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Aus der Medizinischen Universitätsklinik
- Abteilung IVder Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Brsg.
Molekulargenetische Untersuchung des
c-MET Proto-Onkogens
bei papillären Nierenkarzinomen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Brsg.
Vorgelegt 2005
von Susanne Munk-Schulenburg
geboren in Nordenham
Dekan
Prof. Dr. med. C. Peters
1. Gutachter
Prof. Dr. med. H.P.H. Neumann
2. Gutachter
Prof. Dr. med. U. Wetterauer
Jahr der Promotion 2006
INHALT
1 Einleitung
1
1.1 Klinische Aspekte der Nierenkarzinome
1
1.1.1 Ätiologische Faktoren
1
1.1.2 Histologische Einteilung
4
1.2 Papilläre Nierenzellkarzinome
6
1.2.1 Morphologie der papillären Nierenzellkarzinome
6
1.2.2 Hereditäre papilläre Nierenkarzinome
7
1.2.3 Klinische Präsentation
7
1.2.4 Diagnostik
11
1.2.5 Therapie und Prognose
11
1.3 Pathogenese der papillären Nierenkarzinome
14
1.3.1 Das c-MET-Proto-Onkogen und sein Produkt
der MET-Rezeptor
14
1.3.2 Bekannte Mutationen des c-MET-Proto-Onkogens
in Bezug auf papilläre Nierenkarzinome
1.3.3 Zytogenetische Befunde bei papillären Nierenkarzinomen
1.4. Fragestellung
2 Material und Methoden
2.1 Material
18
21
22
23
23
2.1.1 Patientengut
23
2.1.2 Geräte
25
2.1.3 Enzyme
26
2.1.4 Nukleotide und Nukleinsäuren
26
2.1.5 Chemikalien
26
2.1.6 Lösungen
28
2.2 Methoden
30
2.2.1 Register
30
2.2.2 DNA-Extraktion aus Vollblut
31
2.2.3 Polymerasekettenreaktion
32
2.2.4 Agarosegel-Elektrophorese
35
II
2.2.5 Single-Stranded Conformational Polymorphism (SSCP) Analyse
36
2.2.6 Acrylamidgel-Elektrophorese
36
2.2.7 Silberfärbung der Acrylamidgele
38
2.2.8 Sequenzierung
38
2.2.9 Kontrolle anhand Normalproben
39
3 Ergebnisse
40
3.1 Register
40
3.2 Ergebnisse der SSCP- Analysen der Positivproben
43
3.3 Fallbeschreibungen der Patienten mit der Mutation A3529G in Exon 16
49
3.4 Ergebnisse der SSCP- Analysen der DNA-Proben
52
3.5 Fallbeschreibung des Patienten mit der Mutation G698T in Exon 2
56
3.6 Weitere Polymorphismen
57
3.7 SSCP- Analysen der Patienten mit bekannten somatischen Mutationen
58
3.7.1 Fallbeschreibung des Patienten mit der somatischen Mutation
G3522A in Exon 16
60
3.7.2 Fallbeschreibung des Patienten mit der somatischen Mutation
T3936G in Exon 19
3.8 Sensitivität der SSCP- Analyse
4 Diskussion
60
61
62
4.1 Konstitutionelle- Mutationen des MET- Gens
bei sporadischen papillären Nierenkarzinomen
62
4.2 Konstitutionelle- Mutationen des Met- Gens bei papillären
Nierenkarzinomen mit unklarer und positiver familiärer Anamnese
4.3 SSCP- Analyse der Positivkontrollen
65
67
4.4 Konstitutionelle- Mutationen des MET- Gens bei Patienten mit
somatischen- Mutationen im Tumorgewebe
68
4.5 Histologische- Klinische Korrelation bei sporadischen
und familiären papillären Nierenkarzinomen
4.6 MET- Polymorphismus
69
70
III
5 Zusammenfassung
71
6 Anhang
72
7 Abkürzungen
73
8 Literaturverzeichnis
74
9 Lebenslauf
84
10 Danksagung
85
1
1
Einleitung
EINLEITUNG
Der Entstehungsmechanismus menschlicher Tumoren ist sehr vielfältig und bis heute noch
nicht bei allen Tumorarten vollständig aufgeklärt. Genetische Veränderungen werden
allgemein als Grundlage einer Tumorentstehung angesehen, wobei vor allem den Genen eine
bedeutende Rolle zugetragen wird, die die Proliferation und Differenzierung einer Zelle
beeinflussen. Insbesondere die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (Marshall 1991) und
die Aktivierung zellulärer Proto-Onkogenen (Bishop 1991) werden als einen wichtigen
Bestandteil der Pathogenese von Neoplasien angesehen. Durch eine solche Mutation können
Zellen einen Wachstumsvorteil gegenüber gesunden Zellen erhalten und somit gesundes
Gewebe überwuchern und verdrängen. Solche Genveränderungen können sporadisch
auftreten oder im Rahmen eines familiären, erblichen Tumorleidens.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den sporadischen und familiären papillären
Nierenkarzinomen, welche mit Veränderungen im so genannten c-MET Proto-Onkogen
einhergehen können.
1.1
Klinische Aspekte der Nierenkarzinome
1.1.1 Ätiologische Faktoren
Neben den erblichen Faktoren im Rahmen eines familiären Tumorsyndroms wie z.B. bei dem
Von-Hippel-Lindau-Syndrom oder den familiären papillären Nierenkarzinomen spielen eine
Reihe von anderen Ursachen bei der Krankheitsentstehung eine bedeutende Rolle, da die
Mehrzahl der Nierenkarzinome und auch der papillären Nierenkarzinome auf dem Boden
einer sporadischen Erkrankung entstehen. Dabei scheinen Alter, Geschlecht, Umwelteinflüsse
und geographische Faktoren eine Rolle zu spielen.
Das Auftreten von Nierenkarzinomen steht in einem engen Verhältnis zum Alter der
Betroffenen. Daten von einer standardisierten Studie zeigen einen Anstieg der Frequenz nach
dem dreißigsten Lebensjahr, mit einer minimalen Inzidenz davor (De Reijke et al. 1987). Ein
gehäuftes Auftreten erscheint im sechzigsten und siebzigsten Lebensjahr (Abb. 1.1).
Einleitung
2
45
40
35
30
25
Frequenz
20
15
10
5
0
30
40
50
60
70
Alter in Jahren
80
90
Abbildung 1.1: Altersverteilung von Nierenzellkarzinomen in 118 Fällen (aus: De Reijke et al. 1987)
Ein
weiterer
wichtiger
Faktor
der
sporadischen
Nierenzellkarzinome
ist
die
Geschlechtszugehörigkeit. Die Häufigkeit von sporadischen Nierenkarzinomen ist bei
Männern dreimal höher als bei Frauen. Nach der Menopause zeigt sich eine leichte Erhöhung
des Männer-Frauen Verhältnis zu Ungunsten der Frauen (Manuel Urrutia Avisrror, Oxford
Textbook of Clinical Nephrology, 2nd ed. 1998).
Eine vergleichende Studie über die Häufigkeit von Nierenkarzinomen in verschiedenen
Ländern zeigt eine erhöhte Inzidenz in den hoch entwickelten Industrieländern. Dies scheint
mit vielen Faktoren vergesellschaftet zu sein, z.B. mit der Verstädterung und der ständigen
Belastung des Organismus durch verschiedene karzinogene Substanzen aus Umwelt und
Industrie (Paganini-Hill et al. 1983). Eine weitere Rolle spielen zudem unterschiedliche
Lebensgewohnheiten und das Eßverhalten. So konnte vor einigen Jahren in einer
epidemiologischen Studie gezeigt werden, daß adipöse Frauen ein erhöhtes Risiko besitzen,
an einem Nierenkarzinom zu erkranken (Mellemgard et al. 1994). Ein häufig diskutierter
Risikofaktor ist das Tabakrauchen (Bennington und Laubscher 1968; Kreiger et al. 1993),
wobei der pathogenetische Mechanismus hierbei noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Ein
erhöhtes Risiko wurde zudem bei einer langjährigen Einnahme verschiedener Medikamente
berichtet, wie Phenacetin enthaltende Analgetika (Armstrong et al. 1976) oder bei ständigem
3
Einleitung
Gebrauch von Diuretika (Weinmann 1993). Auch bei langjährigen Hämodialyse-Patienten
konnte ein erhöhtes Risiko dokumentiert werden (Ishikawa 1993).
Als weiteren Risikofaktor werden physikalische und chemische Einflüsse diskutiert, wie z.B.
die chronische Belastung durch Cadmium, Blei oder Asbest, welche in Tierexperimenten eine
karzinogene Wirkung zeigten und somit auch beim Menschen als Karzinogen in Betracht
kommen. Auch Aflatoxin, von Aspergillus-Pilzgattungen gebildet und in verschiedenen
Nahrungsmitteln enthalten, erzeugte in Experimenten an Ratten verschiedene Arten von
Nierenkarzinomen (Epstein et al. 1969). Für das Lösungsmittel Trichloroethylen konnte in
einer Studie ein mutagener Effekt auf das VHL-Tumorsuppressorgen gezeigt werden. Bei 44
Patienten mit einem klarzelligen Nierenkarzinom und nachgewiesener chronischer
Trichloroethylen – Exposition konnten in 33 Fällen (75%) somatische Mutationen im VHLGen nachgewiesen werden. Bei den Patienten konnten jeweils mehrere unterschiedliche
Mutationen im VHL-Gen festgestellt werden und die jeweilige Anzahl zeigte eine Korrelation
mit der Schwere der Trichloroethylen – Exposition der Betroffenen (Brauch et al. 1999).
Eine physikalische Substanz, der eine krankheitsauslösende Wirkung zugeschrieben wird, ist
Thorotrast, welches früher unter anderem als Kontrastmittel z.B. bei retrograden
Pyelographien benutzt wurde (Alken et al. 1960; Ruiz-Marcellan et al. 1979).
Weiterhin wird eine hormonell bedingte Ätiologie diskutiert, wobei dem Östrogen eine
protektive Rolle zugeschrieben wird. Diese Theorie basiert auf dem gehäuften Auftreten von
Nierenkarzinomen bei Männern und bei Frauen erst nach der Menopause und wird durch das
Vorhandensein von Hormonrezeptoren auf normalem Nierengewebe und Karzinomgewebe
unterstützt. Eine Hormonbehandlung bei betroffenen Patienten war bisher jedoch nur wenig
erfolgreich (Manuel Urrutia Avisrror, Oxford Textbook of Clinical Nephrology, 2nd ed.,
1998).
Anhand von Tierexperimenten wird weiterhin eine mögliche Virus-induzierte Genese von
Adenokarzinomen der Niere diskutiert (Granhoff et al. 1973).
Ein gehäuftes familiäres Auftreten von Nierenkarzinomen ist ein weiterer wichtiger
Anhaltspunkt in der Klärung ihrer Ätiologie. In den letzten Jahren konnten anhand
verschiedener Studien mit betroffenen Familien genetische Veränderungen nachgewiesen
werden, die für bestimmte Nierenkarzinome prädisponierend zu sein scheinen. Bei den
molekulargenetischen Entdeckungen, die folgten, hatten die Patienten häufig Tumore im
Zusammenhang mit bestimmten erblichen Krankheitssyndromen, wie der Von-HippelLindau-Krankheit (Neumann et al. 1998), den familiären papillären Nierenkarzinomen
4
Einleitung
(Schmidt et al. 1997, 1999) oder im Rahmen der familiären Farbenblindheit (Griffin et al.
1967).
Abschließend ist zu der Ätiologie der Nierenkarzinome zu sagen, daß wahrscheinlich häufig
erst durch das Zusammenspiel mehrerer Risikofaktoren eine Tumorentstehung folgt
(multifaktorielle Genese), wobei mit Sicherheit noch weitere als die o.g. Faktoren existieren,
bei denen bisher noch kein Zusammenhang nachgewiesen werden konnte.
1.1.2 Histologische Einteilung
Eine histologische Einteilung der Nierenkarzinome erweist sich als schwierig, da ständig neue
Erkenntnisse über Genetik und Pathogenese veröffentlicht werden und auch in die
zytomorphologische Untergliederung einfließen. Somit finden sich bei verschiedenen Autoren
abweichende Einteilungen. Eine allgemein verbreitete histologische Klassifizierung soll im
Folgenden dargestellt werden.
Die Heidelberger Klassifikation (The Heidelberg Classification of Renal Cell Tumors,
Kovacs et al. 1997) der Nierenkarzinome unterteilt benigne und maligne Tumore in
verschiedene Untergruppen. Es sollen hierbei die malignen Tumore etwas genauer ausgeführt
werden.
Zu den benignen Tumoren zählen:
1.
Metanephritisches Adenom/ Adenofibrom
2.
Papilläres Nierenzelladenom
3.
Renales Onkozytom
Zu den malignen Tumoren zählen:
1.
Allgemeines oder gewöhnliches Nierenzellkarzinom
Dieser Typ besteht vor allem aus Zellen mit klarem Zytoplasma, wobei das
Wachstumsmuster solide, trabekulär, tubulär oder zystisch sein kann. Auch kleine
papilläre Areale können vorkommen. Das gewöhnliche Nierenkarzinom umfasst 75%
aller malignen Nierenneoplasien und ist somit die häufigste Art. Es wird aufgrund des
klaren Zytoplasmas der Zellen in der Färbung auch Klarzellkarzinom genannt.
Einleitung
5
2.
Papilläres Nierenzellkarzinom
Die Zellen dieses Tumors können klein sein mit spärlichem Zytoplasma, jedoch
kommen auch häufig Zellen vor, die ein mäßig ausgeprägtes bis reichliches
Zytoplasma besitzen mit basophilen, eosinophilen oder blassen Färbeeigenschaften.
Das vorherrschende Wachstumsmuster ist papillär, es kann daneben aber auch eine
tubulopapilläre
und
solide
Struktur
gesehen
werden.
Mit
10%
aller
Nierenzellkarzinome stellt dieser Typ die zweithäufigste Art dar.
3.
Chromophobes Nierenzellkarzinom
Dieser Tumor wächst gewöhnlich in großen, soliden Flächen. Die Zellen besitzen ein
charakteristisches blasses oder eosinophiles, granuläres Zytoplasma, entsprechend den
zahlreichen zytoplasmatischen Mikrovesikeln. Dieser Typ umfasst ca. 5% der
Nierenzellkarzinome.
4.
Sammelrohr-Karzinom (Ductus Bellini-Typ)
Das Erscheinungsbild dieses Tumors ist charakterisiert durch ungleichmäßige
Furchen, umrahmt von hoch atypischen Epithelzellen, in einem dysplastischen Stroma
liegend. Es kann eine fokale Schleimproduktion beobachtet werden. Das kürzlich
beschriebene medulläre Nierenkarzinom wird als eine Variante des SammelrohrKarzinoms angesehen. Diese Tumorart macht ca. 1% aller Nierenzellkarzinome aus.
5.
Unklassifizierte Nierenzellkarzinome
Hierzu werden alle Nierenkarzinome gezählt, die sich auch nach einer genetischen
Analyse nicht einer der Kategorien zuordnen lassen.
Das
mögliche
Auftreten
einer
sarkomatoiden
Veränderung
wurde
bei
allen
Nierenkarzinomtypen dieser Untergruppen gefunden und ein sarkomatoides Erscheinungsbild
kann somit nicht eine Kategorie für sich bilden. Jedoch scheint ein Vorkommen ein
Anzeichen für eine Progression des Tumors zu sein. Bei einem überwiegenden Anteil der
sarkomatoiden Struktur, werden solche Tumore von einigen Autoren als nur sarkomatoid
eingestuft.
6
1.2.
Einleitung
Papilläre Nierenzellkarzinome (papillary renal cell carcinoma, PRCC)
1.2.1 Morphologie der papillären Nierenzellkarzinome
Papilläre Nierenkarzinome definieren sich über die Anwesenheit eines vorherrschenden
charakteristischen Musters des Zellwachstums (Amin et al. 1997; Delahunt und Eble 1997;
Kovacs 1989; Kovacs et al. 1997; Mancilla-Jimenez et al. 1976). Die Tumorzellen sind
angeordnet wie Fingerfortsätze, angeheftet an eine Basismembran mit einem zentralen,
fibrovaskulären Kern und bedeckt von einer oberflächlichen Schicht aus neoplastischen,
epithelialen Zellen. Die Tumorzellen besitzen ein basophiles oder eosinophiles Zytoplasma.
Ein papilläres Wachstumsmuster ist dominierend, wobei der Anteil der papillären Strukturen
sehr variabel sein kann. Verschiedene Autoren haben deswegen vorgeschlagen, daß ein
Tumor mehr als 50% aus papillären Strukturen bestehen muss, um als ein papilläres
Nierenkarzinom klassifiziert werden zu können. Abb. 1.2 zeigt jeweils einen Ausschnitt eines
histologischen Bildes eines papillären Nierenkarzinoms.
Eine weitere Einteilung der PRCC in zwei Subtypen wurde von Delahunt und Eble (The
Heidelberg Classification of Renal Cell Tumors, Kovacs et al. 1997) eingeführt, nach ihren
morphologischen und immunhistochemischen Charakteristika differenziert. Typ 1 ist
gekennzeichnet durch das Auftreten von Papillen, die mit einer einfachen oder doppelten
Schicht bekleidet sind, bestehend aus kleinen, epithelialen Zellen mit einem spärlichen klaren
oder blassen Zytoplasma. Typ 2 zeichnet sich aus durch Papillen, bedeckt von einer Schicht
aus epithelialen Zellen mit reichlichem eosinophilen Zytoplasma, die in Pseudoschichten oder
unregelmäßigen Schichten angeordnet sind.
Abbildung 1.2: Histologische Bilder eines PRCC ( A: Typ 1, B: Typ 2) (aus: Gunawan et al. 2003)
7
Einleitung
1.2.2 Hereditäre papilläre Nierenkarzinome
Hereditäre papilläre Nierenkarzinome sind durch das Auftreten von multiplen, bilateralen
Nierentumoren gekennzeichnet (Zbar et al. 1994; Schmidt et al. 1997), im Gegensatz zu den
sporadischen papillären Nierenkarzinomen, die meistens solitär vorkommen. Die Läsionen
variieren dabei in der Größe von dysplastischen Veränderungen, die nur mikroskopisch
gesehen werden können, bis zu Läsionen mit einer Größe von bis zu 18 cm. Die Anzahl der
Tumoren kann dabei zwischen 1 bis zu 50 Tumoren pro Niere variieren (s. Abbildung 1.3)
Die Morphologie erscheint gleich wie bei den sporadischen PRCC.
Der Erbgang ist autosomal dominant mit variierend starker Penetranz, abhängig von dem
krankheitsauslösenden Gen und der spezifischen Mutation des entsprechenden Gens.
A: sporadische PRCC
B: hereditäre PRCC
Abbildung 1.3: Schematische Zeichnung des Erscheinungsbildes von sporadischen und hereditären
Nierenkarzinomen (aus: Zbar et al. 1998) und makroskopisches Erscheinungsbild eines hereditären
papillären RCC (aus: Lubensky et al. 1999)
1.2.3 Klinische Präsentation
Die klassischen klinischen Anzeichen eines Nierenkarzinoms werden als eine Trias
beschrieben, bestehend aus den Symptomen Schmerzen im Nierenlager, Makrohämaturie und
einem palpablen Tumor. Diese Trias wird heute jedoch nur in 5% bis 10% aller Fälle
beobachtet und deutet leider auf ein schon fortgeschrittenes Stadium der Krankheit hin.
Jeweils eine einzelne dieser Komponenten wird dennoch in ca. 50% der Fälle als ein
Einleitung
8
einzelnes
Symptom
Routinekontrollen
beschrieben.
durch
Nierenkarzinome
Sonographie
oder
im
werden
weitaus
häufiger
bei
Rahmen
anderer
diagnostischer
Untersuchungen entdeckt, als durch die klinische Verdachtsdiagnose aufgrund der
Symptomkonstellation.
Nach einer Studie von Skinner und Gibbsons ist das häufigste Symptom die Hämaturie,
gefolgt von einer spürbaren abdominellen Tumormasse, Schmerzen und Gewichtsverlust.
Symptome
Patienten in %
Hämaturie
59
Palpierbarer Tumor
45
Schmerzen
41
Gewichtsverlust
28
Symptome durch Metastasen
10
Klassische Trias
9
Akute Varikozele
2
Tabelle 1.1: Symptome bei 309 Patienten mit Nierenzellkarzinomen (Daten nach Skinner, Calvin,
Vermillion et al. 1971)
Die Hämaturie ist ein wichtiges diagnostisches Zeichen, wobei andere Blutungsquellen aus
dem unteren urethralen Trakt auszuschließen sind. Hierbei ist das begleitende Auftreten von
wurmartigen Klümpchen im Urin, bestehend aus kleinen
Zellhaufen, ein zusätzliches
Anzeichen. Der Schmerz verbunden mit Nierenkarzinomen wird als dumpf und kontinuierlich
beschrieben, wobei er häufig einer Hämaturie folgt. Während einer Makrohämaturie können
Blutklümpchen eine akute Ureterobstruktion hervorrufen, welche zu den typischen
Symptomen einer Nierenkolik führen kann.
Das plötzliche Auftreten einer skrotalen Varikozele wurde in einer Studie bei 11% der Fälle
dokumentiert (Pinals und Krane 1962), wobei sich die Varikozele bei der Mehrheit der
Patienten auf der linken Seite befand. Dies ist auf eine Obstruktion der gonadalen Vene an
ihrem Eintrittspunkt in die Nierenvene zurückzuführen.
Nierenkarzinome können sich häufig auch durch unspezifische aber tumorbedingte
Symptome äußern, die auch auf andere Erkrankungen hinweisend sein können. Diese
Manifestationen werden als paraneoplastische Syndrome bezeichnet. Dazu zählen unter
Einleitung
9
anderem
Gewichtsverlust,
Fieber,
Erythrozytose,
Anämie
oder
Symptome
einer
Hyperkalzämie.
Diese paraneoplastischen Syndrome werden in drei Gruppen eingeteilt: nicht spezifische
Symptome, spezifische Symptome und gemischte Symptome.
Nicht spezifische Symptome
Fieber gehört, wie auch der Gewichtsverlust, zu Symptomen, die viele bösartige Tumore
gemeinsam haben. Es wird als intermittierend und mit einer wechselnden Höhe der
Temperatur beschrieben. Das Fieber wird durch die Freisetzung von einem endogenen
Pyrogen aus den Tumorzellen oder aus Leukozyten innerhalb des Tumors erklärt (Rawlins et
al.1970). Das Fieber verschwindet nach einer erfolgreichen Tumorentfernung und kann somit
als Verlaufsparameter genutzt werden. Auch der Gewichtsverlust scheint durch eine
systemisch wirkende, toxische Substanz aus den Tumorzellen zu resultieren.
Eine Anämie wird bei ca. einem Drittel der Patienten festgestellt und ist vom normochromennormozytären Charakter. Chisholm und Roy (1971) stellten die These auf, daß ein Mangel an
Erythropoetin, durch einen Nierenzell-Untergang bedingt, eine mögliche Ursache ist oder ein
toxischer Einfluss des Karzinoms auf das Knochenmark besteht. Andere hämatologische
Symptome
wie
eine
erhöhte
leukämoide Reaktionen und
Erythrozyten-Sedimentationsrate,
Thrombozytopenie,
Gerinnungsstörungen sind häufig und kommen auch bei
verschiedenen anderen Karzinomen und chronischen entzündlichen Krankheiten vor.
Bei ca. 5% der Patienten mit Nierenkarzinomen wird eine Amyloidose der Niere, Leber, Milz
und der Nebenniere beobachtet, welche sich auch nach Heilung nicht zurückbildet. Die
Ätiologie ist unklar und der Befund deutet auf eine schlechte Prognose hin (Chisholm, Roy
1971).
Eine reversible Leberfunktionsstörung, das so genannte Stauffer- Syndrom, wurde bei ca.
15% aller Patienten dokumentiert und äußert sich durch veränderte Werte bei der
Leberfunktionsprüfung. Die Ursache ist nicht bekannt, jedoch kann eine Normalisierung der
Werte nach einer Tumorentfernung beobachtet werden, sofern keine Lebermetastasen
vorhanden sind (Ritchie, Chisholm 1983).
Spezifische Symptome
Hypertonie ist ein charakteristisches Symptom und tritt bei bis zu 40% der Patienten auf.
Dieser Bluthochdruck kommt durch eine spezielle humorale Aktivität des Tumors zustande,
eine autonome Reninproduktion (Surfin et al. 1977). Bei einem Drittel (ca. 33%) der
Einleitung
10
Patienten mit hochgradigem Nierenkarzinom wurde ein erhöhter Reninspiegel unabhängig
vom Blutdruck gefunden, was mit einer schlechten Prognose einherzugehen scheint (Surfin et
al.1977).
Weitere spezifische Symptome sind Polyzythämie und Hyperkalzämie, welche durch
verschiedene aktivierende Substanzen ausgelöst werden, die aus Tumorzellen freigesetzt
werden oder aus einer fortschreitenden Niereninsuffizienz resultieren. Eine Polyzythämie
wird jedoch nur bei ca. 4% der Patienten beobachtet und wird einer erhöhten Freisetzung von
Erythropoetin oder einer Erythropoetin ähnlichen Substanz zugeschrieben. Gegensätzlich
wird bei ungefähr 63% aller Patienten eine Erythropoetinerniedrigung beschrieben (Surfin et
al. 1977). Hyperkalzämie kann durch eine dem Parathormon ähnliche Substanz aus den
Tumorzellen verursacht werden oder durch einen sekundären Hyperparathyreoidismus in
Folge einer Niereninsuffizienz. Erhöhte Kalzium-Werte normalisieren sich in der Regel nach
einer Therapie und können als Verlaufsparameter genutzt werden.
Gemischte Symptome
Viele Symptome weisen auf das Krankheitsbild eines Nierenkarzinoms hin, doch nur wenige
können direkt mit dieser speziellen Tumorentwicklung in Verbindung gebracht werden. Dazu
gehören die Befunde einer leukämoiden Reaktion, einer Neuropathie, einer Nephritis mit
Salzverlustsyndrom und gastrointestinalen Beschwerden.
Eine Übersicht der Häufigkeit systemischer Auswirkungen gibt Tabelle 1.2
Symptom
Häufigkeit in %
Erhöhte Erythrozyten-Sedimentationsrate
55,6
Anämie
41,3
Hypertonie
37,6
Kachexie
34,5
Fieber
17,2
Abnormaler Leberfunktionstest
15,0
Erhöhte alkalische Phosphatase
14,7
Hyperkalzämie
5,7
Polyzythämie
3,7
Neuromyopathie
3,3
Amyloidose
2,1
Tabelle 1.2: Frequenz systemischer Auswirkungen (Daten modifiziert nach Chisholm und Roy 1971)
Einleitung
11
1.2.4 Diagnostik
Heutzutage steht eine Anzahl von nicht-invasiven Methoden zu Verfügung, die eine sehr
genaue Diagnostik der Nierenkarzinome zulassen. Ultrasonographie, Computertomographie,
Magnetresonanztomographie und Angiographie gehören zu den sensitivsten Methoden der
heutigen Diagnostik. An der Universitätsklinik Freiburg ist die Magnetresonanztomographie
Methode der Wahl. Die endgültige Diagnose wird mittels histo-pathologischer Untersuchung
von Tumorgewebe gestellt.
Auch für das Staging des Karzinoms und dem Erstellen eines Therapieplanes spielen diese
Verfahren eine wichtige Rolle, da Nierenzellkarzinome häufig hämatogen in verschiedene
Organe (besonders in Lunge, Hirn und Knochen) metastasieren und so eine genaue
Ausbreitung und Größe des Tumors festgestellt werden kann. An der Universitätsklinik
Freiburg
werden
hierbei
die
Computertomographie
des
Thorax,
die
Magnetresonanztomographie des Kopfes und die Knochenszintigraphie angewendet. So kann
ein optimales Therapieschema für den Patienten erstellt werden.
1.2.5 Therapie und Prognose
Die Therapie der Wahl ist das chirurgische Entfernen des Tumors. Während bis vor wenigen
Jahren die Nephrektomie die Methode der Wahl war, wird zunehmend zur organerhaltenden
Tumorresektion übergegangen. Eine solche Enukleation des Tumors kann bei unilateralen,
kleinen, nicht in die umgebenden Gefäße und Lymphknoten eingewachsenen Tumoren
erfolgen. Hat der Tumor umgebende Strukturen infiltriert, ist weiterhin die radikale
Nephrektomie die Methode der Wahl. Gleichzeitig wird eine regionale Lymphadenektomie
durchgeführt, da bei vielen Patienten die regionalen und periaortalen Lymphknoten befallen
sind. Sind beide Nieren betroffen, so wird die Entfernung der Tumore bei Erhaltung eines
Nierenteils angestrebt. Lokale Rezidive sowie Metastasen werden soweit möglich operativ
entfernt.
Zu der chirurgischen Behandlung können bei Metastasen adjuvante Therapieformen in
Erwägung gezogen werden, wie Radiotherapie, Chemotherapie, Immuntherapie oder eine
Hormontherapie. Metastasierende Nierenzellkarzinome sind jedoch leider häufig gegen die
gängigen adjuvanten Therapien resistent.
Einleitung
12
Der wichtigste Prognosefaktor eines Patienten mit Nierenzellkarzinom ist das Stadium des
Tumors bei Diagnosestellung und Therapiebeginn. Je höher das Stadium, umso niedriger ist
die 5-Jahres-Überlebensrate (Tabelle 1.3).
Weiterhin ist die Prognose abhängig vom histologischen Typ des Karzinoms. Chromophobe
Karzinomtypen haben eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als papilläre und klarzellige
Typen. Die schlechteste Prognose haben die Karzinome mit sarkomatoiden Anteilen (Moch et
al. 2000).
Speziell für papilläre Nierenkarzinome scheinen Tumore vom Subtyp II eine schlechtere
Prognose zu haben als Tumore vom Subtyp I. Zudem konnte eine kürzere Überlebensrate bei
Patienten mit zusätzlichem Verlust des Chromosom Xp nachgewiesen werden (Moch et al.
2000; Jiang et al. 1998).
Stadium
Patientenzahl Überlebensrate
(%)
I
36
51,0
II
54
58,5
Nierenvene infiltriert
21
64,0
Vena Cava infiltriert
7
25,4
III
8
12,3
IV
32
0
Tabelle 1.3: Korrelation des pathologischen Stadium mit der 5-Jahres-Überlebensrate
13
Einleitung
Das Staging der Nierenkarzinome wird hauptsächlich anhand zweier Klassifikationen
durchgeführt. Die Erste wurde 1969 von Robson eingeführt und orientiert sich an den
makroskopisch sichtbaren pathologischen Befunden, die während der Operation eines Tumors
erhoben werden können. Tabelle 1.4
Grad I
: Der Tumor liegt innerhalb der Nierenkapsel
Grad II
: Infiltration des perinephritischen Fettgewebes, der Tumor liegt noch innerhalb der GerotaFaszie
Grad III
: Beteiligung der regionalen Lymphknoten und/oder der Nierenvene oder Vena Cava
Grad IV
: Beteiligung der angrenzenden Organe und Fernmetastasen
Tabelle 1.4: Stadiumeinteilung des Nierenzellkarzinoms nach Robson et al. 1969
Die internationale TNM Klassifikation von 1997 unterteilt in mehrere Stadien, jeweils für den
Tumor, Lymphknoten und Metastasen. Tabelle 1.5
Tumor
T1
T2
T3a
T3b
T3c
T4
Tumor 7cm oder kleiner, auf die Niere beschränkt
Tumor größer als 7cm, auf die Niere beschränkt
Tumorausdehnung ins perirenale Fettgewebe oder Nebenniere,
aber nicht über Gerota-Faszie hinaus
Infiltration der Nierenvene oder Vena Cava unterhalb des Diaphragma
Infiltration der Vena Cava oberhalb des Diaphragma
Tumorausdehnung außerhalb der Gerota-Faszie
Lymphknoten
NX
N0
N1
N2
Regionale Lymphknoten können nicht eingeschätzt werden
Kein Lymphknotenbefall
Metastasierung in einen regionalen Lymphknoten
Metastasierung in mehrere regionale Lymphknoten
Metastasen
MX
M0
M1
Keine Einschätzbarkeit von Metastasierung
Keine Fernmetastasen
Fernmetastasen
Tabelle 1.5: TNM Klassifikation der Nierenkarzinome (TNM-Classification of malignant tumors, 5th Ed.
1997)
14
1.3
Einleitung
Pathogenese der papillären Nierenkarzinome
Das papilläre Nierenkarzinom tritt fast ausschließlich sporadisch, d.h. als Einzelfall in einer
Familie, auf. In den letzten Jahren konnten einige somatische, sowie konstitutionelle
Mutationen lokalisiert werden, die im Zusammenhang mit der Pathogenese dieser Tumoren
stehen. Dies hat zu einem neuen Verständnis der Nierenkarzinome geführt, wodurch nun
neben der morphologischen Einteilung auch in zunehmendem Maße eine molekulargenetische
Charakterisierung möglich wird. Als eine neue Entität wurde 1994 das familiäre papilläre
Nierenkarzinom (Hereditary Papillary Renal Cell Carcinoma, HPRCC) veröffentlicht (Zbar et
al. 1994). Ein zugrunde liegender Gendefekt konnte lokalisiert werden (Schmidt et al. 1997).
Es wurden Mutationen im so genannten c-MET Proto-Onkogen gefunden. Hierbei konnte bei
hereditären Tumoren eine konstitutionelle Mutation des MET-Gens festgestellt werden
(Schmidt et al. 1997).
Auch bei papillären Nierenkarzinomen ohne eine positive familiäre Anamnese konnten in
13% der Fälle Mutationen im MET-Gen nachgewiesen werden (Lubensky et al. 1999).
MET Proto-Onkogen Mutationen prädisponieren somit sowohl für das hereditäre papilläre
Nierenkarzinom als auch für das sporadische papilläre Nierenkarzinom.
1.3.1 Das c-MET Proto-Onkogen und sein Produkt der MET-Rezeptor
Proto-Onkogene kodieren für spezielle Proteine, deren Aufgabe in der zellulären Rezeption,
Transduktion und Umsetzung von Wachstumssignalen besteht. Onkogene entstehen infolge
von Mutation aus Proto-Onkogenen und können autonomes Zellwachstum induzieren (Bishop
1991). Die molekulargenetischen Veränderungen, die zu einer Aktivierung der ProtoOnkogene führen, können Struktur wie auch Expression der betroffenen Gene verändern. Die
entsprechenden Genprodukte sind insbesondere Wachstumsfaktoren und ihre entsprechenden
Rezeptoren.
Das MET-Gen kodiert für einen transmembranären Tyrosinkinase-Rezeptor, MET. Dieser
Rezeptor, wird in vielen Geweben epithelialer Herkunft exprimiert, unter anderem in der
Niere, Darm, Brustgewebe, Leber, Muskeln und Monozyten (Sonnenberg et al. 1993). Zudem
wird er in vielen epithelialen Tumoren überexprimiert gefunden, so auch in unterschiedlichen
Typen von Nierenkarzinomen, weswegen das MET-Gen als Proto-Onkogen klassifiziert
Einleitung
15
wurde (Park et al. 1986; Di Renzo et al. 1992; 1994; Prat et al. 1991). Der MET-Rezeptor
besteht aus einer Polypeptidkette aus 1390 Aminosäuren, die sich in ein zweikettiges
Heterodimer gliedert. Die Ketten des Dimers sind über Disulfidbrücken (S-S) verbunden
(Birchmeier, Gherardi 1998). Insgesamt besteht der MET-Rezeptor aus drei Untereinheiten,
der extrazellulären Domäne, der transmembranären Domäne und der zytoplasmatischen
(Tyrosinkinase-) Domäne. Die extrazelluläre Domäne enthält die α-Kette mit einem Nterminalen Ende und die transmembranäre β-Kette mit einem C-terminalen Ende an der
extramembranären Sequenz. Die β-Kette enthält neben der transmembranären Domäne eine
zytoplasmatische
Protein-Kinase,
die
für
die
intrazelluläre
Signal-Transduktion
verantwortlich ist. Für die Rezeptoraktivierung finden sich hier zwei spezifische TyrosinPhosphorylierungsstellen bei Y1234 und Y1235. Der entsprechende Rezeptor-Ligand ist der
Hepatocyte growth factor/ Scatter factor (HGF/SF) (Bottaro et al. 1991; Naldini et al. 1992).
Nach einer proteolytischen Spaltung kann HGF an den Rezeptor binden. HGF ist ein
multifunktionaler Faktor, der epitheliale Zell-Mitogenese, Zellbeweglichkeit, Zellwachstum
und Morphogenese stimuliert (Bladt et al. 1995).
Die extrazelluläre Domäne ist für die Ligandenbindung und die Weiterleitung des Signals zur
zytoplasmatischen Domäne verantwortlich, was über eine Rezeptor-Oligomerisation
geschieht. In der zytoplasmatischen Domäne findet über eine Autophophorylierung der
katalytischen Kinase eine Übertragung des Signals an intrazelluläre Zielproteine statt. Hierbei
spielen die downstream gelegenen Tyrosine eine wesentliche Rolle, die je nach
Phosphorylierung die Interaktion mit verschiedenen Signaltransduktoren vermitteln (Takada
et al. 1998).
Die inaktive Konformation des Rezeptors wird durch ein Zusammenspiel verschiedener
Faktoren bestimmt. In der katalytisch inaktiven, unphosphorylierten Form ist der Zugang zu
dem für die Reaktion benötigtem ATP und zur Protein-bindenden Seite durch eine so
genannte „activation loop“ blockiert, die erst durch Ligandenbindung mit folgender
Phosphorylierung aktiviert wird. Die Substrat- bindende Tasche, wird dabei von den Resten
der Pi-„loop“ (Phosphorylierungsstellen) gebildet. In der „activation loop“ in der inaktiven
Form ist die Substrat- bindende Region durch ein Zugangshindernis zu dem für eine Reaktion
benötigten ATP blockiert. Die ATP- bindende Tasche wird durch eine Kinase besetzt und
bildet ein sterisches Hindernis, wodurch die Substrat- bindende Tasche und die ATPbindende Tasche
auseinander gehalten werden. Diese gespaltene Konformation wird
zusätzlich durch chemische Wechselwirkungen zwischen den entsprechenden Taschen
stabilisiert (Schmidt et al. 1999)(siehe Figur 1).
Einleitung
16
Durch
Ligandenbindung
kommt
es
zu
einer
Rezeptor-Oligomerisation
mit
Konformationsänderung. Hierdurch erfolgt eine Phosphorylisierung und als Folge die
Aufhebung der Blockade zwischen der Substrat- bindenden und ATP- bindenden Tasche.
Durch den Zugang zum ATP kann nun eine katalytische Reaktion und Bindung eines
zytoplasmatischen Moleküls erfolgen. In der aktiven Form kann die Tyrosin-Kinase an
zahlreiche Ziel-Moleküle (Signaltransduktoren) binden. Es wird vermutet, daß dies die
Grundlage für die vielfältigen Zell-Antworten auf HGF bildet.
Figur 1: Schematische Darstellung des MET- Rezeptors und HGF (aus: Birchmeier, Gheradi 1998)
HGF/SF: Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor
Pi: Phosphorylierungsstellen, intrazellulär (Y1234/Y1235)
Gab 1 / Grb 2: Beispiele für Zielmoleküle
PI 3-K / MAPK: Phosphoinositide 3 Kinase / Mitogen- aktivierende Protein- Kinase
S-S: Disulfidbrücken
Bei MET-Mutanten konnten eine erhöhte Tyrosin-Autophosphorylisierung und eine
verstärkte Aktivität der Kinase nachgewiesen werden, wodurch vermutet wird, daß die
Tumorgenese quantitativ mit der Größe der Aktivierung des MET durch Mutation
zusammenhängt (Jeffers et al. 1997). Die Aktivierung oder Amplifikation des MET-Rezeptors
Einleitung
17
infolge Mutation erfolgt wahrscheinlich durch eine Destabilisierung der hemmenden
„activation loop“ und somit Überführung in eine dauerhaft aktive Form mit Aktivierung der
Tyrosin-Kinase in einer alternativen Konformation (Hubbard et al. 1994). Belegend hierfür
konnte bei den bisher gefundenen Mutationen des MET-Gens keine Rezeptor-Inaktivierung
gefunden werden.
Weiterhin konnte ein Zusammenhang gefunden werden, daß HGF über den MET- Rezeptor
die Differenzierung und Organisation von Nierenzellen zu sich verzweigenden Tubuli
stimuliert und dabei eine frühembryonale Entwicklung von normalen Nephronen simuliert
(Montesano et al. 1991). Es wird daher vermutet, daß eine vererbte Mutation des MET- Gens,
zu einer verzögerten Differenzierung von vielen Blastenzellen während der embryonalen
Entwicklung führt. Diese undifferenzierten Zellen behalten somit ihre Proliferationskapazität
und bilden embryonale Reste i. Nierengewebe, die während des Lebens langsam weiter
wachsen können (Fischer et al. 1998).
Das MET-Proto-Onkogen selbst besteht aus 21 Exons mit einer Minimumgröße von 110kb
(Schmidt et al.1997), wobei das erste Exon die 5`UTR-Sequenz enthält und nicht kodierend
ist (Gambarotta et al. 1994). Exon 2 bis 21 enthalten die kodierenden Exons, Exon 21 enthält
die 3`UTR-Sequenz. Die Größe der kodierenden Exons bewegt sich in einem Bereich von 81
bis 231 Basenpaaren(bp), mit der Ausnahme von Exon 2, welches 1214 bp besitzt.
Die Lokalisation des MET-Gens ist auf dem langen Arm des Chromosom 7, im Bereich von
7q31.1 in einem 27-centimorgen Intervall zwischen D7S496 und D7S183 (Schmidt et al.
1997) (siehe Figur 2).
Lokalisation des c-MET Gens
Figur 2: Lokalisation des MET- Gens auf Chromosom 7 (aus OMIM Database)
18
Einleitung
Die extrazelluläre Domäne des MET-Rezeptors ist in Exon 2 bis 13 lokalisiert (Codon 25923). Die transmembranäre Domäne befindet sich zusammen mit dem Ende der
extrazellulären und dem Anfang der intrazellulären Domäne in Exon 13 (Codon 933-955).
Die Exons 15 bis 21 enthalten die intrazelluläre Domäne (Codon 956-1390) mit der TyrosinKinase Domäne (Codon 1078-1345) (Schmidt et al., 1997) (siehe Figur 3).
Figur 3: Exon und Intron Grenzen des MET- Gens mit Darstellung der einzelnen Domänen und
Nukleotide (aus: Duh et al. 1997)
Die menschliche MET cDNA kodiert insgesamt für ein Protein von 1408 Aminosäuren (aa).
Die extrazelluläre Domäne enthält 950 Aminosäuren, die transmembranäre Domäne enthält
die Aminosäuren 951 bis 973 und die Tyrosin- Kinase Domäne enthält die Aminosäuren
1102 bis 1351 (Cooper et al. 1984; Park et al. 1987).
1.3.2 Bekannte Mutationen des MET Proto-Onkogens in Bezug auf
papilläre RCC
Es wurden bisher 15 verschiedene konstitutionelle und somatische Mutationen des MET-Gens
identifiziert. Alle Mutationen beschränken sich auf die Exons 16, 17, 18 und 19 des MET-
19
Einleitung
Gens. Die Mutationen sind ausschließlich vom Missense-Typ und in der Tyrosin-Kinase
Domäne des Gens lokalisiert. Bei keiner dieser Mutationen konnte eine Inaktivierung des
MET-Rezeptors nachgewiesen werden.
Die ersten Mutationen des MET-Gens in Bezug auf papilläre RCC wurden 1997 von Schmidt
et al. beschrieben. Es wurden Mutationen bei Patienten mit familiärem papillären NCC und
sporadischem papillären RCC gefunden. Untersucht wurden Exon 2 und Exon 9 bis 21
(Schmidt et al. 1997). In der gleichen Studie konnte zudem eine sehr häufig zusätzlich
auftretende Trisomie des Chromosom 7 bestätigt werden, die charakteristisch für sporadische
papilläre RCC ist (Kovacs 1993). Es wurden 9 Mutationen gefunden, lokalisiert in den Exons
17, 18 und 19 in der Tyrosin-Kinase Domäne. Davon waren 5 konstitutionelle Mutationen
und 4 somatische Mutationen. Insgesamt wurden konstitutionelle Mutationen der Keimbahn
bei 4 von 7 betroffenen Familien gefunden, bei einem Patienten ohne positive familiäre
Anamnese und einem Patienten, dessen Mutter einen nicht genau klassifizierten Nierentumor
hatte. Somatische Mutationen wurden bei 3 von 60 (5%) Patienten mit sporadischen
papillären NCC identifiziert und bei 2 von 3 Tumoren eines Patienten mit bilateralem
papillären RCC.
Eine weitere Studie der gleichen Gruppe konnte bei einem Patientengut von 128 Patienten
weitere 5 neue Missense-Mutationen bei 8 Patienten identifizieren, 5 konstitutionelle und 3
somatische Mutationen, wobei nur sporadische papilläre RCC untersucht wurden. Bei dieser
Studie wurde zudem ein Polymorphismus in Exon 15 entdeckt, der mit einem
Nukleotidaustausch von Cytosin zu Thyrosin bei nt 3223 einhergeht. Die Mutationsanalyse
konzentrierte sich bei dieser Studie auf die Exons 16 bis 19, die Exons 5, 7 und 13 wurden
zusätzlich sequenziert (Schmidt et al. 1999).
Eine weitere neue Mutation vom Missense-Typ wurde bei einer Untersuchung von zwei
großen nordamerikanischen Familien gefunden, wobei Exon 2, 4, 7 und 9 bis 21 untersucht
wurden (Schmidt et al. 1998). In der ersten Familie waren 9 Personen betroffen, in der
zweiten Familie 13 Personen. Die Mutation ist bei beiden Familien identisch, was zu der
Annahme eines gemeinsamen Vorfahren führte. Nach Sequenzierung wurde ein
Nukleotidaustausch von Histidin zu Argenin identifiziert, was jedoch nicht zu einer
Aminosäurenvertauschung führt. Bei der klinischen Untersuchung hatten 22 von 32
Familienmitgliedern mit der Mutation einen Nierentumor, keine Person ohne die Mutation
hatte einen Nierentumor und 12 von 13 Personen über 50 Jahre die Mutationsträger waren,
hatten einen Nierentumor.
Einleitung
20
Insgesamt zeigten 75% der betroffenen Patienten dieser Studien multiple, bilaterale Tumore,
Metastasenbildung war selten. Das durchschnittliche Alter bei Entdeckung der Tumore war
40 Jahre. Die Tumore ließen sich alle dem Subtyp 1 der papilläre Nierenkarzinome zuordnen.
Die Studien zeigten weiterhin, daß eine Mutation des MET- Gen scheinbar mit einer
verminderten Penetranz der Erkrankung und einem spätem Manifestationsalter der klinischen
Symptome vergesellschaftet ist.
Eine Zusammenfassung aller bisher identifizierten Mutationen des c-MET Proto-Onkogens
zeigt Tabelle 1.6
Exon
NukleotidVeränderung
Codon
Effekt auf
Aminosäure
16
G3522A
V1110I
Val Æ Ile
16
C3528T
H1112Y
His Æ Tyr
16
A3529T
H1112L
His Æ Leu
16
C3564G
H1124D
His Æ Asp
18
C3831G
L1213V
Leu Æ Val
19
G3930C
D1246H
Asp Æ His
19
T3936C
Y1248H
Tyr Æ His
19
T3936G
Y1248D
Tyr Æ Asp
19
A3937G
Y1248C
Tyr Æ Cys
19
T3997C
M1268T
Met Æ Thr
16
G3522A
V1110I
Val Æ Ile
16
C3528T
H1112Y
His Æ Tyr
16
A3529G
H1112R
His Æ Arg
17
T3640C
M1149T
Met Æ Thr
18
G3810T
V1206L
Val Æ Leu
19
G3906A
V1238I
Val Æ Ile
19
G3930A
D1246N
Asp Æ Asn
19
T3936G
Y1248D
Tyr Æ Asp
19
A3937G
Y1248C
Tyr Æ Cys
19
T3997C
M1268T
Met Æ Thr
C3223T
T1010I
ThrÆ Ile
somatisch
konstitutionell
MET-Polymorphismus
15
Tabelle 1.6: Bekannte Mutationen und Polymorphismen des c-MET Proto-Onkogens (aus: Schmidt et al.
1997, Schmidt et al. 1999)
Einleitung
21
1.3.3 Zytogenetische Befunde bei papillären Nierenkarzinomen
Verschiedene Studien konnten bei papillären Nierenkarzinomen eine Polysomie der
Chromosomen 3q, 7, 8, 12, 16, 17 und 20 und bei Männern einen Verlust des Y-Chromosoms
nachweisen (Kovacs 1993). Eine Kombination von Trisomie 7 und 17 scheint dabei
besonders charakteristisch für papilläre RCC zu sein (Jiang et al. 1998, Corless et al. 1996)
und eine Progression des Tumors scheint mit einer Trisomie 20 einherzugehen (Palmedo et al.
1999). Insgesamt konnte bei dem Großteil der Patienten mit papillären Nierenkarzinomen und
MET-Mutationen zusätzlich eine Trisomie 7 beobachtet werden (Zhuang et al. 1998; Kovacs
et al.1993). Diese Polysomie scheint für einen Wachstumsvorteil für normale Zellen
verantwortlich zu sein (Ermis et al. 1995). Das MET- Allel auf Chromosom 7 wird dabei
vervielfacht und kann für eine Erhöhung der Zellproliferation verantwortlich sein (Ermis et al.
1995). Dijkhuizen (1997) wies in zwei Fällen von sporadischen papillären RCC eine Trisomie
des Chromosoms 17 nach und nahm somit eine Beteiligung eines weiteren Gens lokalisiert
auf Chromosom 17 in der Pathogenese dieser Tumore an.
Bei einer Untergruppe von sporadischen papillären Nierenkarzinomen wurde eine
chromosomale Translokation (X;1)(p11; q21) nachgewiesen (Meloni et al. 1993). Van
Kessel`s und Cooper`s Arbeitsgruppe zeigten, daß diese Translokation zu einer Fusion des
Transkriptionsfaktor TFE3-Gens bei p11.2 auf dem X-Chromosom mit einem neuen Gen
führt, genannt PRCC, auf Chromosom 1q21.2 . Weitere Untersuchungen des TFE3-Gen in
diesen Tumoren führten zu der Entdeckung, daß TFE3 mit PRCC verbunden ist und daß das
PRCC-TFE3
Fusionsprotein
offensichtlich
eine
N-terminale
Transkriptionsfaktor-
aktivierende Domäne darstellt, die mit der TFE3 DNA-bindenden Domäne verbunden ist
(Beckmann und Kadesch 1990; Sidhar et al. 1996). Ein Charakteristikum dieser Translokation
ist der Verlust des normalen TFE3-Transkripts und Übrigbleiben des hauptsächlich
aktivierenden Fusionsproteins. Diese Translokation wurde bei papillären RCC des Subtyp 1
gefunden, die mit einem unterschiedlichen klarzelligen Erscheinungsbild einhergehen.
MET, PRCC und TFE3 sind somit die bisher bekannten Gene, deren Mutationen für ein
papilläres Nierenkarzinom prädisponieren. PRCC- und TFE3-Mutationen scheinen eine Rolle
bei der Pathogenese der sporadischen papillären Nierenkarzinome zu spielen, METMutationen stehen im Zusammenhang mit sporadischen sowie hereditären papillären
Nierenkarzinomen.
Einleitung
22
1.4
Fragestellung
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekulargenetischen Diagnostik der
hereditären und sporadischen papillären Nierenkarzinome in Bezug auf das c-MET-ProtoOnkogen.
Eine Identifizierung von Patienten mit familiären Nierenkarzinomen ist besonders für den
Patienten und seine Angehörigen wichtig, da sich aus einer solchen Diagnose wichtige Folgen
hinsichtlich der Früherkennung für noch nicht erkrankte, aber mutationstragende Angehörige
ergeben. Auch der wissenschaftliche Aspekt ist bedeutsam, da bisher noch nicht viele
hereditäre papilläre Nierenkarzinome identifiziert wurden, auch aufgrund schwieriger
anamnestischer Evaluation.
Da das papilläre Nierenkarzinom erst seit einiger Zeit als eine eigene Entität angesehen wird
und das familiäre papilläre Nierenkarzinom sehr selten auftritt, gibt es noch nicht allzu viele
molekularpathologische Studien zum MET-Gen. Bisher wurden 15 unterschiedliche
Mutationen des MET-Gens vom Missense-Typ gefunden, alle in einer kleinen Region des
Gens lokalisiert, wobei jedoch noch nicht alle Exons des MET-Gens analysiert wurden.
Vergleiche
der
klinischen
Aspekte
mit
den
histologischen
Befunden
und
den
molekulargenetischen Ergebnissen könnte hilfreich für eine Prognosestellung sein und
weitere Hinweise auf eine molekulargenetische Pathogenese liefern.
Es ergaben sich folgende Fragen:
1.
In welchem Protzentsatz finden sich bei Patienten mit histologisch gesichertem
papillären Nierenkarzinom Mutationen im MET-Gen?
2.
Existieren weitere Mutationen in anderen Regionen des MET-Gens bei Patienten mit
papillären Nierenkarzinomen?
3.
Wie korrelieren das pathologische Erscheinungsbild des Tumors und die histologische
Klassifizierung miteinander, insbesondere in Bezug auf die familiären papillären
Nierenkarzinome, verglichen mit den bisherigen Studien?
23
2
MATERIAL UND METHODEN
2.1
Material
Material und Methoden
2.1.1 Patientengut
Es wurden die schon im Vorfeld gesammelten Blutproben des Registers der Jahre 1984 bis
1994 (Prof. Dr. H.P.H. Neumann 1984-1994) und die über die Hausärzte der Patienten
angeforderten Blutproben des erweiterten Registers verwendet. Die Proben wurden bei – 80°
C tiefgefroren gelagert. Nach Aufarbeitung der DNA wurde das Material bei 4° C im
Kühlschrank aufbewahrt. Zusätzlich wurden 10 DNA-Positivproben mit gesicherten
Mutationen der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt an den National Instituts of Health
(NIH) als Vergleichsproben genutzt. Insgesamt wurden somit DNA-Proben von 70 Patienten
molekulargenetisch untersucht. Aufgrund der histologischen und anamnestischen Befunde
wurden die Patienten in vier Gruppen unterteilt:
10
Patienten mit anamnestisch, histologisch und molekulargenetisch gesicherten
papillären – Nierenkarzinomen. Diese Patienten wurden schon im Vorfeld von einer
anderen Arbeitsgruppe analysiert und es wurden
Mutationen im MET-Gen
identifiziert (Schmidt et al. 1997, Schmidt et al. 1999). Diese Gruppe diente somit als
Positivprobe für die entsprechenden Exons. Es wurden hierbei bei 8 Patienten nur die
mutationstragenden Exons als positive Vergleichsprobe untersucht.
Diese Fälle
stammen aus dem Register der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt. Zwei
Patienten der zehn Fälle stammen aus dem eigenen Register der Jahre 1984 bis 1994
und waren zur Mutationsanalyse an die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt an den
NIH abgegeben worden. Bei diesen Patienten wurden nochmals die Exons 2 und 4 bis
21 analysiert. Bei vier dieser Fälle waren Mutationen in Exon 16 bekannt, darunter die
beiden Fälle des eigenen Registers, die die gleiche Mutation tragen. Eine weitere
Positivprobe des Exons 16 trägt ebenfalls die gleiche Mutation. Bei einem Fall liegt
eine Mutation im Exon 17 vor, bei einem weiteren Fall eine Mutation in Exon 18 und
bei vier weiteren Fällen eine Mutation in Exon 19, wobei zwei Patienten die gleiche
Mutation tragen.
2
Patienten mit einer bekannten somatischen Mutation, welche im Tumorgewebe dieser
Patienten von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt identifiziert wurde, ohne
eine positive familiäre Anamnese. Beide Patienten stammen aus dem eigenen Register
24
Material und Methoden
der Jahre 1984 bis 1994. Eine molekulargenetische Analyse der Blut-DNA war durch
diese Arbeitsgruppe nicht erfolgt, da nur Tumorgewebe zur Verfügung stand.
Entsprechende Blutproben wurden daher nachträglich über die Hausärzte der Patienten
angefordert. Einer der beiden Patienten
wurde im Loretto-Krankenhaus Freiburg
operiert, das histologische Gutachten wurde vom Pathologischen Institut der
Universität Freiburg erstellt.
9
Patienten mit histologisch rein papillären Nierenkarzinomen, ohne positive familiäre
Anamnese. Alle Patienten stammen aus dem eigenen Register. Die Operation wurde
immer in der Urologischen Abteilung der Universitätsklinik Freiburg durchgeführt, die
histologischen Gutachten wurden vom Pathologischen Institut der Universität Freiburg
erstellt.
49
Patienten mit histologisch größtenteils papillär strukturierten Nierenkarzinomen ohne
positive familiäre Anamnese. Alle Patienten aus dem eigenen Register. Die Operation
wurde immer in der Urologischen Abteilung der Universitätsklinik Freiburg
durchgeführt, die histologischen Gutachten wurden vom Pathologischen Institut der
Universität Freiburg erstellt.
Zusammenfassende Darstellung der verwendeten DNA-Proben
Proben- Bekannte Mutation
anzahl
10
A3529G
2
Exon Register
16
Eigenes Register
Untersuchte
Arbeit
2, 4-21
A3529G
16
Eigenes Register
2, 4-21
G3522A
16
NIH
16
A3529G
16
NIH
16
T3640C
17
NIH
17
G3810T
18
NIH
18
G3930C
19
NIH
19
G3930A
19
NIH
19
G3930A
19
NIH
19
T3936C
19
NIH
19
G3522A (somatisch)
16
Eigenes Register
2, 4-21
T3936G (somatisch)
19
Eigenes Register
2, 4-21
50
-
-
Eigenes Register
2, 4-21
8
-
-
Eigenes Register
16, 17, 18, 19
Exons
in
dieser
25
Material und Methoden
Für die molekulargenetischen Untersuchungen wurden die im Folgenden aufgeführten Geräte
und Reagenzien benutzt, welche für diese Arbeit im Labor N5 der Abteilung IV der
Medizinischen Universitätsklinik zur Verfügung standen.
2.1.2 Geräte
Agarose – Elektrophoresekammer
E 92, Biometra, Göttingen
Geltrockner
SE 1160, Hoefer Scientific Instruments
Gene Phor – Gelkammer
Pharmacia Biotech
Heizblock
DB 3A, Techne, Cambridge, UK
Membran – Vakuumpumpe
MZ2C/ 2,4m3/ h, Vacuubrand, Wertheim
PCR – Maschine
60/ 2, Biomed, Theres
PCR – Maschine
Touchdown, Hybaid
Polaroid – Kamera
PHC 34, Hoefer
Polyacrylamidgel – Elektrophoresekammer
SE 1600, Hoefer
Spannungsgeräte
Power – All 3000V/ 200mA, Serva,
Heidelberg
UV – Lampe
UVTM – 25, Hoefer
Zentrifugen
Biofuge 13, Heraeus
Rotixa/ RP 4200 Hettich, Tuttlingen
26
Material und Methoden
2.1.3 Enzyme
Proteinase K
Boehringer Mannheim
Taq – DNA – Polymerase
Gibco
2.1.4 Nukleotide und Nukleinsäuren
dATP, dGTP, TTP, dCTP
Sigma, Deisenhofen
Längenmarker: DNA Längenstandard V
Boehringer Mannheim
Primer – Oligonukleotide
MWG, Biotech, München
2.1.5 Chemikalien
Acrylamid ( 2x kristall. )
Serva, Heidelberg
Acrylease
Stratagene
Agarose ( SeaKem LE )
Biozym Diagnostik, Hameln
Ammoniumpersulfat
Sigma
Borsäure
Merck
Bromphenolblau
Merck, Darmstadt
Chloroform
J.T. Baker
EDTA ( Ethylendiamintetraacetat )
Sigma
27
Material und Methoden
Essigsäure
Roth
Ethanol
J.T. Baker
Ethidiumbromid
Sigma Ficoll ( Typ 400 )
Glycerol
Sigma
Harnstoff
Roth
Igepal
Sigma
Magnesiumchlorid
Sigma
MDE – Gel Solution
FMC Bioproducts Europe
Natriumcarbonat ( wasserfrei, reinst )
Merck
Paraffin ( dickflüssig )
Merck
Phenol ( kristall., reinst )
Merck
SDS ( Dodecylsulfat )
Merck
Salpetersäure
Merck
TEMED ( N, N, N`, N`,- Tetramethylmethylendiamin )
Sigma
Tris ( hydroxymethyl ) aminomethan
Sigma
Xylencyanol
Merck
28
Material und Methoden
2.1.6 Lösungen
2x Acrylamidgel – Ladepuffer
49ml Formamid
12,5mg Bromphenolblau
12,5mg Xylencyanol
1,0ml 0,5 M EDTA
2% Agarosegel
7g Agarose
1,0 x TBE ad 350ml, kurz aufkochen
6 x Agarosegel – Ladepuffer
12,5mg Bromphenolblau
12,5mg Xylencyanol
7,5g Ficoll (Typ 400)
ad 50ml ddH2O
20 % Ammoniumpersulfat
0,2g APS
1,0ml ddH2O
Mutation Detection Enhancement
62,4ml H2O
( MDE ) Gel – Lösung für SSCP
22,5ml MDE
5,6ml 10 x TBE
60 μl TEMED
600 μl APS
10 x dNTP – Lösung
2mM je dNTP in ddH2O
10 x PCR – Puffer
100mM Tris – HCl (pH 8,3)
500mM KCl
10 – 25mM MgCl2
0,1% Gelatine
Reduktionslösung für Silberfärbung
60g Na2CO3
1,0ml Formaldehyd (37%)
ad 2l ddH2O
29
2x Saccharose – Lösung
Material und Methoden
218g Saccharose
2,4g Tris
2,03g MgCl2
20ml Triton X – 100
ddH2O ad 1l, mit HCl auf pH 7,6
Salz – EDTA
2,19g NaCl
4,46g EDTA
mit 1M NaOH auf pH 8 einstellen,
ad 500ml ddH2O
Silbernitrat – Lösung 12mM
2g ad 1l ddH2O
1 x TBE
86,4g Tris
44g Borsäure
32ml 0,5mM EDTA (pH 8,0)
ad 8l ddH2O
0,6 x TBE
51,8g Tris
26,4g Borsäure
19,2ml EDTA
ad 8l ddH2O
TE – Puffer pH 8,0
1,0ml 0,5 M Tris –HCL (pH 8,0)
1,0ml 50mM EDTA (pH 8,0)
48ml ddH2O
10 x Warner – Lösung
81,1g NaCl
3,7g KCl
0,3g MgCl2
ddH2O ad 1l
30
2.2
Material und Methoden
Methoden
2.2.1 Register
Ziel war es, alle Patienten mit papillären Nierenkarzinomen der Universitätsklinik Freiburg
von 1994 bis einschließlich 1998 zu erfassen und dem Register der Jahre 1984 bis 1994
anzufügen. Zudem sollten verschiedene Ergebnisse der diagnostischen Untersuchungen und
die genauen histologischen Befunde dokumentiert werden. Anschließend sollten die bisher
gesammelten Blutproben der Patienten bis 1998 ergänzt werden. Dies geschah in mehreren
Schritten :
1. Da kein Register für Patienten mit papillären Nierenkarzinomen für diesen Zeitraum
existierte, wurden zunächst alle Patienten, die sich einer Operation aufgrund der Diagnose
Nierenkarzinom unterzogen hatten, registriert. Dazu wurden alle Operationsberichte der
Jahre 1994 bis 1998 der Urologischen Universitätsklinik durchgesehen.
2. Nachdem alle Patienten erfasst waren, wurden im Archiv der Urologischen Klinik alle
Krankenakten dieser Patienten herausgesucht und nach dem histologischen Befund
geordnet. Es wurde ein Register der Patienten mit papillären, sowie mit klarzelligen,
onkozytären, überwiegend sarkomatoiden und chromophoben Nierenkarzinomen sowie
Angiomyolipomen, erstellt. Aus den histologischen Gutachten und Untersuchungsbögen
der Patienten mit papillären Nierenkarzinomen wurden verschiedene Befunde entnommen
und in einer gesonderten Liste zusammengestellt.
3. Da der überwiegende Teil der Akten keine sicheren Aussagen zur Familienanamnese und
zum Verlauf zuließen, wurden die jeweils zuständigen Hausärzte ermittelt und
angeschrieben.
Eine
erstellte
Einverständniserklärung
für
die
Patienten,
ein
Informationsschreiben zu der geplanten Untersuchung und ein Fragebogen mit den
wichtigsten Punkten zur Familienanamnese, Verlauf und Begleiterkrankungen wurden
beigefügt. In einem zweiten Schreiben wurden die Hausärzte um die Zusendung von
Patienten – EDTA - Blut gebeten. Die aus den Antworten erhaltenen Informationen
wurden erfasst und auf einer entsprechenden Liste ergänzt.
Zu den schon vorhandenen Blutproben kamen somit noch 28 Proben von neu erfassten
Patienten für eine molekulargenetische Untersuchung hinzu, zusätzlich 8 angeforderte
Positivproben aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt an den NIH,
Bethesda/Frederick, Maryland.
31
Material und Methoden
2.2.2 DNA – Extraktion aus Vollblut ( EDTA )
Gewinnung
von
DNA
aus
peripheren
Blutleukozyten
durch
eine
Phenol-
Chloroformextraktion nach Sambrook (1989).
1. Es wird ein 50 ml – Falcon mit 20 ml einer 2x Saccharose- Lösung, 10 ml einer 1 x
Warner`s – Lösung und 0,5 ml Igepal gefüllt. Das Patienten EDTA – Vollblut wird gut
durchmischt und anschließend 10 ml davon in die Mischung dazugegeben. Der Falcon
wird gut gemischt und dann bei Raumtemperatur ca. 15 – 20 min rotiert, so daß die
Plasmamembran durch Igepal aufgelöst wird und eine Lyse sichtbar wird.
2. Das Gemisch wird nun bei 4° C 20 min mit 3500 rpm zentrifugiert. Danach wird der
Überstand vorsichtig dekantiert, so dass das Pellet im Falcon zurückbleibt.
3. Das Pellet wird einmal mit 15 ml einer 1 x Warner`s – Lösung gewaschen und dann 10
min mit 3500 rpm zentrifugiert. Die überstehende Waschlösung wird dekantiert.
4. Es wird ein 3,5 ml Mix, bestehend aus 2,7 ml TNE, 0,2 ml Proteinase K, 0,6 ml SDS
(10% Stock) und 2,5 ml Natrium – EDTA zu dem im Falcon verbliebenem Pellet
hinzugegeben. Das Pellet sollte vom Boden gelöst werden und evtl. mit Hilfe einer
Pasteurpipette zerkleinert werden. Um einen optimalen Verdau der Zellkernmembran und
ihrer Proteine durch SDS und der Proteinase K zu erreichen, wird das Röhrchen über
Nacht in einem Wasserbad bei 55° C inkubiert.
5. Ist ein ausreichender Verdau erfolgt, so ist eine Lyse deutlich sichtbar. Dem Lysat werden
6 ml Phenol zugegeben und das Gemisch wird 10 – 15 min langsam rotiert. Durch diesen
Vorgang werden Proteine in die organische Phenolphase extrahiert, welche sich im
unteren Teil des Röhrchens bildet. Die DNA verbleibt dabei in der oberen, wässrigen
Phase und kann nach anschließendem 10- minütigem Zentrifugieren mit 2500rpm bei ca.
20° C als Überstand abgenommen werden. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen
pipettiert und diese Prozedur wird nochmals mit Phenol wiederholt und danach zweimal
mit reinem Chloroform.
6. Nach der letzten Chloroform – Extraktion wird der nun gereinigte, wässrige Überstand in
50 ml Falcons pipettiert.
7. Zum Ausfällen der DNA werden 1/10 Vol. Natriumacetat und ca. 2 Vol. Ethanol
zugefügt.
8. Nun kann die DNA mit einer ausgezogenen Pasteur – Pipette herausgeangelt und in ein
Eppendorfcup mit 0,2 – 1,5 ml TE – Puffer, je nach Menge der DNA, überführt werden,
worin sie bei 4° C gelagert wird.
32
Material und Methoden
2.2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1985)
Die PCR ist ein gängiges Verfahren der Gentechnologie, bei dem selektiv bestimmte DNA –
Abschnitte vervielfältigt werden. Nach mehrmaliger Wiederholung des Verfahrens können
selbst kleinste DNA – Mengen sichtbar gemacht werden, oder für weitere Diagnostik
verwendet werden. So kommt es z.B. bei 30 Zyklen zu einer exponentiellen Zunahme der
DNA auf das 2
30
– fache der ursprünglichen Menge. Um die DNA oder beziehungsweise
gewünschte Exons mittels PCR zu amplifizieren, benötigt man ein entsprechendes
Reaktionsgemisch, wofür hier ein 0,2 ml Eppendorf – Röhrchen benutzt wird mit einem
Ansatzvolumen von 10,1 μl, welches sich wie folgend zusammensetzt :
•
5 μl ddH2O
•
1 μl DNA – Verdünnung (die DNA wurde hierfür in einem TE – Puffer 1 : 10 verdünnt)
•
1 μl 10 x PCR – Puffer (verschiedene Konzentrationen, entsprechend den optimalen
Bedingungen jedes einzelnen Primerpaares, welche experimentell
bestimmt wurden und 1,0 mM und 1,5 mM MgCl2 betrugen)
•
1 μl 10 x dNTP – Gemisch
•
1,0 μl forward Primer
•
1,0 μl reverse Primer
•
0,1 μl Taq – Polymerase (thermostabil)
Um eine Polymerasekettenreaktion zu erreichen, muss das Reaktionsgemisch in der PCR –
Maschine immer wieder erhitzt und abgekühlt werden, was hier innerhalb 30 Zyklen geschah,
die jeweils aus drei Teilschritten bestehen :
1. Zuerst wird das Gemisch 30 sec. auf 95° C erhitzt, um eine Auftrennung des DNA –
Doppelstranges in zwei Einzelstränge zu erreichen (Denaturierung). Für eine verlängerte
Denaturierung wird vor dem ersten Zyklus 5 min auf 95° C erhitzt.
2. Dann wird die Temperatur für 40 sec. auf z.B. 62° C heruntergesetzt. Dies ist die
Annealing – Temperatur der beiden Primer – Oligonukleotide, die für die Hybridisierung
der Primer an ihren komplementären DNA – Abschnitt nötig ist. Bei der Hybridisierung
setzen die Primer an ihrem komplementären DNA – Abschnitt an Strang und Gegenstrang
an und markieren so die zu amplifizierende DNA – Sequenz. Zudem wird so gleichzeitig
wieder ein Stück Doppelstrang an der Ansatzstelle der Primer gebildet, welches als
33
Material und Methoden
Ausgangspunkt für die Polymerase nötig ist. Jeder Primer hat eine eigene optimale
Annealing – Temperatur und es wurden jeweils die experimentell ermittelten
Temperaturen verwendet, die sich zwischen 58° C und 62° C bewegen.
3. Im dritten Schritt wird die Temperatur für 30 sec auf 72° C erhöht, um den höchsten
Aktivitätsbereich der Taq – Polymerase zu erreichen. Die Polymerase synthetisiert, von
den Primern ausgehend, in beide Richtungen neue DNA – Stränge, unter Verwendung der
Desoxynucleosid – triphosphate (dNTP`s). Im letzten Zyklus wird eine verlängerte
Polymerase – Synthese Phase eingesetzt, durch Erhöhung der Zeit auf 10 min.
In der vorliegenden Arbeit wurden 19 der 21 Exons des MET-Gens untersucht. Für Exon 3
konnten bisher keine entsprechenden Primer hergestellt werden und Exon 1 ist nicht
kodierend und somit nicht relevant. Diese beiden Exons wurden daher nicht untersucht.
Aufgrund der Größe von Exon 2 ist es in sieben Fragmente aufgeteilt, für die jeweils
entsprechende Primer existieren. Exon 9, Exon 13, Exon 14, Exon 15 und Exon 21 sind
gleichfalls jeweils in zwei Fragmente unterteilt, da ihre Produkte ebenfalls sehr groß sind.
Die optimalen PCR-Bedingungen der einzelnen Primer, ihre genauen Sequenzen und die
Größe des Produktes sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.
F: forward primer
bp: Basenpaare
R: reverse primer – jeweils in 5`Æ 3`Richtung
mM: Millimolar
Exon
Primersequenz
2–1
F: GTC CAG TTG GGA AGC TTT ATT TC
R: CAT AAA TGT AGT TAG TGG CAC CAA G
F: TTC ACC GCG GAA ACA CCC ATC
R: AGT AGG TGT CGA CAA CTA GAG CC
F: GCC AAT TTA TCA GGA GGT GTT TGG
R: CAC AGT CAG GAC ACT GGC TG
F: CTC CCC ACA GAT AGA AGA GCC
R: GGG TAA GAA TCT CTG AAC TCA GG
F: CCA GTC CTA CAT TGA TGT TTT ACC
R: GCT GAC ATA CGC AGC CTG AAG TAT
F: ACA TGG AAA TGC CTC TGG AGT G
R: TTT GAT AGG GAA TGC ACA CAT GGC
F: CCG AAC CAA TGG ATC GAT CTG C
R: TAT ACC TCA CAG TTT ATA AGT GGG
F: AAA CTG AGC TTG TTG GAA TAA GG
R: GTG ACA CTG GTT GTA AAT ATG CA
MgCl2Konz.
2–2
2–3
2–4
2–5
2–6
2–7
4
Annealing-
Größe des
Temperatur
PCR-Produkts
1,0 mM
62
°C
335
bp
1,5 mM
60
°C
241
bp
1,5 mM
60
°C
214
bp
1,5 mM
60
°C
252
bp
1,0 mM
62 °C
277
bp
1,0 mM
62
°C
233
bp
1,0 mM
62
°C
181
bp
1,0 mM
62
°C
254
bp
34
Exon
Primersequenz
5
F: CAA ACT AGA TAC CCC TCC TGG
R: ACA AAA ACA TGT ATG CCA GCT GT
F: TTT GTT CGT TTT CCA TAA ATG TGA
R: AAG CAC ACC CCA GCA AAG CAT
F: TCC CTT GGA TTT GTC ATG TAT TAA
R: CAA AAC AAA GTA ACT TGT TCA TCT
F: GAA GAT TCT ATC CTA TCA TGT TTG
R: TTT TTC TTC TCC ACA CAC ACA CAC
F: AAG GTA AGT TTG AGA TCC AGT CTG
R: CGG TAA CTG AAG ATG CTT GTC TC
F: ATT GAC TTA GCC AAC CGA GAG AC
R: CCT CTT GAC TAT TCT ACA GC
F: CTC TGA CCT GTA ATC AGT GCA
R: GTT AGA GGC AAA GAT GCA GAG
F: GGA TGT TGC CAA GCT GTA TTC
R: GGC CAA GTA CAA TTG TAT TC
F: TGT AAG CAT TCC TGC AGA ACT G
R: ACT GGC TTC CTT ATT TAC ATC AT
F: ATC TAT CAT GGG TAA ATG CTG AC
R: TCC TGT GAA ATT CTG ATC TGG TTG
F: AGC AAT TTC TTC AAC CGT CCT TGG
R: TGA CTG TGT TCT TAA GGT AAC TTC
F: GGG CCC ATG ATA GCC GTC TTT AA
R: GTT GGG CTT ACA CTT CGG GCA C
F: ACT CCT CAT TTG GAT AGG CTT G
R: TAC ACA ACA ATG TCA CAA CCC A
F: CCA TTA AAT GAG GTT TTA CTG TTG T
R: AGG TCA ATG TGG ACA GTA TTT TGC
F: CAT CCT AAC TAG TGG GGA CTC TG
R: CAA AGG CCA AAG ATA AAA TGC TTA
F: ATT AAA TGT TAC GCA GTG CTA AC
R: GGT TGC AAA CCA CAA AAG TAT
F: GTA TTC ACT GTT CCA TAA TGA AGT
R: GAT GGC TGG CTT ACA GCT AGT T
F: AAC AGT AGA TGC TTA GTT TAT GCT
R: AAC AGA TTC CTC CTT GTC ACT T
F: TTC TAT TTC AGC CAC GGG TAA T
R: ATG AAA GTA AAA GAG GAG AAA CTC
F: TAT GTA TGG TCA CAT CTC TCA C
R: CCT TTG AAG GCA GGC ATT TCT GT
F: ACA GAA ATG CCT GCC TTC AAA GG
R: CGG AGC GAC ACA TTT TAC GTT CAC
F: CAC CCT AAA GCC GAA ATG CG
R: CAA GGA GCA AAG AAT ATC GAT GGC
Material und Methoden
MgCl2Konz.
6
7
8
9–1
9–2
10
11
12
13 – 1
13 – 2
14 – 1
14 – 2
15 – 1
15 – 2
16
17
18
19
20
21 – 1
21 – 2
Annealing-
Größe des
Temperatur
PCR-Produkts
1,0 mM
57
°C
259
bp
1,0 mM
60
°C
268
bp
1,5 mM
55
°C
225
bp
1,5 mM
62
°C
273
bp
1,5 mM
60
°C
286
bp
1,5 mM
60
°C
163
bp
1,0 mM
62
°C
259
bp
1,0 mM
62
°C
360
bp
1,5 mM
57
°C
252
bp
1,5 mM
60
°C
115
bp
1,0 mM
62
°C
200
bp
1,5 mM
50
°C
139
bp
1,5 mM
55
°C
170
bp
1,5 mM
55
°Co
189
bp
1,5 mM
55
°C
229
bp
1,5 mM
50
°C
176
bp
1,5 mM
50
°C
286
bp
1,5 mM
55
°C
214
bp
1,5 mM
57
°C
252
bp
1,5 mM
50
°C
250
bp
1,5 mM
57
°C
213
bp
1,5 mM
57
°C
307
bp
Tabelle 2.1: Benutzte Primer zur Amplifikation des MET-Gens (Referenz : Duh et al., 1997)
35
Material und Methoden
2.2.4 Agarosegel – Elektrophorese
Anhand der Agarosegel – Elektrophorese kann der Erfolg einer PCR überprüft werden. Es
werden jeweils 4 μl der verschiedenen Amplifikationsprodukte mit je 3 μl eines 6 x
Agarosegel – Ladepuffers vermischt. Jedes einzelne Gemisch wird dann in eine Geltasche auf
ein 2%- iges Agarosegel aufgetragen, welches in einer Gelkammer liegt und mit 1 x TBE –
Puffer bedeckt wird. Gleichzeitig wird am Rand ein Längenmarker (Boehringer Mannheim,
Längenstandard V) gleicher Konzentration aufgetragen. Bei 250 Volt und einer Laufzeit von
ca. 4 min werden die DNA – Fragmente aufgetrennt. Anschließend wird das Gel auf eine UV
– Lampe bei 366 nm gelegt und durch das im Gel vorhandene Ethidiumbromid können die
aufgetrennten Fragmente sichtbar gemacht werden. Ethidiumbromid ist ein fluoreszierender
Stoff, der mit der DNA interkaliert und unter UV – Licht leuchtet. Die DNA – Fragmente
können nun durch Vergleich mit dem Längenstandard beurteilt werden. Zur Dokumentation
werden die Gele mit einer Polaroid – Kamera fotografiert. Bild 2.1
Bild 2.1: Agarosegelelektrophorese des Exons 12 mit Proben, Längenmarker links im Bild
Für die Herstellung des 2%- igen Agarosegels werden 350 ml 1 x TBE mit 7 g Agarose und
15 μl Ethidiumbromid vermischt und in der Mikrowelle bei 500 Watt erhitzt, bis sich die
Agarose vollständig gelöst hat. Nach kurzer Abkühlung wird die Mischung zum Erhärten in
eine Gießvorrichtung gegossen und mit einem Taschenkamm versehen. Ca. 1 Stunde später
kann das Gel verwendet werden.
36
Material und Methoden
Wie sich bei dieser Erfolgskontrolle zeigte, traten bei einigen Primerpaaren nur unspezifische
Bindungen auf, welche durch das Auftreten von mehreren Banden (Produkten) in
verschiedenen Größenbereichen (Vergleich mit Längenmarker) sichtbar wurden. Um ein
zufrieden stellendes Ergebnis zu erreichen, wurden für jedes Primerpaar die optimalen
Bedingungen bezüglich Pufferkonzentration und Annealing – Temperatur experimentell
bestimmt. Ein gutes Bindungsverhalten wird durch eine scharfe Bande im Agarosegel
angezeigt, die sich in Höhe der berechneten Größe der Reaktionsprodukte befindet.
2.2.5 SSCP – Analyse (Ainsworth et al., 1991)
Die SSCP – Methode ermöglicht es, kleinste Abweichungen in der Primärsequenz von DNAEinzelsträngen (aus der PCR hervorgegangen) zu erkennen. Dabei wird sich ein ganz
spezielles Faltungsverhalten von DNA – Einzelsträngen zu nutze gemacht. Unter nicht –
denaturierenden Bedingungen faltet sich ein DNA – Einzelstrang aufgrund intramolekularer
Wechselwirkungen zu einer ganz bestimmten Konformation. Ist seine Primärsequenz jedoch
verändert, z.B. durch eine Punktmutation, faltet sich der Einzelstrang anders. Im Gegensatz zu
den nicht veränderten Wildtyp - Einzelsträngen zeigt diese neue Konformation ein anderes
Laufverhalten in der Gelelektrophorese, da es unterschiedlich schnell durch das Gel wandert.
Im Gel zeigt sich somit bei mutierten Einzelsträngen ein verändertes Bandenmuster, es
können eine oder mehrere zusätzliche Banden auftreten (SSCP – shift).
Für die Elektrophorese wurden Acrylamidgele verwendet. Zum Teil wurden die Gele
zusätzlich mit Glycerol versetzt. Glycerol verändert die Gelmatrix und somit auch die
Laufeigenschaften. Es wirkt stabilisierend auf Sekundärstrukturen, die eine höhere
Variabilität haben.
2.2.6 Acrylamidgel – Elektrophorese
Für die Elektrophorese benötigt man Flachbettgele (370 x 290 x 0,25 mm), die vertikal in die
Gelkammern eingespannt werden. Zur Herstellung eines Gels bedarf es zweier Glasplatten,
von denen beide vorher 1 x mit 70%-igen und 1 x mit 100%- igen Alkohol gereinigt werden.
Eine Glasplatte wird zusätzlich noch mit Acrylease abgerieben, um eine spätere Abhebung
der Platte vom Gel zu erleichtern. Beide Glasplatten werden, getrennt durch zwei schmale
37
Material und Methoden
Abstandshalter (0,25 mm dick), übereinander gelegt und an den langen Seiten und einer
kurzen mit Klebeband gründlich abgedichtet. Die vorbereitete Gelmischung wird
luftblasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen und anschließend ein Taschenkamm
eingesetzt. Für die Gelmischung werden verwendet:
•
22,5 ml einer MDE – Gellösung (Mutation Detection Enhancement)
•
62,4 ml ddH2O
•
5,6 ml 10 x TBE
•
60 μl TEMED (Tetramethylendiamid)
•
600 μl APS (Ammoniumpersulfat, 20%- ig)
Für mit Glycerol versetzte Gele wurde die Menge an ddH2O auf 44,4 ml reduziert und
zusätzlich 18 ml 50%- iges Glycerol zugegeben.
Nach ca. einer halben Stunde ist ein Gel dieser Zusammensetzung auspolymerisiert, wobei
diese Zeitspanne von der Konzentration des APS in der Lösung abhängt. Zur Elektrophorese
werden die Gele in die vertikalen Gelkammern eingespannt und der Kamm mit einem Scalpell
herausgezogen. Es wird ein 0,6 x TBE Laufpuffer verwendet. Um Verschmutzungen der Gele
möglichst gering zu halten, wird ein ca. halbstündiger Vorlauf mit 400 Volt durchgeführt. Vor
dem Auftragen der DNA – Proben werden die Geltaschen mit Laufpuffer mittels einer
Mikropipette gespült. Die 10 μl PCR – Produkte werden jeweils mit 15 μl SSCP – Ladepuffer
vermischt und 5 min bei 96° C denaturiert. Anschließend muss das Gemisch sofort in einem
Eisbad abgekühlt werden, um eine Bildung von Doppelsträngen zu verhindern. Für die
Beladung des Gels werden pro Tasche 8 μl des Gemisches verwendet.
Bei einer Spannung von 250 Volt beträgt der Gellauf unter nicht denaturierenden
Bedingungen ca. 16 Stunden.
38
Material und Methoden
2.2.7 Silberfärbung der Acrylamidgele (Budowle et al., 1991)
Die Silberfärbung dient der Anfärbung der PCR – Produkte. Nach abgelaufener
Elektrophorese werden die Glasplatten der Gelkammer entnommen und waagrecht auf die
Platte der Färbevorrichtung (Bender et al., 1994) gelegt. Dabei wird die mit Acrealyse
behandelte Glasplatte nach oben gelegt, so daß diese gelöst werden kann und das Gel auf der
unteren Platte verbleibt. Anschließend wird der Färberahmen in die Vorrichtung eingespannt,
so daß das Gel auf allen Seiten abgedichtet wird. Im ersten Schritt wird das Gel mit 1% - iger
Salpetersäure behandelt, welche nach 3 min aus der Färbevorrichtung abgegossen wird.
Danach wird das Gel 3 x mit Aqua destillatum gewaschen und eine 12 mMolare
Silbernitratlösung wird zugegeben. Das Gel wird lichtgeschützt bedeckt und verbleibt so für
20 min. Nach Abgießen der Silbernitratlösung wieder 3- maliges Waschen mit Aqua dest.
Dann wird eine Reduktionslösung zugegeben, bestehend aus Natriumcarbonat und
Formaldehyd. Diese Lösung bewirkt eine Reduktion der Silberionen welche sich an die DNA
gebunden haben und es tritt eine sichtbare Färbung ein. Die PCR- Produkte stellen sich so als
dunkle Banden dar. Die Reduktionslösung wird danach sofort abgegossen und es erfolgt eine
Spülung mit Aqua dest, welches 5 min auf dem Gel belassen wird. Zum Abbrechen und
Fixieren der Färbereaktion wird das Gel kurz mit 10%- iger Essigsäure bedeckt und
anschließend mit Hilfe eines auf das Gel aufgelegten Filterpapiers (Schleicher und Schuell)
von der Glasplatte abgezogen. Das Gel mit Filterpapier wird für 1,5 Stunden auf einem
Vakuum – Geltrockner bei 80° C getrocknet.
2.2.8 Sequenzierung
Diejenigen Proben, die in der SSCP- Analyse aberrierende Banden zeigten, sowie die
Positivproben, wurden zur DNA- Sequenzierung in ein darauf spezialisiertes Labor geschickt
(Labor für DNA-Analytik, PD Dr. Juliane Alt-Mörbe, Freiburg). Hierfür wurden die
auffälligen Banden aus den entsprechenden SSCP- Gelen ausgeschnitten und über 12 Stunden
in TE- Puffer gelagert. Die DNA diffundiert dabei in den Puffer und kann anschließend
mittels PCR und entsprechenden Primern wie unter 2.2.4 beschrieben reamplifiziert werden.
Nach anschließender Erfolgskontrolle mittels Agarosegel- Elektrophorese wurden die Proben
verschickt. Alternativ kann das PCR-Produkt auch direkt zur Sequenzierung gegeben werden.
Die Sequenzierung erfolgte in einem halbautomatischen Sequenzierer mit Fluoreszenz-
39
Material und Methoden
markierten Primern nach der Dideoxymethode. Außer den Ergebnissen stellt das Labor auch
die entsprechenden Sequenz-Diagramme zur Verfügung.
2.2.9 Kontrolle anhand Normalproben
Grundsätzlich wird im Labor von Prof. Dr. Neumann jede festgestellte Sequenz-Variante
unklarer Bedeutung durch 100 Normalkontrollen (DNA gewonnen von gesunden
Blutspendern, nach Einverständnis) hinsichtlich des Vorliegens einer möglicherweise
pathogenen Mutation bzw. eines Polymorphismus überprüft. Dies ist auch für diese Arbeit
mittels SSCP-Analyse und nachfolgender Sequenzierung nach o.g. Methoden erfolgt.
40
3
ERGEBNISSE
3.1
Register
Ergebnisse
Es wurden alle Patienten einbezogen, die in dem Zeitraum von 1994 bis 1998 wegen einem
Nierenkarzinom in der Urologischen Abteilung der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg
operiert wurden. Zusätzlich wurde ein Fall mit bekanntem papillären Nierenkarzinom aus
dem Loretto-Krankenhaus Freiburg dem Register hinzugefügt. Insgesamt wurden 234 Fälle
erfasst. Für den Zeitraum von 1984 bis 1994 konnte auf eine vorhandene Registerauswertung
zurückgegriffen werden (Neumann et al. 1998). Als nächster Schritt erfolgte eine Einteilung
nach dem histologischen Befund. Von den 234 Fällen fanden sich 46 Patienten mit papillären
Nierenkarzinomen, 128 Patienten mit einem Nierenkarzinom vom klarzelligen Typ, 7
Patienten mit einem Karzinom vom chromophoben Typ und 6 Patienten mit einem
vorwiegend sarkomatoiden Typus. Des Weiteren fanden sich 8 Fälle mit einem Onkozytom, 8
Patienten mit einem Angiomyolipom und weitere 31 Fälle mit nicht exakt klassifizierbaren
Nierenkarzinomen.
Tabelle 3.1 zeigt eine prozentuale Verteilung der Einteilung.
Histologie
Häufigkeit
klarzellig
128 (55%)
papillär
46 (20%)
chromophob
7 (3%)
sarkomatoid
6 (3%)
Onkozytom
8 (3%)
Angiomyolipom
8 (3%)
nicht klassifizierbar
31 (13%)
Tabelle 3.1: Histologischer Befund bei 234 Patienten mit Nierenzellkarzinomen (Abteilung Urologie der
Universitätsklinik Freiburg 1994-1998)
Durch Hinzufügen der 46 neu erfassten Fälle von Patienten mit papillären Nierenkarzinomen
zu den schon vorhandenen Fällen der Jahre 1984 bis 1993, ergab sich eine Anzahl von 103
Patienten mit papillären Nierenkarzinomen in den Jahren 1984 bis 1998, die in der
41
Ergebnisse
Universitätsklinik Freiburg in diesem Zeitraum operiert worden sind, einschließlich des
auswärtigen Falles aus dem Loretto-Krankenhaus Freiburg.
Alle Tumore wurden histopathologisch als papilläre oder überwiegend papilläre
Nierenkarzinome klassifiziert.
Anhand des histologischen Befundes, der Patientenakte und eines speziell erstellten
Fragebogens an die Hausärzte der Patienten, wurden von allen Patienten mit papillären
Nierenkarzinomen die klinischen Daten erfasst. Es konnten jedoch nicht sämtliche Daten
erhoben werden, da manche Befunde nicht zugänglich waren, keine Rückantwort durch die
Hausärzte erfolgte oder manche Patienten verstorben waren. Somit waren die erhobenen
Daten in vielen Fällen inkomplett. In einem gesonderten Schreiben an die Hausärzte wurde
jeweils eine EDTA- Blutprobe der entsprechenden Patienten angefordert.
Die histo-pathologische Einteilung nach Delahunt und Eble wurde nicht überprüft, da eine
solche Klassifikation in den histologischen Befunden nicht vorgenommen wurde.
Tabelle 3.2 zeigt, welche Angaben in welcher Häufigkeit von den 103 Patienten evaluiert
werden konnten.
Patientendaten
Häufigkeit
n= 103
Geburtsdatum
(103) 100%
Anschrift
(100) 97%
Hausarzt
(94) 91%
Alter bei erster OP
(101) 98%
verstorben laut Hausarzt
(19) 18%
Antwort vom Hausarzt
(64) 62%
Blutprobe erhalten vom Hausarzt
(28) 27%
Tabelle 3.2: Angaben von 103 Patienten
Das Alter der Patienten bei der ersten Operation lag zwischen 23 und 88 Jahren mit einem
Mittelwert von 61,4 Jahren. Die Geschlechtsverteilung war 77/ 26 (männlich/ weiblich).
42
Ergebnisse
Bezüglich des Tumors konnten folgende Daten erhoben werden, zusammengestellt in
Tabelle 3.3
Tumor
Häufigkeit
n= 103
unilateral
97 (94%)
bilateral
5 (5%)
multifokal
7 (7%)
sporadisch
80 (78%)
familiär
1 (1%)
unklar
22 (21%)
TNM
99 (96%)
OP-Art: N / E
99/4 (96%/4%)
Tabelle 3.3: Daten zu 103 Tumoren
N : Nephrektomie
E : Enukleation
Die Größe der Tumoren variierte zwischen 2,1 und 18 cm. Nach der TNM-Klassifikation
variierte das Tumorstadium zwischen T1 und T4. Eine Übersicht der Häufigkeit der einzelnen
Tumorstadien nach der TNM-Klassifikation bei 99 Patienten gibt Tabelle 3.4
Häufigkeit (n=99)
Tumorstadium
(7)
(39)
(32)
(18)
(0)
(3)
6%
36%
29%
7%
0%
3%
Lymphknotenbefall
(11)
11%
Fernmetastasen
(20)
20%
T1
T2
T3a
T3b
T3c
T4
Tabelle 3.4: Häufigkeit der einzelnen Tumorstadien nach TNM bei OP-Datum bei 99 Patienten (TNMReferenz nach der TNM- Classification of malignant tumors, 1997, erläutert in Kapitel 1.2.5, Tab. 1.5)
43
Ergebnisse
Von den 19 erfassten verstorbenen Patienten, erlagen 12 den nachfolgenden Komplikationen
der Krankheit, 7 verstarben an anderer Ursache. Bei den an den Folgen des Nierenkarzinoms
gestorbenen Patienten fanden sich ausschließlich die Tumorstadien T3a und T3b nach der
TNM-Klassifikation bei OP-Datum.
3.2
Ergebnisse der SSCP- Analyse der Positivproben
Die SSCP – Analyse wurde bei allen unter 2.1.1 beschriebenen Positivproben (Schmidt et al.
1997, Schmidt et al. 1999) als Screeningverfahren eingesetzt. Die Positivproben wurden als
Vergleichskontrollen in den entsprechenden Exons genutzt und die Reproduzierbarkeit der
erwarteten Ergebnisse wurde überprüft.
Untersucht wurden alle 10 Positivproben der Exons 16, 17, 18 und 19, wobei für Exon 16 vier
Positivproben vorhanden sind, für Exon 17 und 18 jeweils eine und für Exon 19 vier
Positivproben (Schmidt et al. 1997, Schmidt et al. 1999). Bei drei Positivproben des Exons 16
handelt es sich um die gleiche Mutation. Zwei der entsprechenden Patienten gehören einer
Familie an und stammen aus dem eigenen Register für papilläre RCC der Jahre 1984 bis
1998. Zwei Positivproben des Exons 19 tragen ebenfalls die gleiche Mutation. Die
Mutationsanalyse erfolgte jeweils in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt an den
National Institutes of Health. Die weiteren Positivproben stammen aus derselben
Arbeitsgruppe.
Die Positivproben für die Exons 16, 18 und 19 fielen jeweils durch eine aberrierende Bande
auf und konnten somit als positiv angenommen werden. Anschließende entsprechende
Sequenzierungen konnten die bekannten Ergebnisse der Mutationsanalysen der Arbeitsgruppe
von Prof. Dr. L. Schmidt bestätigen. In Exon 17 konnte die Positivprobe mittels SSCP –
Analyse nicht bestätigt werden. Eine aberrierende Bande konnte nicht gesehen werden. Eine
Sequenzierung konnte nicht durchgeführt werden, da keine DNA dieser Probe mehr
vorhanden war.
Im Folgenden sollen die Ergebnisse der Positivproben für die einzelnen Exons dargestellt
werden.
44
Ergebnisse
Positivkontrollen des Exon 16
Abbildung 3.1 zeigt einen Ausschnitt der SSCP- Analyse des Exon 16 mit den zwei
Positivproben der gleichen Mutation und einer Normalprobe. In der Mitte des Bildes der
Normalbefund, rechts und links davon fallen die zwei Positivproben mit einer zusätzlichen
Bande auf (Pfeile). Die anschließende Sequenzierung einer der Positivproben ergab
nebenstehenden Ausschnitt der DNA- Sequenz. Durch einen Vergleich mit der
Wildtypsequenz erkennt man die Nukleotidveränderung von A zu G bei dem Nukleotid 3529.
Die bekannte Mutation (Mutation A3529G) der Patienten konnte bestätigt werden. Bei diesen
beiden Fällen wurden auch Exon 2 und Exon 4 bis 21 untersucht. Hierbei ergab sich jeweils
ein Normalbefund. Referenz der Wildtypsequenz nach Park et al. 1987 (siehe Abbildung 3.1).
Mutierte Sequenz:
T
A
T
A
T C
G
T
G
G
Wildtyp- Sequenz:
T
A
T A
T C
A
T
G
G
Nukleotid:
3523 3524
3525 3526 3527 3528 3529
3530 3531 3532
Abbildung 3.1: Ausschnitt der SSCP- Analyse des Exons 16 mit zwei Positivproben (Pfeile) und Ergebnis
der Sequenzierung einer der Positivproben
Bei den hier abgebildeten Positivproben handelt es sich um die zwei Patientenproben aus dem
erstellten Register der Jahre 1984 bis 1998, welche zur weiteren Diagnostik weitergeleitet
worden waren. Die entsprechenden Mutationen dieser Patienten wurden in der Arbeitsgruppe
von Prof. Dr. L. Schmidt an den NIH identifiziert und wurden daher als Positivproben
genutzt.
Bei den beiden weiteren Positivproben des Exons 16 zeigte sich in der SSCP- Analyse
ebenfalls ein jeweils verändertes Laufverhalten. Die anschließenden Sequenzierungen
45
Ergebnisse
konnten die bekannten Mutationen (Mutation A3529G und Mutation G3522A) der
entsprechenden Proben bestätigen.
Positivkontrolle des Exons 17
Die Positivprobe des Exons 17 zeigte in der SSCP – Analyse kein verändertes Laufverhalten
gegenüber den anderen Proben (s. Abbildung 3.2). Auch zwei weitere SSCP–Analysen des
Exons 17 mit veränderten Versuchsbedingungen hinsichtlich der Gelzusammensetzung und
der Lauftemperatur, konnten kein abweichendes Laufverhalten der Positivprobe darstellen.
Bezüglich der Gelzusammensetzung wurden reine Acrylamid- Gele, sowie Acrylamid- Gele
mit 10% Glycerol versetzt, verwendet.
Eine PCR zur Reamplifizierung dieser Probe anhand des ausgeschnittenen SSCP-Produkts
misslang. Eine weitere Analyse konnte nicht durchgeführt werden, da keine DNA mehr
vorhanden war. Eine Sequenzierung dieser Probe konnte somit nicht durchgeführt werden.
Der Versuch an eine weitere DNA-Probe dieses Patienten zu gelangen verlief leider ebenfalls
erfolglos.
Abbildung 3.2: Ausschnitt der SSCP– Analyse des Exons 17 mit einer Positivprobe (Pfeil) und zwei
Normalproben.
Die Positivprobe stellt sich in dem mit Glycerol versetzten Gel genauso wie die
Normalproben dar. Es ist keine zusätzliche Bande sichtbar.
46
Ergebnisse
Positivkontrolle des Exons 18
Abbildung 3.3 zeigt das Ergebnis der SSCP– Analyse des Exons 18 mit einer Positivprobe, in
einem mit Glycerol versetzten Gel. Das Ergebnis der Sequenzierung der Positivprobe zeigte
einen Nukleotidaustausch an der Position 3810 von G nach T. Die bekannte Mutation
(Mutation G3810T) des Patienten wurde somit bestätigt (siehe Abbildung 3.3). Die
Positivprobe kann deutlich an der zusätzlichen Bande erkannt werden. Das wellige
Erscheinungsbild der beiden Normalproben links im Bild ist bedingt durch ein erschwertes
Abziehen des SSCP- Gels von der Glasplatte.
Abbildung 3.3: Ausschnitt der SSCP– Analyse des Exons 18 mit einer Positivprobe (Pfeil) und drei
Normalproben
47
Ergebnisse
Positivkontrollen des Exons 19
Alle vier vorhandenen Positivproben des Exons 19 zeigten in der entsprechenden SSCP–
Analyse aberrierende Banden. Zwei Positivproben tragen die gleiche Mutation (Mutation
G3930A). Abbildung 3.4 zeigt jeweils einen Ausschnitt der SSCP– Analyse des Exons 19 aus
unterschiedlichen Gelelektrophoresen und den Ergebnissen der Sequenzierungen der
Positivproben mit den drei unterschiedlichen Mutationen. Alle bekannten Mutationen der
Patienten konnten bestätigt werden. Die Positivproben können deutlich an der zusätzlichen
Bande (Pfeile) erkannt werden. Die Normalproben zeigen ein anderes Bandenmuster.
Mutierte Sequenz:
G
A
C
Wildtyp-Sequenz:
G
A
G
Nukleotid:
3928 3929 3930
A
C
A
C
3931 3932
Mutierte Sequenz:
G
A
A
A
C
Wildtyp-Sequenz:
G
A
G
A
C
Nukleotid:
3928 3929 3930 3931 3932
Mutierte Sequenz:
T
G
C
Wildtyp-Sequenz:
T
G
T
Nukleotid:
3934 3935 3936
A
T
A
T
3937 3938
Abbildung 3.4: Ausschnitt der SSCP – Analyse des Exon 19 mit vier Positivproben (Pfeile) und sieben
Normalproben und den Ergebnissen der Sequenzierungen der drei unterschiedlichen Positivproben als
Peak- Diagramme.
48
Ergebnisse
Tabelle 3.5 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse der SSCP- Analyse der
Positivproben der Exons 16, 17, 18 und 19 und die entsprechenden Mutationen.
Positivproben/
DNA-Nr.
Exon
Nukleotid Mutation
SSCP-Analyse
Sequenzierung
2437
16
3529
A3529G
+
+
2557
16
3529
A3529G
+
+
5080
16
3522
G3522A
+
+
5081
16
3529
A3529G
+
+
5082
17
3640
T3640C
-
Nicht möglich
5083
18
3810
G3810T
+
+
5084
19
3930
G3930C
+
+
5085
19
3930
G3930A
+
+
5086
19
3930
G3930A
+
+
5087
19
3936
T3936C
+
+
Tabelle 3.5: Zusammenfassung der Ergebnisse der SSCP – Analyse der Positivproben
49
Ergebnisse
3.3 Fallbeschreibungen der Patienten mit der Mutation A3529G in Exon 16
Beide Patienten gehören derselben Familie an. Es handelt sich hierbei um den zum Zeitpunkt
der Operation (1997) 46- jährigen Vater als Indexpatienten und seinen 24 Jahre alten Sohn,
der auf seinen Wunsch hin prädiktiv molekulargenetisch untersucht wurde. Der Indexpatient
stammt aus dem erstellten Register für papilläre Nierenkarzinome. Die molekulargenetischen
Analysen wurden zunächst durch die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt an den NIH
durchgeführt. In dieser Arbeit konnten die gefundenen Mutationen durch eine SSCP –
Analyse mit anschließender Sequenzierung bestätigt werden. In dieser Familie wurde auch die
26 jährige Tochter des Indexpatienten prädiktiv molekulargenetisch untersucht, es ließ sich
bei ihr keine Mutation feststellen. In der SSCP – Analyse zeigte sich keine aberrierende
Bande und es wurde deshalb keine Sequenzierung durchgeführt. Dieses Ergebnis bestätigt den
Befund der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt. Vater und Sohn sind somit
Mutationsträger der gleichen Mutation (A3529G). Diese Familie stellt somit den einzigen
familiären Fall in diesem Register dar.
Klinisch zeigte der Indexpatient im MRT multiple, bilaterale Tumore (s. Abbildung 3.6). Der
Sohn war asymptomatisch und wurde als Träger derselben Mutation erst durch die prädiktive
Diagnostik entdeckt.
Die Familienanamnese des Indexpatienten ist unklar. Mit der einzigen Schwester und ihrer
Familie soll kein Kontakt bestehen. Der Vater soll an nicht mehr evaluierbarer Ursache
verstorben sein, die Mutter soll an den Folgen eines Mamma- Karzinoms verstorben sein.
Eine Großmutter des Vaters soll an unbekannter Ursache mit 75 Jahren verstorben sein, ein
Großvater soll ebenfalls an unbekannter Ursache, angeblich in jüngeren Jahren, verstorben
sein. Weitere Informationen waren nicht evaluierbar.
Die Familie lehnte weitere ihnen angebotene diagnostische Untersuchungen bei dem Sohn ab.
Ein möglicherweise schon bestehender Tumor bei dem Sohn konnte somit nicht erfasst
werden.
Abbildung 3.5 zeigt den Stammbaum der Familie mit entsprechendem Ergebnis der SSCP–
Analyse und der Sequenzierung der DNA- Proben der betroffenen Personen.
50
Ergebnisse
?
?
I:1
I:2
?
II:2
III:2
II:1
II:3
III:1
Mutierte Sequenz:
T
A
T
A
T
C
G
T
G
G
Wildtyp- Sequenz:
T
A
T
A
T
C
A
T
G
G
Nukleotid:
3529
Abbildung 3.5: Stammbaum der Familie mit der Mutation A3529G in Exon 16 und Ergebnisse der SSCPAnalysen sowie das Ergebnis der Sequenzierung des Exon 16 des Indexpatienten
Der Indexpatient ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Beide Mutationsträger sind dunkel
markiert. Die Tochter trägt keine entsprechende Mutation. Die SSCP – Analysen zeigen bei
51
Ergebnisse
dem Indexpatienten und seinem Sohn eine eindeutige zusätzliche Bande (siehe Pfeile). Bei
der Tochter zeigt sich ein Normalbefund.
In der MRT- Aufnahme des Indexpatienten sind nach Kontrastmittelgabe multiple, bilaterale
Tumore der Nieren zu erkennen (weiße Pfeile). Die Bilder wurden freundlicherweise von
Herrn Prof. Dr. Riedasch, Abteilung Urologie der Universitätsklinik Heidelberg, zur
Verfügung gestellt.
Abbildung 3.6: MRT- Darstellung des Abdomens des Indexpatienten mit der Mutation A3529G
Die histologische Untersuchung der Tumore erbrachte den Befund von bilateralen, multiplen
Nierentumoren mit etwas unterschiedlichem Wachstumsmuster. Die rechte Niere wurde durch
Nephrektomie entfernt. Es fanden sich hier multiple tubulo-papilläre Adenome und Herde
eines tubulo-papillären Adeno-Karzinoms. In der linken Niere wurden zwanzig Tumore
entfernt. Acht Tumore wurden histologisch separat aufgearbeitet. Es handelte sich in allen
Fällen um papillär klarzellige oder papillär chromophile Tumoren. Der maximale
Durchmesser der Tumore war 1,8 cm.
52
3.4
Ergebnisse
Ergebnisse der SSCP- Analyse der DNA- Proben
Die SSCP– Analyse wurde auch bei allen weiteren 60 Blutproben der Patienten als
Screeningverfahren eingesetzt. Insgesamt wurde bei 52 Patienten mit papillären
Nierenkarzinomen das Exon 2 und Exon 4 bis 21 des MET– Gens untersucht, bei 8 weiteren
Patienten wurden nur die Exons 16, 17, 18 und 19 untersucht, die sich in anderen Studien als
„hot spot“ Region zeigten. Die Blutproben dieser 8 Patienten sind zum Abschluss der Arbeit
eingegangen und die Diagnostik der meisten Exons war schon abgeschlossen.
Im Folgenden sollen die Ergebnisse der SSCP– Analysen der einzelnen Exons
zusammengefasst werden.
Exon 2
Es wurden insgesamt 52 DNA – Proben untersucht.
In der SSCP- Analyse konnte bei der DNA-Nr. 3837, im telomeren Drittel des Exons 2,
deutlich in dem nicht mit Glycerol versetzten Gel eine zusätzliche Bande gesehen werden.
Eine weitere SSCP- Analyse dieses Exons mit veränderten Versuchsbedingungen (mit
Glycerol versetztes Gel) konnte die aberrierende Bande bei derselben Probe bestätigen (siehe
Pfeile, Abbildung 3.7).
Bei allen anderen DNA – Proben ergab sich ein Normalbefund.
SSCP- Gelanalyse ohne Glycerol
SSCP- Gelanalyse mit Glycerol
Abbildung 3.7: Ausschnitt der SSCP- Analysen des Exons 2 telomeres Drittel mit unterschiedlichen
Versuchsbedingungen
53
Ergebnisse
Bei der anschließenden Sequenzierung der aberrierenden Bande der DNA-Nr. 3837 in Exon 2
zeigte sich ein Nukleotidaustausch bei der Position 698 des MET- Gens von G zu T, mit
einem daraus resultierenden Aminosäurenaustausch von Serin zu Isoleucin (siehe Abbildung
3.8). Eine solche Veränderung im MET – Gen wurde bisher nicht beschrieben. Referenz des
Wildtyps nach Park et al. (1987).
Mutierte Sequenz:
G
A
A
G
A
T
Wildtyp- Sequenz: G
A
A G
A
G
C
C
C
A
Nukleotid:
694 695
697
698
699
700
701
702
693
696
C
C
C
A
Abbildung 3.8: Peak- Diagramm der veränderten Sequenz in Exon 2 der Probe 3837, verglichen mit der
Wildtyp- Sequenz. Man erkennt einen Nukleotidaustausch von G zu T bei dem Nukleotid 698.
Zur weiteren Abklärung der nachgewiesenen Veränderung G698T in Exon 2 des MET- Gens
wurden 100 Kontrollproben (DNA von gesunden Blutspendern, nach deren Einverständnis)
hinsichtlich derselben Veränderung mit den gleichen Methoden untersucht. Hierbei fand sich
bei 8 Patienten der gleiche Nukleotidaustausch. Bei der Sequenzveränderung G698T in Exon
2 handelt es sich somit um einen Polymorphismus.
54
Ergebnisse
Exon 3
Exon 3 wurde nicht untersucht, da bisher keine geeigneten Primer für dieses Exon hergestellt
werden konnten.
Exon 4
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 5
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 6
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 7
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 8
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 9
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 10
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 11
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 12
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 13
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 14
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 15
Es wurden 52 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
55
Ergebnisse
Exon 16
Es wurden insgesamt 60 DNA – Proben untersucht.
In der SSCP- Analyse konnte bei der Probe mit der DNA-Nr. 1291 eine zusätzliche Bande
gesehen werden. Zur Kontrolle wurde eine weitere SSCP- Analyse durchgeführt. Es konnte
mit veränderten Versuchsbedingungen mit einem mit Glycerol versetzten Gel, sowie
nochmals einer SSCP- Analyse ohne Glycerol, keine zusätzliche Bande mehr gesehen werden
(siehe Pfeile Abbildung 3.9).
SSCP- Gelanalyse ohne Glycerol
SSCP- Gelanalyse mit Glycerol
Abbildung 3.9: Ausschnitt der SSCP- Analysen des Exons 16 mit unterschiedlichen Versuchsbedingungen
Die Sequenzierung der ausgeschnittenen zusätzlichen Bande der Probennummer 1291 in
Exon 16 ergab kein Ergebnis, da sich keine DNA in der Probe nachweisen ließ. Bei der
aberrierenden Bande handelt es sich hierbei somit wahrscheinlich um ein PCR Artefakt,
wofür auch die Tatsache spricht, daß die zusätzliche Bande nur in einer Gelanalyse auftritt.
Auch in einer weiteren SSCP – Analyse ohne Glycerol, welche hier nicht dargestellt ist, ließ
sich die zusätzliche Bande nicht mehr darstellen.
Bei allen anderen Proben ergab sich ein Normalbefund.
56
Ergebnisse
Exon 17
Es wurden 60 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 18
Es wurden 60 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 19
Es wurden 60 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 20
Es wurden 54 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
Exon 21
Es wurden 54 DNA – Proben untersucht. Bei allen Proben ergab sich ein Normalbefund.
3.5
Fallbeschreibung des Patienten mit der DNA-Nr. 3837 und dem
Polymorphismus G698T in Exon 2:
Es handelt sich um einen bei Diagnosestellung 55–jährigen männlichen Patienten. Die
Operation aufgrund der Diagnose unilaterales Nierenkarzinom erfolgte 1992 durch eine
Nephrektomie. Intraoperativ fand sich ein Tumorstadium 2 nach Robson und ein TNMStadium T3a N0 M0. Die Tumorgröße betrug 7cm.
Eine positive Familienanamnese bezüglich Nierenkarzinome ließ sich nicht evaluieren. Der
Patient ist weiterhin in Nachsorgebehandlung bei seinem Hausarzt. Es trat bisher kein
Tumorrezidiv auf. Weitere Informationen waren nicht erhältlich.
57
3.6
Ergebnisse
Weitere Polymorphismen
In den Exons 2 (telomeres Viertel), 7 und 20 konnten bei mehreren Proben verschiedene
gleiche Zusatzbanden gefunden werden, die durch die Häufigkeit bei den Proben und
aufgrund des typischen Bandenmusters von Muster A, B oder AB, auf einen Polymorphismus
schließen lassen. Ein Beispiel dafür zeigt Abbildung 3.10 anhand Exon 20 .
A
B
AB
Abbildung 3.10: Ausschnitt der SSCP- Analyse des Exons 20 (SSCP- Gelanalyse mit Glycerol)
Es können verschiedenartige Banden gesehen werden, die bei verschiedenen Proben
mehrmals auftreten. Es tritt ein Polymorphismus- typisches Muster auf, mit der Abwechslung
von Muster A, B oder AB. Anhand der Sequenzierungen des Exons 20 verschiedener
Patienten mit einem AB- Bandenmuster konnte bei diesen Patienten der Polymorphismus
C4106T heterozygot nachgewiesen werden. Im Folgenden wird das Ergebnis der
Sequenzierung des Exons 20 des Patienten 6012 mit einem AB- Bandenmuster dargestellt. Es
kann eindeutig die Nukleotidveränderung C4106T in heterozygotem Zustand gesehen werden
(siehe Abbildung 3.11). Die Sequenzierung der Patientin 5301 mit einem A- Bandenmuster
ergab an dieser Nukleotidstelle Homozygotie T4106T (siehe Abbildung 3.11). Die
Sequenzierung eines Patienten mit einem B- Bandenmuster ergab an dieser Stelle
58
Ergebnisse
Homozygotie C4106C (Sequenzierung nicht dargestellt). Damit konnte ein häufiger
Polymorphismus in Exon 20 gezeigt werden.
Seq.:
C T
G
A
Nukleotid:
T/C G T
4106
A A
C
T
G
A
T
G T
A A
4106
Abbildung 3.11: Ergebnisse der Sequenzierungen des Exon 20 des Patienten 6012 mit dem heterozygoten
Polymorphismus C4106T und der Patientin 5301 mit Homozygotie T4106T
Im telomeren Viertel von Exon 2 konnte mit den gleichen Methoden der Polymorphismus
C728T in heterozygotem Zustand bei mehreren Proben nachgewiesen werden. In Exon 7
konnte bei mehreren Proben der Polymorphismus A2138G in heterozygotem Zustand
nachgewiesen werden. Die einzelnen Ergebnisse der jeweiligen SSCP- Analysen und
Sequenzierungen werden hier nicht weiter dargestellt. Die Diagnostik erfolgte jeweils mit den
beschriebenen Methoden.
Der von Schmidt et al. gefundene Polymorphismus in Exon 15 konnte bei keinem der
Patienten gefunden werden.
59
Ergebnisse
Tabelle 3.6 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse der SSCP- Gelanalysen der einzelnen
Exons des MET- Gens bezüglich Mutationen bzw. Polymorphismen, ohne die Positivproben.
Exon 2
Sequenzveränderung
Fall/ DNA-Nr.
positiv
3837
Nukleotid Pathogene Polymorphismus
Mutation
698
keine
G698T
728
C728T
Exon 4
negativ
alle Proben
keine
Exon 5
negativ
alle Proben
keine
Exon 6
negativ
alle Proben
keine
Exon 7
positiv
mehrere Proben
Exon 8
negativ
alle Proben
keine
Exon 9
negativ
alle Proben
keine
Exon 10
negativ
alle Proben
keine
Exon 11
negativ
alle Proben
keine
Exon 12
negativ
alle Proben
keine
Exon 13
negativ
alle Proben
keine
Exon 14
negativ
alle Proben
keine
Exon 15
negativ
alle Proben
keine
Exon 16
negativ
alle Proben
keine
Exon 17
negativ
alle Proben
keine
Exon 18
negativ
alle Proben
keine
Exon 19
negativ
alle Proben
keine
Exon 20
positiv
mehrere Proben
Exon 21
negativ
alle Proben
2138
4106
keine
keine
A2138G
C4106T
keine
Tabelle 3.6: Zusammenfassung der Mutationsanalysen der einzelnen Exons des MET-Gens
60
3.7
Ergebnisse
SSCP-Analyse der Patienten mit bekannten somatischen Mutationen im
Tumorgewebe
Bei den beiden Patienten, bei denen eine somatische Mutation in den Exons 16 (DNA-Nr.
3117; Mutation G3522A) und 19 (DNA-Nr. 2871; Mutation T3936G) im Tumorgewebe
identifiziert wurde (Schmidt et al., 1997), fanden sich bei der SSCP- Analyse der Blut- DNA
der entsprechenden Exons und der restlichen Exons des MET-Gens keine aberrierenden
Banden. Ein Patient stammt aus dem eigenen Register für papilläre Nierenkarzinome, der
zweite Patient wurde im Loretto-Krankenhaus Freiburg in der Urologischen Abteilung
operiert, das histologische Gutachten wurde am Pathologischen Institut der Universitätsklinik
Freiburg erstellt. Die entsprechenden Mutationen in den Tumoren wurden in der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt an den NIH identifiziert. Blutproben der Patienten zur
SSCP – Analyse wurden nachträglich angefordert.
3.7.1 Fallbeschreibung des Patienten mit der somatischen Mutation G3522A
Es handelt sich um einen zum Zeitpunkt der Operation 55-jährigen männlichen Patienten. Die
Operation durch eine Nephrektomie erfolgte 1994 am Loretto-Krankenhaus Freiburg. Die
Histologie ergab einen unilateralen, 5cm im Durchmesser großen, vorwiegend papilläre
strukturierten, abgekapselten Tumor der rechten Niere. Das Tumorstadium nach TNM betrug
T2N0MX. Eine Einteilung nach Robson wurde nicht durchgeführt. Weitere Diagnostik ergab
keinen Hinweis auf Metastasen.
Die Familienanamnese hinsichtlich Nierenkarzinome ist negativ.
3.7.2 Fallbeschreibung des Patienten mit der somatischen Mutation T3936G
Bei dem männlichen Patienten erfolgten zwei Operationen aufgrund der Diagnose
Nierentumor in der Universitätsklinik Freiburg im Abstand von sieben Jahren. Zum Zeitpunkt
der ersten Operation war der Patient 45 Jahre alt. Es fand sich in der linken Niere ein 6cm
großer Tumor, der durch eine Nierenteilresektion entfernt wurde. Eine Nephrektomie wurde
aufgrund einer reduzierten Funktion der kontralateralen Niere, durch eine hydronephrotisch
geschrumpfte Niere mit mehreren Zysten, nicht durchgeführt. Die Histologie ergab einen
61
Ergebnisse
tubulo-papillär wachsenden Tumor mit dem Tumorstadium T2N0M0 nach der TNM
Klassifikation.
Die zweite Operation erfolgte 1994. Es fand sich ein 4cm großer Tumor in der rechten Niere.
Aufgrund eines zusätzlich multifokalen Vorkommens von papillären Adenomen und einem
Tumoreinbruch in das Nierenbecken, erfolgte eine Nephrektomie der rechten Niere.
Histologisch fand sich ein chromophiles, adenopapilläres Nierenzellkarzinom. Das
Tumorstadium nach TNM betrug T2N0MX. Eine Stadiumeinteilung der Tumore nach Robson
wurde jeweils nicht durchgeführt.
Die Familienanamnese des Patienten hinsichtlich Nierentumore ist negativ.
Eine Probe dieses zweiten Tumors wurde zur Analyse an die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L.
Schmidt an den NIH geschickt. Der Befund stand zum Zeitpunkt dieser Arbeit noch aus.
3.8
Sensitivität der SSCP- Analyse
Da sich 9 von den 10 Positivproben in der SSCP- Analyse mit eindeutig aberrierenden
Banden darstellten (90%) und die bekannten Mutationen durch Sequenzierungen bestätigt
werden konnten, kann von einer relativ hohen Sensitivität dieses Analyseverfahrens für diese
Exons ausgegangen werden. Da keine weitere DNA der Positivkontrolle des Exons 17 zu
erhalten war und die Reamplifizierung der DNA aus der SSCP- Analyse erfolglos verlief,
kann keine genaue Aussage zu der Sensitivität dieses Verfahrens hinsichtlich dieser
Positivkontrolle für Exon 17 gemacht werden. Eine Ursache, warum die Positivkontrolle für
Exon 17 keine aberrierende Bande gezeigt hat muss somit offen bleiben.
62
4
Diskussion
DISKUSSION
Um die Bedeutung des c-MET Proto-Onkogens für die Entstehung von sporadischen und
familiären papillären Nierenkarzinomen zu eruieren, wurden in der vorliegenden Arbeit
erstmals Exon 2 und Exon 4 bis 21 des c-MET Proto-Onkogen eines Patientenkollektives mit
papillären Nierenkarzinomen analysiert. Um bisherige Ergebnisse aus anderen Studien zu
reevaluieren und die Sensitivität der Untersuchungen anhand der SSCP-Analyse zu
überprüfen, wurden 10 positive Proben aus einer anderen Arbeitsgruppe (Schmidt et al. 1997,
1999) als Positivproben in die Untersuchungen eingeschlossen, wobei zwei Patienten aus dem
eigenen Register der Jahre 1984 bis 1994 stammen. In allen Fällen wurde die SSCP-Analyse
mit
Blutproben als Verfahren zur Identifizierung von konstitutionellen- Mutationen in
peripheren Lymphozyten eingesetzt, da
bisherige Studien eine gute Sensitivität dieses
Analyseverfahrens in Bezug auf das c-MET Proto-Onkogen zeigten und die entsprechenden
Primerpaare gute Resultate lieferten ( Duh et al. 1997; Schmidt et al. 1997).
In dieser Arbeit wurden keine Tumore untersucht und somit wurden keine somatischenMutationen bestimmt. Bei zwei Patienten aus dem eigenen Register der Jahre 1984 bis 1994
der Uniklinik Freiburg sind von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L .Schmidt an den NIH
(1997) somatische Mutationen im Tumorgewebe identifiziert worden und es wurde in dieser
Arbeit zusätzlich bei diesen Patienten auf konstitutionelle Mutationen hin untersucht.
4.1
Konstitutionelle Mutationen des MET- Gens bei sporadischen
papillären Nierenkarzinomen
Bei allen Proben dieses Patientenkollektivs, wiesen weder die sporadischen, noch die familiär
unklaren Fälle, eine konstitutionelle pathogene Mutation des c-MET Proto-Onkogens auf.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen bei den sporadischen papillären Nierenkarzinomen eine
Vergleichbarkeit mit weiteren Studien, bei denen eine geringe Häufigkeit von
konstitutionellen, sowie auch somatischen Mutationen im MET-Gen bei Patienten mit
sporadischen
papillären
Nierenkarzinomen
nachgewiesen
werden
konnte.
In
der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt an den NIH konnte in einer Studie mit 128
ausschließlich sporadischen Fällen 16 MET- Mutationen (13%) mittels SSCP- Analyse
nachgewiesen werden. Bei 8 von den 16 Patienten fanden sich konstitutionelle Mutationen,
d.h. bei ca. 6% des Patientenkollektivs (Schmidt et al. 1999). In einer weiteren Studie wurden
63
Diskussion
bei 3 von 60 (5%) Patienten mit sporadischen papillären RCC somatische Mutationen
identifiziert, bei 6 von 7 (86%) Patienten mit familiären papillären RCC wurden
konstitutionelle Mutationen gefunden (Schmidt et al. 1997). Die Mutationen beschränken sich
alle auf die Tyrosin- Kinase Domäne des MET- Gens.
Es können verschiedene Ursachen für die insgesamt geringe Häufigkeit von c-MET ProtoOnkogen Mutationen bei sporadischen papillären RCC angenommen werden. So könnten
somatische Mutationen zum Beispiel nur in einem der morphologischen Subtypen der
papillären RCC vorkommen oder es existieren weitere bisher unbekannte Kandidatengene.
Weiterhin werden von unabhängigen Studien Mutationen in den TFE3- und PRCC- Genen für
sporadische papilläre RCC verantwortlich gemacht (Sidhar et al.1996; Wetermann et al.
1996).
Eine Trisomie des Chromosoms 7 ist eine charakteristische Eigenschaft von papillären RCC.
Eine Studie von Kovacs et al. (1993) zeigte eine somatische Trisomie 7 in 95% der Fälle bei
papillären Nierenkarzinomen. Verglichen mit der Studie von Schmidt et al. (1999), bei der
6% der Fälle eine somatische- und 6% der Fälle eine konstitutionelle MET- Mutation
aufwiesen sowie dieser Studie, bei der 1,7% (1/58) eine MET- Mutation aufwiesen, scheinen
die meisten papillären RCC mit einer somatischen Trisomie 7 einherzugehen, ohne eine METMutation zu tragen (siehe Abbildung 4.1).
Interphase-FISH einer Trisomie 7
bei einem Patienten mit PRCC
Chromosom 7 markiert mit roten
Sonden
A: MET- Gen ohne Mutation (met)
+ : leichter Proliferationsreiz
B: MET- Gen mit Mutation (MET)
+++ : starker Proliferationsreiz
Abbildung 4.1: Polysomie des Chromosom 7 mit Duplikation des MET- Allels und zytogenetische
Darstellung einer Trisomie 7 mittels Interphase-FISH (nach Lubensky et al. 1999)
64
Diskussion
Von besonderem Interesse ist hierbei das Ergebnis einer Studie von Bernues et al. (1995), bei
der eine partielle Duplikation auf Chromosom 7 in der Region 7q21-q35, bei einer Familie
mit familiärem papillären RCC und MET- Mutation, identifiziert werden konnte. Dies hatte
somit eine Vervielfältigung des mutierten MET- Allels zu Folge. In einer Studie mit
familiären, sowie auch sporadischen papillären RCC, wurde eine Polysomie des Chromosom
7 und eine Duplikation des mutierten MET- Allels bei allen identifizierten Mutationen
gefunden (Fischer et al. 1998). Diese Befunde lassen die Vermutung zu, daß eine Duplikation
des mutierten MET- Gens nötig ist, um eine Tumorentstehung zu verursachen. Eine Mutation
von einem Allel des MET- Gens scheint keinen Einfluss auf die Funktion des Wildtyp- Allels
während der embryonalen Genese zu haben und eine konstitutionelle Mutation allein scheint
für eine Entwicklung eines papillären RCC nicht ausreichend zu sein. Ein weiterer Hinweis
hierfür sind Familienmitglieder von betroffenen Personen, mit hereditären papillären RCC,
die zwar eine Mutation tragen, aber keine Tumoren entwickeln (Fischer et al. 1998). Die
niedrige Penetranz der Erkrankung bei konstitutionellen Mutationen des MET- Gens, könnte
somit durch diese Hypothese erklärt werden.
Wie diese und vorhergegangene Studien zeigten, scheinen Mutationen des c-MET ProtoOnkogen nur für eine kleine Anzahl von sporadischen papillären RCC eine Rolle zu spielen.
Eine zusätzliche MET- Mutation scheint jedoch einen weiteren Wachstumsvorteil für
papilläre RCC zu bringen, da das mutierte Gen- Allel dupliziert wird.
Der Befund in der vorliegenden Arbeit schließt jedoch in dieser relativ kleinen Studie
unerkannte konstitutionelle Mutationen bei den untersuchten Patienten nicht aus, da die
Sensitivität der SSCP- Analyse allgemein zwischen 35% und bis zu 100% beschrieben wird
(Claustres et al.1993; Michaud et al. 1992; Orita et al. 1989; Sheffield 1993; Soto et al.1992).
Die Sensitivität dieses Verfahrens hängt in hohem Maße von der Optimierung der
experimentellen Bedingungen und der Sequenz des entsprechenden DNA- Abschnitts ab.
Zudem kann das SSCP- Verfahren in dieser Arbeit nicht als 100% sensitiv für alle Exons
beschrieben werden, da nur für die Exons 16, 17, 18 und 19 Positivkontrollen zur Verfügung
standen und hier auch nicht für alle in diesen Exons unterschiedlichen beschriebenen
Mutationen (Schmidt et al.1999).
65
4.2
Konstitutionelle
Mutationen
des
Diskussion
MET-
Gens
bei
papillären
Nierenkarzinomen mit unklarer und positiver familiärer Anamnese
Die Diagnose Familiäres Papilläres Nierenkarzinom bereitet oft aufgrund einer schwer zu
erhebenden Familienanamnese Schwierigkeiten. Ist die Diagnose einmal gestellt und gibt es
in den betroffenen Familien mehrere symptomatische Mitglieder, so kommt der
molekulargenetischen Untersuchung dieser Patienten und auch den nicht symptomatischen
Angehörigen eine Schlüsselstellung zu.
Bei den Patienten mit unklarer familiärer Anamnese fanden sich, wie schon erwähnt, keine
konstitutionellen Mutationen, wobei hier nicht erkannte Mutationen mittels der SSCPAnalyse nicht vollständig ausgeschlossen werden können. Somatische Mutationen wurden
nicht untersucht. Neben der schon bekannten Familie mit familiären papillären RCC dieses
Registers, fanden sich keine weiteren Patienten mit einer eindeutig gesicherten Diagnose des
familiären papillären RCC in dem Patientenkollektiv dieser Studie. Auch in den
vorangegangenen Studien zeigten sich wenige größere Familien mit hereditärem papillären
RCC, die beiden beschriebenen großen nordamerikanischen Familien scheinen dabei auf
einen gemeinsamen Vorfahren zurückzuführen zu sein (Schmidt et al.1997; Schmidt et al.
1998). Konstitutionelle Mutationen des MET- Gens wurden jedoch wie schon erwähnt auch
bei 3 von 60 Patienten mit unklarer Familienanamnese identifiziert (Schmidt et al.1997) und
bei 8 von 128 mit sporadischen papillären RCC (Schmidt et al. 1999). Die bisher
identifizierten Mutationen bei familiärem papillären RCC wurden in den Exons 16, 17, 18
und 19 lokalisiert. Diese Mutationen liegen alle im Gebiet der Tyrosin- Kinase Domäne des
MET-Gens, lokalisiert in den Exons 15 bis 21 (Duh et al.1997), die eine wichtige Rolle für die
intrazelluläre Signaltransduktion spielt (Takada et al. 1998).
Da bei den MET- Mutanten eine erhöhte Tyrosin- Autophosphorylisierung und eine verstärkte
Aktivität der Kinase gefunden wurde, scheint eine Tumorexpression hier auf eine
Veränderung der Tyrosinkinase- Domäne zurückzuführen zu sein (Jeffers et al.1997). Auch
weitere positive Befunde einer Mutation in der Tyrosin- Kinase Domäne des MET- Gens bei
anderen Tumorarten, untermauern den Zusammenhang der Lokalisation einer Mutation in
diesem Bereich des Gens und einer Tumorexpression (Di Renzo et al. 1992, 1994, 2000,
Olivero et al. 1996). Eine Polysomie des Chromosom 7 scheint dabei eine weitere
entscheidende Rolle zu spielen. Wie schon erwähnt hängt die Stabilität der Konformation der
„activation loop“ des MET- Gens von vielen verschiedenen Faktoren ab und bietet somit viele
Angriffspunkte für Mutationen in der Tyrosin- Kinase Domäne. Es liegt somit nahe, daß noch
66
Diskussion
weitere Mutationen in der Tyrosin- Kinase Domäne existieren können, die bislang unentdeckt
sind.
Abbildung 4.2 zeigt eine Darstellung der Tyrosin- Kinase Domäne des MET- Gens mit
bekannten Lokalisationen von Mutationen und für die Stabilisierung dieser Konformation
wichtigen Aminosäuren-Positionen, die als Angriffspunkte für Mutationen dienen können.
dunkelgrauer oberer Teil des Bildes: N- terminales Ende
hellgrauer unterer Teil des Bildes: C- terminales Ende
F1241, D1222, Y1252: wichtige Aminosäuren- Positionen die für die Stabilisierung der Konformation wichtig
sind
Fette schwarze Punkte: Lokalisationen von MET- Mutationen
(Codon 1112, 1124, 1149, 1110, 1238, 1213, 1206, 1268, 1248 und 1246)
Abbildung 4.2: Die Tyrosin- Kinase Domäne des MET- Gens in der inaktiven Form mit Lokalisationen
von bekannten Mutationen (aus: Schmidt et al. 1999)
Da eine Mutation in den weiteren Regionen des MET- Gens noch nicht im Zusammenhang
mit papillären Nierenkarzinomen identifiziert werden konnte, scheint der Tyrosin- Kinase
Bereich die signifikante Rolle für die Tumorentstehung zu spielen. Erwähnenswert erscheint
hier auch die Tatsache, daß vier der bisher gefundenen Mutationen des MET- Gens (M1268T,
67
Diskussion
D1246H, D1246N, V1110I) in Codons lokalisiert sind, die homolog zu Codons im c- KIT, im
RET- Proto-Onkogen und im c-erbB (Schmidt et al.1999; Shu et al. 1990) sind, welche als
Ziele von natürlich vorkommenden Mutationen nachgewiesen werden konnten (Hofstra et al.
1994; Nagata et al. 1995). MET, c-KIT, RET und c-erbB sind alle transmembranäre
Tyrosinkinaserezeptoren, welche Mutationen in der Tyrosinkinase- Domäne aufweisen
können und entsprechend zu einer karzinomatösen Entartung in verschiedenen Geweben
führen können. Diese Beobachtungen legen nahe, daß die Tyrosinkinase- Domäne als „hot
spot“ dieser Gene angesehen werden kann und eine Mutation in diesem Bereich zu
karzinomatöser Zellproliferation führt.
Nicht zu vernachlässigen sind hierbei jedoch auch die transmembranäre und extrazelluläre
Domäne des MET-Gens, die in der Kette der Signaltransduktion weitere wichtige Funktionen
innehaben. Wie diese Arbeit zeigt, könnte auch eine Mutation in diesen Bereichen zu einer
Tumorentstehung führen, welche aufgrund der bisherigen Ergebnisse der Studien jedoch nicht
in größerer Häufigkeit zu erwarten wäre. Um mit einer größeren Sicherheit Mutationen in
diesen Bereichen für eine Tumorgenese einzuschließen, sind weitere Studien mit großem
Patientenkollektiv nötig.
Anhand der bisherigen Studien erscheint es eindeutig, daß konstitutionelle Mutationen des
MET- Gens auch bei Patienten ohne eine ausgedehnte positive Familienanamnese gefunden
werden können, größere Familien mit mehreren betroffenen und symptomatischen
Familienmitgliedern
scheinen
eher
ungewöhnlich
zu
sein.
Familiäre
papilläre
Nierenkarzinome scheinen eher in kleinen Familien vorzukommen, in denen es nur wenige
betroffene Personen gibt. Es ist daher davon auszugehen, daß MET Proto-Onkogen
Mutationen mit einer niedrigen Penetranz von Tumoren einhergehen, mit einem späten
Manifestationsalter.
4.3
SSCP-Analyse der Positivkontrollen
Die Positivkontrollen der Exons 16, 18 und 19 zeigten aberrierende Banden in der SSCPAnalyse und die entsprechenden Sequenzierungen konnten die bekannten Mutationen der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. L. Schmidt bestätigen. Die Positivprobe des Exons 17 konnte
mittels der SSCP- Analyse nicht bestätigt werden, es konnte keine Alteration erkannt werden.
Für die SSCP- Analyse wurden hierbei verschiedene Versuchsbedingungen hinsichtlich der
Gelzusammensetzung und der Lauftemperatur ausprobiert. Für dieses Ergebnis der
68
Diskussion
Positivprobe kommen mehrere Erklärungsmöglichkeiten in Frage. Eine schwierige
Differenzierung zum Wildtyp könnte durch das Auftreten einer sehr stabilen, langstieligen
Sekundärstruktur
der
amplifizierten
Sequenz
dieser
Mutation
entstehen,
die
die
Einzelstrangmobilität stark behindert. Weiterhin könnten nicht optimale experimentelle
Bedingungen für dieses Exon eine weitere Fehlerquelle darstellen. Weiterhin besteht die
Möglichkeit, dass die entsprechende Probe nicht die tatsächliche Positivkontrolle enthielt. Da
keine Sequenzierung dieser Probe erfolgen konnte, muss die Ursache hierfür offen bleiben.
Da 9 von den 10 (90%) Positivproben sich bei der SSCP- Analyse mit eindeutig aberrierenden
Banden darstellten und sich die Ergebnisse durch Sequenzierung bestätigten, kann die
Sensitivität der angewandten SSCP- Analyse bezüglich dieser Exons als relativ hoch
angenommen werden. Da die Positivproben in Acrylamidgelen ohne und mit Zusatz von
Glycerol aberrierende Banden zeigten, scheinen beide Gelarten für eine SSCP- Analyse
empfehlenswert zu sein.
Eine weitere kürzlich entwickelte Methode zur Entdeckung von Heteroduplex in DNA mit
Unterschieden zwischen der Wildtyp- DNA und mutierten DNA- Strängen, die so genannte
DHPLC- Methode (Denaturing High- Performance Liquid Chromatography), scheint nach
einer neueren Studie genauso empfehlenswert zu sein. Es wurde in dieser Studie ein
Patientenkollektiv mit den 15 bekannten MET- Mutationen bei papillären Nierenkarzinomen
nochmals mit der DHPLC- Methode analysiert und die Methode stellte sich als 100% genau
in der Erfassung dieser Mutationen dar (Nickerson et al. 2000). Es ist somit möglich, daß
DHPLC noch sensitiver bezüglich MET- Mutationen ist, als die SSCP- Analyse. In einer
weiteren Studie wurde ein Vergleich der DHPLC- Analyse mit der SSCP- Analyse zur
Entdeckung von Mutationen im TSC2 Gen erstellt, wobei sich DHPLC als sensitiver darstellte
(Choy et al. 1999). Auch eine Anwendung dieser Methode bei der Identifizierung von
Polymorphismen wird diskutiert, da in Studien gute Ergebnisse geliefert wurden (Zhonghua et
al. 2001). Da DHPLC eine schnelle, billige und sensitive Methode darstellt, ist zu erwägen, ob
dieser neuen Methode nicht der Vorzug zu geben ist.
4.4
Konstitutionelle Mutationen des MET- Gens bei Patienten mit
somatischen Mutationen im Tumorgewebe
Bei den beiden Patienten mit somatischen Mutationen im Tumorgewebe zeigten sich keine
zusätzlich aberrierenden Banden in der SSCP- Analyse der Blut- DNA. Da bei beiden
69
Diskussion
Patienten auch eine negative familiäre Anamnese vorliegt, können somit sporadische papilläre
Nierenkarzinome angenommen werden. Wie schon erwähnt, finden sich bei den sporadischen
papillären RCC häufiger somatische Mutationen als konstitutionelle Mutationen. Eine
unterschiedliche konstitutionelle Mutation zusätzlich zu einer somatischen Mutation scheint
unwahrscheinlich zu sein und so eine Konstellation wurde in bisherigen Studien nicht
gefunden. Das negative Ergebnis dieser Arbeit bezüglich einer konstitutionellen Mutation bei
diesen Patienten, bestätigt die schon identifizierten Mutationen (Schmidt et al. 1997) der
Patienten als rein somatische Mutationen.
4.5
Histologische- Klinische Korrelation bei sporadischen und familiären
papillären RCC
Wie schon eingangs erwähnt sind familiäre papilläre Nierenkarzinome durch ein bestimmtes
klinisches Erscheinungsbild gekennzeichnet. Sie treten häufig als multiple, bilaterale
Nierentumore auf (Zbar et al. 1994; Schmidt et al.1997). In einer weiteren Studie fand sich
jedoch auch dieses typische Erscheinungsbild bei 3 Personen mit papillären RCC und METMutationen mit unklarer familiärer Anamnese (Schmidt et al. 1997). Da jedoch die
Familienanamnesen häufig schwer zu erheben sind, können hierbei weitere unerkannte
Familienmitglieder mit papillären RCC nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Zudem können
weitere Familienmitglieder existieren, die als Carrier eine MET- Mutation tragen, ohne ein
Karzinom entwickelt zu haben oder noch asymptomatisch sind und so einer Erfassung
entgehen.
Bei den Befunden dieser Arbeit traten lediglich 4,8 % der Nierentumore bilateral und 7%
multifokal auf, die restlichen Nierenkarzinome waren solitär. Dieses Erscheinungsbild
entspricht weitgehend der Häufigkeit der sporadischen Tumore dieser Arbeit. Da bei bis auf
einen Fall keine konstitutionellen Mutationen im MET-Gen gefunden wurden, müssen weitere
Ursachen für multiple, bilaterale papilläre Nierenkarzinome in Betracht gezogen werden, wie
z.B. somatische Mutationen im Tumor, Virusinfektionen, Mutationen des TFE3 und PRCCGens oder Mutationen in bisher unbekannten Genen.
Kovacs und Kovacs (1993) fanden in einer Studie, daß praktisch alle sporadischen papillären
RCC multipel auftreten, auch bei Patienten ohne eine positive familiäre Anamnese. So kann
ein einzelner Tumor mit multiplen mikroskopischen papillären Läsionen einhergehen oder es
treten größere bilaterale multiple Läsionen auf. Fraglich ist jedoch, ob die Patienten beider
70
Diskussion
Gruppen derselben oder verschiedenen Entitäten zuzuordnen sind. Delahunt und Eble (1997)
hingegen fanden einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von mikroskopischen
papillären Läsionen und der Morphologie des Primärtumors. Mikroskopische Läsionen traten
deutlich häufiger bei dem Typ I der papillären Nierenkarzinome auf. Diese Unterschiede
machen das Problem der exakten Einteilung der papillären Nierenkarzinome deutlich,
bezüglich der histologischen, wie auch der Phänotyp-Genotyp Zuordnung und einem
möglichen
klinischen
Hinweiszeichen
für
sporadische
bzw.
hereditäre
papillären
Nierenkarzinomen.
Weitere statistische Daten dieser Studie wie die Geschlechtsverteilung, das Patientenalter bei
Erstdiagnose und die Häufigkeit von papillären Nierenkarzinomen an der Gesamtzahl der
Nierentumore entsprechen den Daten in der Literatur.
4.6
MET- Polymorphismus
Der von Prof. Dr. L. Schmidt an den NIH beschriebene Polymorphismus C3223T (T1010I) in
Exon 15 wurde in dieser Studie bei keiner Patientenprobe gefunden und scheint einen eher
seltenen Polymorphismus darzustellen, oder kommt in der geographischen Region dieser
Arbeit nicht vor.
In dieser Arbeit konnten in mehreren Exons verschiedene Muster von aberrierenden Banden
gesehen werden. Das hier gefundene Bandenmuster spricht aufgrund des typischen Auftretens
der drei Muster A, B oder AB für einen häufigen Polymorphismus. Diese Befunde wurden
durch mehrere Sequenzierungen bestätigt, es konnten in den jeweiligen Exons entsprechende
Polymorphismen nachgewiesen werden.
In der vorliegenden Arbeit wies ein Patient mit einem sporadischen papillären
Nierenkarzinom eine Veränderung im c-MET Proto-Onkogen auf, die bei den anderen
Patienten nicht gesehen werden konnte. Es handelt sich hierbei um einen seltenen
Polymorphismus im telomeren Drittel des Exons 2 an Position 698 mit einem
Nukleotidaustausch von G nach T und einem daraus resultierenden Aminosäurenaustausch
von Serin zu Isoleucin. Da dieser Nukleotidaustausch bei der Untersuchung von 100 KontrollPatientenproben ebenfalls bei 8 Proben auftrat, muss ebenfalls von einem Polymorphismus
und nicht von einer pathogenen Mutation ausgegangen werden.
71
5
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das papilläre Nierenkarzinom ist nach dem klarzelligen Nierenkarzinom der zweithäufigste
maligne Nierentumor. Das papilläre Nierenkarzinom kommt fast ausschließlich sporadisch
vor. 1994 wurde als neue Entität das Familiäre Papilläre Nierenkarzinom publiziert und der
zugrunde liegende Gendefekt wurde auf dem langen Arm des Chromosom 7 im Bereich von
7q31.1-34 lokalisiert, im c-MET Proto-Onkogen. Die 15 bisher identifizierten Mutationen
sind alle vom Missense-Typ und beschränken sich auf die Tyrosin-Kinase Domäne des METGens in den Exons 16, 17, 18 und 19, wobei bei den vorangegangenen Studien nicht alle
Exons untersucht worden sind. Die beschriebenen Mutationen fanden sich sowohl in
peripheren Lymphozyten als konstitutionelle Mutationen, sowie im Tumorgewebe als
somatische Mutationen. Bei den familiären Fällen traten konstitutionelle Mutationen häufiger
auf (86%) als bei den sporadischen Fällen (13%), wobei auch der Anteil an somatischen
Mutationen im MET- Gen insgesamt bei den sporadischen Fällen als gering eingeschätzt wird.
Um die Bedeutung von Mutationen im MET- Gen für die Genese der papillären
Nierenkarzinome
zu
evaluieren
und
um
die
Sensitivität
der
verwendeten
molekulargenetischen Diagnostik zu überprüfen, wurde in dieser Arbeit ein Kollektiv von 60
Patienten hinsichtlich Mutationen in den Exons 2 und 4 bis 21 des MET- Gens untersucht. Die
Analyse der Positivkontrollen ergab in 9 von 10 Fällen (90%) den Mutationsnachweis. Bei
der molekulargenetischen Analyse der 58 als sporadisch klassifizierten Fälle und der beiden
Patienten mit schon bekannten somatischen Mutationen im MET- Gen, konnte in keinem Fall
eine weiteren konstitutionelle Mutationen identifiziert werden. In Exon 2 konnte der bisher
nicht beschriebene Polymorphismus G698T nachgewiesen werden. Anhand der gewonnenen
Daten lässt sich das seltene Auftreten von konstitutionellen Mutationen im c-MET ProtoOnkogen bei sporadischen papillären Nierenkarzinomen bestätigen. Die Evaluierung der
Patientendaten und der Familienanamnese zeigte jedoch die Schwierigkeit der eindeutigen
klinischen Zuordnung von sporadischen und familiären Fällen. Die SSCP- Analyse als
angewendetes Diagnostikverfahren lässt sich aufgrund der guten Sensitivität empfehlen. Bei
eindeutig familiären papillären Nierenkarzinomen ist aufgrund der Ergebnisse früherer
Studien mit Sicherheit eine genetische Diagnostik mittels der SSCP- Analyse zu befürworten,
da hieraus frühzeitige Möglichkeiten therapeutischer Intervention resultieren. Bei Patienten
mit nur vager positiver Familienanamnese ist eine molekulargenetische Untersuchung
abzuwägen.
72
6
Anhang
Anhang
Im Labor N5 von Prof. Dr. H.P.H. Neumann werden weiterhin Patienten mit papillären
Nierenkarzinomen hinsichtlich Mutationen im c- MET Proto–Onkogen untersucht. Die
nachfolgende Tabelle (Tabelle 6.1) gibt eine Übersicht über alle bisher gefundenen
Mutationen in diesem Patientengut.
DNA-Nr.:
Exon
Nukleotid
Mutation
Codon
1291
11
2739
T2739C
F849L
2557
16
3529
A3529G
H1112R
2437
16
3529
A3529G
H1112R
6012
17
3603
G3603A
G1137R
6069
18
3879
A3879G
M1229R
2871
19
3936
T3936G
Y1248D
Tabelle 6.1: Übersicht aller bisher gefundenen Mutationen aus der Arbeitsgruppe von
Prof. Dr. H.P.H. Neumann
73
7
Abkürzungen
Arg
Arginin
Asn
Asparagin
Asp
Asparaginsäure
ATP
Adenosintriphosphat
bp
Basenpaare
C
Kohlenstoff
Cys
Cystein
ddH2O
Aqua bidest
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleosid – 5`- Triphosphat
EDTA
Ethylen- Diamine Tetra Acetate
His
Histidin
HGF
Hepatocyte growth factor
Ile
Isoleucin
Leu
Leucin
m
Milli (10-3)
M
Molar
Met
Methionin
MRT
Magnetresonanztomogramm
N
Stickstoff
nt
Nukleotid
μ
Mikro (10-6)
PCR
Polymerasekettenreaktion
RCC
Renal cell carcinoma (Nierenzellkarzinom)
PRCC
Papillary renal cell carcinoma (Papilläres
Nierenzellkarzinom)
SSCP
Single Strand conformation Polymorphism
TNM
Tumor Nodes Metastasis
Taq
Thermus aquaticus
Thr
Thryptophan
Tyr
UTR
Tyrosin
Untranslated Region
Val
Valin
Abkürzungen
74
8
Literaturverzeichnis
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84
9
Lebenslauf
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Susanne Munk-Schulenburg
Geburtsname:
Schulenburg
Geburtsdatum:
24.11.1972
Geburtsort:
Nordenham
Schulausbildung
Pestalozzi Grundschule, Freiburg
1979 – 1982
Johannes – Schwartz Grundschule, Freiburg
1982 – 1983
Wentzinger Gymnasium, Freiburg
1983 – 1993
Abitur
1993
Freiwilliges Soziales Jahr
Johanniter – Unfall – Hilfe, Freiburg
1993 – 1994
Studium der Humanmedizin
1994, Universität Freiburg
Ärztliche Vorprüfung
1997
1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
1998
2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2000
Praktisches Jahr
Städtisches Klinikum Karlsruhe
2000/ 2001
3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2001
ÄiP in der Orthopädischen Chirurgie
Januar 2002 – Juni 2002
Loretto-Krankenhaus Freiburg
ÄiP in der Inneren Medizin des
August 2002 – Januar 2003
Diakoniekrankenhaus Freiburg
ÄiP in der Humangenetik
Februar 2003 – Juli 2003
Assistenzärztin in der Humangenetik
August 2003 – April 2005
Institut für Humangenetik und Anthropologie der
Universität Freiburg, PD Dr. Kohlhase
85
10
Danksagung
Danksagung
Ich bedanke mich sehr herzlich bei Herrn Prof. Dr. med. Hartmut P. H. Neumann für die
Überlassung des Themas und die großzügige Unterstützung. Das von Prof. Neumann in den
Jahren 1984- 1994 erstellte Register und die gesammelten Blutproben der Patienten stellte
eine wichtige Grundlage dieser Arbeit dar, ohne die dieses Patientenkollektiv nicht in diesem
Rahmen möglich gewesen wäre.
Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Dr. Apel für die ausgezeichnete Einarbeitung und
die große Unterstützung im Labor bedanken, sowie für die vielen Anregungen bei der
Verfassung dieser Arbeit. Ich fand immer kompetente Hilfe und viel Geduld bei ihm.
Außerdem bedanke ich mich bei Herrn Dr. Bender für die Beantwortung meiner zahlreicher
Fragen.
Mein ganz besonderer Dank ist an meine Großmutter Frau Anna Nowara und meine
Pateneltern Christine und Andreas Miedniak gerichtet, die mich während meines Studiums
finanziell und moralisch unterstützt haben.