"Bioaffinitätsanreicherung als neues Verfahren zum
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Bioaffinitätsanreicherung als neues Verfahren zum Nachweis von lebensmittelrelevanten Mikroorganismen (AiF 331 ZN) FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Ausgangssituation FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Ausgangssituation Lebensmittel Milch Warnwert in Milch und Milchprodukten Molke ((EG) Nr. 2073/2005, (EG) Nr. 1441/2007) Mikroorganismen Bacillus cereus (Sporen) 100 KBE/g Staphylococcus aureus 500 KBE/g Nachweis bisher Nachteil Routineanalytik: Inkubation in Selektivmedium zeitintensiv: Ergebnisse nach 24-144h FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Biosensoren in der Lebensmittelproduktion - Potential • Einfache und schnelle Detektion relevanter MO DNT • Berücksichtigung produktspezifischer Besonderheiten und Prozessabläufe SMA SDA Streptomycin Cloxacillin • Prozessintegration und Prozesskontrolle Ampicillin • Minimierung störender Effekte Cefapirin • Plausibilitätsüberprüfung Penicillin G Neomycin B Gentamicin Erythromycin A Tylosin • Miniaturisierung Norfloxacin Tetracyclin • Minimierung des analytisches Aufwandes DNT Ersatz zeitintensiver und kostenaufwändiger Laboranalysen durch ein einheitliches System FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Grundlagen FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen 5 Direkter Nachweis von S. aureus und B. cereus Bioaffinitätsanreicherung Probe (Milch/Molke) Sensor S. aureus B. cereus (Sporen) Zulauf Probe Zulauf Probe Zulauf Spüllösung ng Zulauf Probe Zulauf Spüllösung immobilisierte Rezeptoren ktion 1000 ml Detektion Abfall 1 ml Detektion Abfall Abfall 105-106/ml 102-103/ml FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Prinzip vegetative Formen Monolithische Säule Liganden: Antikörper, Aptamere ≈ 1 mL Bacillus cereus (Verderbsindikator) Sporen Staphylococcus aureus (Hygieneindikator) in 1l Milch FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Prinzip der monolithischen Affinitätschromatographie monolithische Säule Bindung Eluation untersuchte Matrix Analyt Durchfluss Eluat FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Geometrien Anreicherungsprinzip MO Durchströmung mit Probefluid Fängermolekül Porenwand FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Durchströmung mit Eluationslösung Arbeitsschwerpunkte und Vernetzung • FS 1, LMU München Monokl. Antikörper Rezeptoren FS 2, Universität Hamburg DNA-Aptamere – Charakterisierung • Bioaffinitätsanreicherung Biofunktionalisierung – Simulationen • Größe, Geometrie, Zeit Bioaffinitätsanreicherung – Automatisierung • Kartuschensystem – Charakterisierung • Detektion Sensor – Sensoroptimierung – Auswertung • FS 4, TU München Monolithischer Sensor FS 3, Universität Erlangen Mikrofluidik Automatisierung Anwendung – Milch/Molke – Keimverteilung • Inhomogen, Fett • Validierung Mikrobiologische Validierung FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Numerische Simulationen 2D FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen 11 Digitalisierung 4,5 mm 1 mm micro-CT image (jpg) 9 mm binäre Darstellung nach Schwellwertauswertung Säule FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Definitionen - Formeln Reynoldszahl Darcy´s Gesetz = Permeabilität U = Geschwindigkeit = dynamische Viskosität p = Porengröße Q = Flussrate = Kinematische Viskosität A = Fläche P = Druck L = Länge Porosität () = Leervolumen Gesamtvolumen FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Zusammenhang Druck – Flussrate FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Optimierung der Geometrie untersuchte Alternativen poröses Medium FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Modellierung Modellierung eines porösen Mediums 4 mm 0.1 mm Fall B CFX Ansys 12.0 Fall A Porosität Permeabilität = 60 - 80% = 1.5 - 3.7x10-13 m2 FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Druck, Geschwindigkeit und Stromlinien Rezirkulationsströmung Wasser 1 ml/min = 80% = 3.7x10-13 10 ml/min m2 FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Druck, Geschwindigkeit und Stromlinien = 80% 5 ml/min = 3.7x10-13 m2 FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen = 60% Die Lattice Boltzmann Methode einfache Implementierung von Randbedingungen hoch parallelisierbar geeignet für komplexe Geometrien – poröse Medien Lattice Boltzmann Gleichung FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen 19 Simulationsmethoden 2D Lattice-Boltzmann Methode Fluid zentrale XY-Ebene 4.5 mm = 60% FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Simulierte Alternativen Ziel: gleichmäßige Verteilung der Strömung über die Querschnittsfläche der Säule Maßnahme: unterschiedliche Form der Oberfläche des Einlaufs (alle anderen Parameter unverändert) Einlauf Einlauf FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Einlauf Druckverteilung Druck [bar] 1 ml/min t = 0.5 s FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Geschwindigkeit Einlauf: eben nach unten offen Flussrate: 1 ml/min Zeit: 0,5 s FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Numerische Simulationen 3D FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen 24 Rekonstruktion der Geometrie Porengröße 20 µm ± 4 Porosität 60% Q = 1ml/min FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Druck – Einfluss der Spalthöhe hi Spalthöhe h0 < h1 < h2 0 < 0,5mm < 1,75mm FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Druck – Einfluss der Oberflächenform h1 FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Druck – Einfluss der Oberflächenform h1 FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Geschwindigkeit – Einfluss der Oberflächenform inhomogene Geschwindigkeitsverteilung FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Zusammenfassung – Ausblick • 2D- und 3D-Simulationen von Säulen mit • variabler Spalthöhe zwischen Fluidaufgabe und Säulenoberfläche • unterschiedlichen Oberflächenformen • Parameter beeinflussen • Druckverteilung über die Säulenhöhe • absolute Höhe der Geschwindigkeit • Geschwindigkeitsverteilung über den Säulenquerschnitt • Bewertung der Ergebnisse notwendig • Integration von Mikroorganismen - Bioaffinität FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! FEI-Jahrestagung 2011, 6.-7.09.2011, Erlangen
