°C
21°C
Tab 3.1 Reagenzien und Lösungen. Angegeben sind Herstellung und Lagerungstemperatur.
3.2
Puffer, Lösungen und Medien
Puffer / Lösungen
H2O-DEPC
PCR und real-time PCR
PCR-Puffer, 10x
PCR-Puffer II, 10x
Puffer ROX-K
Plasmidpräparation
Resuspensionspuffer
Lysispuffer
Neutralisationspuffer
Gelelektrophorese
Laufpuffer
6x Ladefarbstoff
1x TAE-Puffer
EDTA
Herstellung/Hersteller
0,1% DEPC, H2O bidest (v/v), ü. N. 37°C,
autoklavieren
200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl
100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 500 mM KCl
6-Carboxyl-X-Rhodamin in 10x PCR-Puffer II
50 mg Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 10% RNase
A (w/v)
200 mM NaOH, 1% SDS
3 M KAc (pH 5,5)
30 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) in 1x TAE-Puffer
0,2% Orange G (w/v), 0,5% Xylencyanol FF (w/v),
60% Glyzerol, 60 mM EDTA
40 mM Tris HCl, 20 mM Eisessigsäure, 1 mM EDTA
(pH 7,5)
0,5 M EDTA-Dihydroxid, gelöst in H2O-DEPC; pH
8,0 (NaOH)
Lagerung
21°C
-20°C
-20°C
-20°C
4°C
21°C
21°C
21°C
4°C
21°C
21°C
Ligation
T4 DNA-Ligase-Puffer
DNase I Verdau
10x DNase I Puffer
Dephosphorylierung
Antarctic Phosphatase Puffer
Sequenzierung
5x TM-Verdünnungspuffer
Transfektion
2x BES-Puffer
CaCl 2 Lösung
p24-ELISA
10x TROPIX-Puffer
10x TBS
10x TROPIX Assay Puffer
14
50 mM Tris HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl 2, 1mM ATP,
10 mM DTT, 5 µg/ml BSA
-20°C
100 mM Tris, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2
-20°C
New England Biolabs, Frankfurt
-20°C
Applied Biosystems
-20°C
50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 Na2HPO4 (pH 6,95)
2,5 M
-20°C
-20°C
24,3 g Tris Base, 10 ml MgCl2 (1M); auf 1 l mit aqua
dest. Auffüllen, Einstellung auf pH 9,8 mit 1 M HCl
150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 7,5)
Applied Biosystems
4°C
21°C
21°C
Material und Methoden
Puffer / Lösungen
10x NaHCO3
Medien für Bakterienkultur
Herstellung/Hersteller
42 g NaHCO3 (Sigma), 500 ml dH2O (pH 8,5)
2% (w/v) Bacto-Typton, 0,5% (w/v) BactoHefeextrakt, 8,5 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl; nach dem
SOC-Medium
Autoklavieren Zugabe von 1 mM MgCl 2, 2 mM
Glukose
1% (w/v) Pepton, 0,5% (w/v) Bacto-Hefeextrakt, 85,5
LB-Medium
mM NaCl
1,5% (w/v) Agar in LB-Medium gelöst und
LB-Agarplatten
autoklaviert
X-gal
2% in Dimethylformamide
Herstellung kompetenter Bakterienzellen
2% Trypton-Pepton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 0,1 M
Tym-Broth
CaCl 2, 0,01 M MgCl 2 oder MgSO4
0,03 M KAc, 0,05 M MnCl 2, 0,01 CaCl 2, 15% (w/v)
Tbf I
Glycerol, 0,1 M KCl
0,01 M Na-MOPS (pH 7,0), 75 mM CaCl 2, 15% (w/v)
Tbf II
Glycerol, 0,01 KCl
Eukaryote Zellkultur
Invitrogen, mit 10% FKS, 2 mM Glutamin und 120
DMEM
mg/l Penicillin/Streptomycin
Invitrogen, mit 10% FKS, 2 mM Glutamin und 120
RPMI-1640
mg/l Penicillin/Streptomycin
0,25%ige Lösung in 140 mM NaCl, 5,5 mM KCl, 0,5
mM Di-Natriumhydrogenphosphat, 5,5 mM Glucose,
Trypsin-EDTA
25 mM Tris HCl, 0,3 mM EDTA, 0,1% Trypsin (pH
7,5)
Lagerung
21°C
21°C
4°C
4°C
-20°C
4°C
4°C
4°C
4°C
4°C
4°C
Tab 3.2 Puffer, Lösungen und Medien. Angegeben sind Verwendungszweck, Hersteller bzw.
Herstellung und Lagerungstemperatur.
3.3
Enzyme und Antikörper
Enzym
Restriktionsenzym
ApaI
AgeI
BamHI
BbsI (Lagerung -80°C)
DpnI
EcoRI
HindIII
KpnI
MscI
NheI
NotI
PstI
PvuII
SalI
SpeI
SphI
XbaI
XhoI
PCR und SDM
Taq-Polymerase
PfuTurbo DNA-Polymerase
RT-PCR
M-MLV RT
Hersteller/Erkennungssequenz
Erkennungssequenz (5`à3`)
GGGCCC
ACCGGT
GGATCC
GAAGAC(N) 6
GATC
GAATTC
AAGCTT
GGTACC
TGGCCA
GCTAGC
GCGGCCGC
CTGCAG
CAGCTG
GTCGAC
ACTAGT
GCATGC
TCTAGA
CTCGAG
Temperatur
25
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
Eigene Herstellung nach 73
Stratagene, Heidelberg
Invitrogen, Karlsruhe
15
Material und Methoden
Enzym
Dephosphorylierung
Antarctic Phosphatase
Ligation
T4 DNA-Ligase
Weitere Enzyme
Proteinase K
RNase A
RNase-freie DNase I
DNase-freie RNase H
Antikörper
Schaf-anti-HIV-1 p24 gag
Maus-anti-HIV (EH12AP),
Alkaline Phosphatase
konjugiert
Hersteller/Erkennungssequenz
New Englangd Biolabs
New England Biolabs
Sigma, Hamburg
Sigma
Boehringer, Mannheim
Roche
Hersteller
Aalto Bio Reagents Ltd. Dublin, Irland
Aalto Bio Reagents Ltd.
Tab 3.3 Enzyme und Antikörper. Angegeben sind Verwendungszweck, Bezeichnung und Herkunft.
Bei Restriktionsenzymen sind Erkennungssequenz (N = A, T, G oder C) und die optimale Temperatur
angegeben. Wenn nicht anders vermerkt, erfolgte die Lagerung der Enzyme bei -20°C.
3.4
Kommerzielle Kits
Bezeichnung
Big Dye
NucleoSpin Extract II
NucleoSpin RNA-Virus
NucleoSpin Blood
NucleoSpin Plasmid
PureLink HiPure Plasmid DNA Purification
QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis
TripleMaster PCR System
Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Kit
StrataCloneTM PCR Cloning
Anwendung
Sequenzierung
PCR-Reinigung
Isolierung viraler RNA
Isolierung zellulärer DNA
Plasmidisolierung
Plasmidisolierung
Mutagenese
High-Fidelity PCR
High-Fidelity PCR
Klonierung
Hersteller
Applied Biosystems
Macherey-Nagel, Düren
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Invitrogen
Stratagene, Heidelberg
Eppendorf
Stratagene
Stratagene
Tab 3.4 Kommerzielle Kits. Angegeben sind Bezeichnung, Anwendungszweck und Hersteller.
3.5
Oligonukleotide
Schmelztemperaturen
Oligonukleotide
sowie
wurden
mögliche
mit
dem
Dimerisierung
Programm
eines
von
oder
Operon
mehrerer
berechnet
(https://www.operon.com/oligos/toolkit.php). Alle Moleküle wurden über HPLC
aufgereinigt.
Bezeichnung
PCR/Sequenzierung
LTR 1
LTR 464
LTR 606 rc
LTR 611
HIV 713 rc
gag 997 rc
gag 1976
gag 2023
gag 2058
pol 2259
pol 2316
16
Nukleotid-Sequenz (5`à 3`)
Position
TGGAAGGCTAATTTGGTCCt
GGTTAGACCAGATCTGAGCC
GGGTCTGAGGGATCTCTAG
AGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC
CGCTTCAGCAAGCCGAG
TCTGAAGGGATGGTTGTAGC
GCAAAGAAGGGCACATAGCCA
GGCTGTTGGAAATGTGGAAAGG
GGCTGTTGGAAATGTGGAAAGG
GTCACTCTTTGCCAACGACC
GCTCTATTAGATACAGGAGCAG
1-20
464-483
588-606
611-633
698-713
978-997
1976-1996
2023-2044
2058-2081
2259-2279
2316-2337
Material und Methoden
Bezeichnung
pol 2589
pol 2593 rc
pol 2835 rc
pol 2981
pol 3002
pol 3206 rc
pol 3287 rc
pol 3458 rc
pol 3495 rc
pol l3528
int 4286
int 4452
int 4575 rc
int 4677 rc
int 4962
vpr 5685 rc
tat 5979 rc
env 7048
env 7218 rc
env 7326
BamHI/EcoRI env 7045
ApaI / XhoI env 7552 rc
BamHI/EcoRI nef 8737
ApaI/XhoI nef 9297 rc
SCREENselR78A
SCREENselY115A rc
SCREENselQ151N
SCREENselD549N
bact 728 rc
bact 830 rc
APOBEC3G-o.f
APOBEC3G-o.r
Apo3G/FAge1
Apo3GAge1rc
M13 forward
M13 reverse
T7
Sp6rc
Nukleotid-Sequenz (5`à 3`)
CCAGGAATGGATGGCCC
CCTGGCTTTAATTTTACTGGTACAG
GTGGTATTCCTAATTGAACTTCCC
TCAGTACAATGTGCTTCCACAGG
CTGTGGAAGCACATTGTACTG
TTTGTCTGGTGTGGTAAATCCCCAC
CAGCACTATAGGCTGTACTGTC
TTAGAATCTCTCTGTTTTCTGCC
CATGTACCGGTTCTTTTAGAATCTC
GCAGAAATACAGAAGCAGGG
GAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACC
GTAGCAGTTCATGTAGCCAGTG
CTGGTGAAATTGCTGCCATTGTC
CTCCTTGACTTTGGGGATTGTAG
GGTGAAGGGGCAGTAGTAATAC
CCTAAGTTATGGAGCCATATCCTAG
CTTCCTGCCATAGGAGATGCC
CCAATTTCACAGACAATGC
CTACTAATGTTACAATGTGC
GACCCAGAAATTGTAACGCAC
GGATCCGAATTCCTGCCAATTTCACAGACAATGC
GGGCCCCTCGAGCACATTTGTCCACTGATGGGAGG
GGATCCGAATTCGAGCTATTCGCCACATCC
GGGCCCCTCGAGCACGGGTGTAACAAGCTGGTG
GTTCTCTTATTAAGTTCTG
CTAAGGGAACTGAAAAAGC
GTACAATGTGCTTCCAAAT
GGAGGAAATGAACAAGTAA
CGTGGCCATCTCTTGCTC
CTGGAAGAGTGCCTCAGG
CGAATTTCAGCACTGTTGGAGC
GAATTTAGCCATTTCCTGGGC
AAACCGGTATGAAGCCTCACTTCAGAAACAC
AAACCGGTGTTTTCCTGATTCTGGAGAATGG
GTAAAACGACGGCCAG
CAGGAAACAGCTATGAC
TAATACGACTCACTATAGG
GATTTAGGTGACACTATAGA
pNL4-3 genomic DNA rc
TCTTGTGGTATCAGAGTAGAGG
Mutagenese und Klonierung
CTCCAGTATTTGCCATAAAGAGAAAAGACAGTAC
Sdm K65R
TAAATGGAG
CTCCATTTAGTACTGTCTTTTCTCTTTATGGCAAAT
Sdm K65R rc
ACTGGAG
GGAGAAAATTAGTAGATTTCGCAGAACTTAATAA
Sdm R78A
GAGAACTCAAG
CTTGAGTTCTCTTAAGTTCTGCGAAATCTACTAAT
Sdm R78A rc
TTTCTCC
GTACTGGATGTGGGCGATGACAGCTTTTTCAGTTC
Sdm Y115A
CCTTAGATAAAG
CTTTATCTAAGGGAACTGAAAAAGCTGCATCGCC
Sdm Y115Arc
CACATCCAGTAC
CAGTACAATGTGCTTCCAAATGGATGGAAAGGAT
Sdm Q151N
CACCAGC
GCTGGTGATCCTTTCCATTTGGAAGCACATTGTAC
Sdm Q151N rc
T
tg M184I
CCAGACATAGTTATCTATCAATACATAGATGATTT
Position
2589-2605
2569-2593
2812-2835
2981-3003
2982-3002
3182-3206
3266-3287
3458-3480
3471-3495
3528-3547
4286-4311
4452-4473
4575-4597
4655-4677
4962-4983
5661-5685
5959-5979
7048-7066
7199-7218
7326-7346
7045-7066
7552-7533
8737-8755
9280-9297
2781-2800
2982-2910
2984-3003
4176-4195
711-728
813-830
696-717
1085-1105
1-23
1361-1383
1004210063
2722-2764
2722-2764
2760-2805
2760-2805
2871-2916
2871-2916
2982-3022
2982-3022
3075-3125
17
Material und Methoden
Bezeichnung
tg M184I rc
tg M184V
tg M184V rc
Sdm_Age1-insert
Sdm_Age1-insert rc
Sdm D549N_550K
Sdm D549N_550K rc
Reverse Transkription
random hexamers
Real-time PCR
pol 2981
pol 3206 rc
int 4452
int 4677rc
bact428
bact532
APOBEC3G-RT-f
APOBEC3G-RT-r
CCR5 624
CCR5 778rc
IN K65
IN K65R
IN M184
IN M184V
IN 184wt
IN M184I
Nukleotid-Sequenz (5`à 3`)
GTATGTAGGATCTGAC
GTCAGATCCTACATACAAATCATCTATGTATTGAT
AGATAACTATGTCTGG
GACATAGTTATCTATCAATACGTGGATGATTTGTA
TGTAGGATCTGAC
GTCAGATCCTACATACAAATCATCCACGTATTGAT
AGATAACTATGTC
GGAGATTCTAAAAGAACCGGTACATGGAGTGTAT
TATGACC
GGTCATAATACACTCCATGTACCGGTTCTTTTAGA
ATCTCC
GGAGGAAATGAACAAGTAAATAAATTGGTCAGTG
CTGAATC
GATTCCAGCACTGACCAATTTATTTACTTGTTCAT
TTCCTCC
Position
NNNNNN
-
TCAGTACAATGTGCTTCCACAGG
TTTGTCTGGTGTGGTAAATCCCCAC
GTAGCAGTTCATGTAGCCAGTG
CTCCTTGACTTTGGGGATTGTAG
CCCAGCCATGTACGTTGC
CCATCTACGAGGGGTATGC
GAACCTTGGGTCAGAGGAC
CCGTGTTTATGTGGAGCCTG
GCTGTCGTCCATGCTGTG
GAGCTGCAGGTGTAATGAAGAC
TCCAGTATTTGCCATAAAGIA
CCAGTATTTGCCATAAAGIG
CCAGACATAGTTATCTATCAATAIA
CCAGACATAGTTATCTATCAATAIG
AGATCCTACATACAAATCATIC
CAGATCCTACATACAAATCATIT
2981-3003
3182-3206
4452-4473
4655-4677
428-445
532-550
856-874
964-983
624-641
757-778
2723-2743
2724-2743
3101-3122
3101-3122
3101-3122
3101-3123
3075-3125
3078-3125
3078-3125
3470-3511
3470-3511
4176-4218
4176-4218
Tab 3.5 Oligonukleotide. Angegeben sind Bezeichnung, Nukleotidsequenz in 5`à3`Orientierung mit
eventuellen Modifikationen und die Position des Oligonukleotids. Letztere bezieht sich für HIV-1
Oligonukleotide auf HXB2 (genebank accession Nummer NC 001802), für zelluläre Zielsequenzen auf
die Position in der jeweiligen cDNA. Das mutierte Triplett bei Mutagenese-Oligonukleotiden ist
unterstrichen, die ausgetauschte Base ist fett markiert. Restriktionserkennungsstellen sind kursiv
markiert.
3.6
Plasmide
Für Mutagenesen wurden zum Teil einzelne zu mutierende Bereiche aus pNL4-3
durch Restriktion entfernt und in kürzere Vektoren kloniert, um die Mutagenese in
diesen
Vektoren
durchzuführen.
Nach
erfolgreicher
Einbringung
von
Nukleotidaustauschen wurden die mutierten Fragmente durch die gleichen
Restriktionsendonukleasen in die Ausgangsvektoren zurückkloniert.
Bezeichnung
Beschreibung
Hersteller /
Quelle
pcDNA3
eukaryotes Expressionsplasmid; enthält den
Cytomegalovirus immediate early enhancer-promotor
mit anschließender multiple cloning site und das
Ampicillin-Resistenzgen
Invitrogen
18
Material und Methoden
Bezeichnung
pcDNA3.1(+)
psilencer3.1 H1
pcDNA3-env
pcDNA3-nef
pcDNA3.1(+)HA
pSilencer3.1 H1 pol
pSilencer3.1 H1 env
pSilencer3.1 H1 pol Dvif
pSilencer3.1 H1 polR78A
pSilencer3.1 H1 polY115A
pSilencer3.1 H1
polD549N_550K
pNL4-3
pNL4-3 Dvif
pNL4-3M184V
pNL4-3 DvifM184V
pNL4-3M184I
pNL4-3 DvifM184I
pNL4-3K65R/M184V
pNL4-3 DvifK65R/M184V
pNL4-3Y115A
pNL4-3 DvifY115A
pNL4-3R78A/Q151N
pNL4-3 DvifR78A/Q151N
pNL4-3D549N_550K
pNL4-3 DvifD549N_550K
Beschreibung
eukaryotes Expressionsplasmid; enthält den
Cytomegalovirus immediate early enhancer-promotor
mit anschließener multiple cloning site, das Neomyzinund Ampicillin-Resistenzgen
eukaryotes shRNA Expressionsplasmid, enthält den
RNA-Polymerase III abhängigen H1 Promotor, das
Hygromyzin- und Ampicillin-Resistenzgen
enthält einen Teil des pNL4-3 env-Gens
enthält einen Teil des pNL4-3 nef-Gens
enthält HA-tag
enthält einen Teil des HIV-1 NL4-3 pol-Gens
enthält einen Teil des HIV-1 NL4-3 env-Gens
enthält einen Teil des HIV-1 NL4-3 pol-Gens mit vifDeletion
enthält die Mutation R78A im Gen der HIV-1 NL4-3 RT
enthält die MutationY115A im Gen der HIV-1 NL4-3 RT
enthält die Mutation D549N im Gen der HIV-1 NL4-3
RT/DNase H
HIV-1 Volllängen-Expressionsplasmid
HIV-1 vif-deletiertes Expressionsplasmid mit Deletion
im vif-Gen
HIV-1 Volllängen-Expressionsplasmid, enthält die
M184V Mutation im Gen der RT
HIV-1 vif-deletiertes Expressionsplasmid, enthält
M184V Mutation im Gen der HIV-1 NL4-3 RT
HIV-1 Volllängen-Expressionsplasmid mit M184I
Mutation im Gen der RT
HIV-1 vif-deletiertes Expressionsplasmid, enthält
zusätzlich M184I Mutation im Gen der RT
HIV-1 Volllängen-Expressionsplasmid mit K65R und
M184V Mutationen im Gen der RT
HIV-1 vif-deletiertes Expressionsplasmid, enthält
zusätzlich K65R und M184V Mutationen im Gen der RT
HIV-1 Volllängen-Expressionsplasmid mit K65R und
M184V Mutationen im Gen der RT
HIV-1 vif-deletiertes Expressionsplasmid, enthält
zusätzlich Y115A Mutation im Gen der RT
HIV-1 Volllängen-Expressionsplasmid mit R78A und
Q151N Mutationen im Gen der RT
HIV-1 vif-deletiertes Expressionsplasmid, enthält
zusätzlich R78A und Q151N Mutationen im Gen der RT
HIV-1 Volllängen-Expressionsplasmid mit D549N
Mutation im Gen der RT
HIV-1 vif-deletiertes Expressionsplasmid, enthält
zusätzlich D549N Mutation im Gen der RT
Hersteller /
Quelle
Invitrogen
Ambion
1
42
61
61
-
Tab 3.6 Plasmidkonstrukte. Angegeben sind Bezeichnungen, Charakteristika und Hersteller oder
Quelle.
3.7
Nachweis und Analyse von DNA
3.7.1
Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese wird eingesetzt, um DNA-Moleküle aufzutrennen, zu
identifizieren und zu reinigen. Die Gele bestanden aus 1% Agarose (w/v) in 1x TAE19
Material und Methoden
Puffer, der gleichzeitig als Laufpuffer eingesetzt wurde. Den Gelen wurde 0,02 µg
Ethidiumbromid pro ml hinzugefügt, das sich in doppelsträngige DNA einlagert. Die
DNA wurde mittels UV-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 312 nm analysiert.
Für die Fixierung der Proben und Markierung der Lauffront wurden den Proben 0,24
Vol. Probenpuffer zugesetzt. Als Marker wurden 4 µl Gene Ruler aufgetragen, bei
präparativen Gelen bis zu 10 µl, da diese Gele unter höherer Wellenlänge von
366 nm, mit entsprechend geringerer Intensität, analysiert wurden. Die Elektrophorese
wurde bei einer Spannung von 60-80 V durchgeführt. Alle Ergebnisse wurden mittels
einer CCD-Kamera fotografisch dokumentiert (Gelfotoanlage E.A.S.Y. Win32,
Herolab, Wiesloch).
3.7.2
DNA-Präparation durch freeze & squeeze
Unter UV-Belichtung bei 366 nm wurden DNA-Fragmente mit einem Skalpell aus
dem Agarose-Gel ausgeschnitten, in Parafilm verpackt und bei -20°C für 30 min
gefroren. Anschließend drückte man die nun in Wasser gelöste DNA aus diesem
Stück heraus. Agaroseverunreinigungen wurden mittels Zentrifugation 5 min bei
13.000 x g aus der Lösung entfernt.
3.7.3
Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA
1:10 oder 1:20 Verdünnungen der zu untersuchenden DNA-Lösung wurden
hergestellt. Diese wurden in Quarzküvetten überführt und mit dem UV-Spektrometer
Lambda 2, Perkin Elmer vermessen: 230 nm misst niedermolekulare Verbindungen
wie Nukleotide, 258 nm DNA und RNA, bei 280 nm erhält man den Proteinanteil der
Lösung und 320 nm ist der Korrekturfaktor, der von den anderen Extinktionen
subtrahiert wird. Die DNA-Konzentration erhält man aus folgender Formel:
OD258 x molarer Extinktionskoeffizient x Verdünnungsfaktor = DNA-Konzentration
[µg/ml]
Molarer Extinktionskoeffizient für dsDNA: 50 µg/ml
Die Reinheit der DNA-Lösung lässt sich aus dem Verhältnis der Absorptionswerte bei
258 nm und 280 nm bestimmten: Reine DNA liegt vor, wenn OD258/OD 280 = 1,8-2,0
80
.
20
Material und Methoden
3.8
Polymerase-Ketten-Reaktion
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR)
65
wurde mit 10x
PCR-Puffer II, 3,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTPs, je 0,4 µM Oligonukleotide und der
Taq-Polymerase in einem Endvolumen von 20 oder 50 µl durchgeführt. Die TaqPolymerase stammte aus eigener Herstellung
73
. Die verwendeten Oligonukleotide
sind in Tab 3.5 dargestellt und wurden von biomers.net (Ulm, Germany) synthetisiert.
Alle PCR- und Sequenzierreaktionen wurden im Mastercycler gradient (Eppendorf)
durchgeführt.
Anzahl der Zyklen
Temperatur (°C)
Zeit (s)
Reaktion
1
94
300
Denaturierung
35-45
94
30
Denaturierung
T m minus 5-7
30
Hybridisierung
72
60/1kb
Elongation
72
300
Vervollständigung
1
High-fidelity PCR
Für die Amplifikation von DNA-Fragmenten zur Mutationsanalyse wurden highfidelity DNA-Polymerase Mischungen verwendet, um die Fehlerrate bedingt durch die
DNA-Polymerase so gering wie möglich zu halten. Für die Klonierung von env- und
nef-Fragmenten der H9 Zell-Experimente wurde das TripleMaster PCR system
(Eppendorf) eingesetzt. Eine Reaktion bestand aus 10x high-fidelity Puffer, 200 µM
dNTPs, 0,4 µM je Oligonukleotid, 2,5 U TripleMaster Polymerase Mix und 100 ng
Ausgangs-DNA in einem Endvolumen von 50 µl. Herstellerangaben zufolge hat
dieser Enzymmix eine Mutationsrate von 2,3 x 10-6 Mutationen pro Basenpaar pro
Duplikation.
Anzahl der Zyklen
Temperatur (°C)
Zeit (s)
Reaktion
1
94
120
Denaturierung
25-35
94
20
Denaturierung
50-65
10-20
Hybridiserung
72
40
Elongation
21
Material und Methoden
Für alle Experimente mit PBMCs wurde das Easy-A High-Fidelity PCR Cloning Kit
(Stratagene) eingesetzt. Eine Reaktion enthielt 10x Easy-A Reaktionspuffer, 500 µM
dNTPs, 0,4 mM je Oligonukleotid, 2,5 U Easy-A High-Fidelity cloning enzyme und
100 ng Ausgangs-DNA in einem Endvolumen von 50 µl. Dieser Enzymmix hat laut
Hersteller eine Fehlerrate von 1,3 x 10 -6 Mutationen pro Basenpaar pro Duplikation.
Anzahl der Zyklen
Temperatur (°C)
Zeit (s)
Reaktion
1
95
120
Denaturierung
30-35
95
40
Denaturierung
T m minus 5-7
30
Hybridisierung
72
60/1kb
Elongation
72
420
Vervollständigung
1
3.8.1
Die
Quantitative real-time PCR
real-time
PCR
erlaubt
eine
quantitative
Aussage
über
die
Anzahl
doppelsträngiger DNA-Kopien in Untersuchungsmaterial. Hierzu wurde der
Fluoreszenzfarbstoff SYBR green I dem Reaktionsansatz beigemischt. Sobald es in
doppelsträngige DNA interkaliert, steigt die Fluoreszenzintensität von SYBR green I
um den Faktor 200 an. Je mehr doppelsträngige DNA im Reaktionsansatz vorliegt,
desto öfter können SYBR green Moleküle interkalieren. Dementsprechend steigt die
Fluoreszenz proportional zur Menge an doppelsträngiger DNA an und dieser Anstieg
wird kontinuierlich gemessen. Die Quantifizierung basierte auf der softwaregestützten Berechung eines Fluoreszenz-Schwellenwertes. Der Zyklus, in dem eine
Probe diesen berechneten Wert überschreitet, wird als Schwellenwert-Zyklus (Ct) der
jeweiligen Probe zugewiesen.
Um eine quantitative Aussage treffen zu können, wurde in der PCR eine
standardisierte DNA-Verdünnungsreihe von 107 bis 101 Molekülen pro Reaktion
mitgeführt. Durch die Standard-Verdünnungsreihe und einer daraus abgeleiteten
Korrelationskurve konnte für jede Probe eine initiale Kopienzahl berechnet werden.
Ein real-time PCR-Ansatz enthielt in einem Endvolumen von 50 µl 0,2 µM Puffer
ROX-K, 0,4x PCR-Puffer II, 3,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTPs, 0,2x SYBR green I, je
0,2 µM der Oligonukleotide, Taq-Polymerase und 10 µl der zu messenden DNA-
22
Material und Methoden
Probe. Die PCR wurde bei folgenden Temperaturen in einem Thermozykler ABI
PRISM 7700 (Applera, Applied Biosystems) durchgeführt.
Anzahl der Zyklen
Temperatur (°C)
Zeit (s)
Reaktion
1
94
300
Denaturierung
50
94
15
Denaturierung
55
30
Hybridisierung
72
30
Elongation
3.8.2
Allel-spezifische real-time PCR
Mit der real-time PCR wurden nicht nur rein quantitative Untersuchungen
durchgeführt, sondern auch selektive Reaktionen, die auf dem unterschiedlichen
Bindungsvermögen von Oligonukleotiden beruhen, wenn die Bindestelle mutiert ist.
Diese Methode wurde eingesetzt, um die Anwesenheit von Mutationen in Virusstocks
zu verifizieren und die Anteile verschiedener Virusvarianten in ZellkulturÜberständen zu bestimmen. Dazu wurde virale cDNA gleichzeitig in zwei real-time
PCRs eingesetzt: Eine mit dem Wildtyp-selektiven und die Zweite mit dem Mutantenselektiven Oligonukleotid. Diese Allel-spezifischen Oligonukleotide enthielten an der
zweiten Position neben dem 3`-terminalen selektiven Nukleotid ein Inosinmolekül,
um die Selektivität dieser Reaktion zu erhöhen 61. Das gegenläufige Oligonukleotid
war nicht selektiv. Die Hybridisierung fand bei 60°C statt. Die individuelle
diskriminorische
Fähigkeit
jedes
Assays
wurde
durch
die
falsch-positive
Amplifikation festgelegt.
3.8.3
Schmelzkurven-Analyse
Da SYBR green I unspezifisch in doppelsträngige DNA interkaliert, kann nicht
zwischen verschiedenen PCR-Produkten sowie Oligonukleotiddimeren unterschieden
werden. Unspezifische Amplifikationen können die Ergebnisse verfälschen. An jede
real-time PCR wurde deshalb eine Schmelzkurvenanalyse angeschlossen. Dabei
wurde die doppelsträngige DNA zunächst bei 90°C denaturiert. Anschließend wurde
die Temperatur in 15 s Schritten auf 60°C reduziert. Bei einer für jede Fragmentgröße
spezifischen Temperatur bildet sich aus den Einzelsträngen wieder ein Doppelstrang,
so dass die Fluoreszenzintensität ansteigt. Sowohl die Länge als auch der GC-Gehalt
23
Material und Methoden
der Amplifikate beeinflussen das Schmelzverhalten der DNA-Fragmente, wodurch
zwischen spezifischen und unspezifischen PCR-Produkten sowie OligonukleotidDimeren unterschieden werden kann.
3.8.4
DNA-Sequenzierung
Alle DNA-Sequenzierungen wurden mit dem ABI PRISM 3100 (Applied
Biosystems) durchgeführt. Ein 20 µl Sequenzieransatz setzte sich zusammen aus 300
ng Plasmid-DNA oder 100 ng PCR-Produkt/500 Nukleotide, 20 pmol Oligonukleotid,
3 µl Big Dye Kit (Gemisch aus FddNTPs, DNA-Polymerase und 2,5x Puffer) und 3 µl
5x TM-Verdünnungspuffer.
Anzahl der Zyklen
Temperatur (°C)
Zeit (s)
Reaktion
25
96
10
Denaturierung
T m minus 5-7
15
Hybridisierung
60
240
Elongation
Die Sequenzen wurden mit dem Programm EditView 3.7 (Applied Biosystems)
ausgewertet, Vergleiche der sequenzierten DNA-Bereiche mit einer entsprechenden
Referenzsequenz wurden mit dem Programm Vector NTI 7.0 Suite (Invitrogen)
vorgenommen.
3.9
Methoden zur RNA- und DNA-Präparation
3.9.1
Präparation von Plasmid-DNA
Für die Isolation von Plasmidmengen von bis zu 30 µg wurde 5 ml LB-Amp-Medium
mit 2 µl einer Schüttelkultur angeimpft und über Nacht bei 37°C im Bakterienroller
kultiviert. Die Zellen wurden bei 4000 x g abzentrifugiert und das Zellpellet wurde in
300 µl Resuspensionspuffer aufgenommen. Nach Zugabe von je 300 µl Lysispuffer
und nachfolgend 300 µl Neutralisationspuffer wurden die Lysate 15 min bei 13.000 x
g zentrifugiert. Aus dem Überstand wurden die Plasmide mit Isopropanol und
70%igem Ethanol gefällt und gereinigt. Die getrocknete DNA wurde in H2O
aufgenommen. Alternativ oder zur Präparation von Plasmidmengen über 30 µg
wurden Plasmid-DNA-Präparationskits, die in Tab 3.4 aufgeführt sind, verwendet.
Bei dieser Methode wird nach der alkalischen Lyse der Bakterienzellen die Plasmid24
Material und Methoden
DNA unter Niedrigsalz-Bedingungen an eine Anionenaustauscher-Matrix einer Säule
gebunden. Durch einen Waschschritt bei mittlerer Salzkonzentration werden RNA,
Proteine und niedermolekulare Verunreinigungen entfernt. Die Plasmid-DNA wird
dann in einem Hochsalz-Puffer eluiert. Eine darauffolgende Isopropanol-Fällung dient
dem Konzentrieren und Entsalzen der DNA. Alle Plasmide wurden anschließend
mittels Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert.
3.9.2
PCR-Aufreinigung
PCR-Amplifikate wurden mit dem NucleoSpin Extract II Kit über Silica-MembranSäulen gereinigt, wodurch Oligonukleotide, Enzyme und Salze aufgrund ihrer
geringen Größe aus der Lösung entfernt wurden. Eluiert wurde die DNA im Puffer
NE (5 mM Tris/HCl, pH 8,5). Dieses Verfahren wurde auch angewendet, um freeze &
squeeze Produkte zu konzentrieren.
3.9.3
Isolierung genomischer DNA
Mit dem NucleoSpin Blood Kit wurde genomische DNA aus 1 x 106 H9 Zellen oder
3 x 106 PBMCs verschiedener Spender isoliert. Die Zelllyse wurde bei 70°C in einem
Puffer mit chaotropen Ionen und zusätzlicher Proteinase K durchgeführt. Unter
Zugabe von Ethanol wurden laut Herstellerangaben optimale Bindebedingungen
geschaffen, so dass die DNA an der Silicamembran reversibel gebunden wurde.
Kontaminationen wurden durch Waschen mit zwei unterschiedlichen Puffern entfernt.
Reine genomische DNA wurde unter niederionischen Bedingungen in einem
schwach-alkalinen Puffer eluiert.
3.9.4
Isolierung gesamtzellulärer RNA
Für die Isolierung gesamtzellulärer RNA wurden 1 x 106 H9 Zellen oder 3 x 106
PBMCs verwendet. Das Zellpellet wurde in 1 ml PeqGold Trifast aufgenommen,
gevortext und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 200 µl
Chloroform dazugegeben, für 15 s kräftig geschüttelt, wieder 3-10 min bei
Raumtemperatur inkubiert und dann 15 min bei 4°C und 12.000 x g zentrifugiert. Die
obere wäßrige Phase wurde daraufhin in ein Eppi überführt mit 500 µl Isopropanol
versetzt, gevortext und 10 min bei 4°C und 12.000 x g abzentrifugert. Der Überstand
wurde entfernt und das Pellet mit 75%igem unvergälltem Ethanol versetzt, gevortext
und anschließend wie zuvor abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet
25
Material und Methoden
luftgetrocknet und schließlich in 50 µl H2O-DEPC aufgenommen. 20 µl wurden für
eine cDNA Synthese verwendet, der Rest wurde bei -80°C gelagert.
3.9.5
Isolierung viraler RNA
Zur Isolierung der viralen RNA aus Überständen infizierter Zellkulturen wurde das
NucleoSpin RNA-Virus Kit eingesetzt. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben
des Herstellers. 20 µl der aufgereinigten RNA wurden sofort für eine cDNA-Synthese
verwendet, der Rest wurde bei -80°C gelagert.
3.9.6
Synthese von cDNA
Durch diesen Schritt wurde die virale RNA in cDNA mit der Reversen Transkriptase
des Moloney Murine Leucemia Virus (M-MLV) umgeschrieben. Die RNA wurde
zuerst mit 20 pmoles random hexamers auf 80°C erhitzt und 2 min auf Eis gekühlt,
um die Sekundärstrukturen der RNA aufzuschmelzen. Danach wurde der Ansatz mit
10x PCR-Puffer II, 3 mM MgCl2, 20 mM dNTPs, 10 mM DTT, 40 U M-MLV RT auf
ein Endvolumen von 40 µl gebracht. Die cDNA-Synthese erfolgte bei folgenden
Temperaturschritten:
Temperatur (°C)
Zeit (min)
Reaktion
25
5
Hybridisierung der Oligonukleotide
37
50
cDNA-Synthese
70
15
RT-Inaktivierung
3.10 Zielgerichtete DNA-Mutagenese
3.10.1 Zweistufige PCR-Mutagenese
Diese Methode setzt sich aus zwei seriell durchzuführenden PCRs zusammen:
Zunächst wurden in zwei separate Ansätze DNA-Fragmente amplifiziert, die genau in
dem Bereich überlappen, in dem sich die einzuführende Punktmutation befindet.
Diese Punktmutation liegt im mittleren Bereich der Mutageneseoligonukleotide, die
abweichend von der Sequenz des Ausgangsmoleküls einen oder mehrere
Basenaustausche besitzen und so die Mutation(en) in die Amplifikate einführen. Die
äußeren gegenläufigen Oligonukleotide enthalten keinen Nukleotidaustausch. Diese
26
Material und Methoden
beiden PCR-Fragmente wurden dann in der zweiten PCR zusammen mit den äußeren
Oligonukleotiden aus den ersten Reaktionen eingesetzt. Dieser PCR-Ansatz enthielt
50 bis 100 ng aufgereinigtes PCR-Produkt, 10x Pfu-Puffer, 1 mM dNTPs, je 0,4 mM
Oligonukleotid und 2,5 U Pfu Turbo DNA-Polymerase.
Anzahl der Zyklen
Temperatur (°C)
Zeit (s)
Reaktion
1
95
240
Denaturierung
10
95
30
Denaturierung
63
30
Hybridisierung
72
150
Elongation
95
30
Denaturierung
56
30
Hybridisierung
72
165
Elongation
72
900
Vervollständigung
35
1
Für die ersten 10 Zyklen dieser zweiten PCR wurde eine Hybridisierungstemperatur
gewählt, die oberhalb der Schmelztemperatur der äußeren Oligonukleotide liegt, so
dass zunächst die beiden Amplifikate der ersten PCR durch Überlappung als
Startoligonukleotide für die Taq-Polymerase fungierten. Dadurch entstand zunächst
das gewünschte lange DNA-Fragment, dass in den darauffolgenden Zyklen bei einer
niedrigeren Hybridisierungstempetatur mittels der beiden äußeren Oligonukleotide
amplifiziert wurde.
3.10.2 Orts-gerichtete Mutagenese
Bei der Methode des XL Site-Directed Mutagenesis Kit dienten die Plasmide pNL4-3,
pNL4-3Dvif, pcDNA3 pol und pcDNA3 env als Matrize. Das Oligonukleotidpaar, das
die einzuführende Mutation enthält, ist zueinander und zu den beiden antiparallelen
DNA-Strängen des Plasmids komplementär. Nach einem PCR-Zyklus befinden sich
in dem Ansatz theoretisch zu gleichen Teilen zirkuläre Ausgangsplasmide und lineare
Kopien, die die Mutation tragen. Die Oligonukleotide binden im nächsten Zyklus
wieder an das Ausgangsplasmid und führen so die Mutationen in die neuen Kopien
ein. Eine Elongation entlang der synthetisierten DNA-Kopie ist unmöglich, da die
Matrize direkt nach der Bindestelle abbricht. Nach 18 Zyklen liegen die Wildtyp27
Material und Methoden
Plasmide und Mutanten-DNA-Stränge theoretisch in einem Verhältnis von 1:18 vor.
Ein DpnI-Verdau wurde angeschlossen, um die methylierten Wildtyp-Plasmide aus
der Lösung zu restringieren. Fast alle E. coli-Stämme methylieren DNA an den
Adeninbasen, so auch XL10 Gold ultracompetent Bakterien, aus denen die Plasmide
isoliert wurden. Die in dieser Reaktion synthetisierte DNA ist nicht methyliert und
demnach vor einer DpnI-Restriktion geschützt. Für eine Mutagenese-Reaktion wurden
300 ng Ausgangsplasmid zu einem Ansatz aus 10x Reaktionspuffer, 10 mM dNTPs,
3 µl QuickSolution, je 125 ng der Mutageneseoligonukleotide und 2,5 U Pfu Turbo
DNA-Polymerase mit einem Endvolumen von 50 µl gegeben.
Anzahl der Zyklen
Temperatur (°C)
Zeit (s)
Reaktion
1
95
60
Denaturierung
18
95
50
Denaturierung
60
50
Hybridisierung
68
60/1kb
Elongation
68
420
Vervollständigung
1
3.11 Klonierung von DNA-Fragmenten
3.11.1 Restriktion von DNA-Fragmenten
DNA-Fragmente können mittels Restriktion und nachfolgender Ligation in ein
Plasmid eingeführt werden. Dazu wurde das DNA-Fragment, das von zwei
Restriktionsschnittstellen flankiert war, mittels spezifischer Restriktionsenzyme aus
einem
Plasmid
herausgeschnitten
Restriktionsschnittstellen-tragenden
Empfänger-Molekül
wurde
auf
oder
ein
PCR-Produkt,
Oligonukleotiden,
die
gleiche
Weise
wurde
amplifiziert
mit
geschnitten.
Das
enzymatisch
behandelt.
Restriktionen wurden in einem Endvolumen von 20 bis 30 µl mit den empfohlenen
Restriktionspuffern und Enzymmengen nach den Herstellerangaben durchgeführt. Die
Restriktionsprodukte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, durch
freeze & squeeze aus dem Gel eluiert und wenn nötig zusätzlich mit dem NucleSpin
Extract II Kit aufgereinigt. Restriktionen wurden auch zu Kontrollzwecken eingesetzt,
um Plasmid-DNA zu charakterisieren. Da bestimmte Restriktionsendonukleasen
28
Material und Methoden
methylierte DNA nicht schneiden können, wurde in solchen Fällen Plasmid DNA in
E.coli SCS110 Zellen vermehrt.
3.11.2 Dephosphorylierung und Ligation von DNA-Fragmenten
Zum Teil wurden die Vektoren vor einer Ligation dephosphoryliert, um Religationen
bei kompatiblen Enden zu vermeiden, da die für die Ligation notwendigen
Phosphatreste dann nicht mehr vorhanden waren. Die Dephosphorylierung ist eine
enzymatisch katalysierte Abspaltung einer Phosphatgruppe von einem DNA-Molekül.
Diese Phosphatreste werden erst bei der Ligation durch das gewünschte insert
bereitgestellt. Dephosphoryliert wurde mit der hitzeinaktivierbaren Antarctic
Phosphatase nach den Angaben des Herstellers. Der Vektor wurde mit der
entsprechenden Menge an 10x Phosphatase Puffer versetzt und bei 37°C mit 1 µl
Phosphatase/µg Plasmid für 15-60 min inkubiert. Die Inaktivierung der Phosphatase
erfolgte für 15 min bei 65°C. Das geschnittene und aufgereinigte lineare EmpfängerPlasmid und das gewünschte insert werden in der Ligationsreaktion durch die
T4-Ligase kovalent verbunden. 50 ng des Vektors wurden dazu in einem molaren
Verhältnis zwischen 1:1 und 1:10 mit dem entsprechenden insert in einem
Endvolumen von 10 bis 20 µl mit 5x T4 DNA-Ligase-Puffer und 1 U T4 DNA-Ligase
1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C ligiert.
3.12 Nutzung von Bakterien
Bezeichung
Hersteller
E. coli XL10 Gold
ultracompetent cells
Stratagene
E. coli SCS110
Stratagene
Eigenschaften
TetR D(mcrA) 183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1 sup E44
thi-1 recA1 gyr96 relA1 lac Hte[F` proAB lac qZDM15 Tn10
(TetR) Amy CamR]a
rpsL (Str-r thr leu endA thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam
dcm supE44 D(lac-proAB) [F` traD36 proAB lac qZDM15]
Tab 3.7 Bakterien. Angegeben sind Bezeichnung, Hersteller und Genotyp.
3.12.1 Kultivierung und Lagerung von Bakterien
Bakterien wurden entweder auf 5 µg Ampicillin-haltigen Agarplatten oder in
100 µg/ml Ampicillin LB Medium für 12-16 h kultiviert. Für die langfristige
Konservierung wurde eine Bakterienkultur mit Glyzerol in einer Endkonzentration
von 10% versetzt, gut vermischt und bei -80°C eingefroren. Zur Rekultivierung eines
Bakterienstocks wurde von der Kryokultur Bakterien entnommen und in Ampicillinhaltiges LB-Medium übertragen. Aufgetaut wurden Bakterien auf Eis.
29
Material und Methoden
3.12.2 Herstellung von Transformations-kompetenten Zellen
Für die Herstellung Transformations-kompetenter Zellen wurden die E. coli-Stämme
XL10Gold und SCS110 verwendet. Gram-negative Bakterien sind natürlicherweise
nicht fähig, Fremd-DNA aufzunehmen. Durch die Behandlung mit Kalziumchlorid,
Manganchlorid oder Rubidiumchlorid kann die Aufnahme freier DNA bei niedriger
Temperatur induziert werden. Die genauen Mechanismen der DNA-Aufnahme sind
jedoch noch nicht bekannt. Zu Beginn wurde ein Verdünnungsausstrich kompetenter
Bakterien auf LB-Agarplatten mit 10 mM MgCl2 bei 37°C über Nacht inkubiert. 5 ml
Tym-Broth wurden mit einem Teil einer Bakterienkolonie inokuliert und bei 37°C
und 180 U/min im Thermoschüttler über Nacht inkubiert. Mit dieser Vorkultur
wurden 250 ml Tym-Broth angeimpft. Für etwa 3 h wurden die Bakterien bei 37°C
und 250 U/min inkubiert bis eine optische Dichte bei 600 nm von 0,5-0,6 erreicht war.
Alle nachfolgenden Schritte erfolgten auf Eis und die Puffer wurden eiskalt
verwendet. Die Bakterienkultur wurde 5 min bei 4°C und 1.800 x g zentrifugiert.
Anschließend wurden die pelletierten Bakterien mit 75 ml TbfI und vorgekühlten
Pipetten langsam resuspendiert und mindestens 90 min inkubiert. Die maximale
Transformations-Kompetenz ist nach 12-24 h erreicht. Anschließend wurde die
Bakterienlösung 5 min bei 4°C und 1.800 x g zentrifugiert und das Pellet in 10 ml
TbfII vorsichtig resuspendiert. Die kompetenten Bakterien wurden à 200 µl
aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
3.12.3 Transformation durch Hitzeschock
Ultrakompetente Bakterien wurden auf Eis aufgetaut. 30 ng Plasmid wurden
zugegeben, für 30 min auf Eis inkubiert und anschließend wurde die Zellsuspension
für 30-45 s bei 42°C transformiert. Die Bakterien wurden in 42°C-temperierten SOCMedium aufgenommen und bei 37°C bei 500 U/min für 1 h inkubiert. Danach wurden
die Bakterien auf Amp-LB-Platten ausgestrichen und nach ~15 h einzelne
Bakterienkolonien gepickt.
3.12.4 Screening der Bakterienklone
Einzelne Kolonien wurden gepickt, in Ampicillin-haltiges LB-Medium (Amp-LBMedium, 100 µg/ml Ampicillin) überführt und für 1 h bei 37°C inkubiert. Dann
wurde ein PCR-Screening durchgeführt, um positive Klone zu identifizieren. Der
Ansatz enthielt neben 1 µl Bakterienkultur 10x PCR-Puffer II, 1,5 mM MgCl2,
30
Material und Methoden
0,5 mM dNTPs, je 0,4 µM Oligonukleotide und Taq-Polymerase in einem
Endvolumen von 20 µl.
3.13 Eukaryotische Zellen
3.13.1 Kultivierung von eukaryotischen Zellen
Alle eukaryotischen Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit
kultiviert.
Bezeichung
293T
HeLa CD4 high
H9
MT2
MT4
Herkunft und Beschreibung
Humane, embryonale, epitheliale Nieren-Zelllinie,
transformiert durch Adenovirus Typ 5, exprimiert
zusätzlich das große T-Antigen des Virus SV40,
adhärent 24
Humane, epitheliale Tumor-Zelllinie
(Adenokarzinom) 82, stabil transduziert mittels dem
amphotrophen Pseudotyp des SFF-CD4 Retrovirus,
exprimiert stabil CD4, adhärent 41
Stammt von der neoplastischen T-Zelllinie Hut 78
ab, exprimiert CD4, Suspensionszelle 55,74
Humane T-Zellen, isoliert von einer Patientin mit
adulter T-Zell Leukämie, HTLV-transformiert,
Suspensionszelle 63
Humane T-Zellen, isoliert von einer Patientin mit
adulter T-Zell Leukämie. HTLV-transformiert. RT
Produktion ist negativ. OKT4+, OKT4A+ und IL-2
Rezeptor+, Suspensionzelle 63
APOBEC3
Expression
Medium
nein
DMEM
nein
DMEM
ja
RPMI-1640
ja
RPMI-1640
nein
RPMI-1640
Tab 3.8 Zelllinien. Angegeben sind Herkunft, Beschreibung, APOBEC3 Expression und verwendetes
Medium.
3.13.2 Isolierung und Kultivierung von peripheral blood mononuclear
cells
Die peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) wurden aus buffy coats HIV
negativer Blutspender nach Ficoll-Hypaque-Auftrennung mit Histopaque 1077
isoliert. Nach der Isolation wurden die Zellen auf eine Dichte von 3 x 106 Zellen/ml
ausgesät und mit 3 µg/ml PHA stimuliert. Nach 24 h wurde IL-2 in einer
Konzentration von 10 U/ml zugegeben. PHA wurde an Tag 3 aus der Zellsuspension
durch zweifaches Waschen entfernt. Das RPMI-1640 Medium enthielt ab Tag 1 nach
Isolation immer 10 U IL-2/ml.
3.13.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung
Suspensionszellen wurden einmal mit PBSo gewaschen, adhärente Zelllinien wurden
mit PBSo gewaschen, mit 1 ml Trypsin-EDTA für 1-5 min bei 37°C von der Platte
31
Material und Methoden
gelöst und mit Medium gewaschen, um Trypsin zu inaktivieren. Für die Zellzählung
wurden 10 µl dieser Zellsuspension mit 0,5 Vol. Trypanblau und 0,4 Vol. PBSo
versetzt. Die Mischung wurde in eine Fuchs-Rosenthal-Zählkammer gefüllt und die
Zellen wurden mikroskopisch ausgezählt. Die Auszählung von 16 Quadraten einer
solchen Zählkammer entspricht der Anzahl der Zellen in 0,2 µl, wodurch sich die
Zellzahl pro ml Zellsuspension aus folgender Formel ergibt: Zellen/ml = gezählte
Zellen x 5 (entsprechend 1 µl) x 10 (Verdünnungsfaktor) x 1000 (entsprechend auf
1 ml). Gleichzeitig erfolgte eine Vitalitätsbestimmung durch Trypanblau. Bei
Trypanblau handelt es sich um einen Farbstoff, der durch defekte Zellmembranen in
die Zelle gelangt und tote Zellen dadurch blau färbt. Im Gegensatz dazu sind lebende
Zellen bei mikroskopischer Analyse strahlend hell zu sehen.
3.13.4 Transiente Transfektion von 293T-Zellen
Plasmid-DNA wurde über Kalzium-Phosphat-Transfektion in eukaryotische Zellen
eingebracht. Die DNA wurde in entsprechender Menge H2O aufgenommen und
anschließend mit 2x BES unter Einblasen von Luft vermengt. Anschließend wurden
die entstandenen Kalzium-DNA-Kristalle auf die Zellen getropft. 12-16 h später
wurden diese Kristalle von den Zellen gewaschen. Nach insgesamt 48 h wurden die
zellfreien, Virus-haltigen Zellkultur-Überstände entweder direkt für Infektionen
eingesetzt, oder aliquotiert und bei -80°C gelagert. Zellkultur-Überstände, die für
Versuche zur Mutationsanlaysen bestimmt waren, wurden zusätzlich mit DNase I
(1 µl DNase/500 µl Überstand, 10x DNase I Puffer bei 25°C und 30 min) behandelt,
um Plasmidkontaminationen zu reduzieren.
Zellkulturformat
12-Loch Platte
6-Loch Platte
10-cm Schale
Plasmidmenge (µg)
1
2
10
H2O (µl)
45
90
1317
CaCl 2 (µl)
5
10
183
2x BES (µl)
50
100
1500
Tab 3.9 Kalzium-Phosphat-Transfektion. Angegeben sind Zellkulturformat, die dementsprechende
Plasmid-, Kalziumchlorid- und BES-Menge.
3.13.5 Kryokonservierung und Auftauen von eukaryotischen Zellen
Eukaryotische Zelllinien wurden einmal mit PBSo gewaschen und 10 7 Zellen wurden
pro 800 µl in Medium aufgenommen. Den Zellen wurden 100 µl DMSO und 100 µl
FKS tropfenweise zugegeben, so dass als Endkonzentration 10% DMSO und 20%
FKS enthalten war. Diese Suspension wurde zunächst bei -20°C und 24 h später bei
-80°C eingefroren. Das Auftauen erfolgte innerhalb weniger Minuten bei 37°C,
danach wurde das DMSO durch zweifaches Waschen mit auf 37°C vorgewärmtem
32
Material und Methoden
Medium entfernt. Die Zellen wurden in auf 37°C vorgewärmtes Medium
aufgenommen und bei 37°C, 5% CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit kultiviert.
3.14 Virusstock-Charakterisierung
3.14.1 Virusanzucht zur Herstellung infektiöser Stock-Lösungen
Virusstocks wurden wie folgt hergestellt: 293T wurden mit HIV-1 VolllängenPlasmiden transfiziert und 48 h später wurde der Zellkultur-Überstand bei 4.000 x g
für 10 min zentrifugiert, um Zell-freie Virusstocks zu erhalten. 500 µl 293T
Zellkultur-Überstand wurden zur Infektion von 1 x 104 MT4 Zellen verwendet, um
die Replikationskompetenz der Virusstocks zu überprüfen. Die Kulturen wurden
mikroskopisch täglich im Hinblick auf HIV-1 induzierte zytopathische Effekte
anaylsiert. Die Bestimmung des Virustiters erfolgte durch die quantitative Messung
von HIV-1 RNA-Kopien/ml Virusstock. Die Viren wurden lysiert und nach Isolierung
der viralen RNA und anschließender cDNA-Synthese unter Anwendung der
quantitativen real-time PCR analysiert.
3.14.2 HIV-1 p24 Antigen-ELISA
Dieser Assay ist ein zweiseitiger sandwich ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assay)
64
. Zuerst wurde eine 1:600 Verdünnung des ersten Antikörpers gegen das
virale p24 mit NaHCO3 hergestellt, damit wurden p24-Platten (weiße 96-Lochplatten,
hochbindend;
Costar,
Cambridge,
USA)
beschichtet
und
über
Nacht
bei
Raumtemperatur inkubiert. Am folgenden Tag wurde pro Loch 100 µl 2% BSA auf
die Platten verteilt, 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und schließlich bei -20°C
gelagert. Eine Standardverdünnungsreihe wurde mit rekombinantem p24 in einer 1%
Empigenlösung (32 ng/ml) in 1:4-Schritten angefertigt. Die Virus-haltigen ZellkulturÜberstände wurden mit 4% Empigen inaktiviert; die Empigen-Endkonzentration
betrug 1%. Nach dem Auftauen wurden die Platten einmal mit 1x TBS gewaschen
und mit der Standardverdünnungsreihe und mit inaktivierten Zellkultur-Überständen
befüllt. Nach 3 h wurden die Zellkultur-Überstände mit 1x TBS von der Platte
gewaschen und pro Loch 100 µl einer 1:8000 Verdünnung des sekundären, Alkaline
Phosphatase-konjugierten p24-Antikörpers in 20% Schafserum und 1x TBS, mit
0,05% Tween, eingesetzt. Nach 1 h wurde ungebundener, sekundärer Antikörper mit
0,1% Tween in PBSo und anschließend 1x TROPIX Waschpuffer entfernt. CDP33
Material und Methoden
STAR mit Sapphire Substrat (TROPIX) wurde in TROPIX Assay Puffer 1:4
verdünnt, davon wurden je 50 µl auf die Löcher verteilt. Das Substrat wird durch die
Alkaline Phosphatase umgesetzt und dabei wird Licht freigesetzt. Nach 45 min wurde
die Lumineszenz mit einem Orion Microtiter Luminometer (Berthold, Pforzheim)
gemessen.
3.15 Infektion eukaryotischer Zellen mit HIV-1
3.15.1 Bestimmung der Permissivität
Es wurden 1 x 10 5 H9 Zellen mit 2,5 x 10 7 RNA-Kopien der Virusstocks HIV-1
NL4-3,
HIV-1 NL4-3M184V,
HIV-1
NL4-3M184I,
HIV-1 NL4-3Dvif,
HIV-1
NL4-3DvifM184V und HIV-1 NL4-3DvifM184I infiziert. 1 x 10 5 MT4 Zellen wurden mit
5 x 107 RNA-Kopien der genannten Virusstocks sowie HIV-1 NL4-3K65R/M184V und
HIV-1NL4-3DvifK65R/M184V mittels spinoculation
69
infiziert. Danach wurden die
Zellen zweimal mit PBSo gewaschen, in 2 ml Medium aufgenommen und im
Brutschrank über 5 Tage kultiviert. Beginnend am Tag der Infektion (= Tag 0)
wurden maximal täglich 150 µl Überstand für einen p24-ELISA abgenommen und
diese Menge mit Medium wieder ersetzt. Weiterhin wurden je 3 x 106 PBMCs mit
500 µl aller Virusstocks infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen dreimal mit
PBSo gewaschen. Die Zellen des Spenders D wurden im bulk infiziert und danach zu
je 3 x 106 Zellen auf die Kulturplatten verteilt. Hier wurde parallel zur
Permissivitätsbestimmung der Einfluss der Reversen Transkriptase auf die G-zu-A
Mutationsrate untersucht.
3.15.2 Bestimmung der G-zu-A Mutationsrate in HIV-1 DNA
Es wurden 1 x 106 H9 Zellen mit je 1 ml Virusstocks HIV-1 NL4-3, HIV-1
NL4-3M184V, HIV-1 NL4-3M184I, HIV-1 NL4-3Dvif, HIV-1 NL4-3DvifM184V und
HIV-1 NL4-3DvifM184I mittels spinoculation infiziert. Danach wurden die Zellen
zweimal mit PBSo gewaschen und in 2 ml RPMI-1640 Medium in einer 24-LochZellkulturplatte in Kultur genommen. Nach 48 h wurde die Zellkultur bei 4000 x g
zentrifugiert, um Zell-freie Zellkultur-Überstände zu gewinnen. 1 ml dieses
Überstandes wurde zur Infektion von 1 x 10 6 frischer H9 Zellen über spinoculation
eingesetzt. Der restliche Überstand wurde aliquotiert und bei -80°C für weitere
Analysen eingefroren. Nach der spinoculation wurden die Zellen zweimal mit PBSo
34
Material und Methoden
gewaschen, in 1 ml Medium aufgenommen und für 6 h inkubiert. Danach wurden hier
die Zellen wieder zweimal gewaschen, das Pellet in 200 µl PBSo aufgenommen und
bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. Diese Experimente wurden
ebenfalls mit PBMCs durchgeführt. Im Gegensatz zu den Experimenten mit H9
Zellen wurden außerdem die Virusstocks HIV-1 NL4-3K65R/M184V und HIV-1
NL4-3DvifK65R/M184V verwendet. Außerdem wurden folgende Versuchsbedingungen
variiert: Es wurden je 500 µl Virusstock zur Infektion von 3 x 10 6 PBMCs verwendet
und die erste Infektionsrunde wurde nach 36 h beendet. Im Folgenden wurde aus den
H9 Zellen und PBMCs zelluläre und virale DNA isoliert, ein Teil des HIV-1 env- und
nef+3`LTR-Bereichs amplifiziert, über TA-Vektoren kloniert, einzelne Klone
sequenziert und analysiert (Abb 3.1).
Abb 3.1 Versuchsdarstellung. Angegeben sind Plasmide, Zelltypen, Reaktionsabschnitte und
Kontrollversuche.
3.16 Statistische Datenauswertung
Die Analyse der G-zu-A Mutationen in den HIV-1 env- und nef+3`LTR-Sequenzen
erfolgte durch das hypermut 2.0 Programm, das man frei im Internet benutzen kann
(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html)
79
. Dieses
Programm vergleicht die eingegebenen Sequenzen mit einer Referenzsequenz und
35
Material und Methoden
listet tabellarisch und grafisch alle Mutationen und insbesondere die G-zu-A
Mutationen zusätzlich in ihrem Dinukleotidkontext auf. Die Überprüfung gefundener
Unterschiede auf statistischer Signifikanz erfolgte mit Hilfe des Mann-Whitney-Tests.
Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden bei p-Werten von <0,05 als statistisch
signifikant definiert. Die statistischen Berechnungen erfolgten mit Hilfe des
Programms
VassarStats,
das
auf
der
http://faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html zur freien Verfügung steht.
36
homepage
Ergebnisse
4
Ergebnisse
4.1
Replikationsverhalten von HIV-1 NL4-3 und HIV-1
NL4-3Dvif Varianten in T-Zelllinien und PBMCs
Virusstock
HIV-1 NL4-3
HIV-1 NL4-3M184V
HIV-1 NL4-3M184I
HIV-1 NL4-3K65R/M184V
HIV-1 RNAKopien/ml x 10 8
48,3
Zellen für die Infektionen
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
44,0
PBMCs Spender B, C, D
49,7
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
59,6
PBMCs Spender B, C, D
42,1
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
8,7
PBMCs Spender B, C, D
-
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
45,0
PBMCs Spender B, C, D
HIV-1 NL4-3Y115A
0,13
-
HIV-1 NL4-3R78A/Q151N
0,02
-
HIV-1 NL4-3D549N
0,09
-
53,4
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
34,8
PBMCs Spender B, C, D
44,3
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
32,7
PBMCs Spender B, C, D
54,1
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
22,5
PBMCs Spender B, C, D
HIV-1 NL4-3Dvif
HIV-1 NL4-3DvifM184V
HIV-1 NL4-3DvifM184I
HIV-1 NL4-3DvifK65R/M184V
-
H9 T-Zelllinie, PBMCs Spender A
47,8
PBMCs Spender B, C, D
HIV-1 NL4-3DvifY115A
7,3
-
HIV-1 NL4-3DvifR78A/Q151N
8,1
-
HIV-1 NL4-3DvifD549N
8,1
-
Tab 4.1 Charakteristika der Virusstocks. Angegeben sind Bezeichnung, HIV-1 RNA-Kopien/ml,
und damit erfolgte Experimente. Alle Virusüberstände wurden auf 293T Zellen angezogen und die
Replikationsfähigkeit auf APOBEC3-Protein freien MT4 Zellen überprüft.
Für die Untersuchung des Einflusses der Prozessivität der HIV-1 RT auf die G-zu-A
Mutationsrate, induziert durch APOBEC3-Proteine, wurden zunächst virushaltige
293T Zellkulturüberstände generiert. Um zu gewährleisten, dass die Virusmenge in
der zweiten Infektionsrunde, insbesondere in PBMCs, hoch genug ist, um eine für
weitere Analyse ausreichende Anzahl an PBMCs zu infizieren, wurden nur 293T
Zellkulturüberstände für die Infektion eingesetzt, die mindestens 1 x 10 9 HIV-1 RNA37
Ergebnisse
Kopien/ml enthielten (Tab 4.1). Die Virustiter der Varianten HIV-1 NL4-3 Y115A ,
HIV-1
NL4-3R78A/Q151N,
HIV-1 NL4-3 D549N,
HIV-1 NL4-3DvifY115A ,
HIV-1
NL4-3DvifR78A/Q151N und HIV-1 NL4-3DvifD549N waren zu niedrig und die Viren
replizierten weder auf MT2 Zellen noch auf MT4 Zellen. Die HIV-Varianten, die
Wildtyp RT, RTM184V, RTM184I oder RT K65R/M184V enthielten, infizierten und
replizierten in MT4 Zellen. Am Tag der Infektion (Tag 0) und den darauffolgenden
Tagen wurden Zellkultur-Überstände aus der Kultur entnommen. Die Auswertung
erfolgte über einen p24 ELISA. MT4-Zellen und PBMCs des Spender D wurden mit
allen vier HIV-1 NL4-3 und HIV-1 NL4-3Dvif-Varianten infiziert (Wildtyp RT,
RTM184V, RTM184I und RT K65R/M184V). H9 Zellen sowie PBMCs gehören zu den nichtpermissiven Zelltypen, das bedeutet, dass Vif-defiziente HIV-1 Varianten in diesen
Zellen nur einen Replikationszyklus vollständig durchlaufen können, da APOBEC3
Proteine exprimiert und in die Virionen inkorporiert werden. MT4 Zellen hingegen
exprimieren weder APOBEC3G noch 3F im Zytoplasma und sind permissiv
gegenüber einer HIV-1Dvif Infektion 30. Diese Beobachtung konnte bestätigt werden.
Vif-positive
und
Vif-defiziente
HIV-1
Varianten
zeigten
das
gleiche
Replikationsverhalten in MT4 Zellen (Abb 4.1). Das Replikationsverhalten aller acht
Varianten unterschied sich nicht. Im Kontrast dazu konnte keine Replikation der
HIV-1 NL4-3Dvif Varianten festgestellt werden, wenn damit H9 Zellen infiziert
wurden.
Im Gegensatz dazu replizierten die HIV-1Dvif Varianten in PBMCs schlechter als die
Vif-positiven HIV-1 Varianten (Abb 4.1). Für die Infektion der PBMCs wurde die
10x Dosis an Virusstock als für die Infektionen der T-Zelllinien eingesetzt, um die
Infektion der primären Zellen sicherzustellen. Dadurch stieg trotz Nicht-permissivität
der PBMCs der Gehalt an p24 Protein zwischen den Tagen 0 und 4 an und erst danach
stagnierte die p24 Produktion. p24 ist über Tage hinweg auch bei 37°C in Kultur
stabil, dadurch ist das Protein auch an den darauffolgenden Tagen messbar, ohne dass
Virusreplikation stattfindet.
38
Ergebnisse
p24 (ng/ml)
H9 Zellen
140
120
100
80
60
40
20
0
MT4 Zellen
PBMCs Spender D
300
250
100
80
200
60
150
40
100
50
20
0
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
0
0
2
4
6
8
10
Tage nach Infektion
Abb 4.1 HIV-1 NL4-3Dvif Varianten replizieren in MT4 Zellen, weniger effizient in PBMCs und
nicht in H9 Zellen. H9 Zellen, MT4 Zellen und PBMCs des Spenders D wurden durch spinoculation
infiziert. Am Tag der Infektion und mindestens an jedem zweiten Tag wurden Zellkultur-Überstände
abgenommen und über p24 ELISA ausgewertet, schwarzes Quadrat = HIV-1 NL4-3, schwarzer
Diamant = HIV-1 NL4-3M184V, schwarzes Dreiecke = HIV-1 NL4-3M184I, schwarzer Kreis = HIV-1
NL4-3K65R/M184V, weißes Quadrat = HIV-1 NL4-3Dvif, weißer Diament = HIV-1 NL4-3DvifM184V
weißes Dreieck = HIV-1 NL4-3DvifM184I, und weißer Kreis = HIV-1 NL4-3DvifK65R/M184V.
4.2
APOBEC3G mRNA Gehalt in H9 Zellen ist höher
verglichen mit PBMCs vier verschiedener Spender
b-Aktin cDNA Kopien
APOBEC3G cDNA
Kopien
APOBEC3G/105 bAktinmoleküle
H9 Zellen
6910000
63809
923,4
PBMCs
Spender B
4780000
2378
49,7
PBMCs
Spender C
1210000
3176
262,5
PBMCs
Spender D
1430000
8735
610,8
Tab 4.2 APOBEC3G cDNA Kopien in H9 Zellen und PBMCs. Der Gehalt an APOBEC3G cDNA
aus H9 Zellen und PBMCs der Spender B, C und D in Relation zu b-Aktin cDNA-Kopien.
Um eine mögliche Korrelation zwischen der G-zu-A Mutationsrate der viralen DNA
und der APOBEC3G-Expression in den verschiedenen Zelltypen zu bestimmen,
wurde die APOBEC3G mRNA-Expression relativ zum Haushaltsgen b-Aktin
quantifiziert. Die mRNA wurde aus PBMCs isoliert, nachdem 3 Tage mit PHA und 2
Tage lang mit IL-2 stimuliert wurde. In H9 Zellen wurde APOBEC3G etwa 100x
schwächer exprimiert als b-Aktin. In PBMCs ist die Expression der APOBEC3G
mRNA niedriger als in der T-Zelllinie H9. PBMCs des Spenders B exprimieren ~18x
weniger APOBEC3G mRNA als H9 Zellen, bei Spender C wurde ein ~4x
Unterschied gemessen, zwischen Spender D und H9 Zellen ist die Differenz gering:
H9 Zellen exprimieren ~1,5x mehr APOBEC3G mRNA. Diese Ergebnisse zeigen,
39
Ergebnisse
dass die APOBEC3G mRNA Expression in PBMCs verschiedener Spender sehr
variabel ist.
4.3
Keine Unterschiede in der viralen Mutationsrate in
Abhängigkeit von der RT-Variante in Anwesenheit
von Vif
HIV-1 NL4-3
Anzahl aller
sequenzierter
Klone
Anzahl aller
sequenzierter
Basenpaare
Gesamtanzahl
aller Mutationen
Gesamtanzahl an
G-zu-A
Mutationen
Klone ohne G -zuA Mutation (%)
Durchschnittliche
Anzahl an
Mutationen/100
bp
Durchschnittliche
Anzahl an G-zu-A
Mutationen/100
bp
Zelltyp
HIV-1
Bereich
WT RT
M184V
M184I
K65R
+M184V
H9
nef
17
14
15
-
H9
3`LTR
17
14
15
-
H9
env
29
28
23
-
PBMCs
env
11
13
13
6
H9
nef
5.610
4.620
4.950
-
H9
3`LTR
3.281
2.702
2.895
-
H9
env
13.514
13.048
10.718
-
PBMCs
env
5.126
6.058
6.058
2.796
H9
nef
10
31
8
-
H9
3`LTR
4
1
8
-
H9
env
21
15
17
-
PBMCs
env
5
19
11
1
H9
nef
5
26
1
-
H9
3`LTR
0
0
0
-
H9
env
4
1
2
-
PBMCs
env
3
12
4
0
H9
nef
13 (76,5)
14 (87,5)
14 (93,3)
-
H9
3`LTR
17 (100)
16 (100)
15 (100)
-
H9
env
25 (86,2)
27 (96,4)
21 (91,3)
-
PBMCs
env
9 (81,8)
11 (84,7)
11 (84,7)
6 (100)
H9
nef
0,18
0,67
0,16
-
H9
3`LTR
0,12
0,04
0,28
-
H9
env
0,16
0,11
0,16
-
PBMCs
env
0,10
0,31
0,18
0,04
H9
nef
0,09
0,56
0,02
-
H9
3`LTR
0,00
0,00
0,00
-
H9
env
0,03
0,01
0,02
-
PBMCs
env
0,06
0,20
0,07
0,00
Tab 4.3 Mutationsrate im viralen Genom nach zwei Replikationszyklen in H9 Zellen und PBMCs
der Spender A und B in Anwesenheit von Vif. Dargestellt sind die vier RT Varianten, die
untersuchten Regionen im HIV-1 Genom die Anzahl der analysierten Sequenzen und die Anaylse der
Mutationsraten.
40
Ergebnisse
Es wurde untersucht, in welchem Ausmaß unter Anwesenheit des Vif-Proteins G-zuA und andere Mutationen im viralen Genom auftreten. Durch die Expression von Vif
werden während der ersten Infektionsrunde APOBEC3 Proteine degradiert. Es kommt
nicht zum Einbau der zellulären Deaminasen und folglich nicht zur G-zu-A
Hypermutation. Außerdem sollte der direkte Einfluss der HIV-1 RT auf die
Mutationsrate überprüft werden. Bisher wurde nur in biochemischen Assays gezeigt,
dass die RTM184V und RTM184I eine geringere Fehlerrate besitzen
21,76
. Diese
Untersuchungen wurden sowohl mit H9 Zellen als auch mit PBMCs durchgeführt.
Die Zellen wurden mit den Varianten HIV-1 NL4-3, HIV-1 NL4-3M184V und HIV-1
NL4-3M184I infiziert. Virale DNA, isoliert aus H9 Zellen, wurde in drei Bereichen des
HIV-1 Genoms (Abb 1.2) untersucht: env (466 bp), nef (330 bp) und 3`LTR (193 bp).
Die nef- und 3`LTR-DNA bestand aus einem DNA-Fragment. Hier und im folgenden
wird als nef-Sequenz der Abschnitt des nef-Gens bezeichnet, der nicht mit der 3`LTR
überlappt. Als 3`LTR wird die Sequenz bezeichnet, die unabhängig von der
Überlappung mit dem nef-Gen dem 3`LTR entspricht. HIV-1 DNA, isoliert aus
PBMCs der Spender A und B, wurde nur in Bezug auf env sequenziert und analysiert.
Zusätzlich wurde für die Infektion der Zellen von Spender B die HIV-1 NL43K65R/M184V Variante miteinbezogen. Aus den H9-Experimenten wurden zwischen 23
und 29 Klone für env und 14-17 Klone jeweils für nef und 3`LTR untersucht (Tab
4.3). Dabei wiesen 51,1±4,3% der env-, 64,1±12,4% der nef- und 72,3±19,5% der
3`LTR-Sequenzen keine Mutation auf (Abb 4.2 A). Die Sequenzen aus den
Infektionen mit HIV-1 NL4-3M184V zeigten immer die höchste Anzahl unmutierter
Klone, die Unterschiede sind aber nicht signifikant. Bei den env-Sequenzen enthielten
9,4 % der Klone eine G-zu-A Mutation (Abb 4.2 A). Mehr als ein G-zu-A Austausch
pro Klon trat hier allerdings nicht auf, so dass man nicht von Hypermutation sprechen
kann. Anders verhält es sich bei der Analyse der nef-Sequenzen. Obwohl auch hier im
Schnitt nur 8,2% der Sequenzen G-zu-A Mutationen enthielten, waren drei dieser
Sequenzen hypermutiert und wiesen vier oder mehr G-zu-A Transitionen auf (Abb 4.2
A). Die betreffende Sequenz aus der Infektion mit HIV-1 NL4-3 trägt diese
Austausche allerdings alle im APOBEC3F-assoziierten GA-Dinukleotidkontext, und
auch die zwei hochmutierten Sequenzen aus Infektionen mit HIV-1 NL4-3M184V haben
die meisten G-zu-A Mutationen im GA-Dinukleotidkontext.
41
Ergebnisse
A
H9 Zellen
env
H9 Zellen
nef+3`LTR
PBMCs
Spender A+B
env
HIV-1 NL4-3
% der Klone
100
n = 29
n = 17
n = 11
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
HIV-1 NL4-3M184V
% der Klone
100
n = 28
n = 13
n = 14
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
HIV-1 NL4-3M184I
% der Klone
100
n = 23
n = 15
n = 13
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
HIV-1 NL4-3K65R/M184V
% der Klone
100
n=6
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
Anzahl aller Mutationen/Klon
B
H9 Zellen
env
H9 Zellen
nef+3`LTR
zu
A
A
zu
C
G
T
1
24
1
A
0
3
C
0
0
G
32
0
T
2
7
C
0
G
7
0
T
2
12
PBMCs
Spender A+B
env
A
zu
n = 80
C
G
T
3
8
0
0
2
G
T
0
14
3
A
0
2
C
0
0
G
19
0
T
0
4
von
3
A
C
0
n = 46
0
0
n = 43
Abb 4.2 Verteilung der Gesamtmutationszahl in H9 Zellen und PBMCs ist ähnlich in den
Regionen env, nef + 3`LTR. H9 Zellen und PBMCs der Spender A und B wurden mit Vif-positiven
HIV-1 Varianten (Wildtyp RT, RTM184V und RTM184I und RTK65R/M184V) infiziert. Nach der zweiten
Infektionsrunde wurde die zelluläre und virale DNA isoliert: 466 bp aus env und 523 bp aus
nef+3`LTR wurden amplifiziert, kloniert, sequenziert und analysiert. A) Angegeben ist der Prozentsatz
an Klonen, die die entsprechende Anzahl an Mutationen tragen. Die Anzahl der untersuchten Klone ist
angegeben. Zwei unabhängige Experimente wurden bei der Analyse der env-Klone durchgeführt. Für
die Analyse von nef+3`LTR wurde das Experiment einmal durchgeführt. Die Infektion mit HIV-1
NL4-3K65R/M184V wurde nur auf Zellen des Spenders B durchgeführt. B) Dargestellt sind die
aufgetretenen Nukleotidsubstitutionen in H9 Zellen und PBMCs, infiziert mit den HIV-1 NL4-3 RTVarianten. Ergebnisse der einzelnen Varianten waren ähnlich und wurden zusammengefasst. Die
komplette Anzahl an untersuchten Klonen ist angegeben.
42
Ergebnisse
Die Analyse von nef im Kontext der Variante HIV-1 NL4-3M184I unterschied sich von
allen anderen Experimenten: die wenigsten Sequenzen zeigten hier keine Mutation
(Abb 4.2 A). Die Mutationsrate in env im Vergleich von H9 Zellen und PBMCs
unterschieden sich nicht. In einem env-Klon, isoliert aus infizierten PBMCs von
Spender B, befanden sich 11 G-zu-A Austausche. In Abb 4.2 B ist das
Mutationsspektrum für den env- und nef-Bereich aus den H9 Experimenten
dargestellt, sowie das Muster der env-Klone aus Infektionen von PBMCs. Abgesehen
von den vereinzelten Klonen, die G-zu-A Hypermutation aufwiesen, unterschieden
sich die Ergebnisse kaum untereinander. Die häufigste Substitution war, abgesehen
von G-zu-A, A-zu-G. Weitere häufige Mutationen waren C-zu-T und T-zu-C (Abb
4.2 B).
4.4
Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3DvifM184I infizierten
H9 Zellen zeigen erhöhte G-zu-A Mutationsraten
Um den Einfluss der Prozessivität der RT auf die G-zu-A Mutationsrate zu
bestimmen, wurden H9 Zellen in zwei unabhängigen Infektionsrunden mit HIV-1
NL4-3Dvif, HIV-1 NL4-3DvifM184V und HIV-1 NL4-3DvifM184I infiziert. Insgesamt
wurden 99 env-Klone analysiert. Drei Klone enthielten keine G-zu-A Mutation. Zwei
der verbleibenden 96 Klone waren identisch, einer davon wurde von der Analyse
ausgeschlossen, um mögliche Einflüsse klonaler Amplifikation auszuschließen. Alle
31 env-Sequenzen, die aus HIV-1 NL4-3Dvif infizierten H9 Zellen stammten,
enthielten G-zu-A Mutationen (Abb 4.3 A). 18 davon (58,1%) enthielten 1-8 G-zu-A
Transitionen, 13 (41,9%) neun und mehr APOBEC3-assoziierte Mutationen. Der
höchstmutierte Klon enthielt 18 G-zu-A Mutationen, hier waren demzufolge 19,8%
aller Guaninmoleküle der Sequenz ausgetauscht. Ein ähnliches Muster zeigte sich in
env-Sequenzen aus HIV-1 NL4-3DvifM184V infizierten H9 Zellen. Hier wurden 34
Sequenzen untersucht. Zwei Klone enthielten keine G-zu-A Austausche (Abb 4.3 A).
Acht (23,5%) enthielten neun und mehr G-zu-A Mutationen, der höchstmutierte Klon
enthielt 19 G-zu-A Substitutionen. Die übrigen 24 Klone (70,6%) enthielten 1-8 G-zuA Mutationen. Die Unterschiede aus den hier beschriebenen Infektionen waren nicht
signifikant (Abb 4.3 A).
43
Ergebnisse
HIV-1 NL4-3Dvif
K65R
M184V
M184I
H9
HIV-1
Bereich
nef
WT RT
35
35
32
-
H9
3`LTR
35
35
32
-
H9
env
31
34
33
-
PBMCs
env
78
105
90
68
H9
nef
11.550
11.550
10.560
-
H9
3`LTR
6.755
6.755
6.176
-
H9
env
14.446
15.844
15.378
-
PBMCs
env
36.348
48.930
41.940
31.688
H9
nef
346
390
330
-
H9
3`LTR
75
73
76
-
H9
env
257
232
354
-
PBMCs
env
221
312
416
287
H9
nef
341
386
324
-
H9
3`LTR
72
67
67
-
Zelltyp
Anzahl aller
sequenzierter
Klone
Anzahl aller
sequenzierter
Basenpaare
Gesamtanzahl
aller Mutationen
Gesamtanzahl an
G-zu-A
Mutationen
Klone ohne G -zuA Mutation (%)
Durchschnittliche
Anzahl an
Mutationen/100
bp
Durchschnittliche
Anzahl an G-zu-A
Mutationen/100
bp
Durchschnittliche
Anzahl an G-zu-A
Mutationen/100
bp (nur Klone mit
G-zu-A Mutation)
+M184V
H9
env
246
210
334
-
PBMCs
env
190
270
371
254
H9
nef
0 (0)
1 (2,9)
2 (6,3)
-
H9
3`LTR
15 (42,9)
16 (45,7)
15 (46,9)
-
H9
env
0 (0)
2 (5,9)
1 (3,0)
-
PBMCs
env
29 (37,2)
40 (38,1)
33 (36,7)
36 (52,9)
H9
nef
3,00
3,38
3,13
-
H9
3`LTR
1,11
1,08
1,23
-
H9
env
1,78
1,46
2,30
-
PBMCs
env
0,61
0,64
0,99
0,91
H9
nef
2,95
3,34
3,07
-
H9
3`LTR
1,07
0,99
1,08
-
H9
env
1,70
1,33
2,17
-
PBMCs
env
0,52
0,55
0,88
0,80
H9
nef
2,95
3,34
3,07
-
H9
3`LTR
1,07
0,99
1,09
-
H9
env
1,7
1,41
2,24
-
PBMCs
env
0,45
0,89
1,4
1,7
Tab 4.4 Mutationsraten im viralen Genom nach zwei Infektionszyklen in H9 Zellen und PBMCs
der Spender A, B, C und D in Abwesenheit von vif. Dargestellt sind die vier RT Varianten, die
untersuchten Regionen im HIV-1 Genom die Anzahl der analysierten Sequenzen und die Analyse der
Mutationsraten.
44
Ergebnisse
A
H9 Zellen
env
H9 Zellen
nef
H9 Zellen
3`LTR
% der Klone
HIV-1 NL4-3Dvif
n = 31
n = 35
n = 35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
n = 34
n = 35
n = 35
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
n = 32
n = 32
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
70
50
30
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
% der Klone
HIV-1 NL4-3DvifM184V
70
50
30
10
% der Klone
HIV-1 NL4-3DvifM184I
70
n = 33
50
30
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
Anzahl an G-zu-A Mutationen/Klon
B
18
∗
G-zu-A Mutationshäufigkeit
(% aller Guaninmoleküle)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
env
C
nef
H9 Zellen
env
3`LTR
zu
A
A
zu
C
G
T
1
29
3
A
0
4
C
0
1
G
1051
1
T
0
18
C
0
G
790
0
T
0
14
H9 Zellen
3`LTR
H9 Zellen
nef
A
zu
C
G
T
A
C
G
T
0
15
1
A
1
10
1
0
4
C
0
0
24
0
G
206
0
T
0
3
von
1
n = 98
1
n = 102
0
0
n = 102
45
Ergebnisse
Abb 4.3 G-zu-A Mutationsverteilung in env-, nef- und 3`LTR-Sequenzen aus H9 Zellen, infiziert
mit HIV-1 NL4-3Dvif Varianten. H9 Zellen wurden infiziert mit HIV-1 NL4-3Dvif, HIV-1 NL43DvifM184V, und HIV-1 NL4-3DvifM184I. Virale DNA wurde nach der zweiten Infektionsrunden isoliert
und 466 bp von env und 523 bp von nef+3`LTR wurden amplifiziert, kloniert, sequenziert und
analysiert. Für diese Analyse wurden die 330 bp von nef getrennt vom 3`LTR-Bereich betrachtet. Die
Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst. A) Der Prozentsatz der
Klone, die die entsprechende Anzahl an G-zu-A Mutionen trägt, ist angegeben, ebenso die Anzahl der
analysierten Klone. B) Prozentsatz der G-zu-A Mutationsrate mit Standardabweichung in Klonen mit
G-zu-A Mutationen. Angegeben sind die drei analysierten Bereiche des HIV-1 Genoms, gelb = HIV-1
NL4-3Dvif, grün = HIV-1 NL4-3DvifM184V und blau = HIV-1 NL4-3DvifM184I. C) Mutationsspektren
der drei analysierten Bereich des HIV-1 Genoms. Angegeben ist die Art der Mutation und die Anzahl
der untersuchten Klone.
Dem gegenüber stehen die Ergebnisse der env-Klone aus HIV-1 NL4-3DvifM184I
infizierten H9 Zellen. Einer von 33 Klonen wies keine G-zu-A Mutationen auf, 15
Klone (45,5%) trugen 1-8 G-zu-A Austausche. 17 aus 33 env-Sequenzen (51,5%)
enthielten neun und mehr G-zu-A Mutationen (Abb 4.3 A). Vier Klone enthielten 22,
23, 24 und 40 (entsprechend 24,2-44,0% aller Guaninmoleküle) G-zu-A Austausche.
Dieses Resultat unterscheidet sich signifikant von der Ergebnissen aus den Infektion
mit der Variante HIV-1 NL4-3DvifM184V (p=0,04, Abb 4.3 B). Obwohl die G-zu-A
Mutationsrate der Klone aus Infektionen mit HIV-1 NL4-3DvifM184I auch höher war
im Vergleich zu Klonen aus HIV-1 NL4-3Dvif infizierten H9 Zellen, sind diese
Unterschiede statistisch nicht signifikant (p=0,35, Abb 4.3 B).
Bei der Analyse der nicht-G-zu-A Mutationen war die am häufigsten beobachtete
Mutation die A-zu-G Mutation. Die nicht-G-zu-A Mutationsraten der env-Klone aus
den Infektionen mit den drei HIV-1 NL4-3Dvif Varianten waren sehr ähnlich und
wichen nicht von den Ergebnissen, die unter Anwesenheit des Vif-Proteins erzielt
wurden, ab (Abb 4.3 C).
4.5
Keine Unterschiede in den G-zu-A Mutationsraten in
nef und 3`LTR aus infizierten H9 Zellen bezüglich der
HIV-1 NL4-3Dvif RT Varianten
Zusätzlich zu env wurden auch Bereiche des nef-Gens und der 3`LTR untersucht.
Insgesamt wurden 103 Klone sequenziert, ein Klon trat doppelt auf und wurde aus der
Analyse ausgeschlossen. Auch hier sollte untersucht werden, ob eine abgeschwächte
Prozessivität der HIV-1 RT zu einer Erhöhung der G-zu-A Mutationsrate führt.
Sequenziert wurde ein Fragment, das einen Bereich von nef und einen Bereich des
3`LTRs umfasst, ausgewertet wurden diese Teilbereich jedoch getrennt voneinander.
46
Ergebnisse
Die Unterschiede der G-zu-A Mutationsraten in Bezug auf die HIV-1 NL4-3Dvif RT
Varianten waren nicht signifikant (Abb 4.3 B). 17 nef-Sequenzen (48,6%) aus den
Infektionen mit HIV-1 NL4-3Dvif enthielten 1-8 G-zu-A Mutationen, 18 Sequenzen
(51,4%) trugen neun oder mehr dieser Mutationen. Eine dieser Sequenzen hatte 37 Gzu-A Austausche. Im 3`LTR Bereich hatten 15 Sequenzen (42,9%) keine G-zu-A
Substitution, 17 Sequenzen trugen 1-6 (48,5%) G-zu-A Mutationen und nur drei
Sequenzen enthielten neun oder mehr G-zu-A Mutationen (8,6%). Bei Analyse der
Sequenzen aus Infektionen mit HIV-1 NL4-3DvifM184V ergab sich eine G-zu-A freie
Sequenz (2,9%), 14 Sequenzen (40,0%) mit 1-8 G-zu-A Mutationen und 20
Sequenzen (57,1%) mit neun oder mehr G-zu-A Austauschen. Im 3`LTR-Bereich
hatten 16 Sequenzen (45,7%) keinen G-zu-A Austausch, 10 Klone (28,6%) hatten nur
eine Mutation, sieben Sequenzen (19%) trugen 2-7 Mutationen, zwei Sequenzen
enthielten neun oder mehr G-zu-A Mutationen. 2 nef-Sequenzen (6,3%) aus
Infektionen mit HIV-1 NL4-3DvifM184I waren ohne G-zu-A Mutation. 11 Sequenzen
(34,4%) trugen 1-8 G-zu-A Austausche und über 56,4% (19 Sequenzen) enthielten
neun oder mehr G-zu-A Mutationen, die maximal mutierte Sequenz trug 26 G-zu-A
Transitionen. Dieses Ergebnis steht im Kontrast zur 3`LTR-Sequenz. 15 Sequenzen
(46,9%) wurden nicht durch APOBEC3-Proteine mutiert, 15 Sequenzen enthielten
zwischen einer und acht G-zu-A Mutationen. Nur zwei Sequenzen (6,3%) trugen neun
beziehungsweise 10 G-zu-A Transitionen (Abb 4.3 A). Damit war die G-zu-A
Mutationsrate in 3`LTR-Sequenzen deutlich niedriger.
Da gezeigt wurde, dass im HIV-1 Genom ein Gradient an G-zu-A Mutationen durch
die zeitabhängige Wirkung von APOBEC3G entsteht, wurden die env-, nef- und
3`LTR-Sequenzen auf den Gehalt an G-zu-A Mutationen separat untersucht
15,90,105
.
Das nef-Gen ohne die Überlappung mit der 3`LTR ist der Bereich, der am längsten
während der reversen Transkription einzelsträngig verbleibt. Der 3`LTR-Bereich ist
die kürzeste Zeit einzelsträngig. Klone, die keine G-zu-A Mutation enthielten, wurden
für diese Untersuchung nicht gezählt, für env und nef waren es jeweils drei Sequenzen
(3,3% und 2,94%) und im 3`LTR-Bereich waren es 41 Sequenzen (45,17%).
Insgesamt wurden 95 env-, 99 nef- und 61 3`LTR-Sequenzen untersucht. Die
Ergebnisse aller drei Virusvarianten wurden hier zusammengefasst. Durchschnittlich
waren in den env-Sequenzen 8,1 der 91 Guaninmoleküle durch Adenin ersetzt (9,1%),
für nef waren es 10,3 von 99 Guaninmolekülen (11,0%) und für den 3`LTR-Bereich
47
Ergebnisse
3,4 von 48 Guaninmolekülen (7,6%), die pro Klon durch ein Adenin ersetzt wurden.
Die G-zu-A Austauschrate in nef ist signifikant erhöht im Vergleich zu env (p=0,005)
und hochsignifikant erhöht verglichen mit der 3`LTR-Sequenz (p<0,0001). Auch der
Unterschied zwischen env- und dem 3`LTR-Bereich ist hochsignifikant (p<0,0001)
(Abb 4.4). Dies bestätigt, dass die G-zu-A Mutationsrate einen Gradienten aufweist.
p<0,0001
p<0,0001
G-zu-A Mutationshäufigkeit
(% aller Guaninmoleküle)
p=0,005
12
10
8
6
4
2
0
env
nef
3`LTR
Abb 4.4 G-zu-A Mutationshäufigkeit in den Bereichen env, nef und 3`LTR aus H9-stammenden
HIV-1 Sequenzen. Angegeben ist der Prozentsatz der G-zu-A Mutationsrate mit Standardabweichung
und p-Werten.
4.6
Env-Fragmente aus HIV-1 NL4-3DvifM184I und HIV-1
NL4-3DvifK65R/M184V infizierten PBMCs zeigen erhöhte
G-zu-A Mutationsraten
Es wurde gezeigt, dass sich die Replikationsfähigkeit von HIV-1 Varianten mit
unterschiedlichen Aminosäuren an Position 184 der RT, kaum unterscheiden, wenn TZelllinien verwendet werden. Dies legt den Schluss nahe, dass die Prozessivität des
Enzyms alleine nicht unbedingt die reverse Transkription verzögert 4. In PBMCs
hingegen wurde ein Zusammenhang zwischen der Prozessivität dieser RT Varianten
und der Replikationsfähigkeit beobachtet 4. Daher wurden die Experimente auf
primäre Zellen ausgeweitet und der Einfluss der verschiedenen RT Varianten auf die
G-zu-A Mutationsrate in PBMCs von vier verschiedenen HIV-1 negativen Spendern
untersucht. Zusätzlich wurde eine vierte RT-Variante benutzt. Die Kombination der
K65R Mutation mit M184V, welche eine noch geringere Prozessivität als die M184V
RT-Variante alleine aufweist, erweiterte das Spektrum an Prozessivitätsunterschieden
21,100
.
48
Ergebnisse
A
PBMCs
Spender A
PBMCs
Spender B
PBMCs
Spender C
PBMCs
Spender D
% der Klone
HIV-1 NL4-3Dvif
70
n = 22
n =19
n = 19
n = 18
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
n = 20
n = 28
n = 28
n = 29
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
n = 23
n = 22
n = 24
n = 21
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
n = 22
n = 26
n = 20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9+
50
30
10
% der Klone
HIV-1 NL4-3DvifM184V
70
50
30
10
% der Klone
HIV-1 NL4-3DvifM184I
70
50
30
10
% der Klone
HIV-1 NL4-3DvifK65R/M184V
70
50
30
10
Anzahl an G-zu-A Mutationen/Klon
C
zu
A
A
C
G
T
6
63
7
1
29
C
0
G
1085
0
T
1
41
von
0
3
n = 341
G-zu-A Mutationshäufigkeit
(% aller Guaninmoleküle)
B
18
16
p<0,0001
p<0,0001
14
12
10
8
6
4
2
0
Abb 4.5 G-zu-A Mutationshäufigkeiten in den env-Klonen aus PBMCs infiziert mit HIV-1 NL43DvifK65R/M184V. PBMCs wurden infiziert mit HIV-1 NL4-3Dvif, HIV-1 NL4-3DvifM184V, HIV-1 NL43DvifM184I und HIV-1 NL4-3DvifK65R/M184V. Virale DNA wurde nach der zweiten Infektionsrunde
isoliert und 466 bp von env wurden amplifiziert, kloniert, sequenziert und analysiert. Der Prozentsatz
der Klone, die die entsprechende Anzahl an G-zu-A Mutationen trägt ist angegeben, ebenso die Anzahl
der analysierten Klone. A) Angegeben ist der Prozentsatz an Klonen, die die entsprechende Anzahl an
G-zu-A Mutationen tragen. Die Anzahl der untersuchten Klone ist angegeben. B) Mutationsspektrum
der untersuchten Klone. Angegeben ist die Art der Mutation und die Anzahl der untersuchten Klone. C)
Prozentsatz der G-zu-A Mutationshäufigkeit bezogen auf alle Guaninmoleküle mit
Standardabweichung und p-Werten. Gelb = HIV-1 NL4-3Dvif, grün = HIV-1 NL4-3DvifM184V, blau =
HIV-1 NL4-3DvifM184I und rot = HIV-1 NL4-3DvifK65R/M184V.
49
Ergebnisse
Insgesamt wurden 363 HIV-1 env-Klone sequenziert und analysiert. 203 Klone
enthielten mindestens eine G-zu-A Mutation. Um ungewollte Beeinflussung durch
klonale Ereignisse zu vermeiden, wurden davon 22 Klone, zu denen es ein identisches
Duplikat gab, von der Analyse ausgeschlossen. Daher standen für die Auswertung 342
Klone zur Verfügung (Tab 4.4, Abb 4.5). 48 von 78 Klone aus HIV-1 NL4-3Dvif
infizierten PBMCs trugen G-zu-A Austausche. Fast alle dieser env-Sequenzen trugen
1-7 G-zu-A Mutationen (93,8%), nur ein Klon enthielt neun und zwei Klone 11 G-zuA Mutationen (Abb 4.5 A). Ein ähnliches Bild ergab sich bei HIV-1 env-Klonen,
isoliert aus HIV-1 NL4-3DvifM184V infizierten PBMCs. Hier trugen 65 der 105
Sequenzen G-zu-A Mutationen. Dabei enthielt die Mehrheit 1-7 G-zu-A Mutationen
(81,8-100%). Jeweils nur einmal traten Klone mit acht, neun, 12 und 13 G-zu-A
Transitionen auf, zweimal wurden jeweils Klone mit 10 beziehungsweise 11 G-zu-A
Mutationen beobachtet. Die HIV-1 env-Sequenzen aus Infektionsversuchen mit HIV1 NL4-3DvifM184I zeigten höhere G-zu-A Mutationsraten verglichen mit den Klonen
aus HIV-1 NL4-3Dvif oder HIV-1 NL4-3DvifM184V infizierten PBMCs. Dieser
Anstieg war jedoch nicht signifikant (p=0,06 und p=0,09). 57 von 90 Klone trugen Gzu-A Mutationen. Daraus enthielten 33 der Klone (57,9%) 1-7 G-zu-A Mutationen
und weitere 20 Klone neun und mehr G-zu-A Mutationen. Im Gegensatz zu den zuvor
beschriebenen HIV-1 RT-Varianten, wiesen acht Klone zwischen 14 und 18 G-zu-A
Austausche auf. Ein Klon mit 38 G-zu-A Mutationen wurde detektiert, das bedeutet,
dass 41,8% aller Guanosine zu Adenin mutiert sind. Eine derart hoch-mutierte envSequenz wurde auch in Infektionsversuchen mit H9 Zellen, infiziert mit der HIV-1
NL4-3DvifM184I
Variante,
gefunden.
HIV-1
NL4-3DvifK65R/M184V
wurde
für
Infektionen der PBMCs von Spendern B, C und D benutzt (Abb 4.5 A, C). 32 von 68
HIV-1 env-Sequenzen enthielten G-zu-A Mutationen. 15 von 32 Klonen (46,9%)
trugen 1-7 G-zu-A Mutationen. 17 weitere Klone (53,1%) wiesen zwischen neun und
16 G-zu-A Austausche auf (Tab 4.4, Abb 4.5 A). Dies führte schließlich zur höchsten
G-zu-A Mutationsrate und verglichen mit den Infektionen, bei denen HIV-1 NL43Dvif und HIV-1 NL4-3DvifM184V benutzt wurden, waren diese Unterschiede
signifikant. (p<0,001, Abb 4.5 C). Nach den G-zu-A Mutationen traten, wie schon bei
Klonen aus H9 Zellen (Abb 4.3 C), A-zu-G, T-zu-C und C-zu-T Mutationen am
häufigsten auf (Abb 4.5 B). Die isolierte zelluläre DNA aller PBMC Spender wurde
50
Ergebnisse
auf Plasmidkontaminationen getestet, indem ein Vektorfragment, überlappend mit
dem HIV-1 Genom amplizifiert wurde. Alle Proben waren hierfür negativ.
4.7
Die Analyse des Dinukleotid-Kontextes in env und
nef+3`LTR zeigt präferentielle G-zu-A
Transitionsstellen
Die
APOBEC3-Proteine
erkennen
bestimmte
Nukleotidabfolgen,
an
denen
präferentiell Deamination stattfindet. Die bevorzugten Dinukleotid-Kontexte sind für
APOBEC3G und 3F bekannt: CC-zu-CU und TC-zu-TU
10,32,50,101,105
. Im Plusstrang
findet man dann dementsprechend GG-zu-AG und GA-zu-AA. Es ist jedoch auch
bekannt,
dass
weitere
benachbarte
Nukleotide
einen
Einfluss
auf
den
Deaminationsprozess haben können. Daher wurden alle Klone, die mindestens eine
G-zu-A Mutation aufwiesen, auf die Häufigkeit von G-zu-A Transitionen in Bezug
auf jedes einzelne Guaninmoleküls untersucht. Dies wurde für beide Zielsequenzen,
466 bp in env und 523 bp in nef+3`LTR durchgeführt. Das env-Fragment enthält 25
GG-Motive und 31 GA-Motive, das nef+3`LTR-Fragment 47 GG- und 48 GAMotive. Für den env-Bereich wurden die Ergebnisse aus den H9-Experimenten mit
den PBMC-Experimenten zusammengefasst, da die Auswertung sehr ähnliche
Resultate ergab. Es konnte gezeigt werden, dass APOBEC3G eine größere Rolle bei
der Deamination spielt als APOBEC3F. In Abb 4.6 sind daher nur APOBEC3Fassoziierte GA-Dinukleotide markiert, wenn diese Stelle in über 5% der Klone eine
G-zu-A Mutation enthielten. Für APOBEC3G-assoziierte Klone wird jedes GGDinukleotid angezeigt, da dieses Protein eine größere Rolle in der Deamination spielt.
Die Analyse sowohl der env- als auch nef+3`LTR-Sequenzen ergab, dass 85,1% aller
G-zu-A Mutationen im GG-Kontext stattfanden. Allerdings wurde nicht jedes GGDinukleotid gleichhäufig zu einem AG-Dinukleotid mutiert. In der env-Sequenz war
die am stärksten mutierte Stelle in 71,7% aller G-zu-A haltigen Klone mutiert, in nef
waren vier GG-Dinukleotide über 70% G-zu-A mutiert, maximal mit 78,8%.
Zusammengefasst für env- und nef-Fragmente lagen vier dieser fünf hochmutierten
Stellen im Kontext GGG, wobei das erste Guanin zu Adenin mutiert wurde. Das am
häufigsten mutierte Guanin war in der 3`LTR in 27,8% aller Sequenzen zu Adenin
mutiert.
51
Ergebnisse
Dem gegenüber standen GG-Dinukleotide, die kaum oder niemals durch APOBEC3Proteine mutiert wurden. Wenn keine Sequenz einen G-zu-A Austausch trug, so fand
das immer im GGC-Sequenzkontext statt. In diesem Kontext waren maximal 6,9%
der Klone an einer solchen Stelle mutiert. Die signifikant höhere G-zu-A
Mutationsrate in Klonen aus infizierten H9 Zellen spiegelt sich hier auch wider, da die
GG-Dinukleotide in DNA aus H9 Zellen 1,7±0,6 mal stärker mutiert waren als in
DNA infizierter PBMCs. Die Gewichtung der einzelne mutierte Guaninmoleküle war
aber in beiden Zellsystemen gleich.
A
B
6,0
38,4 3,0
70,3 5,8
45,5
T AGA AGA ATA AGA CAG GGC TTG GAA AGG ATT
6.9
..T AAA ACC ATA ATA GTA CAG CTG AAC ACA TCT
31
64
9.7 26.9 6.9
74,3
17,9
31
10,7
6.8
64
52,4 24,8
AGT AGT GTG ATT GGA TGG CCT GCT GTA AGG GAA
6,0
ACA AGA AAA AGT ATC CGT ATC CAG AGG GGA CCA
0,0
TTG CTA TAA G** ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA
6,1
GTA GAA ATT AAT TGT ACA AGA CCC AAC AAC AAT
75,216,0
18,7
97
29,4 55,2 11,8
97
AGA ATG AGA CGA GCT GAG CCA GCA GCA GAT GGG 130
GGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GGA AAA ATA GGA 130
GTG GGA GCA GTA TCT CGA GAC CTA GAA AAA CAT 163
43.4 14.5
11.4
17.6
72,1 24,0
12.8
8,2
47,3
AAT ATG AGA CAA GCA CAT TGT AAC ATT AGT AGA 163
GGA GCA ATC ACA AGT AGC AAT ACA GCA GCT AAC 196
35.9
6,9
GCA AAA TGG AAT GCC ACT TTA AAA CAG ATA GCT 196
10.3
43.4
25,6
AGC AAA TTA AGA GAA CAA TTT GGA AAT AAT AAA 229
22,5
AAT GCT GCT TGT GCC TGG CTA GAA GCA CAA GAG 229
11,9 78,3 37,0
12,9
GAG GAA GAG GTG GGT TTT CCA GTC ACA CCT CAG 262
1.7 9.7 21.0 6.2
3,0
ACA ATA ATC TTT AAG CAA TCC TCA GGA GGG GAC 262
GTA CCT TTA AGA CCA ATG ACT TAC AAG GCA GCT 295
11.7
6.9
CCA GAA ATT GTA ACG CAC AGT TTT AAT TGT GGA 295
11.7 34.5 9.0
GTA GAT CTT AGC CAC TTT TTA AAA GAA AAG GGG 328
3,0
GGG GAA TTT TTC TAC TGT AAT TCA ACA CAA CTG 328
42.4
7,9 1,9 1,0 4,1
23,8
GGA CTG GAA GGG CTA ATT CAC TCC CAA AGA AGA 361
29.7 6.9
13,0
TTT AAT AGT ACT TGG TTT AAT AGT ACT TGG AGT 361
71.7 3.8
CAA GAT ATC CTT GAT CTG TGG ATC TAC CAC ACA 394
17.9
3,1
ACT GAA GGG TCA AAT AAC ACT GAA GGA AGT GAC 394
3,1
CAA GGC TAC TTC CCT GAT TGG CAG AAC TAC ACA 427
10,8 2,0
ACA ATC ACA CTC CCA TGC AGA ATA AAA CAA TTT 427
0.0
9.7
37.9
7,7
12,2
GGA TGG TGC TAC AAG CTA GTA CCA GTT GAG CCA 493
8,0
466
6,0 18,0 1,0
CCA GGG CCA GGG GTC AGA TAT CCA CTG ACC TTT 460
27,8
ATA AAC ATG TGG CAG GAA GTA GGA AAA GCA ATG 460
TAT GCC
18,8 0,0
3,8
11,2
6,0
GAT AAG GTA GAA GAG GCC AAT AAA GGA GAG AA
523
Abb 4.6 G-zu-A Mutationsspektren von viraler DNA. Es wurden nur Klone einbezogen, die
mindestens eine G-zu-A Mutation aufwiesen. In schwarz eingezeichnet ist die Prozentzahl der Klone,
die an dieser Stelle einen G-zu-A Austausch im GG-Kontext, der präferentiell durch APOBEC3G
mutiert wird, enthalten; in grün die G-zu-A Mutationen im APOBEC3F assoziierten GA-Kontext,
wenn über 5% der Klone hier mutiert waren. A) Analysiert wurden die Nukleotide 7057 bis 7522 des
466 bp langen env-Fragments von HIV-1 NL4-3 (genebank accession Nummer AF 324493).
Unterstrichen sind der V3 - und V4 loop und jedes erste Guanin eines GG-Motivs ist fett markiert. Es
wurden insgesamt 290 HIV-1 env-Klone untersucht, 95 aus H9 Zellen und 195 aus PBMCs. B)
Analysiert wurden die Nukleotide 8748 bis 9309 des 523 bp langen nef+3`LTR-Fragments von HIV-1
NL4-3. In grau markiert sind Nukleotide, bei denen sich das gp41-Gen und das nef-Gen überlappen,
unterstrichen ist der 3`LTR-Bereich und jedes erste Guanin eines GG-Motivs ist fett markiert. *
markieren wegen Leserasterverschiebung Platzhalter in der Sequenz; es wurden 102 Klone untersucht.
52
Diskussion
5
Diskussion
Ein Ziel war es, den Einfluss der Prozessivität der HIV-1 RT auf die APOBEC3
Protein-induzierte G-zu-A Mutationsrate zu untersuchen. Die Hypothese lautete, dass
eine erniedrigte Prozessivität zu einer geringeren DNA-Syntheserate führt, was
wiederum bedingt, dass die APOBEC3-induzierte G-zu-A Mutationsrate steigt. Dazu
wurden verschiedene Varianten von HIV-1 NL4-3 und HIV-1 NL4-3Dvif generiert,
die im RT-Gen des Virus Prozessivität-senkende Mutationen tragen. Neben den
Medikamenten-resistenten Varianten M184V, M184I und K65R/M184V wurden auch
die Mutationen Y115A, R78A/Q151N und D549N in das Gen der HIV-1 RT
eingebracht, die in biochemischen Assays, wie dem M13 lacZa forward mutation
assay, eine verringerte Prozessivität der RT zeigen
Y115A,
R78A/Q151N
Volllängenplasmide
nach
und
D549N,
Transfektion
ergaben
weder
59,68,78,99
. Diese RT Varianten,
im
Kontext
hochtitrige
der
HIV-1
Virusstocks
noch
replizierten die Viren in T-Zelllinien. Diese Replikationsunfähigkeit könnte auf die
niedrigen viralen Titer zurückzuführen sein. Wahrscheinlicher ist jedoch, dass sich
diese Mutationen negativ auf die Replikationseigenschaften auswirken. Diese RT
Enzyme wurden vorwiegend isoliert und aufgereinigt in biochemischen Assays und
nicht
im
Kontext
der
viralen
Replikation
untersucht.
Daten
über
das
Replikationsvermögen existieren kaum. Es wurde einmal beschrieben, dass die HIV-1
70
Variante, die die Y115A Mutation enthält, replikationsinkompetent ist
. Über die
Variante mit der Doppelmutation R78A/Q151N gibt es bisher keine Daten zur
Replikationskapazität. Sie kommt in Patientenisolaten nicht vor
57,89,93
. Das spricht
dafür, dass diese Mutationen nicht vorteilhaft für die Virusvermehrung sind. Die
D549-Position befindet sich im aktiven Zentrum der RNase H-Domäne der RT und
verlangsamt die RNase H-Aktivität
78
beziehungsweise hebt sie auf 19. Die Virustiter
dieser Variante zeigen im single-replication cycle assay eine 5-10 fache Reduktion 68.
Die
Medikamentenresistenz-assoziierten
Mutationen
M184V,
M184I
und
K65R/M184V verursachten keine komplette Hemmung der Replikationsfähigkeit.
Diese Mutationen werden oft in Patienten bei Therapieversagen selektioniert, was
darauf hinweist, dass diese Virusvarianten in vivo replikationsfähig sind. Obwohl in
biochemischen Analysen beobachtet wurde, dass diese Mutationen einen ~10-fache
Senkung der Enzymaktivität bedingen, konnte keine klare Korrelation zwischen
Wachstumskapazität und der RT-Variante in dieser Untersuchung mit H9- MT453
Diskussion
Zellen
und
PBMCs
detektiert
werden
97
.
Es
wurde
gezeigt,
dass
die
Replikationsfähigkeit der respektiven Virusvarianten in Abhängigkeit vom dNTPKonzentration einer Zelle ist. Viele T-Zelllinien haben einen hohen Gehalt an dNTPs
und keine Unterschiede im Wachstumsverhalten zwischen Wildtyp-HIV-1 und HIV1M184V und HIV-1M184I sind nachweisbar, in PBMCs jedoch ist die dNTPKonzentration
deutlich
geringer.
Die
M184V-Mutation
verursacht
eine
Verlangsamung der Replikation in PBMCs und dies ist durch die M184I Mutation
noch deutlicher ausgeprägt 4.
Es wurden Infektionen mit HIV-1 NL4-3 durchgeführt, um Unterschiede der
Mutationraten der RT-Varianten zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass die
aufgereinigten RT-Enzyme mit den Mutationen M184V, M184I oder K65R/M184V
eine verringerte Fehlerrate, verglichen mit dem Wildtyp-Enzym, besitzen
21,71,76,97
. In
viralen Replikationsexperimenten hat man widersprüchliche Ergebnisse erhalten, zum
Teil wurden sogar höhere Fehlerraten der M184V- und M184I-Variante verglichen
mit der Wildtyp-RT gemessen
22,40,43
. Die Klone aus den Infektionsversuchen mit
HIV-1 NL4-3 zeigten, hinsichtlich der unterschiedlichen RT-Varianten, keine
Unterschiede in der Mutationshäufigkeit, weder in H9 Zellen noch in PBMCs
verschiedener Spender. Dies weist darauf hin, dass neben der Reversen Transkriptase
noch weitere virale und/oder zelluläre Faktoren die Mutationsrate im viralen Genom
beeinflussen.
Wurde Vif exprimiert, traten hauptsächlich G-zu-A, A-zu-G und T-zu-C Mutationen
auf, sowohl in H9-Zellexperimenten als auch in PBMCs. Das stimmt mit den Daten
der
Los
Alamos
HIV-1
drug
Medikamentenresistenz-vermittelnden
resistance
database
Mutationen
überein;
entstehen
durch
47%
aller
diese
drei
Transitionen 8. In drei nef-Sequenzen aus H9 Zellen stammend, und in einer Sequenz
aus PBMCs befanden sich Klone mit mindestens vier G-zu-A Mutationen. Diese Gzu-A Austausche fanden in den nef-Sequenzen vor allem im GA-Dinukleotid-Kontext
statt, was vermutlich durch APOBEC3F Deaminase-Aktivität verursacht wurde. In
Sequenzen aus Infektionen mit HIV-1 NL4-3Dvif-Varianten wurde keine ausgeprägte
APOBEC3F-assoziierter G-zu-A Hypermutation gemessen. Dies könnte daran liegen,
dass Vif schwächer mit APOBEC3F interagiert und folglich APOBEC3F öfter in das
neuenstehende Viruspartikel verpackt wird 50. Im Gegensatz dazu fanden die G-zu-A
Austausche in dem PBMC-Sequenzen vor allem im GG-Dinukleotid-Motiv statt, ein
54
Diskussion
Indiz für APOBEC3G Deaminaseaktivität. G-zu-A Hypermutationen sind sporadisch
in viralen Genomen HIV-1 infizierter Zellkulturen gefunden worden, die mit Vifpositivem HIV-1 infiziert waren
96
. Auch wurde hypermutierte provirale DNA in
Patienten gefunden: In bis zu ~20% der Sequenzen, vorzugsweise im GG- und GADinukleotidkontext. Ein Hinweis auf das Fehlen oder nichtfunktionelles Vif konnte
nicht gezeigt werden
27,38,45
. Das spricht dafür, dass APOBEC3G/F das virale Genom
deaminieren kann, selbst in der Anwesenheit von Vif. Denkbar ist weiterhin, dass
durch die virale RT Mutationen in vif entstehen und dadurch APOBEC3G/F in die
Virionen eingebaut werden, was schließlich zu G-zu-A Mutationen in der viraler
DNA führt.
Der Einfluss der APOBEC3-Proteine wurde bestimmt durch Infektionsversuche mit
Vif-defizienten HIV-1 Varianten, die sich in ihrer RT unterschieden. In H9 Zellen und
PBMCs, die mit HIV-1 NL4-3Dvif Varianten infiziert wurden, wurde in DNA aus
HIV-1 NL4-3DvifM184I eine höhere G-zu-A Mutationsrate gemessen im Vergleich zu
HIV-1 NL4-3Dvif und HIV-1 NL4-3DvifM184V. Noch stärker waren die Effekte in
DNA aus PBMCs, die mit HIV-1 NL4-3DvifK65R/M184V infiziert waren. Diese
Beobachtungen deuten darauf hin, dass die APOBEC3G/F induzierte G-zu-A
Mutationshäufigkeit invers korreliert zur Prozessivität der HIV-1 RT. Vermutlich
beruht dieser Effekt nicht auf einer direkten Interaktion zwischen den APOBEC3Proteinen und der HIV-1 RT, da publiziert ist, dass die Fähigkeit von APOBEC3G
zur Deamination nicht die Anwesenheit der HIV-1 RT benötigt
91
. Daher wird
angenommen, dass die RT-Enzyme mit verringerter Prozessivität zu einer
verlängerten Exposition der einzelsträngigen HIV-1 DNA gegenüber APOBEC3G
führt. Desweiteren wurde bereits gezeigt, dass der Deaminationsprozess zeitabhängig
ist
15,90,105
. Zwei Studien berichten über einen 5`-zu-3` G-zu-A Gradient in der HIV-1
DNA, wobei die höchste Anzahl an G-zu-A Transitionen im 5`Bereich von nef und
die geringste Menge im 5`LTR gefunden wurde
90,105
. Genauer betrachtet existieren
zwei G-zu-A Gradienten in der HIV-1 DNA, verursacht durch den cPPT mit
jeweiligen Maxima im 5`Bereich von nef und das zweite direkt 5` neben dem cPPT 90.
Diese Ergebnisse stimmen mit dem Modell der reversen Transkription überein und
sprechen für die Zeitabhängigkeit des Deaminationsprozesses.
55
Diskussion
Es wurden sowohl H9 Zellen als auch PBMCs vier verschiedener Spender mit HIV-1
NL4-3Dvif-Varianten infiziert und die HIV-1 DNA bezüglich der G-zu-A
Austauschrate untersucht. In der Analyse der env-Fragmente aus Infektionen mit
HIV-1 NL4-3Dvif-Varianten stellte sich heraus, dass die G-zu-A Mutationsrate in
viraler DNA aus H9 Zellen signifikant höher ist verglichen mit viraler DNA aus
PBMCs. Erwartet wurde ein gegenteiliges Ergebnis. Es wurde gezeigt, dass das
Replikationsvermögen der HIV-1 Varianten mit den Mutationen M184V und M184I
in PBMCs verringert ist, und diese Beobachtung korreliert mit der Prozessivität dieser
RT-Varianten. Dieser Effekt trat nicht in T-Zelllinien auf. Man führte das auf die
geringere dNTP-Konzentration in primären Zellen verglichen mit T-Zelllinien zurück
4
. Vor kurzem wurde gezeigt, dass eine verringerte Aktivität in Bezug auf den Einbau
von dNTP-Molekülen
für
die
herabgesetzte
Prozessivität
und
langsamere
Polymerisationsraten der HIV-1 RT Varianten M184I und M184A verantwortlich ist;
und eine begrenzte dNTP-Konzentration verstärkt diesen Effekt noch
29
. Deswegen
wurde vermutet, dass die geringe dNTP-Konzentration in PBMCs die Polymerisation
noch stärker verlangsamt und die APOBEC3-Proteine länger Zugang zur
einzelsträngige DNA und dementsprechend in stärkerem Ausmaß zur Deamination
führt.
Diese vergleichende Analyse der G-zu-A Mutationsraten in HIV-1 DNA isoliert aus
H9 Zellen und PBMCs ergab desweiteren Unterschiede zwischen beiden Zelltypen im
Anteil nicht-G-zu-A mutierter Klone. Durchschnittlich enthielten 40% der viralen
env-Klone aus PBMCs keinen G-zu-A Austausch. Dieser Effekt wurde in H9 Zellen
nicht beobachtet, nur 3% der env-Klone enthielten hier keine G-zu-A Mutationen.
Eine Plasmidkontamination konnte ausgeschlossen werden, da die isolierte zelluläre
DNA jedes PBMC Spenders auf pNL4-3 Vektor-DNA via PCR getestet wurde und
dieses Ergebnis negativ war. Daher musste dieses Phänomen eine andere Ursache
haben. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Deaminaseaktivität von endogenem
APOBEC3G in T-Zelllinien und PBMCs niedriger ist verglichen mit APOBEC3G,
das in APOBEC3G-transfizierten Epithelzellen exprimiert wird
94
. Dies impliziert,
dass die Deaminaseaktivität von APOBEC3G durch bisher unbekannte Faktoren
unterdrückt werden kann. Diese Faktoren scheinen jedoch nur in T-Zelllinien und
primären Zellen, nicht aber in epithelialen Zellen exprimiert zu werden. Dann könnte
man spekulieren, dass diese Faktoren in H9 Zellen schwächer exprimiert werden als
in PBMCs und dass die Expression in PBMCs verschiedener Spender schwankt.
56
Diskussion
Zusätzlich könnte der Gehalt an APOBEC3G mRNA in primären Zellen niedriger
sein als in H9 Zellen. Dies war der Fall in den verwendeten H9 Zellen und PBMCs.
Die APOBEC3G mRNA Expression war in PBMCs 1,5-18 fach niedriger als in H9
Zellen, wobei aber die APOBEC3G mRNA Expression in PBMCs sehr variabel war.
Eine
Korrelation
zwischen
der
APOBEC3G
mRNA
Expression
und
der
Deaminationsintensität wurde nicht gefunden. Unterschiede in der Expression von
APOBEC3G mRNA in PBMCs verschiedener Spender wurden bereits beobachtet 39.
Bezüglich der hohen Anzahl von Sequenzen ohne G-zu-A Mutationen in PBMCs ist
es auch vorstellbar, dass APOBEC3 Proteine durch weitere Mechanismen außer der
Deaminaseaktivität antiretroviral wirken und dadurch diesen Effekt erzeugten. Es
wurde gezeigt, dass APOBEC3G weitere antiretrovirale Eigenschaften besitzt, zum
Beispiel post-entry Hemmung von HIV-1 in ruhenden CD4 + T-Lymphozyten
Unterdrückung der Ansammlung reverser Transkripte
16
,
30,36,60
, Hemmung des DNA-
Strangtransfers während der reversen Transkription und Inhibition der Integration der
proviralen DNA
52,60
. Weiterhin wäre es möglich, dass eine Zellpopulation innerhalb
der PBMCs existiert, die durch Vif-defizientes HIV-1 infizierbar ist und virale
Replikation zuläßt jedoch keine APOBEC3 Proteine exprimiert.
Die Untersuchung der G-zu-A Mutationsbereiche im env-Abschnitt bezüglich des
Dinukleotidkontextes ergab, dass ~85% aller G-zu-A Mutationen im ersten Guanin
eines GG-Dinukleotids auftraten, obwohl GG-Dinukleotide nur 27,5% in den 466 bp
von env aller möglichen GN-Kombinationen betrug. GT und GC waren nur selten zu
AT beziehungsweise AC mutiert. Dies spricht sehr dafür, dass für den Großteil der Gzu-A Mutationen in dieser Sequenz APOBEC3G verantwortlich war, da CC im
Minusstrang, also GG im Plusstrang, die bevorzugte Zielsequenz von APOBEC3G ist
10,32,50,101
. GA-Dinukleotide waren seltener als GG-Dinukleotiden aber häufiger als
GT- und GC-Dinukleotide mutiert. TC im Minusstrang, entsprechend GA im
Plusstrang, ist die präferentielle APOBEC3F-Zielsequenz. Die Ergebnisse aus den
Analysen des env-Fragments aus H9 Zellen und PBMCs waren sehr ähnlich und es
gab auch keine Unterschiede in Abhängigkeit der RT-Variante. Die 523 bp des
nef+3`LTR-Bereichs wurden nur in HIV-1 DNA aus infizierten H9 Zellen untersucht.
Auch hier traten ~85% aller G-zu-A Mutationen im ersten Guanin des GGDinukleotids auf. Nur sehr wenige G-zu-A Mutationen befanden sich im GC- oder
GT-Zusammenhang, mehr im GA-Kontext, der für die Aktivität von APOBEC3F
57
Diskussion
spricht. Anders als im env-Fragment befinden sich zwei Drittel aller GuaninNukleotide im Kontext von GG und GA. Obwohl dieser Wert höher ist als im envFragment, sind trotzdem GG-Dinukleotidkontext unverhältnismäßig öfter G-zu-A
mutiert als alle anderen Nukleotide. Nicht nur das direkte 5`-Nachbarnukleotid im
Minusstrang-Genom scheint Einfluss auf die Deamination eines Cytosins zu nehmen,
sondern auch noch weitere benachbarte Nukleotide. So liegen sowohl in env als auch
in nef die Guaninmoleküle, die in >70% aller Klone zu Adenin mutiert waren, in vier
von fünf Fällen im TCC-Kontext. In der Plusstrang-DNA ist dies eine GGA-Sequenz.
Im Gegensatz dazu waren in den env-Sequenzen GG-Dinukleotide nie durch
APOBEC3G mutiert, wenn sie im GGC-Kontext auftraten. In nef waren GGC-Motive
in maximal 6,3% der Klone mutiert. Dieses Phänomen wurde bereits beobachtet
7,32,48,92
. Eventuell liegt das an Wechselwirkungen zwischen den Basen der DNA und
den APOBEC3-Proteinen, oder die einzelsträngige HIV-1 DNA bildet an diesen
Stellen leichter Sekundärstrukturen und wird unzugänglich für APOBEC3G/F.
Möglicherweise entstehen solche Sekundärstrukturen nicht zufällig, sondern an
Stellen des HIV-1 Genoms, die durch die Wirkung von APOBEC3 Proteinen leicht
zur Replikationsunfähigkeit des Virus führen. Dies würde vor allem durch
Mutagenese von Kodons, durch die nach Deamination ein Stopkodon entstünde, zu
replikationsinkompetenten HI-Viren führen, zum Beispiel TGG-zu-TAG.
HIV-1 DNA aus infizierten H9 Zellen wurde in den Bereichen env, nef und 3`LTR
auch hinsichtlich der Anzahl an G-zu-A Mutationen im Vergleich zueinander
analysiert. Es ist bekannt, dass sich in der HIV-1 DNA zwei Gradienten an G-zu-A
Mutationen befinden, abhängig von der Expositionsdauer gegenüber APOBEC3Proteinen während der reversen Transkription
7,32,48,90,105
. Für diese Untersuchung ist
der Abschnitt zwischen dem cPPT und dem PPT von Belang, da hierin die
analysierten Bereich liegen. Es wurde erwartet, die meisten G-zu-A Mutationen in nef
zu finden und eine niedrigere Anzahl in env. Da der 3`LTR-Bereich nur kurzfristig
einzelsträngig ist, wurde hier die geringste Anzahl an G-zu-A Mutationen erwartet,
verglichen mit den env- und nef-Bereichen. Da dieser Abschnitt in einem Stück mit
dem nef-Fragment kloniert und sequenziert wurde, konnte bei der Analyse des G-zuA Mutationsrate des nef und 3`LTRs der Übergang von hoher zu niedriger
Mutationsrate untersucht werden. Tatsächlich enthält der nef-Bereich dieses
Gesamtfragments mehr G-zu-A Mutationen als der 3`LTR-Abschnitt. Dieser
58
Diskussion
Unterschied ist hochsignifikant und auch im Vergleich mit env-Sequenzen enthält nef
signifikant mehr G-zu-A Austausche. Zudem trägt env signifikant mehr G-zu-A
Mutationen als der 3`LTR-Bereich. Allerdings ist der durchschnittliche Prozentsatz
der G-zu-A Mutationsrate im 3`LTR-Fragment höher als erwartet. Dies liegt daran,
dass für diese Analyse nur Klone einbezogen wurden, die wenigstens einen G-zu-A
Austausch hatten. ~43% aller nef-Klone wurden deswegen ausgeschlossen, alle
gefundenen G-zu-A Mutationen befanden sich demzufolge in den übrigen ~57% der
Sequenzen und führten zu der relativ hohen G-zu-A Mutationsrate.
Erstmals wurde hier gezeigt, dass die G-zu-A Mutationshäufigkeit, induziert durch
APOBEC3G/F, in HIV-1 DNA erhöht ist, wenn die RT-Prozessivität beeinträchtigt
ist. Zudem wurde erstmalig gezeigt, dass die Deaminaseaktivität von endogenem
APOBEC3G/F aus PBMCs erheblich geringer ist verglichen mit jenen Enzymen aus
H9 Zellen. Dies deutet, zusammen mit der hohen Anzahl nicht-G-zu-A mutierter
Sequenzen, auf weitere Deaminase-unabhängige antiretrovirale Mechanismen der
APOBEC3 Proteine hin. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass Vif noch weitere
antiretrovirale, zelluläre Faktoren inhibiert, die bislang jedoch unentdeckt sind.
59
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Die genomische Diversität von HIV-1 und die Fähigkeit des Virus, sich schnell durch
Mutagenese seines Genoms an verändernde Bedingungen anzupassen, sind
Hauptursachen dafür, dass es bis heute weder einen wirksamen Impfstoff noch eine
Virus-eradizierende Therapie gibt. Die Aufklärung der Mechanismen und der viralen
und zellulären Faktoren, die diese Heterogenität beeinflussen, ist wichtig für das
Verständnis der Pathogenese von HIV-1 und der Entwicklung neuer antiretroviraler
Strategien. Die virale RT und die zelluläre Proteinfamilie APOBEC3, insbesondere
APOBEC3G, tragen beide nach neuen Erkenntnissen maßgeblich zu dieser
Wandlungsfähigkeit des Virus bei. Das Ziel war es daher, eine mögliche Interaktion
dieser beiden wichtigen Faktoren zu ermitteln. Dazu wurde der Einfluss der
Prozessivität der viralen RT auf die durch APOBEC3 induzierte Mutationsrate
untersucht. Hierfür wurden H9 Zellen (T-Zelllinie) und periphere mononukleäre
Zellen des Blutes (PBMCs) verschiedener Spender mit HI-Viren infiziert, die das
virale Protein Vif nicht exprimieren können. Dadurch ist gewährleistet, das
APOBEC3 Proteine in das Viruspartikel eingebaut werden. In der nächsten
Infektionsrunde deaminiert dieses Protein Cytidine in der viralen cDNA und führt
dadurch zur G-zu-A Hypermutation im viralen Plusstrang. Die verwendeten HI-Viren
unterschieden sich in ihren RTs, die unterschiedliche Prozessivitäten aufwiesen. Es
konnte gezeigt werden, dass die Prozessivität der RT signifikant invers korreliert zur
G-zu-A Mutationsrate in der T-Zelllinie H9 sowie in primären Zellen. Dies bedeutet,
dass es sich bei der APOBEC3-induzierten Deamination viraler DNA um einen Zeitabhängigen Prozess handelt, der durch die virale RT beeinflusst werden kann.
Desweiteren haben die Analysen von insgesamt etwa 450 env-Klonen ergeben, dass
die G-zu-A Mutationsrate viraler DNA aus infizierten PBMCs signifikant niedriger ist
als die aus H9 Zellen. Dies war ein unerwartetes Ergebnis, da die reverse
Transkription in PBMCs langsamer verläuft als in T-Zelllinien, was theoretisch zu
einer höheren Mutationsrate führen sollte. Außerdem wies die virale DNA in
durchschnittlich 38% aller aus PBMCs stammenden Klone keine G-zu-A Mutationen
auf. Trotzdem waren diese Viren Replikations-inkompetent, was bedeutet, dass
APOBEC3
Proteine
noch
weitere
Deaminations-unabhängige
antiretrovirale
Aktivitäten besitzen oder dass Vif noch weitere bislang unbekannte antiretrovirale
Faktoren inhibiert.
60
Zusammenfassung
Summary
The genomic diversity of HIV-1 and the virus`s ability to adjust to new conditions by
mutagenesis are main obstacles for effective vaccines and virus eradication. It is
important to clarify the mechanisms as well as the viral and cellular factors
influencing this heterogeneity to understand the pathogenesis of HIV-1 and to push
the development of new antiretroviral strategies forward. According to the latest state
of knowledge, both, the viral RT and the cellular protein family APOBEC3, especially
APOBEC3G, account to the diversity of this virus. Therefore, the aim was to
investigate a possible interaction of both factors. Thus, the impact of the processivity
of HIV-1 RT on the APOBEC3 induced mutagenesis rate was examined. H9 cells (Tcell line) and PBMCs of different donors were infected with Vif-deficient HIV-1. So
it was guaranteed that APOBEC3 proteins were incorporated into the newly produced
viral particles. In the next round of infection, these proteins deaminate cytidine into
urcacil within the viral cDNA and lead consequently to G-to-A hypermutation in the
viral plus strand. The viruses differed in their RT variants, and thus, exhibited
different RT processivities. It was shown, that the processivities of RTs correlate
significantly and inversely to the G-to-A mutation rate in H9 cells as well as in
PBMCs. Thus, the APOBEC3 induced deamination of viral DNA is a time-dependend
process that can be influenced by the HIV-1 RT. Furthermore, the analyses of ~450
env clones showed that the G-to-A mutation level of viral DNA derived from infected
PBMCs was significantly lower than that derived from H9 cells. This was not
expected as the reverse transcription is slower in PBMCs compared to cell lines.
Theoretically, this should result in a higher mutation rate. Moreover, on average 38%
of the viral DNAs derived from PBMCs did not contain any G-to-A mutations.
Nevertheless, these viruses were replication incompetent, indicating that APOBEC3
proteins possess further deamination independend antiretroviral activities; or that Vif
inhibits so far unknown antiretroviral factors.
61
Literaturverzeichnis
7
Literaturverzeichnis
1. Adachi, A., H. E. Gendelman, S. Koenig, T. Folks, R. Willey, A. Rabson, and M. A.
Martin. 1986. Production of acquired immunodeficiency syndrome -associated retrovirus in
human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J Virol 59:284291.
2. Alce, T. M. and W. Popik. 2004. APOBEC3G is incorporated into virus-like particles by a
direct interaction with HIV-1 Gag nucleocapsid protein. J Biol. Chem. 279:34083-34086.
3. Back, N. K. and B. Berkhout. 1997. Limiting deoxynucleoside triphosphate concentrations
emphasize the processivity defect of lamivudine-resistant variants of human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Antimicrob. Agents Chemother.
41:2484-2491.
4. Back, N. K., M. Nijhuis, W. Keulen, C. A. Boucher, B. O. Oude Essink, A. B. van
Kuilenburg, A. H. van Gennip, and B. Berkhout. 1996. Reduced replication of 3TCresistant HIV-1 variants in primary cells due to a processivity defect of the reverse
transcriptase enzyme. EMBO J 15:4040-4049.
5. Bambara, R. A., D. Uyemura, and T. Choi. 1978. On the processive mechanism of
Escherichia coli DNA polymerase I. Quantitative assessment of processivity. J Biol Chem
253:413-423.
6. Barre-Sinoussi, F., J. C. Chermann, F. Rey, M. T. Nugeyre, S. Chamaret, J. Gruest, C.
Dauguet, C. Axler-Blin, F. Vezinet-Brun, C. Rouzioux, W. Rozenbaum, and L.
Montagnier. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired
immune deficiency syndrome (AIDS). Science 220:868-871.
7. Beale, R. C., S. K. Petersen-Mahrt, I. N. Watt, R. S. Harris, C. Rada, and M. S.
Neuberger. 2004. Comparison of the differential context-dependence of DNA deamination by
APOBEC enzymes: correlation with mutation spectra in vivo. J Mol Biol 337:585-596.
8. Berkhout, B. and A. de Ronde. 2004. APOBEC3G versus reverse transcriptase in the
generation of HIV-1 drug-resistance mutations. AIDS 18:1861-1863.
9. Bishop, K. N., R. K. Holmes, and M. H. Malim. 2006. Antiviral Potency of APOBEC
Proteins Does Not Correlate with Cytidine Deamination. J Virol 80:8450-8458.
10. Bishop, K. N., R. K. Holmes, A. M. Sheehy, N. O. Davidson, S. J. Cho, and M. H. Malim.
2004. Cytidine deamination of retroviral DNA by diverse APOBEC proteins. Curr Biol
14:1392-1396.
11. Boyer, P. L. and S. H. Hughes. 1995. Analysis of mutations at position 184 in reverse
transcriptase of human immunodeficiency virus type 1. Antimicrob. Agents Chemother.
39:1624-1628.
12. Boyer, P. L., S. G. Sarafianos, E. Arnold, and S. H. Hughes. 2002. Nucleoside analog
resistance caused by insertions in the fingers of human immunodeficiency virus type 1 reverse
transcriptase involves ATP -mediated excision. J Virol 76:9143-9151.
13. Cases-Gonzalez, C. E., M. Gutierrez-Rivas, and L. Menendez-Arias. 2000. Coupling
ribose selection to fidelity of DNA synthesis. The role of Tyr-115 of human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Biol Chem. 275:19759-19767.
62
Literaturverzeichnis
14. Cen, S., F. Guo, M. Niu, J. Saadatmand, J. Deflassieux, and L. Kleiman. 2004. The
interaction between HIV-1 Gag and APOBEC3G. J Biol. Chem. 279:33177-33184.
15. Chelico, L., P. Pham, P. Calabrese, and M. F. Goodman. 2006. APOBEC3G DNA
deaminase acts processively 3' --> 5' on single-stranded DNA. Nat Struct Mol Biol 13:392399.
16. Chiu, Y. L., V. B. Soros, J. F. Kreisberg, K. Stopak, W. Yonemoto, and W. C. Greene .
2005. Cellular APOBEC3G restricts HIV-1 infection in resting CD4(+) T cells. Nature.
17. Clavel, F., D. Guetard, F. Brun-Vezinet, S. Chamaret, M. A. Rey, M. O. Santos-Ferreira,
A. G. Laurent, C. Dauguet, C. Katlama, C. Rouzioux, and . 1986. Isolation of a new
human retrovirus from West African patients with AIDS. Science 233:343-346.
18. Coffin J., Hughes S.H., and Varmus H.E. 1999. Retroviruses.
19. Cristofaro, J. V., J. W. Rausch, S. F. Le Grice, and J. J. DeStefano. 2002. Mutations in the
ribonuclease H active site of HIV-RT reveal a role for this site in stabilizing enzyme-primertemplate binding. Biochemistry 41:10968-10975.
20. Dang, Y., X. Wang, W. J. Esselman, and Y. H. Zheng. 2006. Identification of
APOBEC3DE as another antiretroviral factor from the human APOBEC family. J Virol
80:10522-10533.
21. Deval, J., J. M. Navarro, B. Selmi, J. Courcambeck, J. Boretto, P. Halfon, S. Garrido Urbani, J. Sire, and B. Canard. 2004. A loss of viral replicative capacity correlates with
altered DNA polymerization kinetics by the human immunodeficiency virus reverse
transcriptase bearing the K65R and L74V dideoxynucleoside resistance substitutions. J Biol
Chem 279:25489-25496.
22. Diallo, K., M. Gotte, and M. A. Wainberg. 2003. Molecular impact of the M184V mutation
in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Antimicrob. Agents
Chemother. 47:3377-3383.
23. Doehle, B. P., A. Schafer, H. L. Wiegand, H. P. Bogerd, and B. R. Cullen. 2005.
Differential sensitivity of murine leukemia virus to APOBEC3-mediated inhibition is
governed by virion exclus ion. J Virol 79:8201-8207.
24. Dubridge, R. B., P. Tang, H. C. Hsia, P. M. Leong, J. H. Miller, and M. P. Calos. 1987.
Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell
Biol. 7:379-387.
25. Flint J.S. 2000. Principle of Virology.
26. Gabuzda, D. H., K. Lawrence, E. Langhoff, E. Terwilliger, T. Dorfman, W. A. Haseltine,
and J. Sodroski . 1992. Role of vif in replication of human immunodeficiency virus type 1 in
CD4+ T lymphocytes. J Virol 66:6489-6495.
27. Gandhi, S. K., J. D. Siliciano, J. R. Bailey, R. F. Siliciano, and J. N. Blankson. 2008. Role
of APOBEC3G/F-mediated hypermutation in the control of human immunodeficiency virus
type 1 in elite suppressors. J Virol 82:3125-3130.
28. Gao, H. Q., P. L. Boyer, E. Arnold, and S. H. Hughes. 1998. Effects of mutations in the
polymerase domain on the polymerase, RNase H and strand transfer activities of human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Mol Biol 277:559-572.
29. Gao, L., M. N. Hanson, M. Balakrishnan, P. L. Boyer, B. P. Roques, S. H. Hughes, B.
Kim, and R. A. Bambara. 2008. Apparent Defects in Processive DNA Synthesis, Strand
Transfer, and Primer Elongation of Met-184 Mutants of HIV-1 Reverse Transcriptase Derive
Solely from a dNTP Utilization Defect. J Biol Chem 283:9196-9205.
63
Literaturverzeichnis
30. Guo, F., S. Cen, M. Niu, J. Saadatmand, and L. Kleiman. 2006. Inhibition of formulaprimed reverse transcription by human APOBEC3G during human immunodeficiency virus
type 1 replication. J Virol 80:11710-11722.
31. Hache, G., M. T. Liddament, and R. S. Harris. 2005. The retroviral hypermutation
specificity of APOBEC3F and APOBEC3G is governed by the C-terminal DNA cytosine
deaminase domain. J Biol Chem 280:10920-10924.
32. Harris, R. S., K. N. Bishop, A. M. Sheehy, H. M. Craig, S. K. Petersen-Mahrt, I. N. Watt,
M. S. Neuberger, and M. H. Malim. 2003. DNA deamination mediates innate immunity to
retroviral infection. Cell 113:803-809.
33. Harris, R. S., K. N. Bishop, A. M. Sheehy, H. M. Craig, S. K. Petersen-Mahrt, I. N. Watt,
M. S. Neuberger, and M. H. Malim. 2003. DNA deamination mediates innate immunity to
retroviral infection. Cell 113:803-809.
34. Harris, R. S. and M. T. Liddament. 2004. Retroviral restriction by APOBEC proteins. Nat
Rev Immunol 4:868-877.
35. Ho, D. D., A. U. Neumann, A. S. Perelson, W. Chen, J. M. Leonard, and M. Markowitz.
1995. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature
373:123-126.
36. Holmes, R. K., M. H. Malim, and K. N. Bishop. 2007. APOBEC-mediated viral restriction:
not simply editing? Trends Biochem Sci 32:118-128.
37. Iwatani, Y., H. Takeuchi, K. Strebel, and J. G. Levin. 2006. Biochemical activities of
highly purified, catalytically active human APOBEC3G: correlation with antiviral effect. J
Virol 80:5992-6002.
38. Janini, M., M. Rogers, D. R. Birx, and F. E. McCutchan. 2001. Human immunodeficiency
virus type 1 DNA sequences genetically damaged by hypermutation are often abundant in
patient peripheral blood mononuclear cells and may be generated during near-simultaneous
infection and activation of CD4(+) T cells. J Virol 75:7973-7986.
39. Jin, X., A. Brooks, H. Chen, R. Bennett, R. Reichman, and H. Smith. 2005.
APOBEC3G/CEM15 (hA3G) mRNA Levels Associate Inversely with Human
Immunodeficiency Virus Viremia. J Virol 79:11513-11516.
40. Jonckheere, H., M. Witvrouw, E. De Clercq, and J. Anne. 1998. Lamivudine resistance of
HIV type 1 does not delay development of resistance to nonnucleoside HIV type 1-specific
reverse transcriptase inhibitors as compared with wild-type HIV type 1. AIDS Res Hum
Retroviruses 14:249-253.
41. Kabat, D., S. L. Kozak, K. Wehrly, and B. Chesebro. 1994. Differences in CD4
dependence for infectivity of laboratory-adapted and primary patient isolates of human
immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68:2570-2577.
42. Karczewski, M. K. and K. Strebel. 1996. Cytoskeleton association and virion incorporation
of the human immunodeficiency virus type 1 Vif protein. J Virol 70:494-507.
43. Keulen, W., A. van Wijk, R. Schuurman, B. Berkhout, and C. A. Boucher. 1999.
Increased polymerase fidelity of lamivudine-resistant HIV-1 variants does not limit their
evolutionary potential. AIDS 13:1343-1349.
44. Khan, M. A., S. Kao, E. Miyagi, H. Takeuchi, R. Goila-Gaur, S. Opi, C. L. Gipson, T. G.
Parslow, H. Ly, and K. Strebel . 2005. Viral RNA Is Required for the Association of
APOBEC3G with Human Immunodeficiency Virus Type 1 Nucleoprotein Complexes. J Virol
79:5870-5874.
64
Literaturverzeichnis
45. Kieffer, T. L., P. Kwon, R. E. Nettles, Y. Han, S. C. Ray, and R. F. Siliciano. 2005. G-->A
hypermutation in protease and reverse transcriptase regions of human immunodeficiency virus
type 1 residing in resting CD4+ T cells in vivo. J Virol. 79:1975-1980.
46. Kim, B., J. C. Ayran, S. G. Sagar, E. T. Adman, S. M. Fuller, N. H. Tran, and J.
Horrigan. 1999. New human immunodeficiency virus, type 1 reverse transcriptase (HIV-1
RT) mutants with increased fidelity of DNA synthesis. Accuracy, template binding, and
processivity. J Biol Chem 274:27666-27673.
47. Korber, B., B. Gaschen, K. Yusim, R. Thakallapally, C. Kesmir, and V. Detours. 2001.
Evolutionary and immunological implications of contemporary HIV-1 variation. Br. Med
Bull. 58:19-42.
48. Langlois, M. A., R. C. Beale, S. G. Conticello, and M. S. Neuberger. 2005. Mutational
comparison of the single-domained APOBEC3C and double-domained APOBEC3F/G antiretroviral cytidine deaminases provides insight into their DNA target site specificities. Nucleic
Acids Res 33:1913-1923.
49. Lecossier, D., F. Bouchonnet, F. Clavel, and A. J. Hance. 2003. Hypermutation of HIV-1
DNA in the absence of the Vif protein. Science 300:1112.
50. Liddament, M. T., W. L. Brown, A. J. Schumacher, and R. S. Harris. 2004. APOBEC3F
properties and hypermutation preferences indicate activity against HIV-1 in vivo. Curr Biol
14:1385-1391.
51. Luo, K., B. Liu, Z. Xiao, Y. Yu, X. Yu, R. Gorelick, and X. F. Yu. 2004. Amino-terminal
region of the human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid is required for human
APOBEC3G packaging. J Virol 78:11841-11852.
52. Luo, K., T. Wang, B. Liu, C. Tian, Z. Xiao, J. Kappes, and X. F. Yu. 2007. Cytidine
deaminases APOBEC3G and APOBEC3F interact with human immunodeficiency virus type 1
integrase and inhibit proviral DNA formation. J Virol 81:7238-7248.
53. Madani, N. and D. Kabat. 1998. An endogenous inhibitor of human immunodeficiency virus
in human lymphocytes is overcome by the viral Vif protein. J Virol 72:10251-10255.
54. Mangeat, B., P. Turelli, G. Caron, M. Friedli, L. Perrin, and D. Trono. 2003. Broad
antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse
transcripts. Nature 424:99-103.
55. Mann, D. L., S. J. O'Brien, D. A. Gilbert, Y. Reid, M. Popovic, E. Read-Connole, R. C.
Gallo, and A. F. Gazdar. 1989. Origin of the HIV-susceptible human CD4+ cell line H9.
AIDS Res. Hum. Retroviruses 5:253-255.
56. Mansky, L. M., E. Le Rouzic, S. Benichou, and L. C. Gajary. 2003. Influence of reverse
transcriptase variants, drugs, and Vpr on human immunodeficiency virus type 1 mutant
frequencies. J Virol 77:2071-2080.
57. Marcelin, A. G., B. Jarrousse, A. Derache, M. Ba, M. L. Dakouo, A. Doumbia, I.
Haidara, A. Maiga, G. Carcelain, G. Peytavin, C. Katlama, and V. Calvez. 2007. HIV
drug resistance after the use of generic fixed-dose combination
stavudine/lamivudine/nevirapine as standard first-line regimen. AIDS 21:2341-2343.
58. Mariani, R., D. Chen, B. Schrofelbauer, F. Navarro, R. Konig, B. Bollman, C. Munk, H.
Nymark-McMahon, and N. R. Landau. 2003. Species-specific exclusion of APOBEC3G
from HIV-1 virions by Vif. Cell 114:21-31.
59. Martin-Hernandez, A. M., E. Domingo, and L. Menendez-Arias. 1996. Human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase: role of Tyr115 in deoxynucleotide
binding and misinsertion fidelity of DNA synthesis. EMBO J 15:4434-4442.
65
Literaturverzeichnis
60. Mbisa, J. L., R. Barr, J. A. Thomas, N. Vandegraaff, I. J. Dorweiler, E. S. Svarovskaia,
W. L. Brown, L. M. Mansky, R. J. Gorelick, R. S. Harris, A. Engelman, and V. K.
Pathak. 2007. Human immunodeficiency virus type 1 cDNAs produced in the presence of
APOBEC3G exhibit defects in plus-strand DNA transfer and integration. J Virol 81:70997110.
61. Metzner, K. J., S. Bonhoeffer, M. Fischer, R. Karanicolas, K. Allers, B. Joos, R. Weber,
B. Hirschel, L. G. Kostrikis, and H. F. Gunthard. 2003. Emergence of minor populations of
human immunodeficiency virus type 1 carrying the M184V and L90M mutations in subjects
undergoing structured treatment interruptions. J Infect Dis 188:1433-1443.
62. Miller, M. D., N. Margot, B. Lu, L. Zhong, S. S. Chen, A. Cheng, and M. Wulfsohn.
2004. Genotypic and phenotypic predictors of the magnitude of response to tenofovir
disoproxil fumarate treatment in antiretroviral-experienced patients. J Infect Dis 189:837-846.
63. Miyoshi, I., I. Kubonishi, S. Yoshimoto, T. Akagi, Y. Ohtsuki, Y. Shiraishi, K. Nagata,
and Y. Hinuma. 1981. Type C virus particles in a cord T-cell line derived by co-cultivating
normal human cord leukocytes and human leukaemic T cells. Nature 294:770-771.
64. Moore, J. P., J. A. McKeating, R. A. Weiss, and Q. J. Sattentau. 1990. Dissociation of
gp120 from HIV-1 virions induced by soluble CD4. Science 250:1139-1142.
65. Mullis, K. B. 1990. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.
Ann Biol Clin (Paris) 48:579-582.
66. Navarro, F., B. Bollman, H. Chen, R. Konig, Q. Yu, K. Chiles, and N. R. Landau. 2005.
Complementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G. Virology 333:374-386.
67. Newman, E. N., R. K. Holmes, H. M. Craig, K. C. Klein, J. R. Lingappa, M. H. Malim,
and A. M. Sheehy. 2005. Antiviral function of APOBEC3G can be dissociated from cytidine
deaminase activity. Curr Biol 15:166-170.
68. Nikolenko, G. N., S. Palmer, F. Maldarelli, J. W. Mellors, J. M. Coffin, and V. K.
Pathak. 2005. Mechanism for nucleoside analog-mediated abrogation of HIV-1 replication:
balance between RNase H activity and nucleotide excision. Proc Natl Acad Sci U S A
102:2093-2098.
69. O'Doherty, U., W. J. Swiggard, and M. H. Malim. 2000. Human immunodeficiency virus
type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol 74:10074-10080.
70. Olivares, I., V. Sanchez-Merino, M. A. Martinez, E. Domingo, C. Lopez-Galindez, and L.
Menendez-Arias. 1999. Second-site reversion of a human immunodeficiency virus type 1
reverse transcriptase mutant that restores enzyme function and replication capacity. J Virol
73:6293-6298.
71. Oude Essink, B. B., N. K. Back, and B. Berkhout. 1997. Increased polymerase fidelity of
the 3TC-resistant variants of HIV-1 reverse transcriptase. Nucleic Acids Res 25:3212-3217.
72. Perelson, A. S., A. U. Neumann, M. Markowitz, J. M. Leonard, and D. D. Ho. 1996. HIV1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.
Science 271:1582-1586.
73. Pluthero, F. G. 1993. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic
Acids Res 21:4850-4851.
74. Popovic, M., E. Read-Connole, and R. C. Gallo. 1984. T4 positive human neoplastic cell
lines susceptible to and permissive for HTLV-III. Lancet 2:1472-1473.
66
Literaturverzeichnis
75. Raba, M., K. Limburg, M. Burghagen, J. R. Katze, M. Simsek, J. E. Heckman, U. L.
Rajbhandary, and H. J. Gross. 1979. Nucleotide sequence of three isoaccepting lysine
tRNAs from rabbit liver and SV40-transformed mouse fibroblasts. Eur J Biochem 97:305-318.
76. Rezende, L. F., W. C. Drosopoulos, and V. R. Prasad. 1998. The influence of 3TC
resistance mutation M184I on the fidelity and error specificity of human immunodeficiency
virus type 1 reverse transcriptase. Nucleic Acids Res. 26:3066-3072.
77. RKI. 2008. Infektionsepidemiologisches Jahrbuch des RKI 2007.
78. Roquebert, B. and A. G. Marcelin. 2008. The involvement of HIV-1 RNAse H in resistance
to nucleoside analogues. J Antimicrob. Chemother. 61:973-975.
79. Rose, P. P. and B. T. Korber. 2000. Detecting hypermutations in viral sequences with an
emphasis on G --> A hypermutation. Bioinformatics 16:400-401.
80. Sambrook J., K. Fukunaga, and Mariatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual.
81. Schafer, A., H. P. Bogerd, and B. R. Cullen. 2004. Specific packaging of APOBEC3G into
HIV-1 virions is mediated by the nucleocapsid domain of the gag polyprotein precursor.
Virology 328:163-168.
82. SCHERER, W. F., J. T. SYVERTON, and G. O. GEY. 1953. Studies on the propagation in
vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant
epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. J. Exp.
Med. 97:695-710.
83. Schrofelbauer, B., Q. Yu, S. G. Zeitlin, and N. R. Landau. 2005. Human
immunodeficiency virus type 1 Vpr induces the degradation of the UNG and SMUG uracilDNA glycosylases. J Virol 79:10978-10987.
84. Sharma, P. L. and C. S. Crumpacker. 1999. Decreased processivity of human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase (RT) containing didanosine-selected
mutation Leu74Val: a comparative analysis of RT variants Leu74Val and lamivudine-selected
Met184Val. J Virol 73:8448-8456.
85. Sheehy, A. M., N. C. Gaddis, J. D. Choi, and M. H. Malim. 2002. Isolation of a human
gene that inhibits HIV-1 infection and is suppressed by the viral Vif protein. Nature 418:646650.
86. Sheehy, A. M., N. C. Gaddis, and M. H. Malim. 2003. The antiretroviral enzyme
APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV-1 Vif. Nat Med 9:1404-1407.
87. Simon, V. and D. D. Ho. 2003. HIV-1 dynamics in vivo: implications for therapy. Nat Rev
Microbiol 1:181-190.
88. Stopak, K., C. de Noronha, W. Yonemoto, and W. C. Greene. 2003. HIV-1 Vif blocks the
antiviral activity of APOBEC3G by impairing both its translation and intracellular stability.
Mol Cell 12:591-601.
89. Sungkanuparph, S., W. Manosuthi, S. Kiertiburanakul, N. Saekang, W. Pairoj, and W.
Chantratita. 2008. Prevalence and risk factors for developing K65R mutations among HIV-1
infected patients who fail an initial regimen of fixed-dose combination of stavudine,
lamivudine, and nevirapine. J Clin Virol 41:310-313.
90. Suspene, R., C. Rusniok, J. P. Vartanian, and S. Wain-Hobson. 2006. Twin gradients in
APOBEC3 edited HIV-1 DNA reflect the dynamics of lentiviral replication. Nucleic Acids
Res 34:4677-4684.
67
Literaturverzeichnis
91. Suspene, R., P. Sommer, M. Henry, S. Ferris, D. Guetard, S. Pochet, A. Chester, N.
Navaratnam, S. Wain-Hobson, and J. P. Vartanian. 2004. APOBEC3G is a single-stranded
DNA cytidine deaminase and functions independently of HIV reverse transcriptase. Nucleic
Acids Res 32:2421-2429.
92. Svarovskaia, E. S., H. Xu, J. L. Mbisa, R. Barr, R. J. Gorelick, A. Ono, E. O. Freed, W.
S. Hu, and V. K. Pathak. 2004. Human apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic
polypeptide-like 3G (APOBEC3G) is incorporated into HIV-1 virions through interactions
with viral and nonviral RNAs. J Biol Chem 279:35822-35828.
93. Svedhem, V., T. Bergroth, K. Lidman, and A. Sonnerborg. 2007. Presence of M184I/V in
minor HIV-1 populations of patients with lamivudine and/or didanosine treatment failure. HIV
Med 8:504-510.
94. Thielen, B. K., K. C. Klein, L. W. Walker, M. Rieck, J. H. Buckner, G. W. Tomblingson,
and J. R. Lingappa. 2007. T cells contain an RNase-insensitive inhibitor of APOBEC3G
deaminase activity. PLoS Pathog. 3:1320-1334.
95. UNAIDS. 2007. AIDS epidemic update: December 2007.
96. Vartanian, J. P., A. Meyerhans, M. Sala, and S. Wain-Hobson. 1994. G-->A
hypermutation of the human immunodeficiency virus type 1 genome: evidence for dCTP pool
imbalance during reverse transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 91:3092-3096.
97. Wainberg, M. A. 2004. The impact of the M184V substitution on drug resistance and viral
fitness. Expert Rev Anti Infect Ther 2:147-151.
98. Wei, X., S. K. Ghosh, M. E. Taylor, V. A. Johnson, E. A. Emini, P. Deutsch, J. D. Lifson,
S. Bonhoeffer, M. A. Nowak, B. H. Hahn, and . 1995. Viral dynamics in human
immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 373:117-122.
99. Weiss, K. K., R. Chen, M. Skasko, H. M. Reynolds, K. Lee, R. A. Bambara, L. M.
Mansky, and B. Kim. 2004. A role for dNTP binding of human immunodeficiency virus type
1 reverse transcriptase in viral mutagenesis. Biochemistry 43:4490-4500.
100. White, K. L., N. A. Margot, T. Wrin, C. J. Petropoulos, M. D. Miller, and L. K. Naeger.
2002. Molecular mechanisms of resistance to human immunodeficiency virus type 1 with
reverse transcriptase mutations K65R and K65R+M184V and their effects on enzyme function
and viral replication capacity. Antimicrob. Agents Chemother. 46:3437-3446.
101. Wiegand, H. L., B. P. Doehle, H. P. Bogerd, and B. R. Cullen. 2004. A second human
antiretroviral factor, APOBEC3F, is suppressed by the HIV-1 and HIV-2 Vif proteins. EMBO
J 23:2451-2458.
102. Xu, H., E. Chertova, J. Chen, D. E. Ott, J. D. Roser, W. S. Hu, and V. K. Pathak. 2007.
Stoichiometry of the antiviral protein APOBEC3G in HIV-1 virions. Virology 360:247-256.
103. Yang, B., K. Chen, C. Zhang, S. Huang, and H. Zhang. 2007. Virion-associated Uracil
DNA glycosylase-2 and Apurinic/apyrimidinic endonuclease are involved in the degradation
of APOBEC3G-edited nascent HIV-1 DNA. J Biol Chem.
104. Yu, Q., D. Chen, R. Konig, R. Mariani, D. Unutmaz, and N. R. Landau. 2004.
APOBEC3B and APOBEC3C are potent inhibitors of simian immunodeficiency virus
replication. J Biol Chem 279:53379-53386.
105. Yu, Q., R. Konig, S. Pillai, K. Chiles, M. Kearney, S. Palmer, D. Richman, J. M. Coffin,
and N. R. Landau. 2004. Single-strand specificity of APOBEC3G accounts for minus-strand
deamination of the HIV genome. Nat Struct Mol Biol 11:435-442.
68
Literaturverzeichnis
106. Zennou, V., D. Perez-Caballero, H. Gottlinger, and P. D. Bieniasz. 2004. APOBEC3G
incorporation into human immunodeficiency virus type 1 particles. J Virol 78:12058-12061.
107. Zhang, H., B. Yang, R. J. Pomerantz, C. Zhang, S. C. Arunachalam, and L. Gao. 2003.
The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-1 DNA.
Nature 424:94-98.
108. Zheng, Y. H., D. Irwin, T. Kurosu, K. Tokunaga, T. Sata, and B. M. Peterlin. 2004.
Human APOBEC3F is another host factor that blocks human immunodeficiency virus type 1
replication. J Virol 78:6073-6076.
69
Abkürzungsverzeichnis
8
Abkürzungsverzeichnis
A
Adenin oder Alanin
AIDS
Erworbenes Immunschwächesyndrom (acquired immunodeficiency syndrom)
APOBEC
Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic peptide
ART
Antiretrovirale Therapie
Bp
Basenpaar(e)
C
Cytosin
CD
Cluster of differentiation
cPPT
Zentraler Polypurin Trakt (central polypurine tract)
D
Asparaginsäure
DNA
Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
dNTPs
Desoxynukleotid-Triphosphat
E.
Escherichia
ELISA
Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay
Env
envelope
G
Guanin
HIV-1
Humanes Immundefizienzvirus Typ I
HTLV-1
Humanes T-Zellleukämie Virus Typ I
I
Isoleucin
IL-2
Interleukin 2
Int
Integrase
K
Lysin
Kb
Kilobasenpaar(e)
LTR
Long terminal repeat
M
Methionin
MOI
multiplicity of infection
M-MLV
Moloney murine leucemia virus
mRNA
messenger RNA
N
Asparagin
Nef
negative factor
NNRTI
Nicht-Nukleosid-analoger Reverse Transkriptase Inhibitor
70
Abkürzungsverzeichnis
NRTI
Nukleosid-/Nukleotid-analoger Reverse Transkriptase Inhibitor
OD
Optische Dichte
PBMCs
peripheral blood mononuclear cells
PBS
primer binding site
PCR
Polymerase Kettenreakion (polymerase chain reaction)
pH
Negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration (potentia
hydrogenii)
PHA
Phytohämagglutinin
Pol
Polymerase
PPT
Polypurin Trakt
Q
Glutamin
R
Arginin
Rc
reverse complementary
RNA
Ribonukleinsäure ( rinonucleic acid)
RNase H
Rinonuklease H
RT
Reverse Transkriptase
SDM
site directed mutagenesis
T
Thymin
TCID
tissue culture infectious dose
Tm
Schmelztemperatur
U
Einheit(en) (units) oder Umdrehungen
V
Valin
v/v
Volumen pro Volumen (volume per volume )
Vif
viral infectivity factor
w/v
Gewicht pro Volumen (weight per volume)
w/W
Gewicht pro Gewicht (weight per weight)
WT
Wildtyp
Y
Tyrosin
71
Danksagung
9
Danksagung
Herrn Professor Dr. Bernhard Fleckenstein danke ich für die Möglichkeit diese Promotionsarbeit am
Institut für Klinische und Molekulare Virologie in Erlangen durchführen zu können.
Ganz herzlich möchte ich mich bei Privatdozentin Dr. Karin Metzner bedanken für dieses spannende
Projekt und die hervorragenden Betreuung, die ich in den letzten Jahren genießen durfte. Dazu gehören
die vielen konstruktiven Diskussionen und kompetenten Hilfestellungen für meine Projekte und stets
ein offenes Ohr mir gegenüber.
Privatdozent Dr. Robert Slany möchte ich für die Betreuung meiner Doktorarbeit von Seiten der
Naturwissenschaftlichen Fakultät danken.
Privatdozentin Dr. Brigitte Biesinger als Koordinatorin des Graduiertenkollegs 1071 hat durch ihr
Organisationstalent die vielen Aktionen reibungslos über die Bühne gehen lassen.
Professor Dr. Michael Mach sage ich meinen Dank für die vielen konstruktiven Mentorengespräche
im Rahmen des Graduiertenkollegs.
Ganz herzlich möchte ich mich auch bei den Laborkollegen bedanken, die mich während meiner
Doktorandenzeit begleitet haben: Peter Hülsmann, Kristina „Tina“ Allers, Nadine Salisch, Regina
Widner, Jasmin Popp und Andi Hofmann. Diese kompetenten und gleichzeitig spaßigen
Zeitgenossen haben mir sehr oft den Laboralltag versüßt.
Pia Rauch, die gute Seele im Labor, hat mir immer weitergeholfen, alle meine Frage geduldig und mit
großer Fachkenntnis beantwortet. Zusammen mit Ralf Spinner hat sie zudem auch für meine
kulinarische Weiterbildung gesorgt und mir in schwierigen Zeiten geholfen.
Rat und motivierende Gespräche habe ich auch außerhalb unserer Arbeitsgruppe erhalten. Besonders
Sabine „Bine“ Wittmann gilt ein großes Dankeschön! Auch nicht fehlen dürfen hier Norbert
Donhauser, Christiane Paatz, Sabrina Haupt, Philipp Schuster, Kathrin Pritschet, Moritz Ries,
Karin Tennert, Eva Gollwitzer, Wolfgang Ruhland, Tim Engel und Christiane Burkhardt.
Dr. Hauke Walter danke ich für die vielen Mono- und Dialoge während der Zeit hier am Institut.
Seine große Sachkenntnis hat mir immer wi eder weitergeholfen und die vielen Stückchen Schokolade,
die er großzügig mit mir geteilt hat, haben mir stets neue Kraft gegeben.
Von Petra und Klaus Göltenboth habe ich nicht nur in kulinarischer Hinsicht profitiert, sondern vor
allem durch die vielen hilfreichen Ratschlägen und Diskussionen, um fachfremde Probleme zu
bewältigen. Bei meiner Schwester Susanne Knöpfel bedanke ich mich für die kritischen Diskussionen
und liebevolle Unterstützung. Mein Dank gebührt auch meine Großeltern Horst† und Traudel
Knöpfel, die immer hinter mir stehen, und meinem Vater Dietrich Knöpfel.
72
Erklärung
10 Erklärung
Ich versichere hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation
selbstständig angefertigt und ohne fremde Hilfe verfaßt habe, keine außer den von mir
angegebenen Hilfsmitteln und Quellen dazu verwendet habe und die den benutzten
Werken inhaltlich oder wörtlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht
habe.
Erlangen, den 23. Juli 2008
Stefanie Knöpfel
73
Lebenslauf
11 Lebenslauf
Stefanie Andrea Knöpfel
Geboren:
Geburtsort:
Familienstand:
Nationalität:
08.05.1980
Erlangen
Ledig
Deutsch
Grundschule am Schießstättenweg
Neumarkt i. d. Opf.
09.1986-08.1990
Abitur
09.1990-06.1999
Ostendorfer Gymnasium
Neumarkt i. d. Opf.
Biologiestudium
Friedrich-Alexander Universität Erlangen Nürnberg
11.1999-12.2004
Diplomarbeit: „Replikationskinetiken von Varianten des
humanen Immundefizienzvirus Typ I“
Betreuung: Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein
Promotion
Institut für Klinische und Molekulare Virologie
Friedrich-Alexander Universität Erlangen Nürnberg
Thema: „Einfluss der Prozessivität der Reversen
Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ I auf
die G-zu-A Mutationsrate induziert durch APOBEC3Proteine“
Betreuung: PD Dr. Karin Metzner
74
01.2005-09.2008