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Jahrbuch 2016/2017 | Erb, Tobias | Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung Synthetic carbon dioxide fixation Erb, Tobias Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg Korrespondierender Autor E-Mail: [email protected] Zusammenfassung Die Umw andlung Schlüsselprozess des im Stoffw echselw ege Treibhausgases globalen und Enzyme Kohlenstoffdioxid Kohlenstoffkreislauf. zur CO 2 -Bindung In in (CO 2 ) den in organische letzten Jahren Mikroorganismen Verbindungen w urden entdeckt. ist mehrere Parallel zu ein neue diesen Entdeckungen w urden Ansätze vorangetrieben, mit Hilfe synthetischer Biologie künstliche Stoffw echselw ege zur Kohlenstoff-Fixierung zu realisieren, die effizienter als die natürlich existierenden Stoffw echselw ege sind. Die synthetische CO 2 -Fixierung könnte neue Anw endungen in Bio- und Nanotechnologie ermöglichen. Summary The conversion of the greenhouse gas carbon dioxide (CO 2 ) into organic compounds is a key process in the global carbon cycle. In the past years, several novel pathw ays and enzymes for the conversion of CO 2 w ere discovered in microorganisms. In parallel to these discoveries, new approaches w ere follow ed by using the methods of synthetic biology to establish artificial pathw ays for the fixation of CO 2 that are more efficient compared to naturally existing CO 2 -fixation pathw ays. Synthetic CO 2 -fixation could pave the w ay tow ards novel applications in biotechnology and nanotechnology. Chemie und Biologie der Kohlenstoff-Fixierung Die w ichtigste Reaktion im globalen Kohlenstoffkreislauf ist die Umw andlung von atmosphärischem Kohlenstoffdioxid (CO 2 ) in organische Materie. Dieser Prozess, der auch als Kohlenstoff-Fixierung bezeichnet w ird, ernährt sprichw örtlich alles Leben auf der Erde: Die fotosynthetische Kohlenstoff-Fixierung von Pflanzen steht am Anfang unserer Nahrungskette. Darüber hinaus bildet fixierter Kohlenstoff in Form fossiler Rohstoffe die Grundlage unserer modernen Industrie- und Energieproduktion. Da aber fossile Rohstoffe endlich sind und die Konzentrationen des Treibhausgases CO 2 stetig steigen, w ird vermehrt nach neuen Möglichkeiten gesucht, eine nachhaltige Kohlenstoffökonomie der Zukunft zu verw irklichen. Trotz intensiver Forschung gelang es der Chemie bisher nicht, Katalysatoren zu entw ickeln, die es erlauben, im © 2017 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 1/7 Jahrbuch 2016/2017 | Erb, Tobias | Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung Großmaßstab atmosphärisches CO 2 unter milden Prozessbedingungen in Mehrfachkohlenstoffverbindungen zu überführen. Im Gegensatz dazu bietet die Biologie mehrere Lösungen. Die bekannteste ist die bereits erw ähnte fotosynthetische Kohlenstoff-Fixierung in Pflanzen, der Calvin-Zyklus, durch den netto fast 70 Gigatonnen Kohlenstoff pro Jahr fixiert w erden. Neben Pflanzen nutzen auch Algen und viele Bakterien den Calvin-Zyklus. Insgesamt w erden geschätzt rund 90 Prozent im globalen Kohlenstoffkreislauf über diesen Stoffw echselw eg gebunden. In den letzten Jahren w urden fünf w eitere, alternative Stoffw echselw ege zur Kohlenstoff-Fixierung in Mikroorganismen entdeckt, die ebenfalls eine w ichtige Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf spielen und Gegenstand aktueller Untersuchungen sind [1, 2]. Obw ohl diese natürlich entstandenen Stoffw echselw ege im Gigatonnen-Maßstab CO 2 fixieren, sind sie in vielerlei Hinsicht nicht perfekt. Das Produkt biologischer Kohlenstoff-Fixierung ist Biomasse, ein komplexes Gemisch, das sich nicht als Rohstoff für die chemische Industrie eignet. Hinzu kommt, dass viele natürliche Stoffw echselw ege in ihrer Kohlenstoff-Fixierung limitiert sind. Ein Beispiel ist der Calvin-Zyklus selbst mit seinem CO 2 -bindenden Enzym RubisCO. Die RubisCO setzt nur fünf bis zehn Moleküle CO 2 pro Sekunde um. Gleichzeitig zeigt das Enzym eine unerw ünschte Nebenreaktion mit Sauerstoff. Eine durchschnittliche RubisCO besitzt eine Fehlerrate von etw a 20 Prozent mit Sauerstoff, w as die Effizienz der Fotosynthese stark einschränkt. Neue CO2 -bindende Enzyme eröffnen neue Möglichkeiten Gibt es Alternativen zur RubisCO-abhängigen Kohlenstoff-Fixierung? Vor einiger Zeit w urde in Alphaproteobakterien eine neue Familie CO 2 -bindender Enzymen entdeckt, die reduktiven Enoyl-CoA Ester Carboxylasen (ECRs, Abb. 1). Diese Enzyme sind interessant, w eil sie bis zu 120 CO 2 Moleküle pro Sekunde umsetzen können und damit zw anzigmal schneller CO 2 fixieren können als die RubisCO und w eil sie keine Seitenreaktion mit Sauerstoff zeigen [3]. Um zu verstehen, w as ECRs zu so effizienten CO 2 -bindenden Enzymen macht, w urde mithilfe speziell entw ickelter spektroskopischer Methoden der Katalyse-Zyklus dieser Enzyme untersucht. Dadurch konnten einzelne chemische Vorgänge w ährend der Katalyse zeitaufgelöst dargestellt w erden, vergleichbar mit einer Art Enzym-Zeitlupe [4]. Diese detaillierten Einblicke in die Biochemie der ECRs legten die Grundlage, diese Enzyme gezielt zur CO 2 -Bindung zu modifizieren. Unter Zuhilfenahme von Enzym-Kristallstrukturen [5] w urde das Substratspektrum von ECRs durch Mutagenese des aktiven Zentrums erw eitertet. Damit steht eine Vielzahl neuer, effizienten CO 2 -Bindungsreaktionen für die Biokatalyse zur Verfügung [6]. © 2017 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 2/7 Jahrbuch 2016/2017 | Erb, Tobias | Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung A bb. 1: R e duk tive Enoyl-C oA C a rbox yla se n (EC R s) sind hoche ffizie nte und ve rsa tile Enzym e zur C O 2-Fix ie rung. (A ) R e duk tive C a rbox ylie rung von Enoyl-C oA Este rn durch EC R s. (B) Ve rgle ich de r C O 2-Fix ie rungsa k tivitä t von EC R s m it a nde re n C a rbox yla se n. (C) Ma ßschne ide rn von EC R : Dre i Muta tione n im a k tive n Ze ntrum e rwe ite rn da s Substra tspe k trum de s Enzym s für lä nge rk e ttige und ve rzwe igte Substra te . © Ma x -P la nck -Institut für te rre strische Mik robiologie /Erb Die synthetische Biologie zeigt neue Wege zur CO2 -Fixierung W ie können diese neuen Reaktionen zur Kohlenstoff-Fixierung eingesetzt w erden? Eine Idee ist, mithilfe synthetischer Biologie künstliche Kohlenstoff-Fixierungsw ege zu entw erfen, die natürlich entstandenen Stoffw echselw egen überlegen sind [7,8]. Mehrere Labore haben sich diesem Ziel verschrieben. Bisher allerdings konnte kein künstlicher Kohlenstoff-Fixierungsw eg realisiert w erden. Viele Ansätze scheiterten an dem Versuch, solche künstlichen Stoffw echselw ege direkt in lebenden Organismen zusammenzusetzen. Es fehlt das grundlegende biologische Verständnis, w ie sich die einzelnen Enzyme im Zusammenspiel verhalten und w ie sich der jew eilige künstliche Stoffw echselw eg in den komplexen Metabolismus des W irtes einfügt. Aus diesem Grund gew innen in letzter Zeit bottom-up Ansätze an Popularität, die eine reduktionistische Strategie verfolgen [8, 9]. In diesen Ansätzen w erden künstliche Stoffw echselw ege von Grunde auf aus einzelnen Enzymen schrittw eise – eben bottom up – zusammengesetzt (Abb. 2). Dazu w erden in einer ersten, theoretischen Phase mit Hilfe metabolischer Retrosynthese plausible biochemische Reaktionen zu möglichen Stoffw echselw egen kombiniert. Danach w erden das thermodynamische Profil und der voraussichtliche EnergieVerbrauch dieser theoretischen Stoffw echselw ege abgeschätzt, um bew erten zu können, w elcher der Designer-Wege sich zur experimentellen Umsetzung eignet. Anhand dieser Vorgehensw eise w urden kürzlich verschiedene synthetische Kohlenstoff-Fixierungsw ege entw orfen, die alle auf einer effizienten ECR-Reaktion basieren. Berechnungen zeigen, dass diese theoretischen Zyklen durchschnittlich 20 Prozent w eniger Energie pro gebundenem CO 2 benötigen als der auf RubisCO-basierte Calvin-Zyklus, w as das grundsätzliche Potential synthetischer Kohlenstoff-Fixierung unterstreicht [8]. © 2017 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 3/7 Jahrbuch 2016/2017 | Erb, Tobias | Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung A bb. 2: Stra te gie zur R e a lisie rung synthe tische r C O 2Fix ie rung. Die Entde ck ung de r e ffizie nte n EC R -C a rbox yla se n bilde t de n Ausga ngspunk t zum Entwurf ve rschie de ne r C O 2Fix ie rungszyk le n m itte ls m e ta bolische r R e trosynthe se . Die the ore tisch m ögliche n Zyk le n we rde n hinsichtlich the rm odyna m ische r Eige nscha fte n be we rte t und Enzym k a ndida te n zu ihre r Um se tzung in bioinform a tische n Da te nba nk e n ide ntifizie rt. In e ine r e x pe rim e nte lle n P ha se we rde n die Enzym k a ndida te n e x prim ie rt und cha ra k te risie rt. Aus ge e igne te n Ka ndida te n wird de r synthe tische Stoffwe chse lwe g im R e a ge nzgla s re k onstituie rt und in m e hre re n R unde n optim ie rt, wobe i Enzym -Engine e ring und m e ta bolische s Korre k turle se n a nge we nde t we rde n. © Ma x -P la nck -Institut für te rre strische Mik robiologie /Erb Vom Design zur Realisierung synthetischer CO2 -Fixierung Im Anschluss an die Design-Phase folgt die experimentelle Umsetzung der theoretischen Stoffw echselw ege. Es gilt entsprechende Enzyme zu finden, die die einzelnen Reaktionen des jew eiligen Stoffw echselw eges katalysieren. Eine w ichtige Quelle zum Erfolg bilden Datenbanken, in denen bisher mehr als 40.000 verschiedene Enzymreaktionen abgelegt w urden. Dennoch kommt es vor, dass für einzelne Reaktionen bisher kein entsprechendes Enzym beschrieben w urde. Mittels Durchmustern von (meta-) genomischen Bibliotheken oder durch gezieltes Protein-Engineering können diese fehlenden Enzyme gefunden beziehungsw eise maßgeschneidert w erden. Ein anderes Problem bei der Realisierung synthetischer Stoffw echselw ege ist die Neukombination von Enzyme aus völlig unterschiedlichen Organismen in einen gemeinsamen Stoffw echselw eg. Dadurch geraten viele Enzyme mit Stoffw echselprodukten in Berührung, denen sie im Laufe der Evolution nie ausgesetzt w aren. Es zeigen sich oft unerw ünschte Seitenreaktionen und Inhibitionen, die es zu verhindern gilt. Um solche Seitenreaktionen zu minimieren, können einzelne Enzyme w iederum auch maßgeschneidert w erden. Eine Alternative dazu ist das metabolic proofreading, das Hinzufügen zusätzlicher, korrigierender Enzyme, die die unerw ünschten Seitenprodukte entfernen und w iederverw erten. Obw ohl das Prinzip des Korrekturlesens aus © 2017 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 4/7 Jahrbuch 2016/2017 | Erb, Tobias | Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung natürlichen Stoffw echselw egen bekannt ist [10], w urde es bisher nicht systematisch im metabolischem Engineering beziehungsw eise der synthetischen Biologie eingesetzt. Erste Erfahrung im Umsetzen der synthetischen CO 2 -Fixierung zeigen jedoch, dass das metabolische Korrekturlesen die Effizienz von DesignerStoffw echselw egen um bis zu einen Faktor zehn steigern kann [8]. Der CETCH-Zyklus: Vom Reagenzglas in lebende Organismen Am Ende des Gesamtprozesses steht ein funktionsfähiger Stoffw echselw eg in vitro, das heißt, im Reagenzglas. Für einen künstlichen Kohlenstoff-Fixierungsw eg, den CETCH-Zyklus, konnte dieses Ziel kürzlich erreicht w erden (Abb. 3A). Der CETCH-Zyklus setzt sich aus insgesamt siebzehn Enzymen zusammen, die aus neun verschiedenen Organismen stammen, darunter befinden sich auch drei maßgeschneiderte Enzyme. Im Reagenzglas fixiert der CETCH-Zyklus CO 2 mit einer Rate von 5 nmol CO 2 pro Minute und mg Protein [8]. Diese Raten im Reagenzglas sind in etw a vergleichbar mit Messungen des Calvin-Zyklus in Zellextrakten. A bb. 3: De r C ETC H-Zyk lus, e in synthe tische r Stoffwe chse lwe g zur k ontinuie rliche n Fix ie rung von C O 2, de r m it Hilfe de r Stra te gie wie in in Abb. 2 da rge ste llt re a lisie rt wurde [8]. (A ) Topologie de s C ETC H-Zyk lus. (B) Mögliche zuk ünftige Anwe ndunge n de s C ETC H-Zyk lus: Durch die Tra nspla nta tion in ve rschie de ne O rga nism e n k önnte n k ünstliche C O 2Fix ie rungswe ge , wie de r C ETC H-Zyk lus, e ffizie nte r a ls na türliche Stoffwe chse lwe ge C O 2 in Biom a sse ode r ge zie lte P roduk te um wa nde ln. Alte rna tiv da zu k önnte n k ünstliche C O 2Fix ie rungswe ge die Ba sis für die Entwick lung a rtifizie lle r, biom im e tische r C hloropla ste n bilde n, die von Strom , W a sse rstoff ode r Ele k trizitä t a nge trie be n we rde n. © Ma x -P la nck -Institut für te rre strische Mik robiologie /Erb In vitro-Stoffw echselw ege zur Kohlenstoff-Fixierung w ie der CETCH-Zyklus bilden den Ausgangspunkt für w eitere Untersuchungen (Abb. 3B). Zuallererst sind solche in vitro-Stoffw echselw ege minimale Systeme, die es erlauben, die generelle Arbeitsw eise, Plastizität und Robustheit komplexer metabolischer Netzw erke zu studieren. Zum anderen sind sie ein w ichtiger Schritt in Richtung des großen Ziels synthetische CO 2 -Fixierung a u c h in vivo, das heißt im lebenden Organismus, zu erreichen. Durch Transplantation in geeignete W irtsorganismen könnten sie eines Tages eventuell die fotosynthetische Effizienz erhöhen oder zur gezielten Produktion von chemischen Bausteinen aus refixiertem CO 2 eingesetzt w erden. Schließlich bieten synthetische Stoffw echselw ege auch die Möglichkeit, neue Technologien an der Schnittstelle zw ischen Nano- und Biotechnologie zu entw ickeln, w ie zum Beispiel biomimetische Organelle zur künstlichen Fotosynthese („künstliche Chloroplasten“). © 2017 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 5/7 Jahrbuch 2016/2017 | Erb, Tobias | Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung Zusammenfassung Die synthetische CO 2 -Fixierung ist ein Forschungsfeld an der Schnittstelle von Biologie und Chemie, das radikal neue Lösungen aufzeigen kann, die effizienter sein können als natürlich entstandene Stoffw echselw ege. Die Konstruktion synthetischer Stoffw echselw ege im bottom-up Ansatz ist eine Weiterentw icklung der Biologie von einer deskriptiv-analytischen zu einer synthetisch-konstruktiven W issenschaft, die grundlegende Designprinzipien metabolischer Netzw erke offenlegt und neue (bio-) technologische Möglichkeiten eröffnen kann. Danksagung Die hier vorgestellten Arbeiten entstanden in Zusammenarbeit mit Marc-Olivier Ebert (ETH Zürich), Ivan Berg (Westfälische W ilhelms-Universität Münster) und Julia Vorholt (ETH Zürich). Dieser Bericht basiert in einigen Teilen auf einem Beitrag in BIOspektrum (DOI: 10.1007/s12268-016-0733-9), der mit Erlaubnis der SpringerVerlags GmbH (Heidelberg) verw endet w urde. Literaturhinweise [1] Erb, T. J. Carboxylases in natural and synthetic pathways Applied and Environmental Microbiology 77, 8466-8477 (2011) [2] Könneke, M.; Schubert, D. M.; Brown, P. C.; Hügler, M.; Standfest, S.; Schwander, T.; Schada von Borzyskowski, L.; Erb, T. J.; Stahl, D. A.; Berg, I. A. Ammonia-oxidizing archaea use the most energy-efficient aerobic pathway for CO 2 fixation Proceedings of the National Academy of Sciences USA 111, 8239-8244 (2014) [3] Erb, T. J.; Berg, I. A.; Brecht, V.; Müller, M.; Fuchs, G.; Alber, B. E. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway Proceedings of the National Academy of Sciences USA 104, 10631-10636 (2007) [4] Rosenthal, R.; Ebert M.-O.; Kiefer, P.; Peter, D.; Vorholt, J. A.; Erb, T. J. Direct evidence for a covalent ene adduct intermediate in NAD(P)H-dependent enzymes Nature Chemical Biology 10, 50-55 (2014) [5] Quade, N.; Huo, L.; Rachid, S.; Heinz, D. W.; Müller, R. Unusual carbon fixation gives rise to diverse polyketide extender units Nature Chemical Biology 8, 117-124 (2012) [6] Peter, D.; Schada von Borzyskowski, L.; Kiefer, P.; Christen, P.; Vorholt, J. A.; Erb, T. J. 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