Dokument_1.

Untersuchung
Influenza Virus-induzierter Signalprozesse und
deren Bedeutung in der Wirtszell-Abwehr
Dissertation
Zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximillians-Universität Würzburg
vorgelegt
von
Christina Ehrhardt
aus Lauterbach
Würzburg 2002
Eingereicht am:
Mitglieder der Prüfungskommission
Vorsitzender:
Prof. Dr. R. Hedrich
Gutachter:
Prof. Dr. S. Ludwig
Gutachter:
Prof. Dr. E. Buchner
Tag des Prüfungskolloquiums:
Doktorurkunde ausgehändigt am:
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1
Bedeutung von Influenza Viren
Die Replikation von Influenza Viren
Mechanismen der intrazellulären Signaltransduktion
1.3.1 Die Rolle der kleinen GTP-bindenden Proteine
der Ras-Superfamilie
1.3.2 Die Mitogen-aktivierten Signalwege
Influenza A Virus-induzierte Genexpression
Das IFNβ-Enhanceosom
1.5.1 AP-1
1.5.2 Interferon Regulatorische Faktoren
1.5.3 NF-κB
Influenza Virus-induzierte Regulation der Proteinsynthese
des Wirtes und der Apoptose
Zielsetzung der Arbeit
2. Material
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
1
3
7
7
9
12
14
16
17
19
20
23
25
Besondere Geräte
Chemikalien und Reagenziensätze
Zellkulturmaterial
Antikörper und Antiseren
Virus-Stämme
Enzyme
Reagenzienansätze (Kits)
Plasmide
Zellen
2.9.1 Bakterien
2.9.2 Eukaryotische Zellen
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26
28
29
30
30
30
31
33
33
33
3. Molekularbiologische Standardmethoden
34
3.1
Arbeiten mit Bakterien
3.1.1 Übernachtkulturen
3.1.2 Glycerindauerkulturen
3.1.3 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien
34
34
34
34
3.2
Arbeiten mit DNA
3.2.1 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien
3.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA
3.2.3 Maxipräparation von Plasmid-DNA
3.2.4 Agarose-Gelelektrophorese
3.2.5 Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA
3.2.6 DNA-Elution aus Agarosegelen
3.2.7 Ligation
3.2.8 Sequenzierung von DNA
3.2.9 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen
35
35
36
36
37
37
38
38
39
39
3.3
Zellkultur
3.3.1 Haltung von Suspensionszellen (U937)
3.3.2 Haltung von adhärenten Zellen (HEK293)
3.3.3 Haltung von adhärenten Zellen (MDCK)
3.3.4 Einfrieren, Lagerung und Rekultivierung von
eukaryotischen Zellen
3.3.5 Transiente Transfektion von U937 Monozyten mit
DMRIE-C Reagenz
3.3.6 Transiente Transfektion von HEK293 Zellen mit CaCl2
3.3.7 Transiente Transfektion von MDCK Zellen mit
FuGENETM-Reagenz
3.3.8 Transiente Transfektion von MDCK und HEK293
Zellen mit Lipofektamin 2000
3.3.9 Anzucht von Influenza Viren in embryonalen
Hühnereiern
3.3.10 Virale Infektion von Zellen
3.3.11 Plaque-Assay
40
40
40
41
41
42
43
43
44
45
47
47
3.4
Molekularbiologische Methoden – Protein
3.4.1 Luziferase-Assay
3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration im Photometer
(BioRad-Protein-Assay)
3.4.3 Immunpräzipitation
3.4.4 Kinase-Assay
3.4.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
3.4.6 Western-Blot
3.4.6.1 Transfer von Proteinen auf eine
Nitrozellulosemembran
3.4.6.2 Immundetektion von Proteinen
3.4.7 Herstellung von Kern-Protein-Extrakten
3.4.8 DNA-Protein-Bindungsassay
3.4.8.1 Radioaktive Markierung einer DNA-Sonde
3.4.8.2 „Elektrophoretic Mobility Shift Assay“ (EMSA)
3.4.9 GST-Pull-Down-Assay
3.4.9.1 Aufreinigung der GST-Fusionsproteine
3.4.9.2 Präparation der Zell-Lysate
3.4.9.3 GST-Pull-Down-Assay
4. Ergebnis
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
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4.9
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56
57
ATF-2 Phosphorylierung infolge einer Influenza Virus
Infektion erfolgt unabhängig von p38
Influenza Virus-induzierte JNK-Aktivität ist in produktiv
infizierten Zellen nachweisbar
Akkumulation von RNA, synthetisiert durch den viralen
Polymerase Komplex, resultiert in der Aktivierung von JNK
Die JNK Signalkaskade übernimmt eine essentielle Rolle in
der Virus-induzierten Aktivierung des IFNβ-Promotors
MKK4/SEK aktiviert die antivirale Genexpression über den
JNK/SAPK Signalweg, scheint aber auch die virale
Replikation zu unterstützen
Influenza Virus-induzierte Aktivierung von JNK und c-Jun
ist in Abwesenheit des NS1 Proteins gesteigert
Das virale NS1 Protein verhindert AP-1 abhängige
Genexpression
Das NS1 Protein inhibiert dsRNA-vermittelte JNK Aktivierung
Untersuchung der Influenza Virus-induzierten Signalwege, die
zur Aktivierung von IRF-3 führen
57
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60
63
64
66
68
69
71
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14
4.15
4.16
4.17
4.18
4.19
Influenza Virus Infektion induziert IRF-3 Translokation in den
Zellkern
Induktion IRF-3 abhängiger Genexpression erfolgt spezifisch
infolge von Influenza Virus Infektion oder dsRNA Stimulation
Die kleinen GTPasen Rac und Rho sind an der Influenza Virusinduzierten IRF-3 Aktivierung beteiligt
Die kleine GTPase Rac wird infolge von Virus Infektion
aktiviert
Endogene IRF-3 Aktivierung wird sowohl nach Influenza
Virus Infektion als auch nach dsRNA Stimulation induziert
Virus-induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von IRF-3
wird durch das Colstridium difficile toxin B-10463 gehemmt
Überexpression der dominant negativen Mutanten von Rac
und Rho verhindern die Virus-induzierte IRF-3 Aktivierung
Virus- und dsRNA-induzierte DNA Bindung von IRF-3 wird
durch die dominant negativen Mutanten von Rac und Rho
gehemmt
Die Blockade der kleinen GTPasen wirkt hemmend auf die
transkriptionelle Aktivität von IRF-3
Die Inhibition der kleinen GTPasen steigert die Virusreplikation
5. Diskussion
71
73
76
80
80
82
83
85
87
89
90
6. Zusammenfassung
104
7. Literatur
107
8. Abkürzungen
123
Danksagung
127
Lebenslauf
128
Veröffentlichungen, Vorträge und Auszeichnungen
130
Erklärung
134
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1 Bedeutung von Influenza Viren
Influenza A Viren sind weltweit verbreitete Pathogene für Menschen und verschiedene
Tierarten. Diese Pathogene werden der Familie der Orthomyxoviridae zugeordnet, die durch
ein segmentiertes RNA-Genom mit negativer Orientierung charakterisiert ist (Modrow et al.,
1997).
Das segmentierte Genom erlaubt den Austausch einzelner Genomsegmente (antigenic shift),
der auch speziesübergreifend vorkommen kann. Auf diese Weise entstehen sporadisch
Influenza Viren mit neuem Genom, die Menschen infizieren und schwere, globale Epidemien
(Pandemien) auslösen. Die „spanische Grippe“ von 1918/19, eine von fünf großen Pandemien
des letzten Jahrhunderts, forderte nach neuesten Schätzungen mehr als 40 Millionen
Todesopfer. Darüber hinaus treten jährlich kleinere Epidemien, lokal begrenzt und geringeren
Ausmaßes auf, die durch Veränderungen antigener Proteinbereiche infolge von
Punktmutationen (antigenic drift) hervorgerufen werden (Webster et al., 1992).
Aufgrund molekularer und serologischer Charakteristika der Nukleoproteine (NP) und der
Matrixproteine (M) werden Influenza Viren den Typen A, B und C zugeordnet. Viren des
Types A besitzen das größte pathogene Potential für Menschen und einige Tierarten (Webster
et al. 1992).
Ein Influenza A Viruspartikel besteht aus 9 strukturellen Proteinen und einer Lipidhülle, die
von der Wirtszelle stammt. Die viralen RNA Segmente 1 bis 3 kodieren für die Komponenten
des RNA-abhängigen RNA Polymerasekomplexes (RDRP), PB1, PB2 und PA, verbunden
mit dem Ribonukleoproteinkomplex katalysieren diese Komponenten Transkription und
Amplifikation des viralen Genoms.
1
1. Einleitung
Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind virale Oberflächenglykoproteine, die von
den vRNA Segmenten 4 und 6 gebildet werden. Gegenwärtig sind 15 verschiedene HA- und 9
verschiedene NA-Subtypen bekannt, aufgrund derer Influenza A Viren in unterschiedliche
Kategorien gegliedert werden. Viren mit den HA-Typen H1, H2 und H3 und NA-Typen N1
und N2 können in Menschen epidemisch wirken (Julkunen et al., 2001).
Segment
5
kodiert
das
Nukleoprotein
(NP),
die
Hauptkomponente
des
Ribonukleoproteinkomplexes. Nach Transport in den Kern der infizierten Zelle bindet dieses
Protein an vRNA-Segmente (Krug et al., 1989; Webster et al., 1992). Die beiden kleinsten
vRNA Segmente kodieren für jeweils zwei Proteine. Das vRNA Segment 7 kodiert das
Matrixprotein M1 und das M2 Protein. Das M1 Protein assoziiert mit der Innenseite der
Lipiddoppelmembran und kleidet die Virushülle von innen aus, M2 ist eine dritte
Transmembrankomponente, die als pH-abhängiger Ionenkanal fungiert. Die Sequenz von
Segment 8 trägt die Informationen für das Kernexportprotein NS/NEP und das einzige
Nichtstrukturprotein NS1 (Krug et al., 1989; Webster et al., 1992; Ludwig et al., 1999). Eine
besondere Eigenschaft des NS1 Proteins (siehe unten) besteht in seiner Fähigkeit dsRNA zu
binden (Hatada et al., 1992). Vor kurzem wurde das elfte Influenza A Virusprotein
identifiziert (Chen et al., 2001). Es handelt sich um das PB1-F2 Protein, das von einem
offenen, um ein Nukleotid verschobenen Leserahmen des PB1 Gensegmentes gebildet wird.
PB1-F2 ist ein mitochondriales Protein, das in der Lage ist, den Zelltod zu induzieren. Eine
Besonderheit von PB1-F2 ist, dass der offene Leserahmen für das PB1-F2 Protein, im
Vergleich zu anderen Influenza A Virusproteinen, in Influenza Virus Isolaten von einigen
Tieren (beispielsweise Schweinen) fehlt.
2
1. Einleitung
vRNA Segmente Gen-Produkte
PB2
PB1
PA
PB2
PB1
PA
HA
HA
NP
NA
NP
NA
M
NS
M1
M2
NS2
NS1*
Abb. 1.1: Influenza A Virus Partikel. Das neu entdeckte PB1-F2 Protein ist in dieser Graphik noch nicht
enthalten.
1.2 Die Replikation von Influenza Viren
Die HA-Proteine der Influenza A Viren binden an N-Acetylneuraminsäure-haltige Rezeptoren
der Wirtszellmembran, wodurch die Virusaufnahme über Rezeptor-vermittelte Endozytose
eingeleitet wird (Stegmann et al., 1990; Root et al., 2000). Vor dem Einbau in die
Wirtszellmembran erfolgt die proteolytische Spaltung der HA-Vorläuferproteine in den
aminoterminalen Anteil HA1 und in den carboxyterminalen Anteil HA2, durch eine vom Wirt
produzierte trypsinähnliche Furinprotease (Klenk et al., 1994). Eine Signalsequenz des HA1
Proteins veranlasst dessen Transport zur Zellmembran, die Adsorption an
Wirtszellrezeptoren, sowie die Hämagglutination. Das saure Milieu der Endosomenvesikel ist
für die Konformationsänderung des HA2 Proteins verantwortlich, durch die seine fusogene
3
1. Einleitung
Region am aminoterminalen Ende exponiert wird, so dass diese in Nachbarschaft der
Endosomenmembran gelangt, sich in diese einlagert und die Verschmelzung der beiden
Lipiddoppelschichten induziert (Webster et al., 1992; Garten et al., 1999). Durch das saure
Milieu der Endosomenvesikel kann ein Protonenfluss ins Innere des Virions durch die M2
Protein Ionenkanäle stattfinden (Veit et al., 1991; Holsinger et al., 1995). Aufgrund des
veränderten pH-Wertes der Endosomenvesikel im Zytoplasma lösen sich die viralen
Ribonukleoproteine von den Matrixproteinen, werden in das Zytoplasma freigesetzt und über
Kernporenkomplexe in den Zellkern transportiert (Martin et al., 1991; Bui et al., 1996). Die
Ansäuerung der Endosomenpartikel ist zum einen für die HA vermittelte Membranfusion und
zum anderen für die Protonenaufnahme über die M2 Protein Ionenkanäle, die letztlich zur
Freisetzung
des
Influenza
Virus
Matrixproteins
(M1)
von
den
viralen
Ribonukleoproteinkomplexen führt, essentiell (Root et al., 2000). Eine Beeinflussung des pHWertes der Endosomenpartikel von außen, beispielsweise durch Amantadin (1Aminoadamantan- Hydrochlorid), verhindert die Influenza A Virus Freisetzung, indem es die
Aktivität der M2 Protein Ionenkanäle blockiert (Asai et al., 2001). Im Zellkern erfolgt
zunächst die primäre Transkription und nachfolgend die Replikation des viralen Genoms.
Genomische vRNA ist bifunktionell: sie wird nicht nur in mRNA transkribiert, sondern wird
ebenso als Matrize (cRNA) genutzt, die wiederum als Matrize für neue vRNA dient (Webster
et al., 1992). Die virale mRNA wird ins Zytoplasma transportiert, wo die Synthese der viralen
Proteine stattfindet. Neu synthetisierte Polymerasen, NP, NS1 und NS2 Proteine werden in
den Zellkern transportiert (Webster et al., 1992; Lamb et al., 1996). Nach der Transkription
der sekundären vRNA in mRNA erfolgt die Synthese der späten Virusproteine, wie HA, NA
oder M1.
Die Replikation wird durch konservierte 5´- und 3´-Enden der vRNA-Segmente mit teilweise
komplementären Nukleotidsequenzen, die 13 und 12 Basenpaare lang sind, ermöglicht, die
aneinanderlagern und eine doppelsträngige Promotorstruktur ausbilden können. Solche
Promotorstrukturen erlauben die Bindung der RNA abhängigen RNA Polymerase und in der
4
1. Einleitung
Folge die Replikation der vRNA-Segmente (Luo et al., 1992; Fodor et al., 1995; Flick et al.,
1996). Die Initiation der Transkription erfordert einen Mechanismus, der es ermöglicht 5´Cap-Strukturen durch die zelluläre Polymerase II auf virale mRNA zu übertragen. Dieses
sogenannte „Cap-Stealing“ ist ein Prozess, für den die PB2-Untereinheit von besonderer
Bedeutung ist. PB2 bindet nicht nur die 5´-Cap-Gruppen, sondern bildet ebenso durch ihre
eigene Nukleaseaktivität freie 3´-OH-Gruppen, welche wiederum als Primer der
darauffolgenden Polymerisationsschritte fungieren (Krug et al., 1989; Webster et al., 1992;
Lamb et al., 1996). In frühen Infektionsphasen wird das virale Genom in hohen Raten
transkribiert und repliziert, während im weiteren Infektionsverlauf die Transkriptionsrate
abnimmt. Die Replikationsrate hingegen bleibt konstant (Shapiro et al., 1987). Wenn auch
keine Erkenntnisse über Details der Regulation der geschilderten Prozesse vorliegen, so kann
doch vermutet werden, dass ein Teil der Nukleoproteine nicht mit den viralen
Ribonukleoproteinen assoziiert ist und so einen Wechsel der viralen Transkription zur
Replikation hervorrufen kann (Shapiro et al., 1988). In späten Infektionsphasen akkumulieren
virale M1 Matrixproteine und inhibieren dadurch die virale Transkription (Hankins et al.,
1989; Ye et al., 1987; Perez et al., 1998).
De novo synthetisierte virale Ribonukleoproteine werden in der späten Infektionsphase in das
Zytoplasma exportiert. An diesem Export ist das virale M1 Matrixprotein beteiligt, welches
sowohl mit viralen Nukleokapsiden als auch mit NS2/NEP-Proteinen (Nukleares Export
Protein) assoziiert ist (Avalos et al., 1997). Letztere besitzen eine leucinreiche Sequenz, die
mit den Kernporen interagiert und so den Export der viralen Ribonukleoproteine einleitet
(O´Neill et al., 1998). Das M1 Protein hemmt den Rücktransport in den Zellkern, indem es
sogenannte karyophile Signale der Nukleoproteine maskiert (Bui et al., 1996). Darüber hinaus
wird diskutiert, dass NP durch Bindung an Aktin Stress-Fibrillen den Rückhalt der
Ribonukleoproteine im Zytoplasma bewirkt (Digard et al., 1999). Den NS1-Proteinen sind in
infizierten Zellen regulatorische Aufgaben zugeordnet: Sie inhibieren Splice- und
Polyadenylierungsvorgänge der pre-mRNA und halten zelluläre RNA Polymerase II
5
1. Einleitung
Transkripte im Nukleus zurück (Fortes et al., 1994; Lu et al.1994; Nemeroff et al 1998).
Ferner verstärken NS1-Proteine die Translation von mRNA mit viralen 5´-Sequenzen (de la
Luna et al., 1995; Enami et al., 1994) und blockieren die Aktivierung der Proteinkinase PKR
(Lu et al 1995; Tan et al., 1998). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das NS1 Protein der
Influenza A Viren ein wichtiger Virulenz Faktor ist, der inhibierend auf die Interferonvermittelte antivirale Antwort des Wirtes wirkt (Garcia-Sastre et al., 1998).
AAdsorpt
d s o r p tion
ion
Knospung
Kn
ospu ng
Po st t r a n slat ionale
Proz ession
V erpackung
T r an sla t io n
Endozyt ose
Fusion und
Ent lassung
RN A Exp o r t
Imp ort
Abb.1.2: Replikationszyklus der Influenza A Viren
NA-, M2- und Vorläufer HA-Proteine durchlaufen einen Reifungsprozess, der sie über den
exozytotischen Transportweg vom rER zum Golgi-Apparat und trans-Golgi-Apparat führt,
bevor sie ausgereift, als Tetra- (NA, M2) bzw. Trimere (HA), in die Plasmamembran
eingebaut werden. Während HA und NA im ausgereiften Zustand glykosyliert sind, gilt dies
nicht für M2 (Lamb et al.,1996).
6
1. Einleitung
Schließlich umschließt die zelluläre Membran die viralen Ribonukleotide und setzt die neu
entstandenen Viruspartikel durch Knospung an der apikalen Zelloberfläche frei (Webster et
al., 1992; Lamb et al., 1996).
1.3 Mechanismen der intrazellulären Signaltransduktion
Wann immer ein extrazellulärer Stimulus auf eine Zelle trifft, wird er über eine Reihe
intrazellulärer Signalmediatoren zu Endeffektoren weitergeleitet, deren Aktivität eine
entsprechende Zellantwort hervorruft. Die Signalübermittlung erfolgt mittels kleiner
GTPasen, Adaptoren, Proteinkinasen und transkriptionell aktiver Proteine. Proteinkinasen,
meist in definierten Signalwegen angeordnet, bilden eine große Genfamilie, deren Aufgabe es
ist, Proteinfunktionen durch reversible posttranslationelle Phosphorylierung an Serin-,
Threonin- oder Tyrosinresten zu modifizieren. Trifft ein extrazelluläres Signal auf einen
Rezeptor und aktiviert diesen, wird dieses Signal von der Zelloberfläche durch eine exakt
kontrollierte Phosphorylierungskaskade zum Zellkern geleitet.
1.3.1 Die Rolle der kleinen GTP-bindenden Proteine der Ras-Superfamilie
Als wichtige molekulare Schalter in eukaryonten Zellen fungieren die kleinen monomeren
Proteine (20-40 kDa) der Ras-Superfamilie, welche intrinsische GTPase Aktivität besitzen.
Ankommende Signale übertragen die kleinen GTP-bindenden Proteine von
Rezeptortyrosinkinasen und Rezeptor assoziierten Tyrosinkinasen ins Zellinnere (Krauss et
al., 2001).
Die Mitglieder der Ras-Superfamilie werden fünf Subfamilien zugeordnet: Ras, Rho, ARF,
Rab und Ran (Ridley et al., 2001). Neben ihrer Aufgabe als molekulare Schalter in
Signaltransduktionsprozessen für Zellwachstum und –motalität (Ridley et al., 2000) scheinen
sie
unter
anderem
auch
in
Vesikeltransport,
Zytoskelettreorganisation,
7
1. Einleitung
Mikrotubuliorganisation und Apoptose involviert (Takai et al, 2001). Aktiv liegen die
GTPasen in GTP- und inaktiv in GDP-gebundenem Zustand vor. Die Energie der
Triphosphate wird hierbei zur Bindung von Signaltransduktionspartnern verwendet und nicht
für enzymatische Prozesse (van Aelst et al., 1997). Um vollständige Funktionsfähigkeit zu
erlangen,
sind
posttranslationelle Farnesylierung oder Geranylierung als
Membranverankerung notwendig (Hall et al., 1998).
Die Ras-Subfamilie (rat sarcoma) bestehend aus: H-Ras (Harvey murine sarcoma), Ki-ras
(K irsten murine sarcoma) und N-ras (neuroblastoma) reguliert unter anderem
Zellproliferation, Zelldifferenzierung und onkogene Transformation. Das breite WirkSpektrum wird durch die Fähigkeit der Ras-GTP-Form vermittelt, direkt an zahlreiche
Effektorproteine zu binden und diese zu regulieren (Scita, et al., 2000). Der am besten
charakterisierte Ras Effektor ist Raf, eine Serin/Threonin Kinase, die den MEK-MAPK
Signalweg aktiviert (Li et al., 2001).
Neuere Studien haben gezeigt, dass Ran-GTPasen für die Mikrotubuliorganisation während
der M-Phase des Zellzyklus verantwortlich sind. Darüber hinaus scheinen sie den RNATransport aus dem Nukleus zu regulieren. Rab-Proteine sind an Sekretionsprozessen und der
Endozytose beteiligt. Die ADP-Ribosylierungsfaktoren (ARF) sind in den Vesikeltransport
des Golgi-Apparates involviert (Takai et al., 2001)
Die Rho-Subfamilie (Ras homolog) umfasst bei Säugern 14 verschiedene Mitglieder: Rho (A,
B, C, D), RhoE/rnd3, Rnd1/Rho6, rnd2/Rho7, Rhog, Rac (1, 2, 3), Cdc42, TC10 und TTF.
Rho, Rac und Cdc42 sind untereinander zu 50%, zu Ras 30% homolog (Hall et al., 1998).
Eine wichtige Funktion von Rho/Rac/Cdc42 ist die Reorganisation des Aktin-Zytoskelettes;
Rho stimuliert in Fibroblasten die Ausbildung von Stressfasern, Rac induziert Lamellopodien
und Membranausstülpungen und Cdc42 die Filopodienbildung (Takai et al., 2001). RhoGTPasen wirken als molekulare Schalter in verschiedensten Signalprozessen einschließlich
Sekretion, Phagozytose, Endozytose, Zellzyklusregulation, transkriptionelle Aktivierung und
Transformation (Barth et al., 1999).
8
1. Einleitung
GEF
TcdB-10463
C. bot. C3
GDI
inaktiv
aktiv
Rho
Rho
GDP
Rho-Kinase
GTP
GAP
Abb. 1.3: Rho-Proteine als molekulare Schalter: Im GTP-gebundenen Zustand sind die Rho-Proteine aktiv und
können Kinasen, beispielsweise die Rho-Kinase aktivieren. Ihre intrinsische Aktivität, die durch GTPasenaktivierende Proteine (GAP) gesteigert werden kann, befördert die GTPasen in den inaktiven Zustand. GTPaseExchange-Faktoren (GEF) katalysieren den Austausch von GDP gegen GTP, der wiederum durch DissoziationsInhibitoren (GDI) gehemmt werden kann (Ridley et al., 2001). Rho-Proteine stellen Angriffsziele für
verschiedene bakterielle Toxine dar, welche die GTPasen durch kovalente Modifikationen aktivieren oder
inaktivieren können (Aktories et al., 1997).
1.3.2 Die Mitogen-aktivierten Signalwege
Mitogen-aktivierte Proteinkinase- (MAPK-) Wege sind evolutionär hochkonservierte
Signalmodule, innerhalb derer die Signalübertragung über MAPK Kinase Kinasen
(MAPKKK), zu dualspezifischen Threonin-/Tyrosinkinasen, den MAPK Kinasen (MAPKK)
erfolgt. Diese wiederum stimulieren das letzte Glied dieser Kaskade, die prolingerichteten
MAP Kinasen, Serin-/Threonin Kinasen, die an einem TXY-Aminosäure Motiv durch
Phosphorylierung aktiviert werden.
Regulierend wirken die MAPK-Signalwege auf eine Reihe biologischer Prozesse, wie
Zelldifferenzierung, -proliferation und programmierten Zelltod (Robinson und Cobb 1997,
Garrington et al., 1999; Pearson et al., 2001). In Vertebraten sind mindestens vier
9
1. Einleitung
verschiedene MAPK-Signalwege bekannt, die unterschiedliche Klassen von MAPK
aktivieren.
Der am besten charakterisierte MAPK Signalweg ist die Raf-MEK-ERK Kinasekaskade.
Stimuliert wird dieser Signalweg durch Wachstumsfaktoren wie EGF oder BlutplättchenWachstumsfaktor (platelet derived growth factor, PDGF), was zur Mitose der betreffenden
Zelle führt. Deshalb wird der Raf/MEK/ERK-Signalweg oft als klassische mitogene Kaskade
bezeichnet. Allerdings weisen einige Daten auch auf die Beteiligung an
Regulationsvorgängen während der Entwicklung und Differenzierung in einer Reihe von
Organismen hin (Daum et al., 1994; Marshall et al., 1995). Beispielsweise ist die
Rezeptortyrosinkinase Sevenless für die Spezifizierung der R7-Photorezeptorzelle bei der
Taufliege Drosophila melanogaster verantwortlich (Dickson et al., 1994). Bei Säugern wird
die Differenzierung von neuronalen Phäochromozytomzellen aufgrund der Dauer der ERKAktivierung bestimmt: Transiente ERK-Aktivierung durch EGF führt zur Mitose, während
anhaltende ERK-Aktivierung durch Stimulation mit Nerven-Wachstumsfaktoren (nerve
growth factor, NGF) die Ausbildung Axon-ähnlicher Neuronen zur Folge hat (Marshall
1995).
Aktivierung von Raf durch Ras führt zur Phosphorylierung zweier Serinreste der
dualspezifischen Kinase MEK (mitogen/extracellular-signal regulated kinase kinase) die
wiederum Phosphatgruppen sowohl auf Threonin- als auch auf Tyrosinreste in den
Zielproteinen, den ERK-Isoformen ERK1(p44) und ERK2 (p42) überträgt (Ahn et al., 1991).
Während ERK das bis jetzt einzige, bekannte Kinasesubstrat von MEK darstellt, kann
aktivierte ERK ihrerseits eine Vielzahl von Zielproteinen sowohl im Kern als auch im
Zytoplasma aktivieren. Zu den Substraten von ERK zählen unter anderem
Transkriptionsfaktoren (beispielsweise c-Jun, Elk1), strukturelle Proteine (beispielsweise
Tallin, Lamine), aber auch weitere Kinasen (beispielsweise RSK, 3pK) (Daum et al., 1994).
Ähnlich dem „klassischen“ Raf-MEK-ERK Signalweg strukturiert sind die in Säugerzellen
vorkommenden stressinduzierten p38- bzw. JNK/SAPK Kinasekaskaden. Ihre Induktion
10
1. Einleitung
erfolgt mittels pro-inflammatorischer Zytokine, wie TNF-α und IL-1 oder sogenannten
Stress-Induktoren, beispielsweise ultraviolettes Licht, osmotischer- oder Hitze-Schock und
chemische Stressagenzien wie Anisomycin und Arsenit (Kyriakis et al., 1994; Raingeaud et
al., 1995). In diesen Kinasekaskaden sind Rho GTPasen an der Signalweiterleitung von der
Zelloberfläche ins –innere beteiligt (Cammarano et al., 2001). Die Signale werden von den
Rho GTPasen auf die MEKK Kinasen (MEKK, MLK2/3) oder direkt zu der MAPK Kinase
MKK6 übermittelt. MEKK (MEK Kinase) aktiviert die dualspezifische MAPKK SEK/MKK4
(SAPK/ERK kinase / stress activated protein kinase) (Yan et al., 1994), wohingegen MLK2/3
die Aktivierung von MKK7, einem Homolog der SEK induziert (Sanchez et al., 1994).
Sowohl SEK/MKK4 als auch MKK7 sind in der Lage JNK/SAPK zu stimulieren, allerdings
wirkt MKK4 spezifisch auf Tyrosin- und MKK7 auf Threoninreste im TXY Motiv (Lawler et
al., 1998). Die Spezifität dieses Kaskadenzweiges beruht auf der Fähigkeit des Gerüstproteins
JIP-1 (JNK interaction partner-1) Komplexe mit JNK (Jun N-terminal kinase) 1 und 2, MKK7
und MLK3 ausbilden zu können (Dickens et al., 1997; Whitmarsh et al., 1998). Substrate von
JNK sind unter anderem die Transkriptionsfaktoren c-Jun und ATF-2 und 3pK/MAPKAP
Kinase-3 (Derijard et al., 1994; Gupta et al., 1995; Kyriakis et al., 1996). C-Jun ist sowohl ein
Substrat von JNK, als auch von ERK. Die JNK induzierte c-Jun Phosphorylierung erfolgt am
N-terminalen Ende und führt zur Aktivierung, wohingegen ERK eine der Stellen, nahe dem
C-terminalen Bindedomäne phosphoryliert und demzufolge inhibierend wirkt (Minden et al.,
1994).
MAPKK MKK6 (Raingeaud et al., 1995), MKK3/RKK (RK Kinase) (Derijard et al., 1995)
oder SEK sind Aktivatoren von p38/RK (MAPKAP-2 reactivating kinase), zu deren
Substraten die MAPKAP Kinase 2 und 3pK, sowie der Transkriptionsfaktor ATF-2 gehören
(Han et al., 1994; Rouse et al., 1994; Lee et al., 1994; Ludwig et al., 1996).
Die Kinase 3pK ist ein Konvergenzpunkt der drei beschriebenen MAPKAP-Signalwege. Sie
könnte deshalb als ein integratives Signalelement sowohl der mitogen-, als auch der
stressinduzierten Antwort in der Zelle fungieren (Ludwig et al., 1996).
11
1. Einleitung
Eine Kaskade analoger Architektur führt zur Aktivierung von ERK5; ERK5 ihrerseits
phosphoryliert und aktiviert unter anderem den Transkriptionsfaktor MEF2C (Kato et al.,
1997) und ist an der Induktion der Muskeldifferenzierung beteiligt (Dinev et al., 2001).
1.4 Influenza A Virus-induzierte Genexpression
Influenza A Viren infizieren beim Menschen zunächst die Epithelzellen der oberen
Atemwege, aber auch T-Zellen, Monozyten und Makrophagen (Ronni et al., 1995; Majde et
al., 2000). In den betroffenen Zellen werden Abwehrmechanismen gegen die virale Infektion
induziert, einschließlich der effizienten Expression antiviraler Zytokine (Julkunen et al.,
2001).
Zytokine, wichtige Bestandteile der Immunantwort in zahlreichen Organismen, spielen bei
der Proliferation und Differenzierung von Leukozyten und anderen Zielzellen eine wichtige
Rolle und fördern Entzündungsprozesse. Infolge einer Influenza A Virus Infektion beim
Menschen produzieren Monozyten pro-inflammatorische Zytokine wie den Tumor-Nekrose
Faktor α (TNFα), Interleukine (IL-1, IL-6) und IFNα/β (Ronni et al., 1997; Sareneva et al.,
1998). Außerdem werden Chemokine (chemotaktische Zytokine) freigesetzt. Mitglieder
dieser Familie ordnet man aufgrund ihrer Fähigkeit, unterschiedliche Rezeptoren zu binden,
den CC-Chemokinen und CXC-Chemokinen zu. Die kurz nach Virusinfektion exprimierten
CC-Chemokine, wie MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1α), MCP-1 (monocyte
chemotactic protein-1) und RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and
secreted) ziehen Monozyten und Makrophagen an (Sprenger et al., 1996). Die Induktion der
Proteinsynthese der oben genannten Gene erfolgt in frühen Infektionsstadien, da die
wirtseigene Proteinsynthese wenige Stunden nach einer Infektion durch virale Mechanismen
unterdrückt wird.
12
1. Einleitung
CXC-Chemokine, wie IL-8 oder GROα (melanoma growth stimulatory activity) sind für die
Rekrutierung von Neutrophilen infolge einer bakteriellen Infektion verantwortlich. Allerdings
wird die Expression dieser Chemokine nach viraler Infektion von Monozyten in diesen
vollständig unterdrückt. Virus-spezifische Induktion mononuklearer Chemokine führt somit
zum Einstrom mononuklearer Leukozyten in Virus-infiziertes Gewebe (Sprenger et al., 1996).
Der Einstrom von Leukozyten über die endotheliale Zellbarriere wird neben einem
Gradienten chemotaktischer Faktoren durch Adhäsionsmoleküle wie dem Influenza A Virusinduzierten endothelialen E-Selektin vermittelt (Imhof et al., 1995; S. Ludwig,
unveröffentlichte Daten).
In den Epithelzellen der Atemwege konnte im Gegensatz zu Monozyten die Influenza A
Virus-induzierte IL-8 Genexpression nachgewiesen werden (Choi et al., 1992).
Eine sehr heterogene Familie Influenza A Virus-induzierter multifunktionaler Zytokine sind
die Interferone (Sato et al., 2001). Diese Zytokine wirken antiviral, regulieren
Immunantworten, Zellwachstum und anti-Tumor Funktionen (Sen, et al., 2000). Untergliedert
in zwei Familien, weisen die TypI Interferone (IFNα/β) mehrere strukturell verwandte
Mitglieder auf, die schnell infolge einer viralen Infektion von Säugerzellen induziert werden.
Die Produktion von IFNα/β erfolgt beispielsweise von Influenza A Virus-infizierten
Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen (Julkunen et al., 2001). TypII Interferon (IFNγ),
ein TH1 Zytokin, ist ein einzelnes, nicht-verwandtes Protein. Dieses TH1 Zytokin wird von
aktivierten T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK) produziert und ist für eine umfassende
Immunantwort verantwortlich (Mamane et al., 1999). Aktiviert werden die Interferone in zwei
Schritten: zunächst erfolgt die Induktion der „Frühen Gene“ über einen direkte
Aktivierungsweg (IFNβ , murines IFNα4), wohingegen die „Späten Gene", einschließlich
IFNα de novo Proteinsynthese benötigen (Marie et al., 1998; Mamane et al., 1999).
Interaktion von produzierten und sekretierten IFN Proteinen mit Nachbarzellen über
Zelloberflächen-Zytokinrezeptoren und Induktion der JAK-STAT Signalwege (Servant et al.,
13
1. Einleitung
2001) resultiert in der Expression von über 30 Proteinen, die diverse Funktionen der
Interferone weiterleiten (Lin et al., 1999). IFNα/β, die wichtigsten antiviralen Zytokine,
induzieren unter anderem die Expression der PKR, der RNAaseL/2´-5´ Oligoadenylat
Synthetase (OAS) und Mx Proteine (GTPasen), die alle antiviral wirken (Haller et al., 1998 ).
Die Bedeutung eines funktionierenden IFN-Systems wird bei Infektion von entsprechenden
Knock-out Mäusen sichtbar: beispielsweise sind STAT-/- Mäuse extrem empfindlich
gegenüber Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) Infektionen. Verglichen mit Wildtyp-Mäusen
verursachen in STAT-/- Mäusen 108-fach niedrigere Viruskonzentration enorme VSVReplikation und Lethalität. Demnach ist das TypI IFN-induzierte antivirale System wichtig,
um die VSV Replikation in vivo zu verhindern. Influenza A Viren sind in STAT-/- Mäusen in
der Lage sich außer in der Lunge in vielen anderen Organen, wie Niere, Leber und Gehirn zu
replizieren. Somit scheint ein intaktes Interferonsystem vor einer systemischen Virusinfektion
zu schützen (Levy et al., 2001).
β-Enhanceosom
1.5 Das IFNβ
IFNβ ist ein wichtiges Schlüsselzytokin, welches von Influenza Virus-infizierten
Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen produziert wird und eine wichtige Rolle in der
angeborenen Immunantwort spielt. Die Expression von IFNβ-Genen wird von dem
sogenannten IFNβ-Enhanceosom kontrolliert. Es handelt sich um einen MultiproteinKomplex, der die drei Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-κB und IRF3/7 enthält, welche an die
Positiv Regulatorischen Domänen (PRD) des Promotors binden können. PRDIV wird von
einem Heterodimer des Leuzinzipper-Proteins ATF-2/c-Jun und PRDII von NF-κB erkannt.
Ein Komplex, bestehend aus Homo- oder Heterodimeren der IFN-Regulatorischen Faktoren 3
und 7, bindet an PRD I und III. Zwei Moleküle HMG I(Y) (high mobility group protein I)
erkennen ebenfalls das IFNβ-Enhanceosom und gehen jeweils eine kooperative Bindung mit
14
1. Einleitung
NF-κB und ATF-2/c-Jun ein. Darüber hinaus sind für die IFNβ−Εxpression die Koaktivatoren
p300/CBP (CREB binding protein) notwendig (Thanos et al., 1995).
Die Expression der antiviral wirkenden Zytokine, wie IFNβ veranlasst die Bekämpfung der
Viren und würde letztlich zu deren Vernichtung führen, wenn keine Funktionen zur Erhaltung
eines Gleichgewichtes zwischen Virus und Wirtszelle vorhanden wären. Influenza Viren
stimulieren zwar die Signalwege, die eine Expression von IFN Genen und anderen Zytokinen
ermöglichen, haben aber gleichzeitig zahlreiche Mechanismen entwickelt, die zum einen die
wirtseigene Proteinsynthese unterbinden und zum anderen einen Wechsel von zellulärer zur
viralen Proteinsynthese verursachen, während antiviral wirkende Signalwege inhibiert werden
(Gale et al., 2000). Eine Schlüsselrolle in der Inhibition der IFN vermittelten antiviralen
Immunantwort übernimmt das Nichtstrukturprotein NS1 (Garcia-Sastre et al., 1998). In
Influenza Virus-infizierten Zellen wird dieses Phosphoprotein in großen Mengen produziert
und liegt zunächst im Nukleus vor, ist aber bei vorangeschrittener Virusreplikation auch im
Zytoplasma zu finden (Egorov et al., 1998). Das besondere Charakteristikum des NS1
Proteins an dsRNA zu binden (Hatada et al., 1992), verhindert beispielsweise die Aktivierung
der Interferon-induzierbaren dsRNA-abhängigen Proteinkinase (PKR) (Lu et al., 1995; Tan et
al., 1998). Weitere regulatorische Funktionen des NS1 Proteins während der viralen
Replikation bestehen in der Inhibition der Polyadenylierung der wirtseigenen mRNA
(Nemeroff et al., 1998) oder in der Inhibition des mRNA Kernexportes aufgrund der Bindung
der NS1 Proteine an PolyA-Ketten der mRNA (Chen et al., 1999). Darüber hinaus inhibieren
NS1 Proteine das Splicen der mRNA, stimulieren die Translation viraler mRNA (de la Luna
et al., 1995) und modulieren Transkription und Replikation viraler mRNA (Marion et al.,
1997). Ein rekombinantes Influenza Virus auf der Basis des Stammes A/PR8/34, dem das
NS1 Gen fehlt (delNS1 Virus) (Garcia-Sastre et al., 1998), kann sich lediglich in Substraten
oder Wirten replizieren, denen ein ausgebildetes Interferonsystem fehlt, beispielsweise VeroZellen, 6 Tage alten Hühnerembryonen (Talon et al., 2000), STAT-/- (Garcia-Sastre et al.,
1998) oder PKR-/- Mäusen (Bergmann et al., 2000). Demzufolge spielen NS1 Proteine eine
15
1. Einleitung
wichtige Rolle für die Inhibition von IFN während der viralen Replikation (Wang et al.,
2000).
1.5.1 AP-1
Transkriptionsfaktoren der AP-1 Familie bestehen aus Homo- und Heterodimeren von Jun (vJun, c-Jun, JunB, JunD), Fos (v-Fos, c-Fos, FosB, Fra1, Fra2) oder den aktivierenden
Transkriptionsfaktoren (ATF-2, ATF-3). Stabile Heterodimere entstehen, wenn Jun-Proteine
mit Fos- oder ATF-Familienmitgliedern interagieren. Homodimere können lediglich von Junoder ATF-Proteinen, nicht von Fos-Proteinen gebildet werden. Die Aktivierung spezifischer
Zielgene wird aufgrund der Dimer-Zusammensetzung bestimmt: Jun-Jun und Jun-Fos Dimere
binden TPA responsive Elemente (TRE), während Jun-ATF oder ATF-ATF Bindung an
cAMP responsive Elemente (CRE) bevorzugen (Karin et al., 1997). Infolge Phosphorylierung
spezifischer Bindungsdomänen erhöht sich die Transaktivierungsfähigkeit verschiedener AP1 Proteine, einschließlich c-Jun und ATF-2 ohne Auswirkungen auf ihre DNA
Bindungsaktivität (Smeal et al., 1992; Deng et al., 1994).
Die Regulation der AP-1 Aktivität findet auf zwei Ebenen statt: Auf transkriptioneller Ebene
kontrollieren die AP-1 Faktoren das Vorkommen der Proteine. Am besten untersucht ist dies
für c-jun und c-fos Gene, die direkt nach Stimulation der Zelle induziert werden. Die
Regulation der AP-1 abhängigen Genexpression auf transkriptioneller Ebene erfolgt unter
anderem über die Raf/MEK/ERK Signalkaskade (Karin et al., 1997). Auf
posttranskriptioneller Ebene modulieren Phosphorylierungsereignisse die AP-1 Aktivität über
die stressinduzierte JNK/SAPK Kinasekaskade. Dabei phosphoryliert JNK ATF-2, wie auch
Serinreste innerhalb der c-Jun Aktivierungsdomäne, aber nicht c-Fos (Deng et al., 1994;
Gupta et al., 1995). Auch die p38 MAPK ist in der Lage ATF-2 zu phosphoylieren
(Livingstone et al., 1995; van Dam et al., 1995).
Influenza Virus Infektion induziert JNK Aktivität und AP-1 abhängige Genexpression in
produktiv infizierten Zellen. Blockade der JNK Aktivierung auf verschiedenen Ebenen der
16
1. Einleitung
Kaskade, mittels Überexpression dominant negativer Kinasemutanten oder Verwendung
inhibitorischer Proteine, führt zur Inhibierung der Virus-induzierten JNK Aktivität,
reduzierter AP-1 Aktivität und verminderter Transaktivierung von IFNβ (Ludwig et al.,
2001).
1.5.2 Interferon Regulatorische Faktoren
Der Interferon Regulatorische Faktor-3 (IRF-3) ist eines von 9 bekannten Mitgliedern der
wachsenden IRF-Familie, die unterschiedlichste Aufgaben in biologischen Prozessen erfüllt:
beispielsweise die Regulation von Pathogenitätsprozessen, des Zellwachstums, der
hämatopoetischen Entwicklung und der Signalübertragung ausgehend von Zytokinen. Alle
Familienmitglieder besitzen in ihrer N-terminalen DNA Bindedomäne (DBD) homologe,
charakteristische Tryptophanregionen (Lin et al., 2000). Diese DNA Sequenzen binden IFNstimulierte, responsive Elemente (ISRE), die in den meisten IFN-induzierbaren
Genpromotoren vorkommen, IFN Konsensus Sequenzen (ICS), die in MHC Klasse IPromotoren existieren oder Positiv Regulatorische Domänen (PRD) im IFNβ Promotor
(Darnell et al., 1994; Nelson et al., 1993; Tanaka et al., 1993). Strukturell scheint die IRFFamilie zu Myb-Onkoproteinen verwandt, obwohl deren Beziehung zu IFN ungeklärt ist
(Leverson et al., 1998). Ein virales Analogon der zellulären Interferon Regulatorischen
Faktoren wird vom humanen Herpesvirus 8 gebildet (Russo et al., 1996).
Das Gen für IRF-3 kodiert ein 55kDa Protein, welches konstitutiv in allen Geweben
exprimiert wird und dessen mRNA Menge sich nicht in Virus-infizierten oder IFN
behandelten Zellen ändert (Servant et al., 2001). In unstimulierten Zellen befindet sich
inaktives IRF-3 im Zytoplasma. Infolge einer Virusinfektion kommt es zu posttranslationalen
Modifikationen durch Phosphorylierung zahlreicher Serin- und Threoninreste am C-Terminus
von
IRF-3.
Virus-induzierte
Phosphorylierung
des
C-Terminus
führt
zur
Konformationsänderung, wodurch die Autoinhibition aufgehoben und Dimerisierung der
Faktoren möglich wird. Phosphoryliertes und aktiviertes IRF-3 wandert in den Zellkern,
17
1. Einleitung
assoziiert mit den Koaktivatoren p300/CBP und stimuliert sowohl DNA Bindung, als auch
transkriptionelle Aktivität Virus-induzierbarer Gene (Lin et al., 1999). Überexpression von
IRF-3 steigert die Virus-vermittelte Expression von TypI IFN und die antivirale
Immunantwort (Juang et al., 1998). Phosphorylierung von IRF-3 löst neben seiner
Aktivierung auch ein Signal für den eigenen Proteasom-vermittelten Abbau aus (Lin et al.
1998). Hemmend kann das Influenza A Virusprotein NS1 auf die Aktivierung von IRF-3
wirken. Zellen, die mit Wildtyp (PR8) Influenza Virus infiziert sind, zeigen verminderte IFNβ
mRNA Induktion, im Vergleich zu Zellen, die mit einem Virus infiziert wurden, dem das NS1
Gen fehlt (delNS1) (Talon et al., 2000). Somit ist NS1 nicht nur ein potenter IRF-3 Hemmer,
sondern auch, bedingt durch die Funktion von IRF-3 in der IFNβ Induktion, ein IFNInhibitor.
IRF-3 wird im Gegensatz zu IRF-7 in einem ersten Aktivierungszyklus unmittelbar nach
Stimulation, beispielsweise Virusinfektion induziert. In einem zweiten Zyklus erfolgt die
transkriptionelle Aktivierung von IRF-7 durch sekretiertes IFN über autokrine und parakrine
Aktivierungsschleifen, die intakte IFN Rezeptoren und JAK/STAT Signalwege erfordern.
Erst in einem dritten Aktivierungszyklus bilden IRF-3 und IRF-7 Heterodimere aus,
sogenannte Virus-aktivierte Faktoren (VAF) (Wathelet et al., 1998; Servant et al., 2002) und
aktivieren IFNα/β der verzögerten Immunantwort (John Hiscott, Montreal, persönliche
mündliche Mitteilung). Ein weiteres Zytokin, das CC-Chemokin RANTES, besitzt
Bindestellen für IRF-3/IRF-7 in seiner Promotorsequenz. RANTES, lange nach der T-ZellAktivierung, durch synergistische Aktivierung von IRF-3/IRF-7 und NF-κB induziert, zieht
unter anderem Mononzyten, Neutrophile Killer- (NK)- Zellen und T-Zellen an (Genin et al.,
2000). Außerdem scheint IRF-3 auch in Virus-induzierte Apoptose involviert: die konstitutiv
aktive Form von IRF-3 war in der Lage, in humanen embryonalen Nierenzellen (293, Jurkat
T-Zellen) Apoptose auszulösen, wohingegen der Wildtyp dies nicht konnte (Heylbroeck et al.,
2000).
18
1. Einleitung
1.5.3 NF-κB
Der dritte Transkriptionsfaktor, der regulatorisch auf den IFNβ Promotor wirken kann, ist NFκB. Die Aktivierung von NF-κB erfolgt infolge zahlreicher physiologischer Prozesse,
einschließlich der Behandlung mit verschiedenen Zytokinen und Mitogenen (Iwamura et al.,
2001). Als ein Transkriptionsfaktor, der inflammatorische Prozesse reguliert, wird NF-κB
schnell, unabhängig von einer neuen Proteinsynthese aktiviert (Zandi et al., 1999). Es konnte
gezeigt werden, dass NF-κB infolge von Influenza Virus Infektion und dsRNA Behandlung
aktiviert wird (Julkunen et al., 2001). Alleine die Expression eines einzigen strukturellen
Proteins, wie dem Influenza Virusprotein Hämagglutinin (HA) ist ausreichend, um die
Bindung von NF-κB an die DNA und seine transkriptionelle Aktivität zu induzieren (Pahl et
al., 1995).
In unstimulierten Zellen sind NF-κB Faktoren, mit ihrer inhibitorischen Untereinheit IκB
komplexiert, im Zytoplasma lokalisiert. Stimuli, weitergeleitet durch NIK (NF-κB inducing
kinase) oder die dsRNA-aktivierte Proteinkinase R (PKR) aktivieren die Protein Kinase IKK
durch Phosphorylierung (Kumar et al., 1994; Chu et al., 1999). Diese Kinase besteht aus zwei
katalytischen Untereinheiten, IKKα und IKKβ , und einer regulatorischen Untereinheit
IKKγ/NEMO (Zandi et al., 1997; Karin et al., 1999). Proinflammatorische Zytokine wie der
Tumor Nekrose Faktor α (TNFα) und IL-1, bakterielle Liposaccharide (LPS) und dsRNA
induzieren die NF-κB Aktivierung über IKKβ , die enzymatisch wichtigste Untereinheit
(Tanaka et al., 1999). IKKα scheint eine distinkte Rolle zu haben und vermittelt
beispielsweise Signale, welche die Keratinozyten-Differenzierung kontrollieren (Takeda et
al., 1999). Letztlich induziert aktivierte IKK ein Signal, das den Ubiquitin-abhängigen Abbau
von gebundenem IκB veranlasst und daraufhin die Kerntranslokation der NF-κB Dimere
(p50/p65) und die Induktion spezifischer Gentranskription zur Folge hat (Baeuerle et al.,
1994).
19
1. Einleitung
Welche exakten molekularen Mechanismen infolge von Influenza Virus Infektion bzw.
dsRNA Behandlung zur Aktivierung von NF-κB führen, bleibt zu klären.
1.6 Influenza Virus-induzierte Regulation der Proteinsynthese des Wirtes und der
Apoptose
Trotz ihrer geringen Genomgröße von 13 kb können Influenza A Viren zahlreiche Säugerund Vogelarten erfolgreich infizieren und sich vermehren. Demzufolge ist es nicht
überraschend, dass Influenza A Viren wirtseigene Zellfunktionen nutzen und zu ihren
Gunsten verändern (Ludwig et al., 1999). Wirtszellen antworten auf eine virale Infektion,
indem sie zytolytische und apoptotische Mechanismen starten, die im Zelltod enden.
Influenza A Viren können sich in Wirtszellen effizient replizieren, da sie die wirtseigene
Genexpression unterdrücken. Der virale Protein-Polymerase-Komplex „stiehlt“ die 5´CapStruktur der zellulären mRNA und nutzt diese als Primer für die virale mRNA Synthese,
während die zelluläre mRNA abgebaut wird (Lamb et al., 1996). Influenza A Virus kodiertes
NS1 Protein blockiert Splice-Prozesse der Vorläufer-mRNA und verhindert den Transport der
wirtseigenen mRNA aus dem Kern, die demzufolge nicht translatiert werden kann (Qiu et al.,
1994). Influenza A Virus-spezifische mRNA wird dagegen im Zytoplasma effizient
translatiert, so dass die virale Proteinsynthese über einen Infektionszyklus gesichert ist (Lamb
et al., 1996). Eine andere Möglichkeit, die virale mRNA Translation zu gewährleisten, besteht
in der Aktivitätsminderung der IFN-induzierten, antiviral wirkenden Proteinkinase R (PKR).
Aktivierte PKR phosphoryliert den eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor 2α (eIF2α),
wodurch die wirtseigene Translation reduziert wird und somit auch die zelluläre
Proteinsythese. Um diesen inhibitorischen Effekt der PKR zu umgehen, interagiert das virale
NS1 Protein, ein dsRNA-bindendes Protein, mit der aktivierenden dsRNA und verhindert die
Aktivierung der PKR. Darüber hinaus können Influenza A Viren das latent vorliegende
20
1. Einleitung
Chaperon-assoziierte Protein, p58IPK aktivieren, das PKR bindet und dessen Dimerisierung
verhindert (Gale et al., 1998).
Effiziente Virusreplikation, Aufrechterhaltung der viralen Proteinsynthese, Ausschaltung der
wirtseigenen Proteinsynthese und Produktion viraler Partikel führt innerhalb von 20 bis 40
Stunden nach einer Infektion zum zytolytischen Tod einer Zelle (Hinshaw et al 1996).
Influenza A Virus-infizierte Zellen zeigen aber auch typische apoptotische Veränderungen:
Chromatinkondensation, Fragmentierung der DNA, Ausbildung apoptotischer Vesikel und
Vernichtung der Wirtszelle (Julkunen et al., 2001).
Der genaue Regulationsmechanismus der Influenza A Virus-induzierten Apoptose ist bisher
ungeklärt, jedoch scheinen sowohl zelluläre, als auch virale Faktoren bedeutsam zu sein. Die
beiden Influenza A Virusproteine NA und NS1 sind möglicherweise in die Regulation der
Apoptose verwickelt. NA aktiviert den latenten Transformierenden Wachstumsfaktor (TGFβ), ein proapoptotischer extrazellulärer Faktor, der nach Influenza Virus Infektion vermehrt
aktiviert wird und Virus-induzierte Apoptose in Mäusen hervorruft (Schultz-Cherry et al.,
1996). NS1 induziert ebenfalls Apoptose, wie in MDCK-Zellen nachgewiesen wurde
(Schultz-Cherry et al., 1998). Jedoch haben neuere Daten gezeigt, dass NS1 auch IFNunabhängiges antiapoptotisches Potential besitzt und die apoptotische Antwort in Influenza
Virus-infizierten Zellen herabreguliert. Influenza Viren, die nicht in der Lage waren NS1
Proteine zu bilden (delNS1), konnten sich in 7-Tage alten Hühnerembryonen effektiver
replizieren als Wildtyp-Viren und verursachten höhere Apoptoseraten (Zhirnov et al., 2002).
Demzufolge ist die unterschiedliche Wirkung wahrscheinlich vom Replikationsstadium des
Virus abhängig. Zu frühen Zeitpunkten könnten die NS1 Proteine dem IFN-System
entgegenwirken, um die Virusreplikation zu gewährleisten, wohingegen die Förderung der
Apoptose zu späteren Zeitpunkten die Virusverbreitung unterstützen könnte. IFNα/β und
gesteigerte PKR Expression werden auch mit Influenza A Virus-induzierter Apoptose in
Verbindung gebracht. Auch das kürzlich entdeckte elfte Influenza Virusprotein PB1-F2
scheint apoptotische Wirkung zu besitzen (Chen et al., 2001). Mutierte Viren, die zu einer
21
1. Einleitung
verminderten Expression von PB1-F2 führten, verursachten geringere Apoptose in humanen
Monozyten als intakte Wildtyp-Viren. Ein charakteristisches Merkmal der Apoptose ist die
Aktivierung der Kaspasekaskade. Zahlreiche apoptotische Signale, vermittelt von IFNα/β,
aktivieren die Initiator Kaspasen 8 und 9, gefolgt von den Kaspasen 1 und 3 (Earnshaw et al.,
1999; Julkunen et al., 2001).
Simultane Infektion von Neutrophilen mit Influenza A Viren und Bakterien steigert den
apoptotischen Zelltod (Colamussi et al., 1999). Einige Bakterien, wie beispielsweise
Staphylococcus aureus produzieren proteolytische Enzyme, die Influenza A Virus
Hämagglutinin spalten können und dadurch die Pathogenität erhöhen (Scheiblauer et al.,
1992).
22
1. Einleitung
1.7 Zielsetzung der Arbeit
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Signalwegen, die, induziert durch virale
Infektion, zur Expression des antiviralen Zytokins IFNβ führen. Wie bereits dargestellt besitzt
das IFNβ Enhanceosom Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren NF−κB, AP-1 und IRF-3
(Abb. 1.4). Rezeptor-vermittelte Signalwege, die zur Aktivierung von NF-κB führen sind
zahlreich beschrieben (Baeuerle et al., 1994; Karin et al., 1999; Tanaka et al., 1999; Takeda et
al., 1999). Darüber hinaus ist bekannt, dass die Influenza Virus-induzierte Aktivierung über
den klassischen IKK/NF-κB Signalweg erfolgt (Abb. 1.4).
Im Rahmen der Diplomarbeit "Virus-Wirtszell Interaktionen in Influenza Virus-infizierten
Zellen" konnte die Bedeutung der viralen Replikation für die Induktion der AP-1 abhängigen
Genexpression, die über den JNK/SAPK-Signalweg vermittelt wird, nachgewiesen werden.
Es wurde gezeigt, dass während der viralen Infektion die Faktoren c-Jun, c-Fos, JunD und
ATF-2 an AP-1 Konsensus Stellen binden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit galt es, die
Mechanismen der Influenza Virus-induzierten AP-1 Aktivierung weiter im Detail zu
betrachten. Zur Erfüllung dieses Forschungszieles sollte im Einzelnen auf folgende
Fragekomplexe eingegangen werden:
- Führt Influenza Virus Infektion zu einer Phosphorylierung der an die AP-1 Konsensus
Stellen gebundenen Faktoren?
- Welche Rolle spielt die Influenza Virus-induzierte JNK Aktivierung für die virale
Replikation?
- Welche virale Komponente ist für die JNK Aktivierung verantwortlich?
- Resultiert die Influenza Virus-induzierte JNK Aktivierung auch gleichzeitig in der
Expression potenter Zytokine wie IFNβ?
Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit bestand in der Charakterisierung der
Signalmechanismen, die zu einer Influenza Virus-induzierten Aktivierung von IRF-3 führen.
23
1. Einleitung
Die Virus-induzierte IRF-3 Aktivierung wird durch C-terminale Virus-abhängige
Phosphorylierung über eine bisher unidentifizierte Virus-aktivierte Kinase weitergeleitet.
Zahlreiche, gut charakterisierte pharmakologische Inhibitoren sind nicht in der Lage, IRF-3
Phosphorylierung zu blockieren, weshalb die Beteiligung eines neuen Signalweges an der
IRF-3 Regulation nahe liegt (Servant et al., 2001).
Aufgrund dieser mangelnden Erkenntnisse über viral induzierte Mechanismen der IRF-3
Aktivierung sollten Signalkomponenten identifiziert werden, welche die Influenza Virus- und
Doppelstrang-RNA-induzierte Aktivierung vermitteln.
Virus-Infektion
MKK4/
SEK
?
?
?
MKK7
JNK
IKK
p5 0 p6 5
IkB
IkB
p5 0 p6 5
c-Jun ATF2
IRF3
HMGI (Y)
PRD IV
IRF3
p65
p50
HMGI (Y)
PRD III-I
PRD II
Abb. 1.4.: Influenza Virus-induzierte Signalwege, die das IFNβ-Enhanceosom induzieren
24
2. Material
2. Material
2.1 Besondere Geräte
Brutschränke, Inkubatoren
Heraeus (Hanau)
EMSA-Gel Apparatur
MSZ (Würzburg)
Geltrockner
BioRad (München)
Minizentrifugen
Eppendorf Centrifuge 5417C und R (kühlbar)
Eppendorf (Hamburg)
Megazentrifugen
Sorvall Zentrifuge RC5B
Du Pont (Bad Homburg)
Megafuge 1.0R
Heraeus (Hanau)
Protein-Gel Apparatur, Blotting Apparatur
BioRad (München)
Spektral-Photometer Hitachi U2000
Jouan GmbH (Unterhaching)
Phosphoimager Fujix Bas-2000 II + Software Tina 2.09d Raytest Isotopenmessgeräte GmbH
(Staubenhardt)
Vortex-Gerät
Roth (Karlsruhe)
Mikroskope : Leitz DM RB (Fluoreszenz)
Leitz (Wetzlar)
Leitz DM IL (Zellkultur-Routine)
Leitz (Wetzlar)
Sterilbank Lamin Air HB2448
Heraeus (Hanau)
Szintillationszähler Wallac 1410
Amersham (Little Chalfont)
FACSCalibur
Becton Dickinson (San Jose)
Microlumat LB96P
Berthold-Technologies GmbH
(Bad Wildbad)
25
2. Material
2.2 Chemikalien und Reagenziensätze
Acrylamid (30%), Bisacrylamid (0,8%)
Roth (Karlsruhe)
Adenosin-5´Triphosphat (ATP)
Sigma (St. Louis)
Agar-Agar
Roth (Karlsruhe)
Agarose
AGS (Heidelberg)
Ammoniumpersulfat (APS)
Roth (Karlsruhe)
Ampicillin
Sigma (St. Louis)
Aprotinin
Roth (Karlsruhe)
BioRad Protein Assay-Stammlösung
BioRad (München)
Bovines Serumalbumin (BSA)
Dianova (San Diego)
Bromphenolblau
Sigma (St. Louis)
Dimethylsulfat (DMSO)
Sigma (St. Louis)
Dithiotreitol (DTT)
Roth (Karlsruhe)
DNA-Längenstandardmarker (1 kb-Marker)
Sigma (St. Louis)
Ethanol
Roth (Karlsruhe)
Ethidiumbromid 1% Lösung
Roth (Karlsruhe)
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Sigma (St. Louis)
Gluthation Sepharose B4
Sigma (St. Louis)
Glycerin
Roth (Karlsruhe)
Glycin
Roth (Karlsruhe)
Harnstoff
Roth (Karlsruhe)
HEPES
Roth (Karlsruhe)
Isopropanol
Roth (Karlsruhe)
Kaliumacetat
Roth (Karlsruhe)
Leupeptin
Serva (Heidelberg)
D-Luziferin
Applichem (Darmstadt)
26
2. Material
Magnesiumacetat
Sigma (St. Louis)
Natriumchlorid (NaCl)
Roth (Karlsruhe)
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Roth (Karlsruhe)
Natriumhydroxid
Roth (Karlsruhe)
Natriumorthovanadat
Sigma (St. Louis)
Natriumpyrophosphat
Sigma (St. Louis)
Nitrozellulose
Schleicher & Schüll (Dassel)
10x Phosphat gepufferte Lösung (PBS)
Gibco BRL (Paisley)
Pefablock
Roth (Karlsruhe)
Poly (d(I-C))
Boehringer (Mannheim)
Protein A-Agarose
Boehringer (Mannheim)
Protein A-Peroxidase (-POD)
Amersham (Little Chalfont)
Protein – Längenmarker (vorgefärbt, SDS-7B)
Sigma (St. Louis)
Röntgenfilme
Amersham (Little Chalfont)
Radiochemikalien
Amersham (Little Chalfont)
Salzsäure
Roth (Karlsruhe)
TEMED
Calbiochem (Bad Soden)
Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan (Tris)
Roth (Karlsruhe)
Triton X-100
Sigma (St. Louis)
Whatman 3 MM Papier
Schleicher & Schüll (Dassel)
Allgemeine Labor-Chemikalien
Merck (Darmstadt)
Roth (Karlsruhe)
SERVA (Heidelberg)
27
2. Material
2.3 Zellkulturmaterial
Agar
Oxoid GmbH (Wesel)
Dulbecco´s modified eagle medium (DMEM)
Gibco BRL (Paisley)
Fötales Rinderserum (FBS)
PAA (Linz)
L-Glutamin
Gibco BRL (Paisley)
10x MEM
Gibco BRL (Paisley)
7,5% NaHCO3
Gibco BRL (Paisley)
Penicillin/Streptomycin
Gibco BRL (Paisley)
RPMI 1650
Gibco BRL (Paisley)
Trypsin-EDTA
Gibco BRL (Paisley)
Trypanblau
Gibco BRL (Paisley)
Zellkulturschalen und -flaschen
Sarstedt (Nümbrecht)
SB202190
Calbiochem
(Beeston, Nottingham)
Amantadin
Sigma (St. Louis)
TPA-Phorbolester
Sigma (St. Louis)
Clostridales Toxin B (TcdB-10436)
Prof. Dr. von Eichel-Streiber
(Mainz)
Natrium-meta-Arsenit
Sigma (St. Louis)
28
2. Material
2.4 Antikörper und Antiseren
Antikörper/Antiseren
Antigen
Referenz/Herkunft
anti-ERK-2 (C-14) G
ERK-2
Santa Cruz (Heidelberg)
anti-JNK-1 (C-17)
JNK-1
Santa Cruz (Heidelberg)
anti-c-Jun/AP-1 (D)
c-Jun/AP-1
Santa Cruz (Heidelberg)
anti-ATF-2 (N-96)
ATF-2
Santa Cruz (Heidelberg)
anti-HA12CA5
HA
MSZ (Würzburg)
anti-IRF-3
IRF-3, phospho. IRF-3
Zytomed GmbH (Berlin)
anti-phospho-ATF-2
phospho. ATF-2
New England Biolabs (Frankfurt)
anti-GST
GST
MSZ (Würzburg)
anti-phopho-c-Jun (KM-1)
phospho. c-Jun
Santa Cruz (Heidelberg)
anti-NP
NP
Webster R. (Memphis)
anti-Rac1
Rac1
Santa Cruz (Heidelberg)
anti Maus gekoppelte Peroxidase (POD)
Amersham (Little Chalfont)
Protein-A gekoppelte Peroxidase
Roche, Molecular Biochemicals
(Mannheim)
Protein-A gekoppelte Agarose-Kügelchen
Roche, Molecular Biochemicals
(Mannheim)
Protein-G gekoppelte Agarose-Kügelchen
Roche, Molecular Biochemicals
(Mannheim)
Substratproteine „myelin basic protein“
Sigma (St. Louis)
29
2. Material
2.5 Virus-Stämme
Humaner Influenza Virus A/Asia/57 (H2N2) (Asia)
Pleschka S. (Giessen)
Aviärer Influenza Virus A/Bratislava/79(H7N7) (FPV)
Pleschka S. (Giessen)
Humaner Influenza Virus A/Puerto-Rico/8/34 (PR8)
Wolff T. (Berlin)
Humane Influenza Virus Mutante delNS1
Wolff T. (Berlin)
2.6 Enzyme
Restriktionsenzyme
Roche (Molecular Biochemicals)
Eurogentech (Seraing)
New England Biolabs (Frankfurt)
RNase I
Roche (Molecular Biochemicals)
(Mannheim)
2.7 Reagenzienansätze (Kits)
ECL Western blotting detection reagents
Amersham (Little Chalfont)
Nucleobond PC 500 Kit
Machery und Nagel
G-25 Sephadex Quickspin Säulen
Roche (Molecular Biochemical)
(Mannheim)
NucleoSpin Extract - Kit
Machery und Nagel (Feucht)
Abi Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit
Perkin Elmer (Netherlands)
30
2. Material
2.8 Plasmide
AP-1 (5x TRE)
Angel, P. (Heidelberg), Angel et al., 1987
IFNβ-luc
Hiscott, J. (Montreal), Leblanc et al.,1990
TATA-luc
Lee et al., 1997
4x IRF-3
MSZ - Christina Ehrhardt
PRD IV
PRD III-I
PRD II
5´ agcttgaaaactgaaagggagaagtgaaagtggggaaaactgaaagggagaagtgaaagtggg 3´
5´gaaaactgaaagggagaagtgaaagtggggaaaactgaaagggagaagtgaaagtgg 3´
Hind III
Ssp I
Sal I
BamH I
Xho I
Nar I
4x
Nar I
large T
poly A
Bcl I
Xmn I
Xcm I
Pvu I
Fsp I
luc+
bla
(A mp. res.)
Bgl I
Bsal
pTATALUC+
4x IRF3
lat e
poly A
EcoO10 9
Fse I
Cla/S ma I/K pn I/ Sac I
Alw NI
Pvu II
Abb. 2.1: Klonierungskarte: Die IRF-3 Bindungssequenz aus dem IFNβ-Promotor wurde vervierfacht und in die
Hind III/Nar I-Schnittstelle des TATA-luc Vektors (Lee et al., 1997) kloniert.
31
2. Material
pSRSPA, pKRSPA
Dorn et al., 1990
KRSPA MKK7 K>M
Kracht, M. (Hannover), Holtmann et al., 1999
KRSPA SAPKβ KK>RR
MSZ (Würzburg), Ludwig et al., 1996
KRSPA flag JIP1
Dickens et al., 1997
SRSPA Tam 67
MSZ (Würzburg) verändert nach:
Brown et al., 1994
KRSPA ERK 2 B3
MSZ (Würzburg), Ludwig et al., 1996
KRSPA ERK 2 C3
MSZ (Würzburg), Ludwig et al., 1996
KRSPA Raf C 4B
MSZ (Würzburg), Bruder et al.,1992
pEBG
Zon, L. (Boston), Sanchez et al., 1994
pEBG SAPKβ KK>RR
MSZ (Würzburg), Ludwig et al., 1996
pEBG SEK1 K>R
Sanchez et al., 1994
pCDNA
Invitrogen (Karlsruhe)
pCDNA p38 AF
Han, J. (La Jolla), Zhang et al., 1995
pCDNA MKK6
Davis, R. (London), Raingeaud et al., 1996
pCS3MT-MKK7 wt
Kracht, M. (Hannover), Holland et al., 1997
pGreenLantern
Life Technologies (Karlsruhe)
pLDNA3-NS1
Wolff, T. (Berlin), Wolff et al., 1996
pEGFP-IRF-3 wt
Hiscott, J. (Montreal), Hiscott et al., 1999
pEGFP-IRF-3 5A
Hiscott, J. (Montreal), Hiscott et al., 1999
pEGFP-IRF-3 5D
Hiscott, J. (Montreal), Hiscott et al., 1999
pRK5
Hall, A. (London), Ridley et al., 1992
pRK5 Rho wt
Hall, A. (London), Ridley et al., 1992
pRK5 Rho N19
Hall, A. (London), Ridley et al., 1992
pRK5 Rac wt
Hall, A. (London), Ridley et al., 1992
pRK5 Rac N17
Hall, A. (London), Ridley et al., 1992
pRK5 cdc42 wt
Hall, A. (London), Ridley et al., 1992
32
2. Material
pRK5 cdc42 N17
Hall, A. (London), Ridley et al., 1992
pHMG
Pleschka, S. (Giessen), Pleschka et al., 1996
pHMG PB1
Pleschka, S. (Giessen), Pleschka et al., 1996
pHMG PB2
Pleschka, S. (Giessen), Pleschka et al., 1996
pHMG PA
Pleschka, S. (Giessen), Pleschka et al., 1996
pHMG NP
Pleschka, S. (Giessen), Pleschka et al., 1996
pHMG PolI GFP
Pleschka, S. (Giessen), Pleschka et al., 1996
pHMG PolISAP
Pleschka, S. (Giessen), Pleschka et al., 1996
pGEX T-PBD (PAK beta = PAK 3, für
Kardinal, C. (Hannover), Benard et al., 1999
Rac1 und cdc42)
2.9 Zellen
2.9.1 Bakterien
•Stamm E.coli DH5α
2.9.2 Eukaryotische Zellinien
•U937 Monozyten.Die Zell-Linie stammt aus einem humanen histiocytischen Lymphom
(Sundstrom et al., 1976).
•A3.01 T-Zellen. Die Zell-Linie stammt von einem vier Jahre alten kaukasischen Mädchen
mit akuter lymphoblastischer Leukämie (Folks et al., 1985)
•Cos7-Zellen
•HeLa Zellen (human cervical carcinoma)
•MDCK Zellen (Madin-Darby cacine kidney)
•HEK293 Zellen (human embryonic kidney)
33
3. Methoden
3. Molekularbiologische Standardmethoden
Allgemeine molekularbiologische Standardmethoden wurden nach Sambrook (Sambrook et
al., 1989) durchgeführt.
3.1 Arbeiten mit Bakterien
3.1.1 Übernachtkulturen
Circlegrow- (CG-) Medium (40 g/l ddH2O) wurde autoklaviert und nach Abkühlung mit 100
µg/ml Ampicillin versetzt. 3 ml dieses ampicillinhaltigen CG-Mediums wurden mit einer
Bakterienkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C geschüttelt.
3.1.2 Glycerindauerkulturen
0,6 ml Bakteriensuspension wurden mit 300 µl 80% Glycerin versetzt, in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei –70°C gelagert.
3.1.3 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien
5 ml einer Übernachtkultur E.coli DH5α, herangezogen in CG-Medium ohne Antibiotika,
wurden mit ebenfalls antibiotikafreiem CG-Medium 1:100 verdünnt und bei 37°C geschüttelt
bis eine OD550 von 0,5 erreicht war. Nach Abkühlung für 30 min auf Eis zentrifugierte man
die Zellen in sterilen Plastikbechern ab (10 min, 4°C, 2500 rpm, JA14-Rotor). Das Pellet
wurde in 40 ml eiskaltem, sterilem 0,1 M CaCl2 aufgenommen, 15 min auf Eis inkubiert und
erneut abzentrifugiert. Daraufhin erfolgte die Resuspendierung der Zellen in 15 ml eiskaltem
0,1 M CaCl2 und weitere 15-minütige Inkubation auf Eis. Die Suspension wurde mit 2,5 ml
eiskaltem Glycerin versetzt, in 200 µl Aliquots in Mikroreaktionsgefäßen in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei –70°C gelagert. Die Bestimmung der Transfektionsrate
erfolgte mittels verschiedener Konzentrationen von Plasmid-DNA, (siehe 3.2.1).
34
3. Methoden
3.2 Arbeiten mit DNA
Plasmid-DNA, die für Anwendungen, wie in vitro-Transkription und Transfektion von Zellen
benötigt wurde, musste zunächst in entsprechender Menge und Reinheit isoliert werden. Dazu
wurden kompetente Bakterien mit der entsprechenden Plasmid-DNA transformiert (3.2.1),
plasmidtragende Einzelkolonien klonal expandiert und die erforderliche Menge an PlasmidDNA durch Mini- oder Maxipräparation gewonnen. Anschließend wurde die DNA durch
Restriktionsverdau (3.2.5) und nachfolgende Gelelektrophorese (3.2.4), wenn notwendig auch
durch Sequenzierung (3.2.8) überprüft.
3.2.1 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien
Transformation von Plasmid-DNA in kompetente DH5α-Bakterien erfolgte mittels
Hitzeschocktransformation nach Sambrook (Sambrook et al., 1989). 1 µg der Plasmid-DNA
wurde mit 25 µl der kompetenten Bakterien für 20 min auf Eis inkubiert. Daraufhin erfolgte
ein Hitzeschock für 90 s bei 42°C und weitere Inkubation auf Eis für 1-2 min. Nach Zugabe
von 500 µl antibiotikafreiem CG-Medium zu der Bakteriensuspension wurde das Gemisch für
45 min bei 37°C geschüttelt. Die Selektion plasmidtragender Bakterienkolonien wurde durch
Ausplattierung auf antibiotikahaltige CG-Agarplatten und anschließendes Anlegen von
Übernachtkulturen, die jeweils eine Einzelkolonie enthielten, erreicht. Die Herstellung der
antibiotikahaltigen Agarplatten erfolgte, indem autoklaviertes 1,4%iges Agar-Agar/CGMedium nach Abkühlung, bei circa 56°C, abhängig vom Selektionsmarker mit 100 µg/ml
Ampicillin bzw. Kanamycin versetzt wurde.
Bei Transformation eines Ligationsansatzes setzte man jeweils 100 µl kompetente Bakterien
und 10 µl des jeweiligen Ligationsansatzes ein. Die weitere Behandlung erfolgte wie bereits
angegeben.
35
3. Methoden
3.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA
Minipräparationen von Plasmid-DNA wurden modifiziert nach der Methode der alkalischen
Lyse von Birnboim und Doly (Birnboim et al., 1979) durchgeführt. Hierzu wurden 1,5 ml
einer Übernachtkultur (siehe 3.1.1) in einem Mikroreaktionsgefäß abzentrifugiert (1 min,
15000 rpm, Raumtemperatur). Sämtliche weiteren Zentrifugationsschritte erfolgten ebenfalls
bei 15000 rpm und Raumtemperatur. Das Pellet resuspendierte man in 100 µl Puffer 1 (50
mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNAse A), fügte 200 µl Puffer 2 (1% SDS,
0,2 N NaOH) hinzu und vermischte den gesamten Ansatz durch Kippen. Daraufhin erfolgte
eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Zur Neutralisation dieses Ansatzes wurden
150 µl Puffer 3 (3 M HAc/KAc) hinzugegeben und die Durchmischung wurde durch
mehrmaliges Kippen erreicht. Es folgte eine weitere 2-minütige Inkubation bei
Raumtemperatur und 4-minütige Zentrifugation. Die DNA-Fällung erfolgte indem der
Überstand mit 900 µl eiskaltem 100%igem Ethanol versetzt, 10 min bei –70°C gelagert und 8
min zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet mit 180 µl
70%igem Ethanol gewaschen und abzentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes trocknete
man das Pellet, löste dieses in 20-30 µl Tris-Puffer (10 mM) und lagerte es kurzzeitig bei 4°C
bzw. längerfristig bei –20°C.
3.2.3 Maxipräparation von Plasmid-DNA
Maxipräparationen von Plasmid-DNA wurden nach dem Protokoll der Firma Machery und
Nagel (Nucleobond PC 500 Kit) durch Reinigung über Anionenaustauschersäulen
durchgeführt. Am Ende der Purifikationsschritte wurde die gefällte DNA je nach Größe des
Pellets in einem adequaten Volumen Tris-Puffer (10 mM Tris-HCL in Wasser)
aufgenommen, photometrisch vermessen und durch Verdünnung mit ddH2O auf 1 µg/µl
eingestellt. Kurzzeitige Lagerung der DNA-Lösungen erfolgte im Kühlschrank bei 4° C, sonst
bei –20° C.
36
3. Methoden
3.2.4 Agarose-Gelelektrophorese
Linearisierte DNA-Moleküle lassen sich aufgrund der negativen Ladung ihres
Phosphatrückgrades mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese der Größe entsprechend
auftrennen. Die Wanderungsgeschwindigkeit linearer Moleküle im elektrischen Feld zur
Anode, ist wegen des Widerstandes der Agarose-Gelmatrix umgekehrt proportional dem
Logarithmus ihrer Länge. Durch den Vergleich mit einem DNA-Längenstandard (z.B. 1 kb
Leiter) ist die Länge der DNA zu ermitteln.
In der Regel wurden 1%ige Agarose-Gele verwendet; falls die aufzutrennende DNA
besonders klein war, verwendete man höherprozentige Gele. Das Agarosepulver wurde mit
TAE (pH 7.8; 40 mM Tris-HCl, 40 mM Eisessig, 2 mM EDTA) gemischt und unter Kochen
aufgelöst. Nach kurzer Abkühlung gab man 1 µl Ethidiumbromid-Stammlösung pro 100 ml
hinzu.
Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in der Lage ist sich sequenzspezifisch in die
DNA-Doppelhelix einzulagern und die einzelnen Fragmentbanden im UV-Licht sichtbar zu
machen.
Die Agaroselösung wurde in abgedichtete Gelschlitten gegossen und ein Kamm blasenfrei
eingesetzt. Nach Polymerisation bei Raumtemperatur setzte man den Gelschlitten in eine mit
1x TAE aufgefüllte Elektrophoresekammer. Die mit Probenpuffer (40% w/v Saccharose, 0,25
w/v Bromphenolblau, 0,25 w/v Xylencyanol) versetzten DNA-Gemische und DNALängenmarker wurden in die Taschen geladen. Der Gel-Lauf erfolgte bei einer konstanten
Spannung von 100 V. Abschließend wurden die aufgetrennten Fragmente unter UV-Licht
ausgewertet und photographiert.
3.2.5 Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA
Restriktionsenzyme vom Typ II erkennen palindromische Nucleotidsequenzen in der DNA
(meist 4–8 bp lang) und spalten die DNA innerhalb dieser Sequenzen hydrolytisch, unter
Erzeugung stumpfer oder überhängender Enden. In einer Restriktionsanalyse wird DNA in
37
3. Methoden
definierte Fragmente zerlegt, die in Klonierungsexperimente eingesetzt oder deren Längen
analysiert werden können.
Ein Reaktionsansatz enthielt den enzymspezifischen Puffer, die zu schneidende DNA, das
Enzym (1 Unit Enzym schneidet ca. 1 µg superspiralisierte Plasmid-DNA) und Wasser.
Für einen analytischen Verdau setzte man ein Reaktionsvolumen von 20 µl und eine DNAMenge von 200-500 ng ein, die während der Inkubation im Heizblock (1 h, 37°C) gespalten
wurde.
Für einen präparativen Verdau wurde ein Reaktionsvolumen von 100 – 150 µl und eine DNAMenge von 5-10 µg eingesetzt, die wie oben beschrieben behandelt wurde.
Um eine Religation eines geschnittenen Vektors zu verhindern, der zu einer Ligation
eingesetzt werden sollte, wurde eine sogenannte Calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP)Reaktion durchgeführt, während der die DNA dephosphoryliert wurde. Hierzu wurden infolge
eines Restriktionsverdaus 2 µl der alkalischen Phosphatase zugegeben und der gesamte
Ansatz weitere 30 min bei 37°C inkubiert.
Nach Zugabe des Ladepuffers wurde der Restriktionsverdau gestoppt.
3.2.6 DNA-Elution aus Agarosegelen
DNA wurde aus Agarosegelen (1-2%) nach dem Protokoll der Firma Machery und Nagel
mittels Anionenaustauschersäulen und Lösungen des NucleoSpin Extract-Kits eluiert.
3.2.7 Ligation
Zur Konstruktion eines rekombinierten DNA-Moleküls ist die Verknüpfung des
Vektormoleküls mit der DNA, die man klonieren möchte notwendig. Diesen Vorgang
bezeichnt man als Ligation, und das Enzym, das ihn katalysiert, heißt DNA-Ligase.
Für eine Klonierung wurde der bereits geschnittene, dephosphorylierte und aus einem
Agarosegel aufgereinigte Vektor mit dem Insert meist im molaren Verhältnis 1:5
zusammengebracht. Das Volumen eines Ligaseansatzes betrug 20 µl bestehend aus Vektor,
38
3. Methoden
Insert, 10x T4-Ligasepuffer, T4 Ligase und ddH2 O. Dieser Ansatz wurde bis zur
Retransformation in Bakterien 14-24 h bei 16°C inkubiert.
3.2.8 Sequenzierung von DNA
Sequenzierungen wurden alle unter Verwendung des Abi PrismTM Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin Elmer nach der Methode von Sanger et. al.
(Sanger et al., 1977) durchgeführt. Statt radioaktiv markierter Didesoxynukleosidtriphosphate
(ddNTPs) wurden jedoch unterschiedlich fluoreszierende ddNTPs eingesetzt. Als Template
wurde ausschließlich über Anionentauscher-Säulen gereinigte DNA aus Agarosegelen oder
Maxipräpaparations-DNA verwendet. Die eingesetzte DNA-Menge betrug 500 ng bis 1 µg,
die Primermenge 10 pmol; von allen anderen Reagenzien wurden die Mengen eingesetzt, die
in der Anleitung des Herstellers empfohlen werden. Die Durchführung der Sequenzierung
erfolgte genau nach Anweisung und wurde als Service des Institutes für Medizinische
Strahlenkunde und Zellforschung, Würzburg von R. Krug übernommen.
3.2.9 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen
Die Konzentration einer DNA-Lösung konnte näherungsweise bestimmt werden, indem die
Intensitäten der Banden der DNA-Probe und einer Probe bekannter DNA-Konzentration in
einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel verglichen wurden. Genauere Bestimmung der
Konzentration verdünnter DNA-Lösungen erfolgte spektralphotometrisch durch Messung der
Absorption bei 260 nm. Dabei entspricht eine optische Dichte (OD) von 1 bei
doppelsträngiger DNA 50 µg/ml, so dass sich durch Multiplikation der gemessenen OD mit
dem Verdünnungsfaktor die Konzentration der DNA-Lösung errechnen lässt. Der Quotient
aus OD260:OD280 stellt ein Maß für die Reinheit der DNA dar und sollte zwischen 1,8-2,0
betragen.
39
3. Methoden
3.3 Zellkultur
Alle Arbeiten wurden unter Laminatluftfluß (Heraeus, Laminair, Sicherheitsstufe 2) mit
autoklavierten oder sterilfiltrierten Lösungen, sterilen Kunststoffmaterialien oder
autokalvierten Glaswaren und unter Verwendung steriler Nährmedien durchgeführt.
Sämtliche Zell-Linien wurden bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeit gehalten.
Zentrifugation der Zellen fand bei Raumtemperatur und 1000 rpm (Heraeus, Megafuge) statt.
3.3.1 Haltung von Suspensionszellen (U937)
U937 Zellen wurden in RPMI 1640 supplementiert mit 10% FBS, 100 µg/ml
Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin kultiviert.
RPMI 1640 ist ein Medium, dem Phenolrot beigemischt ist, das bei starker Ansäuerung durch
zu viele Zellen den pH-Wert durch eine Gelbfärbung anzeigt. Nach 3-5 Tagen wurden die
Zellen in einem Verhältnis von 1:10 – 1:20 gesplittet und mit frischem Medium versehen.
3.3.2 Haltung von adhärenten Zellen (HEK293)
HEK293 Zellen wurden in DMEM supplementiert mit 10% FBS, 100 µg/ml
Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin kultiviert. DMEM ist Phenolrot beigemischt,
das bei starker Ansäuerung durch zu viele Zellen den pH-Wert durch eine Gelbfärgung
anzeigt.
Diese adhärenten Zellen wurden bei einem Konfluenzgrad von etwa 70-90% in einem
Verhältis von 1:3 bis 1:6 passagiert. HEK293 Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und
durch 3- bis 5-minütige Inkubation mit 1x Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) aus der
Kulturflasche gelöst. Nach Ablösung der Zellen erfolgte die Aufnahme der Zellen in frischem
Medium und Aussaat in neue Kulturflaschen.
40
3. Methoden
3.3.3 Haltung von adhärenten Zellen (MDCK)
Die adhärenten MDCK Zellen wuchsen in Kultur in 1x MEM supplemiert mit 10% FBS, 10%
Penicillin/Streptomycin und 0,2% NaHCO3 . Nach 3-5 Tagen erfolgte bei einem
Konfluenzgrad von etwa 80-90% die Passagierung der MDCK Zellen in einem Verhältnis
von 1:8 bis 1:15. Diese adhärenten Zellen stellen ihr Wachstum aufgrund von
Kontaktinhibition bei einem Konfluenzgrad von 90-100% ein. MDCK Zellen wurden einmal
mit PBS gewaschen und durch 10- bis 15-minütige Inkubation im CO2-Brutschrank (37°C)
mit 1x Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) aus der Kulturflasche gelöst. Nach Ablösung der Zellen
erfolgte die Aufnahme der Zellen in frischem Medium und Aussaat in neue Kulturflaschen.
3.3.4 Einfrieren, Lagerung und Rekultivierung von eukaryotischen Zellen
Es besteht die Möglichkeit eukaryotische Zellen über lange Zeiträume, gelöst in Anwesenheit
von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) in flüssigem Stickstoff tief zu frieren. Hierbei gilt die
Faustregel: Zellen langsam einfrieren und schnell auftauen.
Zum Wegfrieren wurden adhärente Zellen einmal mit PBS gewaschen und durch Inkubation
mit Trypsin/EDTA (0,05%/0,02%) von den Kulturflaschen gelöst und daraufhin mit einer
äquivalenten Menge 10% igem PBS/FBS versetzt. Sowohl adhärente, als auch Suspensions
Zellen wurden abzentrifugiert und in 1 ml Einfriermedium bestehend aus 10% DMSO, 10%
FBS und 80% des jeweiligen Kulturmediums aufgenommen. Es wurden 2x 106 – 1x 107
Zellen eingefroren, damit nach dem Auftauen ausreichend Zellen für eine T75-Flasche zur
Verfügung standen.
Zunächst erfolgte die Lagerung der Zellen über Nacht in einer
Styroporbox bei –70°C. Zur endgültigen Lagerung wurden die Aliquots am nächsten Tag in
flüssigen Stickstoff überführt.
Zur Rekultivierung der Zellen wurden diese so schnell, wie möglich in einem Wasserbad bei
37°C aufgetaut und direkt in 15 ml vorgewärmtem Medium verdünnt, abzentrifugiert, in
frischem Medium aufgenommen und auf Kulturflaschen verteilt. Handelte es sich um
41
3. Methoden
adhärente Zellen wurden diese, um alle toten Zellen zu entfernen, am darauffolgenden Tag
einmal mit PBS gewaschen und mit frischem Medium versehen.
3.3.5 Transiente Transfektion von U937 Monozyten mit DMRIE-C Reagenz
Mittels Transfektion ist es möglich Plasmid-DNA z.B. Reporterkonstrukte oder
Expressionsplasmide in eukaryotische Zellen einzubringen. Das Transfektionsreagenz
DMRIE ist ein kationisches Lipid, das spontan mit der DNA interagiert, um DNA-LipidKomplexe zu bilden.
Für die Transfektion sollten sich die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase befinden,
was durch Passagierung der Zellen am Vortag im Verhältnis 1:3 erreicht wurde.
Am Tag der Transfektion mischte man die zu transfizierende DNA (Gesamtmenge 2,6 µg 3,9 µg) in einem Reaktionsgefäß und inkubierte diese bei Raumtemperatur bis zur
Weiterverwendung. Das Verhältnis der DNA des Reporters zur Kinase bzw. zum Füllvektor
betrug bei einer Kotransfektion mit einem Promotor-Reporter-Konstrukt circa 1:4 (0,6 µg
Reporter und 2 µg Kinase).
Im folgenden wurden 0,3–0,5 ml OPTI-MEM pro Ansatz hinzugegeben und die Mischung bei
Raumtemperatur 30 min inkubiert, damit sich Lipid-DNA-Komplexe ausbilden konnten.
Während dieser Inkubationszeit erfolgte die Zentrifugation der Zellen (1000 rpm,
Raumtemperatur, 5 min), darauffolgende Resuspendierung in frischem serum- und
antibiotikafreiem Medium und Einstellung der Zellzahl von 1x 106 Zellen/ml. Serum hätte die
Aufnahme der DNA-Lipidkomplexe in die Zelle verhindert. Sowohl der DNA-OPTI-MEM
Ansatz, als auch je 0,5 ml der eingestellten Zellen wurden auf 6-Well Platten verteilt. Die
Zugabe von 200 µl Medium-FBS-Mischung pro Ansatz erfolgte nach einer Inkubation von 5
h im 37°C CO2-Inkubator, so dass die Endkonzentration 3% FBS enthielt. Die FBSKonzentration musste niedrig gehalten werden, damit sich die Zellen nach der Transfektion
nicht mehr teilen, aber dennoch Protein exprimieren konnten. Anschließend wurden die
42
3. Methoden
Zellen im CO2-Brutschrank, abhängig von weiteren Behandlungsschritten, für 12-36 h
inkubiert.
3.3.6 Transiente Transfektion von HEK293 Zellen mit CaCl2
Um Vektor-DNA in HEK293 Zellen einzuschleusen, wurde die Calcium-Präzipitationsmethode durchgeführt, die darauf basiert, dass die DNA als Kopräzipitat mit
Calciumphosphat von den Zellen aufgenommen wird.
Zunächst wurden 5 µg DNA mit 450 µl H2O (Sigma) in einem Transfektionsröhrchen
vermischt. Daraufhin fügte man 50 µl 2,5 M CaCl2 der DNA zu und 500 ml 2x BBS (50 mM
BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4 x H2O) wurden unter Vortexen zugegeben.
Die Bildung der Präzipitate erfolgte während der Inkubationszeit von circa 20 min und war
durch eine leichte Trübung der Lösung sichtbar. Bevor je 1 ml Transfektionsansatz zu den
Zellen gegeben wurde, musste die Lösung erneut gemischt werden. Nach Inkubation bei 37°C
im CO2-Brutschrank für 6-14 h wurden die Zellen 2x mit je 5 ml warmen PBS gewaschen und
mit neuem DMEM mit 0,3% FBS versehen. Die Zellen wurden für weitere 24-48 h im CO2Brutschrank inkubiert.
3.3.7 Transiente Transfektion von MDCK Zellen mit FuGENETM – Reagenz
Mit Hilfe des Nicht-Liposomalen FuGENETM–Reagenz war es möglich, relativ hohe
Transfektionsraten in MDCK Zellen zu erzielen, wobei nur geringe Zytotoxizität auftrat.
Zunächst wurden 94 µl serumfreies 1x MEM und 6 µl FuGENETM–Reagenz in ein
Transfektionsröhrchen gegeben. Es war darauf zu achten, dass das Transfektionsreagenz nicht
an die Wand des Röhrchens tropfte, sondern direkt in das Medium. Dieser Ansatz wurde 5
min bei Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden in einem zweiten
Transfektionsröhrchen 3 µg DNA (bei Kotransfektionen 1 µg Reporter und 2 µg Kinase)
vorgelegt und schließlich das FuGENETM /Medium Gemisch tropfenweise hinzugefügt. Der
Ansatz wurde leicht gemischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin
43
3. Methoden
überführte man den Ansatz tropfenweise zu den Zellen und inkubierte diese 24-48 h bei 37°C
im CO2-Brutschrank.
3.3.8 Transiente Transfektion von MDCK und HEK293 Zellen mit Lipofektamin 2000
In den mittels dem FuGENETM- oder CaCl 2 -Reagenz durchgeführten transienten
Transfektions-Experimenten wurden Transfektionseffiziensen von nicht mehr als 10-30%
erreicht. Allerdings sind für einige Experimente hohe, konstante, Transfektionsraten
notwendig, um reproduzierbare, aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Aus diesem Grund
wurde das kommerziell erhältliche Lipofektamin 2000 (L2000) (Gibco) eingesetzt. Das
Protokoll vom Hersteller wurde zur Transfektion von MDCK und HEK293 Zellen optimiert,
indem verschiedene DNA- und L2000-Mengen, wie auch unterschiedliche Zellzahlen in
ersten Transfektionsreihen getestet wurden. Die Besonderheit dieses Protokolls bestand darin,
dass eine hohe Anzahl von adhärenten Zellen in Suspension, in Abwesenheit von Antibiotika
durchgeführt wurde. Zur Transfektion eines einzigen 6-Wells wurden 10 µl des
Transfektionsreagenz L2000 unter Vortexen in 250 µl OPTI-MEM gegeben und 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden 2-3 µg DNA in 50 µl OPTI-MEM
aufgenommen und das L2000/OPTI-MEM Gemisch wurde ebenfalls unter Vortexen
beigefügt. Während der 15-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden die Zellen
nach Spülung mit PBS mittels Trypsin/EDTA (0,05%/0,02%) von der Platte gelöst,
abzentrifugiert, auf 1-2x 106 Zellen/ml Medium (ohne Antibiotika) eingestellt und in ein 6Well gegeben. Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgte die Zugabe des DNATransfektionsgemisches zu den Zellen und anschließende Inkubation im Brutschrank für circa
24 h bis zur Weiterverarbeitung. Zur Transfektion eines 24-Wells wurden sämtliche
Mengenangaben durch 4 geteilt und zur Transfektion einer 10 cm Schale mit 8 multipliziert.
Die Untersuchung der Transfektionsrate konnte nach Verwendung eines Vektors, der ein
grün-fluoreszierendes
Protein
(GFP)
kodiert,
wahlweise
im
FACS
bzw.
44
3. Methoden
Fluoreszenzmikroskop erfolgen. In MDCK-Zellen wurden mittels L2000 Transfektionsraten
von mehr als 60% (Abb. 3.1) erzielt.
A
Immunfluoreszenz - Analyse von transfizierten Zellen
Dunkelfeld
B
Hellfeld
Flow cytometry (FACS) - Analyse
0.0 %
0.5 %
1.4 %
59.6 %
0.6 %
98.9 %
0.7 %
38.9 %
Untransfizierte Zellen
Transfizierte Zellen
Abb. 3.1: MDCK Zellen wurden mit einem GFP Expressionsvektor mittels Lipofektamin 2000 und einem
optimierten Protokoll transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mittels Immunfluoreszenz
Mikroskop (40fache Vergrößerung) (A) und FACS analysiert (B).
3.3.9 Anzucht von Influenza Viren in embryonalen Hühnereiern
Influenza Viren lassen sich in embryonalen Hühnereiern relativ gut vermehren. Abhängig
vom eingesetzten Virus-Stamm verwendet man 10-14 Tage alte, bakterienfreie
Hühnerembryonen, die nach Beimpfung noch weitere 3-4 Tage wachsen. Bei Vervielfältigung
45
3. Methoden
des Stammes delNS1 dürfen die Hühnerembryonen nicht älter als 4-5 Tage alt sein und die
Viren sollten nicht länger als Tag 8 in diesen heranwachsen. Dem Influenza Virus-Stamm
delNS1 fehlt die kodierende Sequenz für das NS1 Protein, welches dem Interferonsystem der
Hühnerembryonen und somit der antiviralen Antwort entgegenwirken würde. Ist das
Interferonsystem schließlich vollständig in den Hühnerembryonen ausgebildet (Tag 8-9),
kann es diese Influenzaviren sofort vernichten, so dass diese Viren bereits geerntet sein
müssen, bevor dieser Fall eintritt.
Die Beimpfung der Hühnereier musste so steril, wie möglich erfolgen. Aus diesem Grund
wurden die Hühnereier zunächst mittels 70%igem Ethanol desinfiziert und alle zu
verwendeten Geräte (z.B. Eieröffner) mittels 70%igem Ethanol und Flamme gereinigt. Auf
der Unterseite der Hühnereier wurde vorsichtig, mittels Eieröffner ein kleines Loch durch die
Kalkschale gebohrt. Mit einer sterilen Kanüle (0,6 x 30 mm) wurden 100 µl der in PBS-BALösung (1 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 100 Units/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und
0,2% Bovines Serum Albumin (BA)) aufgenommenen Influenzaviren (1x 10-4 - 1x 10-5 Plaque
Forming Units) durch die Kalkschale in die Allantoishöhle injiziert. Es war bei diesem
Vorgang darauf zu achten, nicht den Embryo zu treffen und zu töten. Dies konnte durch
Kontrolle der Lage der Hühneremryonen unter einer starken Lichtquelle erfolgen. Letztlich
wurde das Loch in der Kalkschale mit Holzleim (Ponal) verschlossen und die Eier für 3-4
Tage im Inkubator (37°C, 70% Luftfeuchte) gelagert.
Sobald sich die Embryonen nicht mehr bewegten (unter einer starken Lichtquelle sichtbar)
bzw. nach 4 Tagen Virusinkubation und Tötung der Embryonen durch Haltung der Eier bei
4°C über Nacht, erfolgte die Virusernte. Auch diese musste so steril, wie möglich
durchgeführt werden. Mittels Löffel und Pinzette wurde die Kalkschale auf der Unterseite des
Eies geöffnet und die Hülle der Allantoishöhle entfernt. Die Allantoisflüssigkeit wurde mit
einer sterilen 10 ml-Pipette abgenommen, in sterile Röhrchen überführt und auf Eis gestellt.
Die Bestimmung der Viruspartikel erfolgte mittels Plaque-Assay (3.3.11). Die Influenza
Viren wurden bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
46
3. Methoden
3.3.10 Virale Infektion von Zellen
Bevor Zellen infiziert werden konnten, bereits transfiziert oder nicht, mussten diese 1-2x mit
PBS gewaschen werden, um das Serum zu entfernen, das die Infektion behindert hätte. Die
Viruslösung, die immer auf Eis zu halten war, wurde in PBS-BA-Lösung (1 mM MgCl2, 0,9
mM CaCl2, 100 Units/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,2% Bovines Serum
Albumin (BA)) verdünnt. Normalerweise wurden 5 MOI (multiplicity of infection) eingesetzt.
Die Infektionslösung wurde auf die Zellen gegeben und für 30 min bei 37°C im CO2Brutschrank inkubiert. Nach Ablauf der Zeit entfernte man die Infektionslösung und fügte
Medium-BA-Lösung (serumfreies Medium mit 0,2% BA und Antibiotika), dem
Ursprungsvolumen entsprechend, hinzu. Daraufhin erfolgte die weitere Inkubation im CO2Brutschrank bis zur Zellernte.
Wurde eine Infektion durchgeführt, um später die freigesetzte Menge an Viruspartikeln zu
untersuchen, wurde das oben aufgeführte Protokoll modifiziert angewendet. Zur Infektion
wurde entsprechend der Angaben 0,1-1 MOI des Influenza Virus eingesetzt und bevor die
Medium-BA Zugabe erfolgte, wurde ein zusätzlicher Waschschritt mit PBS durchgeführt, um
die nicht an Zellen gebundenen Viruspartikel zu entfernen.
3.3.11 Plaque-Assay
Zur Bestimmung der infektiösen Partikelanzahl in Viruslösungen wurden Plaque-Assays auf
MDCK Zellen durchgeführt. Die Infektion erfolgte unter Verwendung einer logarithmisch in
PBS-BA Lösung verdünnten Reihe der zu testenden Viruslösung, wie oben beschrieben. Nach
der 30-minütigen Inkubation im CO2-Brutschrank und Entfernung der Viruslösung wurde ein
Medium-Agar-Gemisch (8,5 ml ddH2O, 25 ml 2x MEM, 150 µl Bovines Albumin, 0,5 ml 1%
DEAE Dextran, 15 ml 2% Oxoid Agar) zu den Zellen gegeben, bis zur Erstarrung bei
Raumtemperatur gehalten und je nach Virusstamm (2-4 Tage) im CO2-Brutschrank inkubiert.
47
3. Methoden
Die Färbung der Plaques erfolgte mit einer Neutral-Rot-PBS-Lösung. 1-2 ml dieser Lösung
wurden auf den Agar getropft und bis zur deutlichen Sichtbarkeit der Plaques für 1-2 h
weiterhin im CO2-Brutschrank inkubiert.
3.4 Molekularbiologische Methoden – Proteine
3.4.1 Luziferase-Assay
Reportergene, z.B. Luziferase (luc) aus dem Leuchtkäfer Photinus pyralis oder die
Chloramphenicoltransferase (CAT) werden verwendet, um die Transkription bestimmter
Gene zu quantifizieren. Die regulatorische Sequenz des zu untersuchenden Gens wird dafür
vor die cDNA des Reportergens in einen promotorlosen Vektor kloniert. Das Genprodukt
dieses Konstruktes kann in einer cytologischen Färbung oder einem Enzym-Assay (z.B.
Luziferase-Assay) detektiert werden.
Der Luziferase-Aktivitätstest basiert darauf, dass Luziferase das Substrat Luziferin unter
Lumineszenzabgabe umsetzt, was quantitativ im Luminometer messbar ist. Dabei ist die
Lumineszenz direkt proportional zur Menge der Luziferase-Aktivität.
Zellen, die mit einem Promotor-Luziferase-Reporterkonstrukt und einer Kinase bzw. dem
Leervektor transfiziert waren, wurden nach 24-48 h geerntet und in 1,5 ml Röhrchen
überführt. Sämtliche Arbeitsschritte waren auf Eis durchzuführen, damit die in Wärme sehr
instabile Luziferase nicht inaktiviert werden konnte. Die Zellen wurden abzentrifugiert (7000
rpm, 4°C, 5 min) und einmal mit eiskaltem PBS gewaschen. Den Überstand saugte man ab
und das Pellet wurde in 100 µl Harvesting-Puffer (50 mM NaMES pH 7.8, 50 mM Tris-HCl
pH 7.8, 10 mM DTT 2% Trition X-100 125) resuspendiert. Das Detergenz Triton brach
durch Bindung an Membranproteine die Zellmembranen auf. Nach 30-minütiger Lyse auf Eis
erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt (14000 rpm, 4°C, 5 min), um verbliebene
Zelltrümmer zu sedimentieren. Man pipettierte 50 µl des Überstandes zusammen mit 50 µl
Assay-Puffer (125 mM NaMES pH 7.8, 125 mM Tris-HCl pH 7.8, 25 mM MgAc, 2 mg/ml
48
3. Methoden
ATP) in eine Vertiefung der 96-Well-Platte. Im Luminometer wurden 50 µl des Substrates
Luziferin automatisch auf die Vertiefungen verteilt und gleich darauf die Lumineszenz
gemessen (Angabe in Relative Light Units = RLU)
Um eventuellen Fehlern durch Verlust von Zellen bei der Transfektion oder beim LuziferaseAssay vorzubeugen, wurde der Proteingehalt gleicher Mengen an Zellysaten der
verschiedenen Ansätze im BioRad Protein-Assay miteinander vergleichen und die RLU auf
diese Daten standardisiert.
3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration im Photometer (BioRad-Protein-Assay)
Proteinkonzentrationen unbekannter proteinhaltiger Lösungen wurden mittels eines BioRadAssays im Photometer bestimmt.
Die absolute Proteinkonzentration einer unbekannten Lösung erhält man, wenn man eine
Messreihe mit einem Protein bekannter Konzentration durchführt. Der BioRad Protein-Assay
basiert auf der Beobachtung, dass das Absorptionsmaximum für eine saure Lösung von
Coomassie Brilliant Blue G-250 nach Bindung an ein Protein von 465 nm (braun) nach 595
nm (blau) verschoben wird. Die Amplitude der Absorption bei 595 nm ist der Menge an
Protein in einem großen Bereich direkt proportional.
1 ml verdünnte BioRad Lösung (1:5 Stammlösung:H2O) wurde mit der zu messenden Menge
an Proteinlösung gemischt und nach 5 min in Plastikküvetten im Photometer bei 595 nm
gemessen. Die Mischung war für 60 min stabil.
3.4.3 Immunpräzipitation
Die zu erntenden Zellen wurden in PBS gewaschen, mittels Triton-Lysis Puffer (TLB) (20
mM Tris-HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 50 mM
Sodium Glycerophosphat, 20 mM Sodium Pyrophosphat, 5 µg/ml Aprotinin, 5 µg/ml
Leupeptin, 1 mM Sodium Vanadat, 5 mM Benzamidin) lysiert, mindestens 20 min auf Eis
inkubiert und schließlich zentrifugiert (14000 rpm, 10 min, 4°C). Daraufhin überführte man
49
3. Methoden
den Überstand in ein neues Eppendorf Röhrchen, bestimmte photometrisch die
Proteinkonzentration und stellte die Ansätze auf eine bestimmte Gesamtproteinmenge ein.
Jedem Ansatz wurden 25 µl Protein A-Agarose (bei Maus- und Kaninchen-Antikörpern) bzw.
G-Agarose (bei Ziegen-Antikörpern) und 1-5 µl Antikörper gegen das zu untersuchende
Protein zugefügt. Nach einer Inkubationszeit von 2 h bei 4°C auf dem Rotor wurden die
entstandenen Immunkomplexe durch Zentrifugation (1-3 min, 14000 rpm, 4°C) pelletiert, der
Überstand abgenommen und die Pellets 2x mit hochkonzenriertem, salzhaltigem TLB (TLB
mit (73 µl/ml) 5 M NaCl) gewaschen.
3.4.4 Kinase-Assay
Es ist möglich, die Kinaseaktivität in vitro durch Zugabe von 32P-γ ATP und einem geeigneten
Substrat zu messen, da die Kinasen die Fähigkeit besitzen γ-Phosphatgruppen von ATP auf
ein Substrat zu übertragen.
Hierzu wurden die Kinasen, wie oben beschrieben, mit spezifischen Antikörpern
immunpräzipitiert, 2x mit TLB gewaschen und anschließend zwei weiteren Waschschritten
mit Kinasepuffer (10 mM MgCl2, 25 mM β-Glcerophosphat, 25 mM HEPES pH 7.5, 5 mM
Benzamidin, 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und 1 mM Sodium Vanadat) unterzogen.
Daraufhin setzte man einen Reaktionsmix an, der für jede Probe 100 µM ATP, 1 µg
geeignetes Substrat, 20 µl Kinasepuffer und 5 µCi
32
P - γATP enthielt. 20 µl des
Reaktionsmixes wurden jeder Probe zugegeben und anschließend 15 min bei 30°C unter
Schütteln inkubiert. Die Zugabe von 6 µl 5x SDS-Probenpuffer (155 mM Tris-HCl pH 6.8,
5% SDS, 50% Glycerin, 25% β-Mercaptoethanol) beendete die Reaktion und die
darauffolgende Inkubation für 5 min bei 100°C denaturierte die Proben. Nach einem kurzen
Zentrifugationsschritt, der die Agarospartikel sedimentieren sollte, wurde der Überstand auf
ein SDS-PAGE Gel aufgetragen.
50
3. Methoden
3.4.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist es möglich, denaturierte Proteine
entsprechend ihrer molekularen Masse in einem elektrischen Feld aufzutrennen.
Zunächst wurde den Proben 8 µl 5x SDS Probenpuffer (155 mM Tris-HCl pH 6.8, 5% SDS,
50% Glycerin, 25% β-Mercaptoethanol) zugegeben und circa 90 s bei 90°C inkubiert.
Natriumdodecylsulfat (SDS) ist ein Detergenz, das nichtkovalente Wechselwirkungen in
nativen Proteinen zerstört und β-Mercaptoethanol enthält, das mögliche Disulfidbrücken
reduziert. Die SDS-Moleküle binden sich an die Hauptketten, wobei die stark negative
Ladung des Komplexes ungefähr der Masse des Komplexes proportional ist. Demzufolge
wandern die Proteine in einem elektrischen Feld in Richtung der positiven Elektrode, wobei
größere Proteine stärker im Gel zurückgehalten werden.
Die verwendeten Gele bestanden aus einem Sammelgel, das die Proteine einer Probe
konzentrierte und einem Trenngel, in dem die Auftrennung entsprechend der Masse erfolgte.
10%ige Trenngele bestanden aus einer 30%igen Acrylamidstammlösung mit 0,8%
quervernetzendem Bisacrylamid, Trenngelpuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 9.0, 0,4% TEMED,
0,4% SDS) und H2O. Das 3,9%ige Sammelgel setzte sich aus einer 30%igen
Acrylamidstammlösung mit 0,8% quervernetzendem Bisacrylamid und Sammelgelpuffer (140
mM Tris-HCl, pH 6.8, 0,11% TEMED, 0,11% SDS) zusammen. Die Polymerisation wurde
durch Zugabe des Radikalstarters Ammoniumperoxodisulfat (10% w/v APS) erreicht. Die
Gele wurden zwischen zwei Glasplatten gegossen, die durch Abstandhalter getrennt waren,
und das Trenngel überschichtete man bis zur vollständigen Polymerisation mit 2-Propanol,
um eine gleichmäßige Grenze zwischen Trenn- und Sammelgel zu bekommen. Das 2Propanol wurde entfernt, das Sammelgel gegossen und ein Kamm blasenfrei eingesetzt. Nach
der Polymerisation wurden die Gele in die beiden mit 1x SDS-PAGE-Puffer (25 mM TrisHCl pH 6.8, 50 mM Glycin, 0,1% SDS) gefüllten Puffertanks der Gelapparatur (BioRad)
gesetzt und die denaturierten Proteine in die Taschen gefüllt. Die Proteingele wurden unter
konstantem Stromfluß (30-45 mA) angeschlossen.
51
3. Methoden
3.4.6 Western-Blot
Mit Hilfe eines elektrischen Feldes werden im Western-Blot Proteine aus einer Gelmatrix auf
eine Nitrozellulosemembran übertragen, auf der man die immobilisierten Proteine durch
Bindung spezifischer Antikörper und geeigneter Detektionssysteme sichtbar machen kann.
3.4.6.1 Transfer von Proteinen auf eine Nitrozellulosemembran
Eine Nass-Elektroblotkammer (BioRad) wurde mit Blotting Puffer (pH 8.2; 39 mM Glycin,
48 mM Tris-HCl, 0,037% SDS, 20% Methanol (frisch zugegeben)) gefüllt. Das Gel wurde
der Lauf-Apparatur entnommen, man entfernte die beiden Glasplatten und legte das Gel auf
mehrere zugeschnittene, in Blotting-Puffer getränkte Whatmanpapiere. Auf das Gel wurde
eine Nitrozellulosemembran luftblasenfrei gelegt, gefolgt von mehreren feuchten
Whatmanpapieren. Dieser Stapel wurde mit einem Saugschwamm und einem Kunststoffgehäuse umgeben, in die Blotting-Kammer eingesetzt. Der Proteintransfer erfolgte unter
konstantem Stromfluß, bei 400 mA für 30 min.
3.4.6.2 Immundetektion von Proteinen
Zunächst wurden unspezifische Bindungsstellen, die ein störendes Hintergrundsignal
verursacht hätten, durch Inkubation mit dem Blockierungs-Reagenz (5% Milchpulver in 1x
TBST (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,2% Triton X-100)) auf einem Schwenker für
mindestens 1 h abgedeckt. Das Blockierungs-Reagenz wurde verworfen, der primäre
Antikörper, gelöst in Blockierungs-Reagenz, zugegeben und für 2-3 h (Raumtemperatur) oder
über Nacht (4°C) inkubiert. Daraufhin wurde die Membran 3x für jeweils 10 min mit 1x
TBST unter Schwenken gewaschen, um überschüssige, nicht gebundene Antikörper zu
entfernen. Anschließend erfolgte die Inkubation der Membran mit einem zweiten Antikörper,
gelöst in 1x TBST für 45 min bei Raumtemperatur. Die Membran wurde wie zuvor
gewaschen und einer ECL (Enhanced Chemoluminiscence)-Reaktion unterworfen.
52
3. Methoden
Die ECL-Lösungen enthalten Luminol, welches ein Substrat für die, an den zweiten
Antikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase ist und nach Oxidation in einen angeregten
Zustand übergeht und Licht emittiert.
Es wurden jeweils 2 ml der beiden ECL-Lösungen in ein ebenes Gefäß gegeben und die
Membran wurde für 1 min unter Schwenken inkubiert. Danach wurde die Membran
getrocknet, in eine ECL-Detektionskassette, zwischen zwei durchsichtige Folien gelegt und
die nun sichtbaren Banden durch Auflegen eines Röntgenfilmes dokumentiert.
3.4.7 Herstellung von Kern-Protein-Extrakten
Die Herstellung der Proteinextrakte fand bei 4°C statt. Für die Präparation von Kernextrakten
im Minimaßstab wurden 1x 107 Zellen bei 1000 rpm, 5 min abzentrifugiert, mit 10 ml PBS
gewaschen, in 1 ml PBS aufgenommen und in Mikroreaktionsgefäße überführt. Nach 30 s
Zentrifugation bei 5000 rpm wurde das Pellet vorsichtig in 500 µl Puffer A (10 mM HEPES
pH 7.9, 10 mM KCl, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM Pefablock) resuspendiert und 15
min auf Eis inkubiert. Mehrmaliges Aufziehen der Suspension in einer gekühlten 26G3/8
Nadel sollte die Zellmembranen der geschwollenen Zellen aufbrechen, wobei die Zellkerne
größtenteils intakt blieben. Diese trennte man durch Zentrifugation (5 min, 5500 rpm, 4°C)
vom zytoplasmatischen Überstand. Nach zweimaligem Waschen der Zellkerne mit Puffer A
wurden diese in 50 µl Puffer C (20 mM HEPES pH 7.9, 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM
EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Pefablock) resuspendiert und die salzlöslichen Kernproteine durch
15-minütiges kräftiges Schütteln bei 4°C extrahiert. Hochmolekulare Bestandteile wurden 5
min bei 14000 rpm abzentrifugiert, bevor der proteinhaltige Überstand in flüssigem Stickstoff
eingefroren wurde. 5 µl des Überstandes verwendete man zur Proteinbestimmung.
53
3. Methoden
3.4.8 DNA-Protein-Bindungsassay
3.4.8.1 Radioaktive Markierung einer DNA-Sonde
Das Klenow-Fragment der E.coli DNA-Polymerase I kann 3´Enden von DNA-Fragmenten
auffüllen, indem es die 5´Überhänge als Matrize nutzt.
Der Reaktionsansatz wird 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, über eine G-25 SephadexSäule gereinigt und die Aktivität der markierten Probe im Szintillationszähler bestimmt.
3.4.8.2 „Elektrophoretic Mobility Shift Assay“ (EMSA)
Die sequenzspezifische Bindung von Proteinen an doppelsträngige DNA kann ermittelt
werden, indem man Proteine mit radioaktiv markierten DNA-Sequenzmotiven inkubiert und
die entstehenden Komplexe in einem nativen Polyacrylamidgel auftrennt. DNA-Fragmente,
an die ein Protein gebunden ist, wandern im Gel langsamer und können dadurch von
ungebundener DNA getrennt werden. Synthetische Kompetitoren wie Poly dI/dC oder Poly
dG/dC verhindern eine unspezifische DNA-Bindung durch Proteine an die Bindeprobe, indem
sie als 2000-10000 facher Überschuss (der Bindeprobe) dem Versuchsansatz hinzugefügt
werden. Der Nachweis einer spezifischen DNA-Protein-Wechselwirkung erfolgt durch
Kompetition mit einem Überschuss des entsprechenden nichtmarkierten Oligonukleotides.
Zu 5 µg Kernextrakt, auf 12 µl eingestellt, wurden 6 µl Puffermix (1x Poly dI/dC, 1x BSA, 5x
Bindungspuffer (60 mM HEPES pH 7.9, 3 mM EDTA, 150 mM KCl, 12% Ficoll))
hinzugegeben, 5 min auf Eis inkubiert und mit 2 µl radioaktiv markierter DNA-Probe (60000
cpm) gemischt. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Ansätze parallel zu
einem Farbmarker (5% Ficoll in 1x Bindungspuffer) auf ein 5%iges Polyacrylamidgel (5%
Polyacrylamid, 7 µl/ml 10% APS, 0,7 µl/ml TEMED, 0,5x TBE), das circa 2 h vorgelaufen
war, aufgetragen. Der Lauf erfolgte bei 180 Volt für circa 2,5 h in 0,4%igem TBE. Das Gel
wurde auf Whatman Papier bei 80°C auf dem Geltrockner getrocknet (circa 50 min). Die
Exposition mit Verstärkerfolien erfolgte meist für 1-3 Tage bei –70°C.
54
3. Methoden
3.4.9 GST-Pull-Down-Assay
Mit Hilfe eines GST-Pull-Down-Assays ist es möglich, die direkte Interaktion zweier oder
mehrerer Proteine nachzuweisen. Das Enzym Glutathion-S-Transferase (GST) ist ein 26 kD
Protein aus dem Cytoplasma von Schistosoma japonicum. In kommerziell erhältliche GSTExpressionsvektoren kann man ein zu untersuchendes DNA-Fragment klonieren und nach
Transformation des rekombinierten Vektors in E.coli das resultierende Fusionsprotein
exprimieren. Der GST-Anteil des Fusionsproteins erlaubt die Bindung an Glutathion und
somit an kommerziell erhältliche Sepharose gekoppelte Gluthation-Perlen. Um die Interaktion
zweier Proteine nachzuweisen, inkubiert man das mit den Glutathion-Perlen konjugierte
Fusionsprotein mit dem aufbereiteten Zell-Lysat. Nach mehrmaligem Waschen und
Auftrennung der Komplexe auf einem SDS-Gel, kann die physikalische Interaktion mittels
eines spezifischen Antikörpers im Western-Blot detektiert werden. In unserem Fall sollte die
aktivierte Form der kleinen GTPase Rac1 (ATP-gebundene Form) aus den Zell-Lysaten
gezogen werden. Hierzu wurde ein rekombinantes GST-Fusionsprotein eingesetzt, das die
ATP-beladene Form von Rac1 durch seine PAK beta (=PAK 3) – Domäne (65-136) bindet.
3.4.9.1 Aufreinigung der GST-Fusionsproteine aus E.coli
50 ml einer Übernachtkultur mit pGEX GST-RBD Plasmid transformierter Bakterien wurden
in 500 ml CG-Medium (50 µg/ml Ampicilin) überführt und für 1-2 h bei 37°C geschüttelt, bis
eine OD600 von 0,8-1,2 erreicht war. Daraufhin erfolgte die Induktion der Protein-Expression
durch Zugabe von 0,1 mM IPTG. Nach einer Inkubationsphase von 4 h bei Raumtemperatur
wurden die Bakterien in eiskalte Zentrifugenbecher überführt, pelletiert und in 10 ml LysisPuffer (1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1x
PBS, 25 µg/ml Pefablock, 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin) resuspendiert. Die
lysierten Bakterien wurden 6x 10 s beschallt (100 W) und dazwischen jeweils 1 min auf Eis
inkubiert. Daraufhin erfolgte ein Zentrifugationsschritt; 10000 g, 1 h, 4°C und darauffolgende
Inkubation der Überstände für 1-2 h oder über Nacht bei 4°C mit 300 µl Glutathion
55
3. Methoden
Sepharose-4B. Die Glutathion Beats wurden 3x mit PBS gewaschen. Es erfolgte sowohl eine
Proteinbestimmung, als auch eine Analyse der Fusionsproteine auf einem SDS-Gel.
3.4.9.2 Präparation der Zell-Lysate.
Die zu untersuchenden Zellen wurden 2 x mit PBS gewaschen und in 200–300 µl Lyse-Puffer
(50 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% DOC, 0,1% SDS, 10 mM
MgCl2, 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 25 µg/ml Pefablock) aufgenommen. Wenn
es sich um adhärente Zellen handelte, wurde ein Zellschaber zum Lösen der Zellen von der
Platte verwendet. Nach einer Inkubationszeit von circa 30 min wurden die Lysate 10 min
zentrifugiert, daraufhin die Proteinkonzentration bestimmt und auf circa 300–500 µg/Probe
eingestellt.
3.4.9.3 GST-Pull-Down-Assay
Die Zell-Lysate und die aufgereinigten GST-Fusionsproteine, die an Glutathionbeats
gekoppelt waren, wurden vermischt, 5 min aufgekocht und auf ein SDS-Gel geladen (3.4.6).
Die Detektion der Banden erfolgte mit einem anti-Rac1 Antikörper.
56
4. Ergebnis
4. Ergebnis
4.1 ATF-2 Phosphorylierung infolge einer Influenza Virus Infektion erfolgt unabhängig
von p38
Influenza A Virus Infektion von Zellen resultiert in der Induktion einer Reihe antiviraler
Zytokine, die durch die Transkriptionsfaktoren der Aktivierenden Protein-1 (AP-1) Familie
reguliert werden. Influenza A Virus-induzierte AP-1 abhängige Genexpression erfolgt in
produktiv infizierten Zellen, also in Zellen, die virale Replikation unterstützen, wie MadinDarby canine kidney Zellen (MDCK) und U937 Zellen (Ludwig et al., 2001). Der erste
regulatorische Schritt innerhalb der AP-1 abhängigen Genexpression, die schnelle
transkriptionelle Aktivierung einzelner AP-1 Faktoren infolge der Zellstimulation spielt dabei
lediglich eine untergeordnete Rolle (Karin et al., 1997). Die transkriptionelle Aktivität der
AP-1 Komplexe wird posttranslational noch stark durch Phosphorylierung gesteigert (Karin et
al., 1997). Zu den Influenza A Virus-induzierten AP-1 Faktoren, die konstitutiv an ihre AP-1
Promotoren gebunden sind, zählen c-Jun, c-Fos, JunD und ATF-2 (Ludwig et al., 2001). Einer
dieser Faktoren, der auch eine wichtige Rolle in der Virus-induzierten Expression antiviraler
Zytokine spielt, ist ATF-2 (Du et al., 1992; Wathelet et al., 1998).
Zur Klärung der Frage, ob eine Influenza Virus Infektion zu einer ATF-2 Phosphorylierung
und damit Aktivierung führt, wurden verschiedene permissive Zell-Linien für
Infektionsexperimente verwendet und die Phosphorylierung von ATF-2 im Western-Blot
betrachtet. In den permissiven 293- (A) und COS7- (B) Zellen führte die Infektion mit den
Influenza A Virusstämmen FPV und Asia nach vier bis acht Stunden zur Phosphorylierung
von ATF-2 (A, B). Zwei verschiedene MAP Kinasen, p38 und JNK/SAPK, sind dafür
bekannt, ATF-2 zu phosphorylieren (Livingstone et al., 1995; van Dam et al., 1995). Die
Spezifizierung welche, dieser Kinasen von Wichtigkeit für die ATF-2 Phosphorylierung ist,
erfolgte mit Hilfe des spezifischen p38 Inhibitors SB202190. Obwohl der p38-Signalweg
57
4. Ergebnis
infolge von Influenza Virus Infektion in verschiedenen Zellen aktiviert wurde (eigene
unveröffentlichte Daten), konnte Virus-induzierte ATF-2 Phosphorylierung nicht durch
hemmende Konzentrationen von SB202190 vermindert oder blockiert werden (Abb. 4.1.B).
Diese Ergebnisse zeigen, dass der JNK/SAPK Zweig der MAP Kinase Kaskaden in erster
Linie für die beobachteten Phosphorylierungsereignisse verantwortlich ist.
B
A
FPV
Infektion
0h
P - ATF2
ATF2
1h 4h
8h
FPV
Infektion
SB202190
-
1h
+
-
4h
+
Asia
-
8h
1h
+ - +
-
4h
+
-
8h
+
P - ATF2
ATF2
Abb. 4.1.: ATF-2 Phosphorylierung erfolgt infolge von Influenza Virus Infektion unabhängig von p38.
293 Zellen (A) oder COS7 Zellen (B) wurden mit den Influenza Virus Stämmen FPV (A, B) oder Asia (B) (8
MOI) unterschiedlich lange infiziert und in An- (B) und Abwesenheit (A,B) des spezifischen p38 Inhibitors
SB202190 (20 µM) inkubiert. Nach Auftrennung der Proteine auf einem SDS-Gel und Übertragung auf eine
Nitrozellulose Membran erfolgte die Inkubation mit einem spezifischen Antikörper gegen phosphoryliertes ATF2. Auftragung gleicher Proteinmengen wurde mit Hilfe eines ATF-2 Antiserums im Western-Blot sichergestellt.
4.2 Influenza Virus-induzierte JNK Aktivität ist in produktiv infizierten Zellen
nachweisbar
Produktive Infektion von Zellen mit verschiedenen Influenza Virus-Stämmen resultiert in der
Aktivierung von JNK (Ehrhardt, 1999). Es konnte gezeigt werden, dass die Virus-induzierte
Aktivierung von JNK-1 unterschiedliche Kinetiken aufweist, unabhängig vom eingesetzten
Virusstamm, sondern abhängig von der Zell-Linie (Ehrhardt, 1999). Zell-spezifische
Unterschiede der Virusreplikation scheinen demnach für die Aktivierung des JNK/SAPK
Signalweges von Bedeutung zu sein. Die Replikationsfähigkeit von Influenza Viren in
verschiedenen Zell-Linien korreliert nicht nur mit der Induktion der JNK Aktivität, sondern
58
4. Ergebnis
auch mit der Induktion der AP-1 abhängigen Genexpression (Ludwig et al., 2001). Um die
Bedeutung der Virusreplikation weiter zu verifizieren, wurde die JNK Aktivierung in An- und
Abwesenheit des antiviral wirkenden Agens Amantatin untersucht (Abb. 4.2.). Amantadin
inhibiert unter anderem die Membranfusion der Influenza A Viruspartikel während der
Infektion, indem es die Protonenaufnahme über den M2 Ionenkanal in das Endosom blockiert
(Hay et al., 1986). Die Inhibierung der Virusreplikation mittels Amantadin führte zu einer
50% geringeren JNK Aktivierung acht Stunden nach Infektion (Abb. 4.2.) korrelierend mit
einem 50% niedrigeren Virustiter. Dies zeigt, dass eine effiziente Virusreplikation für die
Aktivierung der MAPK JNK Voraussetzung ist.
Amantadin
(1mg/ml)
Kontrolle
Infektion
-
+
-
+
Kinase Assay
-GST-c-Jun
Western Blot
-JNK1
1
2
3
4
Abb. 4.2.: Influenza Virus-induzierte Aktivierung von JNK/SAPK ist in produktiv infizierten Zellen
nachweisbar. MDCK Zellen wurden mit dem Influenza Virus Stamm FPV (8 MOI) 8 h infiziert und in An- oder
Abwesenheit der antiviral wirkenden Substanz Amantadin (1 mg/ml) inkubiert. Auftragung gleicher
Proteinmengen wurde mit Hilfe eines JNK-1 Antikörpers im Western-Blot sichergestellt.
59
4. Ergebnis
4.3 Akkumulation von RNA, synthetisiert durch den viralen Polymerase Komplex,
resultiert in der Aktivierung von JNK
In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass für Virus-induzierte JNK und AP-1
Aktivierung eine effektive Virusreplikation Voraussetzung ist, welche mit der Synthese
viraler RNA und Proteine einhergeht. Bisher war jedoch unklar, welche virale Komponente
für die JNK-Aktivierung in Wirtszellen verantwortlich ist. Dies könnten virale Proteine sein,
welche während der Replikation stark produziert werden. Die Influenza A Virus-Proteine
Hämagglutinin, das Nukleoprotein und das Matrixprotein sind als virale Transaktivatoren für
NF-κB identifiziert worden (Flory et al., 2000). Allerdings war keines dieser viralen Proteine
in der Lage JNK zu aktivieren (Ehrhardt, 1999) oder AP-1 abhängige Genexpression zu
induzieren (Flory et al., 2000). Auch die Expression der viralen Proteine NS1 und NEP/NS2
führte nicht zu einer JNK Aktivierung (eigene unveröffentlichte Daten). Eine weitere in Frage
kommende virale Komponente, ist die einzelsträngige vRNA, die mittels des viralen RNA
abhängigen RNA Polymerase (RDRP) Komplexes, bestehend aus PB2, PB1 und PA
Proteinen, transkribiert und repliziert wird (Lamb et al., 1996). Die vRNA wird in mRNA
transkribiert und über cRNA Replikationsintermediate amplifiziert. Um zu prüfen, ob RNA
die Kapazität besitzt, JNK vermittelte Signaltransduktion zu induzieren, wurden MDCK
Zellen mit dem Doppelstrang (ds) RNA-Analogon Poly(IC) verschieden lange und mit
unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Poly(IC) Stimulation führte zeit- und
konzentrationsabhängig zur JNK Aktivierung (Abb. 4.3.A), die nicht durch Aktinomyzin D
oder Zykloheximid inhibiert werden konnte (unveröffentlichte Daten). Diese Ergebnisse
weisen auf eine direkte RNA-induzierte JNK-Aktivierung hin, die keine neue RNA- oder
Proteinsynthese erfordert. Um nachzuweisen, dass Akkumulation Influenza-ähnlicher RNA in
der Wirtszelle in der Lage ist JNK zu aktivieren, wurde ein auf Plasmiden basierendes
Replikationssystem für vRNA-ähnliche RNA Polymerase I (Pol I) Transkripte verwendet
(Pleschka et al., 1996). Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die die RDRP Bestandteile
60
4. Ergebnis
PB2, PB1, PA sowie das NP exprimieren. Die Virus-spezifische Matrize für diesen
Polymerasekomplex wurde über ein Plasmid synthetisiert, welche vermittelt durch die RNA
Pol I zur Bildung einer RNA mit den Influenza-spezifischen Promotorsequenzen führt.
Charakteristisch für das vRNA-ähnliche Pol I Transkript sind seine konservierten 5´ und 3´
Promotorstrukturen der Influenza vRNA Segmente, die ein antisense Reportergen flankieren.
Diese Plasmide wurden erfolgreich in Plasmid-abhängigen genetischen Versuchen eingesetzt,
um vRNA-ähnliche Templates für die RDRP zu erzeugen (Pleschka et al., 1996). Alle drei
Polymerase Gene und das NP Gen müssen kotransfiziert werden, damit die Transkription und
Amplifikation eines Reportergentemplates stattfinden kann (Pleschka et al., 1996). Wurde
GFP als Reportergen (pPol I GFP) mit Plasmiden, die PB2, PB1, PA und NP exprimieren
kotranfiziert, waren 5-10% der transfizierten Zellen grün fluoreszierend, wohingegen keine
Fluoreszens auftrat, sobald das NP- und/oder das vRNA Template exprimierende Plasmid
durch einen Leervektor ersetzt wurde (Abb. 4.3.C). Demzufolge trugen lediglich 5-10% der
transfizierten Zellen alle zur Transkription und Amplifikation des vRNA Templates
notwendigen Plasmide. Wurde Luziferase als Reportergen (pPol I luc) (Abb. 4.3.B.6)
eingesetzt, kam es ebenfalls zu einer JNK/SAPK Induktion. Demnach erfolgte eine
signifikante Aktivierung von JNK/SAPK, in Proben, die mit den notwendigen ReplikaseGenen und entweder pPol I GFP oder pPol I Luc Plasmiden, die Influenza-spezifische vRNA
Templates exprimieren, kotransfiziert wurden (Abb. 4.3.B). Es war keine JNK/SAPK
Aktivierung nachweisbar, wenn NP (Abb. 4.3.B) oder Template RNA nicht eingesetzt oder
durch leere pPol I Vektoren ersetzt wurden (Abb. 4.3.B). Insgesamt deuten diese Ergebnisse
darauf hin, dass JNK/SAPK während der Influenza Virus-spezifischen Transkription und
Replikation eines Influenza-ähnlichen RNA Templates durch den viralen RDRP Komplex
aktiviert wird. Akkumulation von vRNA scheint daher der Stimulus für Aktivierung des JNKSignalweges zu sein.
61
4. Ergebnis
A
50 µg/ml
0´
60 min.
10´ 30´ 60´ 120´ 240´ 0
10
25 50
100 150
-GST-c-Jun
Kinase Assay
-JNK1
Western Blot
B
0 µg/ml
PB2,PB1,PA
-
+
+
+
+
+
+
NP
-
-
+
+
+
+
+
Pol I GFP
Pol I Luc
Pol I Vector
-
+
-
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
-
+
-GST-c-Jun
Kinase Assay
-GST-SAPKß
Western Blot
1
2
3
4
C
5
6
7
16,00
12,00
8,00
4,00
0,00
NP
PB2, PB1, PA
Pol I GFP
Vector
+
+
+
+
+
+
PB2, PB1, PA
Pol I GFP
+
+
+
+
Abb. 4.3.: Stimulation von Zellen mit Poly(IC) oder Amplifikation der Influenza vRNA-ähnlichen Segmente
durch den RDRP-Komplex resultiert in der Aktivierung von JNK. (A) MDCK Zellen wurden mit dem dsRNA
Analogon Poly(IC) mit verschiedenen Konzentrationen, unterschiedlich lange (siehe Angaben) inkubiert. Die
JNK Aktivität konnte, wie bereits beschrieben, im Western-Blot ermittelt werden. (B) MDCK Zellen wurden mit
Expressionsplasmiden für GST-SAPKβ, PB2, PB1, PA und NP transfiziert. Die Transfektion gleicher DNA
Mengen wurde durch Einsatz des Leervektors erreicht. Um dem RDRP Komplex, der Influenza-ähnliche RNA
exprimiert, Template RNA zur Verfügung zu stellen, wurden GFP- oder Luziferase Antisense Reportergene
(pPol I GFP und pPol I Luc) kotransfiziert. In den angegebenen Proben wurden die RNA Template Konstrukte
durch den entsprechenden Leervektor (pPol I Vektor) ersetzt. Die Effektivität des Influenza Replikase
Komplexes konnte aufgrund der Anzahl der GFP-positiven Zellen bestimmt werden. Lediglich 5-10% der
transfizierten Zellen enthielten alle für Transkription und Replikation von GFP notwendigen Plasmide. 24 h nach
der Transfektion erfolgte die Zellernte und Untersuchung der Lysate auf GST-SAPKβ Aktivität im Kinase
Assay. (C) MDCK Zellen wurden mit den angegebenen Expressionsplasmiden transfiziert und mit pPol I GFP
(links) oder pPol Luc (rechts) kotransfiziert. 24 h nach der Transfektion konnten die Zellen im FluoreszenzMikroskop analysiert (links) oder geerntet und in einem Luziferase-Assay eingesetzt werden (rechts).
62
4. Ergebnis
4.4 Die JNK Signalkaskade übernimmt eine essentielle Rolle in der Virus-induzierten
β-Promotors
Aktivierung des IFNβ
Influenza Viren induzieren in infizierten Zellen die Aktivierung potenter antiviraler Zytokine,
wie IFNβ. Wie schon erwähnt, kann das IFNβ-Enhanceosom in seiner Promotorsequenz cJun/ATF-2 Heterodimere binden, essentielle Faktoren für die Virus-induzierte Transkription
dieses Zytokingens (Du et al., 1992). Um zu untersuchen, ob nicht nur die Virus-induzierte
AP-1 abhängige Genexpression über den JNK/SAPK Signalweg erfolgt, sondern auch die
Virus-induzierte IFNβ Expression, wurden dominant negative Mutanten von JNK/SAPK
(SAPKβ(KK>RR)) oder c-Jun (TAM67) mit einem IFNβ Promotor Luziferasekonstrukt
kotransfiziert. Sowohl die Behandlung der transfizierten Zellen mit Poly(IC), als auch
Infektion mit Influenza Viren führte zu einer starken Aktivierung des IFNβ Promotors, die in
Anwesenheit der dominant negativen Mutanten von JNK/SAPK oder c-Jun blockiert wurde
(Abb. 4.4.A und B). Diese Daten bestätigen, dass JNK/SAPK an RNA- und Influenza Virusinduzierter Transkription von IFNβ beteiligt ist. Wenn die JNK/SAPK-Signalkaskade die
Expression effizienter antiviraler Zytokine reguliert, sollte demzufolge die Hemmung dieses
Signalweges die Fähigkeit der Viren steigern, sich in den Wirtszellen zu replizieren. In der
Tat wurden erhöhte Virusmengen im Überstand infizierter MDCK-Zellen nachgewiesen, die
dominant negative Mutanten von MKK7, JNK/SAPK oder c-Jun exprimierten (Abb. 4.4.C).
Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Influenza Virus-induzierte
Aktivierung des JNK Signalweges und der AP-1 abhängigen Genexpression einen Bestandteil
der frühen Immunantwort der Zelle darstellt, beispielsweise durch schnelle Stimulation
antiviraler Zytokine, wie IFNβ.
63
4. Ergebnis
A
B
4
2
0
Vektor Vektor TAM67SAPKß
(KK>RR)
Poly (IC)
+
+
+
6
4
200%
100%
2
0
Vektor Vektor TAM67SAPKß
(KK>RR)
Infection
300%
Prozent der Virusmenge im Vergleich zur Kontrolle (%)
6
Virus Infektion (4h)
Relative Luziferase Aktivität (-fache Aktivierung)
Relative Luziferase Aktivität (-fache Aktivierung)
Poly(IC) (6h)
C
-
+
+
+
0%
Vektor
MKK7 SAPKß TAM67
(K>M) (KK>RR)
Abb. 4.4.: Influenza Virus-induzierte Expression von IFNβ erfolgt über den JNK Signalweg. (A, B) MDCK
Zellen wurden mit einem IFNβ Promotor/Enhanceosom Luziferase Konstrukt transfiziert. Zusätzlich erfolgte die
Kotransfektion von Expressionsplasmiden für einen Leervektor oder für die dominant negativen Mutanten von
JNK/SAPK (SAPKβ KK>RR) oder c-Jun (Tam 67). 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen entweder mit
Poly(IC) (50 mg/ml) für 6 h inkubiert (A) oder mit FPV (5 MOI) für 4 h infiziert (B). Die Luziferaseaktivität der
Zell-Lysate wurde im Western-Blot ermittelt. (C) MDCK Zellen wurden mit Expressionsvektoren für einen
Leervektor oder dominant negative Mutanten von JNK/SAPK (SAPKβ KK>RR), c-Jun (Tam 67) oder MKK7
(MKK7 K>M) kotransfiziert. Die Transfektionseffizienz konnte aufgrund der GFP-Expression mittels FACSAnalyse bestimmt werden und beträgt in diesem Versuchsansatz 50-60%. 9 h nach der Infektion wurde die
Menge der freigesetzten infektiösen Viruspartikel im Plaque-Assay bestimmt. Die Virusmenge aus dem
Überstand von Vektor-transfizierten Zellen wurde auf 100% normiert.
4.5 MKK4/SEK aktiviert die antivirale Genexpression über den JNK/SAPK Signalweg,
scheint aber auch die virale Replikation zu unterstützen
Frühere Experimente (Ehrhardt, 1999) haben gezeigt, dass sowohl MKK4/SEK, als auch
MKK7 infolge einer Influenza Virus Infektion aktiviert werden. Beide Kinasen wirken
synergistisch auf JNK/SAPK, wobei die einzelnen Kaskadezweige durch unterschiedliche
Aktivierungseigenschaften charakterisiert zu sein scheinen. Virus Titration von Überständen
transfizierter und infizierter MDCK Zellen ergaben verminderte Virusmengen, wenn der
JNK/SAPK Signalweg, durch Verwendung dominant negativer Mutanten von SEK (SEK
K>R), inhibiert wurde (Abb. 4.5.A). Im Gegensatz dazu führte die Inhibition von MKK7
64
4. Ergebnis
durch die dominant negative Mutante MKK7 K>R zu erhöhten Virustitern (Abb. 4.5.A).
Diese Daten legen die Vermutung nahe, dass MKK4/SEK zusätzlich zur JNK/SAPK
Aktivierung in einen anderen Signalweg involviert ist, der die virale Replikation unterstützt
(Abb. 4.5.B). MKK7 und SEK/MKK4 könnten synergistisch wirken, um das Gleichgewicht
zwischen Virusausbreitung und Zelltod des Wirtes aufrecht zu erhalten.
A
Prozent der Virusmenge, verglichen zur Kontr olle (%)
B
200%
Virus Infektion
RNA Akkumulation
100%
SEK/
MKK4
MKK7
P
P
JNK/ SA PK
0%
Vector MKK7
K>R
SEK
K>R
Virus Titration der Überstände
von transfizierten und
infizierten MDCK Zellen
Unterstützung
der viralen Replikation
Antivirale
Genexpression
Abb. 4.5.: Die Hemmung des JNK/SAPK Signalweges an unterschiedlichen Stellen zeigt veschiedene Effekte
auf die Virusreplikation. MDCK Zellen wurden mit Expressionsplasmiden für einen Leervektor oder die
dominant negativen Mutanten MKK7 (MKK7 K>R) oder SEK (SEK K>R) transfiziert und mit FPV (1 MOI)
infiziert. 9 h nach der Infektion erfolgte die Bestimmung der, in den Überstand freigesetzten Viruspartikel
mittels Plaque-Assay.
65
4. Ergebnis
4.6 Influenza Virus-induzierte Aktivierung von JNK und c-Jun ist in Abwesenheit des
NS1 Proteins gesteigert
Infolge einer Influenza A Virus Infektion von Zellen kommt es zur Aktivierung von
Transkriptionsfaktoren der AP-1 Familie, vermittelt über die JNK/SAPK Signalkaskade. Wie
gezeigt, scheint die, während der Replikation gebildete virale dsRNA, für die Aktivierung von
JNK und die des IFN-Systems von besonderer Bedeutung zu sein (Ludwig et al., 2001).
Allerdings sind weder die aktivierenden Strukturen der viralen RNA, noch deren
intrazelluläre Lokalisation identifiziert.
Das Influenza A Virus Protein NS1 ist als viraler Regulator der Genexpression bekannt, der
sowohl die Prozessierung der Vorläufer-mRNA, als auch den Export der zellulären mRNA
aus dem Kern ins Zytoplasma inhibiert und die Translation steigert (de la Luna et al., 1995;
Fortes et al., 1994; Salvatore et al., 2001). Das NS1 Protein, charakterisiert durch seine
dsRNA-Bindungsaktivität, wirkt aber auch antiviralen, dsRNA-abhängigen Enzymen und
Prozessen entgegen, einschließlich der Aktivierung der PKR und der Transkriptionsfaktoren
NF-κB, IRF-3 und IRF-7 (Talon et al., 2000; Wang et al., 2000). Die Expression der
dominant-negativen Mutanten von JNK oder des Effektors c-Jun führt zu verminderter IFNβ
Promotor Aktivität und gesteigerten Virus-Titern. Da das NS1 Protein RNABindungsaktivität besitzt und TypI IFN Aktivitäten in infizierten Zellen verhindert, stellt sich
die Frage, ob das NS1 Protein für die Hemmung der RNA induzierten zellulären Antworten
verantwortlich ist. Um die Bedeutung des NS1 Proteins während der JNK Aktivierung zu
ermitteln, wurde Influenza A/PR/8/34 Wildtyp Virus (WT) mit den beiden isogenen VirusVarianten delNS1 und NS-IAmut1 verglichen. Während dem delNS1 Virus das NS1 Gen
vollständig fehlt, exprimiert die NS-IAmut1 ein NS1 Protein mit voller Länge (230 AS),
besitzt aber einen Aminosäureaustausch an den Positionen 181-185 (LIGGL zu KQRRS).
Dies führt zu einer prädominanten zytoplasmatischen Lokalisation des Proteins. Permissive
Vero Zellen wurden mit den WT Viren oder den mutierten Viren für 4 und 8 Stunden infiziert
(Abb. 4.6). Während die JNK Aktivität und die c-Jun Phosphorylierung nach Infektion mit
66
4. Ergebnis
WT oder NS-IAmut1 Viren schwach anstieg, wurden diese Parameter durch delNS1 stark
induziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NS1 Proteine, die im Kern und/oder
Zytoplasma vorhanden sind, Signalübertragung über JNK verhindern. Da Vero Zellen
aufgrund eines genomischen Defektes IFNα/β nicht bilden können (Diaz et al., 1988), ist JNK
Aktivierung über eine autokrine TypI IFN Schleife ausgeschlossen. Die Expression des NPProteins wurde von den hier eingesetzten Influenza Virus Stämmen gleichmäßig
hervorgerufen.
8h
4h
Wildtyp
∆ NS1
NS1mut
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
Kinase assay
-GST-c- Jun
JNK-Aktivität:
WB
- JNK1
JunPhosphorylierung:
WB
- P-c- Jun
WB
- c- Jun
WB
- NP
NP-Expression:
1
2
3
4
5
6
Abb. 4.6.: Virale NS1 Expression inhibiert die Aktivierung von JNK und die Phosphorylierung von c-Jun. (A)
Vero Zellen wurden mit den Influenza Virus Stämmen PR8/WT, delNS1 oder NS-IAmut (5 MOI) für 4 h oder 8
h infiziert. JNK-1 wurde aus den Zell-Lysaten mit einem JNK spezifischen Antiserum (Santa Cruz, CA)
immunpräzipitiert. Es folgte eine Analyse der gewaschenen Immunkomplexe auf JNK Aktivität mit
rekombinantem GST-c-Jun (1-135) als Substrat. Die spezifischen Antikörper gegen phospho-c-Jun und NP
wurden zu deren Detektion verwendet. Auftragung gleicher Mengen der präzipitierten Kinasen und
Transkriptionsfaktoren wurde mittels JNK-1 und c-Jun Antikörpern im Western-Blot sicher gestellt.
67
4. Ergebnis
4.7 Das virale NS1 Protein verhindert AP-1 abhängige Genexpression
Zur Beurteilung der Rolle der im Kern und/oder Zytoplasma vorliegenden NS1-Proteine für
die JNK-abhängige Genexpression, wurde die Induktion eines IFNβ LuziferaseReportergenplasmides infolge von Infektion mit PR8 WT oder delNS1 Viren betrachtet (Abb.
4.7.A). Die Infektion mit delNS1 Viren führte zu einer dreifach stärkeren Induktion des
IFNβ Promotors, da von diesem Virusstamm keine NS1 Proteine gebildet werden, welche die
induzierende virale Komponente, die Doppelstrang RNA, hätte wegfangen können.
Wie bereits erwähnt, besitzt IFNβ in seiner Promotorsequenz Bindestellen für AP-1, NF-κB
und IRF-3 und ist darüber hinaus dafür bekannt, infolge einer Virus Infektion über den
JNK/SAPK Signalweg aktiviert zu werden (Ehrhardt, 1999).
Wie aus Abb. 4.7.B hervorgeht, reduzierte die NS1 Expression die virale Promotoraktivierung
in diesem Versuchsansatz dreifach, dagegen führte das Fehlen von NS1 zur Virus-induzierten
Hyperphosphorylierung von c-Jun, die wiederum mit der gesteigerten transkriptionellen
Aktivität des AP-1 Faktors korrelierte. Die Überexpression von NS1 wirkte hemmend auf die
Virus-induzierte Aktivierung aller drei Transkriptionsfaktoren AP-1, IRF-3 und NF-κB, die
letztlich zusammen die Aktivität des IFNβ Promotors kontrollierten und resultierte
demzufolge in einer starken Inhibition. Wie aus Abb. 4.6 hervorgeht, involvierte die delNS1induzierte IFNβ Promotoraktivierung JNK und c-Jun. Diese Induktion war in dominant
negativen JNK (SAPKβ KK>RR) bzw. dominant negativen c-Jun (Tam67) transfizierten
Zellen, in denen demzufolge ein Zweig einer Signalkaskade blockiert wurde, reduziert. Die
dargestellten inhibitorischen Effekte von NS1 stimmen mit denen auf NF-κB und IRF-3
Aktivitäten, die ebenfalls an der IFNβ Induktion beteiligt sind, überein (Talon et al., 2000;
Wang et al., 2000). Da eine große Anzahl von Genen von AP-1 Faktoren reguliert werden, ist
es wahrscheinlich, dass NS1 nicht nur auf die Aktivität des IFNβ Promotors, sondern auch auf
andere Zielgene inhibierend wirkt.
68
4. Ergebnis
B
100
100
80
80
Relative Luziferase Aktivität
Relative Luziferase Aktivität
A
60
40
20
0
60
40
20
0
mock delNS1 WT
Vector
β TAM67
SAPKβ
KK>RR
NS1
Abb. 4.7.: Inhibition der Signalübertragung von JNK/AP-1 beeinträchtigt die delNS1 Virus-induzierte
Aktivierung des IFNβ Promotors. (A) 1 x 106 MDCK Zellen wurden mit 100 ng des IFNβ Promotor Luziferase
Reportergenkonstruktes p125-Luc transfiziert. 24 h nach der Tranfektion erfolgte die mock Behandlung oder
Infektion mit den Influenza Virus Stämmen PR8/WT oder delNS1 (1 MOI) für 4 h. Die Zellextrakte wurden im
Luziferase-Assay analysiert. Die durch delNS1 hervorgerufene Enzymaktivität wurde auf 100% normiert. Der
Durchschnittswert stammt aus 3 unabhängigen Experimenten. (B) MDCK Zellen wurden mit p125-Luc und
zusätzlich 4 µg des Leervektors pKRSPA oder den Expressionsplasmiden für die dominant negative Mutanten
JNK/SAPK (SAPKβ KK>RR), c-Jun (Tam67) oder das NS1 Protein transfiziert. Die Infektion der Zellen
erfolgte mit dem Influenza Virus delNS1 (1 MOI) für 4 h. Die Analyse der Zell-Lysate erfolgte im LuziferaseAssay.
4.8 Das NS1 Protein inhibiert dsRNA-vermittelte JNK Aktivierung
Wie bereits erwähnt, ist das NS1 Protein ein viraler Regulator der Genexpression, der
besonders durch seine dsRNA-Bindungsaktivität gekennzeichnet ist, aber auch antiviralen,
dsRNA-abhängigen Enzymen und Prozessen, einschließlich der Aktivierung der PKR und der
Transkriptionsfaktoren NF-kB, IRF-3 und IRF-7 entgegen wirkt (Talon et al., 2000; Wang et
al., 2000). Darüber hinaus konnte in Abb. 4.6. und 4.7. bereits eine Beteiligung von NS1
69
4. Ergebnis
Proteinen an der Regulation der Virus-induzierten AP-1 abhängigen Genexpression, die über
den JNK/SAPK-Signalweg vermittelt wird, nachgewiesen werden.
Untersuchungen sollten nun klären, ob NS1 Expression für die Regulation der durch dsRNA
oder andere Stimuli induzierte JNK und AP-1 Aktivierung verantwortlich ist. Mit Hilfe der
Transfektion von Zellen mit JNK/SAPK zusätzlich zu einem NS1 Expressionskonstrukt oder
Leervektor sollte nach dsRNA Stimulation die JNK Aktivität ermittelt werden. Sowohl das
NS1 WT Protein, als auch das prädominant zytosolische NS-IAmut1 Protein waren in der
Lage, die JNK Aktivierung fast vollständig zu hemmen (Abb. 4.8.). Wie wirkt aber in diesem
Zusammenhang das prädominant zytosolische NS-IAmut1 Protein im Nukleus, wenn dort
Influenza Virus Replikation stattfindet, während der dsRNA durch Hybridisierung von
genomischer und antigenomischer RNA Stränge gebildet wird? Möglicherweise assoziiert
NS1 mit intramolekularen Strukturen der viralen RNA und inhibiert JNK, indem es den
viralen RNA Transport ins Zytoplasma verhindert (Marion et al., 1997). Die Aktivierung von
JNK durch den klassischen Aktivator Natrium-Arsenit konnte durch NS1 Expression nicht
inhibiert werden (Abb. 4.8.B), wodurch die Spezifität von NS1 auf Virus- oder dsRNAabhängige Antworten hemmend zu wirken, bewiesen ist.
A
dsRNA:
Vektor
-
+
WT
-
IAmut1
+
-
+
B
Vektor
WT
0
0.5 : mM NaAsO2
0.5
Kinase assay
- P -c-Jun
Immunoblot
-GST-JNK
Abb. 4.8.: Die Expression des NS1 Proteins inhibiert dsRNA- aber nicht Arsenit-induzierte Aktivierung von
JNK. MDCK Zellen wurden mit einem Plasmid, das GST-JNK/SAPKβ exprimiert zusätzlich zu einem pcDNA3
Leervektor oder Plasmiden, die NS1/WT oder NS1-IAmut exprimieren, kotransfiziert. 24 h nach der
Transfektion wurden die Zellen mit dsRNA (50 µg/ml) für 6 h stimuliert und lysiert. Die Bestimmung der JNK
Aktivität in den Lysaten erfolgte mittels Immunkomplex Kinase-Assay unter Verwendung von GST-c-Jun. Die
Menge von GST-JNK jeder Probe wurde mittels eines GST-spezifischen Antiserums bestimmt. JNK Aktivität
wurde ebenfalls in Vektor oder NS1WT transfizierten Zellen bestimmt, die mit 0,5 mM Natrium Arsenit, einem
klassischen JNK Aktivator 30 min stimuliert waren.
70
4. Ergebnis
4.9 Untersuchung der Influenza Virus-induzierten Signalwege, die zur Aktivierung von
IRF-3 führen
Wie bereits dargestellt, wird IFNβ von einem übergeordneten Komplex, dem IFNβEnhanceosom kontrolliert (Thanos et al., 1995). Die Promotorsequenz dieses Enhanceosoms
weist Bindungsstellen für NF-κB, AP-1 und IRF-3 auf. Bisher wurde sehr viel über die
Signalwege berichtet, die unter anderem auch nach viraler Infektion zur Aktivierung von AP1- und NF-κB-abhängiger Genexpression führen. Allerdings ist wenig über Virus-induzierte
Signalübertragungsprozesse bekannt, die in IRF-3 Phosphorylierung und Aktivierung
involviert sind. Die Untersuchung solcher Signalübertragungsprozesse, die besonders
interessant sind, da sie spezifische Virusantworten induzieren, sollte im zweiten Teil dieser
Arbeit erfolgen.
4.10 Influenza Virus Infektion induziert IRF-3 Translokation in den Zellkern
IRF-3 kann infolge eines stimulierenden Ereignisses an zahlreichen Serin- und
Threoninresten, sowohl am C-, als auch am N-terminalen Ende phosphoryliert werden. Es
führen aber lediglich Phosphorylierungsereignisse an 5 Serin-/Threonin-Resten des CTerminus zu seiner Aktivierung und zum effektiven Transport in den Zellkern (Hiscott et al.,
1999). Aus diesem Grund musste zunächst die Frage geklärt werden, ob Influenza Viren in
der Lage sind, IRF-3 zu aktivieren. Es wurden MDCK Zellen mit verschiedenen GFP-Fusions
Konstrukten, welche unterschiedliche IRF-3 Formen exprimieren transfiziert. Es handelte sich
um die IRF-3 Wildtyp-Form, die infolge von Phosphorylierung in den Zellkern wandern
kann, um eine Mutante, die aufgrund von Mutationen nicht mehr phosphoryliert werden kann
(IRF-3 5A) und demzufolge im Zytoplasma bleibt und um eine Mutante, die konstitutiv
negative Ladungen an den Phosphorylierungsstellen trägt und somit in den Kern wandert
71
4. Ergebnis
(IRF-3 5D) (freundlicherweise von J. Hiscott, Montreal, zur Verfügung gestellt). Vier
Stunden nach Infektion mit dem Influenza A Virusstamm FPV war die IRF-3 Translokation
in den Nukleus in IRF-3 Wildtyp-transfizierten Zellen sichtbar (Abb. 4.9.). Zellen, die
dominant negative Mutanten von IRF-3 exprimierten, zeigten keine Virus-induzierte IRF-3
Translokation, während in Zellen, die aktive Mutanten exprimierten, IRF-3 konstitutiv im
Zellkern vorlag. Diese Ergebnisse bestätigten, dass IRF-3 Phosphorylierung und
Translokation in den Zellkern durch Influenza Virus Infektion induziert wurde.
GFP-IRF3 wt
GFP-IRF3 5A
GFP-IRF3 5D
uninfiziert
infiziert mit
5 MOI FPV
für 4 Stunden
Abb. 4.9.: Influenza Virus Infektion induziert IRF-3 Translokation in den Zellkern. MDCK Zellen wurden mit
IRF-3 GFP-Fusionskonstrukten transfiziert. Diese Konstrukte kodieren IRF-3/WT, die aktive Mutante und die
dominant negative Mutante von IRF-3. 24 h nach Transfektion erfolgte die Infektion mit FPV (5 MOI) für 4 h
und anschließende Auswertung am Fluoreszensmikroskop (40fache Vergrößerung).
72
4. Ergebnis
4.11 Induktion IRF-3-abhängiger Genexpression erfolgt spezifisch infolge von Influenza
Virus Infektion oder dsRNA Stimulation
Um in unserem Labor die Virus-induzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF-3
untersuchen zu können, wurde ein Werkzeug hergestellt, mit dessen Hilfe zahlreiche
Signalmediatoren in diesem Zusammenhang getestet werden sollten. Es handelt sich um ein
4x IRF-3 Promotor-Luziferase-Konstrukt, bestehend aus vier hintereinander geschalteten
spezifischen IRF-3 Bindesequenzen aus dem IFNβ-Enhanceosom, die in einen TATALuziferase Expressionsvektor kloniert wurden (Abb. 3.1.). Dieses Konstrukt wird im
folgenden als 4x IRF-3 Promotor bezeichnet.
Um die spezifische Stimulierbarkeit des 4x IRF-3 Promotors zu untersuchen, wurden
zunächst Vektor- und 4x IRF-3 transfizierte MDCK Zellen mittels dsRNA stimuliert bzw. mit
Influenza Viren (PR8/WT, delNS1) infiziert. Eine starke IRF-3 Promotoraktivierung war nach
Behandlung der transfizierten MDCK Zellen mittels dsRNA sichtbar und wurde auch durch
Influenza Virus Infektion mit PR8/WT oder delNS1 hervorgerufen. In MDCK Zellen, welche
mit dem TATA-Luziferase Leervektor transfiziert wurden, konnte keine Promotoraktivierung
durch einen dieser Faktoren stimuliert werden (Abb 4.10).
73
4. Ergebnis
16,00
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
Promotor-Konstrukt
Stimulus
Vektor
mock
Vektor
dsRNA
Vektor
PR8/WT
Vektor
delNS1
IRF-3
mock
IRF-3
ds RNA
IRF-3
PR8/WT
IRF-3
delNS1
Abb. 4.10.: Influenza Virus Infektion und dsRNA Stimulation führen zur spezifischen Aktivierung von IRF-3.
MDCK Zellen wurden mit dem 4x IRF-3 Konstrukt und dem TATA-Luziferase Leervektor transfiziert. Zellen
blieben unbehandelt (mock) und die Stimulation erfolgte mit den Influenza Virus Stämmen PR8/WT oder
delNS1 (5 MOI) oder dem dsRNA Analogon poly(IC) (50 mM) für 4 h. Die Auswertung wurde mittels
Luziferase-Assay durchgeführt.
Um eine weitere Spezifizierung des 4x IRF-3 Promotors im Hinblick auf virale Infektion und
virale Komponenten durchzuführen, wurden Zellen, die mit dem 4x IRF-3 Konstrukt
transfiziert waren, mit Eiklar und unbehandelten Influenza Viren (PR8/WT) bzw. durch UVStrahlung partiell inaktivierte Viren (PR8/WT-UV) infiziert. Da Influenza Viren in
embryonalen Hühnereiern gezüchtet werden, sollte die Verwendung von Eiklar eine
Beteiligung von Ei-Proteinen an der 4x IRF-3 Promotoraktivierung darstellen. Der Einsatz
von partiell inaktivierten Viruspartikeln diente dem Nachweis von dsRNA-ähnlichen,
zellulären Abbauprodukten, die während der Virusreplikation von zerstörten Wirtszellen
freigesetzt werden können.
Die Auswertung des Luziferase-Assays (Abb. 4.11.) ergab eine 20fache 4x IRF-3
Promotoraktivierung infolge der PR8/WT Infektion. Zu einer reduzierten Promotoraktivität
kam es nach Infektion mit Viren, die partiell mit UV-Licht inaktiviert waren. Ei-Proteine
waren an der IRF-3 Promoter Induktion nicht beteiligt, da keine Eiklar-induzierte 4x IRF-3
Promtoraktivität nachgewiesen werden konnte.
74
4. Ergebnis
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
Promotor-Konstrukt
Stimulus
IRF-3
mock
IRF-3
Eiklar
IRF-3
PR8/WT-UV
IRF-3
PR8/WT
Abb. 4.11.: MDCK Zellen wurden mit dem 4x IRF-3 Konstrukt transfiziert. Die Stimulation erfolgte mit dem
Influenza Virus Stamm PR8/WT (5MOI), durch UV-Licht partiell inaktiviertes Virus (PR8/WT (5 MOI) oder
Eiklar (Volumen entsprechend Virusvolumen). Die Zell-Lysate wurden im Luziferase-Assay analysiert.
Nachdem die spezifische Aktivierung des 4x IRF-3 Promotor durch dsRNA Stimulation und
Virus Infektion gezeigt werden konnte, blieb die Frage zu klären, ob dieser 4x IRF-3
Promotor auch durch andere stimulierende Agenzien induziert werden kann.
Zur Klärung dieser Frage wurde der Breitbandstimulus TPA, ein Phorbolester, als Agens
verwendet. TPA ist dafür bekannt AP-1, Ets und NF-κB Stellen aktivieren zu können und
wird zur Untersuchung der allgemeinen Stimulierbarkeit verschiedenster Ereignisse
herangezogen. In den Promotor-Reportergen Studien wurden AP-1/Ets, AP-1 und 4x IRF-3
Promotor Luziferase Konstrukte eingesetzt. Das AP-1 Konstrukt besitzt 5
hintereinanderliegende „TPA responsive element“ (TRE)-Abschnitte, die einem
Luziferasereportergen vorgelagert sind (Angel et al., 1987) und AP-1/Ets ist durch 4 AP1/Ets-Tandem Bindesequenzen charakterisiert (Bruder et al., 1992).
TPA-Stimulation (Abb. 4.12.) der transfizierten MDCK Zellen ergab in diesem
Versuchsansatz 4fache Promoteraktivierung von AP-1/Ets und AP-1, wohingegen 4x IRF-3
nicht aktiviert wurde.
75
4. Ergebnis
4,50
4,00
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Promotor-Konstrukt
Stimul us
AP-1/ets
mock
AP-1/ets
TPA
AP-1
mock
AP-1
TPA
IRF-3
mock
IRF-3
TPA
Abb. 4.12.: TPA ist nicht in der Lage, IRF-3 abhängige Transkription zu induzieren. 2,5 x 105 MDCK Zellen
wurden mit 200 ng der Luziferase Reportergenkonstrukte AP-1/Ets, AP-1 oder 4x IRF-3 transfiziert. 24 h nach
der Transfektion erfolgte die Stimulation mit TPA (100 ng/ml) für 12 h. Analysiert wurden die Zell-Lysate im
Luziferase-Assay. Die Daten repräsentieren den Durchschnittswert von drei unabhängigen Experimenten.
4.12 Die kleinen GTPasen Rac und Rho sind an der Influenza Virus-induzierten IRF-3
Aktivierung beteiligt
Zur Klärung der Frage welche intrazellulären Mediatoren für die Virus-induzierte IRF-3
abhängige Genexpression verantwortlich sind, wurden zusätzlich zum 4x IRF-3 Luziferase
Promoter-Konstrukt verschiedene Signalkomponenten unterschiedlichster Signalwege
überexprimiert. Die Verwendung einzelner dominant-negativer Signalkomponenten würde bei
deren Beteiligung an der Virus-induzierten IRF-3 abhängigen Genexpression zur Blockade
der endogenen Enzyme und letztlich zur Inhibition der IRF-3 Aktivierung führen. Ein
induzierter Signalweg sollte durch Überexpression von Wildtyp-Konstrukten oder aktiven
Mutanten die IRF-3 Aktivierung selektiv steigern.
Eine Beteiligung der Raf/MEK/ERK Signalkaskade, des JNK/SAPK und des MKK6/p38
Signalweges an der Virus-induzierten IRF-3 Aktivierung scheint ausgeschlossen, da
Überexpression verschiedener Signalkomponenten dieser Kaskaden keine Veränderungen in
76
4. Ergebnis
der 4x IRF-3 Aktivierung nach Virus Stimulation bewirken konnten. Folgende für die oben
genannten Signalwege repräsentative, inhibitorisch wirkende Kinase Mutanten wurden in
Promotor-Reportergenstudien eingesetzt: RafC4B, ERK2B3 und ERK2C3 wirken hemmend
auf die Raf/MEK/ERK Signalkaskade, MKK7K>M, SAPKβKK>RR und Tam67 hemmen die
JNK/SAPK/AP-1 Signalkaskade und MKK3Ala, MKK6Ala, p38K>M und p38AF blockieren
den MKK3/MKK6-p38 Signalweg. Die MEK/ERK5 Signalkaskade wurde mittels ERK5AEF
untersucht.
Wie aus den Luziferase-Assays hervorgeht, waren die kleinen GTPasen Rac und Rho, im
Unterschied zu den oben untersuchten Kinasen, in der Lage die Virus-induzierte IRF-3
abhängige Genexpression zu beeinflussen. Abbildung 4.13 zeigt, dass Influenza Virus
Infektion von Rac/WT-transfizierten MDCK Zellen zu einer höheren 4x IRF-3 Promotor
Stimulation führte als Infektion von Vektor-transfizierten Zellen. Die dominant negative
Mutante von Rac repremierte die Grundstimulation von 4x IRF-3 transfizierten, uninfizierten
Zellen und inhibierte die Virus-induzierte 4x IRF-3 Aktivierung stark. Ähnliche Ergebnisse
ergab die Kotransfektion von 4x IRF-3 und Rho-Konstrukten (Abb. 4.13.). Auch hier wurde
die Virus-induzierte 4x IRF-3 Promotoraktivität durch Überexpression des WT-Konstruktes,
im Vergleich zu Vektor-transfizierten Zellen gesteigert. Die dominant negative Mutante von
Rho wirkte wiederum inhibierend, allerdings weniger stark als die dominant negative Mutante
von Rac. Die Überexpression von cdc42-Konstrukten beeinflusste die Virus-induzierte 4x
IRF-3 Promotoraktivität nicht. Demzufolge war eine abnehmende Aktivität von Rac, Rho und
cdc42 zu beobachten.
77
4. Ergebnis
A
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
IRF-3 Promotor-Konstrukt
Stimulus
Vektor
mock
Vektor
PR8/WT
Rac/WT
mock
Rac/WT
PR8/WT
Rac/dn
mock
Rac/dn
PR8/WT
RhoA/dn
mock
RhoA/dn
PR8/WT
30,00
B
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
IRF-3 Promotor-Konstrukt
Stimulus
C
Vektor
mock
Vektor
PR8/WT
RhoA/WT
mock
RhoA/WT
PR8/WT
Vektor
mock
Vektor
PR8/WT
cdc42 WT
mock
cdc42 WT
PR8/WT
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
IRF-3 Promotor-Konstrukt
Stimulus
cdc42 dn
mock
cdc42 dn
PR8/WT
Abb. 4.13.: Die Überexpression der dominant negativen Mutanten von Rac und Rho inhibiert die Virusinduzierte 4x IRF-3 Promotoraktivität. 2,5 x 10 5 MDCK Zellen wurden mit 200 ng 4x IRF-3 Konstrukt und
zusätzlich 500 ng unterschiedlicher Expressionsvektoren kotransfiziert. Diese Expressionsvektoren kodieren (A)
Rac/WT, Rac/dn, (B) Rho/WT, Rho/dn, (C) cdc42/WT, cdc42/dn und den Leervektor. 24 h nach der
Transfektion wurden die Zellen mit PR8/WT (5 MOI) für 4 h infiziert und anschließend im Luziferse-Assay
ausgewertet.
78
4. Ergebnis
Nach Stimulation der kotransfizierten MDCK Zellen mit dsRNA kam es, wie nach Influenza
Virus Infektion, zu einer Aktivierung von 4x IRF-3 in Vektor-transfizierten Zellen und zu
einer gesteigerten 4x IRF-3 Aktivität in Rac/WT-transfizierten Zellen. Die dominant negative
Mutante von Rac wirkte wiederum repremierend auf die Grundaktivität von IRF-3 und stark
inhibierend auf die dsRNA stimulierte Aktivierung (Abb 4.14.). Rho-transfizierte MDCK
Zellen zeigten im Vergleich zu Vektor-transfizierten Zellen keine signifikanten Unterschiede
in der induzierten 4x IRF-3 Aktivierung. Grund hierfür könnten einerseits die geringe, durch
dsRNA-induzierte Stimulation und andererseits die nur teilweise Beeinflussung von IRF-3
durch Rho sein.
A
16,00
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
IRF-3 Promotor-Konstrukt
Stimulus
B
Vektor
mock
Vektor
dsRNA
Rac/WT
mock
Rac/WT
dsRNA
Rac/dn
mock
Rac/dn
dsRNA
Vektor
mock
Vektor
dsRNA
Rho/WT
mock
Rho/WT
dsRNA
Rho/dn
mock
Rho/dn
dsRNA
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
IRF-3 Promotor-Konstrukt
Stimulus
Abb. 4.14.: dsRNA induzierte 4x IRF-3 Promotoraktivität wird durch Inhibition von Rac reduziert.
2,5 x 10 5 MDCK Zellen wurden mit 200 ng 4x IRF-3 Konstrukt und zusätzlich 500 ng unterschiedlicher
Expressionsvektoren kotransfiziert. Diese Expressionsvektoren kodieren (A) Rac/WT, Rac/dn oder (B) Rho/WT,
Rho/dn und den Leervektor. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit dem dsRNA Analogon Poly(IC)
für 4 h stimuliert und anschließend im Luziferse-Assay ausgewertet.
79
4. Ergebnis
4.13 Die kleine GTPase Rac wird infolge von Influenza Virus Infektion aktiviert
Nachdem gezeigt werden konnte, dass infolge einer Influenza Virus Infektion der 4x-IRF-3
Promotor aktiviert und durch Überexpression dominant negativer GTPase Mutanten inhibiert
wird, sollte die tatsächliche Aktivierung der GTPase nachgewiesen werden. Hierzu wurde ein
sogenannter Pull-Down-Assay durchgeführt, in dem ein rekombinantes GST-Fusionsprotein
eingesetzt wurde, das es ermöglicht, die aktivierte, GTP-beladene Form der GTPase Rac aus
Zell-Lysaten zu präzipitieren. Wie Abb. 4.15. zeigt, erfolgte bereits 1 h nach Virus Infektion
die Rac Aktivierung.
0´ 15´
Infektion (FPV, 5MOI)
30´ 1h
2h 4h
- Rac-1
Abb. 4.15.: Rac wird infolge von Influenza Virus Infektion aktiviert. 293 Zellen wurden für die angegebenen
Zeitwerte mit 10 MOI FPV infiziert und in einem spezifischen Lyse-Puffer (siehe 3.4.9.2) geerntet. Es erfolgte
eine Inkubation mit einem rekombinanten GST-Fusionsprotein (PAK) und Auftrennung der Banden auf einer
SDS-Page. Die Detektion wurde mittels eines spezifischen anti-Rac-1 Antiserums erreicht.
4.14 Endogene IRF-3 Aktivierung wird sowohl nach Influenza Virus Infektion als auch
nach ds RNA Stimulation induziert
In unstimulierten Zellen befindet sich inaktives IRF-3 im Zytoplasma. Stimulationsereignisse,
die Phosphorylierungen am C-Terminus verursachen, führen zu Konformationsänderungen,
Aufhebung der Autoinhibition und letztlich zur Aktivierung der transkriptionellen Aktivität
von IRF-3. Nach Translokation in den Zellkern, assoziiert aktiviertes IRF-3 mit
Koaktivatoren und stimuliert DNA Bindung und transkriptionelle Aktivität verschiedener
Gene (Lin et al., 1999). Um einen Eindruck über den zeitlichen Verlauf der Virus- und
80
4. Ergebnis
dsRNA-induzierten Aktivierung des in der Zelle vorhandenen, endogenen IRF-3 zu erhalten,
wurden MDCK Zellen 0 bis 6 Stunden (siehe Abb. 4.16.) mit Influenza Virus (PR8/WT)
infiziert oder mit dsRNA stimuliert. Infolge einer Influenza Virus Infektion kam es bereits
nach 15 min zu einer IRF-3 Phosphorylierung, angezeigt durch eine verzögerte Migration im
SDS-Gel, die 30 min nach Infektion nicht mehr sichtbar war. 4 bis 8 h nach Infektion kam es
zu einer starken Phosphorylierung von IRF-3. Ähnliche Ergebnisse rief die Stimulation der
Zellen mit dsRNA hervor. Hier kam es allerdings schon nach 2-4 h zu einer deutlichen IRF-3
Phosphorylierung.
Zusammenfassend zeigen diese Daten eine starke Phosphorylierung von IRF-3 2-8 h nach
Stimulation/Infektion.
A
PR8/WT
0´ 15´ 30´ 1h 2h 4h 6h 8h
- P IRF-3
- IRF-3
- JNK-1
B
dsRNA
0´
5´ 10´ 15´ 30´ 1h 2h 4h
- P IRF-3
- IRF-3
- JNK-1
Abb. 4.16.: Influenza Virus Infektion und dsRNA Stimulation führt zur IRF-3 Phosphorylierung. (A) MDCK
Zellen wurden mit dem Influenza Virus Stamm PR8/WT (5 MOI) von 0 bis 8 h infiziert und anschließend
lysiert. (B) MDCK Zellen wurden für 0 bis 4 h mit dem dsRNA Analogon Poly(IC) (50 mM) stimuliert und
anschließend lysiert. Die Auftrennung der Proteine erfolgte auf einem SDS-Gel. Das spezifische pan-Antiserum
gegen IRF-3 (Zymed) ist in der Lage neben endogenem unphosphoryliertem IRF-3 auch phophoryliertes IRF-3,
in Form einer geschifteten Bande im Western Blot sichtbar zu machen. Die aufgetragene Proteinmenge wurde
mit Hilfe eines JNK-1 Antikörpers detektiert.
81
4. Ergebnis
4.15 Virus-induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von IRF-3 wird durch das
Clostridium difficile toxin B-10463 gehemmt
Die Daten der Luziferase-Assays (Abbildungen 4.13. und 4.14.) implizieren eine wichtige
Rolle der kleinen GTPasen Rho und Rac in der Influenza Virus- und dsRNA-induzierten
Aktivierung von IRF-3. Um deren Beteiligung auch auf endogener Ebene nachweisen zu
können, wurde ein spezifischer Inhibitor gegen Rho und Rac eingesetzt und die Virus- und
dsRNA-induzierte endogene IRF-3 Aktivierung auf Proteinebene im Westen-Blot untersucht.
Clostridium difficile produziert, wie viele andere Bakterien Toxine, die kleine GTPasen
chemisch modifizieren und dadurch inaktivieren. Das clostridiale Toxin TcdB ist ein relativ
großes Toxin. Es besteht aus 2366 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 269 kDa
(Barroso, 1990). Intrazellulär monoglykosyliert Toxin B mit seiner N-terminalen
Enzymdomäne Threonin 37 von RhoA und Threonin 35 von Rac1 und Cdc42 (Just et al.,
1995). Diese Glykosylierung vermindert die intrinsische GTPase Aktivität um den Faktor 5
und blockiert den Membran-Zytosol Wechsel der Rho-Proteine (Genth, 1999). Das in den
folgenden Versuchen eingesetzte TcdB-10463 ist in der Lage RhoA, Rac1 und Cdc42 durch
Glykosylierung zu inaktivieren (von Prof. Dr. von Eichel-Streiber, Institut für Med.
Mikrobiologie und Hygiene der Johannes Gutenberg Universität, Mainz, freundlicherweise
zur Verfügung gestellt).
MDCK Zellen wurden 2-3 h vor Infektion mit dem clostridialen Toxin B-10463 (10 ng/ml)
inkubiert. Sobald die Zellen ihre Zellkontakte lösten (im Mikroskop sichtbar), erfolgte die
Infektion mit dem Influenza Virus Stamm PR8/WT bzw. die Stimulation mit dsRNA und eine
darauffolgende Inkubation in Anwesenheit des Toxins .
Sowohl die 4-stündige Influenza Virus Infektion, als auch dsRNA Stimulation verursachten
starke Phosphorylierung von IRF-3, im Gegensatz zu den unbehandelten Zellen. Die
Induktion der Phosphorylierung wurde durch das clostridiale Toxin B verhindert. Diese Daten
82
4. Ergebnis
bestätigen eine Beteiligung der kleinen GTPasen Rac und Rho an der Influenza Virus- und
dsRNA induzierten IRF-3 Phosphorylierung.
B
A
PR8/WT
TcdB-10436
-
+
-
+
+
+
dsRNA
TcdB-10436
-
+
-
+
+
+
- P IRF-3
- IRF-3
- P IRF-3
- IRF-3
- ERK-2
- ERK-2
Abb. 4.17.: Virus- und dsRNA-induzierte IRF-3 Phosphorylierung wird durch Hemmung der kleinen RhoGTPasen blockiert. MDCK Zellen wurden 2-3 h vor Infektion mit dem clostridialen Toxin B-10463 (10 ng/ml)
inkubiert. Sobald die Zellen ihre Zellkontakte lösten (im Mikroskop sichtbar), erfolgte die Infektion mit dem
Influenza Virus Stamm PR8/WT (5 MOI) bzw. die Stimulation mit dsRNA (50 mg/ml) und eine weitere
Inkubation in Anwesenheit des Toxins für 3 h. Nach Auftrennung der Proteine auf einem SDS-Gel erfolgte deren
Detektion mittels eines spezifischen IRF-3 Antikörpers im Western-Blot. Verwendung gleicher Proteinmengen
wurde anhand ERK-2 im Western-Blot sichergestellt.
4.16 Überexpression der dominant negativen Mutanten von Rac und Rho verhindern die
Virus-induzierte IRF-3 Aktivierung
Um die mit dem Toxin B-10463 Inhibitor erhaltenen Daten unabhängig zu bestätigen, wurden
Expressionskonstrukte für Rac/WT bzw. Rho/WT und die dominant negative Mutante von
Rac bzw. Rho in MDCK Zellen transfiziert. Influenza Virus Infektion (PR8/WT) verursachte
eine starke IRF-3 Phosphorylierung in Vektor-transfizierten Zellen, die durch Überexpression
des Rac/WT noch erhöht wurde (Abb. 4.18). Dagegen verringerte die überexprimierte
dominant negative Mutante von Rac die Influenza Virus-induzierte IRF3-Phosphorylierung.
Auch die Überexpression des Rho/WT Proteins zeigte infolge der Influenza Virus Infektion
eine starke IRF-3 Phosphorylierung, die aber im Vergleich mit den Vektor-transfizierten
83
4. Ergebnis
Zellen nicht gesteigert wurde. Die dominant negative Mutante von Rho war in der Lage, die
Virus-induzierte IRF-3 Phosphorylierung zu mindern, wirkte aber nicht so effizient wie die
dominant negative Mutante von Rac. Die Ergebnisse dieses Western-Blots korrelieren mit
denen der Luziferase-Assays und zeigen, dass Rac grössere Wirkung auf die IRF-3
Stimulation ausübt als Rho. Aus diesen Daten ist zu schliessen, dass Rac und Rho wichtige
Mediatoren der Influenza Virus- und dsRNA-induzierten IRF-3 abhängigen Genexpression
sind.
A
PR8/WT
Vektor
Rac/WT Rac/dn
-
-
+
+
-
+
- P IRF-3
- IRF-3
- ERK-2
B
PR8/WT
Vektor
+
Rho/WT Rho/dn
+ - +
- P IRF-3
- IRF-3
- ERK-2
Abb. 4.18.: Überexpression der dominant negativen Mutanten von Rac und Rho verhindern die Virus-induzierte
IRF-3 Aktivierung. MDCK Zellen wurden mit Plasmiden die Rac/WT, Rho/WT, Rac/dn oder Rho/dn
exprimieren transfiziert und mit dem Influenza A Virusstamm PR8/WT infiziert. Die Detektion der, auf einem
SDS-Gel aufgetrennten Proteine, erfolgte mittels eines IRF-3 Antiserums. Die Auftragung gleicher
Proteinmengen wurde mit Hilfe eines ERK-2 Antikörpers sichergestellt.
84
4. Ergebnis
4.17 Virus- und dsRNA-induzierte DNA Bindung von IRF-3 wird durch die dominant
negativen Mutanten von Rac und Rho gehemmt
Die vorherigen Experimente haben die IRF-3-abhängige Genexpression infolge einer
Influenza Virus Infektion und dsRNA Stimulation gezeigt. Innerhalb der Virus- und dsRNAinduzierten Signalübertragung wurden die kleinen GTPasen Rac und Rho als wichtige
Mediatoren identifiziert. Weitere Untersuchungen sollten die Bedeutung von Rac und Rho für
die IRF-3 Aktivität während der Transkription darstellen. „Elektro Mobility Shift Assays“
(EMSA) sollten zeigen, ob Transkriptionsfaktoren an IRF-3 Konsensus-Bindestellen der
DNA während der Virusinfektion bzw. dsRNA Stimulation, auch bei Überexpression der
dominant negativen Mutanten der kleinen GTPasen binden. Aus diesem Grund wurden
MDCK Zellen mit Expressionskonstrukten für einen Leervektor und die dominant negativen
Mutanten von Rac und Rho transfiziert, mit Influenza Virus infiziert oder dsRNA stimuliert.
Die Resultate des EMSA (Abb. 4.19) zeigten eine Hochregulation der IRF-3 Faktoren 4 h
nach Virus Infektion und dsRNA Stimulation. Sowohl die dominant negative Mutante von
Rac, als auch jene von Rho inhibierten Virus- und dsRNA-induzierte DNA Bindung von IRF3, was in Form von schwächeren Banden sichtbar war. Hemmungsexperimente, in denen
nicht radioaktiv markierte IRF-3 (ISGF 15) Oligonukleotide (1:10), als sog. Kompetitoren
verwendet wurden, beweisen, dass die Proteine IRF-3-spezifische Bindefaktoren waren.
Ein weiterer EMSA, in dem ein anderes IRF-3 spezifisches Oligonukleotid (PRDI/III)
verwendet wurde, dieses Oligonukleotid entspricht der IRF-3 spezifischen Bindungssequenz
aus dem IFNβ-Enhanceosom, zeigte ebenfalls, dass dsRNA-induzierte DNA Bindung von
IRF-3 durch die dominant negativen Mutanten von Rac und Rho unterbunden wurde. Der
Einsatz eines nicht radioaktiv markierten IRF-3 (PRDI/III) Oligonukleotids (1:10) zeigte, dass
es sich bei den Proteinen um IRF-3 spezifische Bindefaktoren handelte.
85
4. Ergebnis
A
Rac/dn
Vektor
mock
PR8/WT
dsRNA
+
Rho/dn
+
+
Vektor
+
+
+
+
+
+
+
Kompetition
+
1:10 1:10
ISGF-15
B
Vektor
mock
dsRNA
+
+
+
Rac/dn
Rho/dn
+
+
+
+
Kompetition 1:10
PRDI/III
Abb. 4.19.: Virus- und dsRNA-induzierte DNA Bindung von IRF-3 wird durch die dominant negativen
Mutanten von Rac und Rho gehemmt. MDCK Zellen wurden mit Plasmiden, die einen Leervektor oder die
dominant negativen Mutanten von Rac bzw Rho exprimieren, transfiziert und mit dem Influenza Virus Stamm
PR8/WT (A) infiziert bzw. dsRNA (A, B) stimuliert. Die präparierten Kernextrakte wurden im EMSA mittels
radioaktiv gelabelter IRF-3 Proben (ISGF-15 (A), PRDI/III (B)) analysiert. Die spezifische IRF-3 DNA Bindung
konnte in Anwesenheit der entsprechenden ungelabelten Oligonukleotide (Kompetitor, 1:10) unterdrückt
werden.
86
4. Ergebnis
4.18 Die Blockade der kleinen GTPasen wirkt hemmend auf die transkriptionelle
Aktivierung des IFNß Promotors
Um die Bedeutung der GTPasen Rac und Rho für Virus-induzierte Promotoraktivierung eines
nach Infektion freigesetzten Zytokins zu ermitteln, wurde ein IFNβ Promotor Luziferase
Konstrukt in Promotor-Reportergenstudien eingesetzt. Bekanntermassen ist IFNβ ein sehr
bedeutendes antivirales Zytokin, das infolge einer Influenza Virus Infektion stark induziert
wird (Julkunen et al., 2001). Darüber hinaus besitzt IFNβ in seiner Promotorregion eine
Bindestelle für IRF-3 (Hiscott et al., 1999) und stellt demzufolge ein wichtiges
Untersuchungsobjekt dar.
Die Resultate der Luziferase-Assays zeigten nach Infektion mit dem Influenza Virus Stamm
FPV (4.20 A) bzw. nach Stimulation mit dsRNA (4.20 B) eine erhöhte IFNβ Aktivierung in
Rac/WT- und in Rho/WT-transfizierten MDCK Zellen. Die jeweiligen dominant negativen
Mutanten inhibierten die Virus- bzw. dsRNA-induzierte IFNβ Aktivierung. Auch in diesen
Experimenten wirkte die kleine GTPase Rho in geringerem Maße als Rac aktivierend, wie
repremierend auf die induzierte Promotoraktivität. Insgesamt sprechen diese Daten für eine
Korrelation der Rac und Rho vermittelten IRF-3 und IFNβ Promotoraktivierung.
87
4. Ergebnis
A
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
IFNß Promoto r-Konstrukt Vektor
Stimulus mock
B
Vektor
FPV
Rac/WT
mock
Rac/WT
FPV
Rac/dn
mock
Rac/dn
FPV
Rho/WT Rho/WT Rho/dn
mock
FPV
mock
Rho/dn
FPV
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
IFNß Promoto r-Konstrukt Vektor
Stimulus mock
Vektor
dsRNA
Rac/WT
mock
Rac/WT
dsRNA
Rac/dn
mock
Rac/dn
dsRNA
Rho/WT Rho/WT Rho/dn
mock
dsRNA
mock
Rho/dn
dsRNA
Abb. 4.20.: Die Blockade der kleinen GTPasen wirkt hemmend auf die Virus- und dsRNA-induzierte IFNßPromotoraktivität. 2,5 x 10 5 MDCK Zellen wurden mit 200 ng IFNβ Luziferase Reportergenkonstrukt und
zusätzlich 500 ng unterschiedlicher Expressionsvektoren kotransfiziert. Diese Expressionsvektoren kodieren für
Rac/WT, Rho/WT, Rac/dn, Rho/dn und den Leervektor. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen entweder
mit (A) PR8/WT (5 MOI) oder (B) dem dsRNA Analogon Poly(IC) für 4 h stimuliert und anschließend im
Luziferse-Assay ausgewertet.
88
4. Ergebnis
4.19 Die Inhibition der kleinen GTPasen steigert die Virusreplikation
Um sicher zu stellen, dass die Inhibition der kleinen GTPasen Rho/Rac, die sich in räumlicher
Nähe der Zelloberfläche befinden, nicht die Virusaufnahme und Replikation negativ
Prozent der Virusmenge im Vergleich zur Kontrolle (%)
beeinflussen, wurden die Virustiter der inhibierten und infizierten Zellen bestimmt.
180%
100%
0,00
Virus-Stamm
TcdB-10436
FPV
-
FPV
+
PR8/WT
-
PR8/WT
+
Abb. 4.21.: Die Inhibition der kleinen GTPasen steigert die Virusreplikation. Die Überstände der in Abb. 4.17
beschriebenen Zellen wurden nach 13 h abgenommen und im Plaque-Assay auf MDCK Zellen eingesetzt.
Es konnte somit gezeigt werden, dass die kleinen Rho-GTPasen die Virusreplikation nicht
beeinträchtigen und demnach tatsächlich spezifisch hemmend auf eine Influenza Virusinduzierte Signalkaskade wirken, die zur Induktion des Transkriptionsfaktors IRF-3 führen.
89
5. Diskussion
5. Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Aufklärung Influenza Virus-induzierter SignalMechanismen, um Abwehrmechanismen der Wirtszellen und somit das Zusammenspiel
zwischen Virus und Wirt besser verstehen zu lernen. Influenza Virus/Wirtszell-Interaktionen
können prinzipiell in drei Gruppen eingeteilt werden. (i); Interaktionen, welche die
Virusvermehrung ermöglichen, beispielsweise das RNA-Splicen oder das „Cap-snatching“.
(ii); Interaktionen, welche Merkmale der antiviralen Antwort der Zelle darstellen, z.B. die
Interferon Produktion. (iii); Interaktionen, welchen bis jetzt keine speziellen Funktionen
zugewiesen werden konnten oder welche scheinbar zufällig auftreten und weder die virale
Vermehrung unterstützen, noch die Zellabwehr fördern. Als Beispiel für die letztere Gruppe
von Interaktionen könnte die Phosphorylierung des M2-Proteins betrachtet werden, die für die
Influenza Virus Vermehrung nicht essentiell zu sein scheint (Thomas et al., 1998).
Infolge einer Influenza Virus Infektion werden eine Reihe von Chemokinen und Zytokinen
wie: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INFβ, IFNγ und TNF exprimiert (Choi et al.,
1992; Ochiai et al., 1993; Pahl et al., 1995; Sprenger et al,. 1996; Knobil et al., 1998).
Die meisten dieser Zytokine tragen in ihren Promotorregionen Bindestellen für
Transkriptionsfaktoren der NF-κB und AP-1 Familien. In Bezug auf NF-κB konnte bereits
gezeigt werden, dass die Expression einzelner Influenza Proteine zur Aktivierung von NF-κB
und NF-κB abhängiger Genexpression führt. Dieser Effekt scheint spezifisch für NF-κB zu
sein, da eine Transaktivierung von Promotoren mit Bindestellen für Transkriptionsfaktoren
der AP-1 und Ets Familie nicht beobachtet wurde (Flory et al., 2000). Weiterhin ist bereits
bekannt, dass die Aktivierung von NF-κB infolge Virus Infektionen über die IκB Kinase
(IKK) erfolgt (Kumar et al., 1994; Chu et al., 1999; Flory et al., 2000). Dies gilt auch für
Influenza Virus Infektion.
90
5. Diskussion
Die Aktivierung von AP-1 kann nicht durch die Expression einzelner Influenza Proteine
hervorgerufen werden. Dennoch weiß man, dass Influenza Infektion zur Hochregulation von
AP-1 abhängigen Genen, beispielsweise von IFNβ oder IL-8 führt (Choi et al., 1992;
Sprenger et al., 1996; Knobil et al., 1998). Demzufolge müssen andere Mechanismen als die
reine Überexpression viraler Proteine eine Rolle spielen. Normalerweise erfolgt die Kontrolle
der AP-1 Aktivität sowohl auf transkriptioneller Ebene, als auch durch posttranslationale
Veränderungen (Karin et al., 1997). Die Ergebnisse der Diplomarbeit haben gezeigt, dass die
transkriptionelle Hochregulation der einzelnen AP-1 Faktoren eine unbedeutende Rolle in der
AP-1 abhängigen Genexpression spielt, da die einzelnen AP-1 Faktoren konstitutiv an die
DNA gebunden sind. Die Zusammensetzung der einzelnen Komplexe ändert sich auch infolge
einer Influenza Virus Infektion nicht (Ludwig et al., 2001).
Daher wurde in dieser Arbeit zunächst untersucht, ob es nach einer Influenza Virus Infektion
tatsächlich zur Phosphorylierung und Aktivierung einzelner AP-1 Faktoren kommt. Zu
diesem Zweck wurde die Phosphorylierung des AP-1 Faktors ATF-2 betrachtet, von dem
bekannt ist, dass er eine wichtige Rolle in der Virus-induzierten Expression antiviraler
Zytokine spielt (Du et al., 1992; Wathelet et al., 1998). Die Influenza Virus-induzierte
Phosphorylierung von ATF-2 ist vier bis acht Stunden nach der Infektion in permissiven
Zell-Linien sichtbar (Abb. 4.1A). Eine Spezifizierung des an der ATF-2 Phosphorylierung
beteiligten Signalweges konnte mittels des spezifischen p38 Inhibitors SB202190 erfolgen.
Da lediglich die beiden Kinasen p38 und JNK/SAPK für die ATF-2 Phosphorylierung
bekannt sind, sollte ein Ausschlussverfahren zu Hilfe gezogen werden. Die produktive
Infektion von Zellen bewirkt eine starke Aktivierung des JNK/SAPK Signalweges und führt
zur Aktivierung von AP-1. Obwohl der p38 Signalweg ebenfalls infolge von Influenza Virus
Infektion aktiviert wird, scheint er nicht in die Phosphorylierung von ATF-2 involviert zu
sein, da effektive Konzentrationen von SB202190 diese Phosphorylierung nicht vermindern
oder gar hemmen konnten (Abb. 4.1B). Somit ist vermutlich die JNK/SAPK Signalkaskade
für die beobachtete Phosphorylierung verantwortlich.
91
5. Diskussion
Auf der Suche nach den, für die Induktion der Signaltransduktion und letztlich der
Genexpression, relevanten Viruskomponenten konnte gezeigt werden, dass die
Virusreplikation für die Aktivierung von JNK/SAPK von essentieller Bedeutung ist. Das
antiviral wirkende Agens Amantadin, das die Freisetzung der Influenza Virus Partikel
inhibiert, indem es die Protonenaufnahme über den M2 Ionenkanal in das Endosom blockiert,
ruft eine 50% geringere JNK Aktivierung acht Stunden nach Infektion hervor, einhergehend
mit einem 50% niedrigerem Virustiter. Eine weitere Beobachtung, die mit der Relevanz der
Replikation einhergeht, stammt aus Zellen, die eine virale Replikation nicht unterstützen.
Solche nicht permissiven Zellen, wie T-Lymphozyten oder HeLa Zellen zeigen keine
Influenza Virus-induzierte JNK und AP-1 Aktivierung. Zwar infizieren die Influenza Virus
Partikel diese Zellen, der Replikationszyklus läuft jedoch abortiv ab und es werden keine
neuen Viren freigesetzt. Neben der Influenza Virus Infektion resultieren Infektionen mit dem
Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) (Chu et al., 1999) oder Enzephalomyokarditis Virus
(Iordanov et al., 2000) ebenfalls in einer starken JNK Aktivierung. Zu klären bleibt, warum es
zu keiner JNK Aktivierung in nicht permissiven Zellen kommt, obwohl beispielsweise in
HeLa Zellen noch Virus-spezifische RNA gebildet wird. Dies könnte ein Konzentrationsoder ein Kinetik Phänomen sein. Auch das dsRNA Analogon Poly(IC) ist in der Lage JNK zu
induzieren. Demzufolge scheint die virale Replikation und die Ansammlung viraler RNA
hauptverantwortlich für die starke JNK Aktivierung zu sein. Allerdings sind den
Untersuchungsmöglichkeiten durch die Verwendung von Poly(IC) Grenzen in der
Repräsentation von RNA von sich replizierenden Einzelstrang-RNA Viren gesetzt. Aus
diesem Grund wurde ein auf Plasmiden basierendes Replikationssystem für vRNA-ähnliche
Pol I Transkripte verwendet, um die Transkription und Replikation des viralen Genoms in
Abwesenheit einer Infektion zu imitieren (Pleschka et al., 1996). Mit Hilfe dieses Systems
konnte zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass Akkumulation Virus-spezifischer RNA
die Aktivierung der JNK Signalkaskade veranlasst. Obwohl die virale RNA mit
Nukleoproteinen komplexiert vorliegt und auf diese Weise RNP Komplexe bildet, besitzt sie
92
5. Diskussion
die Kapazität der Signalinduktion. Demzufolge ist es wichtig, die direkten zellulären
Signalsensoren für virale RNA zu identifizieren. Bislang ist ein einziges zelluläres signalübertragendes Enzym bekannt, die 68-kDa große Doppelstrang-abhängige RNA-abhängige
Kinase (PKR), die direkt von der dsRNA reguliert wird (Williams et al., 1999) und die
Phosphorylierung der α-Untereinheit des Eukaryotischen Initiations Faktors 2 inhibiert (de
Haro et al., 1996).
Es konnte gezeigt werden, dass JNK und seine oberhalb gelegenen Aktivatoren MKK4/SEK
und MKK7 die Influenza Virus-induzierte AP-1 Aktivierung vermitteln. Verschiedenste
Kinasen sind wiederum als Aktivatoren von MKK7 und MKK4/SEK bekannt (Fanger et al.,
1997) und könnten in die Virus-induzierte JNK Aktivierung involviert sein, jedoch konnte
keine dieser Kinasen durch dsRNA induziert werden. Demnach bleibt die Frage zu klären,
welche dsRNA-regulierten Enzyme oberhalb von MKK4/SEK und MKK7 liegen.
Interessanterweise scheinen die, auf JNK/SAPK synergistisch wirkenden Kinasen
MKK4/SEK und MKK7 unterschiedliche Aktivierungseigenschaften zu besitzen. Die
Inhibition von MKK7 führt zu gesteigerten Virustitern, wohingegen die Inhibition von
MKK4/SEK verminderte Virusmengen hervorruft. Diese Daten legen die Vermutung nahe,
dass MKK4/SEK neben der JNK/SAPK Aktivierung einen weiteren Signalweg induzieren
kann, der möglicherweise die virale Replikation unterstützt. Die synergistische Wirkung von
MKK4/SEK und MKK7 könnte mit einer Erhaltung des Gleichgewichtes zwischen der
Virusausbreitung und dem Zelltod des Wirtes erklärt werden.
Neben dem JNK/SAPK Signalweg wird infolge einer Influenza Virus Infektion die
Raf/MEK/ERK-Signalkaskade (MAPK-Kaskade) induziert. Dabei ist eine biphasische
Aktivierung mit einem sehr frühen Zeitpunkt (circa 5-30 min p.i.) und in späten Stadien des
Vermehrungszyklus zu beobachten. In den nicht permissiven HeLa Zellen fehlt allerdings die
späte ERK Aktivierung. Demzufolge könnte die physikalische Bindung des Virus an seine
Rezeptoren zu einer ersten Aktivierung führen, wodurch zunächst normale virale
93
5. Diskussion
Proteinsynthese induziert wird. Die späte Aktivierung während des Vermehrungsprozesses
scheint sehr spezifisch zu erfolgen (Pleschka et al., 2001) und könnte der Auslöser des
fehlerhaften Knospungsprozesses (Budding) in HeLa Zellen sein (Gujuluva et al., 1994). Der
Defekt im Knospungsprozess kommt letzten Endes vermutlich durch falsch in die Membran
eingebaute HA Proteine zu Stande (Portincasa et al., 1990). In T-Lymphozyten kommt es
ebenso zur Produktion einer Reihe viraler Proteine, die aber nicht zu neuen Viruspartikeln
zusammengesetzt werden (Brownson et al., 1979).
Normalerweise tritt 5-6 h nach einer Influenza Virus Infektion eine Beendigung der
wirtseigenen Proteinsynthese auf (Lamb et al., 1996). Für die Wirtsabwehr wichtig ist hierbei
vor allem die Produktion des sehr potenten Zytokins IFNβ, das infolge einer Influenza Virus
Infektion freigesetzt wird. IFNβ besitzt in seiner Promotorsequenz u.a. Bindestellen für
Transkriptionsfaktoren der NF-κB und AP-1 Familien (Maniatis et al., 1998, Julkunen et al.,
2001). Bevor die wirtseigene Proteinsynthese ausgeschaltet wird, muss demzufolge die
Transaktivierung des IFNβ Promotors erfolgen. In der Tat kommt es zur Induktion der JNK
Aktivität 2-4 h nach der Influenza Virus Infektion, wie auch der viralen Induktion der AP-1
abhängigen Genexpression und somit auch der IFNβ Produktion. Die späte Virus-induzierte
JNK Aktivität 8-10 h nach der Infektion hat vermutlich an Ereignissen der Genexpression
keinen Anteil. Obwohl die Viren dieser späten Aktivierung nicht entgegenwirken, ist diese für
die Virusreplikation vermutlich nicht von Nutzen, da eine Verminderung der JNK Aktivität
zu einer gesteigerten Virusvermehrung führt (Abb. 4.4C) und folglich einen schnellen Zelltod
verursachen würde.
Die Influenza Virus induzierte Aktivierung der AP-1 abhängigen Genexpression und anderer
Transkriptionsfaktoren induziert die Expression antiviraler (z.B. IFNβ), proinflammatorischer
(TNFα, IL-6) und chemotaktischer (z.B. RANTES) Zytokine, die sowohl die angeborene, als
auch die erworbene Immunantwort gegen die eingedrungenen Viren bilden (Biron et al.,
2001; Julkunen et al., 2001). Darüber hinaus kann die Aktivierung von JNK und c-Jun in die
94
5. Diskussion
Induktion der Apoptose verwickelt sein (Shaulian et al., 2001), die während einer Influenza
Virus Infektion auftritt (Schultz-Cherry et al., 1998). Als viraler Regulator der Genexpression
ist das Influenza Virus Protein NS1 bekannt, das sowohl die Prozessierung der VorläufermRNA, als auch den Export der zellulären mRNA aus dem Kern ins Zytoplasma inhibiert und
die Translation steigert (de la Luna et al., 1995; Fortes et al., 1994; Salvatore et al., 2002). Ein
charakteristisches Merkmal des NS1 Proteins ist seine Fähigkeit, dsRNA binden zu können
(Talon et al., 2000; Wang et al., 2000). Die Inhibition der JNK induzierten Immunantwort
durch das NS1 Protein steigert die Effizienz der viralen Replikation und damit die
Virusausbreitung. Neuere Daten haben jedoch gezeigt, dass NS1 nicht nur als IFN-Antagonist
wirken kann, sondern auch IFN-unabhängiges antiapoptotisches Potential besitzt und die
apoptotische Antwort in Influenza Virus-infizierten Zellen herabreguliert (Zhirnov et al.,
2002). Die unterschiedliche Wirkungsweise der NS1 Proteine ist wahrscheinlich vom
Replikationsstadium des Virus abhängig. Zu frühen Zeitpunkten könnten die NS1 Proteine
dem IFN-System entgegenwirken, um die Virusreplikation zu gewährleisten, wohingegen die
Förderung der Apoptose zu späteren Zeitpunkten die Virusverbreitung unterstützen könnte.
Wahrscheinlich wird auf diese Weise die Pathogenität der Viren beeinflusst (Schultz Cherry
et al., 1998 ; Zhirnov et al., 2002).
Die hier vorliegende Charakterisierung des NS1 Proteins als einen spezifischen Antagonisten
der Virus- und dsRNA-induzierten Aktivierung der JNK Aktivität und als einen Antagonisten
der durch JNK iduzierten Transkriptionsfaktoren, wie AP-1, ist bislang der erste Nachweis für
diese antagonistische Eigenschaft eines viralen Proteins. Da eine große Anzahl von Genen
von AP-1 Faktoren reguliert wird, erscheint es wahrscheinlich, dass NS1 nicht nur auf die
Aktivität des IFNβ Promotors, sondern auch auf andere Zielgene inhibierend wirkt. Weiterhin
exprimieren möglicherweise auch andere Viren Genprodukte, die der Funktion des NS1
Proteins entsprechen. Beispielsweise wird diese Hypothese durch eine neuere Entdeckung
unterstützt, die zeigt, dass das Rotavirusprotein VP8
die TRAF-2 abhängige JNK
Aktivierung blockiert, wobei zu klären ist, ob dies während der viralen Infektion geschieht
95
5. Diskussion
(La Monica et al., 2001). Ein weiterer Kandidat mit antagonistischer Wirkung gegen IFN ist
das Ebola Protein VP35, das dsRNA- und Virus-vermittelte Aktivierung des IFN-Promotors
in vitro inhibieren konnte (Basler et al., 2000). Auch das Herpes Simplex Protein ICP34.5
zeigt antagonistische Eigenschaften gegenüber IFN (He et al., 1997).
Die Influenza Virus-induzierte JNK Aktivität wird, wie bereits in Absatz 4.5. erwähnt, durch
Phosphorylierung der dualspezifischen Kinasen MKK4 und MKK7, die von anderen
Regulatoren kontrolliert werden, induziert (Davis et al., 2000). Da weiterhin gezeigt werden
konnte, dass NS1 die JNK Aktivierung und AP-1 Induktion inhibiert, stellt sich die Frage, an
welchen Stellen der Signalkaskade dieses Protein seine Wirkung entfalten kann. Die Protein
Kinase R (PKR) und die 2´,5´-Oligoadenylat Synthetase könnten potentielle Sensoren für
Doppelstrang- und/oder virale RNA sein, die JNK aktivieren, da beide Enzyme RNA binden
können (Goh et al., 2000; Iordanov et al., 2000 Iordanov et al., 2001), obwohl an anderer
Stelle gezeigt wurde, dass die JNK Aktivierung unabhängig von PKR erfolgt (Chu et al.,
1999). Vermutlich verbreitet das NS1 Protein seine inhibitorische Funktion durch seine
Fähigkeit, direkt dsRNA zu binden, die daraufhin nicht mehr in der Lage ist,
Signalmechanismen auszulösen. Die Tatsache, dass durch einen klassischen Stress Inducer
(Sodium Arsenit) induzierte JNK Aktivität nicht durch das NS1 Protein inhibiert werden
kann, deutet auf alternative Signalwege hin. Obwohl die Transkriptionsfaktoren, wie NF-κB
und der Interferon Regulatorische Faktor 3 (IRF-3) von verschiedenen „upstream“ Faktoren
reguliert werden, resultiert die Wirkung des NS1 Proteins in deren Inhibierung (Talon et al.,
2000; Wang et al., 2000) und folglich in der Inhibierung des IFNβ Promotors. Genetische
Knockout Mäuse für PKR (PKR-/-) sind in der Lage, infolge einer Influenza Virus Infektion
JNK oder IRF-3, aber nicht NF-κB zu aktivieren (Chu et al., 1999; Smith et al., 2001). Es
bleibt zu klären, ob die NS1-vermittelte Inhibition des JNK Signalweges durch die reine
Bildung der dsRNA und/oder der Bindung von dsRNA Molekülen an entsprechende zelluläre
Sensoren verursacht wird. Die Daten charakterisieren das NS1 Protein als einen Antagonisten
96
5. Diskussion
der Virus- und dsRNA-induzierten Aktivierung von JNK und AP-1. Die genaue Identifikation
der gesamten Faktoren und Signalwege, die für die Induktion der Zytokine und Chemokine
infolge einer Influenza Virus Infektion verantwortlich sind, ist in Zukunft zu untersuchen.
Infolge einer Influenza Virus Infektion wird unter anderem das sehr potente antivirale Zytokin
IFNβ freigesetzt. Neben seinen Bindestellen für NF-κB und AP-1 Faktoren besitzt IFNβ auch
Bindestellen für den Interferon Regulatorischen Faktor 3 (IRF-3) in seiner Promotorsequenz.
Diese Faktoren bilden, mit weiteren Kofaktoren, wie p300/CBP (CREB binding protein) und
„High mobility group“ Proteinen, einen übergeordneten Kontrollkomplex, das IFNβ
Enhanceosom. IRF-3 scheint eine wichtige Rolle in der Virus-vermittelten Expression von
TypI IFN zu spielen, da seine Überexpression die antivirale Immunantwort steigert (Juang et
al., 1998).
Die Virus-induzierten Signalkaskaden, die NF-κB induzieren, müssen noch im Detail
aufgeklärt werden, obwohl erste Hinweise bestehen, dass Viren Signalwege nutzen, welche
auch die klassische Induktion der NF-κB abhängigen Genexpression, durch Zytokine und
Mitogene, bewirken (Chu et al., 1999). Die Influenza Virus-induzierten Signalmechanismen,
die zur Aktivierung der AP-1 abhängigen Genexpression führen, konnten in unserem Labor
bereits weitgehend aufgeklärt werden (Ludwig et al., 2001). Influenza Virus-induzierte
Signalwege, die IRF-3 aktivieren, sind dagegen nicht bekannt.
Es wurde gezeigt, dass das kleine synthetische Molekül CG8 stimulierend auf die Mitogen
aktivierte Kinase Kinase 1 (MEKK1) wirkt, die IRF-3 über den JNK Signalweg aktiviert
(Kim et al., 2000). Die bakterielle Zellwandkomponente Lipopolysaccharid (LPS) kann IRF-3
scheinbar über die Stress aktivierte Proteinkinase p38 aktivieren (Navarro et al., 1999). Virusinduzierte IRF-3 Aktivierung korreliert mit einer C-terminalen Phosphorylierung von IRF-3
Aktivierung, welche über eine bislang unidentifizierte Virus-aktivierte Kinase (VAK)
vermittelt wird (Servant et al., 2001).
97
5. Diskussion
Die Untersuchung der intrazellulären Signalmediatoren über welche Influenza Virus Infektion
zur selektiven Aktivierung von IRF-3 führen, konnte mit Hilfe eines PromotorReportergenkonstruktes durchgeführt werden, das vier Kopien eines IRF-3 bindenden DNAMotivs enthält und einem Luziferase Promotor vorgeschaltet ist. Die Transfektion dieses 4x
IRF-3 Promotorkonstruktes und die nachfolgende Infektion mit den Influenza Virus Stämmen
PR8 oder delNS1 führte zu einer effizienten IRF-3 abhängigen Promotor Aktivierung 4
Stunden nach der Infektion. Im Gegensatz zu dem AP-1 Luziferase-PromotorReportergenkonstrukt, das fünf „TPA responsive element“ Kopien enthält (Angel et al., 1987)
oder dem AP-1/Ets Promotor, konnte der IRF-3 Promotor nicht durch das breitspezifische
stimulierende Agens TPA induziert werden. Mittels dieser Vorversuche wurde die spezifische
Stimulierbarkeit des IRF-3 Promotors sichergestellt (Abb. 4.10 - 4.12). Da die Influenza
Viren in embryonalen Hühnereiern herangezogen werden, musste darüber hinaus die
spezifische Wirkung der Influenza Viruspartikel nachgewiesen werden. Die Verwendung von
Eiklar und mittels UV-Strahlung partiell inaktivierten Viruspartikeln als stimulierende
Agenzien zeigen keine bzw. geringe IRF-3 Promotor Aktivierung im Vergleich zu WildtypInfluenza Virus (PR8) infizierten Zellen. Proteine aus der reinen Ei-Flüssigkeit sind an der
IRF-3 Promotoraktivierung nicht beteiligt, da Eiklar alleine diese nicht induzieren konnte.
Auch dsRNA ähnliche und zelluläre Abbauprodukte, die während der Virusreplikation von
zerstörten Wirtszellen freigesetzt werden können, scheinen keine oder nur geringe Bedeutung
für die Aktivierung des IRF-3 Promotors zu besitzen. An anderer Stelle wurde bereits
berichtet, dass eine vollständige Virusreplikation für die vollständige Aktivierung von IRF-3
notwendig ist, da durch UV-Inaktivierung oder die Inhibierung mittels Ribavirin, das die
Virusreplikation blockiert, die IRF-3 Aktivierung ebenfalls blockiert wurde (Servant et al.,
2001).
Auf der Suche nach intrazellulären Signalmechanismen, die eine Virus-induzierte IRF-3
abhängige Genexpression induzieren können, wurden verschiedene Signalkomponenten
98
5. Diskussion
unterschiedlichster Signalwege zusätzlich zu dem IRF-3 Luziferase PromotorReportergenkonstrukt überexprimiert. Keine der in den Promotor-Reportergenstudien
untersuchten Signal-Kinasen, wie Raf, ERK2, MKK7, SAPKβ, MKK6, p38, MKK3 oder
ERK5 kommen für eine Beteiligung an der Influenza Virus-induzierten Aktivierung von IRF3 in Frage, da keine der eingesetzten Mutanten diese Virus-induzierte Aktivierung
beeinflussen konnten. Unterschiedlichste Kinasen wie ERK1/2, JNK, p38, IKKα/β und PKR
waren auch in anderen Untersuchungen nicht in der Lage, die Phosphorylierung des CTerminus von IRF-3 zu bewirken (Servant et al., 2001).
Alleine die kleinen GTPasen Rac und Rho konnten, im Gegensatz zu den oben aufgeführten
Kinasen, die Influenza Virus-induzierte IRF-3 Promotor Aktivierung beeinflussen. Die
Promotor-Reportergenstudien zeigen die Inhibition der Influenza Virus-induzierten IRF-3
Promotor Aktivität sowohl durch die dominant negative Mutante von Rac, als auch von Rho.
Auch die IRF-3 Aktivität, die infolge von dsRNA Behandlung auftritt, wird durch die
dominant negativen Mutanten der beiden kleinen GTPasen inhibiert. Die Verwendung eines
IFNβ Promotor-Reportergenkonstruktes lieferte den Beweis für die Beteiligung der GTPasen
Rac und Rho an der Virus-induzierten Signalübermittlung, die nicht nur einen spezifischen
Transkriptionsfaktor, wie IRF-3 betrifft, sondern auch die Genexpression eines wichtigen
Zytokins, wie IFNβ.
Die Bedeutung der kleinen GTPasen für die Virus-induzierte IRF-3 Aktivierung konnte nicht
nur mit Hilfe eines spezifischen Promotorkonstruktes, sondern auch endogen nachgewiesen
werden. Mit Hilfe eines IRF-3 Antikörpers, der in der Lage ist phosphoryliertes IRF-3 anhand
einer im SDS-Gel höher laufenden Bande zu detektieren, konnte zunächst eine Influenza
Virus-induzierte IRF-3 Phosphorylierung 4-8 h nach Infektion und eine dsRNA induziert
IRF-3 Phosphorylierung 2-4 h nach Stimulation nachgewiesen werden. Die im Gegensatz zur
dsRNA-induzierten später auftretende Virus-induzierte Phosphorylierung könnte damit erklärt
werden, dass während der Virusreplikation erst dsRNA gebildet werden muss, bevor diese
stimulierend auf IRF-3 wirken kann. Das Toxin des Bakteriums Clostridium difficile (TcdB)
99
5. Diskussion
ist wie viele andere bakterielle Toxine in der Lage, die kleinen GTPasen chemisch zu
modifizieren und dadurch zu inaktivieren. Werden die Zellen vor und während einer Influenza
Infektion oder dsRNA Stimulation mit diesem Toxin inkubiert, wird sowohl die Virus-, als
auch die dsRNA-induzierte IRF-3 Phosphorylierung blockiert. Im Gegensatz zu den Toxin
behandelten Zellen zeigen die unbehandelten Zellen infolge der Virus- bzw. dsRNAStimulation eine deutliche Phosphorylierung von IRF-3. Die Untersuchung der Virustiter von
infizierten Zellen, die mit dem bakteriellen Toxin TcdB inkubiert wurden, deutet darauf hin,
dass die Inhibition der GTPasen die Virusaufnahme und Replikation nicht behindert, sondern
steigert, da wegen der reduzierten IRF-3 Aktivierung weniger antiviral wirkendes IFN
freigesetzt wird und die Virusreplikation nicht behindern kann. Um die Spezifität des
clostridialen Toxins zu verifizieren und um sicher zu stellen, dass nicht die gesamte
Genexpressionsmaschinerie durch dieses Toxin beschädigt wird, erfolgte die Überexpression
der dominant negativen Mutanten von Rac und Rho. In der Tat konnte auch
die
Überexpression dieser GTPase-Mutanten die Phosphorylierung von endogenem IRF-3
inhibieren.
In „Elektrophoetic Mobility Shift Assays“ (EMSAs) konnte die Bindung der IRF-3
Transkriptionsfaktoren an die IRF-3 Bindestellen der DNA infolge Influenza Virus Infektion
bzw. dsRNA Stiumlation gezeigt werden. Weiterhin war es möglich, die Blockade der
induzierten IRF-3 Bindung an die DNA nach Überexpression der dominant negativen
Mutanten von Rac und Rho nachzuweisen.
Sowohl die Ergebnisse der Luziferase-Assays, als auch die der Western-Blots und die des
EMSAs zeigen eine stärkere Inhibition der Virus- bzw. dsRNA-induzierten IRF-3
Aktivierung, sobald die dominant negative Mutante der GTPase Rac überexprimiert wird.
Somit sei die Spekulation erlaubt, dass Rac entweder Rho übergordnet ist oder Rac und Rho
parallel zueinander wirken, wobei Rac einen stärker in die IRF-3 Aktivierung involvierten
Signalweg kontrolliert.
100
5. Diskussion
Bislang konnten die Virus-induzierten Rac/Rho Effektoren nicht identifiziert werden. Die
MAPK Signalkaskaden wurden von uns und einigen anderen Arbeitsgruppen (Smith et al.,
2001) in Bezug auf Virus-induzierte IRF-3 Aktivierung getestet und waren nicht in der Lage,
diese zu beeinflussen. NF-κB ist ebenfalls von Rac/Rho abhängig, jedoch konnte der
klassische NF-κB Signalweg bislang nicht mit der Virus-induzierten IRF-3 Aktivierung in
Verbindung gebracht werden.
In dieser Arbeit konnte die Relevanz der Virusreplikation und der während der Replikation
gebildeten viralen dsRNA für die Influenza Virus-induzierte antivirale Genexpression
mehrfach gezeigt werden. Influenza Viren müssen mit ihren Wirten eine ausgeglichene
Wechselwirkung erreichen, damit sie von diesen profitieren und deren ProteinsyntheseMaschinerie nutzen können. Jedoch dürfen die Viren ihre Wirte nicht zu schnell töten, sollten
aber selbst ebenfalls nicht vernichtet werden.
Eine Influenza Virus Infektion aktiviert den JNK/SAPK Signalweg über die oberhalb
gelegenen Mediatoren MKK7 und MKK4/SEK. Diese beiden Kinasen wirken synergistisch,
wobei MKK4/SEK neben dem JNK/SAPK Signalweg vermutlich einen weiteren Signalweg
induziert, der die virale Replikation unterstützt. Somit kann auf dieser Ebene bereits ein
Gleichgewicht zwischen Virus und Wirt eingestellt werden. Es kommt jedoch auch zur
Phosphorylierung verschiedenster Transkriptionsfaktoren, wie ATF-2, die an
Promotorsequenzen potenter Zytokine binden und deren Produktion einleiten. Bei Inhibition
der Virusreplikation wird die JNK/SAPK Signalkaskade weniger stark aktiviert und
gleichzeitig sind niedrigere Virustiter messbar. Verantwortlich für die Induktion der
JNK/SAPK Signalkaskade ist die, während der Replikation gebildete dsRNA, wie mittels
eines auf Plasmiden basierenden Replikationssystems nachgewiesen werden konnte.
Allerdings sind die Signalmediatoren, die eine dsRNA induzierte Aktivität auf MKK7 und
MKK4/SEK weiterleiten können, bislang unbekannt.
101
5. Diskussion
Es ist ein ökonomischer Weg des Virus, möglichst viele Funktionen der Virusreplikation auf
die Wirtszelle zu übertragen. Auf diese Weise kann das eigene virale Genom klein gehalten
werden und es besteht die Möglichkeit einer schnellen Vervielfältigung und somit die
Möglichkeit, die Vermehrungsrate zu erhöhen. Ein Nachteil dieser Virus/Wirt
Wechselwirkung besteht in der Abhängigkeit des Virus von seinem Wirt. Ein Virus muss den
antiviralen Aktivitäten der Wirtszelle entgegenwirken, ohne diese vollständig zu zerstören.
In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass das virale NS1 Protein in der Lage ist,
der Influenza Virus-induzierten JNK Aktivität entgegenzuwirken und somit die antivirale
Antwort, vermittelt durch IFNβ zu reduzieren. Das NS1 Protein ist durch seine Fähigkeit
charakterisiert dsRNA zu binden. Vermutlich entfaltet dieses Protein seine Wirkung, indem es
direkt an dsRNA bindet und diese nicht mehr in der Lage ist, Signalprozesse, die zur JNK
Aktivierung führen, zu induzieren. Somit konnte gezeigt werden, dass auch das Influenza
Virus Partikel selbst Wirkmechanismen besitzt, seine Virulenz einzuschränken, um aber ein
Überleben zu gewährleisten. Die detaillierte Untersuchung der NS-1 vermittelten Inhibition
des JNK Signalweges ist in Zukunft durchzuführen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit konnten die kleinen Rho-GTPasen als erste Signalmediatoren in
der Influenza Virus-induzierten Aktivierung von IRF-3 nachgewiesen werden. IRF-3 ist ein
wichtiger Regulator in der Virus-vermittelten Expression von TypI IFN, da seine
Überexpression die antivirale Immunantwort steigert (Juang et al., 1998). Sowohl die
dominant negative Mutante von Rac, als auch die von Rho sind in der Lage, Virus- bzw.
dsRNA-induzierte Aktivierung von IRF-3 zu inhibieren. Weitere, in die Virus-induzierte
Aktivierung von IRF-3 involvierte Signalkomponenten gilt es in Zukunft zu identifizieren.
Hierzu können neuere Methoden, Genexpressionsmuster durch „Micro Array“-Analysen
(Gavin et al., 2002) oder Protein/Protein-Interaktionen mittels der „Yeast-Two-Hybrid Assay“
zu identifizieren, angewendet werden. „Micro Array“-Analysen sind allerdings nicht in der
Lage, die Reihenfolge von Mediatoren innerhalb einer Kinasekaskade aufzuklären. Im „YeastTwo-Hybrid Assay“ werden Schwierigkeiten in der Identifizierung der direkten IRF-3
102
5. Diskussion
aktivierenden Kinase auftreten, da es sich bei IRF-3 um einen Transkriptionsfakor handelt,
der im „Yeast-Two-Hybrid Assays“ selbst transaktivierend wirken kann. Ein Ansatz hier
könnte sein, die transaktivierende Domäne zu mutieren oder zu deletieren. Dennoch sind dies
neue Untersuchungsmöglichkeiten, die Mechanismen der Virus-Wirt Interaktionen in Zukunft
aufzuklären und möglicherweise Ansatzpunkte in der Bekämpfung von Viren zu finden.
103
6. Zusammenfassung
6. Summary
Infection of cells with Influenza A virus induces the expression of a variety of genes,
including the type I interferons which are a first line of defense against viral infections. IFNβ,
the most important cytokine, is controlled by a higher order complex, the enhanceosom,
which contains binding sites for the transcription factors AP-1, NF-κB and IRF-3. We could
show that the Influenza Virus induced AP-1 dependent gene expression occurs via the
JNK/SAPK pathway (Ehrhardt, 1999; Ludwig et al., 2001). Among the AP-1 factors which
were identified to bind their cognate DNA element during viral infection are those, that are
regulated via phosphorylation by JNKs, such as ATF-2. Accordingly, the induction of AP-1
dependent gene expression correlates with a strong activation of JNK and its upstream
activators MKK4 and 7 in permissive cells. Virus yields from transfected and infected cells in
which JNK signaling was inhibited by different approaches were higher compared to the
levels from control cells. Therefore we conclude that virus-induced activation of JNK and
AP-1 is not exploited by the virus to support its replication but rather is required for the innate
antiviral immune response. Data obtained with a virus-free plasmid-based vRNA replication
system indicated that JNK activation is a cause of viral RNA accumulation during infection.
This was supported by the observation, that infection of cells with a virus lacking viral NS1
protein, which is known to bind and to sequester RNA from cellular signaling intermediates,
caused a strongly enhanced JNK activity compared to control infections. Furthermore, the
NS1 protein was identified as the first viral protein that antagonizes virus- and dsRNAinduced activation of the stress response signaling pathway mediated through Jun N-terminal
kinase. IRF-3 is specificially activated in response to viral infection and is therefore the most
potent candidate to regulate the fast and strong antiviral gene expression. After an Influenza
virus infection IRF-3 becomes phosphorylated and migrates to the nucleus where it binds to
antiviral gene promoters. However, the IRF-3 kinase and the cellular signaling pathways
leading to IRF-3 phosphorylation are unknown. To investigate signaling mediators upstream
of IRF-3, we have constructed an IRF-3 responsive promoter-reporter gene plasmid derived
from the IFNβ promoter. The small Rho-GTPase Rac1 was identified as the first non-RNA
binding cellular mediator involved in the Influenza virus-induced IRF-3 dependent gene
expression. Inactivation of these Rho GTPases by the specific inhibitor toxin B or dominant
negative Rac1 resulted in the inhibition of virus- and dsRNA-induced IRF-3 phosphorylation
and DNA binding as well as of IRF-3 dependent promoter activity, e.g. of the IFNβ promoter.
Thus two important components of virus-mediated immune response were identified and
characterised.
104
6. Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Influenza A Virus Infektion induziert die Expression zahlreicher Gene, einschließlich
der TypI Interferone, die eine erste Abwehrlinie gegen virale Infektionen bilden. Hierbei ist
IFNβ das wichtigste Zytokin. IFNβ wird durch einen multimeren Komplex, das Enhanceosom
kontrolliert, das Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-κB und IRF-3 in
seiner Promotorsequenz besitzt.
In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass die Influenza Virus-induzierte AP-1 abhängige
Genexpression über den JNK/SAPK-Signalweg erfolgt (Ehrhardt, 1999; Ludwig et al., 2001).
Unter den, an DNA Elemente bindenden AP-1 Faktoren waren solche, die aufgrund von
Phosphorylierung durch die JNKs reguliert werden, wie beispielsweise ATF-2. Weiterhin
korrelierte die Induktion der AP-1 abhängigen Genexpression mit der starken Aktivierung
von JNK und seiner upstream Regulatoren in permissiven Zellen. Die Virusmengen
transfizierter und infizierter Zellen, in denen JNK inhibiert wurde, waren höher im Vergleich
zu Virusmengen der Kontrollzellen. Demzufolge kann die Virus-induzierte Aktivierung von
JNK und AP-1 nicht der Virusreplikation dienen, sondern gehört vielmehr zu einer antiviralen
Immunantwort. Daten aus einem Virus-freien, auf Plasmiden basierenden vRNA
Replikations-System deuten darauf hin, dass die JNK Aktivierung aus der Akkumulation
viraler RNA resultiert. Entsprechend bewirkte die Infektion von Zellen mit einem Virus, dem
das virale NS1 Protein fehlt, welches RNA binden und somit "wegfangen" kann, eine
gesteigerte JNK Aktivität im Vergleich zu den Kontroll-Infektionen. Damit konnte das NS1
Protein als erstes virales Protein identifiziert werden, das der Virus- und dsRNA-induzierten
Aktivierung des JNK/SAPK-Signalweges entgegen wirkt. Der Transkriptionsfaktor IRF-3
wird spezifisch infolge einer viralen Infektion aktiviert und ist daher ein potenter Kandidat,
die schnelle und starke antivirale Genexpression zu regulieren. Infolge einer Influenza Virus
Infektion wird IRF-3 phosphoryliert, wandert in den Kern und bindet dort an Promotoren, die
die antivirale Genexpression steuern. Bislang sind die IRF-3 Kinase und zelluläre
Signalwege, die eine IRF-3 Phosphorylierunge induzieren, unbekannt. Um in unserem Labor
Signalmediatoren, die upstream von IRF-3 liegen, zu suchen, wurde ein IRF-3 responsives
Promotor-Reportergen-Plasmid, aus dem IFNβ Promotor stammend, konstruiert. Die kleine
Rho-GTPase Rac1 wurde als erster nicht an RNA bindender, zellulärer Mediator identifiziert,
der in die Influenza Virus-induzierte IRF-3 abhängige Genexpression involviert ist. Die
Inaktivierung der Rho-GTPasen durch das spezifische Inhibitor Toxin B oder dominant
negatives Rac1 resultierten in der Inhibierung der Virus- und dsRNA-induzierten IRF-3
Phosphorylierung und DNA Bindung, sowie der IRF-3 abhängigen Promotoraktivität,
beispielsweise des IFNβ Promotors. Damit konnten zwei wichtige Komponenten der Virusinduzierten Immunantwort identifiziert und charakterisiert werden.
105
6. Zusammenfassung
Zusammenfassende Darstellung
Virus-Infektion
virale RNA-Akkumulation
Rac
MKK4/
SEK
IKK
?
?
MKK7
JNK
p50 p65
IkB
IkB
p50 p65
c-Jun ATF2
IRF3
HMGI (Y)
PRD IV
IRF3
p65
p50
HMGI (Y)
PRD III-I
PRD II
Abb. 6.1.: Zusammenfassende Darstellung der Virus- und dsRNA-induzierten Signalwege, die zur
β Promotors und somit zur Induktion der antiviralen Immunantwort führen.
Induktion des IFNβ
106
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122
8. Abkürzungen
8. Abkürzungen
Abb.
AP-1
APS
ATF
ATP
BA
BBS
BES
BMP
bp
BSA
bzw.
C
Ca
cAMP
CBP
C-terminal
CaCl2
CAT
cDNA
CG
CIAP
CMV
CO2
cpm
CTP
cRNA
CREB
d.h.
DMEM
DMSO
dn
DNA
DOC
DTT
dsRNA
ECL
E.coli.
Abbildung
Activating protein 1
Ammoniumpersulfat
activated transcription factor
Adenosintriphosphat
bovine albumin
BES buffered saline
(N,N-bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonic acid)
Bone morphogenic protein
Basenpaare
Rinderserumalbumin
beziehungsweise
Celcius
Calcium
cyclic Adenosine Monophosphat
CREB binding protein
carboxyterminal
Calciumchlorid
Chloramphenicolacetyltransferase
Copy DNA
Circle grow
Calf intestinal alkaline phosphatase
Cytomegalovirus
Kohlendioxid
counts per minute
Cytidintriphosphat
Copy RNA
cAMP response element binding protein
das heißt
Dulbecco´s modified Eagle´s Medium
Dimethylsulfoxid
dominant negativ
Desoxyribonucleinsäure
Desoxycholsäure Natriumsalz
Dithiothreitol
doppelsträngige RNA
Enhanced chemoluminicence
Escherischia coli
123
8. Abkürzungen
EDTA
EGF
EGFP
EMSA
ERK
FBS
g
GDP
GEF
GST
GTP
GTPase
h
HA
HAc
HMG(I)Y
IFN
IκB
IKK
IL
IP
IPTG
IRF
JAK
JNK
KAc
kDa
kb
l
LiAc
LPS
LTR
M
M
m
µ
mA
MAPK
MCP
MEM
Ethylendiamin-tetraacetat
Epidermal growth factor
enhanced green fluorescent protein
electrophoretic mobility shift assay
extracellular signal regulated kinase
fötales Rinderserum
Gramm; Erdbeschleunigung
Guanidindiphosphat
Guanine nucleotid exchange factor
Gluthathion S-Transferase
Guanosintriphosphat
Guanosintriphosphatase
Stunden
Hämagglutinin-Epitop
Essigsäure
high mobility group protein I
Interferon
Inhibitor of κB
IκB Kinase
Interleukin
Immunpräzipitation
Isopropyl ß-D-Thiogalactopyranoside
Interferon Reglulatorischer Faktor
Janus Kinase
c-Jun N-terminale Kinase
Kaliumacetat
Kilodalton
Kilo Basen
Liter
Lithium Acetat
Lipopolysaccharid
Long terminal repeat
Matrixprotein
mol/l
milli
mikro
Milliampere
Mitogen aktivierte Protein Kinase
monocyte chemotactic protein
minimal essential medium
124
8. Abkürzungen
MEK
MEKK
min
MKK
ml
MLK3
MOI
MSZ
mRNA
mut
n
NA
NF-κB
NIK
nm
N-terminal
NP
NS
OD
PA
PAGE
PBS
PKR
pmol
Poly dI/dC
Poly dG/dC
PRD
Raf
RDRP
RNA
Rho
RLU
rpm
SAPK
SDS
s
SEK
STAT
u.a.
TAE
MAPK/ERK Kinase
MEK Kinase
Minute
MAPK Kinase
Milliliter
mixed lineage kinase 3
multiplicity of infection
Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung
messenger RNA
Mutante
nano
Neuraminidase
Nuclear factor kappa B
NF-κ inducing kinase
Nanometer
aminoterminal
Nukleoproteine
Nichtstrukturproteine
Optische Dichte
Proteine des Polymerasekomplexes
Polyacrylamid Gelelektrophorese
Phosphate buffered saline
von dsRNA aktivierte Proteinkinase
Pikomol
Polydeoxyinosinic-Polydeoxycytidylic acid
Polydeoxyguanylic-Polydeoxycytidylic acid
positive regulatory domain
Rap(p)idly accelerated fibrosarcoma
RNA-Polymerasekomplex
Ribonucleinsäure
Ras homolog
Relative light units
Umdrehungen in der Minute
Stress activated protein kinase
Natriumdodecylsulfat
Sekunde
SAPK/ERK Kinase
Signal transducer and activators of transcription
unter anderem
Tris-Acetat-EDTA
125
8. Abkürzungen
TBE
TBS
TBST
TEMED
TGF
TLB
TNF
TPA
TRE
Tris
U
UV
v
V
v.a.
vRNA
w
WT
tris borate buffer
tris buffered saline
TBS mit Triton
N´, N´, N´, N´,- tetramethylenediamine
tumor growth factor
Triton Lyse Puffer
Tumor Necrose Faktor
12-o-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat
TPA responsive element
tris(hydroxymethyl)methyl-amine hydrochloride
units
ultra violett
Volumen
Volt
vor allem
virale RNA
Gewicht
Wildtyp
126
Danksagung
An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Stephan Ludwig ganz
herzlich für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und seine stets engagierte und
ermutigende Betreuung meiner Doktorarbeit danken.
Herrn Prof. Dr. E. Buchner danke ich für die freundliche Übernahme der Zweitkorrektur
dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. U.R. Rapp möchte ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes an seinem
Institut danken.
Weiterhin gilt mein Dank den Kooperationspartnern Dr. Stephan Pleschka, Dr. Oliver Planz
und Dr. Christian Kardinal, mit denen ich zusammenarbeiten durfte.
Großer Dank gilt natürlich allen Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe. Danke an Dr. Bernd
Neufeld, Dr. Bruce Jordan, Dr. Dragomir Dinev und Dr. Marc Schmidt für
abwechslungsreiche Tage im Labor. Dr. Pei Feng Chen möchte ich für die Einweihung in die
Geheimnisse der EMSA´s danken. Martina Koch danke ich für ihre tatkräftige Unterstützung
in einer stressigen Zeit. Darüber hinaus danke ich Walter und Martin für einen Einblick in die
alpenländische Dikussionskultur.
Vielen herzlichen Dank auch an die zahlreichen anderen netten Leuten der MSZ-Zeit, allen
voran Dr. Jörg Hartkamp, Anette Geiß, Bille Schmidt (aus der Hautklinik), Dr. Andris Avots,
Ludmilla Wixler, Gunther Tietsch, Monika Wagenbrenner, Ewald Lipp, Frau Pfränger, Frau
Röder und Frau Dr. Blättler und allen anderen.
Nicht zuletzt geht ein herzlicher Dank an meine Eltern, die mir das Studium erst ermöglicht
haben.
127
LEBENSLAUF
Persönliche Daten
Name:
Ehrhardt
Vorname:
Christina
Adresse:
Heisenberg Str. 5a
97076 Würzburg
Geburtsdatum:
06.01.1975
Geburtsort:
Lauterbach/Hessen
Familienstand:
ledig
Nationalität:
deutsch
Ausbildung
1981-1987
Stadt-Schule Alsfeld (Grund- und Förderstufe)
1987-1994
Albert-Schweitzer Gymnasium, Alsfeld
1994
Abitur
1994-1996
Philipps-Universität Marburg
Studium der Biologie
Prüfungsfächer: Botanik, Zoologie, Chemie, Physik
Abschluß: Vordiplom
128
1996-1999
Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Studium der Biologie
- Hauptfach: Mikrobiologie
- Nebenfächer: Biochemie, Zell- und Entwicklungsbiologie
03-12/1999
- Diplomarbeit am Institut für Medizinische Strahlenkunde und
Zellforschung (MSZ) (geleitet von Herrn Prof. Dr. U.R. Rapp) in der
Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Stephan Ludwig
- Titel der Diplomarbeit: Virus-Wirtszell Interaktionen in
Influenza-Virus-infizierten Zellen
(eingereicht am 21.12.1999)
01-03/2000
- Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Medizinische
Strahlenkunde und Zellforschung (MSZ) in der Arbeitsgruppe von
Herrn Dr. Stephan Ludwig
seit März 2000
Promotion (Dr.rer.nat) am Institut für Medizinische Strahlenkunde und
Zellforschung, Universität Würzburg
Betreuer: Prof. Dr. Stephan Ludwig
Thema: Untersuchung Influenza Virus-induzierter Signalprozesse und deren
Bedeutung in der Wirtszell-Abwehr
129
Veröffentlichungen
1.
Ludwig, S.*, Ehrhardt, C.*, Neumeier, E. R., Kracht, M., Rapp, U. R., and Pleschka,
S., Influenza virus-induced AP-1-dependent gene expression requires activation of the
JNK signaling pathway, J Biol Chem, 276, 10990-8. (2001).
2.
Pleschka, S., Wolff, T., Ehrhardt, C., Hobom, G., Planz, O., Rapp, U. R., and
Ludwig, S., Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the
Raf/MEK/ERK signalling cascade, Nat Cell Biol, 3, 301-5. (2001).
3.
Bode, J. G., Ludwig, S., Ehrhardt, C., Erhardt, A., Ruhl, M., Schaper, F., Heinrich,
P.C., and Häussinger, D., HCV core protein induces suppressor of cytokine signaling
(SOCS)-3 and inhibits tyrosine-phosphorylation of signal transducer and activator of
transcrition (STAT)-1, (J Immunol, under revision).
4.
Scheller, C., Flory E., Sopper, S., Ehrhardt, C., Chen, P., Koutsilieri, E., Ludwig, S.,
and Jassoy, C.,, Stimulation of CD95 in the presence of caspase inhibitors induces
cytokine expression in primary T lymphocytes., (Europ J Immunol, under revision),
(IF:5.240).
5.
Ludwig, S.*, Wang, X.*, Ehrhardt, C.*, Zheng, H., Planz, O., Pleschka, S., GarciaSastre, A., and Wolff, T., The influenza A virus NS1 protein inhibits activation of Jun
N-terminal kinase (JNK) and AP-1 transcription factors, (submitted to J Virol).
6.
Ehrhardt, C., Wurzer, W.J., Planz, O., Pleschka, S., Kardinal, C., and Ludwig, S.
Rac1 is a critical mediator of the virus-induced IRF-3 dependent gene expression.
Manuskript in Vorbereitung für Nat Cell Biol.
* equal contribution
130
Veröffentlichte Abstracts
1.
Ehrhardt, C., Pleschka, S., Neumeier, E., Kracht, M., Rapp, U.R. Ludwig, S.
Influenza virus infection induced AP-1 dependent gene expression requires RNAmediated activation of Jun-N-terminal kinase (JNK). Millennium Meeting: Signal
Transduction - Receptors, Mediators and Genes, Berlin, Müggelsee. (Seite 157)
(November 2.-4. 2000).
2.
Pleschka, S., Wolff, T., Ehrhardt, C., Hobom, G., Planz, O., Rapp, U.R., Ludwig, S.
The mitogenic Raf/MEK/ERK signaling cascade controls influenza virus replication
by regulating nuclear export of viral RNP complexes. Millennium Meeting: Signal
Transduction - Receptors, Mediators and Genes, Berlin, Müggelsee. (Seite 137)
(November 2.-4. 2000).
3.
Pleschka, S., Wolff, T., Ehrhardt, C., Hobom, G., Planz, O., Rapp, U.R., Ludwig, S.
The mitogenic Raf/MEK/ERK signaling cascade controls influenza virus replication
by regulating nuclear export of viral RNP complexes. Signal Trasduction Society
(STS), (1, 61). (2001).
4.
Ehrhardt, C., Pleschka, S., Neumeier, E., Kracht, M., Rapp, U.R., Ludwig, S.
Influenza virus induced AP-1 dependent gene expression requires RNA-mediated
activation of Jun-N-terminal kinase (JNK). Signal Trasduction Society (STS), (1, 79).
(2001).
131
5.
Ehrhardt, C., Pleschka, S., Wurzer, W.J., Planz, O., Wolff, T., and Ludwig, S.
JNK and AP-1 activation in Influenza virus infected cells is caused by vRNA
accumulation and is part of the innate antiviral response. Cell signaling, transcription
and translation as therapeutic targets. Luxembourg, (Seite 140) (30.01. - 02.02. 2002).
6.
Ludwig, S., Wolff, T., Ehrhardt, C., Planz, O., Pleschka, S.
Defining signal transduction targets for antiviral therapy: MEK inhibitors act as antiinfluenza virus agents. Cell signaling, transcription and translation as therapeutic
targets. Luxembourg, (Seite 298) (30.01. - 02.02. 2002).
7.
Wurzer, W.J., Ehrhardt, C., Giner, M., Pleschka, S., Planz, O., Ludwig, S.
The role of NF-kappaB during influenza virus infections-sinner or saint?
Jahrestagung: Gesellschaft für Virologie, Erlangen. (Seite 117), (8.-11. April 2002).
8.
Ehrhardt, C., Wurzer, W.J., Planz, O., Pleschka, S., Ludwig, S.
Rho GTPases are critical mediators for virus and dsRNA-induced activation of IRF-3
in the innate immune response to virus infections. Jahrestagung: Gesellschaft für
Virologie, Erlangen. (Seite 287), (8.-11. April 2002).
132
Vorträge
1.
Ehrhardt, C., Pleschka, S., Neumeier, E., Rapp U.R., Ludwig S.
Influenza virus infection induces AP-1 dependent gene expression via upregulation
of AP-1 factors and activation of Jun-N-terminal kinase. Signal Transduction Society
(STS): Receptors, Mediators and Genes. 3rd Joint Meeting,Berlin, (02.-04.12.1999).
2.
Ehrhardt, C., Wurzer, W.J., Planz, O., Pleschka S., and Ludwig S.
Rho GTPases are critical mediators of virus and dsRNA-induced activation of IRF-3
in the innate immune response to virus infections. Jahrestagung: Gesellschaft für
Virologie, Erlangen (08. - 11. April 2002).
Poster
1.
Ehrhardt, C., Pleschka, S., Neumeier, E., Kracht, M., Rapp, U.R. Ludwig, S.
Influenza virus infection induced AP-1 dependent gene expression requires RNAmediated activation of Jun-N-terminal kinase (JNK). Millennium Meeting: Signal
Transduction - Receptors, Mediators and Genes, Berlin, Müggelsee, (02.-04.11.
2000).
2.
Ehrhardt, C., Pleschka, S., Wurzer, W.J., Planz, O., Wolff, T., and Ludwig, S.
JNK and AP-1 activation in Influenza virus infected cells is caused by vRNA
accumulation and is part of the innate antiviral response. Cell signaling, transcription
and translation as therapeutic targets. Luxembourg, (30.01. - 02.02. 2002)
Auszeichnungen:
1.
Travel Grant: Millennium Meeting: Signal Transduction - Receptors, Mediators and
Genes. Influenza virus induced AP-1 dependent gene expression requires RNAmediated activation of Jun-N-terminal Kinase (JNK). (02.-04. November 2000).
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Erklärung
Ich erkläre, dass ich die vorgelegte Dissertation selbständig angefertigt und keine anderen als
die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Weiterhin erkläre ich, dass die vorgelegte Arbeit noch in keinem anderen Prüfungsverfahren
in gleicher oder ähnlicher Form vorgelegen hat.
Außer den in dem Zulassungsgesuch urkundlich vorgelegten Graden habe ich keine weiteren
Grade erworben oder zu erwerben versucht.
Würzburg, den
Christina Ehrhardt
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