„HIV spezifische Immunität und virale Fluchtmechanismen“

HIV spezifische Immunität und virale
Fluchtmechanismen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
Vorgelegt
von
Katja Maurer
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 01.10.2008
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Winkler
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Harrer
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
8
1.1
Pathogenese der HIV Infektion
8
1.2
Das HIV-1 Genom und der virale Replikationszyklus
9
1.3
Das Nef Protein
11
1.4
HIV-1 Tropismus
13
1.5
Faktoren die den HIV Krankheitsverlauf beeinflussen
13
1.5.1
HLA-Allele
14
1.5.2
HIV spezifische T-Zellantwort und Entwicklung von Fluchtmutanten
16
1.5.3
Chemokinrezeptordefekt Δ CCR 5
17
1.5.4
Apobec3G
18
1.5.5
Neutralisierende Antikörper
18
1.6
Antivirale Therapie
19
2
Zielsetzung
21
2.1
Analyse von Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
21
2.2
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren bei
einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion durch
das gleiche Virus
2.3
21
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M
2.4
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast bei
Patient F
2.5
22
22
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte
T-Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
22
3
Material, Methoden und Patienten
24
3.1
Verbrauchsmaterial
24
3.2
Laborgeräte
25
3.3
Reagenzien und Lösungen
26
3.4
Zellkulturmedien und Zusätze
28
3.5
Kommerziell erhältliche Kits
29
3.6
Enzyme
30
3.7
Antikörper
30
III
Inhaltsverzeichnis
3.8
Vektoren und Zusätze
31
3.9
Bakterien, Zellen und Zelllinien
31
3.10
Oligonukleotidprimer
32
3.11
DNA bzw. RNA Extraktion und Reverse Transkription
35
3.12
Polymerasekettenreaktion (PCR)
35
3.13
DNA-Gelelektrophorese
37
3.14
Sequenzierung
37
3.15
Klonierungsmethoden
38
3.16
RNA Herstellungsverfahren und Elektroporation
38
3.17
Zellkulturverfahren
40
3.18
Zellseparierung und Bestimmung der Zellzahl
41
3.19
HLA-Typisierung
42
3.20
Herstellung von Peptiden
42
3.21
Chrom-Freisetzungs-Versuch
42
3.21
γ-IFN-ELISPOT
43
3.22
Virusstock-Herstellungsverfahren und Infektion von Zellen
44
3.23
Durchflußzytometrie (FACS-Analyse)
46
3.24
Statistische Analyse
47
3.25
Patienten
48
4
Ergebnisse
49
4.1
Analyse von Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
49
4.1.1
Langzeitanalyse der HLA-B8-positiven Patientin 01
49
4.1.2
Analyse der CTL Erkennung von autologen viralen Varianten der Patientin 01
53
4.1.3
Korrelation von HLA-B8 mit Mutationen innerhalb des FL8 Epitopes bei
HIV-1 infizierten Patienten
4.1.4
54
Die CTL Antwort in HLA-B8-positiven Patienten auf das FL8 Wildtyp Epitop
und seine jeweiligen Varianten
4.1.5
56
Korrelation zwischen CD4 Zellzahl und Viruslast mit HLA-B8 und den damit
assoziierten Mutationen
4.2
58
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren bei
einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion durch
das gleiche Virus
60
IV
Inhaltsverzeichnis
4.2.1
Klinische Daten der Patienten U und R
4.2.2
Virologische Untersuchungen zur Detektion der HI-Viren der Patientin U
60
61
4.2.3
Sequenzvergleich auf Aminosäureebene verschiedener Regionen der HI-Viren
beider Patienten
4.2.4
61
Prüfung einer Beteiligung von Apobec3G auf die Mutationsrate der Viren in der
Patientin U
4.2.5
64
Prüfung auf das Vorhandensein von anderen hypermutierenden Genen in der
Patientin U
4.2.6
65
Prüfung auf das Vorhandensein eines genetischen Polymorphismus in den
Wirtsfaktoren Apobec3G und CCR5 der Patienten U und R
4.2.7
66
Prüfung von CD8-depletierten PBMC der Patientin U auf Infektionsfähigkeit
mit verschieden tropen HIV-1 Stämmen und deren Replikationskinetik in
diesen Zellen.
4.2.8
69
Prüfung der Zellkulturüberstände von PHA-Blasten der Patientin U auf antivirale
Eigenschaften bei Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
4.2.9
70
Prüfung des Serums der Patientin U auf neutralisierende Eigenschaften
bei Infektion mit den Laborstämmen NL4-3 und 89.6
71
4.2.10 Analyse der neutralisierenden Aktivität des Serums der Patientin U
72
4.2.11 Analyse der HIV-1 spezifischen CTL Erkennung in den Patienten U und R
74
4.2.12 Analyse der HIV-1 spezifischen CTL Antwort der Patientin U gegen das
autologe HIV-1 Nef Protein
77
4.2.13 Analyse der fünf Aminosäure langen Deletion im C-terminalen Bereich von
Nef mittels Klonierung und Sequenzvergleich auf Aminosäureebene
78
4.2.14 Analyse der HIV-1 spezifischen CTL Antwort der Patientin U gegen die
synthetisch hergestellten Peptide, die den Bereich der fünf Aminosäure
langen Deletion in Nef eingrenzen
81
4.2.15 Restriktionsanalyse der Peptide PEGEENSCLL und VTSRENSCLL für
die HLA-Allele der Patientin U
82
4.2.16 Funktionelle Analysen der autologen nef Gene der Patienten U und R
4.3
84
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M
V
86
Inhaltsverzeichnis
4.3.1
Klinischer Verlauf des HLA-B13-positiven Patienten M
4.3.2
Einfluss der Immunsupprimierung durch die Einnahme von Steroiden auf die
Entwicklung von CTL Fluchtmutanten in dem Patienten M
4.3.3
88
Analyse der L-zu-M Mutation in dem Nef B13 restringierten Epitop
RQDILDLWV auf die CTL Erkennung in dem Patienten M
4.4
86
91
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast
bei Patient F
92
4.4.1
Klinischer Verlauf des HLA-B27-positiven Patienten F
92
4.4.2
Prüfung der Aminosäuresequenzen verschiedener Regionen in HIV-1
des Patienten F auf das Vorhandensein von Substitutionen in funktionell
wichtigen Domänen
93
4.4.3
Funktionelle Analysen des autologen nef Genes des Patienten F
94
4.5
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte
T-Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
95
5
Diskussion
98
5.1
Analyse von Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
98
5.2
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren
bei einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion
durch das gleiche Virus
5.3
101
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M
5.4
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast
bei Patient F
5.5
107
109
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte
T-Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
111
6
Zusammenfassung
112
6.1
Analyse von CTL Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
112
6.2
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren
bei einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion
durch das gleiche Virus
6.3
113
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M
VI
114
Inhaltsverzeichnis
6.4
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast
bei Patient F
6.5
115
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte
T-Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
115
7
Summary
117
7.1
Analyses of CTL escape mutations in HLA-B8-positive patients
117
7.2
Analyses of genetic, immunological and virological factors in a patient couple
with divergent course of the HIV-1 infection despite infection with the same
virus
7.3
117
Treatment with steroids led to a loss of the so far good control of HIV-1
viremia in Patient M
119
7.4
Preservation of normal CD4 counts despite high viral load in Patient F
119
7.5
Analysis of the lytic ability of TCR-RNA electroporated T-cells and
the influence on the infection with lab strain NL4-3
120
8
Literaturverzeichnis
121
9
Abkürzungsverzeichnis
10
Anhang
134
11
Publikationen, Konferenzbeiträge und Auszeichnungen
136
12
Lebenslauf
138
13
Danksagung
139
131
VII
Einleitung
1
Einleitung
1.1
Pathogenese der HIV Infektion
Die Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) bzw. das damit assoziierte
Krankheitsbild AIDS (engl.: Acquired Immuno-Deficiency Syndrom) wurde erstmals im
Jahre 1981 beschrieben (Gottlieb et al., 1981). Es ist durch das Auftreten von persistierenden
und rezidivierenden Infektionen mit opportunistischen Pathogenen und einer starken
Abnahme der Anzahl an CD4+ T-Lymphozyten gekennzeichnet. Neben diesen Symptomen
zählt das Auftreten von malignen Tumoren, wie Lymphomen oder das Karposi Sarkom, zu
den Manifestationen der Krankheit AIDS. Erste Hinweise darauf, dass ein Retrovirus die
Ursache der Immunschwäche sein könnte, lieferten Luc Montagnier und Mitarbeiter vom
Pasteur Institut in Paris (Barre-Sinoussi et al., 1983). Das Virus wurde zunächst als
Lymphadenopathi-assoziiertes Retrovirus (LAV) oder humanes T-Zell Leukämie Virus Typ
III (HTLV-III) bezeichnet und konnte im Jahre 1986 eindeutig den Lentiviren zugeordnet
werden. Seither wird es als humanes Immunschwächevirus Typ 1 (human immunodeficiency
virus type 1), HIV-1, bezeichnet (Coffin et al., 1986). Im gleichen Jahr konnte ein weiteres
Virus aus AIDS Patienten isoliert werden, das 40 % Homologie zu HIV-1 aufweist und als
HIV-2 bezeichnet wird (Clavel et al., 1986; Kanki et al., 1986). HIV-2 ist in West-Afrika
endemisch und inzwischen auch in Indien verbreitet. Es ruft ein AIDS-ähnliches
Krankheitsbild hervor, zeigt aber im Vergleich zu HIV-1 eine abgeschwächte Virulenz.
Heute unterscheidet man drei Hauptgruppen bei HIV-1 von denen weltweit vor allem die
Viren der M-(major-) Gruppe des HIV-1 verbreitet sind. Die größte Bedeutung in den
Industrienationen hat der Subtyp B (Holmes, 2001). In den folgenden Jahren wurden
verwandte Retroviren auch bei einigen Affenspezies gefunden und analog zu HIV als Simian
Immundefizienz Viren (SIV) benannt (Peeters et al., 1989; Vanden Haesevelde et al., 1996;
Allan et al., 1991).Die Übertragung des Virus erfolgt sexuell, parenteral durch kontaminierte
Blutprodukte oder kontaminierte Nadeln von Drogenabhängigen, und vertikal während der
Schwangerschaft (Modrow & Falke, 1998). Die akute Infektion mit HIV hat eine
unspezifische Symptomatik und nach dem kurzen Stadium der initialen Virämie, geht die
Zahl der Viren im Blut des Infizierten zunächst wieder zurück. Die folgende Latenzzeit
dauert in der Regel mehrere Jahre und wird von einem langsamen, aber steten Absinken der
Anzahl der CD4+ T-Lymphozyten begleitet.
8
Einleitung
Sinkt die CD4 Zahl unter einen bestimmten Schwellenwert (unter 200 Zellen/µl), kommt es
meist zum Auftreten des Krankheitsbildes AIDS (Coffin et al., 1997). Die HIV Erkrankung
wird nach der gängigen CDC-Klassifikation in die drei klinischen Kategorien A
(asymptomatisches Stadium der Infektion), B (symptomatische Patienten ohne AIDS) und C
(Patienten mit AIDS) und in die drei CD4 Zellzahlbereiche 1 (>500 CD4-Zellen/µl), 2 (200499 CD4-Zellen/µl), und 3 (<200 CD4-Zellen/µl) eingeteilt (Castro et al., 1992).
1.2
Das HIV-1 Genom und der virale Replikationszyklus
Abb. 1: Aufbau und Struktur eines
HI-Virons.
(http://www.niaid.nih.gov).
Detaillierte Beschreibung im Text.
Das HIV-1 Genom liegt als etwa 9.000 Basenpaar großes, plus-orientiertes, einzelsträngiges
RNA Molekül in zwei Kopien im Viruskapsid vor. Dieses Genom besteht aus neun Genen,
die von langen terminalen Wiederholungen (long terminal repeats, LTRs) eingerahmt
werden. Die LTRs werden für die Integration des Provirus in die DNA der Wirtszelle
benötigt. HIV besitzt wie alle anderen Retroviren auch die drei Hauptgene gag, pol, env.
Das gag-Gen kodiert die Strukturproteine für das Kernstück des Virus. Das pol-Gen trägt
die Information für die Enzyme der Virusduplikation und –Integration. Das env Gen kodiert
die Information für die Glykoproteine der Virushülle. Die übrigen sechs Gene (tat, rev, vif,
vpr, vpu und nef) kodieren Proteine, die Replikation und Infektion des Virus beeinflussen.
Ein zellulärer Transkriptionsfaktor, der in allen aktivierten T-Zellen vorhanden ist,
stimuliert die Bildung von Viruspartikeln aus dem integrierten HIV-Provirus. Die viralen
Gene tat und rev kodieren für die Proteine Tat und Rev. Tat amplifiziert die Transkription
der viralen RNA. Rev erhöht den Transport viraler RNA in das Zytoplasma.
9
Einleitung
Nach der Zusammensetzung der HI-Viren erfolgt die Freisetzung der Viren aus dem
Zytoplasma (Übersichtsartikel Frankel & Young, 1998). Die Infektion einer Zelle beginnt
mit der Adsorption eines Viruspartikels. HIV nutzt dazu in der Regel das CD4-Protein, das
auf der Oberfläche von T-Helferzellen, Makrophagen und Monozyten exprimiert wird und
dort
mit
dem
T-Zellrezeptor
an
MHC-Klasse-II-Proteine
bindet.
Der
virale
Bindungspartner, das Gag-gp120-Protein, liegt funktionell als trimerer Komplex vor. Durch
die Bindung des Viruspartikels erfolgt eine Konformationsänderung im gp120, wodurch die
Wechselwirkung eines nun freigelegten Bereiches, des V3-Loops, mit einem der beiden
Chemokinrezeptoren CCR5 und CXCR4 ermöglicht wird. Erst durch eine zweite
Umlagerung im Env Protein, bei welcher der fusogene Bereich von Env gp41 freigelegt
wird, erfolgt die Fusion von Virus- und Zellmembran. Durch die Fusion der Viren mit der
Zellmembran gelangt das Viruskapsid ins Zytoplasma, wo es den Präintegrationskomplex
freisetzt. Dieser Komplex besteht aus dem viralen RNA Genom, den Enzymen Reverser
Transkriptase (RT) und Integrase (IN), sowie dem Matrix Protein (MA) und dem Viralen
Protein Rapid (Vpr). Dieser ist für die Bildung der doppelsträngigen Provirus DNA durch
reverse Transkription verantwortlich. Der Komplex wandert in den Zellkern wo die
provirale DNA durch die Integrase ins Wirtsgenom eingebaut wird (Schroder et al., 2002).
Bei der Expression der viralen Gene kann eine frühe und eine späte Phase unterschieden
werden. Zunächst gelangen nur mehrfach gespleißte mRNAs aus dem Zellkern in das
Zytoplasma, wodurch die regulatorischen Proteine Tat und Rev gebildet werden. Rev ist in
der folgenden Phase für den Export von ungespleißten und einfach gespleißten mRNAs
sowie der genomischen RNA zuständig. Im Zytoplasma folgt nun die Translation der
Strukturproteine und der viralen Enzyme. Das Env Protein gelangt während der Translation
mittels einer N-terminalen Signalsequenz in das Endoplasmatische Retikulum, wo
Glykosylierung und Oligomerisierung stattfinden. Anschließend erfolgt der Transport über
den Golgi-Apparat zur Zellmembran, wo sich die einzelnen Virus-Bestandteile
zusammenfinden und sich unreife Partikel abschnüren. Für die Inkorporation des viralen
Genoms
ist
eine
Interaktion
zwischen
Verpackungssignal
und
Gag-Polyprotein
verantwortlich. Bei der Reifung des abgeschnürten Partikels kommt es zur Spaltung des
Gag- sowie des Polyproteins durch die virale Protease (Frankel und Young, 1998).
10
Einleitung
1.3
Das Nef Protein
Das nef Gen von HIV-1 schließt sich an den Env-Leserahmen an und überlappt dabei zum
Teil die U3-Region des 3`LTRs (Long Terminal Repeats). Da das Nef Protein N-terminal
myristyliert wird, assoziiert es größtenteils mit den Membranen der Wirtszelle (Franchini et
al., 1986). Im Viron kommt Nef nur in einer N-terminal verkürzten Form vor. Zwischen der
Position W und L (As 57 und 589) verfügt Nef über eine Schnittstelle für die virale
Protease, die Nef in eine Anker und eine Kerndomäne spaltet (Freund et al., 1994).
Zahlreiche in-vivo-Studien belegen, dass das nef Gen des HI-Virus für dessen Pathogenität
von entscheidender Bedeutung ist. So verursachen nef deletierte Viren in Rhesusaffen einen
stark abgeschwächten Krankheitsverlauf, der mit einer verminderten Viruslast einhergeht
(Kestler et al., 1991). Die Sequenzanalyse der Virusisolate langzeitüberlebender HIVPatienten (LTNP) zeigte zudem große Deletionen im nef Leserahmen (Kirchhoff et al.,
1995). Zu den bislang anerkannten in-vitro Funktionen des Nef Proteins zählen die
Herunterregulierung von Zelloberflächenrezeptoren (Garcia and Miller, 1991; Schwartz et
al., 1996), die Modulation zellulärer Signaltransduktion (Fackler et al., 1999; Xu et al.,
1999) und die Steigerung der viralen Infektiosität (Aiken and Trono, 1995; Schwartz et al.,
1995).
Es
konnte
gezeigt
werden
das
Nef
für
die
Herunterregulierung
der
Zelloberflächenrezeptoren mit entscheidenden Proteinen der Endozytosemaschinerie wie
AP 1, 2 und 3, oder der Untereinheit H der vakuolaeren Membran ATPase interagiert und
dadurch den Transport zur und von der Plasmamembran beeinflusst (Lu et al., 1998; Geyer
et al, 2002; Jin et al., 2005). Insbesondere die effektive Präsenz von Oberflächenrezeptoren,
wie CD4 oder auch MHC-I, wird hierdurch gestört. Bei der Internalisierung von MHCKlasse-I spielt das Phosphofurin Acidic Cluster Sorting Protein-1 (PACS-1), das den GolgiEndosomen-Transport kontrolliert, eine entscheidende Rolle. Durch Bindung von Nef an
dieses Protein, wird letzen Endes der vesikuläre Transport von MHC-I gestört (Bauer et al.,
1997; Williams et al., 2002). Auch das für die Antigenpräsentation im HLA-Klasse-II-Weg
wichtige Protein CD74 (Invariante Kette der MHC-Klasse-I I), die für die T-Zellaktivierung
wichtigen Oberflächenrezeptor CD28 (Rezeptor CD80), und CD3 (Co-Rezeptor des TZellrezeptor Komplexes), sowie die für die Infektion wichtigen Chemokinrezeptoren
CXCR4 und CCR5, werden durch Nef moduliert (Hrecka et al., 2005; Michel et al., 2005;
Schindler et al, 2003). Durch die Internalisierung dieser Immunrezeptoren kann Nef vor
11
Einleitung
allem die Antigenpräsentation gegenüber CD8+ T-Zellen und natürlichen Killerzellen
verhindern, die einer aufkommenden Virämie initial entgegen wirken. Die Kontrolle des
programmierten Zelltodes (Apoptose) ist ein weiterer wichtiger Mechanismus von Nef, um
HIV vor der zellulären Immunantwort zu schützen. Nef induziert die Expression der beiden
entscheidenden Signalen Fas (CD95) und Fas Ligand (CD95L) und löst zum einen die
Apoptose von CTLs aus, die mit der infizierten Zelle interagieren, und zum anderen wird
die Apoptose der infizierten Zelle selbst unterbunden (Dianzani et al., 2003; Olivetta and
Federico 2006;). Es konnte gezeigt werden, dass die Nef Allele der meisten Primaten
Lentiviren (inklusive HIV-2), die Expression des TCR-CD3 in infizierten Zellen
herunterregulieren. Die Zellen werden dadurch weniger aktiviert und somit dem durch
Aktivierung induzierten Zelltod weniger ausgesetzt (Schindler et al., 2006).
Die Beteiligung an der Signaltransduktion innerhalb der Zelle ist die zweite wichtige
Funktion, die Nef im HIV-Replikationszyklus übernimmt. Es interagiert mit Proteinen der
Signaltransduktion und aktiviert oder inhibiert dadurch nachgeschaltete Signalkaskaden in
der T-Zelle (Baur et al., 1997; Schrager und Marsh, 1999; Wang et al., 2000). Der
hauptsächlich davon betroffene Signalweg ist der des TCR Komplexes, der nach exogener
Stimulation die T-Zelle aktiviert. Nef beeinflusst diesen Signalweg, indem es die Cterminale SH3-Domäne des Guanin Nukleotidaustauschfaktors Vav über sein PxxP-Motiv
bindet und anschließend verschiedene GTPasen aktiviert (Fackler et al., 1999). Diese sind
wiederum für die Aktivierung von Nef-assoziierten Kinasen wie PAK 1 / 2 wichtig, die eine
Umlagerung des Cytoskeletts hervorrufen und die JNK/SAPK-Signaltransduktionskaskade
induzieren (Renkema et al., 1999, Fackler et al., 1997). Diese Umlagerung ist ein Zeichen
für den Übergang der Zelle in einen aktiven Zustand, der die Grundlage für eine optimale
Virusreplikation bietet. Durch die angeschaltete JNK/SAPK-Kaskade wird letztendlich die
Transkriptionsleistung der HIV Gene gesteigert (Aiken et al., 1995). Das „RR“ Motiv (As
105 und 106) stellt unter anderem eine essentielle Grundlage für die SignaltransduktionsFunktion von Nef dar. Ein Aminosäureaustausch zu Leuzin an diesen Positionen, verhindert
die durch Nef induzierte Aktivierung von PAK (Renkema et al., 1999; Fackler et al., 2000;
Review Geyer et al., 2001). Desweiteren reguliert Nef die Transkriptionsfaktoren Nuclear
Factor of activated T-cells (NFAT) und Nuclear Factor κ B (NF-κB), die auch die
Expression des wichtigen Zytokins Interleukin-2 (IL-2) kontrollieren (Fenard et al., 2005).
Exogenes IL-2 induziert die klonale Expansion der T-Zellen und steigert damit deren
Biosyntheseleistung.
12
Einleitung
Die Erhöhung der viralen Infektiosität durch Nef konnte unter anderem durch
Deletionsversuche im nef Gen gezeigt werden (Chowers et al., 1994). Spina et al., (1994)
konnte in vivo zeigen, dass ein Defekt im nef Gen dazu führt, dass die Replikationsrate und
Viruslast von HIV zurückgehen. Ein positiver Effekt von Nef auf die Freisetzung der
Virionen konnte bereits 1993 von Benson gezeigt werden. Weiterhin wurde berichtet, dass
Nef die Effizienz der Reversen Transkription erhöht (Schwartz et al., 1995)
1.4
Je
HIV-1 Tropismus
nach
Tropismus
der
einzelnen
HIV-Stämme
werden
unterschiedliche
Chemokinrezeptoren als Liganden genutzt. Non-Syncytium-Inducing (NSI), M-tropische
HIV-1 Stämme, werden vor allem durch Sexualkontakt übertragen. Sie dominieren
hauptsächlich im frühen Krankheitsverlauf, infizieren primäre Makrophagen und
Lymphozyten und binden an den Corezeptor CCR5. Syncytium Inducing (SI), meist
parenteral übertragene T-tropische Stämme, treten in späteren Krankheitsstadien vermehrt
auf, infizieren transformierte CD4+ T-Zelllinien und primäre Lymphozyten und binden an
Liganden wie CXCR4, CCR 2b, CCR 3 (Moore et al., 1997; Choe et al., 1996; Zhang et al.
1997). Dual-trope Stämme besitzen die Eigenschaften von M-tropen und T-tropen HIV-1
Stämmen und können somit durch die Bindung an die verschiedenen Liganden, eine
Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen infizieren. Sie treten vorwiegend im Spätstadium der
Erkrankung auf. Das Virus kann während des Krankheitsverlaufes durch geringe
Mutationen in seiner Aminosäuresequenz seinen Tropismus wechseln was es ihm
ermöglicht ein größeres Spektrum von Zielzellen zu befallen. In etwa einem Prozent der
kaukasischen Bevölkerung konnte ein homozygot vererbter Rezeptordefekt für den
Chemokinrezeptor 5 festgestellt werden (Samson et al., 1996) und circa 14 % der Kaukasier
sind im Hinblick auf diesen Defekt heterozygot (Sabeti et al., 2005).
1.5
Faktoren die den HIV Krankheitsverlauf beeinflussen
Verschiedene Faktoren können sowohl die Suszeptibilität und Resistenz gegen die HIV-1
Infektion, als auch die Geschwindigkeit der Krankheitsprogression beeinflussen. Zu diesen
gehören sowohl die Fitness des infizierenden Virus, als auch genetische Faktoren und die
Immunantwort des Wirts. Wichtige Grundlagen für die Analyse solcher Faktoren stellen
unter anderem die Gruppe der Langzeit Nichtprogressoren (LTNP) dar. Diese Individuen
sind mit HIV-1 infiziert und zeigen über einen Zeitraum von über 12 Jahren anhaltend keine
13
Einleitung
Symptome der Krankheitsprogression. „Elite Controller“ stellen eine Subgruppe dieser
Individuen dar, welche die Viruslast über einen unbestimmten Zeitraum stark (bis unter die
Nachweisgrenze von 50 Kopien/ml) unterdrücken können (Walker, 2007).
1.5.1
HLA-Allele
Der Haupthistokompatibiltätskomplex ("major histocompatibility complex", MHC) besteht
aus einer Vielzahl von Genen und befindet sich beim Menschen auf dem kurzen Arm des
Chromosom 6. Der MHC wird beim Menschen als HLA-Molekül (Humanes Leukozyten
Antigen-System) bezeichnet. Innerhalb der HLA-Klasse-I-Genregion unterscheidet man
Genorte, die für die sogenannten klassischen HLA-Klasse-I-Antigene A, B und C kodieren,
von weiteren HLA-Klasse-I-Genorten, zu denen HLA-E, -F, -G und MICA/MICB "H"
gehören. Die einzelnen HLA-Allele können serologisch (Differenzierung durch
Moleküloberfläche mittels Antikörper) oder genotypisch (Differenzierung auf DNA-Ebene
mittels spezifischer Primer) bestimmt werden. Sie unterscheiden sich durch die Fähigkeit,
unterschiedliche Peptide durch vorgegebene Ankerpositionen an Anfang und Ende eines
Peptides zu binden. Mutationen in den zu präsentierenden Peptiden, insbesondere an den
entsprechenden Ankerpositionen, können die Bindung an das HLA-Molekül beeinträchtigen
oder ganz verhindern. Die Bezeichnung erfolgt durch die Abkürzung HLA gefolgt von dem
Buchstaben, der den Isotyp bezeichnet (z.B. B) und einer Gruppennummer, die die
spezifische Antigenvariante bezeichnet (z.B. HLA-B27). Die Angabe einer zweistelligen
Nummer beschreibt die Variante der Gruppe (z. B. HLA-B*1501) (Waßmuth et al., 2005).
Die HLA-Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer α-Kette und einer nicht HLA-kodierten ßKette, dem ß2-Mikroglobulin (ß2M). Sie präsentieren den CD8+ T-Zellen endogene, acht
bis neun Aminosäuren lange Peptide. Die Beladung der Klasse-I-Moleküle mit Peptiden
erfolgt nach der Neusynthese der beiden HLA-Klasse-I-Ketten im endoplasmatischen
Retikulum. Die entsprechenden viralen Proteine werden dazu im Zytosol durch einen
Proteasekomplex (LMP2 und LmP7), dem Proteasom, in Peptide gespalten. Diese Peptide
werden in einem ATP-abhängigen Prozess durch ein Transportsystem (TAP1 und TAP2)
ins endoplasmatische Retikulum befördert. Anschließend werden die korrekt gefalteten, mit
Peptid beladenen HLA-Klasse-I-Moleküle via Golgi-Apparat an die Zelloberfläche
transportiert, wo sie den CD8+ T-Lymphozyten (CTL) präsentiert werden. Diese erkennen
die so präsentierten Peptide durch ihren T-Zellrezeptor (TCR).
14
Einleitung
Der HLA-Klasse-II-Proteinkomplex besteht aus zwei etwa gleich großen
membranverankerten α- und β-Untereinheiten und präsentiert exogene 12 bis 19
Aminosäuren lange Peptide an die CD4 + T-Zellen. Durch Endocytose werden die
extrazellulären Proteine in Endosomen aufgenommen und durch Fusion mit beispielsweise
einem Lysosom, angesäuert. In den Endosomen oder Lysosomen befinden sich Proteasen,
die bei niedrigem pH-Wert aktiv sind. Die HLA-Klasse-II-Komplexe wandern zunächst in
das Endoplasmatische Retikulum (ER). Damit sie hier nicht an eines der vielen Proteine
unspezifisch binden, sind die HLA-Klasse-II-Komplexe mit einem Protein namens
Invariante Kette assoziiert. Ein Teil der Invarianten Kette liegt in der Bindungstasche und
verhindert so die Bindung anderer Proteine. Sie formt mit einer anderen Kette ein
Homotrimer. Bis dieser stabile Zustand erreicht ist, sind die HLA-Klasse-II-Komplexe an
Calnexin gebunden. Nachdem der Trimer gebunden ist, verlassen die HLA-Klasse-IIKomplexe das ER. Das intrazelluläre Kompartiment mit dem HLA-Klasse-II-Komplex
fusioniert mit einem Endosom mit niedrigem pH-Wert. Durch die Proteasen wird die
Invariante Kette mehrfach gespalten. Nach zwei Spaltungen bleibt nur noch ein kurzes
Peptid genannt CLIP (class-II-associated invariant chain peptide), welches in der
Bindungstasche liegt, zurück. Um ein Peptid aus dem Endosom binden zu können, muss das
CLIP Protein abgespalten werden. Dieser Vorgang wird beim Menschen durch den HLADM Komplex katalysiert. Dieser Komplex katalysiert die Abspaltung des CLIPs, bindet an
leere HLA-Klasse-II-Komplexe und stabilisiert diese. Außerdem katalysiert HLA-DM den
Austausch eines schwach gebundenen Peptids, durch eines mit höherer Affinität zur
Bindungsgrube (Janeway, 2001). Verschiedene HLA-Klasse-I-Allele wurden sowohl mit
niedrigeren viralen Setpoints, als auch mit langsamerer Krankheitsprogression assoziiert,
wie z.B. HLA-B27 und –B13 (Kaslow et al., 1996; Altfeld et al., 2006; Honeyborne et al.,
2007). Neuere Studien zeigen, dass Personen, die HLA-B57 exprimieren, signifikant
seltener eine symptomatische akute HIV-1 Infektion, sowie eine stärkere virus-spezifische
T-Zellantwort haben und die virale Replikation nach der akuten Infektion besser
kontrollieren können (Altfeld et al., 2003, Altfeld et al., 2006). Der HLA-Haplotyp HLAA1-B8-DR3 und das HLA-B35 Allele wurden hingegen mit einer schnelleren HIV-1Progression in Verbindung gebracht (Steel et al., 1988; McNeil et al., 1996; Kaslow et al.,
1990; Itescu et al., 1991).
15
Einleitung
Zudem konnte gezeigt werden das Patienten mit homozygoten HLA-Allelen einen deutlich
schlechteren Verlauf zeigen, als Patienten mit heterozygoten HLA-Allelen (Carrington et
al., 1999; Tang et al., 1999).
1.5.2
HIV spezifische T-Zellantwort und Entwicklung von Fluchtmutanten
CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) erkennen mit ihrem T-Zellrezeptoren (TCR), die
von den HLA-Klasse-I-Molekülen präsentierten viralen acht bis zehn Aminosäuren langen
Peptide. Diese Erkennung bewirkt eine Aktivierung der CD8+ T-Zelle, was eine spezifische
Lyse der infizierten Zelle zur Folge hat. Zudem beginnen die CTLs zu proliferieren und
sezernieren darüber hinaus Zytokine und HIV-suppresive Chemokine wie Rantes und MIP1α /ß (Cocchi et al., 1995; Young et al., 1997). Durch diese Botenstoffe werden weitere
CTLs sowie CD4+ T-Helferzellen, Makrophagen und dendritische Zellen an den Ort des
Geschehens rekrutiert. CD4+ T-Zellen erkennen 12 bis 19 Aminosäuren lange Peptide, die
aus exogen aufgenommenen Proteinen generiert und von HLA-Klasse-II-Molekülen
präsentiert
werden.
HLA-Klasse-II-Moleküle
werden
von
professionellen
antigenpräsentierenden Zellen wie Monozyten, B-Zellen, aktivierten T-Zellen und
dendritischen Zellen exprimiert. Nach Erkennung des Antigens geben CD4+ T-Zellen eine
Reihe von Zytokinen, die unterschiedliche Abwehrsysteme induzieren können, ab.
Hinweise für die essentielle Rolle der HIV-1 spezifischen zellulären Immunantwort für die
Kontrolle der viralen Replikation und den HIV-1 Krankheitsverlauf, kommen aus
zahlreichen Studien (Koup et al, 1994; Harrer et al, 1996; Musey et al, 1997). Auch für das
Rhesusaffen-Model konnte anhand von CD8-Depletierungsexperimenten eine wichtige
Rolle von CD8+ T-Zellen für die Kontrolle der Replikation von SIV demonstriert werden
(Schmitz et al, 1999). Jedoch auch starke CTL Antworten können nicht verhindern, dass die
meisten HIV-1-infizierten Patienten letztendlich die Kontrolle über die Virusreplikation
verlieren und eine Progression in das Stadium AIDS (Klein et al., 1995) zeigen. Zudem
konnte bereits gezeigt werden, dass die HIV spezifischen T-Zellen nicht die einzige
Ursache für einen immunologischen Schutz vor der HIV-1 Infektion darstellen (Bett et al.,
2001). Diskutiert werden unter anderem die Entwicklung von Mutationen in CTL Epitopen
welche eine Erkennung der CTL durch die TCR verhindern oder einschränken.
16
Einleitung
Die Rolle von diesen CTL Fluchtmutanten für die Krankheitsprogression bei der HIV-1
Infektion ist jedoch immer noch stark umstritten. So gibt es eine Vielzahl von Studien, die
einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von CTL Fluchtmutanten und der
Krankheitsprogression zeigen konnten (Price et al, 1997; Barouch et al., 2002; Friedrich et
al., 2004). Auch die HIV-1 Sequenzen selbst weisen eine deutliche Prägung durch eine von
CTL-vermittelten Immunselektion auf (Moore et al., 2002; Blankson et al., 2006). Andere
Studien hingegen konnten keine CTL Fluchtmutationen bei Patienten mit fortgeschrittenem
Krankheitsstadium finden (Brander et al., 1998; Addo et al., 2003; Draenert et al., 2004).
Gründe für diese diskrepanten Erkenntnisse könnten darin liegen, dass in einem Teil der
Patienten funktionelle Fluchtmechanismen (z.B. Nef vermittelte Herunterregulierung von
HLA-Klasse-I-Molekülen) oder eine funktionelle Beeinträchtigung der CTLs (Liebermann
et al., 2001; Trautmann et al., 2006) eine Rolle spielen. Diese beeinträchtigen die
Wirksamkeit dieser Zellen und ermöglichen so eine fortlaufende HIV-1 Replikation ohne
das Auftreten von CTL Fluchtmutanten. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass nicht alle
auftretenden CTLs in einem bestimmten Patienten den gleichen Druck auf den Virus
ausüben. Vielmehr scheint es signifkante Unterschiede zwischen Epitopen, HLA-Klasse-IMolekülen und T-Zellrezeptoren bezüglich ihrer antiviralen Wirksamkeiten zu geben
(Kiepiela et al., 2004; Dong et al., 2004). HIV-1 spezifische T-Zellen (CTL) können zudem
potenziell auf die virale Fitness Einfluss nehmen. Hierbei könnte die Entwicklung von
Fluchtmutanten, welche es dem Virus ermöglicht den CTLs zu entkommen, eine
entscheidende Rolle spielen. Da HIV ein variabler Virus ist, führt eine starke CTL Antwort
bei den meisten Patienten zum Auftreten von Fluchtmutanten. Wenn diese Epitope in
funktionell wichtigen Regionen liegen, könnten dort auftretende Mutationen die virale
Replikation und Virulenz beeinträchtigen. Dies hätte wiederum eine große Bedeutung für
die Entwicklung von therapeutischen Impfstoffen.
1.5.3
Chemokinrezeptordefekt Δ CCR 5
Neben der Immunantwort des Wirts spielen auch genetische Faktoren eine wichtige Rolle
bei der HIV-1 Pathogenese. Der bedeutendste dieser Faktoren ist eine Deletion am Gen des
CCR5 (Samson 1996). Hierbei handelt es sich um eine 32 Basenpaar umfassende Deletion
der Nukleinsäuren 794 bis 825 (Premack et al.1996) auf dem Rezeptor kodierenden Gen auf
dem Chromosom 3p21. Die Deletion dieses 32 Basenpaar Segmentes führt zu einem nicht
funktionsfähigen Rezeptor und verhindert den Eintritt von M-Tropen HI-Viren in CD4+ T17
Einleitung
Zellen. Das gilt jedoch nicht für T-tropische oder dual-tropische HIV-1 Stämme. Zudem
wurde berichtet, dass sowohl homo-, als auch heterozygote Merkmalsträger dieser Deletion
eine eingeschränkte Infektion mit HIV-1 zeigen. Auch die Progression in das Stadium AIDS
wurde in beiden Fällen als verzögert beobachtet. (Liu et al.1996; Eugen-Olsen et al., 1997).
In einer hier durchgeführten Studie konnte gezeigt werden das heterozygote Merkmalsträger
ein besseres Ansprechen auf die antivirale Therapie zeigen im Vergleich zu Patienten ohne
diese Deletion (Kasten et al., 2000).
1.5.4
Apobec3G
Im Zuge der Aufklärung der Funktionsweise des viralen Infektiositätsfaktors (Vif) von
HIV-1 wurde ein zelluläres Protein identifiziert, das bei Vif-negativen HI-Viren die Bildung
von infektiösen Partikeln verhindert (Sheehy et al., 2002). Solche Viren können in
sogenannten permissiven T-Zelllinien replizieren, nicht aber in nicht-permissiven TZelllinien, sowie primären T-Zellen und Makrophagen. Für die Replikation in diesen Zellen
benötigt HIV das Vif-Protein, um das humane Apolipoprotein B mRNA-editing catalytic
polypeptide (Apobec)3G, auch CEM15 genannt, zu neutralisieren (Yu et al., 2003). Bei
Apobec3G handelt es sich um eine Cytidin-Deaminase, die G-zu-A Hypermutationen im
HIV Genom verursacht. Es konnte gezeigt werden, das dieser zelluläre Faktor in
Abwesenheit von Vif in neu entstehende Virus Partikel verpackt wird, nicht aber in
Anwesenheit von Vif. Die Interaktion mit Vif führt zum schnellen Abbau von Apobec3G
(Sheehy et al., 2003). Während das humane Apobec3G durch das Vif von HIV neutralisiert
wird, können die Apobec3Gs von afrikanischen Grünen Meerkatzen (AGM) und RhesusMakaken (MAC) die Replikation von HIV hemmen (Mariani et al., 2003). Es konnte bereits
gezeigt werden, dass der Austausch einer einzelnen Aminosäure, nämlich Asparagin an
Position 128 im humanen Apobec3G und Lysin im Apobec3G der afrikanischen grünen
Meerkatze, die Fähigkeit des HIV-1 Vif-Proteins zur Bindung und Inaktivierung dieser
Wirtsfaktoren, kontrolliert (Bogerd et al., 2004).
1.5.5
Neutralisierende Antikörper
Neutralisierende Antikörper können die Adsorption von viralen Partikeln an ihre zellulären
Rezeptoren verhindern und damit den Eintritt der Viren in die Zelle blockieren. In der Regel
sind Antikörper Antworten auf HIV-1 stark und vor allem gegen strukturelle Proteine der
Viren gerichtet. Innerhalb von wenigen Wochen nach der Infektion können Antikörper
18
Einleitung
gegen die Env Proteine gp120 und gp41, sowie gegen die Gag-Proteine p24 und p17, im
Plasma der HIV-1 positiven Patienten gefunden werden (Pilgrim et al., 1997; Richman et
al., 2003). Nur ein Teil dieser Antikörper zeigt auch neutralisierende Eigenschaften (Wyatt
et al., 1998). Bis heute sind nur vier neutralisierende monoklonale Antikörper mit breiter
Immunantwort aus HIV-1 infizierten Patienten isoliert worden: IgG1 2G12 und IgG1 b12,
binden an gp120, IgG1 2F5 und IgG1 4E10 binden an gp41 (Muster et al., 1993; Binley et
al., 2004). Die Rolle von neutralisierenden Antikörpern auf die HIV-Pathogenese ist stark
umstritten. Viele Studien konnten eine Assoziation zwischen hohen neutralisierenden
Aktivitäten und langzeitüberlebenden HIV-Patienten (LTNP) finden (Montefiori et al.,
1996; Humbert et al., 2007; Wang et al., 2008). Wiederum andere Studien konnten einen
solchen Zusammenhang nicht feststellen (Harrer et al., 1996; Bailey et al., 2006). Die
neutralisierende Wirkung dieser Antikörper ist unter anderem vermutlich durch die Bildung
von Fluchtmutanten begrenzt. (Albert et al., 1990). Außer der Quantität, scheinen auch
Qualität und Breite der neutralisierenden Antikörper wichtige Aspekte für die Kontrolle der
HIV Infektion darzustellen (Hubert & Trkola Übersichtsartikel, 2007).
1.6
Antivirale Therapie
Seit 1996 wird die hochaktive antiretrovirale Therapie, abgekürzt HAART, eingesetzt.
HAART ist eine Medikation die sich aus der Kombination von bis zu fünf antiviralen
Mitteln zusammensetzt (Yeni et al., 2006). Obwohl fast jeder einzelne Schritt im viralen
Replikationszyklus ein potenzielles Ziel einer Therapie darstellt, wurden bis heute
überwiegend die beiden Enzyme Reverse Transkriptase und die virale Protease inhibitorisch
durch
Nukleosidanaloga,
Nicht-Nukleosidanaloga
und
Proteasehemmer
attackiert
(Übersichtsartikel Temesgen et al., 2006). Die nukleosidanalogen reversen TranskriptaseInhibitoren (NRTI) werden während der cDNA-Synthese in den DNA-Strang eingebaut und
führen letzten Endes zum Abbruch der reversen Transkription (Übersichtsartikel Hammer et
al., 2006). Nicht nukleosidanaloge reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) interagieren
direkt mit der reversen Transkriptase und verursachen eine Hemmung der Enzymaktivität
(Übersichtsartikel De Clercq et al., 2004). Die Protease Inhibitoren (PI) binden als
Peptidanaloga an das aktive Zentrum der viralen Protease und hemmen dadurch die
Prozessierung viraler Proteine (Übersichtsartikel Hughes et al., 2008). Die neueste Gruppe
stellen die Eintrittshemmer dar, sie unterbinden den Eintritt von HIV-1 in die Wirtszelle
(Übersichtsartikel Sterjovski et al., 2006). Derzeit in der Entwicklung befinden sich
19
Einleitung
Integrase Inhibitoren, die den Einbau der proviralen DNA in das Wirtszellgenom blockieren
(Gordon et al., 2007). Als Therapiestandard hat sich heute die Kombination aus zwei
verschiedenen NRTI-Inhibitoren und einem PI oder NNRTI etabliert (Bartlett et al., 2006).
Der hohe Selektionsdruck durch mindestens drei verschiedene antiretrovirale Substanzen,
verringert die Wahrscheinlichkeit der schnellen Entstehung von medikamentenresistenten
HI-Viren. Durch die Nebenwirkungen und hohen Kosten der HAART ist das Interesse an
therapeutischen Impfungen, welche die HIV spezifische Immunantwort stimulieren sollen,
wieder angestiegen. In einer von Harrer 2005 veröffentlichten klinischen Impfstudie mit
einem therapeutischen MVA (Modifizierter Vaccinia Virus Typ Ankara) Nef Impfstoff
konnte das Auftreten von neuen HIV-1 T-Zellepitopen, sowie ein Ansteigen der CD4+ und
CD8+ T-Zellen beobachtet werden (Harrer et al., 2005).
20
Zielsetzung
2
Zielsetzung
Verschiedene Faktoren können die Suszeptibilität und Resistenz gegen die HIV-1 Infektion,
aber auch die Geschwindigkeit der Krankheitsprogression beeinflussen. Zu diesen gehören
sowohl die Fitness des infizierenden Virus, als auch genetische Faktoren und
Immunantworten des Wirts. Um verschiedene Aspekte für die HIV Pathogenese zu
untersuchen, sollten die HIV Gene, sowie genetische und immunologische Faktoren, in
ausgewählten Patientengruppen untersucht werden. Die Analyse von infizierten Paaren
bietet hierbei den Vorteil, dass die Infektionsquelle bekannt ist und wichtige Informationen
über den viralen Stamm liefert.
2.1
Analyse von Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
Die Patientin 01 konnte über mehrere Jahre eine gute Kontrolle der HIV Infektion
aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu führte die Infektion bei ihrem Sexualpartner, Patient
02, zu einer Progression mit einem Abfall der CD4 Helferzellen auf 276 Zellen /µl. Die
eindeutige Klärung wer die Infektion urspünglich übertragen hatte, sollte mittels Analyse
von entsprechenden HLA-Revertierungen erfolgen. Es sollte zudem die Rolle von CTL
Fluchtmutanten auf den HIV-1 Krankheitsverlauf anhand des dominanten auf HLA-B8restringierten Epitop FLKEKGGL (FL8) in HIV-1 Nef untersucht werden. Hierzu sollte die
Auswirkung von CTL Fluchtmutanten in diesem Epitop mittels einer Langzeitstudie an der
Patientin 01 analysiert werden. Des weiterem sollte der Zusammenhang von Mutationen in
diesem Epitop mit dem HLA-B8-Allel und der HIV Progression in HLA-B8-positiven
Patienten in einer Kohorte bestehend aus 56 HIV-1 infizierten Patienten ermittelt werden.
2.2
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren bei
einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion durch das
gleiche Virus
Die Patientin U wurde von ihrem Partner R mit HIV-1 infiziert und zeigte eine
außergewöhnlich gute Kontrolle der HIV Infektion. Bei dem Patienten R führte die
Infektion in einem Zeitraum von 12 Jahren zu einer Progression in das Stadium AIDS. Es
sollten
21
Zielsetzung
wesentliche Faktoren die von der Patientin selbst oder dem HI-Virus ausgehen und zu dem
extrem guten Verlauf beitragen könnten, analysiert werden. So sollten unter anderem eine
potenzielle Abschwächung der Viren und mögliche Zusammenhänge mit den HLA-Allelen
der beiden Patienten mittels Sequenzanalyse untersucht werden. Ebenso sollte ein
genetischer Hintergrund sowie die Immunantwort der Patientin im Hinblick auf CTLs,
neutralisierende Antikörper und antivirale Zytokine, in die Analyse mit einbezogen werden.
Eine funktionelle Abschwächung der HI-Viren der Patientin U aufgrund von einer
detektierten fünf Aminosäuren langen Deletion im Nef Protein ihrer HI-Viren sollte in
Kooperation mit Frank Kirchhoff in Ulm überprüft werden.
2.3
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M
Nach Behandlung mit Steroiden aufgrund einer orthopädischen Erkrankung kam es bei dem
Patienten M zu einem Verlust der bisher guten Kontrolle der HIV Infektion. Es sollte ein
potenzieller Einfluss einer Immunsupprimierung als Folge der Steroid Einnahme auf die
Entwicklung von CTL FLuchtmutationen bei dem Patienten M untersucht werden.
2.4
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast
bei Patient F
Der Patient F zeigte trotz hoher Viruslast normale CD4+ T-Zellen. Es sollten Mutationen in
funktionell
wichtigen
Regionen
gesucht
werden,
welche
zu
einer
potenziellen
Abschwächung der HI-Viren bei dem Patienten F führen könnten. Die dabei detektierte
ungewöhnliche Doppelmutation in der PAK Bindungsregion von Nef, sollte in Kooperation
mit Frank Kirchhoff in Ulm auf eine postulierte Abschwächung der HI-Viren überprüft
werden.
2.5
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte T-
Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
Es sollten für die Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Jan Dörrie und Niels Schaft
(Dermatologie, Erlangen) CD8+ T-Zellen, welche mit mRNA elektroporiert wurden, die
einen HIV-1 RT spezifischen TCR enkodiert, auf eine spezifische Lyse von Targetzellen in
einem hier durchgeführten Chrom-Freisetzungs-Versuch überprüft werden. Zudem sollte
22
Zielsetzung
der
Einfluss dieser TCR-reprogrammierten CD8+ T-Zellen auf die Infektion, von mit dem
Laborstamm NL4-3 infizierten, CD8-depletierten T-Zellen, untersucht werden.
23
Material
3
Material, Methoden und Patienten
3.1
Verbrauchsmaterial
Tab. 1: Verwendete Verbrauchsmaterialien
Material
Hersteller, Stadt
Einmal-Spritzen, 2,5/5/ 10 ml
BD, Heidelberg
Elektroporationsküvetten, 4mm (Zellkultur)
PeqLab, Erlangen
Nitrozellulose-Membranfilter-Mikrotiterplatten, 96-Well
Millipore, München
Polystyrol, Rundboden-Röhrchen, 5 ml
BD, Heidelberg
Gewebekulturplatten, 96-Well Rundboden, steril
BD, Heidelberg
Gewebekulturplatten, 96-/48-/24-Well Flachboden,
BD, Heidelberg
steril
Eppendorf, Hamburg
Küvetten
Kryoröhrchen
Greiner, Frickenhausen
PCR-Reaktionsgefäße
Biozym, Oldendorf
Pipettenspitzen Safe Seal Tips, steril 10 µl
Biozyme, Oldendorf
Pipettenspitzen, steril 20, 100, 1000 µl
Greiner, Frickenhausen
Pipetten, 25 ml
Sarstedt, Nümbrecht
Pipetten, 2/5/10 ml
Greiner, Frickenhausen
Reaktionsgefäße, 1,5/ 2 ml
Eppendorf, Hamburg
Röhrchen, 15/50 ml, konisch , steril
BD, Heidelberg
Separationsmagnet (EasySep )
StemCell Technology,
Filterpapier (Spot-On Filtermat)
Perkin Elmer, Rodgau-
+
Jürgesheim
Sterile Einweghandschuhe
Paul Hartmann AG,
Heidenheim
Sterilfilter, 0,2 µm
Schleicher & Schüll, Dassel
Zellkulturflaschen, 50/250 ml
Greiner, Frickenhausen
24
Material
3.2
Laborgeräte
Tab. 2: Verwendete Laborgeräte
Gerät
Hersteller, Stadt
AID ELISPOT Reader
Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg
Betastrahlenzähler (Liquid Scintillation counter, 1205 Perkin Elmer, Rodgau-Jürgesheim
Betaplate)
CO2-Brutschrank
Heraeus, Hanau
Durchflusszytometer (EPICS XL-MCL)
Beckman Coulter, Krefeld
Elektroporationsapparatur (Gene Pulser Xcell)
BioRad, München
Feinwaage
Mettler/Spoerhase, Gießen
Flüssigstickstoff-Anlage
Cryoson, Schöllkrippen
Röntgenröhre, 2mm Aluminium 120 kV
GE, München
(Isovolt Titan)
Gel Kammer (GNA 200)
Pharmacia, LKB, Freiburg
Grobwaage
Sartorius, Göttingen
Klicker
Eppendorf, Hamburg
Kühleinrichtung
Kühlschrank (+4°C)
Liebherr, Ochsenhausen
Gefrierschrank (-20°C)
AEG, Nürnberg
Gefrierschrank (-80°C)
National Lab, Mölln
Luminometer (Orion I Microplate Luminometer)
Berthold Detection Systems, Pforzheim
Mikroskop, Auflicht
Zeiss, Oberkochen
pH-Meter
WTW, Weilheim
Photometer
Eppendorf, Hamburg
Pipetus
INTEGRA Biosciences, Fernwald
Wasseraufbereitungsanlage (PureAqua)
TM
Sequenzer (ABI PRISM
Millipore, Schwalbach
310 Genetic Analyzer)
Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)
Sterilbank (Laminin Air HB 2472)
Heraeus, Hanau
Thermocycler Uno
Biometra, Göttingen
TQ-PrepWorkstation
Beckman Coulter, Krefeld
UV-Tisch (MultiImageTM Ligth Cabinet)
Biozym, Oldendorf
Vortexer
IKA® Werke GmbH & Co. KG, Staufen
Wasserbad
Köttermann, Uetze-Hänigsen
Zentrifuge
Biofuge 28RS
Heraeus, Hanau
Rotixa/RP
Hettich, Tuttlingen
25
Material
3.3
Reagenzien und Lösungen
Tab. 3: Verwendete Reagenzien und Lösungen
Reagenzien, Lösungen und Puffer
Herstellung
Hersteller, Stadt
Reagenzien, Lösungen
AEC Substrat (3-Amino-9-
Sigma-Aldrich, Steinheim
Ethylcarbazol)
Agar
BD, Heidelberg
Ampicillin
Sigma, München
Agarose
Roth, Mannheim
Avidin/Peroxidase Löung
Vector Laboratories, CA USA
BSA
Biolabs, Frankfurt
Chlorophorm
Sigma-Aldrich, Steinheim
DEPC
Roth, Karlsruhe
Dimethylsulfoxid
Roth, Karlsruhe
DMSO
Merck, Darmstadt
dNTP, 100 mM
je 25 mM dATP, dCTP,
PAN Biotec GmbH, Aidenbach
dGTP, dTTP,
DNA Ladder, 100 bp
NE BioLabs, Frankfurt
DNA Ladder, 1 kb
BioLabs, Frankfurt
DTT
Sigma-Aldrich, Schnelldorf
Ethanol, absolut
Apotheke des Klinikums, Erlangen
Ethidiumbromid
Merck, Darmstadt
Foetales Kälberserum (FKS)
Inaktivierung 56°C 30
Gibco, Eckenstein
Min
Glycerin
Merck, Darmstadt
Hanks
Klinische Universitätsanstalten,
Erlangen
HEPES
Sigma-Aldrich, Schnelldorf
H20DEPC
0,1% DEPC, Aqua dest,
über Nacht. 37°C,
autoklavieren
H 2O 2
Humanes AB Serum
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Schnelldorf
IL-2
Biosource, Hamburg
Isopropanol
Roth, Karlsruhe
TM
Reagenziensystem (ImmunoPrep )
Beckman Coulter, Krefeld
KAc
Merck, Darmstadt
26
Material
Reagenzien, Lösungen
LB Agar
Gibco, Eckenstein
LB Broth Base
Gibco, Eckenstein
Lymhozytentrennmedium
Biotest, Dreieich
(Lymphoflot)
MgCl, 50 mM
Roche, Mannheim
Na-MOPS
Merck, Darmstadt
Natriumazid
Merck, Darmstadt
Penicillin/ Streptomycin
Gibco, Eckenstein
PFA
Merck, Darmstadt
PHA
Sigma-Aldrich, Schnelldorf
Phosphat-gepufferte Saline (PBS)
Gibco, Eckenstein
Random Hexamer
Promega, Mannheim
Reinstwasser, Aqua ad iniectabilia
DeltaSelect GmbH, Dreieich
DeltaSelect
RNase Inhibitor
Promega, Mannheim
RNA.Ladder
NEB, Frankfurt
Saponin
Roth, Karlsruhe
Scintillationslösung (Betaplate Scint)
Perkin Elmer, Rodgau-Jürgesheim
Steriles RNase freies Wasser
Sigma-Aldrich, Steinheim
Streptomycin
Gibco, Eckenstein
Triton X-100
Sigma-Aldrich, Steinheim
Tris
Roth, Karlsruhe
Trypanblau
Serva, Heidelberg
Tween 20
Merck, Darmstadt
Puffer
FACS-Puffer
PBS, 1% BSA
Permeabilisierungspuffer
PBS, 1% BSA, 0.3%
Saponin
MOPS-Puffer 10x
200 mM MOPS, 50 mM
Na-Acetat, 10 mM
EDTA gelöst in RNase
freiem Aqua dest, pH 7
NaHCO3, 10x
42 g NaHCO3, 500 ml
Aqua dest., pH 8,5
BioLabs, Frankfurt
NEB-Puffer, 10x
27
Material
Puffer
PBS/T 0.05%
PBS, 0,05% Tween, pH
7,2
PBS/T 0.1%
PBS , 0,1% Tween, pH
7,2
PCR-BC-Puffer
Invitrogen, Karlsruhe
PCR-BD-Puffer
Invitrogen, Karlsruhe
PCR-Puffer, 10x
Roche, Mannheim
TBS, 10x
150 mM NaCl, 10 mM
Tris-HCl, pH 7,5
TBE-Puffer
90 mM Tris-Base, 90
mM Borsäure, 2 mM
EDTA, pH 8.0
T4 DNA-Ligase Puffer
Invitrogen, Karlsruhe
5xTM-Verdünnungspuffer
Applied Biosystems, Darmstadt
TROPIX-Puffer, 10x
24,3 g Tris Base, 1M
MgCl2, aufüllen mit
Aqua dest, pH 9,8
3.4
Zellkulturmedien und Zusätze
Tab. 4: Benutzte Zellkulturmedien und Zusätze
Medium
Herstellung
Hersteller, Stadt
LB-Medium
LB-Broth Base, 20 mg in 1 L Aqua dest,
LB-Agarplatten
1,5 % Agar in LB-Medium gelöst,
autoklaviert
OptiMEM
Invitrogen, Karlsruhe
RPMI 1640
Gibco, Karlsruhe
R5AB
RPMI 1640 mit 5% humanem AB Serum,
2 mM Glutamin, 40 mM Streptomycin
und 170 mM Penicillin
SOC-Broth
Sigma-Aldrich,
Steinheim
28
Material
Medium
Herstellung
Hersteller, Stadt
R10
RPMI 1640 mit 10 % inaktiviertes FKS, 2
mM Glutamin, 40 mM Streptomycin und
170 mM Penicillin
R10 IL2
R10 mit 20 U/ml IL2
R20
RPMI 1640 mit 20 % inaktiviertes FKS, 2
mM Glutamin, 40 mM Streptomycin und
170 mM Penicillin
SOC-Broth
Sigma-Aldrich,
Steinheim
3.5
Kommerziell erhältliche Kits
Tab. 5: Benutzte Kits
Kommerzieller Kit
Hersteller, Stadt
AT ALLELE SEQR HLA-Cw
Abbott GmBH & Co. KG,
Wiesbaden
Big-Dye-Sequenzier-Kit
ABI, Weiterstadt
Message Max TM T7 Capped Message Transcription Kit
Biozym, Oldendorf
PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini Kit
Invitrogen, Karlsruhe
QIAGEN PCR cloning Kit
Quiagen, Hilden
QIAmp DNA Blood Mini Kit
Quiagen, Hilden
QIAquick Gel Extractions Kit
Quiagen, Hilden
QIAprep Miniprep Kit
Quiagen, Hilden
QIAmp Plasmid Maxi Kit
Quiagen, Hilden
QIAquick PCR Purification Kit
Quiagen, Hilden
QIAmp Viral RNA Mini Kit
Quiagen, Hilden
Vectastain ABC-Kit
Linaris, Wertheim
TM
Zellseparation, magnetisch (EasySep )
StemCell Technologies,
Meylan
29
Material
3.6
Enzyme
Tab. 6: Verwendete Enzyme
Enzyme
Hersteller, Stadt
BamHI
BioLabs, Frankfurt
DNase-freie RNaseH
Quiagen, Hilden
EcoRI
BioLabs, Frankfurt
Expand Polymerase
Roche, Mannheim
Proteinase K
Roth, Karlsruhe
RNAse A
Quiagen, Hilden
RT-SuperscriptIII (Reverse Transkriptase)
Invitrogen, Karlsruhe
SpeI
BioLabs, Frankfurt
Taq Polymerase, 5 U/µl
Roche, Mannheim
T4 DNA-Ligase
Invitrogen, Karlsruhe
3.7
Antikörper
Tab. 7: Benutzte Antikörper
Antikörper
Hersteller, Stadt
Anti-human CD8
BD Bioscience, Heidelberg
Anti- IFN (1-D1K)
Mabtech AB, Hamburg
Anti-human CCR5 PE
BD Bioscience,
Anti-human CD4 (SM3019AS)
Acris GMBH, Hiddenhausen
Anti-HIV p24 gag
Aalto Bio reagents, Irland
Anti (IgG1)-FLAG-FITC
Sigma-Aldrich, Schnelldorf
CD8-FITC
Beckmann Coulter, Marseille
CD4-FITC
Beckmann Coulter, Marseille
IgG1 (Mouse)-FITC
Beckman Coulter, Marseille
IgG1 (Mouse)-PE
Beckman Coulter, Marseille
mAb7-B6-1-Biotin
Mabtech AB, Hamburg
30
Material
3.8
Vektoren und Zusätze
Tab. 8: Verwendete Vektoren
Vektor
Herkunft
pDrive Cloning Vector
Quiagen, Hilden
pGEM-ZA64
Dermatologie, Erlangen
pNL43
Virologie, Erlangen
3.9
Bakterien, Zellen und Zelllinien
Tab. 9: Benutzte Bakterien, Zellen, Zelllinien und Virenstocks
Bakterien, Zellen bzw. Zelllinien Beschreibung
Herkunft
Bakterien E.Coli XL2 blue
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17
Stratagene, La Jolla,
supE44 relA1 lac [F' proABlaclqZ
USA
Δ(lacZ)M15 Tn10 (Tetr)]
PBMC
EBV-immortalisierte B-Zellen
Periphere
mononukleäre
Blutzellen
HIV-positive/-negative
Spender
isoliert aus Citrat-Blut
Blutlymphozyten, welche mit 10µl HIV-positive/-negative
Cyclosporin A und 1 ml B95-8 Spender
Überstand inkubiert wurden
Virenstocks
Beschreibung
Herkunft
vSC8
Rekombinantes Vaccinia Virus des NIH AIDS Research and
HIV Stamm der ß-Galactosidase unter Reference Reagent
der
Kontrolle
des
P11
Promotor Programm, Rockville,
exprimiert
vAbT204
Maryland
Rekombinantes Vaccinia Virus, des das
„
Polymerase Protein von HIV Stamm
BH10 unter der Kontrolle des 7.5K
Vaccinia Promotor exprimiert.
VcF21
Rekombinantes Vaccinia Virus, des
Polymerase Protein von HIV Stamm
IIIB unter der Kontrolle des P11
Promotor exprimiert.
31
„
Material
Virenstocks
Beschreibung
Herkunft
89.6
Dual-Troper HIV-1 Laborstamm
PD. Dr. Karin Metzner,
Virologie, Erlangen
NL43
M-Troper HIV-1 Laborstamm
„
YU-2
T-Troper HIV-1 Laborstamm
„
3.10
Oligonukleotidprimer
Tab. 10: Verwendete Oligonukleotidprimer
Bezeichnung
Sequenz (5’-3’)
Verwendung
Apobec-5-i
CCTTAGAGACTGAGGCCCATCCTTC
Amplifikation,
Sequenzierung
Apobec-3-i
AAGGATGAAGCCTCACTTCAG
Amplifikation,
Sequenzierung
Apobec-5-a
CCTTAGAGACTGAGGCCCATCCTTC
Amplifikation
Apobec-3-a
GGGACTAGCCGGCCAAGGATG
Amplifikation
Apobec-3-753
CCGTGTTTATGTGGAGCCTG
Sequenzierung
Apobec-5 625
GAACCTTGGGTCAGAGGAC
Sequenzierung
CCR5-5 760
CTGCAGCTCTCATTT TCC
Amplifikation
CCR5-5 982
TCAGGAGAAGGACAATGTTG
Amplifikation
Sp6-5
GATTTAGGTGACACTATAG
Sequenzierung
T7-3
TAATACGACTCACTATAGGG
Sequenzierung
Gag-5 764
GACTAGCGGAGGCTAGAAG
Amplifikation
Gag-5 790
ATGGGTGCGAGAGCGTC
Amplifikation
Gag-5 880
TRAAACATYTAGTATGGGCAAGCAG
Sequenzierung
Gag-3 1095
GTCTAARGCTTCYTTGGTGTC
Sequenzierung
Gag-5 1198
GTCAGCCAAAATTATCCTATAGT
Sequenzierung
Gag-5 1406
ATGAGGAAGCTGCAGAATGGG
Sequenzierung
Gag-3 1484
GTTCCTGCTATGTCACTTCC
Sequenzierung
Gag-5 1819
GAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGG
Amplifikation
Gag-5 1980
TTGTGGCAAAGAAGGGCACAT
Amplifikation,
Sequenzierung
Gag-3 2045
CATTCTTTCATTTGRTGTCCTTC
RT-PCR,
Amplifikation
Gag-5 2045
GGAAGGACACCAAATGAAAGATG
32
Sequenzierung
Material
Gag-3 2352
CTAATACTGTATCATCTGCTCCTG
RT-PCR,
Amplifikation
Bezeichnung
Sequenz (5’-3’)
Verwendung
Gag-5 Hind3
CGAAGCTTGATGGGTGCGAGAGCGTC
Amplifikation
Gag-3 Hind3
CGAAGCTTTGCCCCCCTATCTTTATTGTG
Amplifikation
PR-3 2352
CTAATACTGTATCATCTGCTCCTG
Sequenzierung
PR-5 2373
ARATGGAAACCAAAAATRAT
Sequenzierung
PR-5 2508
GGAAGAAATCTGTTGACTCAG
Sequenzierung
PR-3 2607
TGGGCCATCCATTCCTGGCTT
Sequenzierung
Pol-5 Hind3
ATGTTTTTTAGGGAARATCTGGCC
Amplifikation
Pol-3 SpeI
CACTAGTTTACTTATCTATTCCATCTAAAAATAG
Amplifikation
RT-3 2616
CAATGGCCATTGACAGAAG
Sequenzierung
RTa-3 2735
GGCAAATACTGGAGTATTGTATGG
RT-PCR,
Amplifikation
RT-3 3001
CATCCCTGTGGAAGCACATT
Sequenzierung
RT-5 3012
GGATCACCAGCAATATTCCA
Sequenzierung
RT-3 3532
TTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGGTCA
RT-PCR,
Amplifikation
RT-5 4028
AAAYATAGTAACAGACTCACA
Sequenzierung
Int-5 4201
TAATTTATCTACTTGTTCATTTCCTCCAAT
Sequenzierung
Int-3 4470
CACTRGCYACATGAACTGCTACCA
RT-PCR,
Amplifikation
Int-5 4903
TTTATTACAGGGACAGCAG
Amplifikation
Vif-5 5037
GAAAAGCAAAGATCATTAGG
Amplifikation,
Sequenzierung
Vif-5 5290
GGAGTATCCATAGAATGGA
Sequenzierung
Vif-3 5455
GTCCTGCTTGATATTCACA
Sequenzierung
Vpu-5 6207
GAGCAGGGCGGAGTGGCAATGARAGYGA
Sequenzierung
Vpu-3 6584
TACACATGGYTTTAGGCTTT
RT-PCR,
Amplifikation,
Sequenzierung
Vpr-5 5769
CATTTCAGAATTGGGTGYCRACA
Sequenzierung
Vpr-5 5855A
GAGCCCTGGAAYCACCCGGGAAGTCAGCC
Sequenzierung
Nef-3 8675
GCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGG
Amplifikation
Nef-5 8736
GCCACATACCTRBAAGAATAAGACAGG
Amplifikation,
Sequenzierung
33
Material
Bezeichnung
Sequenz (5’-3’)
Verwendung
Nef-5 8960
GTCCCTGGCTRGAAGCACAAGA
Sequenzierung
Nef-3 9035
GTCATTGGTCTCAAAGGTACCTGYGG
Sequenzierung
Nef-3 9133
TCAGGGAARTAGCCTTGTGTGT
Sequenzierung
NL43
CGGGATCCCATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG
Amplifikation,
Klonierung
Nef-3 BamHI
FUNef-5-Flag-
CGAATTCTAACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGC
Amplifikation,
EcoRI
AGTCTTTGTAGTATTCCGGATGCAGCTC
Klonierung
LTR-3 9439
CCACGCCTCCCTGGAAAGTCCC
Amplifikation,
Sequenzierung
LTR-3 9524
TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTAC
RT-PCR,
Amplifikation
34
Methoden
3.11
DNA bzw. RNA Extraktion und Reverse Transkription
Genomische DNA und Plasmid DNA
Die Isolierung von genomischer DNA erfolgte mit dem Reagenziensystem QIAamp DNA
Blood und die Aufreinigung von Plasmid DNA erfolgte mit dem Reagenziensystem Qiagen
Plasmid Kit Mini (3 ml LB) bzw. Maxi (500 ml LB) nach Herstellervorschrift (Qiagen,
Hilden).
Produkte aus PCR oder Restriktionsverdau
Die Aufreinigung von PCR-Produkten erfolgte mit dem Reagenziensystem QIAquick PCR
Purification Kit und die Aufreinigung für Produkte aus PCR oder Restriktionsverdau mit
dem QIAquick Gel Extraction Kit nach Herstellervorschrift (Quiagen, Hilden).
Virale und zelluläre RNA
Die Extraktion von viraler RNA aus Plasma erfolgte mit dem Reagenziensystem QIAamp
Viral RNA Kit (Quiagen, Hilden) und die Extraktion aus Zellkulturüberständen mit dem
Reagenziensystem Pure LinkTM Micro to Midi total RNA Purification System (Invitrogen,
Mannheim) jeweils nach Herstellervorschrift.
Reverse Transkription
Die Umschreibung der extrahierten RNA in cDNA erfolgte mit dem Reagenziensystem RT
Superscript III (Invitrogen). Je nach Art und Länge des RNA Fragmentes wurden eine
Dauer von 30 Min oder 60 Min bei 42°C, 50°C oder 55°C verwendet. Für die
Umschreibung wurden Random Hexamere oder ein entsprechender 3’Primer der
nachfolgenden Nestec PCR eingesetzt.
3.12
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Amplifikation des Chemokin Rezeptor 5 (CCR5) zur Überprüfung der 32 bp Deletion
Der Einzelmix je Probe enthielt immer 25 µl Volumen, bestehend aus 2 µl DNA-Template
(von circa 30.000 Zellen) und 23 µl Mix. Dieser Mix wurde nach folgendem Schema
pipettiert:
35
Methoden
2 µl DNA, 2,5 µl 10 x Puffer, 1 µl 10 mM NTP, 1,5 µl 25 mM MgCl2, je 1 µl CCR5 Primer
CCR5-5 760 (5’-CTG CAG CTC TCA TTT TCC-3’) und CCR5-3 982 (5’-TCA GGA GAA
GGA CAA TGT TG-3’), 0,2 µl Taq (hitzestabiles Enzym aus Thermophilus aquaticus), und
15,8 µl doppelt destilliertes Wasser. Zur Kontrolle wurden bei jeder PCR immer eine
Positivkontrolle und ein Leerwert mitgeführt. Die DNA Proben wurden nach kurzer
Denaturierung bei 94 °C in 40 Zyklen zu je drei Phasen (1. Denaturierung bei 94 °C für 40
Sekunden, 2. Annealing bei 56 °C für 50 Sekunden, 3. Prolongation bei 72 °C für 60
Sekunden) amplifiziert. Durch Auftrennung der Reaktionsprodukte (8 µl) auf einem 3 %igem Agarose-Gel mit 0,04 µg/ml Ethidiumbromid konnte die 32 Basenpaar-Deletion
sichtbar gemacht und anhand eines Längenmarkers genau bestimmt werden.
Amplifikation von cDNA bzw. genomischer DNA-Sequenzen
Hierzu wurden Standardansatz und Standard Reaktionsbedingungen modifiziert, um
optimale Amplifikationsbedingungen zu erhalten. Der Einzelmix je Probe enthielt immer 50
µl Volumen. Der Standardansatz wurde nach folgendem Schema pipettiert: 5µl 10x Puffer
(entsprechend der verwendeten Polymerase unterschiedlich); 10 mM NTP’s; 3 mM MgCl2,
je 100 pmol Primer; 1 U Taq bzw. Expand Polymerase (Roche, Hildesheim); 5-8 µl cDNA
des RT Ansatzes oder entsprechend ca. 20 ng genomische DNA, auf 50 µl aufgefüllt mit
doppelt destilliertem Wasser. Die DNA-Proben wurden nach kurzer Denaturierung bei 95°C
in 30 Zyklen zu je drei Phasen (1. Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden, 2. Annealing
bei 60°C für 30 Sekunden, 3. Prolongation bei 72°C für 60 Sekunden) und abschließend
72°C 10 Min amplifiziert. Die Temperaturen, die Dauer der Reaktionsschritte, deren
Anzahl, als auch die Magnesiumkonzentration musste in vielen Fällen optimiert werden. So
wurden bei der Etablierung einer PCR für die unterschiedlichen Bereiche des Virus- oder
Menschengenoms mögliche Primerkombinationen mit Hilfe des VektorNTI Programmes
ausgewählt und mit der HIV-Datenbank abgeglichen um möglichst viele HIV-Quasispezien
amplifizieren zu können. Alle Primer wurden von der biomer. net GmbH bezogen. Bei der
Etablierung einer PCR wurde zunächst eine Primerkombination bei 1.5 mM und 3.0 mM
MgCl2 bei 60°C Annealing Temperatur versucht. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde
im Folgenden die Temperatur und Reaktionszeit optimiert. Zur Vermeidung von
Kontaminationen wurde für die PCR ein separater Pipettensatz verwendet. Zu jeder PCR-
36
Methoden
Reaktion wurden mindestens eine Negativkontrolle ohne DNA, als auch eine
Positivkontrolle mitgeführt.
3.13
DNA-Gelelektrophorese
Die Aufreinigung sowie Größen- und Mengenbestimmung von DNA-Fragmenten erfolgte
elektrophoretisch in horizontalen 1.5 bis 2.0 %igen Agarosegelen, unter Zusatz von 1 µg/ml
Ethidiumbromid. Zur Markierung der Lauffront und zur Fixierung der Proben im Gel wurde
den zu analysierenden Proben 1 x Ladefarbstoff zugesetzt. Als Fragment-Längenstandard
diente der 1 kb bzw. 100 bp-Marker (Gene Ruler 1 kb bzw. 100 bp ladder). Die
Elektrophorese erfolgte bei einer konstanten Spannung von 90 bis 120 V. Aufgrund der
Eigenschaft von Nukleinsäure, fluoreszierendes Ethidiumbromid zu interkalieren, werden
aufgetrennte DNA-Fragmente unter UV-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 312 nm
sichtbar. Die fotografische Dokumentation erfolgte mittels einer CCD-Kamera.
3.14
Sequenzierung
Alle DNA-Sequenzierungen erfolgten in dem Sequenziergerät ABI PRISM 3100 (Applied
Biosystems). Die Technik beruht auf der Kettenabbruch-Methode nach Sanger. In einem
Endvolumen von 20 µl wurden 100 ng PCR-Produkt/500 Nukleotide mit 20 pmol
Oligonukleotid als Startmolekül, 3 µl BigDye Kit und 1 x TM-Verdünnungspuffer in einem
Thermoblock
(Mastercycler
gradient,
Eppendorf)
unter
folgenden
Bedingungen
amplifiziert: initiale Denaturierung für 3 Min bei 94°C, Amplifikation in 30 Zyklen
(Denaturierung
für
10
sec
bei
94°C/
Anlagerung
bei
50°C
für
30
sec/
Polymerisierungsreaktion für 1 Min 30 sec bei 60°C) sowie Abbruchreaktion für 5 Min bei
60 °C. Die amplifizierte DNA wurde mit Hilfe des Programms Sequencing Analysis 3.7
(Applied Biosystem) sequenziert. Die Sequenzen wurden anschließend mit dem Programm
Vector NTI Advance 10 (Invitrogen) ausgewertet und mit der jeweiligen Referenzsequenz
verglichen.
37
Methoden
3.15
Klonierungsmethoden
Verdau des PCR-Produktes
Die Verdauansätze wurden nach dem folgenden Schema durchgeführt: 1,8 µg DNA aus
PCR-Aufreinigung bzw. Klonierungsvektor, 2 µl NEB-Puffer(10 x), 0,5 µl BSA (10 x), je 1
µl Restriktionsenzym EcoRI (10000 U/ml) und BamHI (10000 U/ml), auf 10 µl mit RNasefreiem Wasser aufgefüllt. Die PCR-Produkte wurden 3 Stunden bei 37°C verdaut.
Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligationsansätze wurden nach dem folgendem Schema durchgeführt: Insert und Vektor
im ungefähren molekularen Verhältnis 5:1, 2 µl Ligase Puffer (10 x), 2 µl, T4-Ligase 1 µl,
aufgefüllt auf ein Gesamtvolumen von 10 µl.
Klonierung in den pDRIVE cloning Vektor
Die HIV nef Gene wurden mittels PCR-Technik mit spezifischen Primern amplifiziert. Die
amplifizierten
Produkte
wurden
mit
dem
QIAquick
PCR
Purification
Kit
(Herstellerprotokoll) aufgereinigt und die Inserts in den pDRIVE cloning Vektor über die
Poly A Überhänge einligiert (Herstellerprotokoll: QIAGEN PCR cloning Kit).
Transformation von thermokompetenten Bakterien
10 µl auf Eis aufgetaute thermokompetente Bakterien wurden mit 1-2 µl Ligationsansatz
versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 30 Min auf Eis folgte ein Hitzeschock bei 42 °C für
30 Sekunden. Auf diesen folgten weitere 2 Min auf Eis. Nach Zugabe von 250 µl SOCMedium wurden die Bakterien für eine Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend auf LBAmp-Platten ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
3.16
RNA Herstellungsverfahren und Elektroporation
In-vitro-Transkription
Zehn µg eines RNA-Produktionsplasmids wurden durch das Enzym SpeI (1 µl SpeI bei 10
U/µl), bei 37°C über Nacht verdaut und dadurch linearisiert. Eine Phenol-Chloroform-
38
Methoden
Isoamylalkohol-Mischung (PCI) (Verhältnis 15:14:1) wurde zu dem SpeI verdauten Plasmid
in einem 1:1 Verhältnis gegeben. Diese Emulsion wurde nach dem vortexen (ca. 1 Min) für
2 Min bei 14.000 U/Min zentrifugiert. Die obere Phase wurde vorsichtig abgenommen und
mit 1 Volumen eines Chloroform:Isoamylalkohol (Verhältnis 24:1) gemischt. Dieses
Gemisch wurde ca. 1 Min gevortext bevor es 2 Min bei 14.000 U/Min zentrifugiert wurde.
Die obere Phase wurde abgenommen und 1/10 des Volumens mit 3 M Kaliumacetat (pH
5,6) sowie 2,5 fachem Volumen 100% Ethanol vermischt. Die DNA wurde durch DNAPräzipitation mit der Kaliumacetat-Ethanolfällung erhalten. Hierzu wurde der DNA-Lösung
1/10 Volumen einer 3 M Kaliumacetatlösung (pH 5,6) sowie 2,5 faches Volumen von 100
% Ethanol zugegeben. Nach kurzem Vortexen des Gemisches fand die Fällung bei -20 °C
für 1,5 Stunden statt. Im Anschluss folgte ein Zentrifugationsschritt bei 14.000 U/Min für
30 Min bei 4 °C. Das Pellet wurde zweimal mit 500 µl 70 % Ethanol und einmal mit 500 µl
100 % Ethanol gewaschen. Nach jedem Waschschritt folgte eine Zentrifugation bei 14.000
U/Min für 15 Min bei 4 °C. Das Pellets wurde an der Luft getrocknet und in RNase freiem
Wasser aufgenommen. Die so gewonnene DNA wurde als Matrix verwendet. Die in-vitroTranskription erfolgte durch eine T7-RNA-Polymerase nach Herstellerangaben (Biozym /
Ambion). Die RNA wurde mit dem Rneasy Mini Kit von Qiagen nach Herstellerprotokoll
extrahiert. Die RNA-Qualität wurde in einer RNA-Agarose-Gel-Elektrophorese überprüft.
Die RNA-Konzentration wurde durch ein Photometer bestimmt. Die RNA wurde bei -20°C
gelagert.
RNA-Gel
Zur Größen- und Reinheitsbestimmung von RNA-Fragmenten wurde die RNA mit RNAAuftragspuffer (Loading Dye) und RNase-freiem Wasser vermischt und nach einer
Inkubationsphase von 2 Min auf Eis 3 Min bei 95°C gefolgt von weiteren 2 Min auf Eis auf
ein 1 %-iges Agarosegel (mit Ethidiumbromid) aufgetragen. Die Gelektrophorese zur
Auftrennung der Fragmente erfolgte in horizontalen Laufkammern bei 80 V in MOPSLaufpuffer. Als Größenstandard (bestehend aus 50 % RNA-Ladder und 50 % RNA-Sample
Puffer) wurde ein ssRNA-Leiter (New England Biolabs) benutzt.
39
Methoden
RNA-Elektroporation von PBMC
PBMC wurden aus den Gewebekulturflaschen durch mehrfaches Spülen mit RPMI (RT)
geerntet und zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in RPMI (RT) resuspendiert,
gezählt und erneut zentrifugiert. Es erfolgte dann die Aufnahme in OptiMEM nach einem
weiteren Zentrifugationsschritt, um die Zellen schließlich auf 5 x106 Zellen einzustellen.
Die RNA wurde mit gestopften Pipettenspitzen in die Küvetten (4 mm) vorgelegt, bevor die
Zellen in einem Volumen von 100-600 µl zugegeben wurden. Nach 3 Min Inkubationszeit
erfolgte die Elektroporation der Zellen mit dem Programm square-wave-pulse bei 500 V
und 5 ms. Im Anschluss wurden die Zellen zügig in eine Gewebekulturflasche mit R10
Medium überführt. Nach einer Inkubationszeit von 4 Stunden konnte mit den Zellen
weitergearbeitet werden.
3.17
Zellkulturverfahren
Kultivierung eukaryotischer Zellllinien
Alle Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C, 7% CO2-Gehalt und 80% relativer
Luftfeuchtigkeit inkubiert. Suspensionszellen und PBMC wurden in Zellkulturflaschen
(Nunc, Wiesbaden) in R10 Medium (PBMC) bzw. R20 Medium (EBV-immortalisierte BZellen) kultiviert. Das Medium wurde in der Regel alle 2-5 Tage ausgetauscht.
Generierung von PHA-Blasten
5x106 PBMC wurden in einer Dichte von 1 x 106/ml in R10IL2-Medium unter Zugabe von
0,5 µg/ml PHA (T-Zell Mitogen) für drei Tage kultiviert. Die so gezüchteten PHA-Blasten
bestehen aus aktivierten T-Zellen, die durch Zugabe von IL-2 verstärkt proliferieren.
Anlegen von CTL-Kulturen
5x106 PBMC wurden mit 5 µg des entsprechenden HIV-Peptids versetzt und in 1 ml R10
Medium mit 20 U/ml IL2 inkubiert. In zweiwöchigem Abstand wurden die CTL-Linien
restimuliert. Hierzu wurden autologen EBV-immortalisierten B-Zellen 1 Stunde mit dem
entsprechendem Peptid inkubiert und bei 90 GY bestrahlt. Die so behandelten EBVimmortalisierten B-Zellen wurden dann in einem Verhältnis 1:1 mit der CTL-Linie
40
Methoden
gemischt und mit 10x106, bei 30 GY bestrahlten, PBMC eines beliebigen Spenders,
versetzt.
Kryokonservierung von Zellen
Die Kryokonservierung dient der Langzeitlagerung von eukaryotischen Zelllinien. Sie
erfolgte in Kryo-Einfrierröhrchen bei -80°C. Hierzu wurden ca. 1-10 x 106 Zellen in 500 µl
R10 Medium aufgenommen und mit der gleichen Menge kaltem Einfriermedium (10%
DMSO in fötalem Kälberserum) versetzt. Die so behandelten Zellen wurden wärmeisoliert
verpackt und so allmählich bei -80°C eingefroren. Anschließend wurden die Röhrchen in
die Gasphase eines Stickstofftanks überführt. Zur Reaktivierung wurden die Zellen direkt in
kaltem R10 Medium aufgenommen, dreimal in je 5 -10 ml kaltem R10 Medium gewaschen
und entsprechend in Kultur genommen.
3.18
Zellseparierung und Bestimmung der Zellzahl
Zellseparierung
Peripherem
Blut
wurde
bei
der
Entnahme
10
I.E./ml
Natrium
Heparin
zur
Gerinnungshemmung zugegeben. Anschließend wurde durch Zentrifugation (10 Min bei
1500 Umdrehungen/Min) das Blutplasma vom Blut abgetrennt und im Verhältnis 1:1 mit
Hanks-Lösung
vermengt.
Dieses
Gemisch
wurde
mit
15
ml
Ficoll
(Lymphozytentrennmedium) überschichtet und für 20 Min bei 1920 Umdrehungen /Min und
20°C zentrifugiert. Der entstandene Lymphozytenring wurde mit einer Pipette abgezogen
und dreimal mit Hanks-Lösung gewaschen.
Magnetische Zellseparation
Mit Hilfe der magnetischen Zellseparation (EasySepTM, StemCell Technologie, UK) können
spezifische Zellpopulationen in hoher Reinheit aus komplexen Zellgemischen gewonnen
werden. Die Zellpopulation wird hierzu in einer Konzentration von 1x108 Zellen/ml in
einem gepuffertem Zellmedium (PBS versetzt mit 2% FCS und 1mM EDTA) aufgenommen
und in ein 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen überführt. Durch Zugabe von, mit Dextran
beschichteten magnetischen Nanopartikel (EasySepTM Selection Cocktail, 100 µl/ml) werden
sowohl Dextran als auch die spezifischen Antigene auf der Zelloberfläche gebunden.
41
Methoden
Nach einer Inkubationszeit von 15 Min erfolgt die Zugabe von magnetischen Nanopartikeln
(EasySepTM Magnetic Nanoparticles, 50 µg/ml) und einer weiteren Inkubationszeit von 10
Min. Die Trennung der entsprechende Zellpopulation (CD8- bzw. CD4-positive T-Zellen)
erfolgte laut Herstellerprotokoll (EasySepTM, StemCell Technologie, UK) mittels eines
magnetischen Feldes.
Bestimmung der Zellkonzentration aus peripherem Blut
Zur Zellzahlbestimmung wurden 10 µl der Zellsuspension mit 90 µl 0,1%-igem Trypanblau
vermischt, davon 10 µl in eine Neubauer-Zählkammer gegeben und unter dem
Lichtmikroskop (Zeiss, Jena) ausgezählt. Anschließend konnte die Konzentration und die
Gesamtzellzahl der gewonnenen PBMC (Peripher Blood Mononuclear Cells) berechnet
werden (Bachmann O).
3.19
HLA-Typisierung
Die HLA-Typisierung wurde mit standardisierten serologischen Techniken (Biotest AG,
Dreieich)
oder
genotypischen
Analysen
(Abbott
GmBH&Co.KG,
Wiesbaden),
durchgeführt.
3.20
Herstellung von Peptiden
Alle Peptide wurden synthetisch als C-terminale Carboxsamide von der Firma EMC
microcollections, Tübingen hergestellt.
3.21
Chrom-Freisetzungs-Versuch
Die Zytotoxizität von Effektorzellen (reprogrammierte CD8+ T-Zellen bzw. CTL-Linien)
wurden in einem
51
Cr-Freisetzungs-Versuch getestet. Jeweils eine Millionen EBV-
immortalisierte B-Zellen (Zielzellen) wurden in einem 15 ml Falkon Röhrchen in einem
Endvolumen von 2 ml aufgenommen, bei 1.600 rpm 10 Min zentrifugiert und mit den
entsprechenden Vaccinia Viren (MOI 3) für 1,5 Stunden bei 37 °C und 7% CO2 inkubiert.
Nach einem Waschschritt wurden die so infizierten Zellen in 1 ml R10 aufgenommen, in
42
Methoden
24-Well-Platten überführt, mit jeweils 500 µCi Chrom versetzt und über Nacht bei 37 °C,
7% CO2 inkubiert. Im Anschluss folgten drei Waschschritte mit R10 (1.600 U/Min für 10
Min) und die Aufnahme des Zellpellets in 1ml R10. Für die Bestimmung der spezifischen
Lyse von, mit Peptid beladenen EBV-immortalisierte B-Zellen, wurden Zielzellen welche
mit einem Kontroll Vaccinia Virus (Vsc8) infiziert wurden, für 1 Stunde mit dem zu
analysierenden Peptid inkubiert (Endkonzentration 20 µg/ml). Die Effektorzellen und
Zielzellen wurden in einem 30:1 Verhältnis auf einer 96-Well-Rundbodenplatte für 5
Stunden in einem Gesamtvolumen von 100 µl koinkubiert (37 °C, 7% CO2). Im Anschluss
wurden jeweils 25 µl der Überstände auf ein Filterpapier (Spot-on Filtermat) übertragen und
Übernacht bei 60 °C im Inkubator getrocknet. Das getrocknete Filterpapier wurde in Folie
eingeschweißt, mit 10 ml Scintillationslösung (Betaplate Scint) versetzt und mit einem
Betastrahlenzähler (Liquid Scintillation Counter) gemessen. Die Quantifizierung erfolgte
unter Anwendung der folgenden Formeln:
Spontanwert in % = spontane Lyse (Mittelwert) /Maximum Lyse (Mittelwert)
Spezifischer Wert in % = (spezifische Lyse (Mittelwert)- Spontanwert)/
(Maximum Lyse (Mittelwert)-Spontanwert)
Spontane Lyse: Targetzellen ohne Effektoren; Maximum Lyse: Targetzellen mit
Lysispuffer, Spezifische Lyse: Targetzellen mit spezifischen Peptid bzw. Vaccinia Virus
infizierten Effektoren
3.21
γ-IFN-ELISPOT
96-Well-Nitrozellulose-Membranfilter Mikrotiterplatten wurden mit 50 µl des γ-IFN
Antikörpers (Klon 1-D1K) in einer Konzentration von 10 µg/ml beschichtet. Nach vier
Waschschritten mit PBS und der Blockierung mit R5AB wurden zwischen 2x104 bis 2x105
PBMC in 100 µl R5AB zu den beschichteten Wells in Dublikaten gegeben. Anschließend
erfolgte die Zugabe der entsprechenden Peptide in Konzentrationen zwischen 0.01 und 20
µg/ml. Die Platten wurden dann für mindestens 16 Stunden bei 37°C und 7 % CO2
inkubiert. Nach sechs Waschritten mit PBS/T 0.05% erfolgte die Zugabe von 100 µl eines
gegen γ-IFN gerichteten mit Biotin gekoppelten Antikörpers (mAb7-B6-1-Biotin). Die
Inkubation erfolgte bei einer Endkonzentration von 2 µg/ml für 2 Stunden bei 37 C° und 7%
43
Methoden
CO2. Nach einem Waschschritt mit PBS/T0.05%, wurden 100 µl einer Avidin/Peroxidase
Löung zu jedem Well gegeben.
Nach einer weiteren Incubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur gefolgt von drei
Waschritten mit 0.05% PBS/T und drei Waschschritten mit PBS, erfolgte die Zugabe des
Chromogens in Form von 100 µl AEC Substrat, versetzt mit 0.01 % H2O2. Die Spots
wurden innerhalb von 4 Min entwickelt und die Farbreaktion wurde durch einen
zusätzlichen Waschschritt mit destilliertem Wasser gestoppt. Die Platten wurden bei
Raumtemperatur luftgetrocknet und die Spots wurden mit dem AID ELISPOT Reader
quantifiziert.
3.22
Virusstock- Herstellungsverfahren und Infektion von Zellen
Generierung von PHA-Blasten
Die einfachste in vitro Amplifikation von HIV ist die Generierung von PHA-Blasten aus
HIV infizierten PBMC. Aus dem Zellüberstand, wurden dann virale RNA und aus den
Zellen DNA für spätere Sequenzanalysen extrahiert.
Herstellung von Kokultivierungen (abgewandeltes Protokoll
der AIDS Clinical Trail
Group)
Drei Tage vor Kokultivierung wurden aus 107 frisch isolierten PBMC eines gesunden
Spenders die CD8+ T-Zellen mittels magnetischer Zellseparation depletiert und in 10 ml
R10IL2 Medium aufgenommen. Die Stimulation erfolgte mit 5 µg/ml PHA. Die so
gewonnenen CD8-depletierten PHA-Blasten wurden am dritten Tag in einem 1:1 Verhältnis
mit frisch isolierten CD8-depletierten PBMC des entsprechenden HIV-1 Patienten in
R10IL2 (106 Zellen/ml) kultiviert. Jeden zweiten Tag wurden 5 ml des Zellkuturüberstandes
entnommen und ebensoviel wieder zugegeben. Alle sieben Tage, über einen Zeitraum von
21 Tagen, wurden erneut CD8-depletierte PHA-Blasten eines gesunden Spenders hergestellt
und in einem 1:1 Verhältnis zu der Kokultivierung gegeben. Zusätzlich wurden die so
behandelten Kokultivierungen noch mit 10x106, bei 30 GY bestrahlten, PBMC eines
beliebigen Spenders gefüttert. Die virale Konzentration im Kokultivierungsüberstand wurde
ab der zweiten Woche im p24 Elisa bestimmt.
44
Methoden
Herstellung von Virenstocks
Für die Generierung von infektiösen und hochtitrigen Virensstocks wurden CEM (für R4trope Laborstämme) und U937 (für X4/R5- und R5-trope Laborstämme) Zelllinien
verwendet.
Infektion von Zellen mit HIV-1
Die zu infizierenden Zellen wurden in einem möglichst geringen Volumen mit
verschiedenen HIV-1 Laborstämmen inkubiert und 2 Stunden bei 1.200 g und einer
Temperatur von 25 °C zentrifugiert (Infektion durch spinoculation beschrieben von
O’Doherty et al., 2000). Anschließend wurden die Zellen 2 x mit PBS gewaschen, in die
entsprechenden Zellkulturgefäße überführt, mit frischem Medium versetzt und kultiviert.
Die verwendete Zellzahl und der Titer der infektiösen Viren ausgedrückt in TCID50 (tissue
culture infectious dose 50% ) richtete sich dabei nach dem jeweiligen Experiment.
Direkter HIV-1 p24-ELISA
Der HIV-1 p24-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) erlaubt die Quantifizierung
des HIV-1 Proteins p24 (McKeating et al., 1991). Dazu wurden die Vertiefungen einer
Mikrotiterplate mit polyklonalen anti-p24-Antikörpern des Schafes beschichtet. Das
zellfreie Probenmaterial wurde zunächst durch die Zugabe von 0,01 Volumen Empigen
(v/v) 1 Stunde lang inaktiviert. Die Mikrotiterplatten wurden zweimal mit 1 x TBS
gewaschen. Pro Vertiefung wurden 100 ml einer Lösung mit Phosphatase-gekoppeltem
monoklonalen p24-Antikörpern (anti-HIV-1-p24 gag; 1 : 8.000 in 20 % Schaf-Serum, 1x
TBS, 0,05 % Tween) hinzu gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Vertiefungen wurden viermal mit 0,1 % Tween in PBS und zweimal mit 1 x TROPIXPuffer verdünntem CDP-StarTM/Saphire IITM gewaschen. Dieses luminogene Enzymsubstrat
regt die Aktivität der Phosphatase an, wobei das generierte Licht direkt proportional zur
p24-Menge ist. Nach einer Inkubation von 45 Min bei Raumtemperatur wurden die Proben
im Luminometer (Orion I Microplate Luminometer) photometrisch analysiert. Die
Auswertung erfolgte mit dem Programm Simplicity 4.02. Als Standard dienten mitgeführte
Verdünnungen aus rekombinantem HIV-1 p24 definierter Konzentrationen von 0,008 bis 32
ng p24/ml. Sie bildeten die Grundlage für die Erstellung einer Korrelationsgeraden und
45
Methoden
ermöglichten die Umrechnung der optischen Dichte des Probenmaterials in die HIV-1 p24Antigene
Konzentration. Standardproben und unbekannte Proben wurden in Doppelansätzen
analysiert.
Bestimmung der Infektiosität
Die quantitative Bestimmung der Infektiösität eines virushaltigen Zellkulturüberstandes
wurde mit einer Endpunkt-Verdünnung gemessen. Dabei wird die TCID50 bestimmt
(definiert als Virusverdünnung, die 50 % der eingesetzten Zellkulturen infiziert). In jede
Vertiefung einer 96-Well Platte wurden 1 x 106 PBMC in 100 µl Medium ausgesät. Der zu
untersuchende Virusstock wurde in 11 aufeinander folgenden Stufen mit dem Faktor drei
verdünnt. Anschließend wurden 50 µl pro Verdünnung in vier Replikaten auf die
Zellkulturplatte übertragen, wobei die letzte Kultur einer 12er Reihe nicht infiziert wurde.
Nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen bei 37 °C wurden die zellfreien Kulturüberstände
mittels HIV-1 p24-Antigen-ELISA analysiert. Die Bestimmung des Titers an infektiösen
Viren erfolgte unter Ermittlung der Konzentration der infektiösen Einheiten gemessen in
TCID50, die mit der Kärber Formel errechnet wurde (Kärber, 1931):
...................TCID50/ml= (ds(P/R+0,5))/(1/d0 x ds x V/1000)
d0 = erste Verdünnungsstufe; ds = Verdünnungsfaktor; P= Anzahl der infizierten
Zellkulturen; R = Replikate; V = Endvolumen/Vertiefung
3.23
Durchflußzytometrie (FACS-Analyse)
Direkte extrazelluläre Immunfluoreszenzfärbung
1-5x105 PBMC, CD8-depletierte PBMC oder EBV-immortalisierte B-Zellen wurden in 5 ml
Polystyrol Rundboden-Röhrchen überführt. Nach einem Waschschritt in PBS (1.500 rpm)
wurden die Zellen mit dem entsprechenden direkt mit PE oder FITC gekoppelten
Antikörper in 50 µl FACS-Puffer (5 µg/ml) für 30 Min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Im
Anschluss wurden die Zellen zweimal in je 500 µl FACS-Puffer gewaschen und in der TQPrepWorkstation laut Herstellerprotokoll mit dem zugehörigen Reagenziensystem fixiert
(TQ-PrepWorkstation und ImmunoPrepTM Reagenziensystem). Die Durchflußzytometrie
erfolgte am EPICS.
46
Methoden
Direkte intrazelluläre Immunfluoreszenzfärbung
5x105 CD8-depletierte PBMC wurden in 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen überführt.
Nach einem Waschschritt in PBS (1.500 rpm) erfolgte die Fixierung der Zellen
entsprechend der im Abschnitt „extrazellulärer Immunfluoreszenzfärbung“ beschriebenen
Methode. Nach einem Waschschritt in PBS wurden die Zellen durch einen
Permeabilisierungspuffer (0,3 % Saponin, 1% BSA in PBS), permeabilisiert. Nach einem
Zentrifugationsschritt bei 2.000 rpm für 2 Min wurden die Zellen in 50 µl
Permeabilisierungspuffer mit 5 µg/ml Anti-FLAG direkt gekoppelten FITC Antikörper für
30 Min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen zweimal in je 500
µl FACS-Puffer gewaschen und in 500 µl PBS mit 1 % PFA aufgenommen. Die
Durchflußzytometrie erfolgte am EPICS.
3.24
Statistische Analyse
Die statistische Auswertung erfolgte anhand des Mann-Whitney-U-Tests und des Fisher’s
Exact Tests mit Hilfe des PC-Programmes SPSS 14.0.
47
Patienten
3.25
Patienten
An den hier durchgeführten Untersuchungen nahmen insgesamt 62 Patienten die in der
Ambulanz der Medizinischen Klinik III des Universitätskrankenhauses in Erlangen
behandelt werden teil. Für die Analyse von Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven
Patienten, wurde in einer Langzeitstudie die Patientin 01 (HLA-A1,-A2, -B8, -B49, -Cw7, Cw7) sowie ihr Sexualpartner Patient 02 (HLA-A3, -A25, -B7, -B18, -Cw7, -Cw12)
untersucht. Die hierfür durchgeführte Querschnittsstudie erfolgte mit 23 HLA-B8-positven
und 33 HLA-B8-negativen HIV-1 infizierte Patienten. Für die zweite Analyse wurde das
heterosexuelle Paar, die Patientin U (HLA-A2, -A3, -B7,- B60(40), Cw0304, Cw0702) und
ihr Sexualpartner, der Patient R (HLA-A24, -A26, -B51, -B38(16), -Cw7, -Cw14)
untersucht. Beide Patienten zeigten trotz der Infektion mit dem gleichen Virus extrem
unterschiedliche Krankheitsverläufe. In einem weiteren Fall wurde der Patient M (HLA-A2,
-A24, B13, -B18, Cw6, -Cw7) untersucht. Die Behandlung mit Steroiden führte bei diesem
zu einem Verlust der bisher guten Kontrolle der HIV Infektion. Der vierte Fall untersuchte
den Patienten F (HLA-A24(9), -A11, -B51(5), -B27, -Cw2, -Cw15), welcher eine normale
Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast aufrechterhalten konnte. Die Studien
wurden durch die Ethik Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität ErlangenNürnberg überprüft und die Teilnehmer gaben ihre Einverständniserklärung. Die
Viruslasten wurden unter Verwendung des Versant HIV-1 RNA Assays (Bayer Diagnostik,
Leverkusen, Deutschland) mit einer Detektionsgrenze von unter entweder 500 Kopien/ml
Plasma (Version 2.0, bis Juli 1998) oder 50 Kopien/ml Plasma (Version 3.0, seit Juli 1998)
bestimmt.
48
Ergebnisse
4
Ergebnisse
4.1
Analyse von Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
Bei der Patientin 01 und ihrem Partner 02 wurde 1998 eine HIV-1 Infektion diagnostiziert.
Es war unklar, wer von beiden Patienten die Infektion auf seinen Partner übertragen hatte.
Patient 01 zeigte über mehrere Jahre eine gute Kontrolle der HIV Infektion. Im Gegensatz
dazu hatte sich bei ihrem Partner, Patient 02, bereits bei Erstvorstellung eine mäßige
Erniedrigung der CD4 Helferzellen auf 321 Zellen/µl und eine Viruslast von 25.000
Kopien/ml gezeigt, weshalb eine ART eingeleitet wurde.
4.1.1
Langzeitanalyse der HLA-B8-positiven Patientin 01
Die HIV Infektion der Patientin 01 wurde 1998 erstmals festgestellt. Zu diesem Zeitpunkt
zeigte sie eine niedrige Viruslast (<500 Kopien/ml) und im Normbereich liegende CD4
Zellzahlen (820 Zellen/µl). Anhand von ELISPOT-Analysen, durchgeführt zu verschiedenen
Zeitpunkten seit ihrer HIV-Erstdiagnose, konnten bei der Patientin 01 HIV spezifische
zytotoxische T-Zellen (CTL) gegen das konservierte auf HLA-B8 restringierte Epitop
FLKEKGGL (FL8, As 90-97) gefunden werden (Abb. 2 A). Im Gegensatz zu der
dauerhaften Erkennung des FL8 Epitopes, wurde ein ebenfalls dominantes und HLA-B8restringiertes Epitop in Gag EIYKRWII, As 260-267 (Goulder et al., 1997) in drei
ELISPOT-Analysen, welche 1998 und 1999 mit frisch isolierten PBMC der Patientin
durchgeführt wurden, nicht erkannt. Über einen Zeitraum von sechs Jahren konnte sie eine
gute Kontrolle der HI-Viren mit einem nur mäßigen Anstieg der Viruslast auf 7.200
Kopien/ml im März 2004, trotz einer Abnahme ihrer CD4 Zellzahlen, aufrechterhalten. Im
November 2004 kam es dann, trotz der anhaltend guten FL8-spezifischen CTL Antwort, zu
einem starken Anstieg der Virämie auf 65.000 Kopien/ml und einem Abfall ihrer CD4 Zellen
auf 201 Zellen/µl (Abb.2 A). Eine antiretrovirale Therapie (ART), welche im Dezember
2004 eingeleitet wurde, führte zu einer raschen Unterdrückung der HIV-1 Virämie.
49
Ergebnisse
Therapie
180
70000
160
SFU
VL
140
120
60000
50000
100
40000
80
30000
60
20000
40
10000
20
0
No
99
bFe
rz
-0
3
0
98
v-
M
98
nJu
VL Kopien/ml
SFU/100000 Zellen
A
J
4
-0
an
No
04
v-
05
bFe
05
nJu
B
ohne Peptid
FLKEKGGL
V1: --R----V2: --RD---V3: ----R--V4: ----Q--Mrz-03
Jun-05
Mar-06
V5: ----M--V6: ----N--V7: ----T--0
50
100
150
200
250
SFU/150000 Zellen
C
ohne Peptid
Mrz-06
WPTVRERM
V1: --AI---V2: --AI-A-0
10
20
30
40
50
60
70
SFU/200000 Zellen
Abb. 2: γ-IFN-ELISPOT-Analyse der FL8 (FLKEKGGL) oder WM8 (WPTVRERM) Erkennung und
ihrer jeweiligen Varianten unter Verwendung von PBMC der Patientin 01 zu verschiedenen
Zeitpunkten. (A) Langzeitanalyse der FL8-spezifischen T-Zellen (weiße Balken) in Korrelation mit der
entsprechenden Viruslast (VL). Für die ELISPOT-Analysen wurden für jeden Zeitpunkt, bis auf März 2003
(1.5x105), PBMC/Well, 105 PBMC/Well eingesetzt. Die experimentell ermittelten Spot Forming Units (SFU)
von März 2003 wurden auf SFU/105 PBMC/Well berrechnet. (B) Erkennung der FL8 und FL8-Varianten durch
PBMC von verschiedenen Zeitpunkten. PBMC von März 2003 (Mrz-03) und Juni 2005 (Jun-05) wurden nur
auf die Erkennung von FL8 und FL8-V4 getestet, PBMC von März 2006 (Mrz-06) auf die Erkennung von FL8
und FL8-Varianten V1-V7. (C) Erkennung der WM8-Varianten durch PBMC im März 2006 (Mrz-06): WM8V1 entspricht der autologen WM8-Sequenz der Patientin 01 bis Januar 2004, WM8-V2 entspricht der
autologen WM8-Seuqenz der Patientin 01 welche im November 2004 erstmals aufkam (siehe Abb. 3).
50
Ergebnisse
Um die Rolle von CTL Fluchtmutationen für den Progress der Krankheit zu untersuchen,
wurden nef Gene der HI-Viren der Patientin 01 aus Plasma Proben von verschiedenen
Zeitpunkten, vor und während der ansteigenden Plasma Virämie, sequenziert. Zusätzlich um
mittels Sequenzvergleich der entsprechenden HLA-Epitope beider Patienten, zu klären wer
die Infektion ursprünglich übertragen hatte, wurden die nef Gene der HI-Viren ihres
Sexualpartners Patient 02 sequenziert. Der Sequenzvergleich auf Aminosäureebene der Nef
Proteine beider Patienten zeigte eine starke Homologie: Die Nef-Sequenz der Patientin 01,
isoliert aus einer Plasma Probe im Juli 2000, unterschied sich nur in vier Aminosäuren von
den Nef Aminosäuren des Patienten 02, welche aus einer Plasma Probe von April 2002
erhalten wurde (Abb. 3). Innerhalb von vier Jahren, von Juli 2000 bis November 2004,
fanden 14 zusätzliche Aminosäure-Substitutionen statt und es entwickelte sich eine fünf
Aminosäuren lange Insertion im Nef Protein der Patientin 01 (Abb. 3). Diese Mutationen
beinhalteten die Reversion von zwei Austauschen welche nur in den HI-Viren des Patienten
02, im Vergleich mit dem Referenzstamm HXB2 (HIV-Datenbank, 2007), zu finden waren
(As: 76, 85). Dies spricht für die Übertragung der Infektion von dem Patienten 02 auf die
Patientin 01. Sechs Aminosäure-Austausche fanden in bereits bekannten CTL Epitopen statt,
welche durch die HLA-Allele der Patienten präsentiert werden konnten. Die Mutationen
innerhalb des immunologisch dominanten B8-restringierten Epitop FL8 (Price et al., 1997;
HIV-Datenbank, 2007) und dem ebenfalls B8-restringierten Nef Epitop WPAIRERM
(WM8-V1) (Kiepiela et al., 2004; HIV-Datenbank, 2007) traten im November 2004 zum
ersten Mal auf und gingen mit dem starken Anstieg der Viruslast einher (Abb. 3: As: 18 und
94). Das stark konservierte FL8 Epitop (HIV-Datenbank, 2007) zeigte eine K-zu-Q
Substitution an Position fünf und das WM8 Epitop eine E-zu-A Substitution an Position
sechs. Innerhalb des auf HLA-A2 begrenzten CTL Epitopes VLEWRFDSRL (HIVDatenbank, 2007) trat im November 2004 eine E-zu-K und eine R-zu-K Mutation auf. Das
auf HLA-A2 restringierte CTL Epitop AFHHVAREL (HIV-Datenbank, 2007) zeigte eine Hzu-R Mutation im Januar 2004, welche im November 2004, einhergehend mit dem Auftreten
einer V-zu-M-Substitution, revertierte.
51
Ergebnisse
A
Pat: Datum: VL:
01 Jan.04
9600 -----------------H---------------------------I---01 Nov.04 65000 -----------------H---------------------------I---Gag HIV 1 HXB2 DIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD
284
B
Pat: Datum: VL:
02
01
01
01
Apr.02 120000 ----------V---AI------T-----G---------R----------Jul.00
1400 ----------V---AI------------G---------R----------Jan.04
9600 ----------V---AI------------G---------R----------Nov.04 65000 --S-------V---AI-A----T-----G---------R----------Nef HIV 1 HXB2 MGGKWSKSSVIGWPTVRERMRRAEPAADRVGAASRDLEKHGAITSSNTAA
50
Pat: Datum: VL:
02
01
01
01
Apr.02 120000 N--D----A------E-----K----V------G-L-------------Jul.00
1400 N--D----A------E-----K----V------G-L-------------Jan.04
9600 N--D----A------E-----R----V------G-L-------------Nov-04 65000 N--D----A------E-----R-----------G----------Q----Nef HIV 1 HXB2 TNAACAWLEAQEEEE.VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEG
99
Pat: Datum: VL:
02
01
01
01
Apr.02 120000 -----Q----------N-------w------------I-----F-----Jul.00
1400 -----Q--------V-N-------w------------I-----F-----Jan.04
9600 --Y--Q--------V-N-------w------------I-----F-----Nov.04 65000 --Y--Q--------V-N-------w------------I-----F-----Nef HIV 1 HXB2 LIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPD*QNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVE
149
Pat: Datum: VL:
02
01
01
01
Apr.02 120000 -.....E--E---NR----M--N--E-------Q---------------Jul.00
1400 -.....E--E---N-----M--N--E-----------------------Jan.04
9600 -.....E--E---N-----M--N--E-----------------R-----Nov.04 65000 -EDE-PE-SE---N-----R--N--E-------K-K---------M---Nef HIV 1 HXB2 PDKIE.EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVAREL
198
Pat: Datum: VL:
02
01
01
01
Apr.02 120000 ----Y--Jul.00
1400 ----Y--Jan.04
9600 ----Y--Nov.04 65000 ----Y--Nef HIV 1 HXB2 HPEYFKNC*
207
Abb. 3: Sequenzvergleich auf Aminosäureebene der Nef Proteine der HI-Viren der Patienten 01, 02 und
des p24 Proteins der HI-Viren von Patientin 01. (A) Sequenzvergleich von einem Teil des p24 Proteins der
HI-Viren der Patientin 01 zu verschiedenen Zeitpunkten. (B) Sequenzvergleich der Nef Proteine der HI-Viren
des Paares zu verschiedenen Zeitpunkten. Aminosäure-Austausche im Vergleich zu HIV-1 HXB2 sind als
Buchstaben angegeben. Das Gag Epitop EI8 ebenso wie das Nef FL8 und WM8 Epitop sind fett gedruckt
dargestellt. Viruslast (VL) und dazugehöriges Datum sind den viralen Aminosäuresequenzen der Patienten
(Pat) zugeordnet. * bedeutet stop codons, - bedeutet Aminosäure entspricht der von HXB2, . bedeutet Lücke.
HXB2: Nef bzw. Gag Sequenz abgeleitet von dem HIV-1 HXB2 Stamm mit durchnummerierten Aminosäuren.
Apr: April; Jul: Juli; Jan: Januar; Nov: November.
Die Sequenzanalyse des gag Genes der HI-Viren der Patientin 01, isoliert aus einer Plasma
Probe von Januar 2004 und November 2004, ergab keine Mutationen innerhalb des auf HLAB8 restringierten Gag Epitopes EIYKRWII (Abb. 3). Dieses Epitop wird häufig von HLAB8-positiven Patienten erkannt (Goulder et al., 1997). Frühere ELISPOT-Analysen von Dr.
Ellen Harrer ergaben jedoch keine Erkennung dieses Epitopes durch CTLs der Patientin 01
aus einem Zeitraum zwischen 1998 und 1999. Eine CTL Antwort auf dieses Epitop wurde
somit während der Krankheitsprogression nicht getestet.
52
Ergebnisse
4.1.2
Analyse der CTL Erkennung von autologen viralen Varianten der Patientin 01
Um den Einfluss der neu aufgetretenen Mutationen auf die CTL Erkennung zu untersuchen,
wurden ELISPOT-Analysen mit PBMC der Patientin 01 durchgeführt. Hierzu verwendeten
wir verschiedene Peptid-Varianten, welche die neu beobachteten Aminosäure-Substitutionen
oder weitere Mutationen, aufgetreten in anderen Patienten, enthielten. Die Erkennung der
FL8 Varianten wurde anhand von aufgetauten PBMC von März 2003 und Juni 2005, ebenso
wie unter Verwendung von frisch isolierten PBMC von März 2006, getestet. Mit Ausnahme
der Peptidvariante FLRDKGGL (FL8-V2), wurden alle anderen FL8 Varianten zwar
erkannt, jedoch in allen Fällen weniger stark als das FL8 Wildtyp-Peptid (Abb. 2 B). Die
Peptid-Sensitisierungskapapzität des Wildtyp-Peptides FL8 und der Variante FLKEQGGL
(FL8-V4) wurden mittels Peptid-Verdünnungsreihen unter Verwendung von CTL-Linien
ermittelt. Diese Zelllinien wurden durch die Stimulation von PBMC der Patientin 01 mit den
Peptiden FL8 oder FL8-V4 hergestellt. Die Peptid-Sensitisierungskapapzität des FL8
Peptides war zweifach höher als die der autologen Variante FLKEQGGL (FL8-V4) welche
im November 2004 erstmals in Erscheinung trat (siehe auch Abb. 3). Diese Beobachtung war
unabhängig davon, ob für das Titrationsexperiment FL8 oder FL8-V4 stimulierte CTLLinien eingesetzt wurden. Zusätzlich wurde von mir die CTL Antwort gegen das ebenfalls
HLA-B8-restringierte Nef-Epitop WM8 untersucht. Hierzu wurden PBMC von einem
Zeitpunkt nach Anstieg der Virämie und folgende Peptide verwendet: WPAIRERM (WM8V1) entsprechend dem originalen autologen Virus, WPAIRARM (WM8-V2) entsprechend
dem ursprünglichen autologen Virus vom November 2004 und WPTVRERM (Wildtyp)
entsprechend der HIV-1 HXB2 Sequenz (HIV-Datenbank, 2007). Die ELISPOT-Analysen
ergaben eine gute CD8+ T-Zell Reaktion gegen die ursprüngliche autologe Sequenz
WPAIRERM und eine stark abgeschwächte CTL Antwort gegen die Variante mit dem E-zuA Austausch im Peptid WM8-V2 (siehe auch Abb. 3). Dies deutet stark darauf hin, dass die
E-zu-A Substitution eine CTL Fluchtmutante darstellt (Abb. 2 C). Interessanterweise wurde
das Peptid WPTVRERM, welches der HIV-1 HXB2 Sequenz entspricht, nur schwach
erkannt. Das erklärt das CTLs der Patientin 01 gegen dieses Epitop in früheren Studien
unentdeckt blieben, nachdem bei diesen Experimenten Nef-Peptide, entsprechend der HIV-1
HXB2, Sequenz verwendet wurden. ELISPOT-Analysen die mit frisch isolierten PBMC aus
dem Jahr 2006 durchgeführt wurden, zeigten keine T-Zellantwort gegen die HLA-A2
restringierten CTL Epitope VLEWRFDSRL (autologe Variante bis Januar 2004),
53
Ergebnisse
AFHHVAREL (autologe Variante bis Juli 2000), (HIV-Datenbank, 2007) und die Variante
AFHHMAREL (autologe Variante im November 2004).
4.1.3
Korrelation von HLA-B8 mit Mutationen innerhalb des FL8 Epitopes bei HIV-1
infizierten Patienten
Um die Prägung von HLA-B8 auf die Sequenz des FL8 Epitopes zu untersuchen, wurden die
nef Gene der HI-Viren von insgesamt 56 HLA-Klasse-I typisierte HIV-1 infizierte Patienten
ausgewertet. Die entsprechende virale RNA bzw. provirale DNA wurde aus Plasma oder
PBMC isoliert. Die Untersuchungen zu den jeweiligen Nef Aminosäuren in 23 HLA-B8 und
33 nicht-B8 Patienten ergab, dass 57 % (13/23) der B8-positiven Patienten Viren mit
Mutationen im FL8 Epitop aufwiesen, wohingegen in nur 24 % (8/33) der B8-negativen
Patienten Viren mit Substitutionen in diesem Bereich zu finden waren (P = 0.024, Fisher
Exact Test). Bei 48 % der B8-positiven Patienten konnten Aminosäure-Austausche an
Position 5 gefunden werden, während nur 6 % der nicht-B8 Patienten an dieser Position
Mutationen zeigten (P = 0.001, Fisher Exact Test). Weder in den Viren der B8-positiven,
noch in denen der B8-negativen Patienten, konnten Substitutionen an den Positionen 2, 6, 7
und 8 innerhalb des FL8 Epitopes gefunden werden (Tab. 11). Ebenso konnte kein
signifikanter Unterschied in Bezug auf auftretende Mutationen an den Positionen 1, 3 und 4
zwischen den HLA-B8-positiven und B8-negativen Patienten festgestellt werden.
54
Ergebnisse
Tab. 11: Sequenzvariationen innerhalb des B8-restringierten FL8-Epitopes.
HLA-B8-positive Patienten (n = 23)
HLA-B8-negative Patienten (n = 33)
Mutationen innerhalb FL8
n1 =
Mutationen innerhalb FL8
FLKEQGGL
4
FLREKGGL
FLKENGGL
3
FLRKEGGL
FLKEMGGL
1
FLRKKGGL
FLKETGGL
1
FLQEQGGL
FLKEEGGL
1
FLIAKGGL
FLREKGGL
1
LLKEKGGL
FLRDKGGL
1
FLRKEGGL
1
CD4 /µl bei Sequenzierung
VL bei Sequenzierung
3302
14.000
CD4 /µl vor ART4
(10-1.703) 3
(50-350.300)
170
VL vor ART4
368
3800
(2-1.609)
307
64.500 (1.500-500.000)
13250
n1 =
3
1
1
1
1
1
(78-818)
P = n.s.
(500-310300)
P = n.s.
(10-697)
P = n.s.
(500-270000)
P = n.s.
Häufigkeit der Variationen an verschiedenen Positionen innerhalb des FL8-Epitopes in %
n=
F
L
K
E
K*
G
G
L
B8:
23
0
0
13
9
48
0
0
0
nicht-B8:
33
3
0
21
9
6
0
0
0
Mutationen sind fett gedruckt. * P = 0.001, Fischer’s Exact Test; n1: Anzahl der Patienten mit der
entsprechenden Mutation; 2 Median, 3 Schwankungsbreite, n.s.: nicht signifikant, VL: Viruslast in
Kopien/ml. 4 Werte gemessen vor ART-Beginn in behandelten Patienten oder zum Zeitpunkt der
Sequenzierung in unbehandelten Patienten.
55
Ergebnisse
4.1.4
Die CTL Antwort in HLA-B8-positiven Patienten auf das FL8 Wildtyp Epitop und
seine jeweiligen Varianten
Das Epitop FLKEKGGL (FL8) ist konserviert und in HLA-B8-positiven Patienten ist es ein
immunologisch dominantes CTL Epitop. Auch in unserer Kohorte erkannten 14 aus 16
getesteten HLA-B8-positiven Patienten in ELISPOT-Analysen die FL8-Sequenz. Hierzu
wurden entweder frisch isolierte PBMC (n = 12) oder T-Zelllinien, hergestellt aus mit Peptid
stimulierten PBMC (n = 4), verwendet. Mit Ausnahme der Patientin 01, wurden die PBMC
der Patienten auf eine FL8 Erkennung, in einer mittleren Zeitspanne von 1,5 Jahren
(Schwankungsbereich 0-9 Jahre) nach Sammlung der für die Sequenzierung der autologen
Viren verwendeten Plasma oder PBMC Proben, getestet. Um den Effekt von Mutationen an
den Positionen 5 und 3 auf die CTL Erkennung zu ermitteln, wurden PBMC von acht HIV-1
infizierten HLA-B8-positiven Patienten (Patienten 01, 04, 07, 13, 16, 19, 20 und 23) mit
FLKEKGGL (FL8) und varianten Peptiden, mit den entsprechenden autologen Mutationen in
FL8 (Patienten 01, 07, 19, 20 und 23), stimuliert. In einem Standard γ-IFN-ELISPOT-Assay
wurden PBMC und CTL-Linien auf die Erkennung von FLKEKGGL (FL8) und bis zu
sieben FL8 Peptid-Varianten (FL8-V1 bis -V7) mit Peptid-Verdünnungsreihen, getestet
(Abb. 4, Tab. 12). In allen Fällen zeigte das FL8 Wildtyp Epitop, im Vergleich zu den FL8
Varianten, die stärkste CTL Antwort. Alle Mutationen beeinträchtigten die CTL Erkennung,
in unterschiedlichen Ausmaßen, abhängig von der individuellen CTL-Linie. In allen
Patienten führten die zweifachen Mutationen an Position 3 und 4, KE-zu-RD (wie in FL8V2) zur schlechtesten CTL Erkennung. Zwei der Patienten wiesen in ihren HI-Viren eine Kzu-Q Mutation an Position fünf auf und je ein Patient zeigte eine K-zu-T, eine K-zu-N oder
eine K-zu-M Mutation. Alle acht Patienten erkannten ihre autologen Varianten, jedoch in
jedem Fall schwächer als die FL8-Sequenz (Abb. 4).
56
Ergebnisse
A1
Patient 01 autologe virale Sequenz: FLKEQGGL
A2
Patient 01 autologe virale Sequenz: FLKEQGGL
F
600
400
200
300
500
FL8-V4-stimulierte CTL
400
300
200
100
20
1
0.1
0.01
0
Patient 20 autologe virale Sequenz: FLKETGGL
B2
300
200
0,01
100
20
0
1
0.1
0.01
0
Pept. Konz. (µg/ml)
Patient 20 autologe virale Sequenz: FLKETGGL
G
Patient 04 autologe virale Sequenz: FLKEKGGL
600
500
FL8-V7-stimulierte CTL
100
50
100
FL8-stimulierte CTL
400
300
200
100
0
0
20
1
0.1
0.01
Pept. Konz. (µg/ml)
0
20
C2
Patient 23 autologe virale Sequenz: FLKEQGGL
500
1
0.1
0.01
Pept. Konz. (µg/ml)
20
0
H
Patient 23 autologe virale Sequenz: FLKEQGGL
FL8-stimulierte CTL
300
200
150
90
60
30
0
0
20
1
0,1
0,01
pept. conc. (µg/ml)
D2
100
0.01
0
Patient 13 autologe virale Sequenz: FLKEKGGL
80
FL8-stimulierte CTL
60
40
20
0
20
0
Patient 19 autologe virale Sequenz: FLKENGGL
FL8-V4-stimulierte CTL
120
100
0.1
100
SFU/50 000 Zellen
400
1
Pept. Konz. (µg/ml)
180
SFU/50 000 Zellen
SFU/50 000 Zellen
0,1
SFU/30 000 Zellen
S FU/100 000 P BMC
SFU/100 000 Zellen
FL8-stimulierte CTL
0
1
0.1
0.01
pept. conc. (µg/ml)
0
20
1
0.1
0.01
Pept. Konz. (µg/ml)
0
Patient 19 autologe virale Sequenz: FLKENGGL
60
FL8-stimulierte CTL
SFU/20 000 Zellen
SFU/20 000 Zellen
1
150
400
50
0
FL8-V6-stimulierte CTL
40
1
0,1
0,01
V3: FLKER GGL
V6: FLKEN GGL
0
20
Pept. Konz. (µg/ml)
1
0,1
0,01
0
Pept. Konz. (µg/ml)
Patient 07 autologe virale Sequenz: FLKEMGGL
E2
70
FL8: FLKEKGGL
20
0
20
E1
150
Pept. Konz. (µg/ml)
500
D1
200
0
20
Pept. Konz. (µg/ml)
C1
FL8-stimulierte CTL
250
50
0
0
B1
SFU/100 000 Ze llen
FL8-stimulierte CTL
SFU/100 000 Zellen
SFU/100 000 Zellen
800
Patient 16 autologe virale Sequenz: FLKEKGGL
350
600
Patient 07 autologe virale Sequenz: FLKEMGGL
V1: FL REKGGL
V4: FLKEQ GGL
V7: FLKET GGL
30
FL8-stimulierte CTL
50
SF U/25 000 Zellen
SF U/25 000 Zellen
60
40
30
20
FL8-V5-stimulierte CTL
20
V2: FL RD KGGL
V5: FLKEM GGL
10
10
0
0
20
1
0,1
Pept. Konz. (µg/ml)
0,01
0
20
1
0,1
0,01
0
Pept. Konz. (µg/ml)
Abb. 4: Anlayse der Peptid-Sensibilisierungskapazität von FL8 und den entsprechenden PeptidVarianten in standardisierten γ-IFN-ELISPOT-Analysen in acht HLA-B8-positiven Spendern. FL8
stimulierte CTL-Linien (A1 bis E1, F bis H), CTL-Linien stimuliert mit den entsprechenden Peptiden die der
autologen Virensequenz entsprachen (A2, C2 bis E2), und PBMC (B2) wurden auf die Erkennung von FL8 und
FL8 Varianten in Peptid-Verdünnungsreihen, getestet. Ergebnisse sind als SFU/1 x 105 (Patienten 01, 16, 20),
0.5 x 105 (Patienten 13, 23), 0.2 x 105 (Patient 19), 0.25 x 105 (Patient 07) und 1.3 x 105 (Patient 04),
angegeben. Jede Peptid-spezifische CTL-Linie wurde auf die Erkennung von FL8 und FL8 Varianten V1-V7,
getestet. Ausgenommen folgende Patienten: Patient 13 (FL8-spezifische CTL-Linie): FL8-V1 bis -V4 und
Wildtyp FL8; Patient 01 (FL8-V4 spezifische CTL-Linie): FL8-V4 und Wildtyp FL8; Patient 19 (FL8 und
FL8-V6 spezifische CTL-Linie): FL8-V4 bis -V7 und Wildtyp FL8. PBMC des Patienten 20 wurde auf die
57
Ergebnisse
Erkennung FL8 und FL8-V7, getestet.
4.1.5
Korrelation zwischen CD4 Zellzahl und Viruslast mit HLA-B8 und den damit
assoziierten Mutationen
Obwohl die HLA-B8-positiven Patienten, sowohl bei Therapiebeginn als auch zum
Zeitpunkt der Nef-Sequenzierungen, im Median höhere Viruslasten und niedrigere CD4
Zellzahlen aufwiesen als die B8-negativen Patienten, waren diese Unterschiede nicht
signifikant (siehe Tab. 11). Die Tabelle 12 fasst die Patientenmerkmale in Bezug auf die
ermittelten CTL Antworten gegen das FL8 Wildtyp Epitop und der Entwicklung von
Mutationen innerhalb der HLA-B8-positiven Patientengruppe, zusammen. Zum Zeitpunkt
der Nef Sequenzierungen waren drei der insgesamt 23 HLA-B8-positiven Patienten ohne
Therapie, fünf hatten die ART aus unterschiedlichen Gründen unterbrochen und 15 waren
unter ART. Trotzdem zeigten 9 dieser Patienten eine signifikante Plasma Virämie, entweder
auf Grund einer vorhandenen Medikamenten-Resistenz oder sie nahmen die Medikamente
nicht ein. Die Sequenzierungen der nef Gene der Patienten 03 und 04 erfolgten zu
Zeitpunkten nach Unterbrechung der ART, bei Neuanstieg der Virämie auf einen
Höchstwert. Zum Zeitpunkt der Nef-Sequenzanalyse, konnte eine signifikant niedrigere CD4
Zellzahl (Median CD4: 164 Zellen/µl, Schwankungsbereich 10-537) bei den HLA-B8positiven Patienten mit Mutationen in den FL8 Epitopen festgestellt werden, als in Patienten
ohne Mutationen im FL8 Epitop (Median CD4: 467 Zellen/µl, Schwankungsbreite 12-1703;
Mann-Whitney U-Test: P = 0.0131). Die Viruslasten zu den Zeitpunkten der NefSequenzierungen waren höher in Patienten mit Viren die Mutationen im FL8 Epitop
aufwiesen, als in Patienten mit Viren ohne FL8 Mutationen. Diese Unterschiede waren nur
dann signifikant wenn lediglich die Patienten mit detektierbaren Viruslasten für die
Auswertungen herangezogen wurden (mit Mutation Median: 89.500, Schwankungsbereich
9.800-350.300; ohne Mutation Median: 10.000, Schwankungsbereich 3.000-160.000, P =
0.0404) oder wenn die historischen Viruslasten vor ART für die Berechnungen in den
Patienten mit unterdrückten Viruslasten mit ART, herangezogen wurden (mit Mutation
Median: 92.000, ohne Mutation Median 12.000, P = 0,0063). Bei acht der 13 Patienten (62
%) mit Mutationen und nur bei zwei von 10 Patienten (20 %) ohne Mutationen wurde das
Stadium AIDS, CDC Kategorie C, diagnostiziert (P = 0.0903, Fisher Exact Test).
58
Ergebnisse
Tab. 12: Merkmale der HLA-B8-positiven Patienten, die assoziiert sind mit der Erkennung
und Sequenzvariation innerhalb von FL8.
Pat.
18
03
20
09
21
01
23
22
10
19
08
11
07
Erkennung
Mutationen innerhalb
FL8 Mutation
Epitope FL8
N
Y
Y
n.d.
n.d.
Y
Y
Y
n.d.
Y
n.d.
n.d.
Y
n.d.
R
R1
n.d.
n.d.
R1
R1
n.d.
n.d.
R1
n.d.
n.d.
R1
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
R
R
K
K
K
K
K
K
K
K
K
R
K
K
D
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
K
T
N
E
Q
Q
N
Q
N
Q
K
M
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
Letzter Zeitpunkt
Zeitpunkt der Sequenzierung
vor ART5
Viruslast
CD4
Viruslast
CD4
(Kopien/ml)
(Zellen/µl) (Kopien/ml) (Zellen/µl)
349
150.000
590
11.000
170
92.000
97
64.000
39
n.d.
unbehandelt
112
500.000
7
63.000
30
n.d.
26
193.000
449
n.d.
24
n.d.
104
n.d.
L
L
L§
L
L
L
L§
L§
L
L
L
L
L
537
455
426
339
279
201
164
133
75
53
18
11
10
61.0002
11.00002
<503
9.8003
33.0003
65.000
<503
<503
35.03003
69.0003
26.55003
32.50003
18.80003
15
N
WT
1.609
240.0004
1.703
160.0002
04
Y
WT
414
239.4004
700
140.0002
06
Y
WT
unbehandelt
575
3.700
§
189
10.000
513
<5003
05
n.d.
WT
§
490
28.000
488
<503
16
Y
WT
24
Y
WT
unbehandelt
445
4300
14
Y
WT§
19
32.000
433
<503
§
13
Y
WT
162
500.000
330
3.0003
§
17
Y
WT
282
1.500
297
14.0002
§
12
n.d.
WT
2
70.000
12
10.0003
Patienten (Pat.)mit einer CDC Kategorie C Diagnose sind fett gedruckt dargestellt. Y: Erkennung von FL8 in
ELISPOT-Analysen; N: keine Erkennung; R: zwei bis 12-fach reduzierte Peptid-Sensitisierungskapazität der
autologen viralen Sequenz; n.d.: nicht durchgeführt. Aufgetretene Mutationen in FL8 sind fett gedruckt
dargestellt. Virale Sequenzen wurden aus Plasma erhalten, nur Proben mit der folgenden Kennzeichnung §
wurden aus PBMC gewonnen. 1: ELISPOT Ergebnisse für die so markierten Patienten sind in Abb. 4.1.3
dargestellt. 2: Nef-Sequenzierungen durchgeführt während einer Unterbrechung der antiviralen Therapie
(ART); 3: Viruslast gemessen während der ART; 4: hohe Viruslast vermutlich wegen einer primären HIV-1
Infektion. 5: letzte Messwerte vor dem Beginn der ART bei behandelten Patienten. Anzahl der CD4 Zellen
zum Zeitpunkt der Sequenzierung waren höher in Patienten ohne Mutationen (Median: 467 Zellen/µl) als bei
Patienten mit Mutationen (Median: 164 Zellen/µl, Mann-Whitney U-Test P = 0.0131). Wenn die Patienten mit
unterdrückter Viruslast zum Zeitpunkt der Sequenzierung nicht berücksichtigt wurden, zeigten Patienten mit
Mutationen und detektierbaren Viruslasten, höhere Viruslasten in Gegenwart von Mutationen (Median:
89.500 Kopien/ml) als Patienten ohne Mutationen (Median: 10.000, P = 0.0404, Mann-Whitney U-Test). Der
Unterschied der Viruslasten zum Zeitpunkt der Sequenzierung war ebenfalls signifikant (P = 0.0063), wenn
die Viruslasten vor ART von den Patienten mit nicht detektierbaren Viruslasten für die Signifikanzberechnung
herangezogen wurden (mit Mutation Median: 92.000 Kopien/ml, ohne Mutation Median: 12.000 Kopien/ml).
59
Ergebnisse
4.2
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren bei
einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion durch das
gleiche Virus
Die Patientin U wurde von ihrem Partner R mit HIV-1 infiziert. Während der Patient R in
einem Zeitraum von 12 Jahren eine Progression in das Stadium AIDS zeigte, ist es der
Patientin U möglich, die Infektion außergewöhnlich gut zu kontrollieren.
4.2.1
Klinische Daten der Patienten U und R
Die symptomlose HIV Infektion der Patientin U wurde im Mai 2006 erstmals festgestellt. Zu
diesem Zeitpunkt zeigte sie eine Viruslast unter der Nachweisgrenze (<50 Kopien/ml) und
im Normbereich liegende CD4 Zellzahlen (623 Zellen/µl) mit einem normalen CD4-zuCD8-Verhältnis (CD4/CD8: 1,3). Auch zwei Jahre nach Erstdiagnose konnte sie die extrem
gute Kontrolle der Virämie (260 Kopien/ml, Mai 2008) und normale CD4 Zellzahlen (625
Zellen/µl, Mai 2008) aufrechterhalten. Die Tabelle 13 stellt die Patientenmerkmale des
Paares in Bezug auf Erstdiagnose, angenommenen tatsächlichen Zeitraum der Infektion
sowie den klinischen Parametern der HIV Infektion (Krankheitssymptome, Viruslast, CD4
Zellzahlen, CD4-zu-CD8-Verhältnis), gegenüber.
Tab. 13: Patientenmerkmale und klinische Parameter der HIV Infektion
Patient:
Erstdiagnose
Infektionszeitraum
Klinische Symptome
CD4 (Zellen/µl)
U ( weiblich)
R (männlich)
Mai 2006*
April 2006*
Zwischen 1993 und 2006
wahrscheinlich 1993
keine
623 (Mai 2008: 625)
26
1,3
0,1
<50 (Mai 2008: 260)
240000
CD4/CD8
Viruslast (Kopien/ml)
Panzytopenie, BK-Virus induzier
Blasenentzündung
* keine Therapie
60
Ergebnisse
4.2.2
Virologische Untersuchungen zur Detektion der HI-Viren der Patientin U
Um die in extrem geringer Anzahl vorhandenen HI-Viren der Patientin U nachzuweisen,
wurde provirale DNA aus zuvor angelegten PHA-Blasten von einem Zeitpunkt im Mai 2006
isoliert und die nef Gene amplifiziert (siehe Abb. 5). Um zudem die Replikations- und
Infektionsfähigkeit der HI-Viren der Patientin zu überprüfen, wurden Kokultivierungen aus
CD8-depletierten PBMC der Patientin U (Dezember 2007) und des Patienten R (Dezember
2007), mit nicht-infizierten, ebenfalls CD8-depletierten PHA-Blasten (gesunde Spender),
angelegt (siehe Methoden, abgewandeltes Protokoll der AIDS Clinical Trail Group). 14 Tage
nach Infektion wurden im Überstand die p24-Konzentrationen für die Patientin U, 3.500
pg/ml und für den Patienten R, 1.029 pg/ml gemessen. Zudem konnten die so gewonnenen
Zellkulturüberstände für die Infektion von PBMC von zwei weiteren gesunden Spendern
verwendet werden. Die quantitative Bestimmung der Infektiosität wurde nach 22 Tagen in
den Zellkulturüberständen der so infizierten PBMC mittels Endpunkt-Verdünnung im p24ELISA, bestimmt. Die hieraus errechneten MOI (Vielfachheit der Infektion) ergaben bei
Infektion mit Virenüberständen der Patientin U für den Spender A eine MOI von 0.001 und
für den Spender B 0.0004. Bei Infektion mit Virenüberständen des Patienten R ergaben sich
für beide Spender eine MOI von 0.001. Dies zeigte dass die Viren beider Patienten
vergleichbar infektiös waren und replizierten.
4.2.3
Sequenzvergleich auf Aminosäureebene verschiedener Regionen der HI-Viren
beider Patienten
Um eine potenzielle Abschwächung der HI-Viren der Patientin U aufgrund von Mutationen
in funktionell wichtigen Bereichen zu untersuchen und um einen möglichen Zusammenhang
mit den auf die HLA-Allele der Patienten bezogenen Epitope zu sehen, wurden verschiedene
Regionen
des
HIV
Genoms
beider
Patientenviren
sequenziert.
Bis
auf
die
Aminosäuresequenz der Pol Region (As: 1 bis 450) wurden die Sequenzen der Gag, Vif,
Vpu, Vpr und Nef Proteine in vollständiger Länge mittels etablierter PCR-Technik und
spezifischen Primern, erhalten (siehe Abb. 5). Aufgrund der geringen Plasmavirämie wurde
zur Analyse der viralen Sequenz der Patientin U eine Sequenzierung von proviraler HIV-1DNA aus PHA-Blasten durchgeführt. Diese PHA-Blasten wurden aus PHA-stimulierten
PBMC der Patienten im Dezember 2006 bzw. Dezember 2007 (Nef), angelegt. Weiterhin
61
Ergebnisse
wurden virale Sequenzinformation für Pol, Gag, Vif, Vpu, Vpr und Nef aus den bereits
beschriebenen Zellkulturüberständen von einem Zeitpunkt im Dezember 2007 durch Reverse
Transkription und Sequenzierung viraler RNA erhalten. RNA der HI-Viren des Patienten R
wurden aus Plasma von einem Zeitpunkt im Mai 2006 extrahiert. Der Sequenzvergleich auf
Aminosäureebene beider Patientenviren ergab zum Teil starke Aminosäureabweichungen.
Vor allem im Nef Protein zeigten sich 21,2 % Unterschiede (45 Austausche bei insgesamt
212 As) mit einer ungewöhnlichen fünf Aminosäuren langen Deletion in der C-terminalen
Region (As 161 bis 165). Im Vergleich dazu zeigten sich in Gag nur 6,3 %, (32 von 503 As),
in Pol 6,4 %, (29 von 450 As) und zusammengenommen in Vif, Vpu und Vpr 8,7 % (37 von
422 As) Austausche. In Nef konnten Aminosäure-Substitutionen in drei funktionell
wichtigen Bereichen gefunden werden: Die beiden Aminosäuren welche die Schnittstelle für
die HIV-1 Protease in Nef eingrenzen (As 55 und 58) mit A-zu-V (As 56) und E-zu-D (As
59) Austausch (Freund et al., 1994, Review Geyer et al., 2000), die erste Aminosäure (As 62)
der Interaktionsstelle für Nef mit dem humanen Protein PACS-1 mit E-zu-Q Mutation
(Piguet et al., 2000) und die erste Aminosäure (As 174) der Interaktionsstelle für die humane
vakuoläre ATPase (V1H) mit D-zu-G Mutation (Lu et al., 1998). Einige Mutationen konnten
in den HIV Sequenzen beider Patienten beobachtet werden. Viele davon befanden sich in
bereits bekannten CTL Epitopen, welche durch die HLA-Allele des Patienten R präsentiert
werden könnten: Pol HLA-B51 Epitop TAFTIPSI (Sipsus et al., 1997; Sabbaj et al., 2003)
mit I-zu-T Mutation, Vpr HLA-B51 Epitop EAVRHFPRI (Lia et al., 2006; Frahm et al.,
2007) mit I-zu-P Mutation, Nef HLA-A24 Epitope NYTPGPGVPY (HIV-Datenbank, 2007;
Choppin et al., 2001) mit V-zu-I Mutation, Nef HLA-A24 Epitop RYPLTFGWCY (HIVDatenbank; Choppin et al., 2001) mit F-zu-L Mutation und HLA-B51 Epitop
DSRLAFHHVA (Connan et al., 1994; HIV-Datenbank, 2007) mit R-zu-S und V-zu-R
Mutation (siehe Abb.5). Dies deutet stark auf eine Selektion der entsprechenden
Epitopvarianten durch CTLs des Patienten R hin und spricht für eine Übertragung dieser
bereits durch seine HLA-Allele genomisch geprägten, HI-Viren auf die Patientin U.
62
Ergebnisse
Gag
Pat: date:
VL:
Pol Pat: date:
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- - -I - -- -Q - -- - -- - -- -- - -- - -- R- - -L - -- - -- -- - -- - -- S U. De z -0 7
22 0 - - -- - -I -- - -Q - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -Ga g
HI V- 1 H X B2 MG AR A SV L SG GE L DR W EK I RL RP G GK K KY KL K HI V WA S RE LE R FA V NP G L
50
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- D -- - -- -T - -- - -X X -- -- - -K - -F -- - -- - -- - -- -- - -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - -- D -- -- - -A - -- -- - -- - -- - -K -- F -- - -- -- - -- - K- - VS -- - -Ga g
HI V- 1 H X B2 LE TS E GC R QI LG Q LQ P SL Q TG SE E LR S LY NT V AT L YC V HQ RI E IK D TK E A
100
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 E -- - -- - -- -- - -T Q QA A -- -- - -N - S- -- - -- - -- - -M -- - -- - -P L U. De z -0 7
22 0 E -- - -- -- - -- - .. .N V -- - -- - -N -S - -- - -- -- - -- L -- - -- -- - -Ga g H IV -1 H X B2 LD KI E EE Q NK SK K K. . AQ Q AA AD T GH S NQ VS Q NY P IV Q NI QG Q MV H QA I S
148
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - T- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -Ga g H IV -1 H X B2 PR TL N AW V KV VE E KA F SP E VI PM F SA L SE GA T PQ D LN T ML NT V GG H QA A M
198
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- - -- - -- -- - -- - L- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - -- - -- -- - -- - -- -L - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -Ga g H IV -1 H X B2 QM LK E TI N EE AA E WD R VH P VH AG P IA P GQ MR E PR G SD I AG TT S TL Q EQ I G
248
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- K -- -- - -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - K- - -- - -- -- - -Ga g H IV -1 H X B2 WM TN N PP I PV GE I YK R WI I LG LN K IV R MY SP T SI L DI R QG PK E PF R DY V D
298
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - S- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - -- - -- -- - -T - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -Ga g H I V- 1
H X B2 RF YK T LR A EQ AS Q EV K NW M TE TL L VQ N AN PD C KT I LK A LG PA A TL E EM M T
348
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -T A -- -- - -- - K- - -- X- - -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - L- - PT A- - -- - -- -K - -- - T- - -- -- - -Ga g H I V- 1
H X B2 AC QG V GG P GH KA R VL A EA M SQ VT N SA T IM MQ R GN F RN Q RK IV K CF N CG K E
398
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- I- - -- - -- -- X -- - -- - -- -- - -- E -- -- - -- - -- - -- -- H -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - I- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- P -- -- - -Ga g H I V- 1
H X B2 GH TA R NC R AP RK K GC W KC G KE GH Q MK D CT ER Q AN F LG K IW PS Y KG R PG N F
448
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -- -- - -- S -- -- - -- - F- E -- -- - -Q - -D -- - -- - -- - A- -K - -- - -- - U. De z -0 7
22 0 - - -- - -- -- - -- - -- -F - .- V -- - SQ -- D -- - -- -- - -- - -K - -- -- - -Ga g H I V- 1
H X B2 LQ SR P EP T AP PE E SF R SG V ET TT P PQ K QE PI D KE L YP L TS LR S LF G ND P S
498
R. Ma i -0 6 2 40 0 00 -U. De z -0 7
22 0 - G a g H IV -1 H X B2 SQ *
50 1
Vif Pat: date:
Nef Pat: date:
VL:
R . M ai -0 6 2 4 00 00 -- - -- - -- -- - -- - -- - -N -- - -- - -Y -- - R- R -- G K- -- - -- - -- T- - K
U . D ez -0 7
2 20 -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- Y -- -R - R- - GK - -- -- - -- - T- -K
V i f HI V -1 HX B2 ME N RW Q VM IV W QV D RM R IR TW K SL V KH HM Y VS G KA R GW FY R HH Y ES PH P R
50
R . M ai -0 6 2 4 00 00 -- - -- - -- -- E -K - -V - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - V- -- - -K - -- -- - U . D ez -0 7
2 20 -- -- - -- - -- E- - -- V -- - -- -- - -- - -- -- - -- A -- - -- -- K -- - -- -V i f HI V -1 HX B2 IS S EV H IP LG D AR L VI T TY WG L HT G ER DW H LG Q GV S IE WR K KR Y ST QV D P
100
R . M ai -0 6 2 4 00 00 AT - -- - -- -- - -- - -- E -- -- N -V - -R V- - -S - -- - -- -- - -- - -- -- - U . D ez -0 7
2 20 G- -- - -- - -- -- - -- - E- - X- N- - -- R -- -- S -- - -- - -- -- - -- - -- -V i f HI V -1 HX B2 EL A DQ L IH LY Y FD C FS D SA IR K AL L GH IV S PR C EY Q AG HN K VG S LQ YL A L
150
R . M ai -0 6 2 4 00 00 T- - -- - -R -- - -- - -- A -- -- - -- - -- -- - MD - -- N R- -- - U . D ez -0 7
2 20 T- -- - -- R -- -- - -- - V- - -- -- - -- - -- -- D -- E -- I -- -V i f HI V -1 HX B2 AA L IT P KK IK P PL P SV T KL TE D RW N KP QK T KG H RG S HT MN G H*
1 92
Vpr Pat: date:
VL:
R . M ai -0 6 2 4 00 00 -- - -- - NH -- - -- - Y- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - P- -- - -- - Y- -- - U . D ez -0 7
2 20 -- -- - -- - -- -- - -Y - -- - -- -- - -- - S- -- - -- - -P - -- -- - -Y - -- -V pr
HI V -1 HX B2 ME Q AP E DQ GP Q RE P HN E WT LE L LE E LK NE A VR H FP R IW LH G LG Q HI YE T Y
50
R . M ai -0 6 2 4 00 00 -- - -T - -- VL V -- - -- - -- -- - -- - -Q -- - -- I I- - -- -- - -- - -U . D ez -0 7
2 20 -- -- - -- - -- -- V -- - -- - -- -- - -- - -- -- - I- - -- - -- -- - -- V pr
HI V -1 HX B2 GD T WA G VE AI I RI L QQ L LF IH F RI G CR HS R IG V TR Q RR AR N GA S RS *
97
Vpu Pat: date:
VL:
R . M ai -0 6 2 4 00 00 M- - LV - A- -- - -- - -A - L- -- - -T - -- -- - K- - -- - -R -- - -- N -I Q- - U . D ez -0 7
2 20 M- AL H -A - -- -- - -- - -- - -- -- T -- - -- -- - -- K -- R -- -- - -- I R- -V pu
HI V -1 HX B2 TQ P IP I VA IV A LV V AI I IA IV V WS I VI IE Y RK I LR Q RK ID R LI D RL IE R A
50
R . M ai -0 6 2 4 00 00 -- - -- - -- -. D QE E LS G LM -- - YN - -- -- N -U . D ez -0 7
2 20 -- -- - -- - -. DQ E EL S NL - -- -- Y -- - -- N- V pu
HI V -1 HX B2 ED S GN E SE GE I SA L VE M GV EM G HH A PW DV D DL *
63
VL:
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- - -- -P - -- - -- -- - -- - -- I -- -- - -- - -- -G - -- - -- - T- S- - -U. D e z- 0 7
22 0 - - -- - -- -P - -- - -K -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -. S -- - L- - -- S- - -P ol HI V -1 HX B2 F F RE D LA FL Q GK A RE FS S EQ T RA N SP TR R EL Q VW GR D NN S PS E AG AD R QG
50
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -L S L- -I - -- - -- -- A -- V -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- N -- -- - -U. D e z- 0 7
22 0 - - -- - -- -I - -- - -- -- A -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- N -- -- - -P ol HI V -1 HX B2 T V SF N FP QV T LW Q RP LV T IK I GG Q LK EA L LD T GA DD T VL E EM S LP GR W KP
1 00
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- V P- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - LU. D e z- 0 7
22 0 - L -- - -- -- - -- - -- -- V P- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - LP ol HI V -1 HX B2 K M IG G IG GF I KV R QY DQ I LI E IC G HK AI G TV L VG PT P VN I IG R NL LT Q IG
1 50
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- I -- - -- -- - -U. D e z- 0 7
22 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- I -- - -- -- - -P ol HI V -1 HX B2 C T LN F PI SP I ET V PV KL K PG M DG P KV KQ W PL T EE KI K AL V EI C TE ME K EG
2 00
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -U. D e z- 0 7
22 0 - - -- X -- -X - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - K- - -- - -- -- - -P ol HI V -1 HX B2 K I SK I GP EN P YN T PV FA I KK K DS T KW RK L VD F RE LN K RT Q DF W EV QL G IP
2 50
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- - Q- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- T -- K -- -- - -U. D e z- 0 7
22 0 - - -- - Q- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- K- - -- - -- -- - -- T X- - -- -- - -P ol HI V -1 HX B2 H P AG L KK KK S VT V LD VG D AY F SV P LD ED F RK Y TA FT I PS I NN E TP GI R YQ
3 00
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- - -- -- - -- - -- -C - -- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -U. D e z- 0 7
22 0 - - -- - -- -- - -- - -- -C - -- - -- - -C -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -P ol HI V -1 HX B2 Y N VL P QG WK G SP A IF QS S MT K IL E PF RK Q NP D IV IY Q YM D DL Y VG SD L EI
3 50
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- A -V -- - -- - -- G- - F- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -U. D e z- 0 7
22 0 - - -- A -- -- - -- - -- E- - F- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -P ol HI V -1 HX B2 G Q HR T KI EE L RQ H LL RW G LT T PD K KH QK E PP F LW MG Y EL H PD K WT VQ P IV
4 00
R. M a i- 0 6 2 40 00 0 - - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - -- - -- -- - -- K -- -- - I- - -- - -- -- V -U. D e z- 0 7
22 0 - - -X - -- -- - -- - -X -- - -- - -- - -X A- T -- K -- R- - -- - A- - -- -- X -P ol HI V -1 HX B2 L P EK D SW TV N DI Q KL VG K LN W AS Q IY PG I KV R QL CK L LR G TK A LT EV I PL
4 50
VL:
R . M ai - 06 24 00 0 0
U . D ez - 06
<50
U . D ez - 07
220
U . D ez - 07
220
N ef
H IV - 1 HX B 2
R . M ai - 06 24 00 0 0
U . D ez - 06
<50
U . D ez - 07
220
U . D ez - 07
220
N ef
H IV - 1 HX B 2
R . M ai - 06 24 00 0 0
U . D ez - 06
<50
U . D ez - 07
220
U . D ez - 07
220
N ef H I V- 1 HX B 2
R . M ai - 06 24 00 0 0
U . D ez - 06
<50
U . D ez - 07
220
U . D ez - 07
220
N ef
H IV - 1 HX B 2
R . M ai - 06 24 00 0 0
U . D ez - 06
<50
U . D ez - 07
220
U . D ez - 07
220
N ef
H IV - 1 HX B 2
- -- -- - -R - LP - -S TI - -- - -- T PP T- - -- - VG -- - V- - -- - -- -- - -- - -- -- - -- - LV - -- AI - -- - K- . .. .T - -- - -G -- - V- Q -- D -- -- - -- - -- -- - -- - LV - -- AI - -- - K- . .. .T - -- - -G -- - V- Q -- D -- -- - -- -- - -- - -- -L V -- - AI - -- -K - .. . .T -- - -- G -- - V- Q- - D- - -- -- - M GG KW S KS S VI G WP TV R ER M RR . .. .A E PA A DR VG A AS R DL E KH GA I TS S
46
- -- -N - -D - -- V -- -- - K- - -- - -- R- - -- - -- -- - -- - L- - -- -- - -- - -- S. . -X - V- - D- -Q - .- - -- - -- K- - -- - -- -- - -G - L- - -- -- - -- - -- S. . -T - V- - D- -Q - .- - -- - -- K- - -- - -- -- - -G - L- - -- -- - -- -- - S. . -T -V - -D - -Q - .- -- - -- - K- -- - -- - -- - -G -L - -- - -- -- - N TA AT N AA C AW L EA QE E .E E VG F PV TP Q VP L RP MT Y KA A VD L SH FL K EK G
95
- -- -- - Y- - -- - -- -- - -- - N- - -- -- - W- - -- -- - -I - -- - -L -- - -- - -- -- - Y- P K- - E- -- - -V - -- - -- -- - W- - -- -- - -I - F- - -L -- - F- - -- -- - Y- P K- - E- -- - -V - -- - -- -- - W- - -- -- - -I - F- - -L -- - F- -- - -- - Y- PK - -E - -- - -V -- - -- - -- -W - -- - -- - -I -- - -- L -- -F - G LE GL I HS Q RR Q DI LD L WI Y HT Q GY FP D xQ N YT PG P GV R YP L TF GW C YK L
14 5
- -- D- - -V - -V T SR -- S C- - -- I -Q -- - -- - -K -- - M- K -- - S- -- - -R - -- -- P EG - -. . .. .- S C- - -- M N- -- T X- - -- -- - M- K -- - S- -- - -R - -- -- P EG - -. . .. .- S C- - -- M N- -- T G- - -- -- - M- K -- - S- -- - -R -- - -- P EG -- . .. . .- S C- -- - MN - -- TG - -- - -- - M- K- - -S - -- -- R V PV EP D KI E EA N KG EN T SL L HP V SL HG M DD P ER EV L EW R FD S RL AF H HV A
19 5
- -- -- - -- - xx
- -- -- - -Y - D- -- -- - -Y - D-- - -- - -Y -D R EL HP E YF K NC *
20 7
Ergebnisse
Abb. 5: Sequenzvergleich auf Aminosäureebene der Gag, Pol, Vif, Vpu, Vpr und Nef Proteine der HIViren der Patienten U und R. Bis auf die Aminosäuresequenz der Pol Region (Protease und Teil der
Reversen Transkriptase) sind die jeweiligen Proteine in vollständiger Länge dargestellt. Abweichungen der
Aminosäuren im Vergleich zu HXB2 sind als Buchstaben gekennzeichnet. Die entsprechenden Viruslasten
sind den entsprechenden Zeitpunkten der jeweiligen Virensequenzen zugeordnet. Virensequenzen des
Patienten R wurden unter Verwendung von Plasma aus RNA erhalten. Virensequenzen der Patientin U
wurden unter Verwendung von PHA-Blasten aus proviraler DNA erhalten. -RNA aus Virus-haltigem
Kulturüberstand, welcher durch Kokultivierung von CD8-depletierten PBMC von Dez-07 der Patientin U am
Tag 22 gewonnen wurde; . bedeutet: Deletion; X bedeutet: Sequenz nicht detektierbar; * bedeutet:
Stopcodon; x bedeutet: vorläufiges Stopcodon in HXB2; HXB2: Durchnummerierte Aminosäuresequenz von
HIV-1 Stamm HXB2. Dez.: Dezember.
4.2.4
Prüfung einer Beteiligung von Apobec3G auf die Mutationsrate der Viren in der
Patientin U
Da sich das Nef Protein der HI-Viren der Patientin U als stark mutiert zeigte, stellte sich die
Frage, ob diese Mutationen durch das humane Apobec3G-Molekül induziert wurden. Da
Apobec3G eine G-zu-A Hypermutation (Sheehy et al., 2002) bewirkt, wurde ein spezielles
Analyseprogramm, Hypermut2.0 (www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/HYPERMUT/hypermut.
html)
angewendet.
Die
Kalkulationen
ergaben
keine
Apobec3G
induzierten
Hypermutationen. Zusätzlich um dieses Ergebnis zu bestätigen und um einen eventuellen
Trend der vorhandenen Nukleotid-Austausche zu erkennen, ermittelten wir die Anzahl der
jeweils erfolgten Nukleotid-Substitutionen im Nef Protein der HI-Viren der Patientin U im
Vergleich zu denen des Patienten R mittels eines Sequenzvergleichs auf Nukleotidebene
(Abb. 6). Die Häufigkeit der Austausche eines jeweiligen Nukleotides zu einem anderen
ergab ein eher gleichmäßiges Verteilungsmuster ohne erkennbare, Bevorzugung einer
Austauschrichtung (Substitutionshäufigkeiten: 13 A-zu-G, 11 G-zu-A, 8 A-zu-C, je 6 C-zu-T
und T-zu-C, je 4 A-zu-T und G-zu-C, 3 T-zu-G, je 2 C-zu-G und T-zu-A und 1 G-zu-T).
Somit zeigte sich kein Hinweis für G-zu-A Hypermutationen, was eine relevante Beteiligung
von Apobec3G an den Mutationen unwahrscheinlich macht.
64
Ergebnisse
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
Pat: Datum:
R Mai-06
U Dez-06
HIV-1 HXB2
4.2.5
---------------------C-----C-CCC-------T-----A-----------------------------CT-AG-----------G--A---ATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGATTGGATGGCCTACTGTAAG
50
----------------A--CCACCAACAGCT-------------T-G-------------A----A--............---------------G--GGAAAGAATGAGACGAGCT............GAGCCAGCAGCAGATAGGG
100
---------T------------------------G-----------------------------A---------C-----------------------TGGGAGCAGCATCTCGAGACCTGGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGC
150
-------------A------K-A----------G------------------------......-G----M------T---------C------C---AATACAGCAGCTACCAATGCTGCTTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGA
200
-R----A-AAG----Y----------G----------------------------A-...-A-------------A----------------------GGAGGAGG...TGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAA
250
----------A------T-------------------------------------------G----C-C-----------------------------TGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGG
300
------------------T----------------------------C-T
------------------T------C--A---------G----------GGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCT
350
----------A----A-----A-------------------------------G----------G---------------------------------GTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGCAGAACTACACAC
400
-----------A----------C--------A----------------------------A------T----------C------------T----T-G
CAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTA
450
-----------T--------AG---------TT-C-TC-A---------G
---------------CC......-----G.........--A--------G
GTACCAGTTGAGCCAGATAAGATAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACAC
500
-T--------------A-A----AA--Y-------------------A--T--------------A---A-----------CA-R-G-----------CAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAG
550
--------AT-----A----------A-----------------AGA----------AT-----A----------A-----------------AGA--AAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCC
600
--------------------------A*********
-----------------A----A---AG-------CGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGA
636
Abb.
6:
Sequenzvergleich
auf
Nukleotidebene des nef Genes der HIViren der Patienten U und R.
Abweichungen der Nukleotidsequenzen im
Vergleich zu HXB2 sind als Buchstaben
gekennzeichnet.
Die
entsprechenden
Zeitpunkte der jeweiligen Virensequenzen
sind
den
Patienten
zugeordnet.
Virensequenzen des Patienten R wurden
unter Verwendung von Plasma aus RNA
erhalten. Virensequenzen der Patientin U
wurden unter Verwendung von PHABlasten aus proviraler DNA erhalten. .
bedeutet: Deletion; * bedeutet: Stopcodon;
HXB2:
Durchnummerierte
Nukleotidsequenz von HIV-1 Stamm
HXB2.
Prüfung auf das Vorhandensein von anderen hypermutierenden Genen in der
Patientin U
Um mögliche Effekte anderer humaner Apobec3G-ähnlicher Proteine, welche ebenfalls zu
einer Hypermutation der HI-Viren in der Patientin U führen könnten, zu detektieren, wurden
CD8-depletierte
PBMC
der
Patientin
mit
dem
Laborstamm
NL4-3
infiziert.
Zellkulturüberstände wurden an den Tagen 0, 5 und 9 entnommen, um RNA für die
Sequenzanalyse mittels PCR-Technik zu isolieren (Abb. 6). Um die Infektion und
Replikation zu bestätigen, wurde zudem der p24-Gehalt in den Überständen an den Tagen 0
(2.177 pg/ml), 9 (11.695 pg/ml) und 12 (5.850 pg/ml) gemessen. Es konnte kein Anstieg der
Mutationsrate, nach Passage des definierten NL4-3 Laborstammes in CD8-depletierten
PBMC der Patientin U, festgestellt werden (Abb. 7). Dies spricht gegen einen Effekt anderer,
ebenfalls Hypermutationen erzeugender Genprodukte in dieser Patientin.
65
Ergebnisse
NL43 Nef Tag:
0 ATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGATTGGATGGCCTGCTGTAAG
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
50
0 GGAAAGAATGAGACGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGTAT
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
100
0 CTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCT
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
150
0 AACAATGCTGCTTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAAGAGGTGGG
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
200
0 TTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAG
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Ner Tag:
250
0 CTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTA
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
300
0 ATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACAC
5 -------------------------------------------------9 ----------------------R--------------------------NL43 Nef Tag:
350
0 ACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCA
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
400
0 GATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCA
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
450
0 GATAAGGTAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCC
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
500
0 TGTGAGCCTGCATGGAATGGATGACCCTGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGA
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
550
0 GGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCG
5 -------------------------------------------------9 -------------------------------------------------NL43 Nef Tag:
600
0
GAGTACTTCAAGAACTGCTGA
5
--------------------9
--------------------621
Abb. 7: Sequenzvergleich auf Nukleotidebene des nef Genes des Laborstammes NL4-3 an den Tagen 0,
5 und 9 nach Passage in CD8-depletierten PBMC der Patientin U. Abweichungen der Nukleotidsequenzen
im Vergleich zu der NL4-3 Sequenz erhalten am Tag 0 sind als Buchstaben gekennzeichnet. Die
entsprechenden Tage sind den jeweiligen Virensequenzen zugeordnet. NL4-3: Durchnummerierte
Nukleotidsequenz von HIV-1 Laborstamm NL4-3.
4.2.6
Prüfung auf das Vorhandensein eines genetischen Polymorphismus in den
Wirtsfaktoren Apobec3G und CCR5 der Patienten U und R
Genetische Polymorphismen die zu einem besseren Langzeitverlauf im Hinblick auf die
HIV-1 Infektion führen, wurden schon mehrfach beobachtet. So konnte bereits gezeigt
werden, dass der Austausch einer einzelnen Aminosäure, nämlich Asparagin an Position
128 im humanen Apobec3G und Lysin im Apobec3G der afrikanischen grünen Meerkatze,
die Fähigkeit des HIV-1 Vif Proteins zur Bindung und Inaktivierung dieser Wirtsfaktoren
kontrolliert (Bogerd et al., 2004). Um einen solchen genetischen Hintergrund für den extrem
guten Verlauf der HIV-1 Infektion in der Patientin U zu prüfen, wurden zunächst die
66
Ergebnisse
apobec3g Gene beider Patienten sequenziert. Hierzu wurde RNA aus PBMC der Patienten
isoliert und die nach reverser Transkription (unter Verwendung eines spezifischen antisense
Primers) erhaltene cDNA mittles eines spezifischen Primerpaares und etablierter PCR
Methode, amplifiziert. Der Sequenzvergleich auf Aminosäureebene beider Patienten mit
einer Apobec3G Referenzsequenz (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez Zugangsnummer:
AAF182420), zeigte einen einzigen heterozygoten Q-zu-E Austausch an Position 275 (siehe
Abb. 8). Diese Mutation wurde bereits von Do et al., 2005 und Valcke et al., 2006
beschrieben. In beiden Fällen konnte kein Einfluss auf den Infektionsverlauf mit HIV-1
gefunden werden.
Pat. R
Pat. U
APOBEC3G
Pat. R
Pat. U
APOBRC3G
Pat. R
Pat. U
APOBEC3G
Pat. R
Pat. U
APOBEC3G
Pat. R
Pat. U
APOBEC3G
Pat. R
Pat. U
APOBEC3G
Pat. R
Pat. U
APOBEC3G
Pat. R
Pat. U
APOBEC3G
--------------------------------------------------------------------------------------------------MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLD
50
--------------------------------------------------------------------------------------------------AKIFRGQVYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKC
100
--------------------------------------------------------------------------------------------------TRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMK
150
--------------------------------------------------------------------------------------------------IMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPP
200
--------------------------------------------------------------------------------------------------TFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKH
250
-------------------------------------------------------------------------X------------------------GFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFIS
275
300
--------------------------------------------------------------------------------------------------KNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTF
350
------------------------------------------------------------------VDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN
384
Abb. 8: Sequenzvergleich auf Aminosäureebene des humanen Apobec3G Leserahmen der Patienten U
und R mit einer Apobec3G Referenzsequenz. Die Aminosäuresequenzen wurden nach Extraktion von
mRNA (aus PBMC der Patienten), Reverser Transkription und Amplifikation der cDNA erhalten. X: bedeutet
heterozygote Q-zu-E Abweichung (heterozygoter Nukleotidaustausch C-zu-G) der Aminosäure im Vergleich
zu der Referenz Apobec3G Sequenz (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez Zugangsnummer: AAF182420).
Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass eine 32 Basendeletion in CCR5, einem wichtigen
67
Ergebnisse
Korezeptor für HIV-1, homozygote Merkmalsträgern vor einer Infektion mit CCR5-tropen
HIV-1-Varianten schützt. Heterozygote Träger des d32CCR5-Allels zeigen eine verzögerte
Progression, in das Stadium AIDS (Liu et al. 1996; Eugen-Olsen et al., 1997). Aus diesem
Grund wurde das CCR5 Gen beider Patienten aus PBMC in Form von genomischer DNA
extrahiert und mit einem spezifischen Primerpaar amplifiziert. Die Abb. 9 zeigt die
amplifizierten PCR Produkte der CCR5 Gene beider Patienten. Der Vergleich mit den
amplifizierten CCR5 Allelen eines homozygoten Spenders ohne 32 Basendeletion und den
ebenfalls amplifizierten CCR5 Allelen eines heterozygoten Merkmalsträgers dieser
500
Abb. 9: Agarosegel zur Detektion einer Homobzw. Heterozygoten 32 Basendeletion des
CCR5 Alleles. Die PCR Produkte der CCR5 Gene
der Patienten U und R wurden zusammen mit den
angegebenen Kontrollen in einem 4 % Agarosegel
aufgetrennt. Homozygot: bedeutet PCR Produkt
des CCR5 Genes eines Spenders mit homozygoten
CCR5
Allelen
ohne
32
Basendeletion;
Heterozygot: bedeutet PCR Produkt des CCR5
Genes
eines
bekannten
heterozygoten
Merkmalsträger der 32 Basendeletion.
ga
t
Ne
Bp
iv
ko
H
nt
e te
ro
ll e
ro
z
Ho yg o
t
m
oz e
yg
Pa
ot
t ie
e
nt
Pa U
ti e
nt
R
Deletion, ergab keine Deletion in den CCR5 Genen beider Patienten (Abb. 9).
400
300
200
100
Zusätzlich sollte eine eingeschränkte Infektiosität der Zellen der Patientin U aufgrund von
mangelhafter CCR5 Expression ausgeschlossen werden. Hierfür wurde die Expression
von CCR5 auf EBV-immortalisierten B-Zellen und CD8-depletierten PBMC der Patientin
U mittels CCR5-Färbung und FACS Analyse mit denen des Patienten R und
verschiedenen Spendern verglichen. Die Abb. 10 zeigt die prozentuale Expression der
CCR5 Rezeptoren auf den EBV-immortalisierten B-Zellen der Patienten U und R.
68
Ergebnisse
B-Zellen Pat.R
B-Zellen Pat.U
10
CCR5
10
10
10
10
4
10
3
15,10 %
10
2
10
1
10
84,90 %
0
0
256
512
768 1024
10
4
3
16,59 %
2
1
83,41 %
0
0
256
512
768 1024
Größe
Abb. 10: FACS Analyse der CCR5 Expression auf EBV-immortalisierten B-Zellen
der Patienten U und R. EBV-immortalisierte B-Zellen der Patienten (Pat) U und R
wurden mit dem Anti-human CCR5 Antikörper, direkt gekoppelte mit dem Farbstoff PE
(Phycoerythrin), gefärbt. In den Dot-Blots der FACS-Analyse ist auf der X-Achse die
Größe und auf der Y-Achse die Fluoreszenzintensität von PE dargestellt.
Die CCR5 Expressionen auf EBV-immortalisierten B-Zellen lag für beide Patienten
(Patientin U: 15,1 % und Patient R: 16,59 %) im gleichen Bereich. Der
Expressionsnachweis von CCR5 auf CD8-depletierten PBMC erfolgte in jedem Fall zwei
Tage nach Stimulation mit PHA. Auch hier war die Expression für die Zellen der Patientin
U (1.92 %) mit der des Patienten R (1,84 %) und der mittlere Expression von 6
verschiedenen Spendern (Mittelwert: 1,94 %, rangierend: 0,32 % - 4%), vergleichbar.
4.2.7
Prüfung von CD8-depletierten PBMC der Patientin U auf Infektionsfähigkeit mit
verschieden tropen HIV-1 Stämmen und deren Replikationskinetik in diesen Zellen.
Um zu überprüfen ob die Zellen der Patientin U mit HIV-1 Stämmen mit unterschiedlichen
Tropismen für CCR5 und CXCR4 infizierbar sind, wurden CD8-depletierte PBMC der
Patientin U mit PHA zwei Tage vor Infektion stimuliert. Die so erhaltenen PHA-Blasten
wurden dann mit dem T-tropen NL4-3, M-tropen YU2 und dem Dual-tropen 89.6 HIV-1
Stamm infiziert (MOI 0,001). Die Infektion mit den Viren und deren Replikation wurde
jeden zweiten Tag anhand der p24-Produktion in den Zellkulturüberständen über einen
Zeitraum von 16 Tagen im ELISA gemessen. Die HIV-1 Virenstocks sowie der p24-ELISA
wurden von Karin Metzner bereitgestellt. Die CD8-depletierten PBMC der Patientin
konnten mit HIV-1 Virenstämmen mit unterschiedlichen Korezeptortropismen infiziert
69
Ergebnisse
werden und die Viren zeigten über einen Zeitraum von 16 Tagen eine vergleichbare
Replikationskinetik (Abb. 11).
200000
p24 [pg/m l]
150000
Negativkontrolle
100000
NL4-3 CXCR4
89,6 dual-trop
50000
YU-2 CXCR5
0
0
-50000
2
4
6
8
10
12
14
16
Tage nach Infektion
Abb. 11: Infektionsfähigkeit von CD8-depletierten PBMC der Patientin U mit
verschieden tropen HIV-1 Stämmen und deren Replikationskinetik. CD8depletierte PBMC der Patientin U wurden zwei Tage nach PHA Stimulation mit
verschieden tropen HIV-1 Laborstämmen (T-trop: NL4-3, M-trop: YU-2 und Dualtrop: 89.6) bei einer MOI von 0.001, infiziert. An jeden zweiten Tag (Beginn Tag
0), über einen Zeitraum von 16 Tagen wurde der Zellkulturüberstand mittels
ELISA auf den p24-Gehalt untersucht. Negativkontrolle: bedeutet CD8-depletierte
Zellen wurden nicht mit HI-Viren infiziert.
4.2.8
Prüfung der Zellkulturüberstände von PHA-Blasten der Patientin U auf antivirale
Eigenschaften bei Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
Um das Vorhandensein von antiviralen Zytokinen in Zellkulturüberständen der Patientin U
zu untersuchen, wurden PBMC der Patientin U und die eines gesunden Spenders, mit PHA
stimuliert. Drei Tage nach Stimulation wurden die jeweiligen Zellkulturüberstände
entnommen und für die Infektionsanalysen im p24-ELISA, verwendet. Hierzu wurden CD8depletierte PHA-Blasten eines gesunden Spenders (K2) mit dem Laborstamm NL4-3 bei
MOI 0.001 und MOI 0.0002 in einem 1:1 Verdünnungsverhältnis mit den jeweiligen
Überständen durch Spinokulation (siehe Methoden), infiziert. Jeden zweiten Tag wurden
Zellkulturüberstände der so infizierten Zellen entnommen und erneut mit Medium und den
entsprechenden Überständen der Patientin U oder des gesunden Spenders K1, im Verhältnis
1:1, versetzt. Der p24-Gehalt wurde jeden zweiten Tag in den Zellkulturüberständen, über
einen Zeitraum von 15 Tagen, im ELISA gemessen. Die Überstände der Patientin U und die
des Spenders K1, zeigten keinen Einfluss auf die Infektion und Replikation mit NL4-3. Dies
spricht gegen das Vorhandensein von antiviralen Zytokinen im Zellkulturüberstand der
Patientin U (Abb. 12).
70
Ergebnisse
35000
30000
gesunder Spender K2: Überstand K1 (1:1)
30000
/ml
15000
20000
15000
10000
5000
10000
5000
0
-5000
gesunder Spender K2: Überstand Pat. U (1:1)
25000
20000
24
p 24 [p g/m l]
25000
35000
0
0
3
5
7
9
11
13
15
-5000
Tage nach Infektion.
Negativkontrolle
0
3
5
7
9
11
13
15
Tage nach Infektion.
NL4-3: MOI 0.001
NL4-3: MOI 0.0002
Abb. 12: Einfluß des Zellkulturüberstandes von PHA-Blasten der Patientin U auf die
Infektion mit NL4-3. Zellkulturüberstände von PBMC der Patientin U und eines gesunden
Spenders K1 wurden drei Tage nach Stimulation mit PHA entnommen und für die Infektion von
CD8-depletierten PBMC des gesunden Spenders K2 (MOI 0.001 bzw. MOI 0,0002) im Verhältnis
1:1 mittels Spinokulation, verwendet. An jedem zweiten Tag (Beginn Tag 0), über einen Zeitraum
von 15 Tagen, wurde der Zellkulturüberstand der so infizierten Zellen mittels ELISA auf den p24Gehalt untersucht. Negativkontrolle: bedeutet CD8-depletierte Zellen wurden nicht mit NL4-3
infiziert. Pat.: Patient
4.2.9
Prüfung des Serums der Patientin U auf neutralisierende Eigenschaften bei Infektion
mit den Laborstämmen NL4-3 und 89.6
Es wurde das Serum der Patientin U auf neutralisierende Antikörper überprüft. Hierzu
wurde die Infektion mit verschieden tropen HIV-1 Laborstämmen in Anwesenheit des
Serums der Patientin U im p24-ELISA, quantifiziert. Als Kontrollserum diente das Serum
von einem gesunden Spender K1. Für die Infektion mit den Laborstämmen NL4-3 (MOI
0.001 und 0.0002) und 89.6 (MOI 0.001) wurden CD8-depletierte PBMC eines weiteren
gesunden Spenders (K2) mit PHA stimuliert und mittels Spinokulation im Verhältnis 1:1
mit Serum der Patientin U oder entsprechend mit dem des gesunden Spenders K2, infiziert.
Die Zellkulturüberstände der so infizierten Zellen wurden jeden zweiten Tag entnommen
und die infizierten Zellen mit Medium und den entsprechenden Seren der Patientin U oder
des gesunden Spenders K1, im Verhältnis 1:1, versetzt. Mittels ELISA wurde der p24Gehalt in den so gewonnenen Überständen über einen Zeitraum von 15 Tagen (NL4-3) bzw.
12 Tagen (89.6), ermittelt. Das Serum der Patientin U zeigte bei einer 1:1 Verdünnung eine
vollständige Hemmung der Infektion mit NL4-3 bei MOI 0.0002 und MOI 0.001 (Abb.13
A) und für 89.6 bei MOI 0.001 (Abb. 13 B). Im Gegensatz dazu hatte das Serum des
71
Ergebnisse
gesunden Spenders K1 keinen Einfluss auf die Infektion mit NL4-3 oder 89.6. Dies spricht
für das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern im Serum der Patientin U.
A
gesunder Spender K2: Serum K1 (1:1)
35000
30000
30000
25000
25000
p24 [pg/m l]
p24 [p g /m l]
35000
20000
15000
10000
gesunder Spender K2: Serum Pat.U (1:1)
Negativkontrolle
NL4-3 MOI 0.001
NL4-3 MOI 0.0002
20000
15000
10000
5000
5000
0
0
0
-5000
3
7
9
11
13
15
-5000
Tage nach Infektion
B
80000
5
0
3
5
7
9
11
13
15
Tage nach Infektion
HIV-1 89.6 dual-trop
p 24 [p g /m l]
70000
60000
50000
Negativkontrolle
40000
gesunder Spender K1
30000
gesunder Spender K1/Serum gesunder Spender K2
gesunder Spender K1/Serum Pat. U
20000
10000
0
0
2
4
6
8
10
12
Tage nach Infektion
Abb. 13: Neutralisierende Aktivität des Serums der Patientin U auf die Infektion mit NL4-3
und 89.6. Serum der Patientin U und eines gesunden Spenders K1 wurden für die Infektion von
CD8-depletierten PBMC des gesunden Spenders K2, mit A) NL4-3 (MOI 0.001 bzw. MOI 0.0002)
und B) 89.6 (MOI 0.001), im Verhältnis 1:1 mittels Spinokulation, verwendet. An jeden zweiten
Tag (Beginn Tag 0), über einen Zeitraum von 15 Tagen (NL4-3, A), bzw. 12 Tagen (89.6, B),
wurde der Zellkulturüberstand der so infizierten Zellen mittels ELISA auf die p24-Konzentration,
untersucht. Negativkontrolle: bedeutet CD8-depletierte Zellen wurden nicht mit NL4-3 infiziert.
Pat.: Patient
4.2.10 Analyse der neutralisierenden Aktivität des Serums der Patientin U
Es wurde zunächst eine Dosis-abhängige Hemmung der Infektion mit dem Laborstammm
NL4-3 durch verschiedene Serumkonzentrationen der Patientin U, untersucht. Hierzu
wurden PHA stimulierte, CD8-depletierte PBMC der gesunden Spender K1 und K2 mittels
Spinokulation bei unterschiedlichen Verdünnungsstufen des Serums der Patientin U,
infiziert (MOI 0.001). Die Zellkulturüberstände der so infizierten Zellen wurden jeden
zweiten Tag entnommen und die infizierten Zellen mit Medium und den entsprechend
verdünnten Seren der Patientin U, versetzt. Als Kontrolle wurde das Serum des gesunden
72
Ergebnisse
Spenders K2 in einer 1:1 Verdünnung mitgeführt. Mittels ELISA wurde der p24-Gehalt in
den so gewonnenen Überständen über einen Zeitraum von 12 Tagen ermittelt (Abb. 14). Die
mitgeführte Serum Negativkontrolle des gesunden Spenders K2 zeigte wie erwartet bei
einer 1:1 Verdünnung keine inhibierende Wirkung auf die Infektion mit NL4-3. Das Serum
der Patientin U ergab für beide Spenderzellen eine Dosis-abhängige Hemmung der
Infektion
mit NL4-3. Die 1:10 Verdünnung des Serums führte noch zu einer fast vollständigen, die
1:100 Verdünnung zu einer 50 %-igen Inhibition der Infektion beider Spenderzellen. Die
Verdünnungsstufen 1:1.000 und 1:10.000 zeigten keine Hemmung der Infektion mehr.
p24 (pg/ml)
80000
gesunder Spender K1
80000
70000
70000
60000
60000
50000
50000
40000
40000
30000
30000
20000
20000
10000
10000
0
gesunder Spender K2
Negativekontrolle
NL4-3
NL4-3: Serum K2 1:1
NL4-3: Serum Pat. U 1:1
NL4-3: Serum Pat. U 1:10
NL4-3: Serum Pat. U 1:100
NL4-3: Serum Pat. U 1:1000
NL4-3: Serum Pat. U 1:10000
0
0
2
4
6
8
10
12
0
2
Tage nach Infektion
4
6
8
Tage nach Infektion
10
12
Abb. 14: Dosis-abhängige Hemmung der Infektion mit NL4-3 durch unterschiedliche
Serumverdünnungen der Patientin U. Serum der Patientin U wurde für die Infektion von CD8depletierten PBMC der gesunden Spender K1 und K2 mit NL4-3 (MOI 0.001) in einer
Verdünnungsreihe mittels Spinokulation, eingesetzt. Als Serum Negativkontrolle wurde das Serum
des gesunden Spenders K2 in einer 1:1 Verdünnung mitgeführt. An jedem zweiten Tag (Beginn Tag
0), über einen Zeitraum von 12 Tagen, wurde der Zellkulturüberstand der so infizierten Zellen
mittels ELISA auf die p24-Konzentration untersucht. Negativkontrolle: bedeutet CD8-depletierte
Zellen wurden nicht mit NL4-3 infiziert. Pat.: Patient
Um den neutralisierenden Effekt von Antikörpern der Patientin U in Bezug auf seine
Inaktivierungsbreite und Stärke bei Infektion mit verschieden-tropen HI-Viren zu
untersuchen, wurde eine Plasmaprobe der Patientin an unsere Kooperationspartner im
Biomedizinischen Forschungszentrum in Frankfurt, versand. Die Probe wurde für 30
Minuten bei 56 Grad Celsius wärmebehandelt, um Patientenviren zu inaktivieren. Die
Analyse dieses Plasmas mittels eines dort etablierten Antikörper Neutralisationsassays
wurde von Sascha Antoni aus der Arbeitsgruppe um Frau Dr. rer. nat. Ursula Dietrich
durchgeführt (siehe Anhang Abb. 25). Hierzu wurden verschiedene rekombinante
Reporterviren mit unterschiedlichen Plasmaverdünnungen der Patientin U eine Stunde
73
Ergebnisse
präinkubiert und danach für die Infektion von U87 CD4+ Zellen mit CCR5 (JR-CSF,
D117III, 89.6) oder mit CXCR4 (NL4-3) Oberflächenrezeptoren, verwendet. Die Infektion
wurde anhand der Renilla-Luziferase-Aktivität im ELISA quantifiziert. Die Neutralisation
der Viren in Prozent wurde aus den jeweiligen Plasmaverdünnungen und den
entsprechenden Virenkontrollen ohne Plasma, ermittelt (siehe Anhang Abb.25 und Tab. 14).
Tab. 14: Vergleich der mittleren reziproken Plasmaverdünnungen von
unterschiedlichen HIV-1-Patientengruppen für eine 50 % tige und 90 % tige
Neutralisation der verschieden tropen HI-Viren.
JR-CSF
(CCR5)
IC50
IC90
D117III
(CCR5)
IC50
IC90
89.6
(CCR5/CXCR4)
IC50
IC90
NL4-3
(CXCR4)
IC50
IC90
*LTNP (N=7)
160
27
2564
225
959
66
4516
674
*Progressoren (N=7)
144
13
368
46
194
43
2036
209
Patientin U
69
<10
302
32
163
66
1165
219
*: die entsprechenden reziproken Plasmaverdünnungen sind aus Humbert et al., 2007, entnommen und
entsprechen den mittleren Neutralisationen für die jeweilige Patientengruppe. IC50 bzw. IC90: reziproke
Plasmaverdünnungen für eine 50 %- bzw. 90 % Neutralisation. LTNP: Langzeit Nicht-Progressoren
(LTNP); N: Patientenanzahl
Alle getesteten HIV-1 Laborstämme wurden durch das Plasma der Patientin U neutralisiert,
jedoch ohne starke Ausprägung. Die reziproken Plasmaverdünnungen der Patientin U,
ausgedrückt als 50 % (IC 50) und 90 % (IC 90 %) neutralisierende Aktivitäten, wurden den
bereits publizierten Ergebnissen von Humbert et al., 2007, gegenübergestellt (Tab. 14). In
dieser Publikation wurden unter anderem Plasmaproben von LTNP (Patienten mit guter
Virussuppression über 15 Jahren) und Progressoren (Patienten mit schlechtem
Therapieverlauf) auf ihre antiviralen Aktivitäten überprüft. Der Vergleich der IC50 und
IC90 Werte dieser beiden Patientengruppen mit den Werten für die Patientin U zeigte, dass
die antivirale Aktivität des Plasmas der Patientin U vergleichbar mit denen aus der
Progressorengruppe war. Dies deutete stark darauf hin, dass die extrem gute Kontrolle der
HIV-1 Infektion in dieser Patientin nicht alleine auf die hemmende Wirkung ihres Plasmas
zurückgeführt werden kann.
74
Ergebnisse
4.2.11 Analyse der HIV-1 spezifischen CTL Erkennung in den Patienten U und R
Mittels ELISPOT-Analysen sollte nach potenziellen HIV-1 spezifischen CTLs in beiden
Patienten gesucht werden. Hierzu wurden frisch isolierte PBMC und mit Peptid stimulierte
PBMC von März und September 2007 sowie März und Juni 2008 verwendet. Insgesamt
wurden 390 überlappende und optimale Peptide entsprechend der jeweiligen HLA-Allele
beider Patienten untersucht. Für den Patienten R konnten in Peptid stimulierten PBMC von
Juni 2008 HIV-1 spezifischen CTLs gegen das in Nef lokalisierte HLA-A24 Epitop
RYPLTFGWCY (HIV-Datenbank, 2007; Choppin et al., 2001) sowie gegen seine autologe
Variante mit dem F zu L Austausch an Position 6 (siehe Abb. 5) und gegen das auf HLAB51 restringierte Epitop DSRLAFHHV (Connan et al., 2001), gefunden werden. Für die
Patientin U konnte eine breite CTL Antwort gegen verschiedene Regionen in HIV-1
detektiert werden (Abb. 15). Die stärkste CTL Antwort zeigte sich gegen das in p17
lokalisierte Peptid KIRLRPGGKKKYKL. Es enthält zwei HLA-A3 (HIV-Datenbank, 2007;
Altfeld et al., 2001c; Walkerpercom et al., 1996) und ein HLA–B7 Epitop (HIV-Datenbank,
2007; Jin et al., 2000) und befindet sich in dem funktionell wichtigen KernlokalisationsBereich des Gag p17 Proteins. Weiterhin konnten gute CTL Erkennungen gegen
Aminosäuresequenzen in folgenden HIV Proteinen gefunden werden: Gag p17
LKHIVWASRELERFA, Reverse Transkriptase KIEELRQHLLRW (enthält ein HLA-A2
Epitop, HIV-Datenbank, Haas et al., 1998 und ein HLA–B60 Epitop, Altfeld et al., 2000),
Vif DCFSESAIRNAILGH und Nef RPMTYKGAL (HLA-B7 Epitop, HIV-Datenbank,
2007; Oxenius et al., 2004). Interessanterweise nahm parallel zum leichten Anstieg der
Viruslast von 80 Kopien/ml im März 2007 auf 260 Kopien/ml im Mai 2008 die messbare
CTL Aktivität im Blut an Stärke zu. Zudem konnten im Juni 2008 CTL Antworten gegen
die beiden in Nef lokalisierten Epitope FPVRPQVPL (HLA-B7) und YPLTFGWCY (dieses
überlappt mit dem A24 Epitop RYPLTFGWCY, HIV-Datenbank; Choppin et al., 2001)
detektiert werden. Die jeweiligen autologen Varianten für die HI-Viren der Patientin U
(FPVKPQVPL und RFPLTFGWCF) wurden im Vergleich deutlich schlechter erkannt
(Abb. 15).
75
Ergebnisse
Nef: FPVRPQVPL B7
Nef: FPVKPQVPL
Nef: RYPLTFGWCY A24 enthält B7, A2
Viruslast:
(Kopien/ml)
Nef: RFPLTFGWCF
Nef: KEKGGLEGL
B60
Nef: RPMTYKGAL B7
Vpu: SEGDQEELSALVEMG
Vpu: RIRERAEDSGNESEG
Jun. 08
260
Mrz. 08
290
Sep. 07
90
Mrz. 07
80
Vpu: VVWTIVFIEYRKILR
Vpu: QILAIVALV
Vpr: VEAIIRILQQLLFIH enthält A2
Vpr: TWAGVEAIIRILQQL enthält A2
Vpr: SLGQHIYETYGDTWA
Vpr: EWTLELLEELKSEAV
Vif: KKIKPPLPSVTKLTE enthält A3, A2, B7
Vif: DCFSESAIRNAILGH
RT: KIEELRQHLLRW enthält A2, B60
PR: LNFPISPIETVPVKL enthält B7, A2
PR: LWQRPLVTIKIGGQL enthält A3
p17: RLRPGGKKK A3
p17: KIRLRPGGKKKYKL A3, B7
p17: LETSEGCRQILGQLQ
p17: LKHIVWASRELERFA
no peptide
SFU/100.000 PBMC
Abb. 15: γ-IFN-ELISPOT-Analyse der CTL Erkennung in der Patientin U zu verschiedenen
Zeitpunkten. Frisch isolierte PBMC der Patientin U wurden auf die Erkennung von Peptiden aus
verschiedenen Regionen in HIV-1 untersucht. Die Peptidesequenzen entsprechen der von HIV-1 HXB2. Die Viruslasten sind den entsprechenden Isolationszeitpunkten der PBMC zugeordnet. Bezifferte
Großbuchstaben entsprechen den Epitopen für die HLA-Allele der Patientin U, die in den
entsprechenden Aminosäuresequenzen enthalten sind. Mrz.: März; Jun.: Juni; Sep.: September; RT:
Reverse Transkriptase; PR: Protease
76
Ergebnisse
4.2.12 Analyse der HIV-1 spezifischen CTL Antwort der Patientin U gegen das
autologe HIV-1 Nef Protein
Da sich das Nef Protein der HI-Viren der Patientin U im Sequenzvergleich als stark mutiert
zeigte, sollte nun die CTL Erkennung auf die autologe Nef-Sequenz untersucht werden. Das
nef Gen wurde hierfür aus proviraler DNA von Dezember 2006 amplifiziert und für den
Nachweis mit Epitop-spezifischen Antikörpern mit der C-terminalen FLAG Sequenz
fusioniert. In dieser Form wurde es in den RNA Produktionsvektor pGEM (zur Vefügung
gestellt von der Arbeitsgruppe um Niels Schaft und Jan Dörrie) kloniert und konnte so
mittels reverser Transkription in mRNA umgeschrieben werden. Die so erhaltene autologe
Nef mRNA sowie Wildtyp Nef mRNA, entsprechend des Laborstammes HXB2, wurde in
frisch isolierte PBMC der Patientin U von Dezember 2007, elektroporiert. Die FACS
Analyse mittels FLAG-Färbung zeigte bei 70 % der elektroporierten Zellen nach 4 Stunden
eine Expression des autologen Nef Proteins der Patientin U. Die CTL Erkennung der so
elektroporierten PBMC wurden mittels ELISPOT analysiert. Um zu sehen aus welchen
Bereichen des Nef Proteins die stärksten CTL Antworten stammten, wurden zudem für die
ELISPOT-Analysen nicht elektroporierte PBMC der Patientin U mit überlappenden,
gepoolten Peptiden (jeweils vier Peptide mit je 20 As), versetzt. Wie aus der Abb. 16
ersichtlich, verursachten das autologe Nef Protein sowie das Wildtyp Nef Protein
vergleichbar starke CTL Reaktionen. Die stärkste CTL Antwort stammte aus der mittleren
Region, Aminosäuren 81 bis 130 (gepoolte Peptide 9-12). Auch in den angrenzenden
Regionen, Aminosäuren 41 bis 90 (gepoolte Peptide 5-8) und Aminosäuren 121 bis 170
(gepoolte Peptide 13-16) zeigten sich gute CTL Erkennungen. Die Region welche durch die
gepoolten Peptide 13-16 eingegrenzt wird, enthält auch die fünf Aminosäure lange Deletion
(As 161 bis 165) im C-terminalen Bereich des autologen Nef Proteins der Patientin U (siehe
auch Abb. 5).
77
Ergebnisse
+ Nef Pool 17-20
+Nef Pool 13-16
+Nef Pool 9-12
+Nef Pool 5-8
+Nef Pool 1-4
Elektroporiert mit autologer Nef mRNA
Elektroporiert mit WT (HXB2)Nef mRNA
Elektroporiert
Nicht elektroporiet
0
50
100
150
200
250
Spot Forming Unit/200 000 PBMC
Abb. 16: γ-IFN-ELISPOT-Analyse der CTL Antwort der Patientin U auf das autologe HIV-1 Nef
Protein. PBMC der Patientin U wurden mit 15 µg autologer Nef mRNA oder Wildtyp (WT) Nef mRNA
(entsprechend der HXB2 Referenzsequenz) elektroporiert und nach vier Stunden für die Analysen im
ELISPOT verwendet. Zudem wurden nicht elektroporierte PBMC der Patientin U mit gepoolten Nef
Peptiden (Pool: 1-4, As 1 -50; 5-8, As 41-90; 9-12, As 81-130; 13-16, As121-170; 17-20; As 161-205)
versetzt. Als Negativkontrollen dienten nicht elektroporierte und ohne mRNA elektroporierte PBMC.
4.2.13 Analyse der fünf Aminosäure langen Deletion im C-terminalen Bereich von Nef
mittels Klonierung und Sequenzvergleich auf Aminosäureebene
Um zu sehen, ob die fünf Aminosäure lange Deletion (As 161 bis 165) im Nef Protein der
HI-Viren der Patientin U nicht nur zu einer Minorität der Viren gehörte, wurde die aus PHABlasten amplifizierte Nef DNA von einem Zeitpunkt im Dezember 2006 in den pDrive
Vektor (Quiagen) kloniert und die aus den Klonen erhaltene DNA sequenziert. Der
Sequenzvergleich auf Aminosäureebene der aus den Klonen erhaltenen Sequenzen, mit der
ursprünglich aus PHA-Blasten erhaltenen Nef-Sequenz der Patientin U, zeigte für alle 13
Klone die fünf Aminosäure lange Deletion (Abb. 17 A). Um des weiteren zu sehen ob diese
Deletion bereits im Nef Protein der HI-Viren des Patienten R vorkam, was auf eine bereits
im Patienten R erfolgte Selektion dieser Deletion durch seine CTLs hinweisen würde, wurde
auch die von ihm aus Plasma erhaltene Nef DNA in den pDrive Vektor kloniert und
sequenziert (Abb. 17 B). Der Sequenzvergleich auf Aminosäureebene der aus diesen Klonen
erhaltenen DNA mit der ursprünglich aus Plasma sequenzierten Nef DNA, zeigte in keinen
78
Ergebnisse
der 29 Klone die entsprechende Deletion. Dies gab einen weiteren Hinweis darauf, dass diese
Deletion durch einen Selektionsdruck, ausgeübt durch die CTLs der Patientin U, und nicht
durch die des Patienten R entstanden war. Für die weiteren Untersuchungen hierfür wurden
verschiedene Peptide entsprechend der Abb.17 A unten, hergestellt. Es wurde jeweils eine 23
Aminosäure lange Sequenz mit entweder der autologen Sequenz des Nef Proteins der Viren
des Patienten R (autologe Pat R) oder derer der Patientin U mit den fünf entsprechenden
Aminosäuren für die Deletion, (autologe Pat U + Insert) synthetisiert. Zusätzlich wurde die
entsprechend autologe Sequenz für die Patientin U ohne Insert (autologe Pat U) und
verschiedene kürzere Peptide entsprechend ihrer autologen HI-Viren Sequenzen mit oder
ohne Aminosäuren, aus dem Deletionsbereich, hergestellt.
79
Ergebnisse
A)
As HXB2
128
176
Pat. R. Plasma Mai. 06 DWQNYTPGPGIRYPLTLGWCYKLVPVDPDKVEEVTSRENSCLLHPISQH
Pat. U. PHA-B Dez. 06 ------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 1
------------C-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 2
------------F-------F-----E-SEG--*****-------MNLKlon 3
------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 4
------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 5
------------F-----M-F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 6
------------F-----*-X-----E-PEG--*****-------MNLKlon 7
------------F-------F-----E-P-G--*****-------MNLKlon 8
------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 9
------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 10
------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 11
------------F-------F-----E-SEG--*****-------MNLKlon 12
------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLKlon 13
------------F-------F-----E-PEG--*****-------MNLAutologes Nef Pat. R
VDPDKVEEVTSRENSCLLHPISQ
Autologes Nef Pat. U +Insert
VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL
GEEVTSRENS
EV
SCLLHPMNL
EVTSRENSCL
VTSRENSCLL
TSRENSCLL
RENSCLLHPMNL
NSCLLHPMNL
Autologes Nef Pat. U
VEPPEGEE
NSCLLHPMNL
VEPPEGEE
NSCLLH
VEPPEGEE
NSC
VEPPEGEE
N
PEGEE
NSCLL
PEGEE
NSCL
PEGEE
NSC
B)
As HXB2
149
175
Pat. R. Mai. 06 KLVPVDPDKVEEVTSRENSCLLHPISQ
Klon 1
--------------------------Klon 2
--------------------------Klon 3
--------------------------Klon 4
------------------N-------Klon 5
---------A----------------Klon 6
--------------------------Klon 7
--------------------------Klon 8
----------------GD--------Klon 9
----------------G---------Klon 10
--------------------------Klon 11
--------------------------Klon 12
--------------------------Klon 13
--------------------------Klon 14
--------------------------Klon 15
----------------G---------Klon 16
--------------------------Klon 17
--------------------------Klon 18
--------------P-----------Klon 19
-----G--------------------Klon 20
--------------------------Klon 21
-----------D—-T-----------Klon 22
--------------------------Klon 23
--------------------------Klon 24
--------------------------Klon 25
--------------------------Klon 26
--------------------------Klon 27
--------------------------Klon 28
--------------------------Klon 29
---------------------------
80
Ergebnisse
Abb. 17: Klonierung der nef Gene der HI-Viren beider Patienten und Sequenzanalyse auf
Aminosäureebene der fünf Aminosäure langen Deletion im C-terminalen Bereich des Nef Proteins der
Patientin U. Sequenzvergleich des Nef Proteins des Patienten R (erhalten aus Plasma im Mai 2006) mit dem
der Patientin U (erhalten aus PHA-Blasten im Dezember 2006) und den jeweiligen Sequenzen, erhalten aus
den Klonierung der nef Gene in den pDrive Vektor vom selben Zeitpunkt. Die konstruierten Peptide für die
anschließenden Untersuchungen zur CTL Erkennung der fünf Aminosäure langen Deletion, sind unter dem
Alignment aufgeführt A). Sequenzvergleich des Nef Proteins des Patienten R (erhalten aus Plasma im Mai
2006) mit den jeweiligen Nef-Sequenzen aus den Klonierungen der nef Gene in den pDrive Vektor vom
selben Zeitpunkt B). Abweichungen der Aminosäuren (As) im Vergleich zur Nef-Sequenz der jeweils als
erstes aufgeführten Sequenz im entsprechenden Alignment, sind als Buchstaben gekennzeichnet. Die Zahlen
über den jeweiligen Sequenzvergleich entsprechen den Aminosäure Positionen für den Reverenzstamm
HXB2. * bedeutet Deletion; X bedeutet: Sequenz nicht detektierbar; Dez.: Dezember.
4.2.14 Analyse der HIV-1 spezifischen CTL Antwort der Patientin U gegen die
synthetisch hergestellten Peptide, die den Bereich der fünf Aminosäure langen Deletion in
Nef eingrenzen
Für den Fall, dass sich die fünf Aminosäure lange Deletion durch den Selektionsdruck der
CTLs der Patientin U entwickelt hätte, würden deren CTLs eine Erkennung auf eines der
synthetisch hergestellten Peptide zeigen, welches mindestens einen Teil der Aminosäuren
der Deletion enthält. Deshalb wurden die entsprechenden Peptide in verschiedenen
ELISPOT-Analysen auf eine CTL Antwort überprüft. Hierzu wurden frisch isolierte PBMC
oder mit Peptid stimulierte PBMC der Patientin U auf eine CTL Erkennung bzw.
Kreuzreaktion in mit Peptid stimulierten CTL-Linien, getestet. Die Tabelle 19 (siehe
Anhang) fasst die so analysierten CTL Erkennungen der Patientin U auf die bereits
beschriebenen neu synthetisierten Peptide zusammen. Mittels dieser ELISPOT-Analysen
konnten CTL Erkennungen in zwei Regionen innerhalb des 23 Aminosäuren umfassenden
Bereiches detektiert werden. Die mit Peptid stimulierten PBMC zeigten starke CTL
Antworten
gegen
das
autologe
(VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL)
Peptid
und
der
gegen
Patientin
das
U
autologe
mit
dem
Peptid
Insert
mit
der
entsprechenden Deletion (VEPPEGEENSCLLHPMNL) (siehe Anhang Tab. 19). Eine
schwache
Antwort
konnte
für
das
autologe
Peptid
für
den
Patienten
R
(VDPDKVEEVTSRENSCLLHPISQ) festgestellt werden. Da die CTL Erkennung dieser
Peptide durch eine Präinkubation der zu testenden Zellen mit Anti-CD8-Antikörpern, nicht
aber mit Anti-CD4-Antikörpern blockiert wurde, konnte eine CD4 Antwort für diese
Peptide ausgeschlossen werden. Weiterhin sollte nun die optimale Epitoplänge für die
erkannten
Regionen
gefunden
VEPPEGEENSCLLHPMNL
werden.
(autologe
Hierzu
Pat
wurden
U)
die
(Abb.
mit
18
den
Peptiden
A)
und
VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL (autologe Pat U + Insert) (Abb. 18 B) stimulierten
CTL-Linien auf die Erkennung von jeweils kürzeren Peptidversionen untersucht. Die
81
Ergebnisse
VEPPEGEENSCLLHPMNL stimulierte CTL-Linie zeigte die stärkste Reaktion mit
PEGEENSCLL, die kürzere Version PEGEENSCL wurde schlechter erkannt und die
Version PEGEENSC zeigte keine Erkennung mehr. Somit kann das Epitop PEGEENSCLL
als das optimale Epitop definiert werden. Die VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL
stimulierte CTL-Linie zeigte die stärkste Antwort gegen das zehn Aminosäuren umfassende
Peptid VTSRENSCLL, welches die fünf deletierten Aminosäuren (VTSRE) enthält. Das
autologe 23 Aminosäuren lange Peptid wurde schlechter erkannt und eine deutlich
schlechtere CTL Antwort zeigte sich gegen das nur neun Aminosäuren umfassende Peptid
TSRENSCLL.
A
VEPPEGEE
NSCLLHPMNL stimulierte
CTL Linie
ohne Peptid
PEGEE
NSC
PEGEE
NSCL
PEGEE
NSCLL
B
VEPPEGEE VTSRENSCLLHPMNL stimulierte CTL Linie
ohne Peptid
TSRENSCLL
VTSRENSCLL
VEPPEGEE
VEPPEGEEVTSRE NSCLLHPMNL
NSCLLHPMNL
0
50
100
150
200
250
300
350 400
450
Spot Forming Unit / 50 000 Zellen
0
50
100
150
200
250
Spot Forming Unit / 50 000 Zellen
Abb. 18 Analyse der optimalen Epitoplänge für die bereits erkannten Aminosäureabschnitte im Bereich
der fünf Aminosäure langen Deletion in standardisierten γ-IFN-ELISPOT-Analysen. Die mit dem Peptid
VEPPEGEENSCLLHPMNL
stimulierte
CTL-Linie
A)
und
die
mit
dem
Peptid
VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL stimulierte CTL-Linie B) wurden auf die Erkennung von entsprechend
kürzeren Peptiden getestet. Ergebnisse sind als SFU /0,5x105 angegeben.
4.2.15 Restriktionsanalyse der Peptide PEGEENSCLL und VTSRENSCLL für die HLAAllele der Patientin U
Die Patientin U besitzt den HLA-Typ A2, A3, B7, B60(40), Cw3, Cw7. Es sollte nun
untersucht werden, welche dieser HLA-Allele die von ihren CTLs erkannten Peptide
PEGEENSCLL und VTSRENSCLL, präsentieren. Aus diesem Grund wurden HLARestriktionsanalysen mit EBV-immortalisierten B-Zellen von verschiedenen Spendern,
welche je ein oder zwei HLA-Allele mit der Patientin U teilten, durchgeführt. Die
entsprechenden EBV-immortalisierten B-Zellen, wurden mit dem jeweils auf Präsentation zu
testenden Peptid, präinkubiert und nach mehreren Waschschritten in einem 1:1 Verhältnis
mit den entsprechenden CTL-Linien im 96-Well Format ausgesät. Die Restriktionsanalysen
82
Ergebnisse
für das Peptid mit der fünf Aminosäure langen Deletion VEPPEGEENSCLLHPMNL
(autolog Pat U) wurde zunächst unter Verwendung von EBV-immortalisierten B-Zellen
durchgeführt, welche mindestens ein HLA-Allel mit der Patientin U teilten (Abb. 19 A
links). Hierbei konnte eine Präsentation dieses Peptides über das HLA-B60(40) Allele
festgestellt werden.
Für die weiterhin durchgeführte Restriktionsanalyse mit den entsprechend kürzeren
Versionen dieses Peptides (PEGEENSCLL, PEGEENSCL und PEGEENSC) wurde eine BZelle verwendet, welche die HLA-Allele B60(40) und -Cw7 mit der Patientin U teilte (Abb.
19 A rechts). HLA B60(40) ist das restringierende HLA-Allel, da HLA B60(40) negative
und Cw7-positive Zelllinien diese Peptide nicht präsentieren konnten. Die stärkste Reaktion
wurde für das Peptid PEGEENSCLL festgestellt, das damit als das optimale Epitop definiert
werden konnte. Die Restriktionsanalyse des Peptides VTSRENSCLL sowie der kürzeren
Vesion TSRENSCLL erfolgte mit EBV-immortalisierten B-Zellen welche mindestens eines
der Allele mit der Patientin U teilte. Die Auswertungen im ELISPOT zeigten für das Peptid
VTSRENSCLL ebenfalls eine Präsentation über das HLA-B60(40) Allel (Abb. 19 B).
A
B-Zelle: A1, A32, B8,B60(40) , Cw4,Cw7
Peptid stimulierte CTL Linie
ohne Peptid
ohne Peptid
VEPPEGEE
Peptid stimulierte CTL Linie
ohne Peptid
Peptid Stimulierte CTL Linie
NSCLLHPMNL
HLA-A2
PEGEE
NSC
PEGEE
NSCL
PEGEE
NSCLL
HLA-A3
HLA-B7,-Cw7
HLA-B60(40)
HLA-Cw3
HLA-Cw7
VEPPEGEE
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Spot Forming Unit /100 000 Zellen
NSCLLHPMNL
0
50
100 150 200 250 300 350 400 450
Spot Forming Units / 100 000 Zellen
B
Peptid stimulierte CTL Linie
ohne Peptid
ohne Peptid
Peptid stimulierte CTL Linie
VTSRENSCLL
TSRENSCLL
HLA-Cw7
HLA-B60(40), -Cw7
HLA-Cw3
HLA-A2
0
100
200
300
400
500
600
700
Spot Forming Unit /100 000 Zellen
Abb. 19: HLA-Restriktionsanalyse der Peptide PEGEENSCLL und VTSRENSCLL in
standardisierten γ-IFN-ELISPOT. EBV-transformierte B-Zellen welche mindestens ein HLA-Allele mit
der Patientin U teilten wurden mit dem Peptid VEPPEGEENSCLLHPMNL A links) oder mit den Peptiden
83
Ergebnisse
VTSRENSCLL bzw. TSRENSCLL B links) präinkubiert und mit einer entsprechend Peptid stimulierten
CTL-Linie im Verhältnis 1:1 im 96-Well-Format ausgesät. EBV-immortalisierte B-Zellen, welche die HLAAllele B60(40) und Cw7 mit den Allelen der Patientin U teilten wurden mit dem Peptid PEGEENSCLL und
entsprechend kürzeren Versionen A rechts) präinkubiert und mit einer entsprechend Peptid stimulierten CTLLinie im Verhältnis 1:1 im 96-Well-Format, ausgesät. Ergebnisse sind als SFU/1x105 angegeben. Die mit der
Patientin U geteilten HLA-Allele sind rot dargestellt.
4.2.16 Funktionelle Analysen der autologen nef Gene der Patienten U und R
Um die Auswirkungen der HIV-1 nef Gene der Patienten U und R auf wichtige Nef
Funktionen zu analysieren wurden die amplifizierten Nef-DNAs (provirale DNA von
Dezember 2006, Patientin U und RNA von Mai 2006, Patient R) an Prof. Frank Kirchoff
(Virologie, Universität Ulm), versandt. Die Analyse dieser Nef-DNA mittels eines dort
etablierten Assays zur Prüfung der wichtigsten Nef Funktionen (Herunter– bzw.
Heraufregulierung wichtiger Oberflächenrezeptoren wie CXCR4, CD28, MHC-Klasse-I,
CD4, CD3 und CD74) wurden von Jan Schmökel durchgeführt. Hierzu wurden die Nef
Allele der Patienten U und R in einen replikationskompetenten, auf HIV-1 NL4-3
basierenden, proviralen Vektor kloniert, welcher Nef und eGFP von einer bizistronischen
RNA koexprimiert (siehe auch Schindler et al., 2003). Als Negativkontrolle diente ein
entsprechendes HIV-1 NL4-3 Konstrukt das eGFP durch ein IRES (Interne RibosomenEintrittstelle) Element alleine exprimiert. Als Positivkontrollen dienten Reporterkonstrukte
die den Wildtyplinien NL4-3 und NA7 entsprachen. Mit diesen so erhalten
Reportervirenkonstrukten wurden PBMC von gesunden Spendern infiziert. Zwei Tage nach
Infektion wurden die Zellen mit PHA (Phytohaemaglutine) stimuliert, um den durch
Aktivierung induzierten Zelltod zu induzieren. Drei Tage nach Infektion wurde die
Expression der Oberflächenrezeptoren CD4, CXCR4, MHC-Klasse I, CD28 und vier Tage
danach die Expression der Rezeptoren CD3 und IL2 im FACS gemessen. Fünf Tage nach
Infektion wurde die Häufigkeit der apoptotischen Zellen in Prozent mittels eines Annexin V
(Anv) Apoptose Detektionskits ermittelt (BD Bioscience). Die Tabelle 15 stellt die so
erhaltenen Ergebnisse für beide Patienten den Ergebnissen für die beiden Wildtyp HIV-1
Stämme gegenüber.
Tab. 15: Funktionelle Analyse der autologen nef Gene der Patienten U und R.
84
Ergebnisse
Herunterregulierung (n-fach):
Heraufregulierung (n-fach):
CD74
Expression [MFI] :
Prozent [%] :
CXCR4
CD28
MHC-I
CD4
CD3
IL2R
Apoptotische Zellen
(3 dpi)
(3 dpi)
(3 dpi)
(3 dpi)
(4 dpi)
(3 dpi)
(4 dpi)
(5 dpi)
HIV-1 NA7
1,68
1,63
3,15
1,96
1,34
12,86
841,09
25,37
HIV-1 NL43
1,55
1,58
3,89
2,03
1,54
n.d.
944,07
26
Pat.U
1,95
2,03
4,47
1,65
2,73
4,78
737,25
26,64
Pat. R
1,78
2,02
3,55
2,85
1,76
8,52
872,23
20,76
Nef vermittelte n-fache Herunterregulierung von Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), CD28, HLA-Klasse-IMolekülen (MHC-I), CD4, CD3 bzw. Heraufregulierung von CD74, wurde errechnet durch die
Division
der mittleren Fluoreszenz Intensität [MFA] der Zellen welche mit einem Nef-defizienten HIV-1 Virus
gemessen wurde und den entsprechenden MFAs der eingesetzten HIV-Konstrukte, die Nef und eGFP
durch ein IRES Element koexprimieren (HIV-1 NA7, HIV-1 NL4-3, Pat.U, Pat. R). Die
entsprechenden Konstrukte basieren auf dem HIV-1 Laborstamm NL4-3 und tragen die nef Gene des
jeweiligen Patienten (Pat. U, Pat. R) gefolgt von einem IRES Element und dem eGFP Gen. Die
Expression des Interleukin-2 Rezeptores (IL-2 R) wurde in MFI angegeben, die von Annexin V (AnV)
positiven Zellen in %. HIV-1 NA7 und HIV-1 NL4-3 entsprechen zwei HIV Wildtyp Linien. Die
Messungen erfolgten 1 bis 5 Tage nach Infektion (dpi).
Die für die HIV Infektion wichtigen Oberflächenrezeptoren CD4, CXCR4 sowie der für die
T-Zellaktivierung wichtige Oberflächenrezeptor CD28, zeigten keine Abnahme der
Herunterregulierung für beide Patienten. Ebenso waren die Expression des IL2 Rezeptors,
der ein Kennzeichen der T-Zellaktivierung ist, sowie die mit der Aktivierung einhergehende
Apoptose von Zellen, vergleichbar mit den Wildtypkonstrukten. Die mit dem
Reportervirenkonstrukt für die Patientin U infizierten Zellen zeigten eine etwas geringere
Expression von MHC-Klasse-I Molekülen (im Vergleich zu: HIV-1 NL4-3, 1,1 fach und
HIV-1 NA7, 1,4 fach) und dem für die Aktivierung von T-Zellen wichtigen
Oberflächenrezeptor CD3 (im Vergleich zu: HIV-1 NL4-3, 1,77 fach und HIV-1 NA7, 2
fach). Die Expression der Invarianten Kette (CD74), welche verhindert dass Proteine im
endoplasmatischen Retikulum an die MHC-Klasse-II Komplexe gebunden werden, war um
das 2,7 fache erniedrigt im Vergleich zu der des HIV-1 NA7 Konstruktes und 1,8 fach
erniedrigt im Vergleich zu der des Reportervirenkonstrukt mit dem Nef Allel des Patienten
R.
85
Ergebnisse
4.3
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M
Nach Behandlung mit Steroiden aufgrund einer orthopädischen Erkrankung kam es bei dem
Patienten M zu einem Verlust der bisher guten Kontrolle der HIV Infektion.
4.3.1
Klinischer Verlauf des HLA-B13-positiven Patienten M
Die symptomlose HIV Infektion des Patienten M wurde im Juni 2001 erstmals festgestellt.
Zu diesem Zeitpunkt zeigte er trotz einer niedrigen Viruslast (5.200 Kopien/ml) erniedrigte
CD4 Zellzahlen (310 Zellen/µl). Die Tabelle 16 fasst den Krankheitsverlauf von der
Erstdiagnose bis September 2006 zusammen. Der Patient nahm ab Dezember 2001 an einer
therapeutischen Vakzinestudie mit einem Nef-exprimierenden MVA-Vektor (MVA-nef) teil.
Nach drei Immunisierungen wurde ab April 2002 eine Therapiepause durchgeführt.
Tab. 16: Krankheitsverlauf des Patienten M
Zeitpunkte
CD4 Zellzahlen
Viruslast
(Zellen/µl)
(Kopien/ml)
Erstdiagnose und Beginn von HAART
Jun. 01
310
5200
25 Wochen nach Beenden von HAART
14. Okt. 2002
440
1300
13.März 2006
503
4000
Behandlung mit Steroiden seit Apr.
2006
9. Mai 2006
186
25 000
Ende der Steroid Behandlung und
Zahninfektion
22. Mai 2006
407
83 000
Patient lehnt HAART ab
7. Jun. 2006
537
43 000
17. Jul. 2006
297
16 000
18. Sept. 2006
377
6700
Apr.: April; Jun.: Juni; Jul.: Juli; Okt.: Oktober; Sept.: September
86
Ergebnisse
Fünfundzwanzig Wochen nach Beendigung der HAART im Oktober 2002 zeigte er eine
niedrige Viruslast mit einer normalen CD4 Zellzahl (siehe Tab. 16). Von April 2006 bis
Mai 2006 wurde er aufgrund einer orthopädischen Erkrankung mit einer hohen Dosis an
Steroiden behandelt. Dies führte zu einem starken Anstieg der Viruslast von im März 4.000
Kopien/ml zu 83.000 Kopien/ml im Mai. Der Patient besitzt den HLA-Typ A2, A24, B13,
B18, Cw6 und Cw7. Das HLA-B13 Allele ist mit einem besseren HIV Krankheitsverlauf
assoziiert (Ogg et al., 1998; Honeyborne et al., 2007). Anhand von ELISPOT-Analysen,
durchgeführt zu verschiedenen Zeitpunkten seit seiner HIV-Erstdiagnose, konnten bei dem
Patienten M CTLs gegen das auf HLA-B13 restringierte Epitop RQDILDLWI in Nef
(Venet et al., 1993) gefunden werden. Diese CTL erkannten mit gleicher Effektivität die
autologe Virusvariante RQDILDLWV mit einem I-zu-V Austausch an Position 9. (Abb.
19). Dieses Epitop wurde bereits als dominantes Epitop in HLA-B13-positiven Patienten
beschrieben (Harrer et al., 2005 AIDS). Zudem konnten gute CTL Antworten gegen zwei
weitere B13 restringierte Epitope RQANFLGKI (Gag p15) und RQYDQILIEI (Protease)
detektiert werden. Das ebenfalls als B13 publizierte Epitop in der Reversen Transkriptase
GQGQWTYQI (Honeyborne et al., 2007) zeigte keine CTL Erkennung in den PBMC vom
Januar 2007 und vom April 2008. Durch Stimulation von PBMC vom März 2008 mit dem
Peptid GQGQWTYQI konnten jedoch spezifische CTL gegen dieses Peptid in diesem
Patienten nachgewiesen werden. Gegen das HLA-A24 Epitop RYPLTFGWC (Ikeda-Moore
et al., 1997) und -B18 Epitop YPLTFGWCY (Culmann et al., 1991; Frahm et al., 2007) in
Nef konnten schwache CTL-Reaktionen gefunden werden. Interessanterweise zeigte sich
über den Zeitraum von Mai 2004 bis April 2008 eine Abnahme der CTL Aktivität gegen die
erkannten Epitope (Abb. 20).
87
Ergebnisse
Patient M: HLA-A2, -A24, -B13, -B18, -Cw6, -Cw7
*²P24: PIVQNLQGQMVHQAISPRTL enthält B13
*²P24: IAPGQMREPRGSDIAGTTST enthält B13
Apr. 08
P17: SLYNTVATL A2
Jan. 07
*P17: SLYNAVATL
Mai. 04
³ P15: RQANFLGKI B13
³ PR: RQYDQILIEI B13
*³PR: RQYDQVSIEI
*RT: GQGQWTYQI B13
*³RT: GHGQWTYQI
²RT: ILKEPVHGV A2
²Nef: RQDILDLWI B13
²Nef: RQDILDLWV B13
*²Nef: RQDILDMWV
²³Nef: RYPLTFGWC A24
²³Nef: YPLTFGWCY B18
ohne Peptid
0
100
200
300
400
500
Spot Forming Unit /100 000 PBMC
600
Abb. 20: γ-IFN-ELISPOT-Analyse der CTL Erkennung des Patienten M zu verschiedenen
Zeitpunkten. Für die ELISPOT-Analysen wurden frisch isolierte PBMC des Patienten M mit Peptiden aus
verschiedenen Regionen in HIV-1 entsprechend seiner HLA-Allele, inkubiert. Zudem wurden entsprechende
Peptid-Varianten, die den autologen Sequenzen in seinen HI-Viren entsprachen, eingesetzt. Bezifferte
Großbuchstaben entsprechen den Epitopen für die HLA-Allele des Patienten M oder denen die in den
entsprechenden Aminosäuresequenzen enthalten sind. * bedeutet: PBMC von Mai 04 wurden nicht getestet; ²
beutet: PBMC von Apr. 08 wurden nicht getestet; ³ bedeutet PBMC von Jan. 07 wurden nicht getestet. Apr.:
April; Mrz.: März; Jan.: Januar; RT: Reverse Transkriptase; PR: Protease
4.3.2 Einfluss der Immunsuprimierung durch die Einnahme von Steroiden auf die
Entwicklung von CTL Fluchtmutanten in dem Patienten M
Es sollte ein potenzieller Einfluss einer Immunsuprimierung als Folge der SteroidEinnahme auf die Entwicklung von CTL FLuchtmutationen in dem Patienten M untersucht
werden. Hierzu wurden die gag, pol und nef Gene aus Plasma Proben von Zeitpunkten vor,
während und nach der Behandlung mit Steroiden, sequenziert. Die Abb. 21 zeigt den
Sequenzvergleich auf Aminosäureebene für die wichtigsten HLA-B13 Epitope.
88
Ergebnisse
Gag As
135
HXB2
143 Gag As 226
236
V Q N I Q G Q M V
G Q M R E P R G S D I
4000
- - - L - - - - -
- - - - - - - - - - -
Mai.06 VL 25000
- - - L - - - - -
- - - - - - - - - - -
Jul.06 VL 16000
- - - L - - - - -
- - - - - - - - - - -
Gag As
429
Mrz.06 VL
HXB2
437
Pol As 113
122
R Q A N F L G K I
R Q Y D Q I L I E I
4000
- - - - - - - - -
- - - - - V S - - -
Mai.06 VL 25000
- - - - - - - - -
- - - - - X S - - -
Jul.06 VL 16000
- - - - - - - - -
- - - - - V S - - -
Mrz.06 VL
Pol As
488
HXB2
496
Nef As 106
114
G Q G Q W T Y Q I
R Q D I L D L W V*
4000
- H - - - - - - -
- - - - - - - - -
Mai.06 VL 25000
- H - - - - - - -
Mrz.06 VL
- - - - - - X - -
Jun.06 VL 43000
n.d.
- - - - - - - - -
Jul.06 VL 16000
n.d.
- - - - - - M - -
Sept.06 VL 6700
- H - - - - - - -
n.d.
Abb. 21: Sequenzvergleich auf Aminosäureebene der B13 Epitope zu verschiedenen Zeitpunkten aus
unterschiedlichen Regionen in HIV. Die Virensequenzen wurden unter Verwendung von Plasma aus
RNA erhalten. Die entsprechenden Viruslasten (VL) in Kopien/ml, sind den entsprechenden Zeitpunkten
der jeweiligen Virensequenzen zugeordnet. Abweichungen von den Aminosäuren (As) im Vergleich zu
HXB2 sind als Buchstaben gekennzeichnet. HXB2: Durchnummerierte As Sequenz von HIV-1 Stamm
HXB2. – bedeutet: As entspricht der von HXB2; X bedeutet: Vorkommen von zwei As (HXB2 As und der
entsprechenden As Substitution); n.d. bedeutet: nicht durchgeführt; * bedeutet: Sequenz entspricht der des
HIV-1 Subtypen B mit As V anstelle von I an Position 114; Jun.: Juni; Jul.: Juli; Sept.: September.
89
Ergebnisse
Die in Gag und Pol enthaltenen HLA-B13 Epitope zeigten in dem Zeitraum von März 2004
bis Juli bzw. September 2006 keine neu entstandenen Aminosäure-Substitutionen (Abb. 21).
Das Epitop GQGQWTYQI zeigte in allen Sequenzierungen (erste Sequenzierung im März
2006) eine Q-zu-H Substitution an Position 2. Die aus mit diesem Peptid stimulierten
PBMC erhaltenen CTL-Linien vom März 2008 zeigten in den ELISPOT-Analysen eine
Erkennung des GQGQWTYQI-Peptids, die Kreuzreaktion mit der Q-zu-H Variante zeigte
keine Erkennung. Auch für die mit dieser Variante stimulierten CTL-Linien konnte keine
Erkennung im ELISPOT nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die Q-zu-H
Variante in diesem Epitop durch einen Selektionsdruck der CTLs des Patienten M schon vor
der Steroidapplikation entstanden war. Die in der Protease lokalisierte Aminosäuresequenz
RQYDQILIEI zeigte ebenfalls seit März 2006 einen IL-zu-VS Doppelaminosäureaustausch
an den Positionen 6 und 7. Das Wildtyp-Peptid RQYDQILIEI wurde in den ELISPOTAnalysen mit PBMC von Mai 2004 gut erkannt, im Januar 2007 und April 2008 konnte
keine Erkennung mehr detektiert werden (Abb. 20). PBMC von März 2008 die mit diesem
Peptid und der IL-zu-VS Variante stimuliert wurden, zeigten in beiden Fällen eine CTL
Erkennung. Dies deutet ebenfalls auf eine Selektion der entsprechenden Varianten schon
vor der Steroid-Einnahme hin. Die Erkennung des Wildtyp Epitopes und der Variante in
entsprechend stimulierten CTL-Linien weist auf eine mögliche Nachreifung eines neuen TZellrezeptors nach Entstehung dieser Mutation hin. Die Ursache der ansteigenden Viruslast
nach Steroid-Applikation liegt somit sehr wahrscheinlich nicht in neu entstandene CTL
Fluchtmutanten, sondern wurde durch eine funktionelle Hemmung der CTLs durch die
Steroide verursacht. Das in dem Patienten M dominante B13 Epitop in Nef, RQDILDLWV,
zeigte im Mai 2006 mit der Einnahme des Steroides und dem damit einhergehenden Anstieg
der Viruslast auf 25.000 Kopien/ml (März 2006: 4.000 Kopien/ml), zu gleichen Teilen die
Aminosäuren L und M an der Position 7. Nach Beendigung der Steroidbehandlung im Juni
2006, bei einer Viruslast von 43.000 Kopien/ml, konnte an dieser Position nur noch die dem
Wildtyp entsprechende Aminosäure L festgestellt werden. Dann im Juli 2006, bei einer
Viruslast von 16.000 Kopien/ml zeigte sich an der Position 7 eine L-zu-M Substitution
(Abb. 20). Die CTL Antwort gegen das Wildtyp Epitop und der L-zu-M Variante wurde mit
PBMC von Januar 2007 überprüft. Die ELISPOT-Analysen ergaben eine gute CD8+ T-Zell
Reaktion gegen die ursprüngliche autologe Sequenz RQDILDLWV und eine stark
abgeschwächte CTL Antwort gegen die Variante mit dem L-zu-M Austausch (Abb. 20).
90
Ergebnisse
4.3.3
Analyse der L-zu-M Mutation in dem Nef B13 restringierten Epitop RQDILDLWV
auf die CTL Erkennung in dem Patienten M
Es sollte der Effekt der Mutation an der Positionen 7 in dem dominanten HLA-B13 Epitop
RQDILDLWV auf die CTL Erkennung ermittelt werden. Hierzu wurden frisch isolierte
PBMC des Patienten M von Januar 2008 mit Verdünnungsreihen des Wildtyp-Peptides und
der L-zu-M Variante RQDILDMWV in einem Standard γ-IFN-ELISPOT-Assay getestet
(Abb. 22). Die L-zu-M Peptidvariante zeigte eine stark beeinträchtigte CTL Erkennung im
SFU / 100 000 P BMC
Vergleich zur Wildtyp Version dieses Peptides.
120
100
RQDILDLWV
80
RQDILDM WV
60
40
20
0
20
1
0,1
0
Pept. Konz.(µg/ml)
Abb. 22: Analyse der CTL Erkennung der L-zu-M Substitution an Postition 7 in dem Nef B13
restringierten Epitop RQDILDLWV in standardisierten γ-IFN-ELISPOT-Analysen. PBMC des
Patienten M von Januar 2007 wurden auf die Erkennung von RQDILDLWV und der Variante
RQDILDMWV in Peptidverdünnungsreihen, getestet. Variante Aminosäure ist rot markiert. Ergebnisse
sind als SFU/1x105 angegeben. Pept. Konz.: Peptid Konzentration.
91
Ergebnisse
4.4
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast
bei Patient F
Es wurde im folgendem der seit 2001 als HIV positiv diagnostizierte Patient F untersucht.
Dieser zeigte trotz hoher Viruslast eine im Normbereich liegende CD4+ T-Zellanzahl.
4.4.1
Klinischer Verlauf des HLA-B27-positiven Patienten F
Zum Zeitpunkt der HIV-1 Erstdiagnose im Juni 2001 konnte eine CD4 Zellzahl von 834
Zellen/µl festgestellt werden. Einen Monat später
im April 2001 wurde die höchste
Viruslast
89.000
vor
der
HAART
(Juni
2001) mit
Kopien/ml
diagnostiziert.
Interessanterweise zeigte sich trotz dieser hohen Viruslast eine normale CD4 Zellzahl von
733 Zellen/µl (Normbereich: 430 bis 1.400 Zellen/µl). Die Tabelle 17 fasst den
Krankheitsverlauf von der Erstdiagnose bis zum Beginn der ersten HAART zusammen. Der
Patient nahm ab Dezember 2001 an einer therapeutischen Vakzinestudie mit einem Nefexprimierenden MVA-Vektor (MVA-nef) teil. Nach drei Immunisierungen wurde ab Mai
2002 eine Therapiepause durchgeführt. Ab Mai 2003 waren keine Daten über den Patienten
mehr verfügbar, bis er sich erneut im April 2007 im Vollbild von AIDS wieder vorstellte.
Tab. 17: Krankheitsverlauf des Patient F
CD4 Zellzahlen
Viruslast
(Zellen/µl)
(Kopien/ml)
März. 01
834
Positiv
Höchste Viruslast
25. April 2001
733
89 000
Niedrigste CD4 Zellzahl
25. Mai 2001
590
79 000
Beginn HAART
21. Juni 2001
635
450
(2. Juni 2001)
Zeitpunkte
Erstdiagnose
Positiv bedeutet es konnten HIV-1 Antikörper nachgewiesen werden.
92
Ergebnisse
4.4.2
Prüfung der Aminosäuresequenzen verschiedener Regionen in HIV-1 des Patienten
F auf das Vorhandensein von Substitutionen in funktionell wichtigen Domänen
Es sollten Mutationen in funktionell wichtigen Regionen untersucht werden, welche zu
einer potenziellen Abschwächung der Virulenz der HI-Viren in dem Patienten F führen
könnten. Hierzu wurden die gag, pol und nef Gene des Patienten F zu verschiedenen
Zeitpunkten amplifiziert. Für die Zeitpunkte mit niedrigen Viruslasten (Mai 2002 und April
2007) wurde provirale DNA aus vorher angelegten PHA-Blasten für die Amplifizierung
mittels etablierter PCR verwendet. Alle anderen Sequenzen wurden unter Extraktion von
RNA aus Plasma nach reverser Transkription und Amplifikation der cDNA, erhalten. Das
Pol Protein (provirale DNA, April 2007) zeigte keine auffälligen AminosäureSubstitutionen im Vergleich zum Referenzstamm HXB2 (Daten nicht gezeigt). Die Abb. 23
zeigt den Sequenzvergleich auf Aminosäureebene für einen Teil des Gag (A) und Nef
Proteins (B).
A Datum: CD4:
VL:
Mai 02 766 48000
Apr.07 35
80*
Gag HIV 1 HXB2
B Datum: CD4:
Apr.01
Mai.01
Dez.01
Jun.02
Sep.02
Apr.07
Nef
-A--------------------------------------------X-------------------------------------------IGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEP
246
291
VL:
733 89000
590 79000
726
<50*
896 18000
926 25000
35
80*
HIV 1 HXB2
----------Y--E-K--------N---------C------I-FS----------Y--E-K--------N---------C------I-F-----------Y--E-K------V-N---------C------I-------------Y--E-K--------N---------C------I-F-----------Y--E-K------V-N---------C------I-F-----------Y--E-K--------N---------C------I---KEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPL
92
137
Abb. 23: Sequenzvergleich auf Aminosäureebene der Gag und Nef Regionen der HI-Viren des
Patienten F. Sequenzvergleich von einem Teil des p24 Proteins der HI-Viren des Patienten F zu
zwei verschiedenen Zeitpunkten (A). Sequenzvergleich von einem Teil des Nef Proteins des
Patienten F zu verschiedenen Zeitpunkten (B). Virensequenzen die mit * gekennzeichnet sind wurden
unter Verwendung von PHA-Blasten aus proviraler DNA erhalten. Alle anderen Virensequenzen
wurden unter Verwendung von Plasma aus RNA erhalten. Abweichungen der Aminosäuren im
Vergleich zu HXB2 sind als Buchstaben gekennzeichnet. HLA-B27 Epitope sind als fett gedruckte
Buchstaben gekennzeichnet. Das „RR“ Motiv der PAK Bindungsdomäne ist rot unterlegt. Die
entsprechenden Viruslasten und CD4 Zellzahlen sind den entsprechenden Zeitpunkten der jeweiligen
Virensequenzen zugeordnet. X bedeutet: Sequenz nicht detektierbar; HXB2: Durchnummerierte
Aminosäuresequenz von HIV-1 Stamm HXB2. Apr.: April, Jun.: Juni; Sep.: September, Dez.:
Dezember.
93
Ergebnisse
Die Sequenzanalysen des von HLA-B27-positiven Patienten häufig erkannten HLA-B27restringierten Epitops KRWIILGLNK in Gag p24 zeigte weder im Mai 2001 noch fünf
Jahre später im April 2007 Mutationen Abb. 23 A). Dieses Epitop ist in HLA-B27-positiven
Patienten ein dominantes Epitop und seine Erkennung ist mit einer langsameren Progression
der HIV-1 Infektion assoziiert (Schneidewind et al., 2007; Altfeld et al., 2006; Goulder et
al., 1997). Interessanterweise konnte für den Patienten F nur eine schwache CTL
Erkennungen gegen dieses Epitop (mit diesem Peptid stimulierte PBMC von Juni 2007) im
ELISPOT nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). In den Nef-Sequenzen seiner HIViren konnten von April 2001 bis April 2007 zwei Mutationen (As 105 R-zu-E und As 107
Q-zu-K) in der funktionell wichtigen Bindungsregion für die p24-aktivierte Kinase 1 und 2
(PAK 1/ 2) (As 106, 107) festgestellt werden (Renkema et al., 1999; Fackler et al., 2000).
Beide Mutationen sind ungewöhnlich und die R-zu-E Mutation an Position 1 (As 105) ist in
dem so genannten “RR” Motiv innerhalb der PAK Bindungsstelle lokalisiert. Mutationen
innerhalb diesen Motivs können verschiedene Nef Funktionen beeinträchtigen (Geyer et al.,
2001). Bei diesen Mutationen handelt es sich sehr wahrscheinlich um CTL
FLuchtmutationen innerhalb des auf HLA-B27 restringierten Epitops RRQDILDLWI (As
106-115). In den ELISPOT-Analysen zu verschiedenen Zeitpunkten (frisch isolierte PBMC,
2002 und Peptid stimulierte PBMC von Dezember 2003 sowie Juli 2007) konnten CTL
Erkennungen gegen dieses Epitop in dem Patienten F festgestellt werden (Daten nicht
gezeigt).
4.4.3
Funktionelle Analysen des autologen nef Genes des Patienten F
Um zu klären, ob diese Mutationen zu einer postulierten Abschwächung der HI-Viren in
dem Patienten F beitrugen, wurde das amplifizierte nef Gen von Mai 2001 an Prof. Frank
Kirchhoff (Virologie, Universität Ulm), versandt. Die Analyse dieser Nef DNA erfolgte
analog der unter 4.2 beschriebenen Methode. Die Durchführung wurde hierbei von Jan
Münch vorgenommen (siehe auch Schindler et al, 2003). Die Tabelle 18 fasst die
Ergebnisse aus diesen funktionellen Analysen zusammen.
94
Ergebnisse
Herunterregulierung
Heraufregulierung
(n-fach):
Expression Prozent
(n-fach):
[MFI] :
[%] :
CXCR4
CD28
MHC-I
CD4
CD3
CD74
IL2R
AnV
(3 dpi)
(3 dpi)
(3 dpi)
(3 dpi)
(4 dpi)
(3 dpi)
(4 dpi)
(5 dpi)
HIV-1 NA7
1,30
3,34
1,91
2,46
0,76
12,25
2.038
33
Pat.F
1,75
2,40
2,88
2,45
1,15
8,08
1.474
18
Tab. 18: Funktionelle Analyse des autologen nef Genes der HI-Viren des Patienten F
Nef vermittelte n-fache Herunterregulierung der Rezeptoren CXCR4, CD28, CD4, CD3 und des Major
Histokompatibiltätskomplex (MHC-I), bzw. Heraufregulierung von CD74 wurde errechnet durch die
Division der mittleren Fluoreszenz Intensität [MFA] der Zellen welche mit einem Nef deletierten HIV-1
Virus gemessen wurden und den entsprechenden MFAs der eingesetzten HIV-Konstrukte die Nef und eGFP
durch ein IRES Element koexprimieren (HIV-1 NA7, Pat.F). Die entsprechenden Konstrukte basieren auf
dem HIV-1Laborstamm NL4-3 und tragen das nef Gen des Patienten F von Mai 2001 (Pat. F Mai. 01)
gefolgt von einem IRES Element und dem eGFP Gen. Die Expression des Interleukin-2 Rezeptores (IL-2 R)
wurde in MFI angegeben, die von Annexin V (AnV) positiven Zellen in %. HIV-1 NA7 entspricht der HIV
Wildtyp Linie M. Die Messungen erfolgten 1 bis 5 Tage nach Infektion (dpi). Gezeigt sind die Werte aus
drei unabhängigen Experimenten.
Im Vergleich zu dem Wildtyp Reporterkonstrukt NA7 (Schindler et al., 2005), konnte für das
nef Gen des Patienten F eine um 1,53 fach stärkere Herabregulierung des TCR-CD3, eine 1,4
fach geringere Expression des IL-2 Rezeptors (Kennzeichen der späten T-Zell Aktivierung)
und 15 % weniger apoptotische Zellen festgestellt werden. Diese Ergebnisse stehen im
Einklang mit publizierten Daten von Schindler, 2006, welche zeigten, dass die Nef Allele der
meisten Primaten Lentiviren (inklusive HIV-2) die Expression des TCR-CD3 in infizierten
Zellen herunterregulieren. Die Zellen werden dadurch weniger aktiviert und somit weniger
dem durch Aktivierung induzierten Zelltod ausgesetzt. Zudem zeigten die MHC-Klasse-I
Moleküle eine 1,5 fach stärkere Herabregulierung, was die schlechte Erkennung des in HLAB27-postitiven Patienten dominante Epitop, KRWIILGLNK erklären könnte. Bei der
Invarianten Kette war eine 1,5 fach geringere Heraufregulierung feststellbar.
4.5
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte T-
Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Jan Dörrie und Niels Schaft (Dermatologie,
Erlangen) sollten CD8+ T-Zellen, welche mit RNA elektroporiert wurden, die einen HIV-1
95
Ergebnisse
Pol spezifischen TCR enkodiert, auf eine spezifische Lyse von Targetzellen in einem hier
durchgeführten 51Cr-Freisetzungs-Versuch überprüft werden. Als Targetzellen wurden
HLA-A2 positive EBV-immortalisierte B-Zellen verwendet. Diese Targetzellen wurden
entweder mit dem HLA-A2 restringierten, aus der Polymerase von HIV stammenden Peptid
ILKEPVHGV oder mit verschiedenen rekombinanten Vaccinia Viren (Kontroll-Vaccinia
Virus: Vsc8; HIV-1 Polymerase exprimierende Vaccinia Viren: vAbt204 und VcF21)
inkubiert. Als Negativkontrolle dienten Targetzellen welche mit dem Vaccinia Virus Vsc8
infiziert wurden. Die Chrominkubation erfolgte über Nacht. Für den Vergleich der
spezifischen Lysen wurde zudem eine ILKEPVHGV spezifische CTL-Linie mitgeführt
(Abb. 24).
80 CTL Linie ILKEPVHGV 40
35
68
70
% Lyse
60
49
50
40
CTL/ Pol TCR
37
48
30
Kontroll Vaccinia Virus:
Vsc8
25
Kontroll Vaccinia Virus:
Vsc8 + Peptid: ILKEPVHGV
20
34
30
15
Polymerase kodierendes
Vaccinia Virus: vAbT204
20
10
Polymerase kodierendes
Vaccinia Virus:VcF21
10
5
0
0
E:T Ratio 30:1
A
4
5
1
E:T Ratio 30:1
B
Abb. 24: Vergleich der spezifischen Lyse von TCR-RNA elektroporierten T-Zellen mit der CTL-Linie
ILKEPVHGV. Als Effektoren (E) wurde die CTL-Linie ILKEPVHGV (mit diesem Peptid stimulierte
PBMC) A) sowie CD8+ T-Zellen, welche mit einer RNA die den HIV Pol spezifischen TCR B) enkodiert, in
einem 51Cr-Freisetzungs-Versuch 24 Stunden nach Elektroporation getestet. Als Target (T) dienten HLA-A2
positive EBV immortalisierte B-Zellen welche über Nacht mit Chrom inkubiert wurden und entweder mit
dem Peptid ILKEPVHGV beladen waren oder mit folgenden Vaccinia Viren (MOI 3) 1,5 Stunden
präinkubiert wurden: Vsc8 (Negativkontrolle), vAbt204 und VcFR21 (HIV Polymerase exprimierenden
Vaccinia Viren). Abgebildet ist die spezifische Lyse ermittelt aus Triplikaten.
Die TCR-reprogrammierten CD8+ T-Zellen und die mit Peptid stimulierte CTL-Linie
zeigten eine vergleichbare Lyse der mit dem HLA-A2 restringierten Peptid beladenen
Targetzellen. Targetzellen die mit den beiden, die HIV-1 Polymerase exprimierenden
Vaccinia Viren, inkubierten wurden, wurden von den reprogramierten CD8+ T-Zellen nur
sehr schwach lysiert (vAbT204: 4% und VcF21: 5%). Auch die ILKEPVHGV stimulierte
96
Ergebnisse
CTL-Linie lysierte diese infizierten Targetzellen weniger stark als die mit dem Peptid
beladenen Targetzellen (19%, vAbT204 bzw. 18%, VcF21). Weiterhin wurden von mir
für dieses Kooperationsprojekt verschiedene Infektionsanalysen mittels p24-ELISA
durchgeführt. Hierbei sollte der Einfluss der TCR-reprogrammierten CD8+ T-Zellen auf die
Infektion, von mit dem Laborstamm NL4-3 infizierten, CD8-depletierten T-Zellen,
untersucht werden. Es konnte weder für die mit Peptid stimulierte CTL-Linie noch für die
reprogrammierten CD8+ T-Zellen eine Reduktion der Infektion in diesem Analysesystem
beobachtet werden.
97
Diskussion
5
Diskussion
5.1
Analyse von Fluchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
Um die Bedeutung von CTL Fluchtmutanten auf den HIV-1 Krankheitsverlauf zu
untersuchen, wurde in einer Kohorte von HLA-B8-postitiven Patienten der Einfluss von
CTLs, die das immunologisch dominante HLA-B8-restringierte Nef Epitop FL8 erkennen,
untersucht. Die Langzeitstudie an der Patientin 01, welche eine gute Kontrolle der HIV
Infektion ohne HAART über einen Zeitraum von sechs Jahren aufrechterhalten konnte,
ergab das Auftreten von Mutationen in zwei auf HLA-B8-restringierten CTL Epitopen in
Nef. Beide Mutationen gingen mit dem starken Anstieg der Viruslast und der
Krankheitsprogression einher. Die Sequenzanalyse ihres HLA-B8-negativen Sexualpartners
(Patient 02) ergaben klare Hinweise darauf, dass die Mutanten in beiden HLA-B8restringierten Nef-Epitopen nicht übertragen, sondern bei der Patientin 01 selektiert wurden.
Die beiden beobachteten Aminosäurereversionen von zwei Austauschen, welche nur in den
Viren des Patienten 02 im Vergleich mit dem Reverenzstamm HXB2 (HIV-Datenbank,
2007) gefunden wurden, deuten zudem stark darauf hin, dass der Patient 02 die HI-Infektion
auf die Patientin 01 übertragen hatte. Die für die Patientin 01 durchgeführten ELISPOTAnalysen mit PBMC von Zeitpunkten vor und nach dem Anstieg der Virämie, zeigten eine
schwächere CTL Antwort auf die gegenwärtigen autologen viralen Varianten, im Vergleich
zu den entsprechenden früheren, bis Januar 2004, vorherrschenden autologen Varianten FL8
und WM8-V1. Dies weist stark darauf hin, dass diese Mutationen tatsächlich CTLFluchtmutanten darstellen. Die FL8-spezifischen CTLs bei der Patientin 01, erkannten das
variante Peptid mit der K-zu-Q Mutation, schon vor ihrem Auftreten im Plasma.
Experimente
mit
Peptidverdünnungen
ergaben
jedoch
eine
zweifach
niedrigere
Peptidsensibilisierungkapazität für die K-zu-Q Variante im Vergleich zu dem FL8 WildtypPeptid.
Dies
zeigt,
dass
bereits
ein
leichter
Unterschied
in
der
Peptidsensibilisierungskapazität, einen Überlebensvorteil dem viralen Stamm mit dieser
Mutation verleihen kann. Mutationen an der Position 5 innerhalb des FL8-Epitopes, wurden
schon mehrfach als CTL Fluchtmutanten in HLA-B8-positiven Patienten beschrieben (Price
et al., 1997; Goulder et al., 1997). Die Aminosäure an dieser Position scheint als
zusätzlicher Anker zu agieren, welcher die Peptidbindung an das HLA-B8-Molekül
stabilisiert. Dies wird durch Experimente (Price et al., 1997; Goulder et al., 1997) gestützt,
98
Diskussion
in welchen zwar eine ähnlich starke Bindung der K-zu-Q Variante an das HLA-B8-Molekül
gezeigt werden konnten, aber gleichzeitig eine schnellere Abgangsrate des mutierten
Peptides, im Vergleich zu dem Wildtyp FL8-Peptid ergaben. Folglich scheinen
standardisierte ELISPOT-Analysen und Experimente mit Peptidverdünnungen, die
negativen Auswirkungen der CTL Erkennung durch die Mutation an Position 5 zu
untermauern (Price et al., 1997; Goulder et al., 1997; da Silva et al., 2003). Zu dem
Zeitpunkt als die K-zu-Q Mutation innerhalb des FL8-Epitopes bei der Patientin 01
erschien, konnte auch das Auftreten einer neuen E-zu-A Substitution (As 18) an Position 6
in dem ebenfalls auf HLA-B8-restringierten Epitop WPAIRERM (WM8) in Nef beobachtet
werden (Kiepiela et al., 2004; HIV-Datenbank, 2007). Dieser Austausch führte zu einer
Aufhebung der WM8-spezifischen CTL Antwort, was ebenfalls auf eine Selektion als
Fluchtmutante durch WM8-spezifische CTLs hinweist. Das WM8-Epitop ist variabler als
das FL8-Epitop und CTLs die gegen natürlich auftretende WM8 Varianten gerichtet sind,
wurden möglicherweise bei der Analyse der CTL Antwort für die Patientin 01, unter
Verwendung von Nef Peptiden entsprechend der HIV-1 HXB2, Sequenz, übersehen. Im
Vergleich zu FL8, scheint das WM8-Epitop eher ein subdominantes CTL Epitop in HLAB8-positiven Patienten darzustellen (Goulder et al., 1997). Auch in der Patientin 01 kamen
FL8-spezifische CTLs häufiger vor als WM8-spezifische CTLs. Trotzdem weist das
gleichzeitige Auftreten von Mutationen in den beiden Epitopen FL8 und WM8 daraufhin,
dass auch das subdominante WM8-Epitop zu der Hemmung der HIV-1 Replikation in
diesem Individuum beigetragen hat. Diese Beobachtung steht im Einklang mit anderen
Studien, die den bedeutenden Beitrag der Erkennung von subdominanten CTL Epitopen für
die Kontrolle der HIV-1 Infektion in vivo beschreiben (Frahm et al., 2006 u.a.). Es konnte
zudem in der ebenfalls HLA-A2-postiven Patientin 01, das Auftreten von Mutationen in
zwei auf HLA-A2-restringierte CTL Epitope VLEWRFDSRL und AFHHVAREL (HIVDatenbank, 2007) beobachtet werden. Da keine spezifischen CTLs in den ELISPOTAnalysen detektieren werden konnten, kann nicht nachgewiesen werden, dass diese CTLs
durch die Patientin selektioniert wurden. Im Gegensatz zu dem Auftreten von CTL
FLuchtmutationen in den beiden auf HLA-B8-restringierten CTL Epitopen in Nef,
entwickelten sich in der Patientin keine Mutationen in dem ebenfalls auf HLA-B8restringierten und von HLA-B8-positiven Patienten häufig erkannten p24-Epitop
EIYKRWII (EI8) (Goulder et al., 1997).
99
Diskussion
Da die Patientin 01 in verschiedenen ELISPOT-Analysen um 1998 und 1999 keine CTL
Antwort auf dieses Epitop zeigte, kann angenommen werden dass, aufgrund eines
ausgebliebenen Selektionsdruckes auf das EI8-Epitop keine Mutationen entstanden waren.
Während der Krankheitsprogression wurden keine EI8-pezifischen CTLs für die Patientin
01 gemessen. Die Anwesenheit von EI8 spezifischen CTLs, die entweder keine
Unterdrückung der Viruslast verursachten oder keinen Selektionsdruck auf das EI8-Epitop
ausübten, kann somit nicht ausschlossen werden. Um den Einfluss von Mutationen
innerhalb des FL8-Epitopes für den Krankheitsverlauf auch in einem größerem Ausmaß zu
bewerten, wurden Nef-Sequenzen in einer Kohorte bestehend aus 56 HIV-1 infizierten
Patienten analysiert. Die signifikante Korrelation von HLA-B8 auf Mutationen innerhalb
des FL8-Epitopes, insbesondere Mutationen an der Position 5, unterstreicht den starken
Selektionsdruck von CTLs auf das FL8-Epitop. Zudem weist die signifikante Assoziation
zwischen Mutationen innerhalb von FL8 und HLA-B8 darauf hin, dass Substitutionen
innerhalb von FL8 möglicherweise einen negativen Effekt auf die HIV-1 Replikation oder
Fitness haben, weil sie anscheinend nur bei einem durch das Immunsystem ausgeübten
Selektionsdruck in Erscheinung treten. Dies stützt die Vermutung, dass CTL
Fluchtmutationen innerhalb von FL8 tatsächlich die Ursache für den Anstieg der Viruslast
sind und spricht gegen die Möglichkeit, das Mutationen innerhalb von FL8 lediglich aus der
Konsequenz einer gesteigerten Virusreplikation entstehen. Unsere Ergebnisse bestätigen
frühere Berichte, welche das FL8-Epitop, als ein immunologisch dominantes und häufig
erkanntes CTL Epitop in HIV-1-infizierten B8-positiven Individuen beschreiben (Oxenius
et al., 2000; Altfeld et al., 2001). Die weiterhin durchgeführten ELISPOT-Analysen mit
Peptidverdünnungsreihen zur Überprüfung der CTL Antworten in acht B8-positiven
Spendern zeigten, dass alle beobachteten FL8-Varianten die CTL Erkennung abschwächen.
Dies bestätigt vorangegangene Berichte, die eine schwächere CTL Antwort für
Substitutionen an der Position 5, im Vergleich mit dem Wildtyp FL8-Peptid demonstrieren
konnten (Price et al., 1997; Goulder et al., 1997; Frahm et al., 2006). Interessanterweise
konnten innerhalb der Patientenkohorte erhebliche Unterschiede bezüglich der Erkennung
von FL8 Varianten gefunden werden. Dies weißt auf die Verwendung von unterschiedlichen
TCR der individuellen Patienten hin und steht in Übereinstimmung mit anderen Studien, die
HLA-B8-positive Patienten, welche ein diverses TCR-Repertoire für die FL8-Erkennung
verwenden konnten, aufzeigten (Dong et al., 2004; Meyer-Olson et al., 2006).
100
Diskussion
Die Bedeutung von CTL Fluchtmutanten innerhalb des FL8-Epitopes für die
Krankheitsprogression in B8-positiven Patienten wurde zudem durch die signifikante
Korrelation von Mutationen innerhalb des FL8-Epitopes und einer niedrigeren CD4
Zellzahl in allen Patienten, sowie einer höheren Viruslast in einem Teil der Patienten mit
detektierbaren Viruslasten, gestützt. Das Ausbleiben von Mutationen im FL8-Epitop konnte
nicht durch das Fehlen von FL8-spezifischen CTLs begründet werden, da spezifische CTLs
in sieben von acht analysierten Patienten ohne Mutationen gefunden wurden (Tabelle 4.1.2).
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass FL8-spezifische CTLs mit einem spezifischen TCR,
wie dem Vß13.2, eine bessere Erkennung von viralen Varianten aufweisen (Dong et al.,
2004), als CTLs welche andere TCR vß und vα Gensegmente verwenden. Da TCR
Analysen in unserer Studie nicht durchgeführt wurden, kann lediglich darüber spekuliert
werden, ob breitere kreuzreagierende TCR mit dem Fehlen von detektierten Mutationen in
unserer Kohorte assoziiert waren.
Zusammenfassend demonstrieren diese Daten einen starken CTL-Selektionsdruck
auf das immunologisch dominante, auf HLA-B8-restringierte CTL Epitop FL8 in HIV-1
Nef. Die Assoziation von FL8 Mutationen mit einer niedrigeren CD4 Zellzahl, weist auf
eine
wichtige
Rolle
von
CTL
Fluchtmutanten
innerhalb
von
FL8
für
die
Krankheitsprogression hin.
5.2
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren bei
einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion durch das
gleiche Virus
Um die Gründe für den extrem guten HIV Infektionsverlauf der Patientin U (Viruslast < 50
Kopien/ml, mit einem nur leichtem Anstieg nach 2 Jahren auf 260 Kopien/ml) zu
analysieren, wurden wesentliche Faktoren wie die Infektiosität, Replikationsfähigkeit, virale
Gene und eine potenzielle funktionelle Abschwächung ihrer HI-Viren, sowie genetische und
immunologische Wirtsfaktoren im Hinblick auf CTLs, antivirale Zytokine, Korezeptoren,
Apopec und neutralisierende Antikörper untersucht. Durch Experimente mit KoKultivierungen von CD8-depletierten PBMC der Patienten U und R mit denen von
gesunden Spendern, konnte gezeigt werden, dass die Viren der Patientin infektiös waren
und keinen Defekt in ihrer Replikationsfähigkeit besaßen. Der Sequenzvergleich der Gag,
Pol,
101
Diskussion
Vif, Vpu, Vpr and Nef-Regionen ihrer HI-Viren und derer ihres Sexualpartners (Patient R),
zeigten vor allem das nef Gen ihrer Viren als klar mutiert. Ein Zusammenhang zwischen der
hohen Mutationsrate und einem potenziellen Apobec3G-Effekt in der Patientin U scheint
sehr unwahrscheinlich da weder die Anwendung eines speziellen Kalkulationsprogrammes
zur
Berechnung
von
Apobec3G
erzeugten
G-zu-A
Hypermutationen
(www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/HYPERMUT/hypermut.html), noch die exakte Analyse
der Nef-Sequenzen beider Patientenviren auf Nukleotidebene einen Hinweis darauf
lieferten. Hinweise auf das Vorhandensein von anderen humanen Apobec3G ähnlichen
Proteinen, welche ebenfalls zu einer Hypermutation der HI-Viren in der Patientin führen
könnten, wurden bei einer Passage des definierten NL4-3 Laborstammes in CD8depletierten PBMC der Patientin nicht gefunden. Einige Mutationen konnten in den HIV
Sequenzen beider Patienten beobachtet werden. Viele davon befanden sich zudem in bereits
bekannten CTL Epitopen, die durch die HLA-Allele des Patienten R präsentiert werden
könnten. Dies spricht für eine Selektion dieser entsprechenden Epitopvarianten durch CTLs
des Patienten R und einer Übertragung dieser, bereits durch seine HLA-Allele genomisch
geprägten, HI-Viren auf die Patientin U. Drei für Nef funktionell wichtige Regionen, wie
die Schnittstelle für die HIV-1 Protease (Freund et al., 1994, Review Geyer et al., 2000), die
Interaktionsstelle für Nef mit dem humanen Protein PACS-1 (Piguet et al., 2000) und für
die humane vakuoläre ATPase (V1H) (Lu et al., 1998), wiesen in den Sequenzvergleichen
Mutationen auf. Zudem konnte eine ungewöhnliche fünf Aminosäure lange Deletion in der
C-terminalen Region in den Viren der Patientin U, welche mit der 3’ LTR überlappt,
detektiert werden. Dies gab einen ersten Hinweis darauf, dass möglicherweise auch eine
funktionelle Abschwächung der HI-Viren der Patientin U, wie die Modulation von
Oberflächenrezeptoren (z.B. MHC-Moleküle, CD4-Oberflächenrezeptoren und CD74) eine
Ursache für den extrem guten Verlauf ihrer Infektion sein könnten. So konnte bereits
mehrfach gezeigt werden, dass das nef Gen der HI-Viren eine große Bedeutung für dessen
Pathogenität hat (Kestler et al, 1991; Kirchhoff et al., 1995) und wichtige Funktionen bei
der Herunterregulierung von Zelloberflächenrezeptoren (Garcia and Miller, 1991; Schwartz
et al., 1996) übernimmt. Nef interagiert hierfür mit entscheidenden Proteinen der
Endozytosemaschinerie wie der humanen vakuoläre ATPase. Hierdurch wird der Transport
zur und von der Plasmamembran beeinflusst (Lu et al., 1998; Geyer et al., 2002; Jin et al.,
2005). Zudem konnte bereits gezeigt werden, dass durch Bindung von Nef an das PACS-1
102
Diskussion
Protein, letzten Endes der vesikuläre Transport von MHC-I gestört wird (Bauer et al., 1997;
Williams et al., 2002). Auch wurde bereits über große Deletionen im Nef Lesereahmen von
LTNP berichtet (Kirchhoff et al., 1995). Ein bekannter genetischer Polymorphismus in den
Wirtsfaktoren Apobec3G (Bogerd et al., 2004) und dem CCR5-Rezeptor (Liu et al. 1996;
Eugen-Olson et al., 1997) als Ursache für den sehr guten Infektionsverlauf in der Patientin
U konnte mittels PCR und Sequenzanalyse nicht gefunden werden. Auch eine geringere
CCR5 Expression als Hintergrund für eine potenziell geringere Infektiosität der Zellen der
Patientin U, konnte mittels FACS Analyse nicht beobachtet werden. Dagegen sprach
zudem, dass CD8-depletierte PBMC der Patientin U mit verschieden tropen HIV-1
Stämmen infiziert werden konnten und eine vergleichbare Replikationskinetik in diesen
Zellen im p24-Elisa aufwiesen. Auch für das Vorhandensein von antiviralen Zytokinen in
Zellkulturüberständen der Patientin U konnte mittels Infektionsanalyse von verschieden
tropen HIV-1 Stämmen im p24-Elisa kein Hinweis gefunden werden. Interessanterweise
zeigte das Serum der Patientin eine Dosis-abhängige Hemmung der Infektion mit den
Laborstämmen NL4-3 (R5) und 89.6 (X4/R5). So konnte bei einer 1:10 Verdünnung ihres
Serums eine fast vollständige und bei einer 1:100 Verdünnung noch eine 50 % ige
Inhibition beobachtet werden. Diese inhibierende Wirkung bei den entsprechenden
Verdünnungen spricht für das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern im Serum
der Patientin. Die vertiefte Analyse ihres Serums in Kooperation mit Sascha Antoni
(Biomedizinisches Forschungszentrum in Frankfurt) in Bezug auf Inaktivierungsbreite und stärke zeigten eine gute neutralisierende Wirkung auf verschieden trope HIV Laborstämme.
Der Vergleich der neutralisierenden Aktivitäten des Serums der Patientin mit bereits von
Humbert et al., 2007 publizierten Daten über LTNP und Progressoren ergab jedoch, dass die
neutralisierende Wirkung eher mit denen aus der Progressorengruppe vergleichbar waren.
Dies lässt vermuten, dass die extrem gute Kontrolle der HIV-1 Infektion bei dieser Patientin
nicht alleine auf die hemmende Wirkung ihres Serums zurückgeführt werden kann. Dafür
spricht auch, dass die Rolle von neutralisierenden Antikörpern bis heute stark umstritten ist
(Harrer et al., 1996; Bailey et al., 2006). So scheint die neutralisierende Wirkung dieser
Antikörper unter anderem durch die Bildung von Fluchtmutanten begrenzt zu werden
(Albert et al., 1990). Studien die einen Zusammenhang von neutralisierenden Aktivitäten
und LTNP zeigen konnten, sehen diesen oft unter anderem in Assoziation mit hohen
neutralisierenden Aktivitäten (Montefiori et al., 1996; Humbert et al., 2007; Wang et al.,
2008).
103
Diskussion
Die ELISPOT-Analysen zur Detektion von HIV-1 spezifischen CTLs bei beiden Patienten
ergaben für die Patientin U eine breite CTL Antwort gegen verschiedene Regionen in HIV1. Die stärkste CTL Antwort konnte hierbei gegen das in p17 lokalisierte Peptid
KIRLRPGGKKKYKL festgestellt werden. Die sehr gute Erkennung kann durch die zwei in
diesem Peptid enthaltenen HLA-A3 Epitopen (HIV-Datenbank, 2007; Altfeld et al., 2001c;
Walkerpercom et al., 1996) und dem HLA–B7 Epitop (HIV-Datenbank, 2007; Jin et al.,
2000) erklärt werden. Trotz dieser sehr guten Erkennung wies dieses Epitop keine
Mutationen zum Zeitpunkt der Sequenzierung im Dezember 2007 auf. Ein Grund hierfür
könnte darin liegen, dass diese Region in dem funktionell wichtigen KernlokalisationsBereich des Gag p17 Proteins liegt und Mutationen in dieser Region einen potenziellen
Nachteil für das Virus haben könnten. Weiterhin konnten gute CTL Erkennungen gegen
Aminosäuresequenzen, welche mit den HLA-Allelen der Patientin assoziiert sind, in den
HIV Proteinen Gag p17, Reverse Transkriptase, Nef und Vif gefunden werden. Dies lässt
vermuten, dass bei der Analyse von weiteren autologen Sequenzen für verschiedene
Regionen in HIV noch mehr spezifische CTLs für die Patientin U gefunden werden
könnten. Damit scheint die breite und auch starke CTL Antwort gegen verschiedene
Regionen in HIV-1 entscheidend zu dem bislang extrem guten Verlauf in der Patientin
beigetragen zu haben. Dies steht im Einklang mit anderen Studien, welche eine essentielle
Rolle von HIV-1 spezifischen CTLs für die Kontrolle der viralen Replikation und dem HIV1 Krankheitsverlauf beschreiben (Koup et al., 1994; Harrer et al., 1996; Musey et al., 1997).
Die im Juni 2008 für die Patientin U durchgeführten ELISPOT-Analysen zeigten zudem
eine gute CTL Antwort auf die in Nef lokalisierten Epitope FPVRPQVPL (HLA-B7) und
RYPLTFGWCY (ein HLA-A24-Epitop, das auch ein B7-Epitop enthält, HIV-Datenbank;
Choppin et al., 2001). Ihre gegenwärtigen autologen Varianten FPVKPQVPL und
RFPLTFGWCF, wurden im Vergleich zu diesen, deutlich schlechter erkannt. Dies weißt
stark darauf hin, dass diese Mutationen CTL Fluchtmutanten darstellen. Interessanterweise
konnten parallel für den Patienten R in mit Peptid stimulierten PBMC von Juni 2008
erhaltene CTL-Linien HIV-1 spezifischen CTLs gegen das genannte HLA-A24-Epitop
RYPLTFGWCY sowie gegen seine autologe Variante mit dem F-zu-L Austausch an
Position 6, gefunden werden. Somit scheint diese autologe Variante durch einen
Selektionsdruck, ausgeübt durch HLA-A24-restringierte CTLs, in dem Patienten R
entstanden zu sein. Diese Variante wurden dann vermutlich auf die Patientin U übertragen
und erneut aufgrund von einem Selektionsdruck, diesmal ausgeübt durch HLA-B7104
Diskussion
restringierte HIV spezifische CTLs der Patientin U, mutiert. Dies weist darauf hin, dass die
HI-Viren der Patientin U zu einem früheren Zeitpunkt eine gute Replikation zeigten und
erklärt somit auch die Vielzahl von Mutationen, vor allem in dem Nef Protein ihrer HIViren. Für den Patienten R konnten bisher nur insgesamt zwei CTL-Spezifitäten detektiert
werden. Gründe hierfür liegen entweder in einer mit AIDS assoziierten Iummendefizienz
oder einer Deaktivierung der CTL Antwort durch eine effiziente HAART. Da das nef Gen
der Patientin U sich als klar mutiert zeigte und zudem die bereits erwähnte fünf Aminsäure
lange Deletion in der C-terminalen Region enthielt, wurde die CTL Erkennung der Patientin
U auch auf ihre autologe Nef-Sequenz hin überprüft. Die Analysen im ELISPOT unter
Verwendung von überlappenden Nef Peptiden und ihres autologen Nef Proteins (durch
Elektroporation ihrer autologen Nef mRNA) zeigten eine starke Immunantwort gegen ihr
autologes Nef Protein. Die überlappenden Peptide ergaben zudem, dass die stärkste CTL
Antwort hierbei in der mittleren Region innerhalb von Nef lokalisiert ist (As 81 bis 130).
Aber auch gegen die Region, welche die fünf Aminosäuren lange Deletion enthielt, konnte
eine starke CTL Reaktion festgestellt werden. Dies gab einen ersten Hinweis darauf, dass
diese Deletion möglicherweise durch einen Selektionsdruck, ausgehend von ihren CTLs,
entwickelt wurde. Anhand der Sequenzanalyse von 13 klonierten nef Genen der HI-Viren
der Patientin und der Sequenzanalyse eines zweiten Zeitpunktes, konnte ausgeschlossen
werden, dass die fünf Aminosäure umfassende Deletion nur eine Minorität der Viren in der
Patientin darstellten. Zudem konnte in keinen der 29 klonierte nef Gene der HI-Viren ihres
Partners, die entsprechende Deletion detektiert werden. Dies lieferte somit einen weiteren
Hinweis darauf, dass diese Deletion durch einen Selektionsdruck, ausgeübt durch die CTLs
der Patientin U, und nicht durch die des Patienten R, entstanden war. Falls diese Annahme
stimmt, müsste sie eine CTL Antwort gegen ein Peptid zeigen, welches zumindest einen
Teil der deletierten Aminosäuren enthält. Die Klärung dieser Hypothese erfolgte mit bis zu
23 Aminosäuren umfassenden synthetischen Peptiden, die entweder den autologen
Sequenzen der HI-Viren der Patientin U oder derer ihres Partners entsprachen und die
Region der deletierten Aminosäuren enthielten. In den für die Patientin U hierzu
durchgeführten ELISPOT-Analysen konnten schwache CTL Antworten gegen das autologe
Peptid für den Patienten R, sowie starke CTL Antworten gegen das autologe Peptid der
Patientin U mit dem Insert (VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL) und gegen das autologe
Peptid mit der entsprechenden Deletion (VEPPEGEENSCLLHPMNL), detektiert werden.
Die Erkennung des autologen Peptides für die HI-Viren des Patienten R weist darauf hin,
105
Diskussion
dass die Sequenz in dieser Form tatsächlich auf die Patientin U übertragen wurde. Die
starke Erkennung der beiden autologen Sequenzen für die Patientin U mit und ohne
inserierten Aminosäuren, gaben einen ersten Anhaltspunkt darauf, dass möglicherweise
zwei Epitope in dieser Region von den CTLs der Patientin U erkannt wurden. Durch die
Blockierung der T-Zellantwort bei Zugabe von anti-CD8-Antikörpern, nicht aber durch
anti-CD4-Antikörper konnte eine CD4-Antwort gegen diese Peptide ausgeschlossen
werden. Für die Suche nach den optimalen Epitoplängen der bereits erkannten Regionen,
wurden CTL-Linien, welche mit den autologen Peptid ohne (autologe Pat. U:
VEPPEGEENSCLLHPMNL) bzw. mit inserierten Aminosäuren (autologe Pat U + Insert:
VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL) stimuliert wurden, auf die Erkennung jeweils kürzerer
Peptidversionen untersucht. Es konnten hierbei die zwei zehn Aminosäuren umfassenden
Peptide
VTSRENSCLL
und
PEGEENSCLL
ausfindig
gemacht
werden.
Das
VTSRENSCLL Peptid enthielt auch die fünf deletierten Aminosäuren und verstärkte
dadurch die Annahme, dass die Sequenz auf die Patientin U übertragen wurde und durch
einen Selektionsdruck, ausgehend von ihren CTLs, entstanden war. Die durchgeführten
Restriktionsanalysen um eine Präsentation der entsprechenden Peptide über die HLA-Allele
der Patientin zu analysieren, zeigten für beide Peptide eine Präsentation über HLA-B60(40).
Die Funktionsanalysen der jeweiligen Nef DNAs der HI-Viren beider Patienten,
durchgeführt in Kooperation mit der Virologie in Ulm, ergaben keine Unterschiede
hinsichtlich einer Modulation der Oberflächenrezeptoren CD4, CXCR4 und CD28. Auch
die Expression des IL2 Rezeptors, der ein Kennzeichen der späten T-Zellaktivierung ist,
sowie die mit der Aktivierung einhergehende Apoptose von Zellen, waren vergleichbar mit
den Wildtypkonstrukten. Eine etwas geringere Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen
und dem für die Aktivierung von T-Zellen wichtigen Oberflächenrezeptor CD3, konnte für
die Zellen, welche mit den Reportervirenkonstrukt für die Patientin U, infizierten wurden
festgestellt werden. Da in den ELISPOT-Analysen eine gute und breite CD8+ T-Zellantwort
für die Patientin U ermittelte wurde, scheint eine funktionelle Bedeutung dieses
Expressionsunterschiedes auf den MHC-Klasse-I-Weg eher unwahrscheinlich. Ein
deutlicher Unterschied fand sich bezüglich einer niedrigeren Hochregulation der Invarianten
Kette (CD74), welche verhindert dass Proteine im endoplasmatischen Retikulum an die
MHC-Klasse-II-Komplexe gebunden werden (um das
2,7 fach niedriger im Vergleich zu der des HIV-1 NA7 Konstruktes und 1,8 fach niedriger
im Vergleich zu der des Reportervirenkonstrukt mit dem Nef Allel des Patienten R),
106
Diskussion
detektiert werden. Die Bedeutung dieser Invarianten Kette für die Regulation der MHCKlasse-II-Antigenpräsentation, konnte schon mehrfach gezeigt werden (Bertolino et al.,
1996; Stumptner-Cuvelette et al., 2002). So wurde bereits berichtet, dass diese für die
Antigenpäsentation wichtige, Invariante Kette der MHC-Klasse-II (CD74 Rezeptor), durch
Nef heraufreguliert wird (Schindler et al., 2003). Die stabile Oberflächenpräsentation der
Invarianten Kette verhindert die Peptidpräsentation (Roche et al., 1992). Das könnte
bedeuten, dass eine verringerte Hochregulierung dieser Invarianten Kette, verursacht durch
eine beeinträchtigte Nef Funktion der HI-Viren der Patientin U, zu einer verstärkte CD4+ TZellantwort in der Patientin U führen würde. Auch diese Möglichkeit könnte unter anderem
zu der extrem gute Kontrolle der Virämie beigetragen haben. Diese Vermutung steht auch
im Einklang mit der Publikation von Schindler et al., 2003, in welcher in zwei von vier
untersuchten HIV-1 LNTP keine Hochregulierung der Invarianten Kette gefunden werden
konnte. Im Vergleich dazu zeigten die Nef Allele von zehn Progressoren eine
Hochregulierung. Zudem konnten starke und dauerhafte CD4+ T-Helferzellen in HIV-1
infizierten LTNP beobachtet werden (Rosenberg et al., 1997).
Zusammenfassend zeigen die umfassenden Analysen für die Patientin U, dass die
Ursachen für den extrem guten HIV-1 Infektionsverlauf, sehr wahrscheinlich in ihrer
breiten und guten CTL Antwort, aber auch dem Vorhandensein von neutralisierenden
Antikörpern gegen ihre HI-Viren liegen. Zudem weisen die Analysen bezüglich der fünf
Aminosäuren langen Deletion in Nef stark darauf hin, dass diese durch einen
Selektionsdruck, ausgeübt durch spezifische CTLs der Patientin U, entstanden ist. Eine
möglicherweise hieraus oder durch weitere Substitutionen entstandene funktionelle
Einschränkung des Nef Proteins ihrer HI-Viren in Bezug auf die Heraufregulierung des
CD74 Rezeptors, könnte somit einen positiven Einfluss auf die CD4+ T-Zellantwort in der
Patientin U haben.
5.3
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M
Nach der Einnahme von Steroiden, konnten bei dem Patienten M eine starke Zunahme der
Viruslast und ein Abfall der CD4+ T-Zellen beobachtet werden. Die ELISPOT-Analysen,
durchgeführt zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Steroidbehandlung, zeigten,
dass seine dominanten CTL Antworten vor allem gegen B13-Epitope gerichtet waren und
die stärkste Antwort gegen das in Nef lokalisierte Epitop RQDILDLWV festgestellt werden
107
Diskussion
konnte. Auch in anderen Studien wurde dieses Epitop bereits als dominantes Epitop bei
HLA-B13-positiven Patienten beschrieben (Venet et al., 1993; Harrer et al., 2005). Aus den
ELISPOT-Analysen konnte zudem eine Abnahme seiner CTL Aktivität gegen seine
dominanten Epitope in Nef, Gag und der Pol Region von Mai 2004 bis April 2008
beobachtet werden. Dies gab einen ersten Hinweis darauf, dass die Einnahme von Steroiden
zu einer verminderten Aktivität seiner CTLs geführt haben könnte, was den Anstieg der
Viruslast von 4.000 Kopien/ml (März 2006) auf 83.000 Kopien/ml (Mai 2006) erklären
würde. Die Sequenzanalyse in seinen dominanten HLA-B13-Epitopen in Gag und Pol
ergaben in einem Zeitraum von drei bis sechs Monaten nach der Steroideeinnahme, keine
neu entstandenen Aminosäure-Substitutionen. Das in der Polymerase lokalisierte Epitop
GQGQWTYQI zeigte schon vor der Steroidbehandlung eine Q-zu-H Substitution an
Position 2. In den ELISPOT-Analysen von mit dem Wildtyp und der Q-zu-H Variante
stimulierten CTL-Linien, konnte eine Erkennung für das Wildtyp-Peptid und keine
Erkennung für die Variante detektiert werden. Die mit dem Wildtyp-Peptid stimulierten
CTL-Linien konnten die Q-zu-H Variante nicht erkennen. Dies spricht für eine Entstehung
der Q-zu-H Variante in diesem Epitop durch einen Selektionsdruck der CTLs des Patienten
M, schon vor der Steroidapplikation. Die in der Polymerase lokalisierte Aminosäuresequenz
RQYDQILIEI zeigte ebenfalls schon vor der Steroidbehandlung eine Doppelmutation an
den Positionen 6 und 7 (IL-zu-VS). In diesem Fall konnte sowohl für das Wildtyp-Peptid als
auch für die Variante (mit den Peptiden stimulierte PBMS) eine CTL Erkennung detektiert
werden. Dies deutet ebenfalls auf eine Selektion der entsprechenden Varianten, schon vor
der Steroideinnahme hin. Die Erkennung des Wildtyp Epitopes und der Variante in
entsprechend stimulierten CTL-Linien weist auf eine mögliche Nachreifung der CTLAntwort durch Generierung eines neuen T-Zellrezeptors nach Entstehung dieser
Doppelmutation hin. Die Ursache der ansteigenden Viruslast nach Steroidapplikation lag
somit zunächst sehr wahrscheinlich nicht in neu entstandene CTL Fluchtmutanten, sondern
wurde durch eine funktionelle Hemmung der CTLs verursacht. Das in dem Patienten M
dominante B13-Epitop in Nef, RQDILDLWV, zeigte im Mai 2006 mit der Einnahme des
Steroides und dem damit einhergehenden Anstieg der Viruslast zu gleichen Teilen die
Aminosäuren L und M an der Position 7. Im Juni 2006, nach Beendigung der Steroid
Behandlung, bei einer Viruslast von 43.000 Kopien/ml, konnte an dieser Position nur noch
die dem Wildtyp entsprechende Aminosäure L festgestellt werden. Dann im Juli 2006, bei
einer Viruslast von 16.000 Kopien/ml zeigte sich an der Position 7 eine L-zu-M
108
Diskussion
Substitution. Das wechselnde Auftreten der Aminosäuren L und M an dieser Position weist
darauf hin, dass die Mutation an dieser Stelle möglicherweise für den Virus eine ungünstige
Auswirkung auf seine Fitness oder Virulenz haben könnte. Die ELISPOT-Analysen,
durchgeführt mit frisch isolierten PBMC und Peptidverdünnungsreihen des WildtypPeptides und der Varianten Version, ließ eine starke Abnahme der CTL Erkennung für das
mutierte Peptid erkennen. Dies zeigte, dass es sich bei dieser Mutation um eine CTL
Fluchtmutante handelte. So scheint der Anstieg der Viruslast durch die Immunsuppression
als Folge der Steroideinnahme ausgelöst worden zu sein. Eine erhöhte Virusreplikation
steigert über eine Zunahme von Mutationen das Risiko für die Entstehung von
Fluchtmutation. Da nur das dominanteste Epitop in dem Patienten M eine Fluchtmutation
nach Anstieg der Viruslast zeigte, kann vermutet werden, dass die anderen, ebenfalls von
dem Patienten erkannten Epitope, nicht den gleichen Druck auf den Virus ausüben. So
wurden auch in anderen Studien Hinweise darauf gefunden, dass nicht alle auftretenden
CTLs in einem bestimmten Patienten den gleichen Druck auf den Virus ausüben, sondern
dass es signifikante Unterschiede zwischen den Epitopen, HLA-Klasse-I-Allelen und TZellrezeptoren bezüglich ihrer antiviralen Wirksamkeit gibt (Kiepiela et al., 2004; Dong et
al., 2004). Der Anstieg der Viruslast von 4.000 Kopien/ml (März) auf 83.000 Kopien/ml
(Juli 2006) scheint die Folge der Immunsuppression durch die Steroideinnahme zu sein. Der
Viruslastanstieg von 4.000 Kopien/ml auf letzten Endes 16.000 Kopien/ml (Juli 2006)
scheint die Konsequenz aus der entstandenen Fluchtmutation in dem dominanten B13Epitop darzustellen.
Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Analysen, dass die Behandlung mit
Steroiden sehr wahrscheinlich zu einer Hemmung der Immunantwort geführt hatte. Die
Konsequenz daraus war dann eine verstärkte Virusreplikation, welche zu einem erhöhten
Risiko für die Bildung von Fluchtmutationen vor allem in den Epitopen mit starkem Druck
auf den HI-Virus führte. Eine immunsupressive Therapie sollte daher von einer antiviralen
Therapie, die von diesem Patienten abgelehnt worden war, begleitet werden, um einen
Anstieg der Virusreplikation und das Entstehen von Fluchtmutationen zu verhindern.
5.4
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast
bei Patient F:
Die Analyse der HIV-1 Sequenzen in dem Patienten F, welcher trotz hoher Viruslast eine im
Normbereich liegende CD4 Zellzahl aufwies, zeigte zwei Mutationen in der funktionell
109
Diskussion
wichtigen Bindungsregion für die p24-aktivierte Kinase 1 und 2 (PAK 1/ 2) in Nef
(Renkema et al., 1999; Fackler et al., 2000). In verschiedenen ELISPOT-Analysen mit
entweder frisch isolierten PBMC oder mit Peptid stimulierten PBMC (Dezember 2002 bzw.
2003 und Juli 2007), konnten CTL Erkennungen gegen das auf HLA-B27-restringierte
Epitop RRQDILDLWI für den HLA-B27-positiven Patienten festgestellt werden. Da eine
Erkennung auf die entsprechende autologe Variante von uns nicht getestet wurde, kann nur
vermutet werden, dass es sich bei beiden Mutationen um CTL Fluchtmutanten innerhalb
diesen Epitopes handelt. Beide Mutationen sind ungewöhnlich und die R-zu-E Mutation an
der Position 1 ist in dem so genannten „RR“-Motiv innerhalb der PAK-Bindungsstelle
lokalisiert. Da das „RR“-Motiv unter anderem eine essentielle Grundlage für die
Signaltransduktionsfunktion von Nef darstellt, gab dies einen ersten Hinweis darauf, dass
diese Mutationen einen Einfluss auf die Nef Funktion dieser HI-Viren haben könnte. So
konnte bereits gezeigt werden, dass an diesen Positionen ein Aminosäureaustausch zu
Leuzin, eine durch Nef induzierte Aktivierung von PAK verhindert (Renkema et al., 1999;
Fackler et al., 2000; Review Geyer et al., 2001). Die funktionellen Analysen des nef Gens
der HI-Viren des Patienten F in Kooperation mit Jan Münch aus der Arbeitsgruppe um Frank
Kirchhoff sollten deshalb eine potenzielle Abschwächung der HI-Viren in diesem Patienten
aufgrund der ungewöhnlichen Mutationen klären. Es konnte hierbei für das nef Gen des
Patienten F eine stärkere Herabregulierung des TCR-CD3 sowie eine geringere Expression
des IL-2 Rezeptores und eine geringere Apoptose-Inzidenz festgestellt werden. Diese
Ergebnisse stehen in Einklang mit den publizierten Daten von Schindler 2006, welche
zeigen, dass die Nef Allele der meisten Primaten Lentiviren (inklusive HIV-2) die
Expression des TCR-CD3-Komplexes in infizierten Zellen herunterregulieren. Die Zellen
werden dadurch weniger aktiviert und somit weniger dem durch Aktivierung induzierten
Zelltod ausgesetzt. Im Gegensatz dazu ist es den Nef Proteinen von HIV-1 und seinen
nächsten SIV Verwandten nicht möglich, den CD3-TCR herunterzurregulieren und somit
den durch Aktivierung induzierten Zelltod zu verhindern (AICD). Interessanterweise konnte
zudem eine stärkere Herabregulierung der MHC-Klasse-I-Moleküle für den Patienten F
festgestellt
werden. Diese verminderte Expression könnte die schlechte Erkennung des in HLA-B27positiven Patienten dominanten Epitop KRWIILGLNK erklären. Hiefür spricht auch, dass
weder 2002 noch fünf Jahre später, 2007 in den Aminosäuresequenzen dieses häufig von
HLA-B27-positiven Patienten frequentierten Epitopes, Mutationen für die HI-Viren des
110
Diskussion
Patienten F gefunden werden konnten. Dies lässt vermuten, dass in dem Patienten F kein
immunologischer Druck auf diesem Epitop lag. Die Entstehung von Fluchtmutationen in
diesem Epitop wurde bereits mit einer Progression in das Stadium AIDS assoziiert (Goulder
et al., 1997; Altfeld et al., 2006; Schneidewind et al., 2007).
Zusammenfassend zeigen die Analysen für die HI-Viren des Patienten F eine
eingeschränkte Funktionsfähigkeit des Nef Proteins, die letzten Endes zu einer
Abschwächung der Apoptose führt. Dies könnte zu der im Normbereich liegende CD4
Zellzahl, trotz der hohen Viruslast in dem Patienten F, beigetragen haben.
5.5
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte T-
Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
Die hierzu durchgeführten Analysen erfolgten in Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Jan
Dörrie und Niels Schaft (Dermatologie, Erlangen) und sollten zur Klärung der
Funktionsfähigkeit von virusspezifische T-Zellen, welche durch Elektroporation von einer
virenspezifischen TCR mRNA generiert wurden, beitragen. Für diese Untersuchungen wurde
ein TCR verwendet, der das auf HLA-A2-restringierte Peptid in der Reversen Transkriptase,
ILKEPVHGV erkennt. Die Fähigkeit zur spezifischen Lyse von entsprechend beladenen
Targetzellen konnte für die mit dieser spezifischen TCR mRNA elektroporierten CD8+ TZellen, gezeigt werden. Die Lyse der Targetzellen durch eine mit diesem Peptid stimulierten
CTL-Linie, lag in einem vergleichbaren Bereich. Die weiterhin durchgeführten
Infektionsanalysen mittels p24-Elisa, ergaben keine Reduktion der Infektion mit NL4-3 bei
Zugabe von TCR-reprogrammierten CD8+ T-Zellen. Jedoch auch die mit dem auf A2restringierten RT Peptid stimulierte CTL-Linie zeigte kaum einen hemmenden Einfluss auf
die HIV-Replikation. Gründe hierfür könnten in einer geringen Expression des auf HLA-A2restingierten Peptides, welches in der Reversen Transkriptase lokalisiert ist, liegen. So wurde
bereits von Jacks et al., 1988 eine 10 bis 20-fach geringere Expression der HIV-1 Reversen
Transkriptase im Vergleich zu HIV-1 Gag beschrieben, welche zu einer geringeren
Präsentation des RT-Peptids im Vergleich zu p17-Peptiden führt (Tsomides et al, 1994).
111
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Verschiedene Faktoren können die Suzeptibilität und Resistenz gegen die HIV-1 Infektion,
aber auch die Geschwindigkeit der Krankheitsprogression beeinflussen. Um verschiedene
Aspekte für die HIV Pathogenese zu untersuchen, wurden die HIV Gene, sowie genetische
und immunologische Faktoren, in ausgewählten Patientengruppen untersucht. Die Analyse
von infizierten Paaren bietet hierbei den Vorteil, dass die Infektionsquelle bekannt ist und
wichtige Informationen über den viralen Stamm liefert.
6.1
Analyse von CTL FLuchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten
Ein Schwerpunkt war die sorgfältige Analyse der Patientin 01, die seit 1998 eine gute
Kontrolle der HIV Infektion aufrechterhalten konnte. Es konnte ein Zusammenhang
zwischen der Entwicklung von CTL Fluchtmutationen in Nef mit dem Verlust der Kontrolle
über die HI-Viren gezeigt werden. Die Langzeitanalyse der Patientin demonstrierte das
Auftreten von CTL Fluchtmutanten in den beiden B8-restringierten Epitopen FLKEKGGL
(FL8) und WPAIRERM (WM8). Die detaillierte Analyse der Variantenerkennung zeigte
eine abgeschwächte Erkennung für die beobachteten WM8 und FL8 Varianten. Um die
Bedeutung von Mutationen innerhalb des immunologisch dominanten FL8-Epitopes zu
untersuchen, wurden die Nef-Sequenzen in einer Kohorte von 23 HLA-B8-positiven und 33
B8-negativen HIV-1 infizierten Patienten analysiert. Eine signifikante Korrelation konnte
für das Auftreten von Mutationen in dem FL8-Epitop und HLA-B8 beobachtet werden. Die
ELISPOT-Analysen ergaben, dass Mutationen innerhalb des FL8-Epitopes die CTL
Erkennung in den B8-positiven Patienten beeinträchtigten. Zudem konnten innerhalb der
Patientenkohorte erhebliche Unterschiede bezüglich der Erkennung von den verschiedenen
Varianten beobachtet werden. Die Daten zeigen einen starken CTL-Selektionsdruck auf das
immunologisch dominante, HLA-B8-restringierte CTL Epitop FL8 in Nef. Die Assoziation
von FL8 Mutationen mit einer niedrigeren CD4 Zellzahl, weist auf eine wichtige Rolle von
CTL Fluchtmutanten innerhalb von FL8 für die Krankheitsprogression hin.
112
Zusammenfassung
6.2
Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren bei
einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion durch das
gleiche Virus
Bei dem heterosexuellen Paar wurde die Patientin U von ihrem Partner, Patient R infiziert.
Während der Patient R in einem Zeitraum von 12 Jahren eine Progression in das Stadium
AIDS zeigte, ist es der Patientin U möglich, die Infektion außergewöhnlich gut zu
kontrollieren. Es konnten eine Vielzahl von Mutationen in den viralen Genen der Patientin
U vor allem in Nef gefunden werden. Hinweise für einen funktionell aktiven genetischen
Polymorphismus in Apobec3G bzw. für eine Aktivität anderer hypermutierender Gene
konnten nicht gefunden werden. Es zeigte sich eine normale CCR5 Expresssion auf Zellen
beider Patienten und PCR-Analysen konnten die d32-Basenpaardeletion von CCR5
ausschließen, welche zu einer verringerten Expression von CCR5 führt. Die durchgeführten
Infektionsanalysen in Kooperation mit PD Dr. Karin Metzner ergaben, dass die CD4+ TZellen der Patientin U mit verschiedenen HIV-1 Laborstämmen mit unterschiedlichen
Chemokinrezeptortropismen infiziert werden konnten, dass Zellkulturüberstand von PHAstimulierten PBMC der Patientin keinen Einfluss auf die Replikation von verschiedenen
HIV-1 Laborstämmen zeigte und, dass das Serum der Patientin eine dosisabhängige
Hemmung auf die Infektion mit verschieden tropen HIV-1 Laborstämmen hatte. Die
vertieften Analysen zu der neutralisierenden Aktivität des Serums der Patientin in
Kooperation mit Sascha Antoni (Biomedizinisches Forschungszentrum, Frankfurt) wiesen
stark darauf hin, dass die extrem gute Kontrolle der HIV-1 Infektion bei dieser Patientin,
nicht alleine auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern zurückgeführt
werden konnte. In den ELISPOT-Analysen konnte zudem eine starke und breite CTL
Antwort für die Patientin U detektiert werden. Die nef Gene der HI-Viren der Patientin U
waren stark mutiert und wiesen eine ungewöhnliche fünf Aminosäure langen Deletion
innerhalb der C-terminalen Region auf. Sowohl mittels direkter PCR-basierter
Sequenzierung als auch mittels Sequenzanalysen von klonierten nef Genen der HI-Viren der
Patientin konnten keine Viren in der Patientin entdeckt werden, welche die fünfAminosäuren-Deletion nicht enthielten. Bei ihrem Partner fanden sich dagegen keine Nef
Gene mit Deletionen. Um zu prüfen, ob die Mutationen und die Deletion in Nef durch CTL
induziert wurden, wurde die Immunantwort der Patientin unter Verwendung von
überlappenden Nef Peptiden und mit Hilfe transfizierter autologer Nef RNA untersucht.
113
Zusammenfassung
Es konnte eine starke Nef-spezifische Immunantwort mit Erkennung von mindestens vier
Epitopen gezeigt werden. Der Nachweis von CTL in der Patientin, welche ein Epitop
erkannten, das die fünf Aminosäuren aus der Deletion enthielt, ist ein starker Beleg dafür,
dass die Deletion durch CTL der Patientin selektioniert wurden. Die Funktionsanalysen zur
Klärung ob diese Deletion zu einer potenziellen Abschwächung der HI-Viren in der
Patientin U beitrugen, wurden in Kooperation mit Prof. Frank Kirchhoff (Virologie, Ulm)
durchgeführt und zeigten insbesondere eine geringere Heraufregulierung der Invarianten
Kette durch Nef. Da die Nef-bedingte Hochregulierung der Invarianten Kette über die damit
verbundene Hemmung der Antigenpräsentation im HLA-Klasse-II-Weg einen wichtigen
Fluchtmechanismus darstellt könnte vermutet werden, dass eine Abschwächung dieser NefFunktion an dem guten Verlauf der Patientin beteiligt ist.
Insgesamt lassen die Daten darauf schließen, dass die Ursachen für den extrem guten
HIV Infektionsverlauf in der Patientin U sehr wahrscheinlich auf ihre breite und starke CTL
Antwort, aber auch auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern zurückgeführt
werden kann. Zudem weisen die Analysen der Nef-Mutationen und der fünf Aminosäuren
langen Deletion in Nef stark darauf hin, dass diese durch einen Selektionsdruck, ausgeübt
durch spezifische CTLs der Patientin U entstanden sind. Diese Mutationen und die Deletion
führten zu einer verminderten Heraufregulierung der Invarianten Kette des MHC-Klasse-IIWeges durch Nef, was dann zu einer potentiell verstärkten CD4+ T-Zellantwort geführt
haben könnte.
6.3
Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine
immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M:
Weiterhin wurden virale Sequenzanalysen bei einem Patienten durchgeführt, der bisher eine
gute Kontrolle der HIV-1 Infektion zeigte. Nach der Behandlung mit Steroiden aufgrund
einer orthopädischen Erkrankung kam es bei diesem zu einem starken Anstieg der Viruslast
und einem Absinken der CD4+ T-Zellen. Es konnte eine Abnahme der CTL Aktivität gegen
seine dominanten Epitope in Nef, Gag und Pol beobachtet werden. Die Sequenzanalyse der
gag, pol und nef Gene von verschiedenen Zeitpunkten ergaben drei bis sechs Monate nach
der Behandlung mit Steroiden, keine neu entstandenen Mutationen in den gag und pol
Genen. Im Nef Protein konnte eine L-zu-M Mutation an Position 7 in seinem dominanten,
114
Zusammenfassung
auf HLA-B13-restringierten Epitop RQDILDLWV, gefunden werden. Die ELISPOTAnalysen zeigten eine stark reduzierte Erkennung des mutierten Peptides.
Zusammenfassend weisen die Daten darauf hin, dass die Behandlung mit Steroiden
zu einer funktionellen Hemmung seiner T-Zellantwort geführt hatte. Die Konsequenz
daraus war dann eine verstärkte Virusreplikation, welche zu einem erhöhten Risiko für die
Bildung von Fluchtmutationen vor allem in den dominanten Epitopen führte.
6.4
Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast
bei Patient F:
Die Untersuchungen zu dem Patienten F, welcher trotz hoher Viruslast eine im
Normbereich liegende CD4 Zellzahl aufwies, zeigten zwei Mutationen in der funktionell
wichtigen Bindungsregion für PAK in Nef. Diese Mutationen sind sehr wahrscheinlich CTL
FLuchtmutationen in dem auf HLA-B27-restringierten Epitop RRQDILDLWI. Beide
Mutationen sind ungewöhnlich und die R-zu-E Mutation an Position 1 ist in dem
sogenannten “RR” Motiv innerhalb der PAK-Bindungsstelle lokalisiert. Mutationen
innerhalb diesen Motives können verschiedene Nef Funktionen ausschalten. Um zu Klären
ob diese Mutationen zu einer postulierten Abschwächung der HI-Viren in dem Patienten
beitrugen, nachdem dieser eine normale CD4+ T-Zellantwort trotz der hohen Viruslast
aufwies, wurden für funktionelle Analysen, die nef Gene seiner HI-Viren amplifiziert und in
einen Expressionsvektor kloniert. Diese Analysen wurden in Kooperation mit Prof. Frank
Kirchhoff (Virologie, Ulm) durchgeführt. Die Ergebnisse aus diesen funktionellen Analysen
ergaben eine stärkere Herabregulierung des TCR-CD3 und weniger apoptotische Zellen im
Vergleich zu zwei, dem Wildtyp entsprechenden Kontroll-Nefgenen. Diese Daten stehen in
Einklang mit den publizierten Daten von Schindler et al, 2006, welche zeigen, dass die Nef
Allele der meisten Primaten-Lentiviren, inklusive HIV-2, die Expression des TCR-CD3 in
infizierten Zellen herunterregulieren. Die Zellen werden dadurch weniger dem durch
Aktivierung induzierten Zelltod ausgesetzt (AICD).
6.5
Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte T-
Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3
Diese Untersuchungen erfolgten in Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Jan Dörrie und
Niels Schaft (Dermatologie, Erlangen) und sollten zur Klärung der Funktionsfähigkeit von
virusspezifischen T-Zellen, welche durch Elektroporation von einer virenspezifischen TCR
115
Zusammenfassung
mRNA generiert wurden, beitragen. Die hierzu durchgeführten Chrom-FreisetzungsVersuche zeigten eine vergleichbare Lyse von mit Peptid beladenen Targetzellen, durch die
reprogrammierten CD8+ T-Zellen und Peptid stimulierten CTL-Linien. Weder für die
reprogrammierten T-Zellen noch für die stimulierten CTL-Linien konnte ein Einfluss auf
die Replikation des Laborstammes NL4-3 gefunden werden.
116
Summary
7
Summary
Several factors can influence the susceptibility and resistance to the HIV-1 infection, as well
as the course of the infection. To analyse different aspects of the HIV pathogenesis HIV
genes, genetic factors and immunological parameters were analysed in selected patient
groups. The analysis of infected couples has the advantage that the source of infection is
known and the analysis of the partners` viruses provides important information about the
infecting viral strain.
7.1
Analyses of CTL escape mutations in HLA-B8-positive patients
A focus was the thorough analysis of a female patient, who was an excellent controller of
HIV-1 viremia since 1998. An association of developing CTL escape mutations in Nef with
the loss of viral control could be demonstrated. The longitudinal analysis of that female
demonstrated the emergence of CTL escape mutations within the two B8-restricted epitopes
FLKEKGGL (FL8) and WPAIRERM (WM8). Detailed analysis of recognition of variants
revealed a reduction of the recognition of the variants in WM8 and FL8. To investigate the
role of mutations within the immunodominant FL8 epitope we analysed Nef sequences in a
cohort of 23 HLA-B8-positive and 33 B8-negative HIV-1-infected patients. A significant
correlation between the occurrence of mutations in the FL8 epitope and the presence of the
HLA-B8-allele could be observed. ELISPOT analysis revealed that mutations within the
FL8 epitope could decrease CTL recognition in the B8-positve patients. Strong differences
regarding the recognition of viral variants between individual CTL lines from different
donors could be observed. The data demonstrate a strong CTL selection pressure on the
immunodominant HLA-B8-restricted CTL epitope FL8 in HIV-1 Nef. The association of
FL8 mutations with lower CD4 counts indicate an important role of CTL escape mutations
for disease progression.
7.2
Analyses of genetic, immunological and virological factors in a patient couple
with divergent course of the HIV-1 infection despite infection with the same virus
In another investigated heterosexual couple the female patient U was infected by her male
partner, patient R. While the male had progressed to AIDS the female showed an excellent
HIV-1 control. A variety of mutations in the viral genes of the female’s HI-Viruses,
117
Summary
especially in nef, could be detected. Hints for functionally active genetic polymorphisms in
Apobec3G or an activity of other hypermutating genes could not be found. A normal CCR5
expression on cells of both patients could be demonstrated and PCR-analyses could rule out
the 32-bp deletion in the CCR5 gene leading to a reduced CCR5 expression. The performed
infection assays in cooperation with PD Dr. Karin Metzner revealed that the CD4+ T-cells
of patient U could be infected with different tropic HIV-1 lab strains, that the cell
supernatant of PHA stimulated PBMC of that patient did not show any influence on the
replication of different HIV-1 lab strains and that the sera of that patient showed a dose
dependent inhibition of the infection with different tropic HIV-1 lab strains. The further
analyses of the neutralizing capacity of the serum of patient U in cooperation with Sascha
Antoni (Institute of Biomedical Research, Frankfurt) strongly indicates that other factors in
addition to neutralizing antibodies were responsible for the excellent control of viremia.
ELISPOT analyses demonstrated strong and broad CTL responses for patient U. The nef
genes of the female’s viruses were strongly mutated and an unusual five amino acid deletion
within the C-terminal region could be detected. The direct PCR-based sequencing as well as
sequence analyses of cloned nef genes of the HI-viruses of the patient U did not show any
viruses lacking the five amino acid deletion. By contrast this five amino acid deletion could
not be found in the nef genes of her partner’s viruses. To analyse whether these mutations
and the deletion in Nef were induced by CTL, the immune response of patient U was
examined both by using overlapping Nef peptides and electroporated autologous Nef
mRNA. A Nef-specific strong immune response by detecting at least responses against four
epitopes, could be demonstrated. The detection that CTLs of patient U recognize an epitope
comprising the five deleted amino acids strongly indicates that the deletion was selected by
the CTLs of the female. To clarify whether this deletion and the other mutations contribute
to a potential attenuation of the patient viruses we performed functional analyses in
cooperation with Frank Kirchhoff that showed a reduced up-regulation of the invariant
chain by Nef. As the Nef-induced up-regulation of the invariant chain seems to be an
important escape mechanism leading to an inhibition of the antigen presentation in the
HLA-class-II-pathway, it is possible that this reduced Nef-function contributes to the good
HIV control in patient U.
In summary the data strongly suggest that the reasons for the excellent control of
viremia in patient U are due to a broad and strong CTL response, but also due to the
118
Summary
presence of neutralizing antibodies. Additionally, the analyses of Nef mutations and the five
amino acid deletion in Nef strongly indicate that they were developed in patient U due to a
selection pressure by her CTLs. These mutations and the deletion lead to a reduced upregulation of the invariant chain of the MHC-class-II-pathway by Nef and thus led to a
potentially preserved CD4+ T-cell response.
7.3
Treatment with steroids led to a loss of the so far good control of HIV-1
viremia in Patient M
Additional sequence analyses were performed in a patient who showed a good control of
HIV-1. When the patient was treated with steroids for an orthopaedic problem, he
developed a strong increase of viremia and drop of CD4-cells. A decline of CTL activity
against his dominant CTL epitopes in Nef, Gag and in Pol could be observed. Sequence
analyses of the gag, pol and nef genes of different time points revealed no emergence of
new escape mutations in the gag and the pol gene three to six months after steroid
application. In Nef an L-to-M mutation at position 7 could be found in his dominant HLAB13-restricted epitope RQDILDLWV. ELISPOT analysis revealed a strong reduction of the
recognition of the mutated peptide. Altogether, these data suggest that the application of
steroids led to a functional inhibition of his T-cell response allowing an enhanced viral
replication that ultimately led to the development of CTL escape mutations especially in his
dominant CTL epitope.
7.4
Preservation of normal CD4 counts despite high viral load in Patient F
The investigation of HIV-1 sequences in a patient with good CD4 counts despite a high
viral load, revealed two mutations within the PAK-binding site in Nef. These mutations are
presumably CTL escape mutations within the HLA-B27–restricted CTL epitope
RRQDILDLWI. Both mutations are unusual and the R-to-E mutation at position P1 is
located within the “RR” motif of the PAK-binding site. Mutation within this motif could
knock off several Nef functions. To clarify whether these mutations contribute to a
postulated attenuation of the patient viruses as he preserved a normal CD4 count despite a
high viral load, nef genes of this patient were amplified and cloned into expression vectors
for the use in functional assays that were performed in cooperation with Frank Kirchhoff
(Virology, Ulm). The results out of these functional analyses revealed a higher level of T-
119
Summary
cell receptor (TCR)-CD3 down-modulation and a lower percentage of activation-induced
cell death (AICD) by the nef gene of that patient compared to two different wild type nef
genes expressing controls. This is in line with published data by Schindler et al, 2006, who
reported that nef alleles from the majority of primate lentiviruses, including HIV-2, downmodulate TCR-CD3 from infected T-cells, thereby blocking the responsiveness to AICD.
7.5
Analysis of the lytic ability of TCR-RNA electroporated T-cells and the
influence on the infection with lab strain NL4-3
These investigations were performed in cooperation with Jan Dörrie and Niels Schaft
(Department of Dermatologie, Erlangen). The investigation should help to clarify whether
virus-specific T-cells, generated by electroporation of a virale-specific TCR mRNA, are
functional. The chromium-release-assay conducted with peptide loaded target cells, showed
a lytic ability of the reprogrammed CD8+ T-cells which was comparable to those observed
for peptide stimulated CTL lines. Neither the reprogrammed T-cells nor the peptide
stimulated CTL lines showed an influence on the replication of lab strain NL4-3 in
cocultures.
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130
Abkürzungsverzeichnis
9
Abkürzungsverzeichnis
A
Adenin
Abb
Abbildung
AIDS
Acquired Immuno-Deficiency Syndrom
Amp
Ampizillin
Anv
Annexin V
Apobec
Apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide
ART
Antiretrovirale Therapie
As
Aminosäure(n)
Bp
Basenpaar(e)
BSA
bovines Serumalbumin
C
Cytosin
°C
Grad Celsius
CCR
Chemokinrezeptor
cDNA
complementary DNA
CLIP
class-II-associated invariant chain peptide
CO2
Kohlendioxid
CTLs
cytotoxische T-Lymphozyten
D
Asparaginsäure
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DNA
Desoxiribo Nucleic Acid
DMSO
Dimethylsulfoxid
dNTP
desoxy-Nukleotid Triphosphat
E
Escherichia/Glutaminsäure
EBV
Epstein-Barr-Virus
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
eGFP
enhanced Green Fluorescent Protein
ELISA
Enzyme Linked Immunoadorbent Assay
ELISPOT
Enzyme Linked Immuno Spot Technique
ER
Endoplasmatische Retikulum
F
Phenylalanin
FACS
Durchflußzytometrie
131
Abkürzungsverzeichnis
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluorescein-5-isothiocyanat
G
Gramm/Guanin
HAART
Hochaktive Antiretrovirale Therapie
HIV-1
Human Iimmunodeficiency Virus type 1
HLA
Humanes Leukozyten Antigen
I
Isoleucin
IFN
Interferon
IL
Interleukin
IN
Integrase
IRES
interne Ribosomen-Eintrittstelle
K
kilo/Lysin
L
Leucin
LB
Luria-Bertani
LTNP
Langzeit Nichtprogressoren
LTRs
Long Terminal Repeats
µ
mikro
M
Methionin/Molar
MA
Matrix Protein
MFA
mittlere Fluoreszenz Intensität
Min
Minute
MgCL2
Magnesiumchlorid
MHC
Major Histocompatibility Complex
MOI
Multiplicity of Infection
MOPS
Morpholino-Propanylsulfonsäure
mRNA
messenger RNA
MVA
Modifizierter Vaccinia Virus Typ Ankara
N
Asparagin
Na
Natrium
NNRTI
Nicht-Nukleosid-analoger reverse
Transkriptase-Inhibitor
132
Abkürzungsverzeichnis
NRTI
Nukleosid-analoger reverse
Transkriptase-Inhibitor
OD
optische Dichte
P
Prolin
PBMCs
Peripheral Blood Mononuclear Cell
PBS
Phosphat Buffered Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
PE
Phycoerythrin
pg
Pikogramm
pH
negativer dekadischer Logarithmus
der Wasserstoffionenkonzentration
PHA
Phytohämagglutinin
PACS-1
Phosphofurin Acidic Cluster Sorting Protein-1
Pol
Polymerase
Q
Glutamin
R
Arginin
RNA
Ribonucleic Acid
RT
Reverse Transkriptase
S
Serin
T
Thymin/Threonin
TAE
Tris-Acetat-EDTA
TCR
T-Zellrezeptor
TCID
Tissue Culture Infectious Dose
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
Tween 20
Poly(oxyethylen)n Sorbitan Monolaureat
U
Unit
UV
ultraviolettes Licht
V
Volt/Valin
Vif
viralen Infektiositätsfaktors
Vpr
Virale Protein Rapid
W
Tryptophan
133
Anhang
10
Anhang
Neutralisation der Viren in [%]
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
10
100
1000
10000
-20,0
Kehrwerte der Serumverdünnungen
-40,0
JR-CSF: CCR5
50%
D117III: CCR5
89,6: CCR5/CXCR4
NL4-3: CXCR4
90%
Abb. 25: Vergleich der Neutralisation verschieden troper HIV-1 Laborstämmen durch
Serumverdünnungen der Patientin U. Unterschiedlich trope rekombinante Reporterviren wurden mit
Verdünnungen des hitzeinaktivierten Plasmas der Patientin inkubiert und für die Infektion von U87: CD4,
CCR5 positive Zellen oder U87: CD4, CXCR4 positive Zellen verwendet. Die Quantifizierung der
Infektion erfolgte durch Bestimmung der Renilla Luziferase Aktivität im ELISA. Die reziproken
Plasmaverdünnungen sind auf der X-Achse als logarithmische Skala dargestellt. Die Neutralisation der
Viren in % ist auf der Y-Achse dargestellt. Die 50 % Neutralisation ist als rote Linie, die für 90 %
Neutralization als schwarze Linie gekennzeichnet.
134
Anhang
Tab. 19: CTL Erkennung der Patientin U gegen die synthetisch hergestellten Peptide im
Bereich der fünf Aminosäure langen Deletion
Peptide:
Autologe Pat R:
VDPDKVEEVTSRENSCLLHPISQ
Autologe Pat U + Insert:
VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL
GEEVTSRENS
EV
SCLLHPMNL
VTSRENSCLL
TSRENSCLL
RENSCLLHPMNL
NSCLLHPMNL
Autologe Pat U:
VEPPEGEE
NSCLLHPMNL
VEPPEGEE
NSCLLH
VEPPEGEE
NSC
VEPPEGEE
N
PEGEE
NSCLL
PEGEE
CTL-Linien stimuliert mit den Peptiden:
Peptid
autologe
autologe
Frische stimulierte autologe
Pat R
Pat U
Pat U + Insert
PBMC PBMC
-
++
+/-
-
+
+
n.d.
n.d.
-
+++
n.d.
++
n.d.
-
+++
n.d.
n.d.
n.d.
-
n.d.
n.d.
-
++
++++
+++
-
++
+
n.d.
+++
n.d.
n.d.
n.d.
++
n.d.
n.d.
n.d.
++
+++
+
++++
++
+++
++
-
NSCL
n.d.
n.d.
n.d.
+++
n.d.
PEGEE
NSC
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
Die entsprechenden Peptide sind in der linken Spalte auf gelistet. Die CTL Erkennungen sind wie folgt
dargestellt: n.d., nicht durchgeführt;-, keine CTL Erkennung;+/-, CTL Erkennung fraglich +, schwache
CTL Erkennung; ++, stärkere CTL Erkennung; +++, starke CTL Erkennung; ++++, sehr starke CTL
Erkennung. Pat: Patient; autologe Pat R : VDPDKVEEVTSRENSCLLHPISQ; autologe Pat U:
VEPPEGEENSCLLHPMNL; autologe Pat U + Insert : VEPPEGEEVTSRENSCLLHPMNL
135
Publikationen
11
Publikationen, Konferenzbeiträge und Auszeichnungen
Publikationen
•
Romaker D, Schregel V, Maurer K, Auerochs S, Marzi A, Sticht H, Marschall M.
Analysis of the structure-activity relation (SAR) of four UL97-subfamily herpesviral protein
kinases reveals partial but not full functional conservation. J Med Chem, 2006, 49:7044-53
•
Schregel V, Auerochs S, Maurer K, Stamminer T, and Marschall M. .Mapping of a
self-interaction domain of the cytomegaloviral protein kinase pUL97. JGV, 2006, 88:395404
•
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Schmitt-Haendle M,
Spriewald B,
Müller S, Harrer T. Analysis of CTL mediated immune selection in a
dominant HLA B8-restricted CTL Epitope in Nef. JAIDS, 2008, 48:133-41
•
Hofmann C, Harrer T, Kubesch V, Maurer K, Metzner K, Eismann K, Bergmann
S, Schmitt-Haendle M, Schuler G, Dörrie J, Schaft N. Generation of HIV-1-specific T cells
by electroporation of T-cell-receptor RNA. AIDS, 2008, in Press
•
In Vorbereitung:
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Müller S. Harrer T. Viral load
increase and CTL escape during steroid treatment in an HIV-1-infected patient.
Maurer K, Antoni S, Metzner K, Eismann K, Bergmann S, Hoffmann C, Spriewald B,
Müller S, Kirchhoff F, Harrer T. Evidence for CTL mediated induction of a deletion in nef
in an HIV-1-infected patient with excellent viral control.
Konferenzbeiträge
•
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Schätz B, Müller S,
Harrer T. Correlation between CTL escape and disease progression in HIV infection. 5th
Workshop, GfV Study Group “Immunobiology of Viral Infections”, Zeilitzheim, 2006
136
Publikationen
•
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Schätz B, Müller S,
Harrer T. Analysis of CTL mediated immune selection in a dominant HLA B8-restricted
CTL Epitope in Nef. DÖAK, Frankfurt, Eur J Med Res 2007, 121:F.6
•
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Schätz B, Müller S,
Harrer T. CTL mediated immune selection in a dominant HLA B8-restricted CTL Epitope
in Nef. Third European Congress of Virology, Nürnberg, Europ Virol, 2007, 218:VPI023
•
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Schätz B, Müller S,
Harrer T. CTL mediated immune selection in a dominant HLA B8-restricted CTL Epitope
in Nef, 37th Annual Meeting of the German Society for Immunology, Heidelberg, 2007,
119:J.29
•
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Schätz B, Müller S,
Harrer T. Role of CTL-mediated immune selection in a dominant HLA-B8-restricted CTL
epitope in Nef, 11th European AIDS Confrence/EACS, Madrid, 2007
•
Maurer K, Harrer E, Goldwich A, Eismann K, Bergmann S, Schätz B, Müller S,
Harrer T. CTL Escape Mutations within the HIV-1 Nef HLA-B8-restricted CTL Epitope
FL8 Correlate with Disease Progression in HLA-B8 Patients. 15th Conference on
Retroviruses and Opportunistic Infectious (CROI), Boston, 2008, 172:328
•
Maurer K, Antoni S, Bergmann S, Eismann K, Rauch P, Metzner K, Mueller SM,
Harrer EG, Harrer T. A CTL selected deletion in nef is associated with excellent viral
control in a HIV-1 infected patient with a documented source of infection. AIDS-Vaccine
Conference, Kapstadt, 2008
Auszeichnungen
•
Young Investigator Award, 15th Conference on Retroviruses and Opportunistic
Infectious (CROI), Boston, 2008
137
Lebenslauf
12
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Katja Maurer
Geburtsdatum:
30. April 1973
Geburtsort:
Nürnberg
Ausbildung, wissenschaftlicher und beruflicher Werdegeang
seit 05/2005
Promotion an der Medizinischen Klinik III,
Immunologie, FAU Erlangen-Nürnberg
Thema:
„HIV spezifische Immunität und virale Fluchtmechanismen“
03/2005
Abgabe Diplomarbeit
Diplomarbeit in der Virologie, Erlangen-Nürnberg
Thema:
„Herpesvirale Proteinkinasen:
Konservierte Protein-Interaktionen,
Substratphosphorylierung und Colokalisation"
10/2004-02/2005
Studentische Hilfskraft in der Virologie
10/2000
Studium der Biologie (Diplom) an der FAU
Erlangen-Nürnberg
09/1999-08/2000
Berufsoberschule Nürnberg
Abschluss: allgemeine Hochschulreife
09/1996-08/1999
Berufsfachschule für MTLA in Nürnberg
Abschluss: MTLA
138
Erklärung
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Danksagung
Ich möchte gerne Dank sagen für die Unterstützung, die mir viele Menschen während
dieser Arbeit entgegen gebracht haben.
An erster Stelle bedanke ich mich ganz herzlich bei meinem Betreuer und
Arbeitsgruppenleiter Prof. Dr. med. T. Harrer für die Möglichkeit an diesem interessanten
Themengebiet zu forschen.
Bei Prof. Dr. rer. nat. Thomas Winkler möchte ich mich für die Bereitschaft bedanken,
diese Promotionsarbeit von Seiten der naturwissenschaftlichen Fakultät zu betreuen.
Dem Graduiertenkolleg 1071 „Viren des Immunsystems“ und seinem Sprecher Prof. Dr.
med. Bernhard Fleckenstein, sowie der Deutschen Forschungsgesellschaft DFG möchte
ich Dank sagen für das 3-jährige Stipendium, durch welches es mir ermöglicht wurde,
meine Promotion an der Medizinischen Klinik III in Erlangen durchzuführen.
Dank gilt allen Mitarbeitern meiner Arbeitsgruppe.
Meinen Eltern und Freunden möchte ich besonders für die Unterstützung in den letzten 3
Jahren Dank sagen.
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